ES2434111T3

ES2434111T3 - Método para el tratamiento de enfermedades provocadas por hongos, asociadas a cambios de la composición cualitativa y/o cuantitativa del ADN extracelular de la sangre

Info

Publication number: ES2434111T3
Application number: ES12170750T
Authority: ES
Inventors: Dmitry Dmitrievich Genkin; Victor Veniaminovich Tets; Georgy Victorovich Tets
Original assignee: CLS Therapeutics Ltd
Current assignee: CLS Therapeutics Ltd
Priority date: 2003-07-14
Filing date: 2004-07-01
Publication date: 2013-12-13
Anticipated expiration: 2024-07-01
Also published as: PL2497487T3; ES2388605T3; EP1661579B1; RU2269358C2; PL1661579T3; PL2497486T3; ES2433918T3; PL2497488T3; WO2005004789A3; ES2434112T3; EP2497488A1; EP1661579A4; EP2497486B1; WO2005004789A2; EP1661579A2; US20070104702A1; EP2497488B1; EP2497487B1; EP2497486A1; EP2497487A1

Abstract

Enzima ADNasa para su utilización en el tratamiento de enfermedades provocadas por hongos asociadas concambios cualitativos y/o cuantitativos en la composición del ADN sanguíneo extracelular, en el que la ADNasa seintroduce en la circulación sanguínea sistémica.

Description

Método para el tratamiento de enfermedades provocadas por hongos, asociadas a cambios de la composición cualitativa y/o cuantitativa del ADN extracelular de la sangre

Sector técnico

La presente invención concierne a la medicina y veterinaria y se refiere al enzima ADNasa que se utiliza para el tratamiento de enfermedades provocadas por hongos y protozoos.

Técnica anterior

El método terapéutico principal para las enfermedades causadas por bacterias, hongos y protozoos son los antibióticos y la quimioterapia (véase el Manual Merck de Diagnóstico y Terapia, 16ª Edición). La forma principal de la terapia con fármacos contra la aterosclerosis es la terapia con los compuestos del grupo de las estatinas que inhiben la síntesis de colesterol (véase Nuevos conceptos y paradigmas en la medicina cardiovascular: La gestión no invasiva de la enfermedad coronaria, (“New Concepts and Paradigms in Cardiovascular Medicine: The Noninvasive Management of Coronary Artery Disease”) K. Lance Gould, THE AMERICAN JOURNAL OF MEDICINE, Volumen 104, 22 de junio, 1998, págs. 2-17)

La terapia de la diabetes mellitus se compone de tres enfoques principales: la terapia de insulina, fármacos que aumentan la secreción de insulina por el páncreas, fármacos que aumentan la sensibilidad de los tejidos a la insulina

o los que aumentan la utilización de glucosa por los tejidos (Gestión farmacológica de la diabetes: Avances recientes y perspectivas de futuro en el tratamiento diario con fármacos (“Pharmacological Management of Diabetes: Recent Progress and Future Perspective in Daily Drug Treatment”), Gérard Emilien y otros, Pharmacol. Ther. volumen 81, No. 1, págs. 37-51, 1999). El tratamiento de la hipersensibilidad de tipo IV se basa en la terapia inmunosupresora e inmunomoduladora (véase Inmunosupresión Terapéutica (“Therapeutic Immunosupression”), Ed. A.W. Thomson, Ser. Immunology and Medicine, volumen 29, Acad. Publishers Kluwer, Dordrecht, 2001).

Las enfermedades causadas por mutaciones en los genes somáticos y acompañadas por el desarrollo de mosaicismo somático no tienen ningún tratamiento etiológico, véase H. Youssoufian, R. E. Pyeritz Mecanismos y consecuencias del mosaicismo somático en seres humanos (“Mechanisms and Consequences of Somatic Mosaicism in Humans”), Nature Reviews Genetics, 2002; 3:748-758.

