ES2435737T3 - Secuencias genéticas de flavonoide 3',5'-hidroxilasa y usos para las mismas - Google Patents

Secuencias genéticas de flavonoide 3',5'-hidroxilasa y usos para las mismas Download PDF

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada para su uso como promotor que es operable en tejido de pétalo de rosaque comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:30 o una secuencia denucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencias con SEQ ID NO:5 o SEQ IDNO:30 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con al menos una de SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:30 oun complemento de las mismas bajo condiciones de alta rigurosidad.

Description

Secuencias genéticas de flavonoide 3',5'-hidroxilasa y usos para las mismas
5 Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere a promotores que operan eficientemente en rosales y pueden también operar en plantas tales como gerbera o plantas botánicamente relacionadas. También se desvela una secuencia genética que codifica un polipéptido que tiene actividad de flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F3'5'H) y el uso de la secuencia genética y/o sus correspondientes polipéptidos, entre otros, para manipular el color en las flores o partes de las mismas o en otros tejidos de plantas. El F3'5'H tiene la capacidad de modular el metabolismo del dihidrocanferol (DHK), además del metabolismo de otros sustratos tales como dihidroquercetina (DHQ), naringenina y eriodictol. También se desvela
15 una secuencia genética que codifica un polipéptido que tiene actividad de F3'5'H cuando se expresa en rosa o gerbera o plantas botánicamente relacionadas. En el presente documento también se desvelan moléculas antisentido y sentido o moléculas inductoras de ARNi correspondientes a toda o parte de la secuencia genética anteriormente mencionada o un transcrito de la misma, además de plantas genéticamente modificadas, flores cortadas, partes y tejido reproductivo de tales plantas.
Descripción de técnica anterior
Referencia a cualquier técnica anterior en esta memoria descriptiva no es, y no debe tomarse como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que esta técnica anterior forme parte del conocimiento general
25 común en cualquier país.
Los detalles bibliográficos de las referencias proporcionadas en la memoria descriptiva objeto se enumeran al final de la memoria descriptiva.
La industria de las flores o las plantas ornamentales procura desarrollar nuevas y diferentes variedades de flores y/o plantas. Una manera eficaz de crear tales variedades novedosas es a través de la manipulación del color de las flores. Las técnicas de cruce clásicas han sido utilizadas con algún éxito para producir una amplia gama de colores de casi todas las variedades comerciales de flores y/o plantas disponibles hoy en día. Sin embargo, esta metodología ha estado limitada por las restricciones de un conjunto de gens de especies particular y por esta razón
35 es raro que una especie individual tenga el espectro completo de variedades coloreadas. Por ejemplo, el desarrollo de variedades coloreadas novedosas de plantas o partes de plantas tales como flores, follaje y tallos ofrecería una oportunidad significativa tanto a los mercados de flor cortada como a los ornamentales. En la industria de las flores o las plantas ornamentales, el desarrollo de variedades coloreadas novedosas de especies de florecimiento importantes tales como rosa, crisantemo, tulipán, lirio, clavel, gerbera, orquídea, lisianthus, begonia, torenia, geranio, petunia, nierembergia, pelargonio, iris, impatiens y ciclamen sería de gran interés. Un ejemplo más específico sería el desarrollo de una rosa o gerbera azul para el mercado de flor cortada.
Además, el desarrollo de novedosas variedades coloreadas de partes de plantas tales como verduras, frutos y semillas ofrecería oportunidades significativas en la agricultura. Por ejemplo, semillas coloreadas novedosas serían
45 útiles como marcas de propiedad para plantas. Modificaciones adicionales a flavonoides comunes a bayas o frutos que incluyen uvas y manzanas y sus zumos, incluyendo el vino, tendrían la posibilidad de conferir características de estilo alteradas de valor a tales industrias de los frutos y de subproductos.
El color de las flores es predominantemente debido a tres tipos de pigmento: flavonoides, carotenoides y betalaínas. De los tres, los flavonoides son los más comunes y contribuyen a una amplia gama de colores desde el amarillo hasta el rojo y hasta el azul. Las moléculas de flavonoides que hacen la principal contribución al color de las flores son las antocianinas, que son derivados glucosilados de cianidina y su derivado metilado peonidina, moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina y sus derivados metilados petunidina y malvidina y pelargonidina. Las antocianinas están localizadas en la vacuola de las células epidérmicas de los pétalos o en la vacuola de las células
55 subepidérmicas de las hojas.
Los pigmentos flavonoides son metabolitos secundarios de la ruta fenilpropanoide. La ruta biosintética de los pigmentos flavonoides (ruta de los flavonoides) está bien establecida (Holton y Cornish, Plant Cell 7: 1071-1083, 1995; Mol y col., Trends Plant Sci. 3: 212-217,1998; Winkel-Shirley, Plant Physiol. 126: 485-493, 2001a; y Winkel-Shirley, Plant Physiol. 127: 1399-1404, 2001b) y se muestra en las Figuras 1A y B. Tres reacciones y enzimas participan en la conversión de la fenilalanina a p-cumaroil-CoA, uno de los primeros sustratos clave en la ruta de los flavonoides. Las enzimas son fenilalanina amonio-liasa (PAL), cinamato 4-hidroxilasa (C4H) y 4-cumarato: CoA ligasa (4CL). La primera etapa comprometida en la ruta implica la condensación de tres moléculas de malonil-CoA (proporcionada por la acción de la acetil COA carboxilasa (ACC) sobre acetil CoA y CO2) con una molécula de p65 cumaroil-CoA. Esta reacción es catalizada por la enzima chalcona sintasa (CHS). El producto de esta relación, la 2',4,4',6'-tetrahidroxi-chalcona, normalmente se isomeriza de manera muy rápida por la enzima chalcona flavanona
isomerasa (CHI) para producir naringenina. La naringenina se hidroxila posteriormente en la posición 3 del anillo central por la flavanona 3-hidroxilasa (F3H) para producir dihidrocanferol (DHK).
El patrón de hidroxilación del anillo B del dihidrocanferol (DHK) desempeña una función clave en la determinación
5 del color de los pétalos. El anillo B puede hidroxilarse en o bien la posición 3', o en tanto las posiciones 3' como 5', para producir dihidroquercetina (DHQ) o dihidromiricetina (DHM), respectivamente. Dos enzimas clave implicadas en esta parte de la ruta son flavonoide 3'-hidroxilasa y flavonoide 3',5'-hidroxilasa, ambas de la clase de citocromo P450 de las enzimas. Las enzimas citocromo P450 tienen amplia distribución en la naturaleza y se han aislado y secuenciado genes a partir de vertebrados, insectos, levaduras, hongos, bacterias y plantas.
La flavonoide 3'-hidroxilasa (F3'H) es una enzima clave en la ruta de los flavonoides que conduce a los pigmentos basados en cianidina que, en muchas especies vegetales (por ejemplo, Rosa spp., Dianthus spp., Petunia spp., begonia, ciclamen, impatiens, gloria de la mañana y crisantemo) contribuyen al color rojo y rosa de las flores.
15 La flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F3'5'H) es una enzima clave en la ruta de los flavonoides que conduce a los pigmentos basados en delfinidina que, en muchas especies de plantas (por ejemplo, Petunia spp., Viola spp., Lisianthus spp., Gentiana spp., Sollya spp., Salvia spp., Clitoria spp., Kennedia spp., Campanula spp., Lavandula spp., Verbena spp., Torenia spp., Delphinium spp., Solanum spp., Cineraria spp., Vitis spp., Babiana stricta, Pinus spp., Picea spp., Larix spp., Phaseolus spp., Vaccinium spp., Cyclamen spp., Iris spp., Pelargonium sp., Liparieae, Geranium spp., Pisum spp., Lathyrus spp., Catharanthus spp., Malvia spp., Mucuna spp., Vicia spp., Saintpaulia spp., Lagerstroemia spp., bouchina spp., Plumbago spp., Hypocalyptus spp., Rhododendron spp., Linum spp., Macroptilium spp., Hibiscus spp., Hydrangea spp., Cymbidium spp., Millettia spp., Hedysarum spp., Lespedeza spp., Asparagus spp., Antigonon spp., Pisum spp., Freesia spp., Brunella spp., Clarkia spp., etc.) contribuyen al color púrpura y azul de las flores. Muchas especies tales como rosas, gerberas, crisantemos y claveles no producen
25 pigmentos basados en delfinidina debido a que carecen de una actividad de F3'5'H.
La siguiente etapa en la ruta, que conduce a la producción de las antocianinas coloreadas a partir de los dihidroflovonoides (DHK, DHQ, DHM) implica dihidroflavonol-4-reductasa (DFR) que conduce a la producción de las leucoantocianidinas. Las leucoantocianidinas se convierten posteriormente en antocianidinas, pelargonidina, cianidina y moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina. Estas moléculas de flavonoide son inestables bajo condiciones fisiológicas normales y la glucosilación en la posición 3, mediante la acción de las glucosiltransferasas, estabiliza la molécula de antocianidina permitiendo así la acumulación de las antocianinas. En general, las glucosiltransferasas transfieren los restos azúcar de los azúcares UDP a las moléculas de flavonoide y muestran altas especificidades de la posición de glucosilación y especificidades relativamente bajas para los sustratos
35 aceptores (Seitz y Hinderer, Anthocyanins. En: Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Constabel, F. y Vasil, I.K. (eds.), Academic Press, Nueva York, EE.UU., 5: 49-76,1988). Las antocianinas pueden presentarse como 3-monósidos, 3-biósidos y 3-triósidos, además de cómo 3,5-diglucósidos y 3,7-diglucósidos asociados con los azúcares glucosa, galactosa, ramnosa, arabinosa y xilosa (Strack y Wray, En: The Flavonoids - Advances in Research since 1986. Harborne, J.B. (ed), Chapman and Hall, Londres, RU, 1-22, 1993).
Las glucosiltransferasas implicadas en la estabilización de la molécula de antocianidina incluyen UDP glucosa: flavonoide 3-glucosil transferasa (3GT), que transfiere un resto de glucosa de la UDP glucosa a la posición 3-O de la molécula de antocianidina para producir antocianidina 3-O-glucósido.
45 En la petunia y el pensamiento (entre otras), la antocianidina 3-O-glucósido está en general glucosilada por otra glucosiltransferasa, la UDP ramnosa: antocianidin 3-glucosido ramnosiltransferasa (3RT), que añade un grupo ramnosa a la glucosa unida a 3-O de la molécula de antocianina para producir los antocianidin 3-rutinosidos y una vez acilados, pueden modificarse adicionalmente por la UDP glucosa: antocianin 5-glucosiltransferasa (5GT). Sin embargo, en rosas (entre otras), los antocianidin 3-O-glucósidos son generalmente glucosilados por otra glucosiltransferasa, la UDP glucosa antocianin 5-glucosiltransferasa (5GT) para producir antocianidin 3,5diglucósidos.
Muchos antocianidin glucósidos existen en forma de derivados acilados. Los grupos acilo que modifican los antocianidin glucósidos pueden dividirse en dos clases principales basándose en su estructura. Los grupos acilo
55 alifáticos incluyen ácido malónico o ácido succínico y la clase aromática incluye ácidos hidroxicinámicos tales como ácido p-cumárico, ácido cafeico y ácido ferúlico y los ácidos benzoicos tales como ácido p-hidroxibenzoico.
También puede producirse metilación en las posiciones 3' y 5' del anillo B de los antocianidin glucósidos. La metilación de los pigmentos basados en cianidina conduce a la producción de peonidina. La metilación de la posición 3' de los pigmentos basados en delfinidina produce la producción de petunidina, mientras que la metilación en las posiciones 3' y 5' produce la producción de malvidina. La metilación de la malvidina también puede producirse en las posiciones 5-O y 7-O para producir capensinina (5-O-metil malvidina) y 5,7-di-O-metil malvidina.
Además de las modificaciones anteriores, el pH de la vacuola o compartimiento donde los pigmentos están
65 localizados y la copigmentación con otros flavonoides tales como flavonoles y flavonas puede afectar el color del pétalo. Los flavonoles y las flavonas pueden también acilarse aromáticamente (Brouillard y Dangles, en: The
Flavonoids - Advances in Research since 1986. Harborne, J.B. (ed), Chapman y Hall, Londres, RU, 1-22, 1993).
La capacidad para controlar la actividad de F3'5'H, u otras enzimas que participan en la ruta de los flavonoides, en plantas de floración proporcionaría un medio de manipulación del color de partes de plantas tales como pétalos, 5 frutos, hojas, sépalos, semillas etc. Así podrían generarse diferentes versiones coloreadas de un único cultivar y en algunos casos una especie individual podría ser capaz de producir un espectro más amplio de colores.
Se han clonado dos secuencias de nucleótidos (denominadas aquí como SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3) que codifican F3'5'H de petunia (véase la solicitud de patente internacional nº PCT/AU92/00334 y Holton y col., Nature,
366: 276-279, 1993a). Estas secuencias fueron eficaces en la modulación de la 3',5' hidroxilación de flavonoides en petunia (véase la solicitud de patente internacional nº PCT/AU 92/00334 y Holton y col., 1993ª, arriba), tabaco (véase la solicitud de patente internacional nº PCT/AU92/00334) y claveles (véase la solicitud de patente internacional nº PCT/AU96/00296). Sorprendentemente, sin embargo, la inclusión de estas secuencias en casetes de expresión convencionales no condujo a la producción de transcriptos intactos o de longitud completa según se
15 detecta por ARN o análisis de transferencia Northern y consecuentemente los flavonoides 3',5'-hidroxilados no se produjeron en rosas. Por lo tanto, existe una necesidad de identificar secuencias genéticas adicionales que codifiquen F3'5'H que se acumulen eficientemente y sean capaces de modular la 3',5'-hidroxilación de flavonoides tales como antocianinas en rosas y otras especies vegetales comerciales clave.
Sumario de la invención
En toda esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra “comprenden” o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, se entenderán que implican la inclusión de un elemento establecido o número entero o grupo de elementos o números enteros, pero no la exclusión de ningún otro elemento
25 o número entero o grupo de elementos o números enteros.
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos se denominan por un número identificador de secuencia (SEQ ID NO:). SEQ ID NOs: se corresponde numéricamente con los identificadores de secuencia <400>1 (SEQ ID NO:1), <400>2 (SEQ ID NO:2), etc.
La secuencia genéticas que codifican una F3'5'H han sido identificadas y clonadas a partir de varias especies vegetales. Las secuencias genéticas de F3'5'H cuando se expresan en tejido de pétalo de rosa producen un nivel detectable de delfinidina o moléculas basadas en delfinidina como se determina por una técnica cromatográfica tal como cromatografía en capa fina (CCF) o cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC). Alternativamente, o
35 además, la expresión de las secuencias genéticas en tejido de pétalo de rosa producen un nivel suficiente y una longitud de transcrito que es capaz de ser traducida a F3'5'H. Esto se mide convenientemente como moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina, detectables utilizando una técnica cromatográfica tal como CCF o HPLC. Las secuencias genéticas descritas en el presente documento permiten la modulación de la expresión de genes que codifican esta enzima, por ejemplo, por de expresión de novo, expresión en exceso, supresión, inhibición antisentido, actividad de ribozimas, inducción por ARNi o inducción por metilación. La capacidad para controlar la síntesis de F3'5'H en plantas y más específicamente en rosas o gerberas permite la modulación de la composición de antocianinas individuales, además de la alteración de niveles relativos de flavonoles y antocianinas, permitiendo por lo tanto la manipulación del color de tejidos y/u órganos de plantas tales como pétalos, hojas, semillas, sépalos, frutos, etc.
45 Algunas de las moléculas de ácido nucleico codifican una F3'5'H que es capaz de una conversión más eficiente de DHK a DHM en rosas que lo que es la F3'5'H codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 como se mide por la producción de delfinidina en pétalos de rosa.
La eficiencia como se usa en el presente documento se refiere a la capacidad de la enzima F3'5'H para convertir su sustrato DHK o DHQ en DHM en una célula de rosa (o cualquier célula de una planta comercialmente importante tal como gerbera). Esta conversión provee a la planta de un sustrato (DHM) para otras enzimas de la ruta de los flavonoides que están presentes en las plantas para modificar adicionalmente el sustrato. Esta modificación puede incluir, por ejemplo, glucosilación, acilación, ramnosilación y/o metilación para producir diversas antocianinas que
55 contribuyen a la producción de una gama de colores. Así se permite la modulación de antocianinas 3',5'-hidroxiladas en rosa. La eficiencia se evalúa convenientemente por uno o más parámetros seleccionados de: grado de transcripción de F3'5'H, como se determina por la cantidad de ARNm de F3'5'H intacto producido (como se detecta por análisis de transferencia Northern); grado de traducción del ARNm de F3'5'H como se determina por la cantidad de producto de traducción producido; grado de actividad de la enzima F3'5'H como se determina por la producción de derivados de antocianina de DHQ o DHM que incluyen pigmentos de delfinidina o basados en delfinidina (como se detecta por CCF o HPLC); el grado de efecto sobre el color de la flor.
