ES2435041T3 - Modulación medida por EPH/EFRINA de la adherencia celular metástasis de células tumorales - Google Patents

Abstract

Anticuerpo dirigido a un dominio de interacción con efrina de un receptor EphA3 para su uso en la prevención,demora o inhibición de metástasis de células tumorales, en el que se modula la capacidad de una célula tumoral queexpresa dicho receptor EphA3 para responder a la unión a efrina en un mamífero y se mejora la repulsión alcontacto celular entre dicha célula tumoral y otra célula que expresa dicha efrina.

Description

Modulación mediada por EPH/EFRINA de la adherencia celular y metástasis de células tumorales

SECTOR DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la modulación de la adherencia celular y la repulsión celular. Más particularmente, la presente invención se refiere a la modulación de la adherencia celular y la repulsión al contacto celular en respuesta a la unión de efrina por las células que expresan receptores Eph. Una característica particular de la presente invención es que la repulsión celular y la adherencia celular se desencadenan por diferentes vías dependientes, del tipo de célula y de la actividad quinasa de Eph en respuesta a la unión de efrina. Por consiguiente, la presente invención se refiere en particular a la prevención, inhibición o retraso de la metástasis de células tumorales a través de la modulación de las interacciones de unión del receptor de Eph-efrina y posterior internalización y señalización del receptor Eph.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los receptores Eph y sus ligandos de efrina unidos a la membrana actúan como señales celulares de orientación que coordinan el movimiento de las células y capas celulares por la mediación de señales repulsivas o de adherencia (Boyd y Lackmann, 2001). La repulsión de célula a célula inducida por efrina dependiente del contacto celular se basa tanto en las señales del receptor activo de la tirosina quinasa (Lawrenson y otros, 2002), como en la escisión proteolítica regulada del ligando para interrumpir las interacciones multivalentes receptor/ligando de alta afinidad (Hattori y otros, 2000). La expresión de variantes de empalme de EphA que carecen del dominio de la quinasa durante el desarrollo de ratones puede cambiar las respuestas celulares al mismo receptor de repulsión de contacto a adherencia de célula a célula (Holmberg y otros, 2000). En la actualidad, es evidente a partir de estos y otros estudios que, en ausencia de la función de señalización citoplásmica del receptor Eph y la falta de escisión de la unión Eph/efrina (Hattori y otros, 2000), la repulsión del contacto celular cambia a adherencia de célula a célula. Además, la activación del receptor Eph puede aumentar la adherencia célula-sustrato (Holmberg y Frisen, 2002) por interferecia a las integrinas ávâ3 o á5â1, aumentando su afinidad por sus ligandos vitronectina o fibronectina (Huynh-Do y otros, 1999, Becker y otros, 2000). El análisis de los mutantes de Eph y efrina mutantes durante diferentes procesos de desarrollo en C-elegans y ratón ha hecho hincapié en la importancia de la repulsión celular, la adherencia celular, mediadas por Eph/efrina, así como la señalización de Eph dependiente de quinasa e independiente de quinasa (George y otros, 1998 , Wang y otros, 1999, Birgbauer y otros, 2001, Kullander y otros, 2001, Birgbauer y otros, 2000).

Hay pocos indicios de la función receptor Eph/efrina en tejido adulto normal, pero cada vez más pruebas dan a entender que estas familias de moléculas están involucradas en la progresión del cáncer y la neovascularización del tumor (Dodelet y Pasquale, 2000, Ogawa y otros, 2000). Sin embargo, al contrario de las funciones de desarrollo bien definidas de los receptores Eph y las efrinas, su función en la biología celular del cáncer sólo se está comenzando a explorar (Batlle y otros 2002). El EphA3, aislado originalmente como antígeno en la superficie de las células pre-B linfoblásticas LIC63 (Boyd y otros, 1992), está sobreexpresado en varios tumores, incluyendo cáncer de pulmón, neuroblastoma, tumores cerebrales y renales y melanoma (Wang y Anderson, 1997, Wicks y otros, 1992, Chiari y otros, 2000). Recientemente, el EphA3 fue redescubierto como antígeno tumoral involucrado en una respuesta de rechazo al tumor de un paciente con melanoma (Chiari y otros, 2000).

Lawrenson y otros, J Cell Science (2002) 115 (5): 1059-1072 describen que los receptores Eph y las efrinas están sobreexpresadas en una gama de tumores y que la activación de EphA3 induce retracción de las protusiones celulares, redondeo celular, aparición de protuberancias en la membrana y la desadherencia y que el agrupamiento de receptores mediados por efrina A5 y la actividad de la tirosina quinasa de EphA3 son esenciales en esta respuesta.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

Los presentes inventores se han dado cuenta de la necesidad de comprender mejor el significado funcional de la expresión del receptor Eph y las interacciones Eph-efrinas a través de los cada vez más diversos tipos de células tumorales que expresan receptores de Eph.

Sorprendentemente, los presentes inventores proponen que se produce tanto adherencia celular como repulsión al contacto celular en respuesta a la unión a efrina, siendo la respuesta concreta dependiente del tipo de célula tumoral que expresa el receptor Eph.

Por lo tanto, la presente invención se refiere, en términos generales, a la modulación de la adherencia celular, la repulsión al contacto celular, invasión y/o metástasis mediante la modulación del sistema receptor Eph-efrina.

En un aspecto, la presente invención da a conocer un anticuerpo contra el dominio de interacción de efrina de un receptor EphA3, para su uso en la prevención, demora o inhibición de metástasis de células tumorales mediante la

modulación de la capacidad de una célula tumoral que expresa dicho receptor EphA3 de responder a la unión a efrina en un mamífero, con lo que se mejora la repulsión al contacto celular entre dicha célula tumoral y otra célula que expresa dicha efrina.

En un segundo aspecto, se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo dirigido a un dominio de interacción de efrina de un receptor EphA3, para su uso en la prevención, demora o inhibición de metástasis de células tumorales mediante la modulación de la capacidad de una célula tumoral que expresa dicho receptor EphA3 de responder a la unión a efrina en un mamífero, con lo que se mejora la repulsión al contacto celular entre dicha célula tumoral y otra célula que expresa dicha efrina.

Un ejemplo de célula tumoral, según esta realización, es una célula de melanoma maligno o una célula de tumor renal. Los modelos experimentales de dichos tipos de células son células de melanoma LiBr o células de riñón epitelial humanas, células (HEK) 293.

Cuando se va a inhibir o reducir la adherencia célula-célula, la célula tumoral responde normalmente a la unión a efrina mediante la adherencia a otra célula que expresa la efrina unida.

Un ejemplo de dicha célula tumoral es una célula tumoral linfoblástica, tales como células de leucemia pre-B. Un modelo experimental de dicho tipo de célula es LK63.

Preferentemente, el receptor Eph es EphA3.

Preferentemente, la efrina es efrina A5.

También se da a conocer en el presente documento un método para identificar un agente que modula la adherencia celular y/o repulsión celular, incluyendo dicho método la etapa de determinar si dicho agente modula la adherencia celular o repulsión celular en respuesta a la unión a efrina.

También se da a conocer en el presente documento una composición farmacéutica que comprende un agente para su uso en la modulación de la adherencia celular mediada por receptor Eph-efrina, junto con un diluyente o excipiente portador farmacéuticamente aceptable.

También se da a conocer el uso de un agente que modula la adherencia celular y repulsión al contacto mediados por receptor dirigido específicamente hacia células tumorales que expresan el receptor Eph y mediante la internalización en los lisosomas de estas células y la liberación de un fármaco citotóxico injertado en el ambiente ácido que destruirá las células tumorales diana.

En el presente documento, a menos que se indique lo contrario, "comprenden", "comprende" y "que comprende" se utilizan de forma inclusiva en vez de exclusivamente, de modo que un número entero indicado o grupo de números enteros pueden incluir uno o más números enteros o grupos de enteros no declarados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. La efrinaA5 unida a la superficie causa o bien repulsión celular o adherencia celular de las células tumorales positivas a EphA3.

(A)

Se sembraron células de leucemia pre-B humanas LK63 positivas a EphA3 y células de melanoma LiBr en cubreobjetos de vidrio recubiertos con efrina-A5-Fc (efrina, 10 µg/ml) o fibronectina (FN, 10 µg/ml). Después de 4 h, el citoesqueleto de las células adherentes fijas se tiñó con rodamina-faloidina. Se muestran fotografías de imágenes de fluorescencia representativas, la segunda columna representa secciones ampliadas de la primera. Barra de escala: 20 i m.

(B)

La adherencia de LK63 y la desadherencia de LiBr a la efrinaA5 unida a la superficie son dependientes de la dosis. Se sembraron LK63 (2x105 células/pocillo) y células LiBr (5x104 células/pocillo) en pocillos de placas de cultivo de 96 pocillos injertados con proteína A que se habían recubierto con efrinaA5-Fc a densidades indicadas. Se añadió efrinaA5 monomérica soluble como inhibidor (+ inhibidor) a cultivos de LK63 y LiBr en paralelo a 100 veces el exceso molar antes de la siembra. Después de 4 horas de incubación, las células adherentes, que resistieron un lavado riguroso, se cuantificaron mediante ensayo XTT (absorbancia A492). La fijación celular se expresa como porcentaje (media, S.E. de tres ensayos independientes) en relación a los pocillos que contienen la mayoría de células adherentes; ( ), LK63 y ( ), células LiBr y ( ), LK63, ( ), células LiBr con inhibición de efrina (+ inh.).

(C)

Las células de melanoma LiBr en cámaras de migración Basement Membrane recubiertas con matrigel (Becton Dickinson, 5x104/pocillo) se expusieron a medios condicionados 3T3 quimiotácticos (medios cond.) o 1,5 i g/ml de efrina-A5 Fc preagrupadas en la cámara inferior, o con 5 i g/ml de efrina-A5 Fc preagrupadas colocadas junto con las células en la cámara superior. Después de 6-7 h, se eliminaron las células no invadidas de la parte superior de la membrana de oclusión (8i m), se tiñeron las células que habían pasado a través de los poros (Diff-Quick Fisher Scientific) y se contaron. Se muestran 15 números de células promedio de 3 experimentos independientes (panel superior). Alternativamente, las células LiBr que habían sido teñidas con Cell Tracker Green CMFDA (Molecular

Probes) se incubaron con células HEK 293/efina-A5 (cada uno, 5x104/pocillo) en la cámara superior y las células invasoras en la parte inferior de la membrana se contabilizaron en el microscopio de fluorescencia. Para inhibir la repulsión al contacto celular entre células HEK 293/efina-A5 y las células LiBr, se añadió efrina A5-Fc soluble (no agrupadas) en la cámara de la parte superior, tal como se indica.

Figura 2. Adherencia célula-célula facilitada por EphA3/efrinaA5.