La resistencia a los fármacos se considera el principal problema de la terapia con antibióticos de una infección bacteriana. La circulación de cepas resistentes a los antibióticos y la aparición de otras nuevas en el proceso del tratamiento (por ejemplo, como resultado de la formación de biopelículas en el organismo del paciente) son la principal causa de la ineficiencia de la terapia (La utilización y la resistencia a los antibióticos en la comunidad (“The use and resistance to antibiotics in the community”) M. Cizman, Int. J. Antimicrob. Agents, abril de 2003 21: págs. 297-307).

En la actualidad se reconoce universalmente que el problema de la resistencia a los antibióticos tiene un carácter de amenaza global (Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos: su importancia clínica en el nuevo milenio (“Mechanisms of antimicrobial resistance: their clinical relevance in the new millennium”) A. M. Sefton, Drugs, 2002, volumen 62: 557-66) y requiere el desarrollo de nuevos antibióticos originales y nuevos métodos con mecanismos de no antibióticos efectivos sobre el proceso infeccioso. Por ejemplo, la vancomicina se utiliza para el tratamiento infeccioso provocado por cocos gram positivos resistentes a la penicilina y la cefalosporina. Las principales desventajas de la vancomicina son el número cada vez mayor de cepas resistentes a la vancomicina en circulación, la elevada toxicidad, el espectro de actividad relativamente estrecho (La amenaza de la resistencia a la vancomicina (“The threat of vancomycin resistance”), T. M. Perl, Am. J. Med., mayo de 1999 106: págs. 26-37).

Los datos mencionados anteriormente indican que es todavía una tarea muy importante el desarrollo de nuevos métodos eficaces, de baja toxicidad, que demuestren un amplio espectro de actividad contra todas las especies de bacterias, incluyendo cepas resistentes a antibióticos. Los problemas de la terapia y la quimioterapia con antibióticos de las enfermedades infecciosas causadas por los hongos y los protozoos son similares a los del tratamiento de las infecciones bacterianas; por ejemplo, cuando se utiliza un fármaco reconocido, anfotericina (Resistencia a fármacos antifúngicos a azoles y polienos (“Antifungal drug resistance to azoles and polyenes”), Mar Masiá Canuto y otros, The Lancet Infectious Diseases, Volumen 2, número 9, 1 de septiembre de 2002, páginas 550-563, Revisión sistemática de la eficacia y la tolerabilidad de las formulaciones del antifúngico anfotericina B (“A systematic review of the antifungal effectiveness and tolerability of amphotericin B formulations”), Jane P. Barrett y otros, Clinic Therapeutics, Volumen 25, Número 5, mayo de 2003, páginas 1295-1320).

La aterosclerosis es una enfermedad sistémica que está acompañada de la formación de placas ateroscleróticas en determinadas paredes de las arterias de tamaño grande y mediano. Dependiendo de la localización, el estadio y el tamaño de las placas ateroscleróticas la enfermedad tiene distintas manifestaciones clínicas (angina de pecho, derrame cerebrovascular y otras). Las manifestaciones especialmente asociadas con la disfunción de órganos

causada por la aterosclerosis sistémica se curan mediante terapia con fármacos o intervención quirúrgica. No existe cura para la aterosclerosis mediante métodos de terapia farmacológica, al igual que para cualquier enfermedad sistémica. Un método reconocido de prevención que retrasa la progresión de la enfermedad es la terapia con inhibidores de la reductasa 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG CoA) (lovastatina, parvastatina, etc.) que conducen a la inhibición de la síntesis de colesterol endógeno y al aumento de la depuración de lipoproteínas de baja densidad del plasma sanguíneo y atenúan el desarrollo de la aterosclerosis (Nuevos conceptos y paradigmas en la medicina cardiovascular: La gestión no invasiva de la enfermedad de las arterias coronarias (“New Concepts and Paradigms in Cardiovascular Medicine: The Noninvasive Management of Coronary Artery Disease”), K. Lance Gould, THE AMERICAN JOURNAL OF MEDICINE, Volumen 104, 22 de junio de 1998, págs. 2-17). Las desventajas de este tratamiento son los efectos adversos (Una mirada a la seguridad de las estatinas disponibles en la actualidad (“A safety look at currently available statins”), M. H. Moghadasian, Expert Opin. Drug Saf. septiembre de 2002 1: págs. 269-74) y la eficacia limitada (“Estatinas: evaluando beneficios, eficacia y seguridad”, M. B. Clearfield, Expert Opin. Pharmacother., mayo de 2002 3: págs. 469-77).