También se ha determinado sorprendentemente que ciertas combinaciones de secuencias de promotores y del gen F3'5'H que fueron funcionales en clavel y petunia no fueron funcionales en rosa. Sorprendentemente, solo un 65 subconjunto particular de combinaciones de secuencias de promotores y del gen F3'5'H produjeron flavonoides 3',5'hidroxilados en flores de rosa. Éstas incluyeron secuencias de F3'5'H aisladas de Viola spp, Salvia spp, Lavandula
spp, Sollya spp. Adicionalmente, las secuencias de F3'5'H de Viola (o F3'5'H de pensamiento) produjeron la acumulación más alta de flavonoides 3',5'-hidroxilados en rosa. Las novedosas combinaciones de secuencias de promotores y del gen F3'5'H pueden emplearse, entre otras cosas, para modular el color o sabor u otras características de plantas o partes de plantas tales como, pero no se limitan a, flores, frutos, frutos secos, raíces,
5 tallos, hojas o semillas. Así, la presente invención representa uno nuevo enfoque para desarrollar variedades de plantas que tengan características de color alteradas. Otros usos incluyen, por ejemplo, la producción de novedosos extractos de plantas transformadas con F3'5'H en las que el extracto tiene uso, por ejemplo, como aromatizante o aditivos alimentarios o productos para la salud o bebida o zumo o colorante. Las bebidas pueden incluir, pero no se limitan a, vinos, bebidas espirituosas, tés, café, leche y productos lácteos.
Por consiguiente, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada para su uso como promotor que es operable en tejido de pétalo de rosa que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:30 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencias con SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:30 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse
15 con al menos una de SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:30 o un complemento de las mismas bajo condiciones de alta rigurosidad.
Las secuencias de nucleótidos que codifican F3'5'H de pensamiento (SEQ ID NOs:9 y 11), F3'5'H de salvia (SEQ ID NOs:13 y 15), F3'5'H de Sollya (SEQ ID NO:17), F3'5'H de lavanda (SEQ ID NO:31) y F3'5'H de Kennedia (SEQ ID NO:26) se definen mediante identificadores de secuencia indicados en paréntesis. Un resumen de los identificadores de secuencia se muestra en la Tabla 1.
Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención proporciona la molécula de ácido nucleico de promotor anteriormente definida operativamente ligada a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
25 nucleótidos que codifica una flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F3'5'H), en el que la secuencia de nucleótidos está seleccionada de SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:31 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencias con SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:31 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con al menos una de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:31 o un complemento de las mismas bajo condiciones de alta rigurosidad, en el que la expresión de dicha molécula de ácido nucleico que codifica una F3'5'H en un tejido de pétalo produce niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina como se mide por una técnica cromatográfica.
35 Las secuencias de aminoácidos de las enzimas F3'5'H expuestas en SEQ ID NO:10 (pensamiento) o SEQ ID NO:12 (pensamiento) o SEQ ID NO:14 (salvia) o SEQ ID NO:16 (salvia) o SEQ ID NO:18 (Sollya) o SEQ ID NO:32 (lavanda) o SEQ ID NO:27 (Kennedia).
Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un método de producción de una planta que florece transgénica capaz de sintetizar una F3'5'H, comprendiendo dicho método transformar establemente una célula de una planta adecuada con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de promotor desvelada en las reivindicaciones operativamente ligada a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una F3'5'H como se ha definido en las reivindicaciones en condiciones que permitan la
45 eventual expresión de dichas secuencias de ácidos nucleicos, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cultivar dicha planta transgénica durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. La expresión de la secuencia de ácidos nucleicos generalmente produce una transcripción de nivel y longitud suficiente para codificar una F3'5'H. Esto se determina convenientemente mediante niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina como se mide por técnicas cromatográficas tales como CCF o HPLC. La planta transgénica puede por lo tanto producir una F3'5'H no indígena a niveles elevados con respecto a la cantidad expresada en una planta no transgénica comparable. Esto produce generalmente un cambio de color visualmente detectable en la planta o parte de la planta o preferiblemente en la florescencia o flores de dicha planta.
55 Otro aspecto de la presente invención contempla un método de producción de una planta transgénica con actividad de F3'5'H reducida, comprendiendo dicho método transformar establemente una célula de una planta adecuada con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de promotor desvelada en las reivindicaciones operativamente ligada a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
o complementaria a una secuencia que codifica una actividad de F3'5'H como se define en las reivindicaciones, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cuando sea necesario cultivar dicha planta transgénica bajo condiciones suficientes para permitir la expresión del ácido nucleico.
Todavía otro aspecto de la presente invención contempla una planta genéticamente modificada o parte de la misma
o células de la misma que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de promotor
65 desvelada en las reivindicaciones operativamente ligada a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una F3'5'H como se define en las reivindicaciones o que comprende un nivel alterado de expresión de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una F3'5'H como se define en las reivindicaciones con respecto al nivel de expresión en una planta no genéticamente modificada, preferentemente en el que la planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma presentan flores o inflorescencia alteradas.
5 Todavía otro aspecto de la presente invención contempla el uso de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de promotor desvelada en las reivindicaciones operativamente ligada a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una F3'5'H como se define en las reivindicaciones en la fabricación de: (i) una planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la
10 misma; o (ii) una construcción genética que puede expresar F3'5'H o regular por disminución una enzima F3'5'H indígena en una planta.
Incluso todavía otro aspecto de la presente invención se extiende a todas las plantas transgénicas o partes de plantas transgénicas o progenie de las plantas transgénicas que contienen las secuencias de ácidos nucleicos de la
15 presente invención como se define en las reivindicaciones, o formas antisentido de las mismas y/o cualquier homólogo o formas relacionadas de las mismas como se define en las reivindicaciones y, en particular, aquellas plantas transgénicas que presentan propiedades florales o de inflorescencia alteradas.
Incluso todavía otro aspecto de la presente invención se extiende a todas las plantas transgénicas o partes de
20 plantas transgénicas o progenie de las plantas transgénicas que contienen las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención como se define en las reivindicaciones, o formas antisentido de las mismas y/o cualquier homólogo o forma relacionada de las mismas como se define en las reivindicaciones y, en particular, aquellas plantas transgénicas que presentan partes aéreas alteradas de la planta tal como propiedades de fruto, bayas, sépalo, bráctea, pecíolo, pedúnculo, ovario, anteras o tallo.
25 Otro aspecto de la presente invención contempla los extractos de las flores de plantas transgénicas o partes de las mismas o células como se definen en las reivindicaciones y, en particular, los extractos de las flores de aquellas plantas transgénicas cuando se usan como aromatizante o aditivo alimentario o producto para la salud o bebida o zumo o colorante.
30 Todavía otro aspecto de la presente invención se refiere a un organismo procariota o eucariota no humano que lleva una secuencia genética que codifica una F3'5'H como se define en las reivindicaciones extracromosómicamente en forma de plásmido.
35 Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una molécula de ácido nucleico como se define en las reivindicaciones en la identificación o amplificación y clonación de material genético que codifica una F3'5'H.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una molécula de ácido nucleico como se define en las reivindicaciones en la identificación o amplificación y clonación de material genético que define un promotor de 40 chalcona sintasa.
Así, la presente invención proporciona promotores que operan eficientemente en plantas tales como rosa y gerbera
o plantas botánicamente relacionadas. Tales promotores incluyen un promotor CHS de rosa y un promotor CHS de crisantemo. También se desvela el promotor CaMV 35S.
45 Un resumen de identificadores de secuencia usados en toda la memoria descriptiva objeto se proporciona en la Tabla 1:
TABLA 1: Resumen de identificadores de secuencia
SEQ ID NO:
NOMBRE ESPECIE TIPO DE SEQ DESCRIPCIÓN
1
petHf1.nt Petunia hybrida nucleótido ADNc de F3'5'H
2
petHf1.aa Petunia hybrida aminoácido traducción de ADNc de F3'5'H
3
petHf2.nt Petunia hybrida nucleótido ADNc de F3'5'H
4
petHf2.aa Petunia hybrida aminoácido traducción de ADNc de F3'5'H
5
promotor RoseCHS Rosa hybrida nucleótido fragmento de promotor
6
D8 oligo#2 Petunia hybrida nucleótido oligonucleótido
7
D8 oligo #4 Petunia hybrida nucleótido oligonucleótido
8
chrysanCHSATG crisantemo nucleótido oligonucleótido
9
BP#18.nt Viola spp. nucleótido ADNc de F3'5'H
10
BP#18.aa Viola spp. aminoácido traducción de ADNc de F3'5'H
11
BP#40.nt Viola spp. nucleótido ADNc de F3'5'H
12
BP#40.aa Viola spp. aminoácido traducción de ADNc de F3'5'H
13
Sal#2.nt Salvia spp. nucleótido ADNc de F3'5'H
14
Sal#2.aa Salvia spp. aminoácido traducción de ADNc de F3'5'H
15
Sal#47.nt Salvia spp. nucleótido ADNc de F3'5'H
16
Sal#47.aa Salvia spp. aminoácido traducción de ADNc de F3'5'H
17
Soll#5.nt Sollya spp. nucleótido ADNc de F3'5'H
18
Soll#5.aa Sollya spp. aminoácido traducción de ADNc de F3'5'H
19
FLS-Nco Petunia hybrida nucleótido oligonucleótido
20
BpeaHF2.nt Clitoria ternatea nucleótido ADNc de F3'5'H
21
BpeaHF2.aa Clitoria ternatea aminoácido traducción de ADNc de F3'5'H
22
Gen#48.nt Gentiana triflora nucleótido ADNc de F3'5'H
23
Gen#48.aa Gentiana triflora aminoácido traducción de ADNc de F3'5'H
24
PetD8 5' Petunia hybrida nucleótido oligonucleótido
25
Cebador de Bpea Clitoria ternatea nucleótido oligonucleótido
26
Kenn#31.nt Kennedia spp. nucleótido ADNc de F3'5'H
27
Kenn#31.aa Kennedia spp. aminoácido traducción de ADNc de F3'5'H
28
chrysCHS.nt crisantemo nucleótido ADNc de CHS
29
chrysCHS.aa crisantemo aminoácido traducción de ADNc de CHS
30
Promotor de chrysCHS crisantemo nucleótido fragmento de promotor
31
LBG.nt Lavandula nil nucleótido ADNc de F3'5'H
32
LBG.aa Lavandula nil aminoácido traducción de ADNc de F3'5'H
Breve descripción de las figuras
Las Figuras 1Ay 1B son representaciones esquemáticas de la ruta de biosíntesis para los pigmentos flavonoides. La
5 Figura 1A ilustra la producción general de antocianidin 3-glucósidos que se producen en la mayoría de las plantas que producen antocianinas. La Figura 1B representa modificaciones adicionales de las antocianinas que se producen en petunia. Las enzimas que participan en la ruta se indican como sigue: PAL = Fenilalanina amonio-liasa; C4H = Cinamato 4-hidroxilasa; 4CL = 4-cumarato: CoA ligasa; CHS = Chalcona sintasa, CHI = Chalcona flavanona isomerasa; F3H = Flavanona 3-hidroxilasa; DFR = Dihidroflavonol-4-reductasa; ANS = antocianidin sintasa, 3GT =
10 UDP-glucosa: flavonoide 3-O-glucosiltransferasa; 3RT = UDP ramnosa: antocianidin 3-glucósido ramnosiltransferasa, AR-AT = Antocianidin rutinósido-aciltransferasa, 5GT = Antocianin 5-glucosiltransferasa; 3'OMT = Antocianin 3'-O-metiltransferasa, 3'5' OMT = Antocianin 3',5'-O-metiltransferasa. Otras abreviaturas incluyen: DHK = dihidrocanferol, DHQ = dihidroquercetina, DHM = dihidromiricetina;
15 TABLA 2: Descripciones de las abreviaturas usadas en las Figuras 2 a 52 La Figura 2 es una representación en diagrama del plásmido pCGP602, pCGP601 y pCGP176 que contiene clones de ADNc de F3'5'H de petunia petHf1 de P. hybrida cv. OGB. El fragmento de F3'5'H de petunia petHf1 se usó en la preparación de construcciones que contienen el clon de ADNc de F3'5'H de petunia. Los fragmentos marcados con
ABREVIATURA
DESCRIPCIÓN
Amp
gen de resistencia a la ampicilina que confiere resistencia al antibiótico ampicilina
ColElori
origen de replicación de plásmido
f1 ori (+)
origen de replicación de fago filamentoso f1
GentR
gen de resistencia a la gentamicina que confiere resistencia al antibiótico gentamicina
LB
frontera izquierda del ADN-T
nptIII
el gen neomicina fosfotransferasa III que confiere resistencia al antibiótico kanamicina
ori pRi
origen de replicación de plásmido
ori 322
origen de replicación de plásmido
pACYC ori
replicón modificado de pACYC184 de E. coli
pVS1
un origen de replicación de amplio espectro de huésped de un plásmido de Pseudomonas aeruginosa
rev
localización aproximada del sito del cebador inverso M13 usado en el análisis de secuencias
RB
frontera derecha del ADN-T
TetR
gen de resistencia a la tetraciclina que confiere resistencia al antibiótico tetraciclina
-20
localización aproximada del sitio de cebador M13 - 20 usado en el análisis de secuencias
RK2
origen de plásmido RK2 Gram-negativo de amplio espectro de huésped
5 32P del fragmento BspHI/FspI de 1,6 kb se usaron para sondar las bibliotecas de ADNc de pétalo. Se marcan los sitios de endonucleasa de restricción seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 3 es una representación en diagrama del plásmido pCGP175 que contiene el clon de ADNc de F3'5'H 10 petHf2 de petunia de P. hybrida cv. OGB. Se marcan los sitios de endonucleasa de restricción seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 4 es una representación en diagrama del plásmido pCGP1303 que contiene un subclon del clon de ADNc de F3'5'H de petunia petHf1 de pCGP601. La construcción de pCGP1303 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan 15 los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 5 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1452. El gen AmCHS 5': petHf1: petD8 3' de pCGP485 fue clonado en el vector binario pWTT2132 (DNAP) en una orientación en tándem con el gen quimérico 20 SuRB. La construcción de pCGP1452 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 6 es una representación en diagrama del plásmido binario pWTT2132 (DNAP) que contiene el gen marcador de selección 35S 5': SuRB y un sitio de clonación múltiple. Se facilita una descripción de pWTT2132 en el 25 Ejemplo 4. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 7 es una representación en diagrama del plásmido pCGP725. El gen AmCHS 5': petHf1: petD8 3' de pCGP485 se clonó en el vector pBluescript II SK (+). La construcción de pCGP725 se describe en el Ejemplo 4. Se 30 marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 8 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1453. El gen Mac: petHf1: mas 3' de pCGP628 se clonó en el vector binario pWTT2132 (DNAP) en una orientación en tándem con el gen quimérico 35 SuRB. La construcción de pCGP1453 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 9 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1457. El gen petD8 5': petHf1: petD8 3' de pCGP1107 se clonó en el vector binario pWTT2132 (DNAP) en una orientación en tándem con el gen quimérico 40 SuRB. La construcción de pCGP1457 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 10 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1461. El gen shortpetFLS 5': petHf1: petFLS 3' de pCGP497 se clonó en el vector binario pWTT2132 (DNAP) en una orientación en tándem con el gen 45 quimérico SuRB. La construcción de pCGP1461 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 11 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1616. El gen petRT 5': petHf1: nos 3' de pCGP846 se clonó en el vector binario pWTT2132 (DNAP) en una orientación en tándem con el gen quimérico 50 SuRB. La construcción de pCGP1616 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 12 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1623. El gen mas/35S: petHf1: ocs 3' de pCGP1619 se clonó en el vector binario pWTT2132 (DNAP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1623 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 13 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1638. El gen CaMV 35S: petHf1: nos 3'
5 de pCGP1636 se clonó en el vector binario pWTT2132 (DNAP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1636 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 14 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1860. El gen RoseCHS 5': petHf1: nos 3' de pCGP200 se clonó en el vector binario pWTT2132 (DNAP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1860 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 15 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP2123. El gen CaMV 35S: petHf2: ocs 3'
15 de pCGP2109 se clonó en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2123 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 16 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1988. El sitio de donación múltiple del vector binario pWTT2132 (DNAP) se sustituyó con el sitio de clonación múltiple de pNEB193 (New England Biolabs). La construcción de pCGP1988 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 17 es una representación en diagrama del plásmido pCGP2105. El casete de expresión 35S 5': ocs 3' con
25 múltiples sitios de restricción de endonucleasa entre los fragmentos de promotor y terminador esta en un esqueleto del vector pBluescript SK (+). La construcción de pCGP2105 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 18 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1307. El gen petD8 5': GUS: petD8 3' de pCGP1106 se clonó en el vector binario pCGN1548 en una orientación en tándem con el gen marcador de selección quimérico nptlI. La construcción de pCGP1307 se describe en el Ejemplo 6. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
35 La Figura 19 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1506. El gen longpetFLS 5': GUS: petFLS 3' de pCGP496 se clonó en el vector binario pBIN19 en una orientación en tándem con el gen marcador de selección quimérico nptlI. La construcción de pCGP1506 se describe en el Ejemplo 6. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 20 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1626. El gen ChrysCHS 5': GUS: nos 3' de pCGP1622 se clonó en el vector binario pWTT2132 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1626 se describe en el Ejemplo 6. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
45 La Figura 21 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1641. El gen petRT 5': GUS: petRT 3' de pCGP1628 se clonó en el vector binario pWTT2132 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1641 se describe en el Ejemplo 6. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 22 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1861. El gen RoseCHS 5': GUS: nos 3' de pCGP197 se clonó en el vector binario pWTT2132 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1861 se describe en el Ejemplo 6. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