A) Se añadieron células de leucemia pre B LK63 a los cultivos de neuronas d.14.5-corticales de ratón positivas a efrinaA5 (paneles I-III), células efrinaA5/HEK 293 (paneles 25 V-VII) o células HEK293 parentales (panel VIII), crecidas en cubreobjetos de vidrio recubiertos con fibronectina. Para interrumpir las interacciones EphA3/efrinaA5, se añadió efrina5 monomérica soluble para a algunos cultivos (panel III, VII) en exceso molar de 100 veces. Se eliminaron las células no adherentes y las células adherentes restantes se tiñeron con rodamina-faloidina. Se utilizaron anticuerpos anti DCC (I-III) y anti efrinaA5 30 (IV) para teñir las neuronas d.14.5-corticales (IV) y efrinaA5 endógena, respectivamente. Los paneles II y VI representan secciones ampliadas de los paneles I y V. Barra de escala: 20 im. B) Se incubaron células en cubreobjetos recubiertos con fibronectina con cantidades limitantes de EphA3-Fc de Alexa para visualizar efrinaA5 en la superficie celular. Después de la adición de las células LK63 a las monocapas de efrinaA5/HEK 293 lavadas, se fusionaron imágenes en microscopio fluorescente (rojo) y de luz (gris) seleccionadas tomadas a intervalos de 20 seg en un período de tiempo de 32 min para esta representación. Barra de escala: 20 i m.

Figura 3. La adherencia de las células LK63 mediada por EphA3 es independiente de las interacciones VCAM e ICAM.

A) Se añadieron células LK63 a células efrinaA5/HEK 293 (II, III, VI, VII) y HMVEC (IV, VIII-XII), en ausencia (IX-XII)

o presencia de una función de bloqueo de los anticuerpos á-VCAM-(II) y á-ICAM-(VI) solos, o en combinación (III, IV, VII, VIII). Después de 60 min, el citoesqueleto de actina de las células que permanecen unidas y los anticuerpos á-VCAM y á-ICAM unidos a las células se tiñeron con rodamina-faloidina (II-IV, VI-VIII, IX-XII) y con anticuerpos secundarios conjugados a Alexa 488 (III, IV, VII, VIII), respectivamente. Se muestran imágenes microscópicas fusionadas (Alexa, verde; rodamina, rojo) (II-IV, VI-VIII). Se examinó la expresión de VCAM 15 y de ICAM en células LK63 fijadas con anticuerpos á-VCAM (I) y á-ICAM (V). Se analizó en paralelo la adherencia independiente de EphA3 de las células LK63 a HMVEC tratadas con LPS (paneles XI, XII, +LPS), o sin tratar (paneles IX, X, -LPS). Los detalles en los paneles III, IV, IX, XI se muestran en un aumento de 2 veces (VII, VIII, X, XII). Barra de escala: 20 i m. B) La adherencia célula a célula se cuantificó mediante el conteo de las células LK63 que permanecen unidas a las células efrina-A5/293 ( ) no tratadas, tratadas con á-ICAM-1/á-VCAM o de control tratadas con IgG, o HMVEC () no tratadas, tratadas con LPS o LPS y á-ICAM-1/á-VCAM en un mínimo de cuatro secciones microscópicas representativas de ampliación 10x. Se muestran el número promedio de células y S.E.

Figura 4. La repulsión mediada por Eph/efrina, pero no la adherencia, conduce a la internalización de efrinaA5.

(A)

Se estimularon células EphA3/HEK 293 sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con fibronectina con efrinaA5-Fc Alexa agrupados previamente. Las imágenes microscópicas confocales fluorescentes representan puntos de tiempo seleccionados durante un periodo de tiempo de 60 min., comenzando 5 min antes de la adición de efrina. Barra de escala: 20 i m.

(B)

En un experimento en paralelo, las células LK63 se trataron tal como se describe en (A) y se analizaron para la determinación de la efrinaA5 Alexa por microscopía confocal. Barra de escala: 20 i m.

(C)

Las células EphA3/HEK 293 se trataron con con efrinaA5-Fc Alexa agrupados previamente en ausencia (I) o en presencia del “bloque Fc” (II), o con efrinaA5-Fc Alexa no agrupados (III). Las células fijadas después de 30 min de estimulación se montaron sobre portaobjetos y se analizaron por microscopía de fluorescencia confocal.

(D)

Antes de la estimulación con efrinaA5-Fc Alexa agrupados previamente, los compartimentos lisosomales de las células EphA3/HEK 293 se tiñeron con verde LysotrackerTM y se monitorizó la translocación de los complejos receptor/ligando a los lisosomas por microscopía confocal de lapso de tiempo (“time-lapse”), llevada a cabo secuencialmente a dos longitudes de onda de excitación. Se fusionaron las imágenes verdes (LysotrackerTM) y rojas (Alexa Fluor 546) resultantes en los intervalos de tiempo indicados.

Figura 5. La adherencia y repulsión celular mediada por EphA3 implican vías bioquímicas distintas.

(A)

Se analizaron por transferencia Western inmunoprecipitados de anti-EphA3 de lisados de Triton-X100 de células EphA3/HEK 293 (columna derecha) o LK63 (columna izquierda), tratadas durante los 15 tiempos indicados con efrinaA5-Fc Alexa agrupados previamente, con anticuerpos anti-EphA3, anti-fosfotirosina, anti c-Cbl y anti SHP2, tal como se indica .

(B)

Se analizó la fosforilación inducida por efrina-A5 de c-Cbl en los inmunoprecipitados anti-fosfotirosina de lisados de Triton-X100 de células EphA3/HEK 20 293 tratadas durante los tiempos indicados con efrinaA5, utilizando anticuerpos anti-EphA3 y anti c-Cbl, tal como se indica.

(C)

La estimulación de las células EphA3/HEK 293, pero no de las células LK63, resulta en la ubiquitinación de

EphA3 en la membrana plasmática. Se analizaron fracciones de membrana plasmática o inmunoprecipitados anti-EphA3 derivados de células EphA3/HEK 293 o de células LK63 estimuladas con efrinaA5 en transferencias Western con anticuerpos contra EphA3 y ubiquitina, tal como se indica.

Figura 6. La repulsión célula a célula mediada por Eph/efrina, pero no la adherencia, conduce a la escisión de efrina5 por una metaloproteasa.

(A)

Se añadieron proteínas de control Alexa efrinaA5-Fc (I, III) o Alexa EphA1 Fc (II), 30 conjugadas sobre Dynabeads recubiertas con proteína A a cultivos de células EphA3/HEK 293 (I, II) o células LK63 (III). La escisión y la internalización de las proteínas fluorescentes se monitorizó por microscopía confocal. Se muestran imágenes seleccionadas de los experimentos de lapso de tiempo confocales (1 marco/min). La fluorescencia de Alexa 546 está representada en blanco y se esbozan las células en los paneles I, mientras que las células en los paneles II, III, aparecen de color gris oscuro o negro.

(B)

Antes de la estimulación (30 minutos) con perlas recubiertas con Alexa efrinaA5-Fc (I, II) o con perlas de control Alexa Fc (III), cultivos paralelos de células EphA3/293 fueron tratados durante 4 h con 5 mM de 1',10'-O-fenantrolina

(II)

o se dejaron sin tratar (I, III). Las células, fijadas en 4% de PFA, se analizaron para la determinación de la escisión y la internalización de las proteínas marcadas mediante microscopía confocal de fluorescencia.

(C)

Los inmunoprecipitados anti-EphA3 de células LK63, LiBr o EphA3/293 no estimuladas (-) o estimuladas con efrinaA5 (+) se analizaron por transferencia Western con anticuerpos anti-ADAM10 y anti-EphA3, tal como se indica.

(D)

Demostración bioquímica de la escisión de efrina. Utilizando un constructo EphA3-Fc, se inmunoprecipitó efrina-A5 a partir de lisados de células EphA3/HEK 293 o células LK63, que habían sido tratadas durante los tiempos indicados con 7,5 µg/ml de efrina-A5 Fc agrupados previamente (+ X-Ink) o no agrupados (-X-Ink), y se analizaron para determinar la escisión de efrina por transferencia Western con el anticuerpo anti-efrinaA5. Para evaluar la escisión por metaloproteasas, cultivos paralelos se trataron con 1',10'-O-fenantrolina (+ OPN) o se dejaron sin tratar.

Figura 7. Células HEK293 con fosforilación del receptor Eph inducida por pervanadato, que expresan EphA3GFP (A)

o 3YF EphA3GFP (B) se incubaron con pervanadato (30 min) a las concentraciones indicadas. Las células fijadas se examinaron para determinar FRET, tal como se describió anteriormente. Izquierda, fluorescencia de GFP; derecha, Mapas de fase de vida de fluorescencia de GFP. Códigos de color tabulados indican vida de GFP en ns.

Figura 8. La inhibición de fosfatasa activa la fosforilación de EphA3 en células LK63

(A)

Los inmunoprecipitados Anti-EphA3 de lisados en TritonX100 de células de melanoma EphA3/HEK 293, EphA3/AO2 y células de leucemia LK63 se trataron ya sea con efrina A5 reticulada o con concentraciones crecientes de pervanadato de sodio, tal como se indica, y se analizaron por transferencia western con anti-fosfotirosina.

(B)

Los inmunoprecipitados Anti-EphA3 de lisados en TritonX100 de células de melanoma EphA3/HEK 293 (panel izquierdo) y EphA3/AO2 (panel derecho) tratadas con vanadato o peróxido de hidrógeno se analizaron tal como se describe en (A).

Figura 9. La inhibición de fosfatasa abroga la adherencia celular mediada por efrina. Se trataron células LK63, sembradas sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con efrina o FN, tal como se describe en la Figura 1A con vanadato (vanadato) o se dejaron sin tratar (sin vanadato). Después de 4 h, el citoesqueleto de las células adherentes fijas se tiñó con rodamina-faloidina. Se muestran fotografías de imágenes de microscopía de fluorescencia representativas. Barra de escala: 20 i m.

Figura 10. LMW-PTP modula la fosforilación de EphA3

(A)

Asociación de LMW-PTP endógeno y recombinante con EphA3. Se analizaron los inmunoprecipitados Anti-EphA3 de lisados de células de melanoma EphA3/HEK 293, EphA3/AO2 y AO9 que expresan EphA3, o lisados de células EphA3/HEK 293 transfectadas transitoriamente con LMW-PTP w/t o dominante negativo (d/n) mediante transferencia Western con anti-LMW-PTP.

(B)

Las células EphA3/293T fueron transfectadas transitoriamente con LMW-PTP w/t o d/n. Los inmunoprecipitados Anti-EphA3 de lisados en Triton100 de células estimuladas con efrina-A5 reticulada se analizaron por transferencia Western con anti-fosfotirosina.

Figura 11. LMW-PTP modula los cambios en la morfología celular mediados por EphA3. Células EphA3/HEK 293 se transfectaron transitoriamente con el vector vacío o ADNc que codifican LMW-PTP w/t o d/n, tal de como se indica. Las células no estimuladas o estimuladas con efrina-A5 Fc (agrupados previamente) sobre cubreobjetos recubiertos con fibronectina se analizaron mediante tinción con Alexa-faloidina para determinar cambios en el citoesqueleto por microscopía confocal.