La causa principal de incapacidad física y muerte de los pacientes con diabetes mellitus tipo 1 y 2 son las complicaciones asociadas con la microangiopatía y el desarrollo de la macroangiopatía. Se considera que el control metabólico efectivo del nivel de glucosa (mantenimiento del nivel de glucosa y el nivel de hemoglobina glucosilada dentro de los límites normales) previene el desarrollo de las complicaciones. La terapia con insulina, que incluye la terapia intensiva de insulina, es el método a elegir cuando es imposible llegar a un control metabólico con otros fármacos (Terapia de la insulina en pacientes ambulatorios con diabetes mellitus tipo 1 y tipo 2: revisión científica, (“Outpatient insulin therapy in type 1 and type 2 diabetes mellitus: scientific review”), D. E. DeWitt, I. B. Hirsch, JAMA, mayo de 2003, 289: págs. 2254-64).

Sin embargo, aunque se utilice terapia de insulina a dosis elevadas, el riesgo de desarrollar complicaciones, incluso mortales, es todavía lo suficientemente elevado (Mortalidad por causa específica en una población con diabetes: Estudio de la mortalidad por diabetes en South Tees (“Cause-specific mortality in a population with diabetes: South Tees Diabetes Mortality Study”), N. A Roper, y otros, Diabetes Care, enero de 2002 25: págs. 43-8). De acuerdo con lo mencionado anteriormente, la tarea del desarrollo de nuevos métodos de terapia contra la diabetes mellitus tipo I y tipo II, incluyendo los métodos de prevención de las complicaciones, sigue siendo de interés actual y está generalmente reconocida.

Uno de los métodos clínicos reconocidos de tratamiento de la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado es la administración del péptido ciclosporina A (Inmunosupresión terapéutica (“Therapeutic Immunosupression”), ed. A. W. Thomson, Ser. Inmunology and Medicine, volumen 29, Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht, 2001). Los inconvenientes bien conocidos de este método son los efectos adversos graves, concretamente, nefrotoxicidad, hipertensión y alto riesgo de aparición de infecciones (Ciclosporina: mecanismos de acción y toxicidad (“Cyclosporine: mechanisms of action and toxicity”), R. M. Graham, Cleve Clin. J. Med., julio-agosto de 1994 61: págs. 308-13). Otro problema es la pérdida de la eficacia durante el tratamiento a largo plazo, que se muestra en el aumento del riesgo de rechazo de trasplantes (Trasplante renal, pasado, presente y futuro (“Renal transplantation, past, present and future”), C. Ponticelli, y otros, J. Nephrol., julio-agosto de 1999 12 Supl. 2: S105-10). De este modo, para tratamientos acompañados por cambios cualitativos y/o cuantitativos de ADN sanguíneo extracelular, el amplio espectro de métodos diferentes que se utilizan tienen inconvenientes similares: toxicidad, efectos adversos, baja eficacia de la terapia. Al mismo tiempo, en la práctica clínica real estas enfermedades a menudo se acompañan entre sí. Por ejemplo, las terapias contra las reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado con fármacos inmunosupresores multiplican el riesgo de enfermedades infecciosas (Avances recientes en el diagnóstico y tratamiento de la infección en el receptor de un trasplante. (“Recent advances in the diagnosis and management of infection in the organ transplant recipient”) N. E. Tolkoff-Rubin, H. R. Rubin; Semin. Nephrol. marzo de 2000, 20: 148-63), la aterosclerosis es una complicación muy común de la diabetes mellitus (Diabetes y aterosclerosis. epidemiología, fisiopatología y tratamiento (“Diabetes and atherosclerosis: epidemiology, pathophysiology, and management”), J. A. Beckman, M. A. Creager, P. Libby; JAMA, mayo de 2002, 287:2570-81) y suele ir acompañada de procesos infecciosos sistémicos (Infección y aterosclerosis: papel potencial de la carga de patógenos y mimetismo molecular (“Infection and atherosclerosis: potential roles of pathogen burden and molecular mimicry”), S.