55 La Figura 23 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1953. El gen AmCHS 5': GUS: petD8 3' de pCGP1952 se clonó en el vector binario pWTT2132 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1953 se describe en el Ejemplo 6. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 24 es una representación en diagrama del plásmido binario pWTT2084 (DNAP) que contiene un gen 35S 5': GUS: ocs 3' en una orientación convergente con el gen marcador de selección quimérico SuRB. Se facilita una descripción de pWTT2084 en el Ejemplo 6. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
65 La Figura 25 es una representación en diagrama del plásmido pCGP1959 que contiene el clon de ADNc de F3'5'H BP#18 de Viola spp. cv. pensamiento negro en un esqueleto de pBluescript SK II (+). Se facilita una descripción de pCGP1959 en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 26 es una representación en diagrama del plásmido pCGP1961 que contiene el clon de ADNc de F3'5'H
5 BP#40 de Viola spp. cv. pensamiento negro en un esqueleto de pBluescript SK II (+). Se facilita una descripción de pCGP1961 en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 27 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1972. El gen AmCHS 5': BP#18: petD8 3' de pCGP1970 se clonó en el vector binario pWTT2132 (DNAP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1972 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 28 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1973. El gen AmCHS 5': BP#40: petD8
15 3' de pCGP1971 se clonó en el vector binario pWTT2132 (DNAP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1973 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 29 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1967. El gen CaMV 35S: BP#18:ocs 3' de pCGP1965 se clonó en el vector binario pWTT2132 (DNAP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1967 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 30 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1969. El gen CaMV 35S: BP#40:ocs 3'
25 de pCGP1966 se clonó en el vector binario pWTT2132 (DNAP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1969 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 31 es una representación en diagrama del plásmido pCGP1995 que contiene el clon de ADNc de F3'5'H Sal#2 de Salvia spp. en un esqueleto de pBluescript SK II (+). Se facilita una descripción de pCGP1995 en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 32 es una representación en diagrama del plásmido pCGP1999 que contiene el clon de ADNC de F3'5'H
35 Sal#47 de Salvia spp. en un esqueleto de pBluescript SK II (+). Se facilita una descripción de pCGP1999 en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 33 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP2121. El gen AmCHS 5': Sal#2: petD8 3' de pCGP2116 se clonó en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2121 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 34 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP2122. El gen AmCHS 5': Sal#47: petD8
45 3' de pCGP2117 se clonó en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2122 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 35 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP2120. El gen CaMV 35S: Sal#2: ocs 3' de pCGP2112 se clonó en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2120 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 36 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP2119. El gen CaMV 35S: Sal#47: ocs 3'
55 de pCGP2111 se clonó en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2119 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 37 es una representación en diagrama del plásmido pCGP2110 que contiene el clon de ADNc de F3'5'H Soll#5 de Sollya spp. en un esqueleto de pBluescript SK II (+). Se facilita una descripción de pCGP2110 en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 38 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP2130. El gen AmCHS 5': Soll#5: petD8 3'
65 de pCGP2128 se clonó en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2130 se describe en el Ejemplo 7. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 39 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP2131. El gen CaMV 35S: Soll#5: ocs 3' de pCGP2129 se clonó en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La 5 construcción de pCGP2131 se describe en el Ejemplo 7. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 40 es una representación en diagrama del plásmido pCGP2231 que contiene el clon de ADNc de F3'5'H Kenn#31 de Kennedia spp. en un esqueleto de pBluescript SK II (+). Se facilita una descripción de pCGP2231 en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 41 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP2256. El gen AmCHS 5': Kenn#31: petD8 3' de pCGP2242 se clonó en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico
15 SuRB. La construcción de pCGP2256 se describe en el Ejemplo 7. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 42 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP2252. El gen de CaMV 35S: Kenn#31: ocs 3' de pCGP2236 se clonó en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2252 se describe en el Ejemplo 7. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 43 es una representación en diagrama del plásmido pBHF2F que contiene el clon de ADNc de F3'5'H BpeaHF2 de longitud completa de Clitoria ternatea en un esqueleto de pBluescript SK II (+). Se facilita una
25 descripción de pBHF2F en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 44 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP2135. El gen AmCHS 5': BpeaHF2: petD8 3' de pCGP2133 se clonó en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2135 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 45 es una representación en diagrama del plásmido binario pBEBF5. El gen eCaMV 35S: BpeaHF2: nos 3' se construyó sustituyendo el fragmento GUS de pBE2113-GUSs con el clon de ADNc de F3'5'H BpeaHF2 de Clitoria
35 de pBHF2F. La construcción de pBEBF5 se describe en el Ejemplo 7. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 46 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP2134. El gen CaMV 35S: BpeaHF2: ocs 3' de pCGP2132 se clonó en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2134 se describe en el Ejemplo 7. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 47 es una representación en diagrama del plásmido pG48 que contiene el clon de ADNc de F3'5'H Gen#48 de Gentiana triflora en un esqueleto de pBluescript SK II (+). Se facilita una descripción de pG48 en el
45 Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 48 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1498. El gen AmCHS 5': Gen#48: petD8 3' de pCGP1496 se clonó en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1498 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 49 es una representación en diagrama del plásmido binario pBEGHF48. El gen eCaMV 35S: Gen#48: nos 3' se construyó sustituyendo el fragmento GUS de pBE2113-GUSs con el clon de ADNc de F3'5'H Gen#48 de
55 Gentiana de pG48. La construcción de pBEGHF48 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 50 es una representación en diagrama del plásmido binario pCGP1982. El gen CaMV 35S: Gen#48: ocs 3' de pCGP1981 se clonó en el vector binario pWTT2132 (DNAP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1982 se describe en el Ejemplo 7. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 51 es una representación en diagrama del plásmido pLFH8 que contiene el clon de ADNc de F3'5'H LBG de Lavandula nil en un esqueleto de pBluescript SK II (+). Se facilita una descripción de pLFH8 en el Ejemplo 7. Se
65 marcan los sitios de restricción de endonucleasa seleccionados. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.
La Figura 52 es una representación en diagrama del plásmido binario pBELF8. El gen eCaMV 35S: LBG: nos 3' se construyó sustituyendo el fragmento GUS de pBE2113-GUSs con el clon de ADNc de F3'5'H LBG de Lavandula de pLHF8. La construcción de pBELF8 se describe en el Ejemplo 7. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una
5 descripción de las abreviaturas.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Se han identificado, clonado y evaluado secuencias genéticas que codifican polipéptidos que tienen actividad de F3'5'H. Las secuencias genéticas recombinantes de la presente invención como se han definido en las reivindicaciones permiten la modulación de la expresión de genes que codifican esta enzima, por ejemplo, por expresión de novo, expresión en exceso, supresión de sentido, inhibición antisentido, actividad de ribozima, minimiza y ADNzima, inducción de ARNi o inducción de la metilación u otras actividades de silenciamiento transcripcional o postranscripcional. La inducción de ARNi incluye moléculas genéticas tales como ADN o ARN de
15 horquilla, de cadena doble corta y ADN o ARN de cadena parcialmente doble con uno o dos nucleótidos protuberantes de cadena sencilla. La capacidad para controlar la síntesis de F3'5'H en plantas permite la modulación de la composición de antocianinas individuales, además de la alteración de niveles relativos de flavonoles y antocianinas, permitiendo así la manipulación del color de los pétalos. Además, la presente invención se extiende a plantas y partes reproductivas o vegetativas de las mismas que incluyen flores, frutos, semillas, verduras, hojas, tallos y similares. La presente invención se extiende adicionalmente a plantas ornamentales transgénicas o genéticamente modificadas. El término “transgénico” también incluye plantas de progenie y plantas de genética posterior y/o cruces de las mismas a partir de plantas transgénicas primarias.
Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada para su
25 uso como un promotor que es operable en tejido de pétalo de rosa que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:30 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencias con SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:30 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con al menos una de SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:30 o un complemento de las mismas bajo condiciones de alta rigurosidad.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a la molécula de ácido nucleico de promotor anteriormente definida operativamente ligada a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F3'5'H), en la que la secuencia de nucleótidos está seleccionada de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ
35 ID NO:26 y SEQ ID NO:31 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencias con SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:31 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con al menos una de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:31 o un complemento de las mismas bajo condiciones de alta rigurosidad, en el que la expresión de dicha molécula de ácido nucleico que codifica una F3'5'H en un tejido de pétalo produce niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina como se mide por una técnica cromatográfica.
En el presente documento se desvela una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de
45 nucleótidos que codifica o complementaria a una secuencia que codifica una F3'5'H o un polipéptido que tiene actividad de F3'5'H en la que la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en un tejido de pétalo de rosa produce un transcrito de longitud completa que es detectable por un análisis de transferencia Northern de ARN total aislado a partir de pétalos de rosa.
En el presente documento también se describe y ejemplifica la identificación, clonación y manipulación de secuencias genéticas que codifican una F3'5'H que actúa de DHK, además de DHQ. La enzima F3'5'H puede ser una F3'5'H de pensamiento, salvia, Sollya, lavanda o Kennedia. La enzima F3'5'H también puede considerarse que incluye un polipéptido o proteína que tiene una actividad de F3'5'H o actividad similar a F3'5'H. Esta última engloba derivados que tienen actividades de F3'5'H alteradas.
55 En el presente documento se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o es complementaria a una secuencia que codifica una F3'5'H o un mutante funcional, derivado, parte, fragmento, homólogo o análogo de la misma en la que la molécula de ácido nucleico se caracteriza por lo siguiente:
(i) el transcrito de F3'5'H en tejido de pétalo de rosa es de nivel y tamaño suficiente para codificar una F3'5'H resultante en moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina detectables en el tejido de pétalo de rosa como se mide por un procedimiento cromatográfico (por ejemplo CCF o HPLC);
65 (ii) el transcrito de F3'5'H en tejido de pétalo de rosa es de longitud completa y se detecta por análisis de transferencia Northern del ARN total aislado de tejido de pétalo de rosa
(iii) la F3'5'H en tejido de pétalo de rosa produce moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina detectables como se mide por un procedimiento cromatográfico (por ejemplo, CCF o HPLC); y/o
5 (iv) la F3'5'H produce un cambio de color visible en tejido de pétalo de rosa.
El término pigmentos basados en delfinidina incluye la antocianidina, la delfinidina o cualquier derivado de los mismos que incluyen, pero no se limitan a, formas glucosiladas, aciladas, metiladas u otras formas modificadas. Las formas metiladas de la delfinidina incluyen, pero no se limitan a, la antocianidina petunidina (metilada en la posición 3'), malvidina (metilada en las posiciones 3' y 5'), 5-O metilmalvidina (metilada en las posiciones 5, 3' y 5'), 5,7-O dimetilmalvidina (metilada en las posiciones 5, 7, 3' y 5'). Las antocianidinas metiladas también pueden modificarse por glucosilación y acilación. El término antocianinas define formas glucosiladas de las antocianidinas respectivas.
Por el término “molécula de ácido nucleico” se entiende una secuencia genética en una condición que se produce no
15 naturalmente. Generalmente, esto significa aislado de su estado natural o sintetizado o derivado de un ambiente que se produce no naturalmente. Más específicamente, incluye moléculas de ácido nucleico formadas o mantenidas in vitro, incluyendo fragmentos de ADN genómico, moléculas recombinantes o sintéticas y ácidos nucleicos en combinación con ácidos nucleicos heterólogos. También se extiende al ADN o ADNc genómico o a partes de los mismos que codifican F3'5'H o una parte de los mismos en orientación inversa con respecto a su propio promotor o a otro. Se extiende adicionalmente a secuencias que se producen naturalmente siguiendo al menos una purificación parcial con respecto a otras secuencias de ácidos nucleicos.
El término “secuencias genéticas” se usa en el presente documento en su sentido más general y engloba cualquier serie contigua de bases de nucleótidos que especifican directamente, o mediante una serie de bases
25 complementarias, una secuencia de aminoácidos en una enzima F3'5'H. Una secuencia de aminoácidos tal puede constituir una F3'5'H de longitud completa tal como se expone en SEQ ID NO:10 (pensamiento) o SEQ ID NO:12 (pensamiento) o SEQ ID NO:14 (salvia) o SEQ ID NO:16 (salvia) o SEQ ID NO:18 (Sollya) o SEQ ID NO:32 (lavanda) o SEQ ID NO:27 (Kennedia) o una forma truncada activa de las mismas o puede corresponderse con una región particular tal como una porción del extremo N, del extremo C o interna de la enzima. Una secuencia genética también puede denominarse una secuencia de nucleótidos e incluye una fusión recombinante de dos o más secuencias.
Según los aspectos anteriores, en el presente documento se describe una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos o secuencia de nucleótidos complementaria sustancialmente como se
35 expone en SEQ ID NO:9 (pensamiento) o SEQ ID NO:11 (pensamiento) o SEQ ID NO:13 (salvia) o SEQ ID NO:15 (salvia) o SEQ ID NO:17 (Sollya) o SEQ ID NO:31 (lavanda) o SEQ ID NO:26 (Kennedia) o que tiene al menos aproximadamente el 50% de similitud con las mismas o que puede hibridarse con la secuencia expuesta en SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15 o SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:31 o SEQ ID NO:26 bajo condiciones de baja rigurosidad.
La Tabla 1 proporciona un resumen de los identificadores de secuencia.
Porcentajes de similitudes e identidades alternativos (al nivel de nucleótidos o aminoácidos) incluyen al menos aproximadamente el 60% o al menos aproximadamente el 65% o al menos aproximadamente el 70% o al menos
45 aproximadamente el 75% o al menos aproximadamente el 80% o al menos aproximadamente el 85% o al menos aproximadamente el 90% o superior, tal como aproximadamente el 95% o aproximadamente el 96% o aproximadamente el 97% o aproximadamente el 98% o aproximadamente el 99%, tal como al menos aproximadamente el 60%, 61%, 62%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%.
Para los fines de determinación del nivel de rigurosidad para definir las moléculas de ácido nucleico capaces de hibridarse con SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15 o SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:31 o SEQ ID NO:26, referencia en el presente documento a una baja rigurosidad incluye y 55 engloba de al menos aproximadamente el 0% a al menos aproximadamente el 15% v/v de formamida y de al menos aproximadamente 1 M a al menos aproximadamente 2 M de sal para hibridación, y al menos aproximadamente 1 M a al menos aproximadamente 2 M de sal para condiciones de lavado. Generalmente, la baja rigurosidad es de aproximadamente 25-30 ºC a aproximadamente 42 ºC. La temperatura puede alterarse y usarse mayores temperaturas para sustituir la inclusión de formamida y/o para dar condiciones de rigurosidad alternativas. Las condiciones de rigurosidad alternativas pueden aplicarse cuando sea necesario, tal como rigurosidad media, que incluye y engloba de al menos aproximadamente 16% v/v a al menos aproximadamente 30% v/v de formamida y de al menos aproximadamente 0,5 M a al menos aproximadamente 0,9 M de sal para hibridación, y al menos aproximadamente 0,5 M a al menos aproximadamente 0,9 M de sal para condiciones de lavado, o alta rigurosidad, que incluye y engloba de al menos aproximadamente 31% v/v a al menos aproximadamente 50% v/v de formamida 65 y de al menos aproximadamente 0,01 M a al menos aproximadamente 0,15 M de sal para hibridación, y al menos aproximadamente 0,01 M a al menos aproximadamente 0,15 M de sal para condiciones de lavado. En general, el
lavado se lleva a cabo a Tm = 69,3 + 0,41 (G + C)% (Marmur y Doty, J. Mol. Biol. 5:109, 1962). Sin embargo, la Tm de un ADN dúplex disminuye 1 ºC con cada incremento del 1% en el número de pares de bases desapareadas (Bonner y Laskey, Eur. J. Biochem. 46: 83, 1974). La formamida es opcional en estas condiciones de hibridación. Por consiguiente, niveles particularmente preferidos de rigurosidad se definen como sigue: rigurosidad baja es 6 x
5 tampón SSC, 1% p/v de SDS a 25-42 ºC; rigurosidad moderada es 2 x tampón SSC, 1,0% p/v de SDS a una temperatura en el intervalo 20 ºC a 65 ºC; rigurosidad alta es 0,1 x tampón SSC, 0.1% p/v de SDS a una temperatura de al menos 65 ºC.
También se divulgan en el presente documento moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica o complementaria a una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:18 o SEQ ID NO:32 o SEQ ID NO:27 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 50% de similitud con las mismas.
15 El término similitud como se usa en el presente documento incluye identidad exacta entre secuencias comparadas al nivel de nucleótidos o de aminoácidos. Si hay no identidad al nivel de nucleótidos, la similitud incluye diferencias entre secuencias que producen diferentes aminoácidos que no obstante están relacionados entre sí a niveles estructurales, funcionales, bioquímicos y/o conformacionales. SI hay no identidad al nivel de aminoácidos, la similitud incluye aminoácidos que no obstante están relacionados entre sí a niveles estructurales, funcionales, bioquímicos y/o conformacionales. En una realización particularmente preferida, las comparaciones de nucleótidos y secuencias se hacen a nivel de identidad más que de similitud.