Figura 12. La actividad de la quinasa EphA3 es esencial para la respuesta de repulsión

(A) Se estimularon células de melanoma AO2, transfectadas de forma estable con EphA3 w/t, 3XYF/EphA3, K570Stop/EphA3, K653M/EphA3 o células parentales no transfectadas sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con fibronectina con 10 nM de efrina-A5 Fc agrupados, mientras que cultivos en paralelo se dejaron sin estimular. Las

muestras fijas y teñidas con faloidina 488 Alexa se analizaron para determinar sus características del citoesqueleto celular por microscopía confocal.

(B) Células de melanoma cultivadas, como mínimo, durante 4 horas a densidades definidas en placas de 96 pocillos recubiertos con fibronectina fueron estimuladas con efrina-A5, tal como se describe en (A). Las células adherentes, que resistieron un lavado riguroso, se cuantificaron mediante ensayo XTT (absorbancia A492). La fijación de las células se expresa como porcentaje (Media, S.E. de pocillos por cuadruplicado) relativo a los pocillos que contienen la mayoría de las células adherentes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención, al menos en parte, surge de la comparación de los presentes inventores de las respuestas biológicas y bioquímicas celulares a efrinaA5 de diferentes células cancerosas que expresan EphA3. Las células de leucemia LK63 normalmente crecen en suspensión, pero se adhieren a efrinaA5 unida a la superficie y a células que expresan efrinaA5 y experimentan cambios morfológicos celulares dramáticos. Sorprendentemente, la activación de EphA3 de células de melanoma LiBr induce la retracción de las protrusiones celulares, el redondeo celular y las desadherencia. Más particularmente, la repulsión celular implica una rápida escisión y la internalización de efrina mediada por metaloproteasas, fosforilación pronunciada de EphA3 y ubiquitinación de c-Cbl y EphA3. Sin embargo, se observa poca o ninguna escisión de efrina en ausencia de agrupación o en células defectuosas en quinasa EphA3 y no se observa escisión de efrinaA5 o internalización de EphA3/efrinaA5 en células LK63, que muestran sólo fosforilación de EphA3 marginal y reclutan la tirosina fosfatasa SHP-2 después de la exposición a efrina-A5. Por lo tanto, la repulsión y la adherencia celular, así como la escisión y la internalización de efrinaA5 son específicas para la interacción Eph/efrina y depende de la efrinaA5 agrupada artificialmente o unida a la superficie. De este modo, se pueden inhibir competitivamente con efrinaA5 no agrupada. Vías de señalización dispares del mismo receptor Eph ordenan ya sea la repulsión célula a célula o la adherencia de las células cancerosas. Mientras la repulsión celular es un mecanismo importante para el desalojo de las células del sitio primario, una inversión de la función de EphA3 de repulsión celular a adherencia celular puede proporcionar un mecanismo de acoplamiento para células tumorales que hacen metástasis.

Como se apreciará a partir de lo anterior, la presente invención contempla la modulación de la repulsión celular entre las células que expresan, respectivamente, un receptor Eph o un efrina. Por consiguiente, se entenderá que por lo general, estas células expresan una efrina o receptor Eph "endógenos", aunque también es posible que estas células podrían modificarse por ingeniería genética para expresar un receptor Eph o efrina recombinantes que no se expresan normalmente por la célula o células.

En consecuencia, se contempla la utilización de un agente en forma de una efrina y/o receptor Eph "exógenos", típicamente aunque no exclusivamente una proteína recombinante en forma soluble y, en ciertas realizaciones, recombinante como una proteína de fusión con otra molécula tal como una porción Fc de un anticuerpo conjugado a un fármaco citotóxico o un radioisótopo.

Por lo tanto, la presente invención se refiere, en términos generales, a la manipulación de las interacciones y la señalización aguas abajo de receptor Eph-efrina, tales como asociado con la escisión proteolítica, la internalización de la efrina unida al receptor Eph y la fosforilación mediada por el receptor Eph, para modular así la repulsión celular y la metástasis del tumor. Esto puede lograrse, en particular, mediante los inhibidores de la interacción proteínaproteína, preferentemente la propia efrina no agrupada. Además, por la orientación de las células que expresan receptores Eph interactivos efrina-A5 (EphA2 - 5, EphA7, 8, EphB2) la presente invención da a conocer un método que destruye selectivamente estas células mediante la liberación de un fármaco citotóxico de conjugado efrina-A5 hidrolizable tras la internalización mediada por el receptor Eph de dicho conjugado.

En vista de lo anterior, se apreciará que la metástasis de células tumorales puede ser manipulada en varios niveles, incluyendo células tumorales que se extienden desde el sitio original, la colonización de nuevos sitios de tumor y la neovascularización según el tipo de célula en cuestión.

Por ejemplo, la administración de un agente tal como una efrina soluble (por ejemplo, en forma de efrina-A5 o una proteína de fusión efrina-A5/Fc humano, efrina-A5-Fc) como un inhibidor competitivo, o efrina-A5-Fc conjugado a través de un enlace lábil a ácidos a un reactivo citotóxico (tal como caliqueamicina hidrolisable (Hamann y otros, 2002) puede reducir o inhibir la unión de las células LK63 a las células que expresan efrina o inducir la destrucción de las células LK63.

Aunque no se desea estar ligado a ninguna teoría en particular, es posible que también la desadherencia de las células tumorales puede conducir a la apoptosis de las células tumorales.

Por el contrario, la administración de un agente tal como un efrina soluble o dominio de unión del ligando del receptor Eph soluble, por ejemplo en forma de efrina-A5-Fc soluble o EphA3-Fc soluble, puede reducir o inhibir la repulsión célula a célula del melanoma LiBr.

También se apreciará que se contempla un agente tal como una efrina "agrupada", "agregada" o " anclada a

superficie", para la utilización en la inducción de repulsión celular y para mejorar su absorción en las células tumorales que expresan EphA3.

La presente invención también se refiere a la utilización de un anticuerpo dirigido a una efrina para bloquear, inhibir o reducir la adherencia entre la célula que expresa el receptor Eph y dicha otra célula que expresa dicha efrina.

La presente invención se refiere a la utilización de un anticuerpo dirigido a una interacción de efrina o dominio de unión de un receptor Eph para mejorar la repulsión entre la célula que expresa el receptor Eph y dicha otra célula que expresa dicha efrina.

Por ejemplo, en una realización particular, la presente invención se refiere a la utilización de un anticuerpo dirigido a un dominio de interacción efrinaA5 de dicho receptor Eph.

Esta realización se apoya en la observación sorprendente de que la exposición de las células HEK 293 a efrina-A5 y el mAb anti-EphA3 IIIA4, en combinación, da como resultado una respuesta morfológica de las células mejorada que conduce al redondeo pronunciado y a la separación. Además, los niveles de fosforilación de tirosina EphA3 en células tratadas con IIIA4 o estimuladas con efrina A5 aumentaron de forma dependiente de la dosis y del tiempo, pero se amplificaron dramáticamente en células tratadas con IIIA4 no agrupado o agrupado previamente en combinación con efrina-A5 Fc (datos no mostrados).

Se incluyen entre otros agentes moléculas que impiden la asociación de las proteasas con EphA3 o efrina-A5 o nhiben la actividad de las metaloproteasas asociada con la escisión de efrina, la internalización y la repulsión celular.

En casos particulares, la presente invención se refiere a la utilización de los inhibidores de ADAM10 y/o metaloproteasas relacionadas.

La presente invención también se refiere a agentes que regulan la fosforilación de la tirosina intracellullar, y más particularmente la fosforilación del receptor Eph, para modular la adherencia celular. Como se describirá con más detalle a continuación, la adherencia célula-célula mediada por el receptor Eph parece resultar de la actividad del receptor de la tirosina quinasa Eph modulada hacia la baja.

Un ejemplo particular de dicho agente es un inhibidor de la actividad de la proteína tirosina fosfatasa para aumentar de este modo la fosforilación del receptor de tirosina Eph y promover la repulsión al contacto o separación de las células que pudieran adherirse a las células que expresan efrina.

Se describen inhibidores específicos de la proteína tirosina fosfatasa SHP-2, LMWPTP y/o proteínas tirosina fosfatasas relacionadas.

Además, la presente invención se refiere a proteínas de fusión hidrolizables entre efrina-A5 y un fármaco citotóxico, tal como caliqueamicina, que inducirán específicamente la destrucción celular tras la internalización de efrina-A5 mediada por el receptor Eph y la translocación en los lisosomas.

La presente invención también se refiere a derivados de efrina-A5 conjugados con metales radiactivos tales como111In o 90Y que inducirán la destrucción celular tras la internalización de efrina-A5 mediada por el receptor Eph.

Se incluyen entre otros agentes adionales mutantes, agonistas, análogos, antagonistas, anticuerpos y miméticos de efrinas que se producen o se diseñan para su utilización en la modulación de la adherencia celular y/o repulsión celular mediante la orientación hacia las interacciones de unión del receptor Eph-efrina y/o la señalización intracelular específicamente asociada con la adherencia celular y/o repulsión celular.

Los miméticos, agonistas, antagonistas, reactivos y análogos orientados hacia tumores citotóxicos derivados de efrina mencionados anteriormente pueden ser péptidos, polipéptidos u otras moléculas orgánicas, preferentemente moléculas orgánicas pequeñas, con una actividad biológica y tiempo de vida media deseados.

Con respecto a las efrinas mutantes, éstas se pueden ser crear por mutagénesis de la proteína no modificada, o por mutagénesis de un ácido nucleico de codificación, tal como por mutagénesis aleatoria o mutagénesis dirigida al sitio. Se da a conocer ejemplos de métodos de mutagénesis de ácidos nucleicos en el capítulo 9 de CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel y otros, mencionado anteriormente.

Se incluyen entre los métodos de mutagénesis aleatoria la modificación química de proteínas por hidroxilamina (Ruan y otros. 1997, Gene 188 35), la incorporación de análogos de dNTP en ácidos nucleicos (Zaccolo y otros, 1996, J. Mol. Biol., 255 589) y la mutagénesis aleatoria basada en PCR tal como se describe en Stemmer, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 10747 o Shafikhani y otros, 1997, Biotechniques 23 304. También se observa que están disponibles comercialmente kits de mutagénesis aleatoria basados en PCR, tales como el kit DiversifyTM (Clontech).

Los agentes moduladores de Eph de la presente invención también pueden ser identificados mediante el cribado de bibliotecas de moléculas tales como bibliotecas químicas sintéticas, incluyendo bibliotecas combinatorias, mediante métodos tales como los descritos en Nestler y Liu, 1998, Comb. Chem. High Throughput Screen. 1 113 y Kirkpatrick y otros, 1999, Comb. Chem. High Throughput Screen 2 211.

La presente invención también se refiere a que las bibliotecas de moléculas de origen natural pueden ser cribadas mediante la metodología tal como se describe en Kolb, 1998, Prog. Drug. Res. 51 185.

Una estrategia alternativa es utilizar búsquedas en bases de datos de estructuras asistidas por ordenador, por ejemplo para la identificación y el diseño de miméticos de efrinas. Los métodos de búsqueda en bases de datos que, en principio, pueden ser adecuados para la identificación de miméticos, se pueden encontrar en la publicación internacional WO 94/18232 (referida a la preparación de miméticos de antígenos de VIH), en la Patente de Estados Unidos Núm. 5.752.019 y en la publicación internacional WO 97/41526 (referida a la identificación de miméticos de EPO).