E. Epstein, J. Zhu, M. S. Burnett, Y. F. Zhou, G. Vercellotti, D. Hajjar, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., junio de 2000 20:1417-20), muchos tipos de diabetes se desarrollan como resultado de la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (Evidencia de la autoinmunidad de islotes celulares en pacientes ancianos con diabetes tipo 2 (“Evidence of islet cell autoimmunity in elderly patients with type 2 diabetes”), M. Pietropaolo, E. Barinas-Mitchell, S. L. Pietropaolo, L. H. Kuller, M. Trucco, Diabetes, enero de 2000, 49: 32-8), o durante el proceso infeccioso (Enfermedades sistémicas causadas por la infección por vía oral (“Systemic diseases caused by oral infection”) X. Li,

K. M. Kolltveit, L. Tronstad, I. Olsen, Clin. Microbiol. Rev., octubre de 2000, 13:547-58), y conduce a un riesgo elevado de desarrollo de infecciones (Diabetes y el riesgo de mortalidad relacionada con infecciones en los EE.UU. (“Diabetes and the risk of infection-related mortality in the U.S.”), A. G. Bertoni, S. Saydah, F. L. Brancati, Diabetes Care, junio de 2001, 24:6 1044-9).

El documento US 6.391.607 B1 se refiere a variantes de secuencias de aminoácidos de ADNasa I humana que han aumentado la actividad hidrolítica del ADN. Se dan a conocer secuencias de ácido nucleico que codifican dichas variantes hiperactivas, para permitir de este modo la producción de estas variantes en cantidades suficientes para su

utilización clínica. Se refiere además a composiciones farmacéuticas y a utilizaciones terapéuticas de las variantes hiperactivas de ADNasa humana I.

Según el documento DE 40 24 530 A1, se controlan virus y enfermedades virales en humanos y animales mediante el tratamiento con nucleasas (I) aisladas de páncreas bovino. Entre las (I) se incluyen también ribonucleasas y desoxirribonucleasas, específicamente ADNasa I.

S. SUGIHARA y otros describen en el BRITISH JOURNAL OF CANCER, NATURE PUBLISHING GROUP, LONDRES, G. B., volumen 67, núm. 1, 1 de enero de 1993 (01/01/1993), páginas 66-70, ISSN: 0007-0920 XP008086562 que un tratamiento con desoxirribonucleasa impide la metástasis hepática transmitida por sangre de células tumorales trasplantadas cutáneamente en ratones.

J. C. DAVIS JR y otros describen en LUPUS, BASINGSTOKE, G. B., volumen 8, No. 1, 1 de enero de 1999 (01/01/1999), páginas 68-76, ISSN: 0961-2033 XP009124143 la utilización de la ADNasa I humana recombinante (ADNasa hr) en pacientes con nefritis lúpica.

Características de la invención

El conseguir el objetivo de desarrollo de un método de alto rendimiento y baja toxicidad para el tratamiento de enfermedades que están acompañadas por el cambio cuantitativo y/o cualitativo de la composición del ADN extracelular del plasma sanguíneo, estando estas enfermedades provocadas por hongos y protozoos, es la base de la presente invención.

Según la presente invención, este objetivo se consigue mediante la introducción de un agente de destrucción de ADN sanguíneo extracelular en la circulación sanguínea sistémica para tratar enfermedades provocadas por hongos y protozoos. Como agente de destrucción de ADN sanguíneo extracelular puede introducirse el enzima ADNasa en la circulación sistémica: El enzima ADNasa puede introducirse en la circulación sistémica en dosis que proporcionan el cambio de perfil electroforético de ADN sanguíneo extracelular que puede ser detectado mediante electroforesis puls-gel, con lo que el enzima ADNasa puede ser administrado en dosis y regímenes que pueden proporcionar un nivel hidrolítico de ADN sanguíneo medido en el plasma sanguíneo y que supera las 150 unidades Kuntz por litro de plasma, y este nivel puede mantenerse durante más de 12 horas durante 24 horas en total.