Los términos usados para describir relaciones de secuencias entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen “secuencia de referencia”, “ventana de comparación”, “similitud de secuencias”, “identidad de secuencias”, 25 “porcentaje de similitud de secuencias”, “porcentaje de identidad de secuencias”, “sustancialmente similar” e “identidad sustancial”. Una “secuencia de referencia” tiene al menos 12, pero frecuentemente 15 a 18 y frecuentemente al menos 25 o más, tal como 30 unidades de monómero, incluyendo nucleótidos y residuos de aminoácidos, de longitud. Debido a que dos polinucleótidos pueden comprender (1) una secuencia (es decir, solo una porción de la secuencia de polinucleótidos completa) que es similar entre dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos se realizan normalmente comparando secuencias de los dos polinucleótidos en una “ventana de comparación” para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. Una “ventana de comparación” se refiere a un segmento conceptual de normalmente 12 residuos contiguos que se compara con una secuencia de referencia. La ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) de
35 aproximadamente el 20% o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento optimo de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse por implementaciones computarizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madisson, WI, EE.UU.) o por inspección y el mejor alineamiento (es decir, resultante del mayor porcentaje de homología con respecto a la ventana de comparación) generado por cualquiera de los diversos métodos seleccionados. También puede hacerse referencia a la familia BLAST de programas, por ejemplo, desvelada por Altschul y col. (Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Una discusión detallada de análisis de secuencias puede encontrarse en la unidad 19.3 de Ausubel y col. (“Current Protocols in Molecular Biology” John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Capítulo 15, 1998).
45 Los términos “similitud de secuencias” e “identidad de secuencias” como se usan en el presente documento se refieren al grado en que las secuencias son idénticas o funcional o estructuralmente similares sobre una base nucleótido por nucleótido o una base aminoácido por aminoácido con respecto a una ventana de comparación. Así, un “porcentaje de identidad de secuencias”, por ejemplo, se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales la base de ácidos nucleicos idénticos (por ejemplo, A, T, C, G, I) o los residuos de aminoácidos idénticos (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) se presentan en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el
55 resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencias. Para los fines de la presente invención, se entenderá que “identidad de secuencias” significa el “porcentaje de coincidencia” calculado mediante el programa de ordenador DNASIS (versión 2.5 para Windows; disponible de Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, EE.UU.) usando valores por defecto convencionales como se usan en el manual de referencia adjunto al software. Se aplican comentarios similares a la similitud de secuencias.
Las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento pueden caracterizarse adicionalmente por tener, o haber tenido antes de la derivación, un contenido de AT global inferior (o contenido de GC superior) en comparación con una molécula de ácido nucleico que codifica una F3'5'H, pero que no produce transcrito intacto detectable en tejido de pétalo de rosa o, cuando se expresa, no produce moléculas de delfinidina o basadas en 65 delfinidina detectables como se mide por un procedimiento cromatográfico tal como CCF o HPLC. Adicionalmente, el % de A o T en la tercera posición de un codón también es inferior a otras enzimas de F3'5'H. Referencia en el
presente documento a un procedimiento cromatográfico incluye un procedimiento relacionado. Por “relacionado” se entiende un procedimiento técnicamente relacionado o un procedimiento que proporciona un resultado similar. Los ejemplos de procedimientos relacionados incluyen otras formas de cromatografía (por ejemplo, cromatografía de gases).
5 Además, las secuencias de nucleótidos que no se expresan bien en tejido de rosa pueden modificarse tal como reduciendo el % de AT global o al menos reduciendo los niveles del % de AT en la tercera posición de un codón para dirigir la expresión en tejido de rosa.
También se desvelan oligonucleótidos útiles como sondas genéticas para reacciones de amplificación o como moléculas antisentido o sentido capaces de regular la expresión del gen correspondiente en una planta. Las moléculas sentido incluyen construcciones en horquilla, ADN y ARN de cadena doble corta y ADN y ARN de cadena parcialmente doble con uno o más nucleótidos protuberantes de cadena sencilla. Una molécula antisentido como se usa en el presente documento también puede englobar una construcción genética que comprende el gen genómico
15 estructural o de ADNc o parte del mismo en orientación inversa con respecto a su promotor o a otro. También puede englobar una secuencia genética homologa. Una molécula de antisentido o sentido también pude dirigirse a porciones terminales o internas del gen que codifica un polipéptido que tiene una actividad de F3'5'H o a combinaciones de los anteriores de tal forma que se reduzca o elimine la expresión del gen.
Con respecto al aspecto anteriormente descrito, un oligonucleótido puede comprender de 5-50 nucleótidos, tales como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 que tienen similitud sustancial con una parte o región de una molécula con una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15 o SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:31 o SEQ ID NO:26. Por similitud o 25 complementariedad sustancial en este contexto se entiende una similitud hibridable bajo condiciones de rigurosidad baja, alternativa y preferiblemente media y alternativa y lo más preferiblemente alta especificas para hibridación de oligonucleótidos (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, EE.UU., 1989). Tal oligonucleótido es útil, por ejemplo, en la selección de secuencias genéticas de F3'5'H a partir de diversas fuentes o para monitorizar una secuencia genética introducida en una planta transgénica. El oligonucleótido preferido está dirigido a una secuencia genética de F3'5'H conservada
o a una secuencia conservada dentro de un genero de plantas, especie de plantas y/o variedad de plantas.
El oligonucleótido anteriormente descrito puede corresponderse con el extremo 5' o 3' de las secuencias genéticas de F3'5'H. Para comodidad, en el presente documento se considera que el extremo 5' define una región
35 sustancialmente entre el codón de iniciación del gen estructural hasta una porción central del gen, y en el presente documento se considera que el extremo 3' define una región sustancialmente entre la porción central del gen y el codón de terminación del gen estructural. Por lo tanto, es evidente que los oligonucleótidos o sondas pueden hibridarse con el extremo 5' o el extremo 3' o con una región común tanto a los extremos 5' como 3'.
La secuencia de ácidos nucleicos que codifica una F3'5'H o diversos derivados funcionales de la misma descritos en el presente documento pueden usarse para reducir el nivel de una F3'5'H endógena (por ejemplo, mediante la cosupresión o supresión mediada por antisentido) u otros procesos de silenciamiento genético postranscripcionales (PTGS) que incluyen ARNi o alternativamente la secuencia de ácidos nucleicos que codifica esta enzima o diversos derivados o partes de los mismos se usan en la orientación sentido o antisentido para reducir el nivel de una F3'5'H.
45 El uso de hebras codificantes, dobles o parcialmente sencillas tales como construcciones con bucles en horquilla es particularmente útil en la inducción de una respuesta de PTGS. En otra alternativa podrían usarse ribozimas, minizimas o ADNzimas para inactivar secuencias de ácidos nucleicos diana.
La inhibición postranscripcional puede utilizarse para reducir la traducción en material polipeptídico. Alternativamente, la metilación puede ser inducida o retirada.
Referencia en el presente documento a la alteración de una actividad de F3'5'H se refiere a una elevación o reducción de la actividad de hasta el 30% o más preferiblemente del 30-50% o incluso más preferiblemente del 5075% o todavía más preferiblemente del 75% o más por encima o por debajo de los niveles endógenos o existentes
55 normales de actividad. Tal elevación o reducción puede denominarse modulación de una actividad de la enzima F3'5'H. Generalmente, la modulación está al nivel de la transcripción o traducción de las secuencias genéticas de F3'5'H.
Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser un ácido ribonucleico o ácidos desoxirribonucleicos, moléculas de cadena sencilla o doble y lineales o circulares covalentemente cerradas. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es ADNc. Se desvelan otras moléculas de ácido nucleico que se hibridan bajo condiciones de rigurosidad baja, preferiblemente media y lo mas preferiblemente alta, con las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento y en particular con la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15 o SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:31 o SEQ ID NO:26 o una parte o región de 65 las mismas. Se describe una molécula de ácido nucleico en la que dicha molécula tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15 o SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:31 o SEQ ID NO:26 o una molécula que tiene al menos el 40%, más preferentemente al menos el 45%, incluso más preferentemente al menos el 55%, todavía más preferentemente al menos el 65%-70%, y todavía incluso más preferentemente más del 85% de similitud al nivel de secuencia de nucleótidos o de aminoácidos con al menos una o más regiones de la secuencia expuesta en SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:13 o SEQ ID 5 NO:15 o SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:31 o SEQ ID NO:26 y en las que el ácido nucleico codifica o es complementario a una secuencia que codifica una enzima que tiene una actividad de F3'5'H. Debe observarse, sin embargo, que las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos pueden tener similitudes por debajo de los porcentajes anteriormente facilitados y todavía codificar una actividad de F3'5'H en la que tienen regiones de conservación de secuencias. También se describen moléculas de ácidos nucleicos en forma de cebadores o sondas 10 de oligonucleótidos que pueden hibridarse con una parte de las moléculas de ácidos nucleicos contempladas anteriormente, y en particular aquellas expuestas en SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15 o SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:31 o SEQ ID NO:26, bajo condiciones de rigurosidad baja, preferentemente media y lo más preferentemente alta. Preferentemente, la porción se corresponde con el extremo 5' o 3' del gen. Por comodidad, en el presente documento se considera que el extremo 5' define una región sustancialmente entre el
15 codón de iniciación de la secuencia genética estructural hasta una porción central del gen, y en el presente documento se considera que el extremo 3' define una región sustancialmente entre la porción central del gen y el codón de terminación de la secuencia genética estructural. Por lo tanto, es evidente que los oligonucleótidos o sondas pueden hibridarse con el extremo 5' o el extremo 3' o con una región común tanto a los extremos 5' como 3'.
20 El término gen se usa en su sentido más amplio e incluye ADNc correspondiente a los exones de un gen. Por consiguiente, una referencia en el presente documento a un gen debe considerarse que incluye:
(i) un gen genómico clásico que consiste en secuencias reguladoras de la transcripción y/o de la traducción y/o una
región codificante y/o secuencias no traducidas (es decir, intrones, secuencias no traducidas de 5' y 3'); o 25
(ii) ARNm o ADNc correspondiente a las regiones codificantes (es decir, exones) y secuencias no traducidas de de 5' y 3' del gen.
El término gen también se usa para describir moléculas sintéticas o de fusión que codifican todo o una parte de un
30 producto de expresión. En realizaciones particulares, los términos molécula de ácido nucleico y gen pueden usarse indistintamente.
El ácido nucleico o su forma complementaria puede codificar una enzima de longitud completa o una parte o derivado de la misma. Por “derivado” se entiende cualquier sustitución, deleción y/o adición de aminoácidos 35 individuales o múltiples con respecto a la enzima que se produce naturalmente y que retiene una actividad de F3'5'H. A este aspecto, el ácido nucleico incluye la secuencia de nucleótidos que se produce naturalmente que codifica una F3'5'H o puede contener sustituciones, deleciones y/o adiciones de nucleótidos individuales o múltiples a dicha secuencia que se produce naturalmente. Un ácido nucleico o su forma complementaria también pueden codificar una “parte” de la F3'5'H, bien sea activa o inactiva, y tal molécula de ácido nucleico puede ser útil como sonda de
40 oligonucleótido, cebador para reacciones en cadena de la polimerasa o en diversas técnicas mutagénicas o para la generación de moléculas antisentido.
Referencia en el presente documento a una “parte” de una molécula de ácido nucleico, secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos se refiere preferiblemente a una molécula que contiene al menos aproximadamente 10
45 nucleótidos contiguos o cinco aminoácidos contiguos, según sea apropiado.
Los derivados de inserción de aminoácidos de la F3'5'H descritos en el presente documento incluyen fusiones del extremo amino y/o carboxilo, además de inserciones dentro de secuencias de aminoácidos individuales o múltiples. Las variantes de secuencias de aminoácidos de inserción son aquellas en las que uno o más residuos de
50 aminoácidos se introducen en un sitio predeterminado en la proteína, aunque también es inserción aleatoria con selección adecuada del producto resultante. Las variantes de deleción se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia. Las variantes de aminoácidos de sustitución son aquellas en las que al menos un residuo en la secuencia ha sido eliminado y en su lugar se inserta un residuo diferente. Sustituciones típicas son aquellas hechas según la Tabla 3.
55 TABLA 3: Residuos adecuados para sustituciones de aminoácidos Cuando la F3'5'H se derivatiza por sustitución de aminoácidos, los aminoácidos se sustituyen generalmente por otros aminoácidos que tienen propiedades similares, tales como hidrofobia, hidrofilia, electronegatividad, cadenas laterales voluminosas y similares. Las sustituciones de aminoácidos son normalmente de residuos individuales. Las
Residuo original
Sustituciones a modo de ejemplo
Ala
Ser
Arg
Lys
Asn
Gln; His
Asp
Glu
Cys
Ser
Gln
Asn; Glu
Glu
Asp
Gly
Pro
His
Asn; Gln
Ile
Leu; Val
Leu
Ile; Val
Lys
Arg; Gln; Glu
Met
Leu; Ile; Val
Phe
Met; Leu; Tyr
Ser
Thr
Thr
Ser
Trp
Tyr
Tyr
Trp; Phe
Val
Ile; Leu; Met
5 inserciones de aminoácidos usualmente están en el orden de aproximadamente 1-10 residuos de aminoácidos y las deleciones variarán de aproximadamente 1-20 residuos. Preferiblemente, las deleciones o inserciones se hacen en pares adyacentes, es decir, una deleción de dos residuos o inserción de dos residuos.
Las variantes de aminoácidos denominadas anteriormente pueden prepararse fácilmente usando técnicas sintéticas
10 de péptidos bien conocidas en la técnica, tales como síntesis de péptidos en fase solida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1964) y similares, o por manipulaciones de ADN recombinante. Las técnicas para hacer mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en ADN que tiene secuencias conocidas o parcialmente conocidas son bien conocidas e incluyen, por ejemplo, mutagénesis de M13. La manipulación de la secuencia de ADN para producir proteínas de variantes que se manifiestan como variantes de sustitución, inserción o deleción se describen
15 convenientemente, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989, arriba).
Otros ejemplos de mutantes recombinantes o sintéticos y derivados de la enzima F3'5'H incluyen sustituciones, deleciones y/o adiciones individuales o múltiples de cualquier molécula asociada a la enzima tal como hidratos de carbono, lípidos y/o proteínas o polipéptidos.
20 Los términos “análogos” y “derivados” también se extienden a cualquier equivalente químico funcional de una F3'5'H y también a cualquier derivado de aminoácido descrito anteriormente. Por comodidad, referencia a F3'5'H en el presente documento incluye referencia a cualquier mutante, derivado, parte, fragmento, homólogo o análogo funcional del mismo.
25 Los métodos desvelados en el presente documento se ejemplifican usando secuencias de ácidos nucleicos de pensamiento, salvia, Sollya o lavanda o Kennedia ya que éstas representan la fuente más conveniente y preferida de material hasta la fecha. Sin embargo, un experto en la materia apreciará inmediatamente que pueden aislarse secuencias similares a partir de cualquier número de fuentes tales como otras plantas o ciertos microorganismos.
30 Ejemplos de otras fuentes adecuadas de genes que codifican F3'5'H incluyen, pero no se limitan a, Vitis spp., Babiana stricta, Pinus spp., Picea spp., Larix spp., Phaseolus spp., Vaccinium spp., Cyclamen spp., Iris spp., Pelargonium spp., Liparieae, Geranium spp., Pisum spp., Lathyrus spp., Clitoria spp., Catharanthus spp., Malva spp., Mucuna spp., Vicia spp., Saintpaulia spp., Lagerstroemia spp., bouchina spp., Plumbago spp., Hypocalyptus spp., Rhododendron spp., Linum spp., Macroptilium spp., Hibiscus spp., Hydrangea spp., Cymbidium spp., Millettia spp.,
35 Hedysarum spp., Lespedeza spp., Asparagus spp. Antigonon spp., Freesia spp., Brunella spp., Clarkia spp., etc.
Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una F3'5'H puede introducirse en y expresarse en una planta transgénica en cualquier orientación proporcionando así un medio tanto para convertir sustratos adecuados, si se sintetizan en la célula vegetal, finalmente en DHM, como alternativamente para inhibir tal conversión de metabolitos
40 reduciendo o eliminando actividad de F3'5'H endógena o existente. La producción de estos sustratos 3',5'hidroxilados se convertirá posteriormente en pigmentos basados en delfinidina que modificarán el color del pétalo y pueden contribuir a la producción de un color más azul. La expresión de la secuencia de ácidos nucleicos en la planta puede ser constitutiva, inducible o de desarrollo y también puede ser específica para tejido. La palabra “expresión” se usa en su sentido más amplio para incluir la producción de ARN o de tanto ARN como proteína. También se extiende a la expresión parcial de una molécula de ácido nucleico.
Por consiguiente, la presente invención proporciona un método de producción de una planta que florece transgénica
5 que puede sintetizar una F3'5'H, comprendiendo dicho método transformar establemente una célula de una planta adecuada con una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de promotor desvelada en las reivindicaciones operativamente ligada a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una F3'5'H como se define en las reivindicaciones en condiciones que permitan la eventual expresión de dichas secuencias de ácidos nucleicos, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cultivar dicha planta transgénica durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. La planta transgénica puede así producir F3'5'H no indígena a niveles elevados con respecto a la cantidad expresada en una planta no transgénica comparable.
Otro aspecto de la presente invención contempla un método de producción de una planta transgénica con actividad
15 de flavonoide 3',5'-hidroxilasa indígena reducida o existente, comprendiendo dicho método transformar establemente una célula de una planta adecuada con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de promotor desvelada en las reivindicaciones operativamente ligada a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o complementaria a una secuencia que codifica una actividad de F3'5'H como se define en las reivindicaciones, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cuando sea necesario cultivar dicha planta transgénica en condiciones suficientes para permitir la expresión del ácido nucleico.
Como se usa en el presente documento, una enzima “indígena” es aquella que es nativa a o que se expresa de forma natural en una célula particular. Una enzima “no indígena” es una enzima no nativa a la célula pero que se expresa mediante la introducción de material genético en una célula vegetal por ejemplo, mediante un transgén. Una
25 enzima “endógena” es una enzima producida por una célula, pero que puede o puede no ser indígena para esa célula.