Se incluyen entre otros métodos una variedad de técnicas biofísicas que identifican interacciones moleculares, tales como ensayos de unión de radioligandos competitivos, ultracentrifugación analítica, microcalorimetría, resonancia de plasmón de superficie y métodos basados en biosensores ópticos. Se dan a conocer ejemplos de estos métodos en el Capítulo 20 de CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Coligan y otros, (John Wiley e hijos, 1997), que se incorpora como referencia en el presente documento.

Será evidente que la presente invención no se limita a las realizaciones mencionadas anteriormente que han sido ejemplificadas en el presente documento. La presente invención da a conocer un nuevo principio, a saber, que las interacciones de unión de receptor Eph-efrina pueden ser manipuladas de una manera específica del tipo de célula para afectar con ello la migración y la repulsión celular.

Con respecto a la metástasis de células tumorales, la presente invención es aplicable a cualquier tipo de células tumorales en las que receptor Eph-efrina media la adherencia celular y/o la repulsión de celular. Se incluyen entre los ejemplos no limitativos de dichas células tumorales leucemias y linfomas, cáncer de pulmón y de colon, neuroblastoma, tumores cerebrales, renales y de riñón, cánceres de próstata, sarcomas y melanomas.

Para una revisión más completa de los tumores potencialmente relevantes la persona experta se refiere a Nakamoto y Bergemann, 2002.

También será evidente que aunque la presente invención se ha ejemplificado con respecto a EphA3 y efrina A5, el principio de la invención que se expone en el presente documento puede aplicarse a las interacciones de efrina con otros receptores Eph, incluyendo EphB2, EphA2, EphA4, EphA5, EphA7, EphA8.

Aunque se ha puesto especial énfasis en la metástasis de células tumorales, la presente invención es aplicable en general a la modulación de los mecanismos de comunicación célula-célula que facilitan la migración, adherencia y repulsión, tales como a los efectos de la regeneración y modelado de tejidos y nervios, cicatrización de heridas, tratamiento de quemaduras y úlceras y regeneración ósea, por ejemplo.

Por consiguiente, la presente invención da a conocer composiciones farmacéuticas que comprenden un agente para utilizar en la modulación de la adherencia y/o repulsión celular mediada por receptor Eph-efrina.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden utilizar para modular la migración celular, la regeneración de tejidos y la cicatrización de heridas. Alternativamente, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar para prevenir o inhibir la metástasis de tumores.

La composición se puede utilizar en tratamientos terapéuticos o profilácticos según sea necesario. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden aplicar en forma de preparaciones terapéuticas o cosméticas para la reparación de la piel, la cicatrización de heridas, cicatrización de quemaduras, regeneración ósea y otros tratamientos dermatológicos.

De forma adecua, la composición farmacéutica comprende un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado.

Preferentemente, el vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable es adecuado para la administración a mamíferos, y más preferentemente, a seres humanos.

"Vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable”, se refiere a una carga, diluyente o sustancia encapsulante sólido o líquido, que puede utilizarse de manera segura en la administración sistémica. Dependiendo de la vía de administración concreta, se pueden utilizar una variedad de vehículos muy conocido en la técnica. Estos vehículos se pueden seleccionarse del grupo que comprende azúcares, almidones, celulosa y sus derivados, malta, gelatina, talco, sulfato de calcio, aceites vegetales, aceites sintéticos, polioles, ácido algínico, soluciones tampón de

fosfato, emulsionantes, solución salina isotónica y sales tales como sales de ácidos minerales incluyendo clorhidratos, bromuros y sulfatos, ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos y malonatos y agua libre de pirógenos.

Una referencia útil que describe vehículos, diluyentes y excipientes farmacéuticamente aceptables es Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. Nueva Jersey EE.UU, 1991) que se incorpora como referencia en el presente documento.

Se puede emplear cualquier vía de administración segura para proporcionar a un paciente la composición de la presente invención. Por ejemplo, se puede emplear la via oral, rectal, parenteral, sublingual, bucal, intravenosa, intraarticular, intramuscular, intradérmica, subcutánea, por inhalación, intraocular, intraperitoneal, intracerebroventricular, transdérmica y similares.

Se incluyen entre las formas de dosificación los comprimidos, dispersiones, suspensiones, inyecciones, soluciones, jarabes, pastillas, cápsulas, supositorios, aerosoles, parches transdérmicos y similares. También se pueden incluir entre estas formas de dosificación los dispositivos de liberación controlada por inyección o implante, diseñados específicamente para este propósito u otras formas de implantes modificados para actuar adicionalmente de esta manera. La liberación controlada del agente terapéutico se puede llevar a cabo por recubrimiento del mismo, por ejemplo, con polímeros hidrofóbicos, que incluyen resinas acrílicas, ceras, alcoholes alifáticos superiores, ácidos polilácticos y poliglicólicos y ciertos derivados de celulosa tales como hidroxipropilmetil celulosa. Además, la liberación controlada se puede llevar a cabo utilizando otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas.

Las composiciones anteriores se pueden administrar de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad que es farmacéuticamente eficaz. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, debe ser suficiente para efectuar una respuesta beneficiosa en un paciente durante un período de tiempo apropiado. La cantidad de agente o agentes a ser administrados puede depender del sujeto a ser tratado incluyendo edad, sexo, peso y estado general de salud del mismo, factores que dependerán del juicio del médico.

Para que la presente invención pueda entenderse más fácilmente y puesta en efecto práctico, la persona experta es referida a los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS

Métodos

Constructos de expresión y reactivos

La efrinaA5 de longitud completa se clonó en un vector de expresión de mamífero derivado de pEF-BOS que contiene un casete de resistencia a neomicina (pEF MC1neopA). La clonación de EphA3 de longitud completa (Wicks y otros, 1992) en pEF-Bos (Nicola y otros, 1996) se ha descrito previamente. Los plásmidos de expresión (pIgBOS) (Coulthard y otros, 2001) que codifican proteínas de fusión en las que cualquiera de los dominios extracelulares de efrinaA5 o EphA3 están fusionados a la bisagra y la región Fc de IgG1 humana (presente de A. van der Merwe, Universidad de Oxford) se utilizaron para transfectar células de ovario de hámster chino (CHO). Se purificaron EphA3-Fc y efrinaA5-Fc a partir de sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad con proteína A. Se purificó la efrinaA5 monomérica marcada con FLAG hasta homogeneidad a partir de sobrenadantes de células CHO transfectadas tal como se describió anteriormente (Lackmann y otros, 1997).

Un anticuerpo monoclonal (Mab) específico de EphA3 nativo (clon IIIA4) y anticuerpos policlonales de conejo purificados por afinidad se han descrito anteriormente (Boyd y otros, 1992; Lackmann y otros, 1997). Los anticuerpos y reactivos adicionales fueron adquiridos de Transduction Laboratories (á-c-Cbl), New England Biolabs (á-fosfotirosina), Santa Cruz (á-efrinaA5, á-SHP-2, á-ubiquitina), y Biogenesis (á-ADAM 10). Los anticuerpos secundarios marcados con HRP se obtuvieron los laboratorios Jackson (anti-ratón) y BioRad (anti-conejo). Los anticuerpos secundarios marcados con Alexa, rodamina-faloidina y LysoTracker (verde) se adquirieron de Molecular Probes. Los anticuerpos monoclonales anti CAM-1 y VCAM-1 humanos de reatón y fueron generosos presentes de Ian Wicks (The Walter y Eliza Hall Institute, Melbourne). El lipopolisacárido (LPS) se obtuvo de Sigma.

Cultivo Celular

La línea celular linfoblástica aguda de células pre-B LK63 y líneas de melanoma LiBr se describieron previamente (Boyd y otros, 1992, Lawrenson y otros, 2002) y se cultivaron en RPMI, 10% de FCS. Las células epiteliales de riñón humano 293 (HEK293, ATCC), se mantuvieron en DME, 10% de FCS. Las células endoteliales microvasculares humanas (HMVECs, Clonetics) se cultivaron en medio basal de células endoteliales (EBM, Clonetics), suplementado con 5% de FCS, glutamina, extracto de cerebro bovino (BBE), hidrocortisona y GA-1000 (gentamicina, anfotericina B). En cultivos conjuntos, las HMVEC se estimularon con LPS (1 µg/ml) o se dejaron sin tratar antes de la adición de las células LK63. Las neuronas corticales de ratón se aislaron de embriones E 14.5 y se cultivaron en medio basal neural (Gibco) suplementado con factores de crecimiento apropiados.

La transfección de células HEK 293 se llevó a cabo utilizando reactivo de transfección Fugene 6 (Roche Biochemicals), y se seleccionaron los clones de células que expresan EphA3 estable (EphA3/HEK 293) y efrinaA5 (efrina-A5/HEK 293) en 2 µg/ml de puromicina o 400 µg/ml de G418, por citometría de flujo utilizando Mab anti EphA3 o proteína EphA3-Fc para la detección, respectivamente.

Conjugados Alexa FluorTM 546 y Dynalbeads

EfrinaA5-Fc, EphA3-Fc, EphA1-Fc recombinantes y la proteína Fc humana recombinante purificadas se marcaron utilizando un kit de marcaje fluorescente Alexa FluorTM 546 (Molecular Probes). El acoplamiento del colorante ALEXA y su efecto sobre la integridad biológica de las proteínas efrina y Eph se monitorizó mediante análisis de unión espectral (HPLC detección por red de diodos) y BIAcore durante la reacción de marcaje. La unión específica de la proteína marcada al dominio extracelular de EphA3 o a Efrina A5 acoplados a chip sensores (efrina-A1), respectivamente (Lackmann y otros, 1997, Lackmann y otros, 1998) se utilizaron para indicar la integridad biológica. Las reacciones de marcaje se terminaron inmediatamente cuando se detectó la primera disminución en la unión.

El conjugado EfrinaA5-Fc Alexa FluorTM 546 (ALEXA efrinaA5-Fc) o una proteína de control no relevante marcada con ALEXA se inmovilizaron en Dynabeads recubiertas con Proteína-A (Dynalbiotech), según las instrucciones del fabricante.

Microscopía confocal e inmunocitoquímica

Se analizó la estimulación con Eph/efrina in situ mediante microscopía confocal de lapso de tiempo e inmunocitoquímica, tal como se ha descrito (Lawrenson y otros, 2002). Para monitorizar la internalización de los complejos EphA3/efrinaA5 y efrinaA5 que se pierden de las Dynabeads, se estimularon células sembradas en placas en cubreobjetos con proteínas de control marcadas con ALEXA efrinaA5-Fc o Alexa, ya sea no agrupadas o agrupadas previamente o acoplados a Dynabeads. Para visualizar la internalización de efrinaA5 en el compartimiento lisosomal, las células EphA3/HEK293 se incubaron con verde LysoTrackerTM. El exceso del colorante LysoTrackerTM se eliminó por lavado con los medios y se sustituyó con Alexa efrinaA5-Fc agrupados previamente. Durante el transcurso del tiempo, se recogieron imágenes secuencialmente a dos longitudes de onda de excitación para reducir al mínimo la superposición espectral entre los diferentes canales. La señales rojas (Alexa FluorTM 546) y verdes (LysoTrackerTM) resultantes y se separaron con un espejo dicroico y se filtraron adicionalmente con filtros de barrera colocados en frente de los detectores por separado.