El desarrollo de enfermedades provocadas por hongos y protozoos está acompañado por un cambio cuantitativo y/o cualitativo en el ADN sanguíneo extracelular, pero a base de los datos disponibles, no hay conocimiento sobre el repertorio genético del ADN sanguíneo extracelular de los pacientes con las enfermedades mencionadas anteriormente, sobre el papel biológico del ADN sanguíneo extracelular en estas enfermedades y sobre el efecto terapéutico potencial de la destrucción del ADN sanguíneo extracelular a efectos del tratamiento de este tipo de enfermedades, de modo que, teniendo en cuenta todo lo mencionado anteriormente, la presente invención cumple con los requisitos de los criterios de "novedad" (N).

Tal como establece el presente solicitante, el ADN sanguíneo extracelular de los pacientes con las enfermedades mencionadas anteriormente contiene un repertorio cuantitativa y cualitativamente único de genes y elementos de regulación genética que difieren en gran medida del repertorio de ADN que se describe en el genoma humano. En contraste con el ADN intracelular, el ADN extracelular de estos pacientes contiene genes humanos principalmente únicos. Se ha descubierto ADN extracelular de bacterias y hongos en la matriz de las biopelículas y en el plasma sanguíneo de humanos infectados.

Se ha establecido que el ADN sanguíneo extracelular que incluye ADN extracelular de bacterias, hongos y protozoos promueve el desarrollo de las enfermedades indicadas anteriormente.

Se ha establecido que la destrucción del ADN extracelular de plasma sanguíneo conduce a efectos terapéuticos sobre las enfermedades indicadas anteriormente.

Las nuevas características mencionadas anteriormente de la presente invención se basan en nuevas ideas acerca de los mecanismos las enfermedades descritas. De esta manera, el método reivindicado cumple los requisitos de los criterios de "etapa inventiva" (IS).

Breve descripción de los dibujos

Tal como se establece a continuación, la presente invención se ha explicado mediante la descripción detallada de las realizaciones sin referencias a dibujos.

Realización preferente

El método reivindicado de la presente invención se lleva a cabo tal como se describe a continuación:

Materiales y métodos.

Se utilizaron los siguientes agentes que destruyen el ADN sanguíneo extracelular: ADNasa pancreática bovina (Sigma y Samson-Med), ADNasa I humana recombinante (Gentech), anticuerpos anti-ADN hidrolizadores de ADN aislados de la sangre de pacientes con lupus eritematoso, de acuerdo con A. M. Shuster (A. M. Shuster y otros, Science, volumen 256, 1992, págs. 665-667).

Se aisló ADN extracelular a partir de plasma sanguíneo tal como se describe a continuación: Se centrifugó plasma fresco (no más de 3-4 horas después de la toma de muestra) con un anticoagulante añadido (citrato de sodio) en Ficoll-PlaquePlus (Amersham-Pharmacia) durante 20 minutos a 1500 G a temperatura ambiente. La mitad del plasma se separó, sin afectar al resto de las células en la almohadilla Ficoll y posteriormente se centrifugó a 10000 G durante 30 minutos para la separación de los fragmentos y residuos de células. El sobrenadante se separó, sin afectar a los sedimentos, y se rellenó hasta el 1% de sarkosil, Tris-HCl 50 µM, pH 7,6, 20 µM EDTA, 400 µM NaCl y, a continuación, se mezcló con un volumen igual de mezcla fenol-cloroformo (1:1). La emulsión preparada se incubó durante 2 horas a T=65°C, a continuación se separó la mezcla de fenol-cloroformo por centrifugación (500 G durante 20 minutos, a temperatura ambiente).