Alternativamente, dicho método puede comprender transformar establemente una célula de una planta adecuada con una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención o su secuencia complementaria, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cultivar dicha planta transgénica durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para alterar el nivel de actividad de la F3'5'H indígena o existente. Preferiblemente, el nivel alterado sería menor que el nivel indígena o existente de actividad de F3'5'H en una planta no transgénica comparable. Sin querer limitarse a la presente invención, una teoría del modo de acción es que la reducción de la actividad de F3'5'H indígena requiere la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos introducida o su secuencia complementaria. Sin
35 embargo, la expresión de la secuencia genética introducida o su complemento puede no requerirse para alcanzar el efecto deseado: a saber, una planta que florece que presenta propiedades florales o de inflorescencia alteradas.
También se describe un método de producción de una planta que florece que presenta propiedades florales o de inflorescencia alteradas, comprendiendo dicho método alteración del gen flavonoide 3',5'-hidroxilasa mediante modificación de las secuencias indígenas mediante recombinación de homólogos de un gen F3'5'H apropiadamente alterado o derivado o parte del mismo introducido en la célula de planta, y regenerar la planta genéticamente modificada a partir de la célula.
Las características florales o de inflorescencia alteradas pueden incluir la producción de diferentes tonalidades de
45 flores azules o púrpura o rojas u otros colores, dependiendo del genotipo y de las condiciones fisiológicas de la planta receptora.
Por consiguiente, se desvela un método de producción de una planta transgénica capaz de expresar un gen recombinante que codifica una F3'5'H o parte de la misma o que lleva una secuencia de ácidos nucleicos que es sustancialmente complementaria a toda o una parte de una molécula de ARNm que codifica la F3'5'H, comprendiendo dicho método transformar establemente una célula de una planta adecuada con la molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o complementaria a una secuencia que codifica, una F3'5'H, cuando sea necesario, bajo condiciones que permitan la eventual expresión de dicha molécula de ácido nucleico aislada y regenerar una planta transgénica a partir de la célula. Por planta
55 adecuada se entiende una planta capaz de producir DHK y poseer las propiedades fisiológicas apropiadas requeridas para el desarrollo del color deseado.
Un experto en la materia reconocerá inmediatamente las variaciones aplicables a los métodos de la presente invención como se define por las reivindicaciones adjuntas, tal como aumentar o disminuir la expresión de la enzima presente de forma natural en una planta diana que conduce a diferentes tonalidades de colores tales como diferentes tonalidades de azul, púrpura o rojo.
Por tanto, la presente invención se extiende a todas las plantas transgénicas o partes de células de las mismas de plantas transgénicas o progenie de las plantas transgénicas como se define en las reivindicaciones que contienen 65 las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención como se define en las reivindicaciones o formas antisentido de las mismas y/u homólogos o formas relacionadas de las mismas y, en particular, aquellas plantas
transgénicas que presentan propiedades florales o de inflorescencia alteradas. Las plantas transgénicas pueden contener una molécula de ácido nucleico introducida que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o complementaria a una secuencia que codifica una F3'5'H. Generalmente, el ácido nucleico se introduciría establemente en el genoma de la planta, aunque la presente invención también se extiende a la introducción de una
5 secuencia de nucleótidos de F3'5'H dentro de una secuencia de ácidos nucleicos de replicación autónoma tal como un virus de ADN o de ARN capaz de replicarse dentro de la célula vegetal. La invención también se extiende a semillas de tales plantas transgénicas. Tales semillas, especialmente si están coloreadas, son útiles como marcas de propiedad para plantas. La presente invención engloba todos y cada uno de los métodos de introducción de material genético en células vegetales que incluyen, pero no se limitan a, transformación mediada por Agrobacterium, bombardeo de partículas biolísticas, etc.
Otro aspecto de la presente invención contempla el uso de extractos de plantas transgénicas o partes de plantas o células de las mismas de las plantas transgénicas o progenie de las plantas transgénicas que contienen las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención como se define en las reivindicaciones y, en particular, los
15 extractos de aquellas plantas transgénicas cuando se usan como aromatizante o aditivo alimentario o producto para la salud o bebida o zumo o colorante.
Las partes de plantas contempladas por la presente invención incluyen, pero no se limitan a, flores, frutos, verduras, frutos secos, raíces, tallos, hojas o semillas.
Los extractos de la presente invención pueden derivarse de las plantas o parte de planta o células de la misma de varias maneras diferentes que incluye, pero no se limitan a, la extracción química o extracción por calor o filtración o exprimiendo o pulverización.
25 La planta, parte de la planta o células de la misma o extracto pueden utilizarse en cualquier número de diferentes maneras tales como por ejemplo la producción de un aromatizante (por ejemplo, una esencia para alimentos), un aditivo alimentario (por ejemplo, un estabilizador, un colorante), un producto para la salud (por ejemplo, un antioxidante, un comprimido), una bebida (por ejemplo, vino, bebida espirituosa, té) o un zumo (por ejemplo, zumo de frutas) o colorante (por ejemplo, colorante alimentario, colorante para textiles, pigmento, pintura, tinte).
En el presente documento también se desvelan formas recombinantes de F3'5'H. Las formas recombinantes de la enzima proporcionarán una fuente de material para investigación, por ejemplo, enzimas más activas y puede ser útil en el desarrollo de sistemas in vitro para la producción de compuestos coloreados.
35 Todavía otro aspecto de la presente invención contempla el uso de las secuencias genéticas descritas en las reivindicaciones en la fabricación de una construcción genética capaz de expresar una F3'5'H o regular por disminución una enzima F3'5'H indígena en una planta.
El término construcción genética se ha usado indistintamente en toda la memoria descriptiva y reivindicaciones con los términos “molécula de fusión”, “molécula recombinante”, “secuencia de nucleótidos recombinante”. Una construcción genética puede incluir una molécula de ácido nucleico individual que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína señal o puede contener múltiples marcos de lectura abiertos que codifican 2 o más proteínas. También puede contener un promotor operativamente ligado a 1 o más de los marcos de lectura abiertos.
45 Otro aspecto de la presente invención se refiere a un organismo procariota o eucariota no humano que lleva una secuencia genética que codifica una F3'5'H como se define en las reivindicaciones extracromosómicamente en forma de plásmido.
En el presente documento también se desvela un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:16
o SEQ ID NO:18 o SEQ ID NO:32 o SEQ ID NO:27 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 50% de similitud con SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:18 o SEQ ID NO:32 o SEQ ID NO:27 o un derivado de dicho polipéptido.
55 Un “polipéptido recombinante” significa un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos introducida en una célula directa o indirectamente por intervención humana o en un padre u otro familiar o precursor de la célula. Un polipéptido recombinante también puede hacerse usando sistemas de transcripción in vitro libres de células. El término “polipéptido recombinante” incluye un polipéptido aislado o, cuando está presente, en una célula o preparación celular. También puede estar en una planta o partes de una planta regeneradas a partir de una célula que produce dicho polipéptido.
Un “polipéptido” incluye un péptido o proteína y está englobado por el término “enzima”.
65 El polipéptido recombinante también puede ser una molécula de fusión que comprende dos o más secuencias de aminoácidos heterólogas.
En el presente documento también se desvelan:
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o
5 complementaria a una secuencia que codifica una flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F3'5'H) o un polipéptido que tiene actividad de F3'5'H, en la que la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en un tejido de pétalo de rosa produce niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina como se mide por una técnica cromatográfica.
2. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o complementaria a una secuencia que codifica una F3'5'H o un polipéptido que tiene actividad de F3'5'H, en la que la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en un tejido de pétalo de rosa produce un nivel y longitud suficiente de transcrito que se traduce en dicha F3'5'H como se ha determinado por niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina como se mide por una técnica cromatográfica.
3.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 1 ó 2, en la que la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en dicho pétalo de rosa produce un cambio de color visualmente detectable.
4.
La molécula de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las realizaciones 1 a 3, en la que la molécula de ácido nucleico se deriva de una planta seleccionada de la lista que comprende Viola spp., Salvia spp., Sollya spp., Lavandula spp. y Kennedia spp.
5.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 4, en la que la molécula de ácido nucleico se deriva de
una planta de Viola spp. 25
6.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 5, en la que la molécula de ácido nucleico se deriva de Viola spp., cultivar pensamiento negro.
7.
La molécula de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las realizaciones 5 ó 6, en la que la secuencia de nucleótidos codifica una F3'5'H que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de similitud con SEQ ID NO:10 y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de similitud con SEQ ID NO:12.
35 8. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 7, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de identidad con SEQ ID NO:9, una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de identidad con SEQ ID NO:11, una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con SEQ ID NO:9 o su complemento bajo condiciones de baja rigurosidad y una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con SEQ ID NO:11 o su complemento bajo condiciones de baja rigurosidad.
9. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 8, que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:9.
45 10. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 8, que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:11.
11. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 4, en la que la molécula de ácido nucleico se deriva de
Salvia spp.
12. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 11, en la que la secuencia de nucleótidos codifica una F3'5'H que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de similitud con SEQ ID NO:14 y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de similitud con SEQ ID NO:16.
13.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 12 que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de identidad con SEQ ID NO:13, una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de identidad con SEQ ID NO:15, una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con SEQ ID NO:13 o su complemento bajo condiciones de baja rigurosidad y una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con SEQ ID NO:15 o su complemento bajo condiciones de baja rigurosidad.
14.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 13 que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta
en SEQ ID NO:13. 65
15.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 13 que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta
en SEQ ID NO:15.
16.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 4, en la que la molécula de ácido nucleico se deriva de
Sollya spp.
17.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 16, en la que la secuencia de nucleótidos codifica una F3'5'H que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:18 y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de similitud con SEQ ID NO:18.
18.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 17 que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:17, una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de identidad con SEQ ID NO:17 y una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con SEQ ID NO:17 o su complemento bajo condiciones de baja rigurosidad.
15 19. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 18 que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:17.
20. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 4, en la que la molécula de ácido nucleico se deriva de
Kennedia spp.
21. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 20, en la que la secuencia de nucleótidos codifica una F3'5'H que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona de SEQ ID NO:27 y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de similitud con SEQ ID NO:27.
25 22. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 21 que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:26, una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de identidad con SEQ ID NO:26 y una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con SEQ ID NO:26 o su complemento bajo condiciones de baja rigurosidad.
23.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 22 que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:26.
24.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 4, en la que la molécula de ácido nucleico se deriva de
Lavandula spp.
25.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 24, en la que la secuencia de nucleótidos codifica una F3'5'H que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:32 y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de similitud con SEQ ID NO:32.
26.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 25 que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:31, una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de identidad con SEQ ID NO:31 y una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con SEQ ID NO:31 o su complemento bajo condiciones de baja rigurosidad.
45 27. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 26 que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:31.
28. La molécula de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las realizaciones 1 a 4, en la que la secuencia de nucleótidos comprende un porcentaje global inferior a o igual al 54% de los nucleótidos
(i)
A, o
(ii)
T, o
55 (iii) A y T
en la tercera posición de nucleótido de cada codón.
29. Una construcción que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende:
(i)
un promotor que es operable en tejido de pétalo de rosa y, en el que dicho promotor está operativamente ligado a,
(ii)
una molécula de ácido nucleico que codifica F3'5'H, o complementaria a una secuencia que codifica una F3'5'H o un polipéptido que tiene actividad de F3'5'H, en la que la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en un tejido
65 de pétalo de rosa produce niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina como se mide por una técnica cromatográfica y, en la que dicha molécula de ácido nucleico se deriva de una planta seleccionada
del grupo que consiste en Viola spp., Salvia spp., Sollya spp., Lavandula spp. y Kennedia spp.
30. Una construcción que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende:
5 (i) un promotor que es operable en tejido de pétalo de rosa y, en el que dicho promotor está operativamente ligado a,
(ii) una molécula de ácido nucleico que codifica F3'5'H, o complementaria a una secuencia que codifica una F3'5'H o un polipéptido que tiene actividad de F3'5'H, en la que la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en un tejido de pétalo de rosa produce un nivel y longitud suficiente de transcrito que se traduce en dicha F3'5'H como se ha determinado por niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina como se mide por una técnica cromatográfica.
31. La construcción de la realización 29 ó 30, en la que la expresión de dicha construcción en dicho pétalo de rosa
produce un cambio de color visualmente detectable. 15
32.
La construcción de una cualquiera de las realizaciones 29 a 31, en la que dicho promotor está seleccionado del grupo que consiste en CHS de rosa, CHS de crisantemo y CaMV 35S.
33.
Una construcción de una cualquiera de las realizaciones 29 a 31, en la que dicho promotor comprende SEQ ID NO:5, o un equivalente funcional de la misma.
34.
Una construcción de una cualquiera de las realizaciones 29 a 31, en la que dicho promotor comprende SEQ ID NO:30, o un equivalente funcional de la misma.
25 35. La construcción de una cualquiera de las realizaciones 29 a 34, en la que la molécula de ácido nucleico se deriva de Viola spp.
36.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 35, en la que la secuencia de nucleótidos codifica F3'5'H que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de similitud con SEQ ID NO:10 y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de similitud con SEQ ID NO:12.
37.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 36 que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente
35 el 40% de identidad con SEQ ID NO:9, una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de identidad con SEQ ID NO:11, una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con SEQ ID NO:9 o su complemento bajo condiciones de baja rigurosidad y una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con SEQ ID NO:11 o su complemento bajo condiciones de baja rigurosidad.
38.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 37, en la que el gen comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:9.
39.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 37, en la que el gen comprende la secuencia de
nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:11. 45
40.
La molécula de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las realizaciones 29 a 34, en la que la molécula de ácido nucleico se deriva de Salvia spp.
41.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 40, en la que el gen comprende una secuencia de nucleótidos que codifica F3'5'H que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de similitud con SEQ ID NO:14 y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de similitud con SEQ ID NO:16.
55 42. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 41, en la que el gen comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de identidad con SEQ ID NO:13, una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de identidad con SEQ ID NO:15, una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con SEQ ID NO:13 o sus complementos bajo condiciones de baja rigurosidad y una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con SEQ ID NO:15 o su complemento bajo condiciones de baja rigurosidad.
43. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 42, en la que el gen comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:13.
65 44. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 42, en la que el gen comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:15.
45. La molécula de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las realizaciones 29 a 34, en la que el gen se deriva de Sollya spp.
5 46. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 45, en la que el gen codifica una F3'5'H que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:18 y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de similitud con SEQ ID NO:18.
47. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 46, en la que el gen comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:17, una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de identidad con SEQ ID NO:17 y una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con SEQ ID NO:17 o sus complementos bajo rigurosidad baja.
48. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 47, en la que el gen comprende la secuencia de 15 nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:17.
49.
La molécula de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las realizaciones 29 a 34, en la que el gen se deriva de Kennedia spp.
50.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 49, en la que el gen codifica F3'5'H que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:27 y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de similitud con SEQ ID NO:27.
51.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 50, en la que el gen comprende una secuencia de
25 nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:26, una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de identidad con SEQ ID NO:26 y una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con SEQ ID NO:26 o sus complementos bajo rigurosidad baja.
52.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 51, en la que el gen comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:26.
53.
La molécula de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las realizaciones 29 a 34, en la que el gen se deriva de Lavandula spp.
35 54. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 53, en la que el gen codifica F3'5'H que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:32 y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de similitud con SEQ ID NO:32.
55. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 54, en la que el gen comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:31 y una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de identidad con SEQ ID NO:31, una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con SEQ ID NO:31 o sus complementos bajo condiciones de baja rigurosidad.
56. La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 55, en la que el gen comprende la secuencia de 45 nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:31.
57.
Un método de producción de una planta que florece transgénica que puede sintetizar una F3'5'H, comprendiendo dicho método transformar establemente una célula de una planta adecuada con una secuencia de ácidos nucleicos como se define en una cualquiera de las realizaciones 1 a 28, en condiciones que permitan la eventual expresión de dichas secuencias de ácidos nucleicos, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cultivar dicha planta transgénica durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos.
58.
Un método de producción de una planta transgénica con actividad de F3'5'H indígena o existente reducida,
55 comprendiendo dicho método transformar establemente una célula de una planta adecuada con una molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de las realizaciones 1 a 28, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cuando sea necesario cultivar dicha planta transgénica en condiciones suficientes para permitir la expresión del ácido nucleico.
59. Un método de producción de una planta genéticamente modificada con actividad de F3'5'H indígena o existente reducida, comprendiendo dicho método alterar el gen F3'5'H mediante modificación de las secuencias indígenas mediante recombinación de homólogos de un gen F3'5'H apropiadamente alterado como se define en una cualquiera de las realizaciones 1 a 28, o un derivado o parte del mismo introducido en la célula de planta, y regenerar la planta genéticamente modificada a partir de la célula.
60. Un método de producción de una planta que florece transgénica que presenta propiedades de inflorescencia alteradas, comprendiendo dicho método transformar establemente una célula de una planta adecuada con una secuencia de ácidos nucleicos como se define en una cualquiera de las realizaciones 1 a 28, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cultivar dicha planta transgénica durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos.
61.
Un método de producción de una planta que florece que presenta propiedades de inflorescencia alteradas, comprendiendo dicho método alterar un gen F3'5'H como se define en una cualquiera de las realizaciones 1 a 28, mediante modificación de las secuencias indígenas mediante recombinación de homólogos a partir de un gen F3'5'H apropiadamente alterado o derivado o parte del mismo introducido en la célula de planta, y regenerar la planta genéticamente modificada a partir de la célula.