Fraccionamiento celular:

El fraccionamiento celular y el aislamiento de las membranes plasmáticas se lograron utilizando un método de sílice coloidal catiónica tal como se describió en (Stolz y otros, 1992). En resumen, las células adherentes estimuladas con efrina se cosecharon en 10 mM de EDTA / PBS, se agruparon con las células separadas en el medio, se lavaron con PBS helado y se resuspendieron en 6% (p/p) de sílice coloidal catiónica en tampón de recubrimiento (MES 20 mM, NaCl 150 mM, sorbitol 280 mM) hasta la concentración final de 3% de sílice. Las células recubiertas con sílice se recuperaron por centrifugación (900 g) y se trataron con 1 mg/ml de ácido poliacrílico (Sigma) para bloquear las cargas residuales en la sílice. Las células lavadas se suspendieron en tampón de lisis (20 mM de Tris-HCl, pH 7,5 que contenía inhibidores de proteasas (CompleteTM, Boehringer), se lisaron a 4ºC por cavitación con nitrógeno (1200 psi, bomba Parr) y las membranas plasmáticas recubiertas de sílice y los núcleos celulares se recogieron por centrifugación.

Las membranas internas contenidas en el sobrenadante se separaron de la fracción citosólica por centrifugación a

100.000 g durante 30 min. El sedimento de membrana plasmática se estratificó en un colchón Opti-prep al 60% (Axis-Shield, Oslo, Noruega) en 20 mM de Tris, pH 7,5 y las membranas recubiertas de sílice purificadas se recogieron como sedimento después de la centrifugación (rotor SW 60 Ti) a 28000 g durante 20 min. El sedimento de membrana se disolvió en 0,5% de SDS y EphA3 se inmunoprecipitó de esta preparación de proteínas de membrana plasmática utilizando el Mab á-EphA3 IIIA4, y se analizó en conjunto con las proteínas totales contenidas en las otras fracciones celulares por análisis de transferencia Western.

Ensayos de adhesión:

Las superficies recubiertas con efrina se prepararon tal como se ha descrito previamente (Lawrenson y otros, 2002). Células LK63 (2x105 células/pocillo) privadas de suero (4h) y células LiBr (5x104 células/pocillo) se sembraron en pocillos recubiertos con efrinaA5-Fc a las densidades indicadas. Se añadió efrinaA5 monomérica soluble como inhibidor (+ inhibidor) a cultivos de LK63 y LiBr en paralelo a un exceso molar de 100 veces antes de la siembra. Después de 4 horas, y extensos protocolos de lavado (PBS), las células adherentes se incubaron con reactivo XTT (Roche) a 37ºC y se cuantificaron después de 4-12 h mediante la medición de la absorbancia A492. La fracción de células LK63 adherentes se estimó mediante la utilización de los valores en los pocillos que carecen de efrina y que contienen la mayoría de las células adherentes como puntos de referencia, y corregiendo para la absorbancia A492 en los pocillos que carecen de células LK63. Los datos se expresan como media +/- error estándar (S.E.) y son

representativos de tres experimentos independientes.

Inmunoprecipitación y transferencia Western

Células privadas de suero (4 h, 1% de FCS) se incubaron con efrinaA5-Fc agrupados previamente (1,5 i g), y en los tiempos indicados se lisaron en 50 mM de Tris, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1% de Triton X100, 1 mM de NaVO4, NaF 10 mM e inhibidores de proteasa (TBS-Tx100). Los lisados se inmunoprecipitaron con Mab IIIA4 (Boyd y otros, 1992) acoplado a esferas de agarosa Mini Leak (Kem-En-Tec A/S, Dinamarca), durante toda la noche a 4ºC. Los inmunoprecipitados lavados (TBS-Tx100) se analizaron por análisis de transferencia Western los anticuerpos apropiados. Las transferencias se visualizaron utilizando un sustrato de ECL (Pierce).

Microscopía FRET

Las células que expresan GFP EphA3 (w/t o mutante) fueron estimuladas, fijada, permeabilizadas y se tiñeron con el anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina conjugado con Cy3 PY72 antes del montaje en portaobjetos de vidrio utilizando Mowiol (Calbiochem). Las secuencias de microscopía de imágenes de tiempo de vida por fluorescencia (FLIM) se obtuvieron a 80 MHz con un microscopio Olympus IX70 (lente de inmersión en aceite 100/1.4 NA) y se analizó tal como se ha descrito (Reynolds, Tischer y otros. 2003). Se utilizaron una línea de láser de argón a 476 nm y filtro de emisión de banda estrecha (HQ510/20; Chroma) para GFP, una lámpara de arco de mercurio de 100W con juego de filtros Cy3 alto Q (excitación, HQ545/30; dicroico, Q580LP; emisor, HQ610/75) para Cy3 y Alexa 546. La fluorescencia de GFP se detectó con un divisor de haz dicroico (Q495 LP; Chroma Technology, Brattleboro, VT) y filtro de emisiones de banda estrecha. Se midió FRET estimulado en células 293 vivas entre efrina-A2GFP y Alexa546 EphA3-Fc expresadas de forma transiente.

Resultados

El mismo receptor EphA provoca respuestas opuestas células en diferentes células tumorales

Para evaluar las consecuencias morfológicas celulares de las células positivas a EphA3 adherentes y no adherentes a la exposición a efrinaA5 se examinaron las células de melanoma LiBr o células de leucemia pre-B LK63 cultivadas sobre superficies recubiertas de fibronectina o efrinaA5-Fc por microscopía confocal. Sobre la fibronectina, las células de melanoma LiBr se unieron firmemente y se extendieron, revelando procesos distintos de las células dendríticas (Lawrenson y otros, 2002) y fibras de estrés de actina rodamina teñidas con rodamina faloidina (figura 1A). Por el contrario, la mayoría de las células LK63 se suspendieron y las pocas células atrapadas en el cubreobjeto exhiben un citoesqueleto cortical de actina en la periferia de la célula (figura 1A, parte superior). La exposición a efrinaA5-Fc anclada a la superficie afecta dramáticamente a ambos tipos de células, pero en direcciones opuestas: las células de leucemia LK63 desarrollan una forma plana, irregular y sus distintos anillos de actina corticales se convierten en un citoesqueleto de actina difuso. Además, se extienden protusiones ricas en actina similares a filopopodios sobresalientes (puntas de flecha) que parecen unir las células sobre el substrato que contiene efrina (figura 1A, parte inferior). Por el contrario, la mayoría de las células de melanoma LiBr no logran fijarse a la superficie recubierta con efrinaA5, por lo que las células restantes la mayoría se contraen, se redondean y tienen poco o ningún contacto con el sustrato. Estos cambios en la morfología celular de melanoma se acompañan de redistribución de la actina polimerizada en densos anillos de actina cortical (figura 1, parte inferior, derecha, (Lawrenson y otros, 2002).

Las superficies de las placas de cultivo celular recubiertas con proteína A se conjugaron con densidades definidas de efrinaA5-Fc que permite examinar la dependencia de la dosis de las respuestas celulares opuestas de adherencia y repulsión. Con el montaje de densidad superficial de efrinaA5 las células LK63 se vuelven cada vez más adherentes (figura 1 B, LK63), y la adherencia celular máxima es evidente a 1,0 -1,8 ng de efrinaA5-Fc/mm2. Las células de melanoma LiBr se adhieren moderadamente en ausencia de efrinaA5, y a muy baja densidad de efrina. El aumento de la concentración superficial de efrinaA5 resulta en su desprendimiento celular dependiente de la dosis del pocillo de cultivo (figura 1B, LiBr). Es importante destacar que, por competencia, la efrina-A5 soluble abroga de forma eficaz el desprendimiento de LK63 y la repulsión de LiBr, y demuestra la especificidad de las respuestas celulares por la interacción efrinaA5/EphA3 (figura 1B, LiBr + inh, LK63 + inh). Se evaluó si la efrina-A5 induce la repulsión de las células de melanoma positivas a EphA3 también se traduce en mayor propensión de estas células para invadir a través de geles de colágeno tridimensionales lejos de la fuente efrina hacia un quimioatrayente (medios acondicionado 3T3). Mientras que la presencia de efrina en la cámara inferior no cambió la capacidad invasiva de las células de melanoma en la cámara superior, la adición de efrina A5-Fc agrupados junto con las células duplicó el número de células invasoras que migran a través de la membrana (figura 1 C, panel superior). Se confirmó esta respuesta con células 293 que expresan efrina A5. Las células LiBr que habían sido teñidas con colorante fluorescente Cell Tracker se colocaron junto con las células efrina-A5/HEK 293 en la cámara superior y las células invasoras en la parte inferior de la membrana se contaron en el microscopio de fluorescencia. Como era de esperar, la presencia de células que expresan efrina aumentó la capacidad invasiva de las células de melanoma varias veces, un efecto que fue abrogado por la adición de efrina-A5 soluble no agrupada como inhibidor competitivo en la cámara superior (figura 1C, parte inferior).

Para examinar la adherencia celular mediada por EphA3 en un entorno diferente, se añadieron células LK63 a monocapas de neuronas corticales de ratón positivas a efrinaA5 E14.5 (figura 2A, I-IV) o células efrinaA5/293 (figura 2A, V-VII, figura 2B), crecidas en cubreobjetos. El análisis de inmunocitoquímica (figura 2A, I, II, V, VI) y el análisis confocal cronológico (figura 2B) indican que las células LK63 se unen con avidez tanto células efrina-A5/293 y neuronas corticales de ratón. En particular, esta adherencia se acompaña de difusión pronunciada de las células LK3 y el desarrollo de extensiones similares a filopodios ricas en actina (figura 2A, II, IV, puntas de flecha). La adherencia de LK63 se suprime mediante el bloqueo de EphA3 endógeno con exceso de efrinaA5 soluble antes de la siembra (figura 2A, III y VII), y las células parentales HEK293 no facilitan la unión o cambios morfológicos notables de LK63 (figura 2A, VIII), lo que sugiere que la unión de las células está mediada a través de la interacción Eph/efrina. El marcaje reversible de la efrina-A5 de la superficie celular con cantidades limitantes de Alexa EphA3-Fc (figura 2B) permitió monitorizar la unión de las células LK63 a una monocapa de efrinaA5/HEK 293 en tiempo real, y registrar las respuestas morfológicas dinámicas en las células que portan efrinaA5 y en células LK63 positivas a EphA3 simultáneamente (figura 2B). La rápida acumulación de células LK63 sobre la monocapa celular de efrinaA5/293 a 11 min de la adición sugiere que el contacto directo entre los dos tipos de células conduce a la adherencia célula-célula inmediata (figura 2B).