El procedimiento de desproteinización con mezcla de fenol-cloroformo se repitió 3 veces y, a continuación, se procesó la fase acuosa con cloroformo y éter dietílico. La separación de los disolventes orgánicos se hizo por centrifugación a 5000 G durante 15 minutos). A continuación, se añadió un volumen igual de isopropanol a la fase acuosa resultante y la mezcla se incubó durante toda la noche a 0°C. Después de la sedimentación, los ácidos nucleicos se separaron por centrifugación a 10000 G durante 30 minutos. El sedimento de ácidos nucleicos se disolvió en Tris-HCl 10 µM, pH 7,6 con EDTA 5 µM, y se sometió al gradiente de CsCl (1 M, 2,5 M, 5,7 M) en un tubo de ensayo para el rotor SW60Ti. El volumen de solución de ADN fue de 2 ml, el volumen de cada etapa de CsCl fue de 1 ml. Se llevó a cabo ultracentrifugación en una centrífuga L80-80 (Beckman) durante 3 horas a 250000 G. El ADN se recogió de la superficie de cada etapa del gradiente en fracciones. Estas fracciones se dializaron durante 12 horas (T=4°C). La presencia de ADN en las fracciones se determinó por electroforesis en agar y el ADN se visualizó por tinción con bromuro de etidio. La cantidad de ADN se determinó con un espectrofotómetro (Beckman DU70) en cubeta (100 mcl) a la longitud de onda de 220-230 nm.

Ejemplo 1.

El tratamiento de la sepsis experimental causada por Candida Albicans

Grupo 3 - 10 ratones. Se administró por vía intravenosa aislado clínico de Candida Albicans a una dosis LD50. Se administró alfa dornasa recombinante (Genentech) por vía intraperitoneal a una dosis de 1 mg/kg dos veces al día en los días 2º, 3º y 4º después de la contaminación.

Grupo 4 - 10 ratones. Se administró por vía intravenosa aislado clínico de Candida Albicans a una dosis LD50. Se administró amfotericina B por vía intraperitoneal a una dosis de 20 mg/kg dos veces al día en los días 2º, 3º y 4º después de la contaminación.

Grupo 5 - 10 ratones. Se administró por vía intravenosa aislado clínico de Candida Albicans a una dosis LD50. Se administró tampón fosfato por vía intraperitoneal como control negativo dos veces al día en los días 2º, 3º y 4º después de la contaminación.

La viabilidad de los ratones y su peso se estimó en el 7º día después de la contaminación. Los resultados se presentan en la tabla 2.

Tabla 2

Viabilidad de los ratones a diferentes puntos temporales después de la contaminación

1 día: 3 días 5 días 7 días

Grupo 3: 100% 100% 100% 100%

Grupo 4: 100% 100% 100% 100%

Grupo 5: 100% 80% 50% 50%

El peso de los ratones del grupo 4 en el 7º día del experimento fue un 20% menor que en el grupo 3. Este hecho indica que anfotericina B es más tóxica que la dornasa alfa, aunque sus eficacias de protección son iguales.

De este modo, ADN sanguíneo extracelular de los animales infectados posee influencia negativa sobre el desarrollo del proceso infeccioso y, de acuerdo con el método reivindicado, su destrucción es eficaz en el tratamiento de infecciones por hongos.

Aplicación industrial

Para la realización de los métodos se utilizaron materiales y equipos fabricados bien conocidos en condiciones de planta y, de acuerdo con lo mencionado anteriormente, la presente invención cumple con los requisitos de los criterios de "aplicación industrial" (IA).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Enzima ADNasa para su utilización en el tratamiento de enfermedades provocadas por hongos asociadas con

cambios cualitativos y/o cuantitativos en la composición del ADN sanguíneo extracelular, en el que la ADNasa se 5 introduce en la circulación sanguínea sistémica.
2. Enzima ADNasa, según la reivindicación 1, en la que el enzima ADNasa se introduce en dosis suficientes para proporcionar un cambio en el perfil electroforético del ADN sanguíneo extracelular, en la que la enzima ADNasa se introduce en dosis y regímenes que proporcionan actividad hidrolítica del ADN del plasma sanguíneo, medida en el

10 plasma sanguíneo, que es mayor de 150 unidades Kunitz por litro de plasma durante más de 12 horas en total dentro de un periodo de 24 horas.