62.
Un método de producción de una planta transgénica que puede expresar un gen recombinante que codifica F3'5'H como se define en una cualquiera de las realizaciones 1 a 28, o parte del mismo o que lleva una secuencia de ácidos nucleicos que es sustancialmente complementaria a toda o una parte de una molécula de ARNm que codifica
15 dicha F3'5'H, comprendiendo dicho método transformar establemente una célula de una planta adecuada con la molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o complementaria a una secuencia que codifica F3'5'H, cuando sea necesario, en condiciones que permitan la eventual expresión de dicha molécula de ácido nucleico aislada, y regenerar una planta transgénica a partir de la célula.
63.
Una planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma que comprende una molécula de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las realizaciones 1 a 28.
64.
Una planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma que comprende una molécula
de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las realizaciones 1 a 28 o que comprende un nivel reducido de 25 expresión de una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las realizaciones 1 a 28.
65.
Una planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma que comprende una molécula de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las realizaciones 1 a 28 o que comprende un elevado nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las realizaciones 1 a 28.
66.
La planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma una cualquiera de las realizaciones 63 a 65, en la que la parte de planta está seleccionada de sépalo, bráctea, pecíolo, pedúnculo, ovario, anteras, flores, frutos, frutos secos, raíces, tallos, hojas, semillas.
35 67. La planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma de una cualquiera de las realizaciones 63 a 66, en la que la planta es una especie hortícola, especie agrícola o especie ornamental.
68.
Uso de una molécula de ácido nucleico aislada como se define en una cualquiera de las realizaciones 1 a 28 en la fabricación de una construcción genética que puede expresar F3'5'H o regular por disminución una enzima F3'5'H indígena en una planta.
69.
Una construcción silenciadora de genes que comprende una molécula de ácido nucleico aislada como se define en una cualquiera de las realizaciones 1 a 28 o un complejo de la misma.
45 70. La planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma de 63 a 66, en la que la planta está seleccionada de una rosa, clavel, lisianthus, petunia, lirio, pensamiento, gerbera, crisantemo, geranio, Torenia, Begonia, Cyclamen, Nierembergia, Catharanthus, Pelargonium, orquídea, uva, manzana, Euphorbia o Fuchsia.
71.
Un extracto de una planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma de una cualquiera de las realizaciones 63 a 67 y 70.
72.
El extracto de la realización 71, en el que el extracto es un aromatizante o aditivo alimentario o producto para la salud o bebida o zumo o colorante.
55 73. El método de una cualquiera de las realizaciones 57 a 62, en el que la planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma presentan inflorescencia alterada.
74.
Una F3'5'H recombinante aislada o péptido que tiene actividad de F3'5'H codificado por una molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de las realizaciones 1 a 28.
75.
La F3'5'H recombinante aislada o péptido que tiene actividad de F3'5'H de la realización 74, en la que la F3'5'H recombinante o péptido que tiene actividad de F3'5'H es una molécula de fusión que comprende dos o más secuencias de aminoácidos heterólogas.
65 76. Una F3'5'H recombinante aislada o péptido que tiene actividad de F3'5'H molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las realizaciones 1 a 28 que comprende una fusión de dos o más secuencias de nucleótidos heterólogas.
77. Un organismo procariota que lleva una secuencia genética que codifica una molécula de F3'5'H según una
cualquiera de las realizaciones 1 a 28 extracromosómicamente en forma de plásmido. 5
78.
Un organismo eucariota que lleva una secuencia genética que codifica una molécula de F3'5'H según una cualquiera de las realizaciones 1 a 28 extracromosómicamente en forma de plásmido.
79.
El uso de una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las realizaciones 1 a 28 en la fabricación de una planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma.
80.
La planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma de la realización 79, en la que la planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma presenta flores o inflorescencia alteradas.
81.
El uso de una secuencia de ácidos nucleicos como se define en una cualquiera de las realizaciones 1 a 28 en la fabricación de una construcción genética que puede expresar F3'5'H o regular por disminución una enzima F3'5'H indígena en una planta.
82.
Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o complementaria a una secuencia que codifica una F3'5'H o un polipéptido que tiene actividad de F3'5'H, en la que dicha molécula de ácido nucleico se deriva de campanilla.
83.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 81, en la que la secuencia de nucleótidos codifica una
25 F3'5'H que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona de SEQ ID NO:21 y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de similitud con SEQ ID NO:21.
84.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 83 que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:20, una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 40% de identidad con SEQ ID NO:20 y una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con SEQ NO:20 o su complemento bajo condiciones de baja rigurosidad.
85.
La molécula de ácido nucleico aislada de la realización 84 que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta
en SEQ ID NO:20. 35
86. La molécula de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las realizaciones 1 a 4, en la que la secuencia de nucleótidos comprende un porcentaje global inferior a o igual al 55% de los nucleótidos
(i)
A, o
(ii)
T, o
(iii) A y T
45 87. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende SEQ ID NO:5 o un equivalente funcional de la misma.
88.
Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende SEQ ID NO:30 o un equivalente funcional de la misma.
89.
Una molécula de ácido nucleico aislada que ha sido modificada de manera que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifica o complementaria a una secuencia que codifica F3'5'H o un polipéptido que tiene actividad de F3'5'H, en la que expresión de dicha molécula de ácido nucleico en un tejido de pétalo de rosa produce niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina como se mide por una técnica cromatográfica, en la que la molécula de ácido nucleico se deriva de una planta seleccionada de la lista que comprende Petunia spp., Gentiana spp. y Clitoria spp.
90.
Una molécula de ácido nucleico aislada que ha sido modificada de manera que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifica o complementaria a una secuencia que codifica F3'5'H o un polipéptido que tiene actividad de F3'5'H, en la que expresión de dicha molécula de ácido nucleico en un tejido de pétalo de rosa produce un nivel y longitud suficiente de transcrito que se traduce en dicha F3'5'H como se ha determinado por niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina como se mide por una técnica cromatográfica, en la que la molécula de ácido nucleico se deriva de una planta seleccionada de la lista que comprende petunia, genciana y campanilla.
91.
El uso de una secuencia de ácidos nucleicos como se define en realización 89 ó 90 en la fabricación de una
65 construcción genética que puede expresar F3'5'H o regular por disminución una enzima F3'5'H indígena en una planta.
92. El uso de una secuencia de ácidos nucleicos como se define en realización 89 ó 90 en la fabricación de una planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma.
El presente documento se describe adicionalmente por los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1
Métodos generales
En general, los métodos seguidos fueron como se describe en Sambrook y col. (1989, arriba) o Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, EE.UU., 2001 o Plant Molecular Biology Manual (2ª edición), Gelvin y Schilperoot (eds), Kluwer Academic Publisher, Los Países Bajos, 1994 o Plant Molecular Biology Labfax, Croy (ed), Bios scientific Publishers, Oxford, RU, 1993.
Los vectores de clonación pBluescript y PCR script se obtuvieron de Stratagene, EE.UU. La pCR7 2.1 se obtuvo de Invitrogen, EE.UU.
Transformación de E. coli Las cepas de Escherichia coli usadas fueron: DH5α
-
supE44, Δ (lacZYA-ArgF)U169, (ø801acZΔM15), hsdR17(rk , mk+), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, re1A1,deoR. (Hanahan, J. Mol. Biol. 166: 557, 1983) XL1-Blue
-
supE44, hsdR17(rk , mk+), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1,
lac-, [F'proAB, lacIq, lacZΔM15, Tn10(tetR)] (Bullock y col., Biotechniques 5: 376, 1987).
Cepa BL21-CodonPlus-RIL
ompT hsdS(Rb- mB-) dcm + Tetr gal endA Hte [argU ileY lecrW Camr]
M15 E. coli se deriva de E.coli K12 y tiene el fenotipo Nals, Strs, Rifs, Thi -, Ara+, Gal+, Mtl -, F-, RecA+, Uvr+, Lon+.
La transformación de las cepas de E. coli se realizó según el método de Inoue y col. (Gene 96: 23-28, 1990).
Cepas y transformaciones de Agrobacterium tumefaciens
La cepa desarmada de Agrobacterium tumefaciens usada fue AGLO (Lazo y col., Bio/technology 9: 963-967, 1991).
Se introdujo ADN de plásmido en la cepa de Agrobacterium tumefaciens AGLO añadiendo 5 μg de ADN de plásmido a 100 μl de las células AGLO competentes preparadas por inoculación de un cultivo LB de 50 ml (Sambrook y col., 1989, arriba) e incubación durante 16 horas con agitación a 28 ºC. Las células se sedimentaron luego y se resuspendieron en 0,5 ml de CaCI2 100 mM al 85% (v/v)/ glicerol al 15% (v/v). La mezcla de ADN-Agrobacterium se congeló por incubación en N2 líquido durante 2 minutos y luego se dejo descongelar por incubación a 37 ºC durante 5 minutos. La mezcla ADN/bacteriana se dispuso luego sobre hielo durante 10 minutos adicionales. Las células se mezclaron luego con 1 ml de medio LB (Sambrook y col., 1989 arriba) y se incubaron con agitación durante 16 horas a 28 ºC. Se seleccionaros células de A. tumefaciens que llevaban el plásmido sobre placas de LB agar que contenían antibióticos apropiados tales como 50 μg/ml de tetraciclina o 100 μg/ml de gentamicina. La confirmación del plásmido en A. tumefaciens se hizo por mapeo con endonucleasas de restricción de ADN aislado a partir de los transformantes resistentes a antibiótico.
Ligaciones de ADN
Las ligaciones de ADN se llevaron a cabo usando el kit de ligación de Amersham o el kit de ligación de Promega según procedimientos recomendados por el fabricante.
Aislamiento y purificación de fragmentos de ADN
Los fragmentos se aislaron generalmente sobre un gel de agarosa al 1% (p/v) y se purificaron usando el kit de extracción en gel QIAEX II (Qiagen) o el kit Bresaclean (Bresatec, Australia) siguiendo procedimientos recomendados por el fabricante.
Reparación de extremos de nucleótidos protuberantes después de la digestión con endonucleasas de restricción
5 Los extremos de nucleótidos protuberantes 5' se repararon usando ADN polimerasa (fragmento de Klenow) según protocolos convencionales (Sambrook y col., 1989 arriba). Los extremos de nucleótidos protuberantes 3' se repararon utilizando T4 ADN polimerasa según protocolos convencionales (Sambrook y col., 1989 arriba).
Eliminación de grupos fosforilo de ácidos nucleicos
Normalmente se utilizó fosfatasa alcalina de gamba (SAP) (USB) para eliminar grupos fosforilo de vectores de clonación para prevenir la recircularización según las recomendaciones del fabricante.
15 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
A menos que se especifique otra cosa, las condiciones de PCR usando ADN plásmido como molde incluyeron usar 2 ng de ADN de plásmido, 100 ng de cada cebador, 2 μl de mezcla de dNTP 10 mM, 5 μl de 10 x tampón Taq ADN polimerasa, 0,5 μl de Taq ADN polimerasa en un volumen total de 50 μl. Las condiciones de ciclado comprendieron una etapa inicial de desnaturalización de 5 minutos a 94 ºC, seguida por 35 ciclos de 94 ºC durante 20 s, 50 ºC durante 30 s y 72 ºC durante 1 minuto con un tratamiento final a 72 ºC durante 10 minutos antes del almacenamiento a 4 ºC.
Las PCR se realizaron en un Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600. 25
Marcado con 32P de sondas de ADN
Los fragmentos de ADN (50 a 100 ng) se marcaron radiactivamente con 50 μCi de [α-32P]-dCTP usando un kit Gigaprime (Geneworks). El [α-32P]-dCTP no incorporado se eliminó por cromatografía sobre columnas Sephadex G50 (fina) o columnas de cromatografía Microbiospin P-30 Tris (BioRad).
Aislamiento de plásmidos
Se analizaron colonias individuales para insertos inoculando caldo LB (Sambrook y col., 1989, arriba) con una
35 selección de antibióticos apropiada (por ejemplo, 100 μg/ml de ampicilina o 10 a 50 μg/ml de tetraciclina, etc.), e incubando el cultivo liquido a 37 ºC (para E. coli) o 29 ºC (para A. tumefaciens) durante ∼16 horas con agitación. El ADN de plásmido se purificó usando el procedimiento de lisis alcalina (Sambrook y col., 1989, arriba) o usando el sistema de purificación de ADN de minipreparaciones The WizardPlus SV (Promega) o el kit Qiagen Plasmid Mini (Qiagen). Una vez que se había determinado la presencia de un inserto, se prepararon cantidades más grandes de ADN de plásmido a partir de 50 ml de cultivos durante la noche usando el procedimiento de lisis alcalina (Sambrook y col., 1989, arriba) o el kit QIAfilter Plasmid Midi (Qiagen) y siguiendo las condiciones recomendadas por el fabricante.
Análisis de secuencias de ADN
45 La secuenciación de ADN se llevo a cabo usando los kits PRISM (marca registrada) Ready Reaction Dye Primer Cycle Sequencing de Applied Biosystems. Se siguieron los protocolos suministrados por el fabricante. Las reacciones de secuenciación en ciclo se llevaron a cabo usando una máquina de PCR Perkin Elmer (GeneAmp PCR System 9600). Las ejecuciones de la secuenciación se realizaron generalmente por Australian Genome Research Facility en The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research (Melbourne, Australia) o localmente en un secuenciador de ADN automatizado 373A (Applied Biosystems).
Las secuencias se analizaron usando una aplicación MacVector™ (versión 6.5.3) (Oxford Molecular Ltd., Oxford, Inglaterra).
55 Las búsquedas de homología por comparación con las bases de datos Genbank, SWISS-PROT y EMBL se realizaron usando los programas FASTA y TFASTA (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85(8): 24442448, 1988) o los programas BLAST (Altschul y col, J. Mol. Biol. 215(3): 403-410, 1990). Se obtuvieron las similitudes de secuencias en porcentaje usando el programa LALIGN (Huang y Miller, Adv. Appl. Math. 12: 373-381, 1991) o el programa ClustalW (Thompson y col., Nucleic Acids Research 22: 4673-4680, 1994) dentro de la aplicación MacVector™ (Oxford Molecular Ltd., Inglaterra) usando parámetros por defecto.
Las alineaciones de secuencias múltiples se produjeron usando ClustalW (Thompson y col., 1994, arriba) usando parámetros por defecto.
65 Ejemplo 2
Transformaciones de plantas
Transformaciones de Petunia hybrida (Sw63 x Skr4)
5 Como se describe en Holton y col. (1993a, arriba) por cualquier otro método bien conocido en la técnica.
Transformaciones de Rosa hybrida
10 Como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. nº 542.841 (PCT/US91/04412) o Robinson y Firoozabady (Scientia Horticulturae, 55: 83-99, 1993), Rout y col. (Scientia Horticulturae, 81: 201-238, 1999) o Marchant y col. (Molecular Breeding 4: 187-194, 1998) o por cualquier otro método bien conocido en la técnica.
Se obtuvieron esquejes de Rosa hybrida generalmente de Van Wyk y Son Flower Supply, Victoria. 15
Transformaciones de Dianthus caryophyllus
Solicitud de patente internacional nº PCT/US92/02612 (transformación de claveles). Como se describe en la solicitud de patente internacional nº PCT/AU96/00296 (clavel violeta), Lu y col. (Bio/Technology 9: 864-868, 1991), Robinson
20 y Firoozabady (1993, arriba) o por cualquier otro método bien conocido en la técnica.
Se obtuvieron esquejes de Dianthus caryophyllus cv. Kortina Chanel o Monte Lisa de Van Wyk and Son Flower Supply, Victoria.
25 Ejemplo 3
Análisis transgénico
Codificación de color
30 Se usó la carta de colores de la Real Sociedad Hortícola (Kew, Reino Unido) para proporcionar una descripción del color observado. Proporcionan un medio alternativo por el que describir los fenotipos de color observados. Sin embargo, los números designados deben tomarse solamente como una guía de los colores percibidos y no deben considerarse limitantes de los posibles colores que pueden obtenerse.
Análisis cromatográfico
Se realizaron análisis por cromatografía en capa fina (CCF) y por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) generalmente como se describe en Brugliera y col. (Plant J. 5, 81-92, 1994).
40 Extracción de antocianidinas
Antes del análisis por HPLC, las moléculas de antocianina y flavonol presentes en los extractos de pétalos y estambres se sometieron a hidrólisis ácida para eliminar restos de glicosilo del núcleo de antocianidina o flavonol. Se
45 usaron patrones de antocianidina y flavonol para ayudar a identificar los compuestos presentes en los extractos florales.
Las antocianidinas en la mezcla de reacción se analizaron por HPLC mediante elución con gradiente usando condiciones de gradiente de 50% de B a 60% de B durante 10 minutos, luego 60% de B durante 10 minutos y
50 finalmente 60% de B a 100% de B durante 5 minutos cuando el solvente A consistió en TFA: H2O (5:995) y el solvente B consistió en acetonitrilo: TFA: H2O (500:5:495). Se usó una columna de cartucho Asahi Pac ODP-50 (250 mm x 4,6 mm de DI) para las separaciones cromatográficas en fase inversa. La velocidad de flujo fue 1 ml/min y la temperatura fue 40 ºC. La detección de los compuestos de antocianidina se llevo a cabo usando un detector tridimensional Shimadzu SPD-M6A a 400-650 nm.