Esta unión es persistente y en cultivos en conjunto prolongados de estas células conduce a grandes grupos de células LK63 que permanecen unidas a la monocapa de células efrinaA5/293. Mientras que poco después del contacto inicial es evidente la formación pronunciada de burbujas en la membrana en las células LK63 (figura 2B, 1',), en las células efrinaA5/HEK 293 aparecen extensiones similares a filopodios teñidas con Alexa EphA3-Fc (es decir, ricas en efrinaA5) que parecen mediar la unión de las células LK63 (figura 2B, flechas). La unión de las células LK63 se acompaña de redondeo y retracción de las células efrinaA5/HEK 293, lo que resulta en la pérdida de los contactos célula-célula en la monocapa efrinaA5/293 después de 21-31 min (figura 2B, 21', 31', puntas de flecha). Por otra parte, una marcada redistribución de la marcas de Alexa y la formación dinámica de grupos fluorescentes diferentes durante la unión de las células LK63 (figura 2B) sugieren que la exposición a superficies celulares que expresan EphA3 provoca una notable redistribución de efrina A5 en la membrana de las células efrinaA5/HEK 293.

La adherencia célula-célula facilitada por EphA3/efrina-A5 no depende de la ligazón de integrina.

Se examinó la participación de moléculas de adherencia celular de linfocitos mediante la utilización de anticuerpos que bloquean la función de abrogar la adherencia de LK63 tanto a células efrina-A5/HEK 293 o HMVEC estimuladas con LPS. La moléculas de adherencia celular vascular e intercelular (VCAM-1 e ICAM-1) son esenciales para la adherencia y la migración de los linfocitos normales (Bevilacqua, 1993) y de células de leucemia (Vincent y otros, 1996), y el análisis de inmunocitoquímica confirma su expresión en células LK63 (figura 3A, I, V). En los experimentos de control, las células LK63 se adhieren notablemente a HMVEC y experimentan cambios morfológicos celulares característicos sólo después de la estimulación con LPS (figura 3A, IX - XII, 3B). Como era de esperar, el tratamiento con los anticuerpos neutralizantes á-ICAM y á-VCAM abroga de forma eficaz esta adherencia de LK63 inducida por LPS (figura 3A, VI, VII, 3B), mientras que la adición de un exceso de efrinaA5 soluble no tiene ningún efecto (no mostrado). Por el contrario, la unión de LK63 mediada por EphA3/efrina apego a las células efrinaA5/293 no se ve afectada por los anticuerpos á-ICAM y á-VCAM, añadidos de forma individual o en combinación (figura 3A, II, III, VI, VII, 3B), y confirma que esta adherencia célula-célula se basa únicamente en la unión proporcionada por la interacción Eph/efrina.

La repulsión célula-célula mediada por Eph/efrina, pero no la adherencia, coincide con la internalización de efrina-A5

El descubrimiento de que EphA3 puede facilitar tanto la adherencia o la repulsión célula-célula llevó a analizar las vías de biología celular y bioquímicas subyacentes. La internalización del receptor Eph inducida por ligando no se ha descrito hasta la fecha, pero es tentador especular que los mecanismos que regulan otras RTK también pueden desempeñar un papel en las respuestas celulares observadas en estos experimentos. Para monitorizar la localización del ligando durante la estimulación celular, se preparó un conjugado fluorescente de Alexa 546 de efrinaA5-Fc (Alexa efrinaA5-Fc). El análisis confocal de lapso de tiempo revela que en cuestión de minutos después de la adición una señal fluorescente se distribuye uniformemente alrededor de las membranas celulares de EphA3/293 (figura 4A). Después de 5-10 minutos, distintos parches de fluorescencia alrededor del perímetro celular sugieren el agrupamiento ligando/receptor (puntas de flecha), seguido por la formación de pequeñas vesículas fluorescentes que se desprenden de la membrana y aparecen en el citosol (vídeo, figura 4A). La mayor parte de la señal fluorescente ha desaparecido de las membranas en 120 min desde la estimulación y se ha acumulado en grandes racimos citosólicos (no mostrados). Por el contrario, las células LK63 que habían sido expuestas a Alexa efrinaA5-Fc agrupados de la misma manera presentaron una fuerte tinción de la membrana plasmática, pero no revelaron ningún signo de internalización del receptor/ligando (figura 4B). Se ha tratado de confirmar que la internalización se basa en la agrupación previa de efrinaA5-Fc, conocida por desencadenar la activación de EphA3. La adición de Alexa efrinaA5-Fc no agrupados a las células EphA3/293 produjo diferentes tinciones fluorescentes de la membrana plasmática, pero poca evidencia de la formación de vesículas citosólicas fluorescentes (figura 4 C, III). Además, la estimulación con Alexa efrinaA5-Fc en presencia de exceso de IgG humana ("bloque Fc") para bloquear la potencial absorción mediada por el receptor Fc, no abroga la internalización de efrinaA5-Fc (figura 4 C, II), lo que confirma un mecanismo independiente del receptor Fc específico de EphA3.

Se caracterizó la internalización de Alexa efrinaA5-Fc mediante la monitorización de los compartimentos lisosomales de las células EphA3/293 estimuladas durante un experimento de lapso de tiempo confocal utilizando verde LysoTrackerTM (figura 4D). Las vesículas citosólicas verdes antes de la estimulación marcan el compartimento lisosomal (figura 4D, 0 min). Después de la adición de Alexa efrinaA5-Fc (rojo), su unión rápida (figura 4D, 5 min), agrupación (5,35 min) y la internalización (35,90 min) son evidentes. Las imágenes rojas (Alexa efrinaA5-Fc) y verdes (LysoTrackerTM) combinadas indican la internalización de efrinaA5 y su colocalización en los lisosomas.

La adherencia o repulsión célula-célula facilitada por EphA3/efrinaA5 implica vías moleculares distintas

Se trató de examinar las vías moleculares implicadas en la repulsión o la adherencia celular mediada por EphA3, por análisis de transferencia IP/Western de lisados de células enteras o compartimentos celulares aislados de células que expresan EphA3 estimuladas con efrinaA5. Lo más sorprendente, los receptores de EphA3 en las células EphA3/293 y leucémicas LK63 difieren profundamente en el nivel de fosforilación de tirosina de EphA3 (figura 5A, panel inferior). Tal como se ha demostrado anteriormente (Lawrenson y otros, 2002), las células EphA3/HEK 293 responden a la estimulación con efrinaA5 agrupada mediante el rápido aumento en la fosforilación de EphA3 en 10 min. Por el contrario, en las células LK63 EphA3 es fosforilada sólo marginalmente después de 60 min de la estimulación. Curiosamente, en las células LK63, pero sólo muy débilmente en las células EphA3/293, la unión de efrinaA5-Fc a EphA3 está acompañada por un rápido reclutamiento de la proteína tirosina fosfatasa SHP-2, lo que sugiere que su actividad podría estar involucrada el mantenimiento del bajo nivel de tirosina fosforilada de EphA3 en las células LK63 (figura 5A, panel central).

Este descubrimiento de que la repulsión celular facilitada por EphA3 coincide con la internalización del complejo receptor/ligando (figura 4) llevó a evaluar la participación de la proteína adaptadora c-Cbl en la señalización de EphA3. Cbl actúa aguas abajo de factor de crecimiento y receptores de citoquinas e integrinas y se sabe que efectúa su modulación a la baja, ubiquitinación y degradación endocítica (Andoniou y otros, 1996, Thien y Langdon, 2001). La asociación constitutiva de c-Cbl con EphA3 era evidente en lisados de células enteras de células LK63, células EphA3/293 (figura 5A) y células de melanoma A09 (no mostradas). Sin embargo, sin dejar de estar unido a EphA3 en las células EphA3/293, c-Cbl se disocia del receptor en las células LK63 tras la estimulación (figura 5A). La inmunoprecipitación de proteínas fosforilados en tirosina de células EphA3/293 reveló una rápida fosforilación de c-Cbl endógeno en un 1 min tras la estimulación con efrinaA5 (figura 5B).

Se ha tratado examinar el destino de los complejos EphA3/efrinaA5 internalizados en compartimentos celulares individuales. El fraccionamiento de los lisados celulares hipotónicos de células recubiertas de sílice coloidal por centrifugación en gradiente de densidad permite la separación eficaz entre la membrana plasmática, el citosol y las membranas internas (Stolz y otros, 1992). El análisis de transferencia Western de células EphA3/293 estimuladas con efrina reveló un aumento de la ubiquitinación de una proteína correspondiente al tamaño aparente de EphA3 en muestras de lisados de células enteras y fracciones aisladas de membrana plasmática (figura 5C) de células EphA3/293 a los 15 minutos de estimulación. Al contrario que las células EphA3/293, las células LK63 tratadas con efrinaA5 revelaron una completa falta de ubiquitinación de EphA3 (figura 5D), de acuerdo con la observación de que c-Cbl se disocia rápidamente del receptor unido a efrina (figura 5A).

La unión de efrinaA5 a las células EphA3/293 pero no a LK63 es seguida por su rápida escisión e internalización.

Para evaluar si la internalización requiere la escisión de la efrinaA5 unida a la superficie, se conjugó Alexa efrinaA5-Fc en Dynabeads con Proteína A, simulando una superficie de ligando de alta densidad para la incubación con células positivas a EphA3 y de control. Ambas, las células LK63 y EphA3/HEK 293 se unieron rápidamente a las esferas marcadas con Alexa efrinaA5-Fc (figura 6 A, I, III). En el caso de las células EphA3/HEK 293 (I), la fluorescencia de Alexa se dispersó localmente desde la superficie de la esfera y en minutos se distribuyó sobre la membrana celular. La internalización era evidente a los 15 minutos y dio como resultado la formación de vesículas fluorescentes características en el citosol (compárense las figuras 4A y 6A). En los experimentos de control, las células HEK 293 parentales (no mostradas) o células EphA3/HEK 293 expuestas a Dynabeads con Alexa EphA1-Fc no relevantes (figura 6A, II, EphA1 Bd) no revelaron ningún signo de escisión o internalización. Otros han demostrado recientemente que la escisión de la interacción efrina-A2/EphA3 durante la repulsión de axones se ve facilitada por ADAM10, una metaloproteasa que también está presente en células HEK293 (Hattori y otros, 2000). La incubación de las células EphA3/HEK 293 con el inhibidor de metaloproteasas 1',10'-O-fenantrolina antes de la adición de las esferas con Alexa efrina-A5-Fc abrogó completamente la escisión y la internalización de efrina (figura 6B, panel II), lo que sugiere la implicación probable de ADAM10 o una proteasa relacionada en esta reacción.