55 Los picos de antocianidina se identificaron por referencia a picos conocidos, concretamente moléculas de delfinidina
o basadas en delfinidina, petunidina, malvidina, cianidina y peonidina.
Etapas del desarrollo de las flores
Petunia
Se recolectaron flores de Petunia hybrida cv. Skr4 x Sw63 en las siguientes etapas de desarrollo definidas:
65 Etapa 1: Yema cerrada sin pigmentar.
Etapa 2: Yema cerrada pigmentada. Etapa 3: Yema pigmentada con corola emergente.
5 Etapa 4: Flor abierta pigmentada con antera intacta (pre-dehiscencia) Etapa 5: Flor completamente abierta con anteras dehiscentes. Para el análisis por CCF o HPLC se recolectaron pétalos de flores de la etapa 4 en la etapa de máxima acumulación
de pigmento. Para el análisis de transferencia Northern se recolectaron pétalos de flores de las etapas 2 a 3 en la etapa de máxima expresión de los genes de la ruta de los flavonoides.
15 Clavel Se recolectaron flores de Dianthus caryophyllus en las siguientes etapas de desarrollo definidas: Etapa 1: Yema cerrada, pétalos no visibles. Etapa 2: Yemas de flores en abertura: puntas de pétalos visibles. Etapa 3: Puntas de casi todos los pétalos expuestas. “Etapa de brochazo”.
25 Etapa 4: Pétalos externos a un ángulo de 45º con respecto al tallo. Etapa 5: Flor completamente abierta. Para los análisis por CCF o HPLC se recolectaron pétalos de flores de la etapa 4 en la etapa de máxima
acumulación de pigmento. Para el análisis de transferencia Northern se recolectaron pétalos de flores de la etapa 3 en la etapa de máxima expresión de los genes de la ruta de los flavonoides.
35 Rosa Las etapas del desarrollo de la flor Rosa hybrida se definen como sigue: Etapa 1: Yema apretadamente cerrada sin pigmentar. Etapa 2: Yema apretadamente cerrada pigmentada. Etapa 3: Yema cerrada pigmentada; sépalos comenzando a abrirse.
45 Etapa 4: La yema de la floral comienza a abrir; pétalos fuertemente pigmentados; se han separado los sépalos.
Etapa 5: Sépalos completamente desdoblados; algún rizamiento. Los pétalos están fuertemente pigmentados y desdoblados. Para los análisis por CCF o HPLC se recolectaron pétalos de flores de la etapa 4 en la etapa de máxima
acumulación de pigmento. Para el análisis de transferencia Northern se recolectaron los pétalos de flores de las etapas 3 a 4 en la etapa de máxima expresión de los genes de la ruta de los flavonoides (Tanaka y col., Plant Cell Physiol., 36(6): 1023-1031, 55 1995).
Mediciones de antocianina/flavonol por mediciones espectrofotométricas
Se añadieron aproximadamente 200 mg de tejido de pétalo fresco a 2 ml de metanol/HCl al 1% (v/v) y se incubaron durante ∼16 horas a 4 ºC. Luego se hizo una dilución 1 en 20 (por ejemplo, 50 μl se llevaron a 1000 μl) y se registro la absorbancia a 350 nm y 530 nm.
Entonces se calcularon las cantidades aproximadas de flavonoles y antocianinas (nmoles/gramo) según las siguientes formulas: 65 Contenido de antocianina
(A /34.000) x volumen detampóndeextracción (ml) x factordedilución x 106
530 masa de tejido de pétalo (gramos)
Contenido de flavonol 5
(A /14.300 x volumen de tampón de extracción (ml) x factor de dilución x 106
530 masa de tejido de pétalo (gramos)
Análisis de transferencia Northern/de ARN
10 Se monitorizó la transcripción de un gen transferido aislando ARN y estimando la cantidad y tamaño del transcrito esperado. Se usó análisis de transferencia Northern para monitorizar el nivel en estado estacionario de transcritos particulares en pétalos. Se determinó que un transcrito estaba intacto o era de longitud completa basándose en el tamaño estimado esperado del gen usado. En general, cuando se usaron ADNc como secuencias codificantes, el tamaño del transcrito esperado sería el tamaño del ADNc más cualquier componente de 5' sin traducir del fragmento
15 de promotor fusionado más cualquier secuencia de 3' sin traducir del fragmento del terminador fusionado. En algunos casos, si una región de ADNc contuviera un sitio de poliadenilación putativo y la región de terminador contuviera un sitio de poliadenilación putativa, se detectarían 2 transcritos. Uno sería de un tamaño coherente con la poliadenilación que se produce precisamente aguas bajo del sitio de poliadenilación dentro de la secuencia de ADNc. El segundo transcrito sería más grande y coherente con el transcrito que está siendo poliadenilado después
20 del sitio de poliadenilación dentro del fragmento de terminador.
Se aisló ARN total a partir de pétalos u hojas usando un kit RNAeasy para plantas (QIAGEN) siguiendo procedimientos recomendados por el fabricante. Para muestras de rosa se añadió PVP al 1% (p/v) al tampón de extracción.
25 Las muestras de ARN (5 μg) se sometieron a electroforesis a través de geles de formaldehído 2,2 M /agarosa al 1,2% p/v usando tampón de electroforesis que contiene ácido morfolinopropanosulfonico 40 mM (pH 7,0), acetato de sodio 5 mM, EDTA 0,1 mM (pH 8,0). El ARN se tiñó con bromuro de etidio y se visualizó bajo luz UV. El ARN ribosómico se usó generalmente como guía en la confirmación de que el ARN no había sido degradado por
30 ribonucleasas intra o extracelulares. El ARN se transfirió a filtros de membrana Hybond-N (Amersham) y se trató como se describe por el fabricante.
Se incluyeron muestras de control sobre geles de ARN como medida de la integridad de la sonda radiomarcada y como guías para los tamaños de transcrito esperados. Los controles para los genes petHf1 y petHf2 incluyeron ARN
35 aislado de pétalos OGB de petunia (etapas 3 a 4) o de flores de claveles transgénicos que previamente habían mostrado que acumulaban transcritos de petHf1. Los controles para otros genes F3'5'H incluyeron generalmente ARN aislado de pétalos de la misma especie de la que se había aislado la secuencia de F3'5'H.
Las transferencias de ARN se sondaron con fragmentos marcados con 32P. La prehibridación (1 hora a 42 ºC) y la
40 hibridación (16 horas a 42 ºC) de los filtros de membrana se llevó a cabo en formamida al 50% v/v, NaCl 1 M, SDS al 1% p/v, sulfato de dextrano al 10% p/v. Los filtros de membrana se lavaron generalmente en 2 x SSC, 1% p/v de SDS a 65 ºC durante entre 1 y 2 horas y luego 0,2 x SSC, SDS al 1% p/v a 65 ºC durante entre 0,5 y 1 hora. Las membranas de filtro se expusieron generalmente a película Kodak XAR con una pantalla de intensificación a -70 ºC durante 16 a 72 horas.
Ejemplo 4
Introducción de genes quiméricos F3'5'H de petunia en rosa
50 Como se ha descrito en la introducción, el patrón de hidroxilación del anillo B de la molécula de antocianidina desempeña una función clave en la determinación del color del pétalo. La producción del dihidroflavonol DHM conduce a la producción de pigmentos púrpuras/azules basados en delfinidina en plantas tales como petunia. La ausencia de actividad de F3'5'H ha sido correlacionada con la ausencia de flores azules en muchas especies de plantas tales como Rosa, Gerbera, Antirrhinum, Dianthus y Dendranthema.
55 Basándose en el éxito de la producción de pigmentos basados en delfinidina en una línea de petunia mutante (Holton y col., 1993a, arriba y la solicitud de patente internacional nº PCT/AU92/00334), en flores de tabaco (solicitud de patente internacional nº PCT/AU92/00334) y en flores de clavel (solicitud de patente internacional nº PCT/AU96/00296), genes quiméricos F3'5'H de petunia similares también se introdujeron en rosas con el fin de
60 producir novedosos pigmentos basados en delfinidina y modificar el color de la flor.
Preparación de construcciones del gen quimérico F3'5'H de petunia
En la Tabla 4 se enumera un resumen de fragmentos de promotor, terminador y codón usados en la preparación de construcciones y las abreviaturas respectivas.
TABLA 4: Abreviaturas usadas en preparaciones de construcciones Con el fin de producir moléculas de delfinidina y basadas en delfinidina en pétalos de rosa se prepararon varias construcciones de vectores binarios utilizando los fragmentos de ADNc de F3'5'H de petunia y diversos fragmentos de promotor y terminador. Los genes quiméricos F3'5'H de petunia demostraron ser satisfactorios en clavel y petunia
ABREVIATURA
DESCRIPCIÓN
AmCHS 5'
Fragmento de promotor de 1,2 kb del gen chalcona sintasa (CHS) de Antirrhinum majus (Sommer y Saedler, Mol Gen. Gent, 202: 429-434, 1986)
CaMV 35S
∼0,2 kb que incorpora fragmento BglII que contiene la región del promotor del gen del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S) (Franck y col., Cell 21: 285-294, 1980, Guilley y col., Cell, 30: 763-773, 1982)
35S5'
Fragmento de promotor del gen CaMV 35S (Franck y col., 1980, arriba) con una secuencia conductora no traducida en 5' de ∼60 pb del gen de la proteína de unión a clorofila a/b de petunia (gen Cab 22) (Harpster y col., MGG, 212: 182-190, 1988)
chrysCHS5'
Región de promotor de un gen CHS de crisantemo (SEQ ID NO:30)
eCaMV 35S
Promotor CaMV 35S potenciado como se describe en Mitsuhara y col., Plant Cell Physiol. 37:4959, 1996
GUS
Secuencia codificante de β-glucuronidasa (GUS) (Jefferson y col., EMBO J. 6: 3901-3907, 1987)
Mac
Promotor híbrido que consiste en el promotor de la manopina sintasa (mas) y una región potenciadora de CaMV 35S (Comai y col., Plant Mol. Biol. 15: 373-381, 1990)
mas/35S
Promotor híbrido que consiste en una región de promotor del gen CaMV 35S con elementos potenciadores de un fragmento del promotor del gen manopina sintasa (mas) de Agrobacterium tumefaciens (Janssen y Gardner, Plant Molecular Biology, 14: 61-72,1989)
mas 5'
Región de promotor de mas de A. tumefaciens
mas 3'
Región del terminador del gen mas de A. tumefaciens
nos 5'
Región de promotor del gen nopalina sintasa (nos) de A. tumefaciens (Depicker y col., J Mol. and Appl. Genetics 1: 561-573, 1982)
nos 3'
Región del terminador del gen nos de A. tumefaciens (Depicker y col., 1982, arriba)
nptII
Gen de resistencia a la kanamicina (codifica neomicina fosfotransferasa que desactiva antibióticos aminoglucosídicos tales como kanamicina, neomicina y G418)
ocs 3'
Fragmento del terminador de ∼1,6 kb del gen octopina sintasa de A. tumefaciens (descrito en Janssen y Gardner, 1989, arriba)
petD8 5'
Región de promotor de ∼3,2 kb de un gen de proteína de transferencia de fosfolípidos (D8) de Petunia hybrida (Holton, Isolation and characterization of petal specific genes from Petunia hybrida. Tesis doctoral, Universidad de Melbourne, Australia, 1992) (SEQ ID NO:24)
petD8 3'
Región del terminador de ∼0,7 kb de un gen de proteína de transferencia de fosfolípidos (D8) de Petunia hybrida cv. OGB (Holton, 1992, arriba)
long petFLS 5'
Fragmento de ∼4,0 kb que contiene la región de promotor de un gen flavonol sintasa (FLS) de P. hybrida
short petFLS 5'
Fragmento de ∼2,2 kb que contiene la región de promotor del gen FLS de P. hybrida
petFLS 3'
Fragmento de ∼0,95 kb que contiene la región del terminador del gen FLS de P. hybrida
petHf1
Clon de ADNc de F3'5'H Hf1 de petunia (Holton y col., 1993a, arriba) (SEQ ID NO:1)
petHf2
Clon de ADNc de F3'5'H Hf2 de petunia (Holton y col., 1993a, arriba) (SEQ ID NO:3)
petRT5'
Región de promotor de un gen antocianidin-3-glucósido ramnosiltransferasa (3RT) de P. hybrida (Brugliera, Characterization of floral specific genes isolated from Petunia hybrida. RMIT, Australia. Tesis doctoral, 1994)
petRT3'
Región del terminador de un gen 3RT de P. hybrida (Brugliera, 1994, sura)
RoseCHS 5'
Fragmento de ∼2,8 kb que contiene la región de promotor de un gen CHS de Rosa hybrida (SEQ ID: 5)
5 conduciendo a transcritos de F3'5'H intactos detectables (como se detecta por análisis de transferencia Northern) y a la producción de pigmentos de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina. La Tabla 5 resume la lista de construcciones de vectores binarios que contienen fragmentos de ADNc de F3'5'H de petunia.
TABLA 5: Resumen de casetes de expresión del gen quimérico F3'5'H de petunia contenidos en construcciones de 10 vectores binarios usados en la transformación de rosas (véase la Tabla 4 para una explicación de las abreviaturas)
PLÁSMIDO
GEN F3'5'H GEN DEL MARCADOR DE SELECCIÓN
pCGP1452
AmCHS 5': petHf1: petD8 3' 35S 5': SURB
pCGP1453
Mac: petHf1: mas 3' 35S 5': SuRB
pCGP1457
petD8 5': petHf1: petD8 3' 35S 5': SuRB
pCGP1461
short petFLS 5': petHf1: petFLS 3' 35S 5': SuRB
pCGP1616
petRT 5': petHf1: nos 3' 35S 5': SuRB
pCGP1638
CaMV 35S: petHf1: ocs 3' 35S 5': SuRB
pCGP1623
mas 35S: petHf1: ocs 3' 35S 5': SuRB
pCGP1860
RosaCHS 5': petHf1: nos 3' 35S 5': SuRB
pCGP2123
CaMV 35S: petHf2: ocs 3' 35S 5': SuRB
Aislamiento de clones de ADNc de F3'5'H de petunia (petHf1 y petHf2)
El aislamiento y caracterización de clones de ADNc de F3'5'H de petunia (petHf1 y petHf2 contenidos en pCGP602
15 (Figura 2) y pCGP175 (Figura 3), respectivamente) (SEC ID NO:1 y SEQ ID NO:3, respectivamente) se ha descrito en la solicitud de patente internacional nº PCT/AU92/00334 y Holton y col. (1993a, arriba).
Los plásmidos pCGP601 (Figura 2), pCGP602 (Figura 2), pCGP176 (Figura 2) contienen homólogos del clon de ADNc de petHf1 F3'5'H de petunia. El plásmido pCGP601 contiene un homólogo de F3'5'H de petunia petHf1 que
20 incluye 52 pb de secuencia no traducida de 5'. El plásmido pCGP602 contiene un homólogo de F3'5'H de petunia petHf1 que incluye 125 pb de secuencia no traducida de 5' (SEQ ID NO:1). El plásmido pCGP176 (descrito en Holton y col., 1993a arriba) contiene un homólogo de F3'5'H de petunia petHf1 que incluye 27 pb de secuencia no traducida de 5' y adicionalmente ∼127 pb de la secuencia no traducida de 3' sobre el clon de ADNc de F3'5'H de petunia petHf1 en pCGP602.
Construcción de pCGP1303 (petHf1 en esqueleto de pUC19)
El clon ADNc de F3'5'H de petunia contenido en el plásmido pCGP601 (descrito anteriormente) (Figura 2) incluyó 52 pb de secuencia no traducida de 5' y 141 pb de secuencia no traducida de 3' incluyendo 16 pb de la cola poli A. El
30 plásmido pCGP601 (Figura 2) se linealizó inicialmente por digestión con la endonucleasa de restricción BspHI. Los extremos se repararon y el clon de ADNc de F3'5'H de petunia petHf1 se liberó tras la digestión con la endonucleasa de restricción FspI. La secuencia de reconocimiento de BspHI engloba el codón de iniciación de la traducción putativo y la secuencia de reconocimiento de FspI comienza a 2 pb aguas abajo del codón de terminación. El fragmento de 1,6 kb que contiene el clon de ADNc de F3'5'H de petunia petHf1 se purificó con los extremos
35 reparados EcoRI de pUC19 (New England Biolabs). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis por endonucleasa de restricción del ADN aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP1303 (Figura 4).
Construcción de pCGP627 (short petHf1 en esqueleto de pBluescript)
40 El plásmido pCGP176 (Holton y col., 1993a, arriba) (Figura 2) se digirió con la endonucleasa de restricción SpeI y EcoRI. Los extremos se repararon luego y se permitió que se religaran. El plásmido resultante se designó pCGP627 y contuvo el clon de ADNc idéntico como en pCGP176, excepto que los sitios de endonucleasa de restricción PstI, BamHI y SmaI se eliminaron del sitio de clonación múltiple del vector pBluescript en el extremo 5' del clon de ADNc.