Al contrario de la respuesta de las células EphA3/293, no hubo evidencias de la escisión o la internalización de Alexa efrinaA5 en células LK63 (figura 6A, III). Sin embargo, las esferas cargadas con efrinaA5 se mantuvieron firmemente unidas a las células durante los experimentos (vídeo figura 6A III) y provocaron formación de burbujas en la membrana diferentes (figura 6A, III, puntas de flecha). Los análisis de transferencia Western de los inmunoprecipitados de células LK63, de melanoma LiBr o EphA3/293 indicaron en consonancia, la asociación de ADAM10 con EphA3 en células EphA3/293 y de melanoma, pero no en células LK63 (figura 6C). Para demostrar la

escisión bioquímica de la efrina, se trataron células EphA3/HEK 293 con efrina-A5 Fc agrupados previamente. Después de la absorción de la efrina unida a Fc con proteína-A, la efrina escindida se precipitó a partir de sobrenadantes celulares agrupados y lisados de Triton-X100 de células EphA3/293 con EphA3-Fc unido a proteína A y se monitorizó mediante transferencia Western con anticuerpo anti-efrinaA5 (figura 6D). La efrinaA5 escindida se observó en las células EphA3/HEK 293 tratadas con efrina A5-Fc agrupados, pero no sin agrupar, mientras que el mismo tratamiento produjo una escisión de efrina significativamente reducida en cultivos de EphA3/HEK 293 en paralelo tratados con 1',10'-o-fenantrolina para bloquear la escisión por metaloproteasas. Curiosamente, las células 293T transfectadas con EphA3 que contienen una mutación de inactivación en el dominio quinasa (K653M EphA3) mostraron sólo escisión de efrina marginal después de la estimulación con efrina-A5 agrupada previamente (figura 6D), lo que sugirie un papel de actividad quinasa de EphA3 en este proceso.

En conjunto, estos resultados indican que en ausencia de escisión de efrinaA5 y obstaculización de la fosforilación del receptor, la interacción EphA3/efrinaA5 cambia de repulsión celular a adherencia celular mediada por Eph/efrina.

Los inhibidores de la fosfatasa activan la fosforilación del receptor Eph

La activación global de EphA3 fue monitorizada por microscopía fluorescente de imágenes en vivo (FLIM) después de bloquear la actividad tirosina fosfatasa citosólica. Tratamiento de las células que expresan EphA3-GFP w/t con el inhibidor de la fosfatasa pervanadato sódico condujo a una dramática disminución dependiente de la dosis en el tiempo de vida fluorescente de GFP a través de toda la superficie celular (figura 7A), indicativo de la fosforilación del receptor universal. Por el contrario, las células que expresan EphA3GFP mutante (3YF EphA3GFP), deficientes de yuxtamembrana y de bucle de activación de tirosinas (Lawrenson, Wimmer-Kleikamp y otros, 2002), retuvieron su tiempo de vida de GFP incluso después del tratamiento con altas concentraciones de pervanadato (figura 7B), lo que confirma la especificidad del análisis FRET, pero también la asignación de estas tres tirosinas en principio como sitios de fosforilación de EphA3 in vivo en células que expresan EphA3 w/t (figura 7A).

Fosforilación del receptor Eph dependiente de la dosis

La observación de que EphA3 está sólo marginalmente fosforilado en células LK63 tras la estimulación con efrina plantea la importante cuestión de cómo se regulado a la baja el nivel de fosforilación en esas células. En consonancia con los datos de FLIM, el tratamiento de EphA3/HEK que sobreexpresan EphA3 (por transfección estable) y células de melanoma maligno EphA3/A02 293 con cantidades crecientes de pervanadato o H2O2 conduce a un aumento dependiente de la dosis en la fosforilación de EphA3 (figura 8 A, B). Sin embargo, en las concentraciones más altas de vanadato ensayadas (1 mM) la fosforilación de EphA3 en células LK63 es significativamente menor a pesar de los niveles comparables de EphA3, posiblemente, lo que sugiere posiblemente un aumento de la actividad tirosina fosfatasa de la proteína tirosina en estas células (figura 8A, panel derecho). Si de hecho la actividad fosfatasa elevada es responsable de la inusual respuesta de estas células a la efrina A5 de la superficie celular, entonces la inhibición de fosfatasas debe evitar la adherencia de LK63 a efrina unida a superficie.

En consonancia, las células LK63, sembradas en cubreobjetos de vidrio recubiertos con efrina o FN tal como se describe en la figura 1A, pero tratadas con pervanadato de sodio (vanadato) pierden sus extensiones características y parecen redondeadas, su citoesqueleto de actina cambia a anillos de actina corticales condensados, tal como se observa en células de melanoma estimuladas con efrina (figura 9). En ausencia de este tratamiento con vanadato, las células LK63 se adhieren a superficies recubiertas con efrina, y presentan un citoesqueleto de actina difuso y extensiones similares a lamelipodios dirigidas hacia la superficie recubierta con efrina.

LMW-PTP se asocia con EphA3 e influye en la fosforilación del receptor

La implicación obvia de los PTP en la señalización de EphA3 llevó a explorar cual o cuales fosfatasas son responsables de los efectos observados. El análisis por inmunoprecipitación con anticuerpos contra fosfatasas conocidas sugirió la asociación de ambos, SHP2 y LMW-PTP. El último es un candidato probable, ya que se ha demostrado que influye en la señalización de EphB2, EphB1 (Stein, Lane y otros) y EphA2 (Kikawa, Vidale y otros. 2002). En consonancia, las células EphA3/HEK293 que sobreexpresan LMW-PTP w/t revelan una falta de fosforilación de EphA3 después la estimulación con efrina-A5 (figura 10B). Por el contrario, la estimulación con efrina-A5 desencadena fosforilación de EphA3 pronunciada en células EphA3/HEK 293 transfectadas con LMWPTP dominante negativo o solo con vector, lo que sugiere que esta fosfatasa de hecho influye en la fosforilación de EphA3. En consonancia, se ha detectado la asociación de LMWTP endógeno con EphA3 en lisados de células EphA3/HEK 293 y células de melanoma maligno (AO2, AO9, figura 10A).

La sobreexpresión de LMWPTP abroga el redondeo celular mediado por efrina-A5 y los cambios en el citoesqueleto de actina.

Para evaluar la relevancia funcional de la asociación de LMWTP con EphA3 se monitorizaron los cambios del citoesqueleto de actina en células 293T que sobreexpresan EphA3 que fueron transfectadas con constructos de LMWPTP w/t o dominante negativo (d/n). En ausencia de efrina, todas las células se propagaron ampliamente y revelaron distintos procesos celulares ricos en actina. Es importante destacar que, de acuerdo con los datos

bioquímicos (figura 11l), el tratamiento con efrina-A5 Fc agrupados previamente conduce al redondeo y la contracción del citoesqueleto de actina sólo en células de control transfectadas con LMWPTP d/n y transfectadas con vector. Por el contrario, las células que sobreexpresan LMWPTP w/t no respondieron al tratamiento con efrina-A5 y no cambian su morfología durante el experimento, lo que indica la implicación funcional de esta actividad de fosfatasa en la señalización de EphA3.

Las respuestas diametralmente opuestas facilitadas por EphA3/efrinaA5 están influenciadas por la actividad quinasa de Eph y la fosforilación

Para examinar si la fosforilación de tirosina y la actividad quinasa de EphA3 influyen en el interruptor molecular entre la repulsión y la adherencia mediadas por Eph/efrina, células de melanoma maligno AO2 negativas a EphA3 que expresan de forma estable EphA3 w/t o mutantes de EphA3 con señalización comprometida portadores de mutaciones en los tres sitios principales de fosforilación (3YF EphA3 ) o que carecen de todo el dominio citoplásmico (EphA3Lcyto) se desafiaron con efrina-A5 Fc agrupados a la vez que se dejaron sin estimular cultivos en paralelo. Dado que la expresión de EphA3 endógeno en las células AO2 es baja a niveles indetectables por transferencia Northern Blot y análisis de FACS, estas células son ideales para la transfección estable de constructos de EphA3. Células fijadas y teñidas con faloidina Alexa 488 en ausencia de efrina poseen cuerpos celulares adherentes con extensos procesos y las fibras de estrés de actina (figura 12 A, panel izquierdo). En analogía a la respuesta de repulsión celular observada en cultivos de melanoma Libr (Lawrenson, Wimmer-Kleikamp y otros, 2002), la estimulación de las células EphA3/A02 con efrina agrupada se acompaña de redondeo celular, redistribución de la actina polimerizada en densos anillos de actina corticales (figura 12A, w/t) y de repulsión celular. Los ensayos de adherencia en las mismas condiciones experimentales confirmaron estos descubrimientos, y sólo aproximadamente el 6% de la población de LiBr de partida y el 45% de la población de partida de EphA3/A02 permaneció unida a la superficie de cultivo de tejidos cuando se expusieron a efrina (ensayo de adherencia, figura 12B). Cultivos en paralelo de AO2 parentales de control, en comparación, no mostraron cambios en la morfología y la mayoría de las células se mantuvo unida durante todo el experimento (figura 12A, B, control). Es importante destacar que la expresión de EphA3 mutado en el extremo C-terminal inactivo de quinasas (EphA3Lcyto) o mutado en tirosina (3YF EphA3) abrogaron la respuesta de repulsión mediada por Eph/efrina y las células permanecieron dispersas y adherentes con una morfología similar y el citoesqueleto de actina a las células no estimuladas con efrina (Figura 12 A, B).

Discusión

EphA3 fue aislado por primera vez como antígeno de superficie celular de células pre-B linfoblásticas LK63 (Boyd y otros, 1992) y se identificó de forma independiente en células de melanoma maligno (Chiari y otros, 2000), que responden a la estimulación con efrinaA5 con la contracción del citoesqueleto y desprendimiento de las células (Lawrenson y otros, 2002). Ahora se demuestra que en células LK63 la exposición a efrinaA5 tiene el efecto opuesto y facilita la unión celular mediada por EphA3. Se demuestra la pérdida simultánea de un anillo de actina cortical distinto, típica de las células LK63 no estimuladas, y la ganancia de una red de actina difusa, propagación celular y desarrollo de extensiones de tipo filopodios ricas en actina, que parecen unir las células a la superficie de efrinaA5. La repulsión inducida por efrinaA5 está acompañada por la rápida escisión de la efrina-A5 unida a la superficie, internalización y degradación lisosomal. Por el contrario, la escisión e internalización de efrina no son evidentes en células LK63, que se unen a efrina-A5i unida a la superficie de forma independiente a la integrina.

En primer lugar, la unión de las células de leucemia pre-B LK63 no adherentes a superficies de cultivo de tejidos decorados con efrina-A5, las neuronas corticales o células efrina-A5/293, pero no la HMVEC estimuladas con LPS, se inhibe con exceso de efrinaA5 soluble, lo que demuestra la necesidad de los contactos célula-célula mediados por efrina-A5/EphA3. Si bien no se ha detectado la expresión de la proteína efrinaA5 en HMVEC, recientemente se ha confirmado la adherencia de LK63 dependiente de efrina-A5/EphA3 a células tumorales endoteliales humanas primarias que expresan efrinaA5.

En segundo lugar, el bloqueo de los receptores de integrina en células LK63 con anticuerpos neutralizantes anti-ICAM-1 y anti-VCAM-1 no afecta a la adherencia de LK63 a las células efrina-A5/293, mientras que la adherencia a HMVEC estimuladas con LPS se reduce significativamente. De acuerdo con su función de vigilancia inmunológica, los linfocitos y las células de leucemia responden a la estimulación con LPS mediante la adherencia rápida al endotelio vascular. Esta respuesta está mediada principalmente por los receptores de integrina ICAM-1 y VCAM-1 (Bevilacqua, 1993), los cuales se expresan abundantemente en células LK63.

Sin embargo, los cambios morfológicos celulares que acompañan a la adherencia inducida por LPS de las células LK63 a HMVEC, incluyendo la propagación de células y el desarrollo de una extensa red del citoesqueleto de actina son muy similares a los observados durante la exposición a efrinaA5 unida a la superficie celular (compárense las figuras 1A, 3A). La observación apoya la noción recientemente propuesta de que la unión célula-célula mediada por el receptor Eph y los cambios en el citoesqueleto acompañantes pueden no seguir mecanismos “mediados por integrina clásicos” (Carter y otros, 2002).

En tercer lugar, el requisito conceptual para la repulsión mediada por Eph/efrina de la liberación de las células que

interactúan mediante la escisión del enlace molecular (Eph/efrina), infiere que la falta de escisión podría promover la unión célula-célula. De hecho, un importante estudio demostró recientemente que la abrogación de la escisión de efrina-A2 catalizada por ADAM dependiente de EphA3 en sitios de contacto célula-célula impide repulsión de axones (Hattori y otros, 2000). En varias células que expresan efrinaA2 analizadas, incluyendo células HEK293 y NIH3T3, se demuestra que la unión de EphA3-Fc agrupados desencadena la escisión proteolítica de la efrinaA2 unida a membrana.

Curiosamente, estos experimentos, que evalúan la escisión de efrinaA5-Fc inmovilizada a la esferes recubiertas con proteína A, sugieren que las células que expresan EphA3 pueden inducir la escisión de efrina en trans. La aparente activación de esta actividad de las metaloproteasas de la efrinaA5 unida a superficie que se une a las células EphA3/293, pero no a las células LK63, plantea preguntas importantes sobre su identidad y mecanismo de activación. El análisis de la inmunoprecipitación indica que una proteasa de tipo Kuzbanian, posiblemente ADAM10, se asocia con EphA3 en EphA3/293 pero no en células LK63. Curiosamente, la asociación constitutiva de ADAM10 con efrinaA2 parece implicar un motivo de efrina (Hattori y otros, 2000) que se alinea con el bucle de unión del receptor de alta afinidad de la estructura-efrina B2 correspondiente (Himanen y otros, 2001). Esta configuración sugiere que el desplazamiento de ADAM-10 durante la interacción Eph/efrina podría actuar como desencadenante de la activación de la escisión de efrina. En consonancia, en los experimentos la liberación y la internalización de efrinaA5 unida se abrogan en presencia del inhibidor de proteasas 1,10-O-fenantrolina. Es importante destacar que, mientras que las esferas recubiertas con efrinaA5-Fc se unen con avidez a las células LK63, no se encontró ningún signo de escisión o internalización del ligando, lo que indica que la deficiencia en la actividad de las metaloproteasas asociada a EphA3 es responsable de la persistencia de la adherencia mediada por EphA3/efrinaA5.

Si bien los mecanismos que terminan las señales Eph inducidas por efrina y que están implicados en el tráfico del receptor Eph no se han descrito hasta la fecha, la cinética rápida de las respuestas del citoesqueleto inducidas por efrina observadas en muchos estudios (Zou y otros, 1999, Miao y otros, 2000 , Elowe y otros, 2001, Lawrenson y otros, 2002, Carter y otros, 2002) sugieren una rápida rotación de los complejos Eph/efrina. Se ha abordado este aspecto de la función de Eph por primera vez y observar que la repulsión celular de las células EphA3/293, pero no adherencia celular de LK63 está acompañada por la rápida internalización de los complejos receptor/ligando y su acumulación en el compartimento lisosomal. La fosforilación simultánea de c-Cbl asociada a EphA3, que facilita la poliubiquitinación y degradación de muchos RTK activados (Thien y Langdon, 2001), así como la ubiquitinación prominente de EphA3, sugieren la degradación de Eph como componente importante de la repulsión celular inducida por efrina. Por el contrario, la aparente falta de ubiquitinación en células LK63, y la disociación de c-Cbl de EphA3 unido efrinaA5 coinciden con los complejos de la superficie celular EphA3/ephin-A5 que persisten como unión molecular estable entre las células que interactúan. En apoyo de estas observaciones, en células Jurkat y COS-7 c-Cbl está asociado constitutivamente con EphB6, un receptor Eph que carece de actividad quinasa intrínseca, y la unión a efrina provocan la desfosforilación de c-Cbl y la disociación de SHP1 (Luo y otros, 2001, Freywald y otros, 2002).

Cabe destacar, que la internalización se reduce drásticamente cuando se aplica efrinaA5-Fc no agrupados a las células EphA3/293, lo que sugiere que se requiere la señalización de EphA3 fosforilada activada por ligando para la endocitosis eficiente de los complejos EphA3/efrinaA5. Curiosamente, los presentes datos demuestran que los receptores EphA3 de las células EphA3/HEK 293 y de leucemia LK63 difieren profundamente en el nivel de su fosforilación de tirosina (figura 3A, panel inferior). Mientras que las células EphA3/293 responden a la estimulación con efrinaA5 aumentando rápidamente la fosforilación de EphA3 (Lawrenson y otros, 2002), sólo se encuentra EphA3 marginalmente fosforilada en las células LK63 tratadas con efrina. Es importante destacar que estos resultados también revelan la asociación constitutiva de la proteína tirosina fosfatasa (PTP) LMW-PTP, y en células LK63 pero no en células EphA3/293, que la unión de efrinaA5 a EphA3 está acompañada por un rápido reclutamiento de PTP SHP-2 (figura 3A, panel central). La sobreexpresión de LMW-PTP w/t disminuye drásticamente la fosforilación de EphA3 después de la estimulación con efrina-A5, mientras que la sobreexpresión del mutante de LMW-PTP dominante negativo (d/n) aumenta el nivel de fosforilación después de la estimulación con efrina-A5, lo que sugiere que LMW-PTP está involucrados en la regulación de los niveles de fosforilación de EphA3 y de ese modo también en la regulación de la actividad de la función quinasa. En consonancia, la sobreexpresión de LMW-PTP d/n, presumiblemente mediante el bloqueo del efecto inhibidor de LMW-PTP endógeno asociado y dando como resultado la activación del receptor EphA3, induce el redondeo celular. Además, parece posible que SHP-2 está implicado en el mantenimiento de los bajos niveles de EphA3 fosforilado en tirosina en las células LK63, que a su vez afecta la señalización de EphA3 y la respuesta del citoesqueleto resultante. SHP-2 es un PTP de expresión ubicua conocido por regular la adherencia celular, difusión, migración o la quimiotaxis inducida por integrina mediante la modulación de la fosforilación de tirosina de los componentes de adherencia focal (Oh y otros, 1999, Manes y otros, 1999, Saxton y Pawson, 1999). Su implicación en la señalización de Eph se sugiere a partir del descubrimiento de que el redondeo y la desadherencia celular medianda por EphA2 y EphB2 de células epiteliales de próstata PC3 y células 293 transfectadas implica el reclutamiento SHP-2 y la desfosforilación de la quinasa de adherencia focal (Miao y otros, 2000, Zou y otros, 1999).

La comunicación célula-célula mediada por Eph/efrina es esencial para el establecimiento de patrones de tejido durante la embriogénesis (Holder y Klein, 1999, Mellitzer y otros, 1999) y fenotipos de Eph o invertebrados y ratones mutantes de efrinas han puesto de relieve la importancia de la repulsión celular y los mecanismos de adherencia

dependientes e independientes de la quinasa Eph (Boyd y Lackmann, 2001). Nuestros hallazgos presentados en el presente documento demuestran que en las células tumorales positivas a EphA3 diferencias notables en la actividad de la quinasa EphA3 y los componentes de señalización aguas abajo, así como en la actividad de metaloproteasas asociada a las células, determinan la respuesta neta biológica de las células a la exposición a efrinaA5, que propaga ya sea la contracción y separación de las células dependientes de la quinasa Eph como la unión y difusión de las células facilitadas por Eph-efrina independiente de quinasa. Además, apoyan la intrigante posibilidad de que las metaloproteasas asociadas a Eph/efrina funcionan como gatillos para activar el interruptor molecular entre la adherencia célula-célula y la repulsión celular mediada por Eph/efrina.

A lo largo de la memoria descriptiva, el objetivo ha sido describir las realizaciones preferentes de la presente invención sin limitar la presente invención a ninguna forma de realización o colección específica de características. Por lo tanto, será evidente para los expertos en la materia, a la luz de la presente descripción, que diversas modificaciones y cambios se pueden hacer en las realizaciones particulares ejemplificadas sin apartarse del alcance de la presente invención.

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Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Anticuerpo dirigido a un dominio de interacción con efrina de un receptor EphA3 para su uso en la prevención, demora o inhibición de metástasis de células tumorales, en el que se modula la capacidad de una célula tumoral que

   5 expresa dicho receptor EphA3 para responder a la unión a efrina en un mamífero y se mejora la repulsión al contacto celular entre dicha célula tumoral y otra célula que expresa dicha efrina.
2. 2. Anticuerpo para el uso, según la reivindicación 1, en el que también se previene, inhibe o demora la

   neovascularización de un tumor. 10
3. 3. Anticuerpo para el uso, según la reivindicación 1, en el que dicha célula tumoral es una célula de melanoma maligno.

4. 4.

   Anticuerpo para el uso, según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal IIIA4. 15

5. 5. Anticuerpo para el uso, según la reivindicación 1, en el que la efrina expresada por dicha otra célula es efrina A5 humana.

6. 6.

   Anticuerpo para el uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el mamífero es un ser 20 humano.

7. 7. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo dirigido a un dominio de interacción con efrina de un receptor EphA3 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para su uso en la prevención, demora o inhibición de metástasis de células tumorales mediante la modulación de la capacidad de una célula tumoral que

   25 expresa dicho receptor EphaA3 para responder a la unión a efrina en un mamífero, en el que se mejora la repulsión al contacto celular entre dicha célula tumoral y otra célula que expresa dicha efrina.
8. 8. Composición farmacéutica para el uso, según la reivindicación 7, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo

   monoclonal IIIA4. 30
9. 9. Uso de un anticuerpo dirigido a un dominio de interacción con efrina de un receptor EphA3 para la fabricación de un medicamento para su uso en la prevención, demora o inhibición de metástasis de células tumorales mediante la modulación de la capacidad de una célula tumoral que expresa dicho receptor EphA3 para responder a la unión a efrina en un mamífero, en el que se mejora la repulsión al contacto celular entre dicha célula y otra célula que

   35 expresa dicha efrina.
10. 10. Uso, según la reivindicación 9, en el que también se previene, inhibe o demora la neovascularización de un tumor.

    40 11. Uso, según la reivindicación 9, en el que dicha célula tumoral es una célula de melanoma maligno.
11. 12. Uso, según la reivindicación 9, en el que el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal IIIA4.
12. 13. Uso, según la reivindicación 9, en el que que la efrina expresada por dicha otra célula es efrina A5 humana. 45