El vector binario pCGP1452 (AmCHS 5': petHf1: petH8 3')
El plásmido pCGP1452 (Figura 5) contiene un gen quimérico F3'5'H de petunia (petHf1) bajo el control de un fragmento del promotor del gen chalcona sintasa (CHS) de Antirrhinum majus (Sommer y Saedler, 1986, arriba) con un fragmento del terminador del gen proteína de transferencia de fosfolípidos (PLTP) (petD8 3') (Holton, 1992, arriba). El casete de F3'5'H de petunia quimérico está en una orientación en tándem con respecto al gen 35S 5':
5 SuRB del vector binario, pWTT2132 (DNA Plant Technologies, USA = DNAP) (Figura 6).
Productos intermedios en la preparación del pCGP1452 binario
El vector binario pWTT2132
El plásmido del vector binario pWTT2132 (DNAP) (Figura 6) contiene un gen quimérico que comprende una secuencia del promotor 35S 5' (Franck y col., 1980, arriba), ligada con la región codificante y una secuencia de terminador para el gen acetolactato sintasa (ALS) del locus SuRB de tabaco (Lee y col., 1988, arriba). Se incluye una secuencia conductora de no traducida de 5' de ∼60 pb del gen proteína de unión a clorofila a/b de petunia (gen 15 Cab 22) (Harpster y col., MGG, 212: 182-190, 1988) entre el fragmento del promotor 35S 5' y la secuencia de SuRB.
Construcción de pCGP725 (AmCHS 5': petHf1: petD8 3' en pBluescript)
Un gen quimérico F3'5'H de petunia bajo el control del promotor CHS de Antirrhinum majus (AmCHS 5') con un terminador PLTP de petunia (petD8 3') se construyó clonando el fragmento de F3'5'H de petunia (petHf1) BclI/FspI de 1,6 kb de pCGP602 (Holton y col., 1993a, arriba) (Figura 2) entre un fragmento del gen CHS de Antirrhinum majus de 1,2 kb 5' con respecto al sitio de iniciación de la traducción (Sommer y Saedler, 1986, arriba) y un fragmento de PLTP SmaI/XhoI de 0,7 kb (petD8 3') de pCGP13ΔBam (Holton, 1992, arriba) 3' con respecto al codón de terminación deducido. El plásmido resultante en un vector de esqueleto de pBluescript II KS (Stratagene, EE.UU.)
25 se designó pCGP725 (Figura 7).
Construcción de pCGP485 y pCGP1452 (vectores binarios AmCHS 5': petHf1: petD8 3')
El gen quimérico F3'5'H de pCGP725 (Figura 7) se clonó en el vector binario pCGN1547 que contiene un casete de gen marcador de selección nptll (McBride y Summerfelt, Plant Molecular Biology 14: 269-276, 1990) para crear pCGP485. Un fragmento de 3,5 kb que contenía el casete AmCHS 5': petHf1: petD8 3' se liberó tras la digestión de pCGP485 con la endonucleasa de restricción PstI. Los extremos de nucleótidos protuberantes se repararon y el fragmento de 3,5 kb purificado se ligó a los extremos SmaI del vector binario, pWTT2132 (DNAP). La inserción correcta del fragmento en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5':
35 SuRB se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado a partir de los transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido se designó pCGP1452 (Figura 5).
Transformación de plantas con pCGP1452
El ADN-T contenido en el plásmido de vector binario pCGP1452 (Figura 5) se introdujo en rosa mediante transformación mediada por Agrobacterium.
El vector binario pCGP1453 (Mac: petHf1: mas 3 ')
45 El plásmido pCGP1453 (Figura 8) contiene un gen quimérico F3'5'H de petunia (petHf1) bajo el control de un promotor Mac (Comai y col., 1990, arriba) con un fragmento del terminador del gen manopina sintasa de Agrobacterium (mas 3'). El casete quimérico F3'5'H de petunia está en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario, pWTT2132 (DNAP) (Figura 6).
Un fragmento de 3,9 kb que contiene el gen Mac: petHf1: mas 3' se liberó del plásmido pCGP628 (descrito en la solicitud de patente internacional nº PCT/AU94/00265) tras digestión con la endonucleasa de restricción PstI. Los extremos de nucleótidos protuberantes se repararon y el fragmento purificado se ligó con los extremos SmaI de pWTT2132 (DNAP). La inserción correcta del gen Mac: petHf1: mas 3' en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de
55 ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido se designó pCGP1453 (Figura 8).
Transformación de plantas con pCGP1453
El ADN-T contenido en el plásmido de vector binario pCGP1453 (Figura 8) se introdujo en rosa mediante transformación mediada por Agrobacterium.
El vector binario pCGP1457 (petD8 5': petHf1: petD8 3')
65 El plásmido pCGP1457 (Figura 9) contiene un gen quimérico F3'5'H de petunia (petHf1) bajo el control de un fragmento del promotor del gen PLTP de petunia (petD8 5') con un fragmento del terminador del gen PLTP de petunia (petD8 3'). El casete quimérico de F3'5'H de petunia está en una orientación en tándem con respecto al gen 35S 5': SuRB del vector binario, pWTT2132 (DNAP) (Figura 6).
Productos intermedios en la preparación del vector binario pCG1457 5
Aislamiento del clon genómico D8 de petunia
Preparación de biblioteca genómica de P. hybrida cv. OGB (Old Glory Blue) en λ2001
10 Se construyo una biblioteca de ADN genómica a partir de ADN de Petunia hybrida cv. OGB en el vector λ2001 (Karn y col., Gene 32: 217-224,1984) usando una digestión parcial con Sau3A del ADN genómico como se describe en Holton, 1992 (arriba). La selección de la biblioteca genómica OGB para el gen D8 de petunia fue como se describe en Holton, 1992, arriba.
15 Aislamiento del clon genómico de D8 OGB2.6
Se realizó PCR con el fin de encontrar un clon genómico no mutante que represente D8. Se usaron Oligo # 2 (5' a 3' GTTCTCGAGGAAAGATAATACAAT) (SEQ ID NO:6) y Oligo #4 (5' a 3' CAAGATCGTAGGACTGCATG) (SEQ ID NO:7) para amplificar fragmentos del gen D8, a través de la región del intrón, usando 4 μl de suspensión de fago de 20 los clones aislados de la selección primaria de la biblioteca genómica OGB. Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen total de 50 μl que contenía 1 x tampón de amplificación (Cetus), mezcla de dNTP 0,2 mM, <1 μg de ADN molde, 50 pmoles de cada cebador y 0,25 μl de polimerasa Taq (5 unidades/μl - Cetus). Las mezclas de reacción se recubrieron con 30 μl de aceite mineral y se sometieron a ciclos de temperatura usando Gene Machine (Innovonics). Las reacciones se sometieron a ciclos 30 veces usando las siguientes condiciones: 94 ºC durante 1 minuto, 55 ºC
25 durante 50 segundos, 72 ºC durante 2 minutos. Un cuarto de cada reacción de PCR se ejecutó sobre un gel de agarosa usando tampón de electroforesis TAE.
Tres clones, λOGB-2.4, λOGB-2.5 y λOGB-2.6 dieron fragmentos de aproximadamente 1 kb, mientras que el clon mutante, λOGB-3.2 (descrito en Holton, 1992, arriba) había producido un producto de 1,25 kb. El clon λOGB-2.6 se
30 eligió para análisis posterior.
pCGP382
El clon genómico λOGB-2.6 contuvo un único fragmento XbaI de 3,9 kb que se hibridó con el ADNc de D8. Este
35 fragmento XbaI se aisló y purificó y ligó con los extremos XbaI de pBluescriptII SK- (Stratagene, EE.UU.). El mapeo de restricción de este clon reveló un sitio PstI interno de 350 pb desde el extremo 3'. Sin embargo, el clon genómico “mutante” en pCGP13 tenía un PstI interno próximo al “ATG” de iniciación putativo de la región codificante (aproximadamente 1,5 kb desde su extremo 3'). La diferencia en la posición del sitio PstI en ambos clones sugirió que el fragmento XbaI de λOGB-2.6 no contenía la secuencia genómica completa de D8. Se realizó una
40 transferencia Southern sobre ADN de λOGB-2.6 digerido con PstI, y se encontró que un fragmento de 2,7 kb se hibridó con el ADNc de D8. El mapeo con endonucleasas de restricción confirmo que este fragmento contenía la región codificante 3' y las secuencias flanqueantes.
Con el fin de obtener un fragmento que contuviera la secuencia genómica de D8 completa se llevaron a cabo varias
45 etapas de clonación. El fragmento PstI de λOGB-2.6 de 2,7 kb se purificó y se ligó con los extremos PstI de pBluescriptII SK- (Stratagene, EE.UU.). El clon resultante se digirió con XbaI para eliminar el fragmento PstI/XbaI de 350 pb. Este fragmento se sustituyó con el fragmento XbaI de 3,9 kb de λOGB-2.6 para producir el plásmido pCGP382.
50 Un fragmento de 3,2 kb que contenía la región del promotor del gen D8 2.6 en pCGP382 se liberó tras la digestión con las endonucleasas de restricción HindIII y NcoI. El fragmento se purificó y ligó con el fragmento NcoI/HindIII de 4,8 kb de pJB1 (Bodeau, Molecular and genetic regulation of Bronze-2 and other maize anthocyanin genes. Disertación, Universidad de Stanford, EE.UU., 1994) para producir pCGP1101 que contenía un casete de petD8 5': GUS: nos 3'.
55 Un fragmento de F3'5'H de petunia petHf1 de 1,6 kb se liberó del plásmido pCGP602 (Holton y col., 1993a, arriba) (SEQ ID NO:1) (Figura 2) tras digestión con las endonucleasas de restricción BspHI y BamHI. El fragmento se purificó y ligó con el fragmento NcoI/BamHI de 6,2 kb del pCGP1101 para producir pCGP1102 que contenía un casete de expresión petD8 5': petHf1: nos 3'.
60 Se purificó un fragmento BamHI de petD8 3' de 0,75 kb (Holton, 1992, arriba) a partir del plásmido pCGP13ΔBamHI y se ligó con los extremos de BamHI/BglII de pCGP1102 para producir el plásmido pCGP1107 que contiene un casete de expresión petD8 5': petHf1: petD8 3'.
65 El plásmido pCGP1107 se linealizó tras la digestión con la endonucleasa de restricción XbaI. Los extremos de nucleótidos protuberantes se repararon y luego el fragmento de 5,3 kb que contenía el casete de expresión petD8 5': petHf1: petD8 3' se liberó tras la digestión con la endonucleasa de restricción PstI. El fragmento se purificó y ligó con los extremos SmaI/PstI del vector binario pWTT2132 (DNAP) (Figura 6). La inserción correcta del gen petD8 5': petHf1: petD8 3' en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcado de selección 35S 5': SuRB
5 se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido se designó pCGP1457 (Figura 9).
Transformación de plantas con Pcgp1457
El ADN-T contenido en el plásmido de vector binario pCGP1457 (Figura 9) se introdujo en rosa mediante transformación mediada por Agrobacterium.
El vector binario pCGP1461 (short pet 5': petHf1: pet FLS 3')
15 El plásmido pCGP1461 (Figura 10) contiene un gen quimérico F3'5'H de petunia (petHf1) bajo el control de un fragmento del promotor del gen flavonol sintasa (FLS) de petunia (short petFLS 5') con un fragmento del terminador del gen FLS de petunia (petFLS 3'). El gen quimérico F3'5'H de petunia está en una orientación en tándem con respecto al gen 35S 5': SuRB del vector binario, pWTT2132 (Figura 6).
Productos intermedios en la preparación del vector binario pCGP1461
Aislamiento del gen FLS de petunia
Preparación de biblioteca genómica de P. hybrida cv. Th7
25 Se preparó una biblioteca genómica de P. hybrida cv. Th7 según Sambrook y col. (1989, arriba) usando una digestión parcial con Sau3A del ADN genómico. El ADN parcialmente digerido se clonó en el vector EMBL-3 lambda (Stratagene, EE.UU.).
La biblioteca de ADN genómico Th7 se selección con fragmentos marcados con 32P de un clon de ADNc de FLS de petunia (Holton y col., Plant J. 4: 1003-1010, 1993b) usando condiciones de rigurosidad alta.
Se eligieron dos clones genómicos (FLS2 y FLS3) para análisis posteriores y se encontró que contenían secuencias aguas arriba de la metionina de iniciación putativa de la región codificante de FLS de petunia conteniendo FLS2 una
35 región de promotor más larga que FLS3.
pCGF486
Un fragmento de 6 kb se liberó tras la digestión del clon genómico FLS2 con la endonucleasa de restricción XhoI. El fragmento que contenía el gen FLS de petunia corto se purificó y ligó con los extremos XhoI de pBluescript SK (Stratagene, EE.UU.). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP486.
45 pCGP487
Un fragmento de 9 kb se liberó tras la digestión del clon genómico FLS3 con la endonucleasa de restricción XhoI. El fragmento que contenía el gen FLS de petunia se purificó y ligó con los extremos XhoI de pBluescript SK (Stratagene, EE.UU.). La inserción correcta del fragmento se estableció por un análisis con endonucleasas de restricción de ADN aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP487.
pCGP717
55 Un fragmento del promotor FLS de petunia de 2,2 kb aguas arriba a partir del sitio de iniciación de la traducción putativo se liberó del plásmido pCGP487 tras la digestión con las endonucleasas de restricción XhoI y Pstl. El fragmento generado se purificó y ligó con los extremos XhoI/Pstl de pBluescript II SK+ (Stratagene, EE.UU.). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP717.
pCGP716
Un fragmento del terminador FLS de petunia de 0,95 kb aguas abajo del sitio de terminación de la traducción putativo se liberó del plásmido pCGP487 tras la digestión con las endonucleasas de restricción HindIII y Sacl. El 65 fragmento generado se purificó y ligó con los extremos HindIII/SacI de pBluescript II KS+ (Stratagene, EE.UU.). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN aislado de
transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP716.
Construcción de pCGP493 (casete de expresión short petFLS 5': petFLS 3')
5 Un fragmento de 1,8 kb que contiene el fragmento del promotor FLS de petunia corto se amplificó por PCR usando el plásmido pCGP717 como molde y el cebador T3 (Stratagene, EE.UU.) y un cebador FLS-Nco (5' AAA ATC GAT ACC ATG GTC TTT TTT TCT TTG TCT ATA C 3') (SEQ ID NO:19). El producto de PCR se digirió con las endonucleasas de restricción XhoI y ClaI y el fragmento purificado se ligó con los extremos XhoI/ClaI de pCGP716. La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP493.
Construcción de pCGP497 (casete de expresión short petFLS 5': petHf1: petFLS 3')
El clon de ADNc de F3'5'H de petunia (petHf1) se liberó del plásmido pCGP627 (descrito anteriormente) tras la
15 digestión con las endonucleasas de restricción BspHI y FspI. La secuencia de reconocimiento de BspHI engloba el codón de iniciación de la traducción putativo y la secuencia de reconocimiento de FspI comienza 2 pb aguas abajo del codón de terminación. El fragmento de F3'5'H de petunia petHf1 generado se purificó y ligó con los extremos ClaI (extremos reparados)/NcoI del plásmido pCGP493. La inserción correcta del fragmento se estableció por el análisis con endonucleasas de restricción de ADN aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP497.
Construcción de pCGP1461 (vector binario short petFLS 5': petHf1: petFLS 3')
El plásmido pCGP497 se linealizó tras la digestión con la endonucleasa de restricción SacI. Los extremos de
25 nucleótidos protuberantes se repararon y un fragmento de 4,35 kb que contenía el casete de expresión del gen short petFLS 5': petHf1: petFLS 3' se libero tras la digestión con la endonucleasa de restricción KpnI. El fragmento generado se purificó y ligó con los extremos PstI (extremos reparados)/KpnI del vector binario pWTT2132 (DNAP) (Figura 6). La inserción correcta del fragmento en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB de pWTT2132 se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante se designó pCGP1461 (Figura 10).
Transformación de plantas con pCGP1461
35 El ADN-T contenido en el plásmido de vector binario pCGP1461 (Figura 10) se introdujo en rosa mediante transformación mediada por Agrobacterium.
El vector binario pCGP1616 (petRT 5': petHf1: nos 3')
El plásmido pCGP1616 (Figura 11) contiene un gen quimérico F3'5'H' de petunia (petHf1) bajo el control de un fragmento del promotor del gen 3RT de P. hybrida (petRT 5') (Brugliera. 1994, arriba) con un fragmento del terminador del gen nopalina sintasa (nos 3') de Agrobacterium (Depicker y col., 1982, arriba). El casete quimérico de F3'5'H de petunia está en una orientación en tándem con respecto al gen 35S 5': SuRB del vector binario, pWTT2132 (DNAP) (Figura 6).
45 Productos intermedios en la preparación del vector binario pCGP1616
Aislamiento del gen 3RT de Petunia
Construcción de biblioteca de ADN genómico de P. hybrida cv. Th7 en EMBL3
Se preparó una biblioteca genómica de Petunia hybrida cv. Th7 según Sambrook y col. 1989, arriba, usando una digestión parcial con Sau3A del ADN genómico. El ADN parcialmente digerido se clonó en el vector EMBL-3 lambda (Stratagene, EE.UU.). La selección de la biblioteca genómica de Th7 para el gen 3RT de petunia fue como se
55 describe en Brugliera, 1994, arriba.
Un fragmento de 3 kb que contenía el casete petRT 5': petHf1: nos 3' se liberó del plásmido pCGP846 (descrito en Brugliera, 1994, arriba) tras la digestión con las endonucleasas de restricción PstI y BamHI. El fragmento purificado se ligó con los extremos PstI/BamHI de pWTT2132 (DNAP) (Figura 6). La inserción correcta del fragmento en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido se designó pCGP1616 (Figura 11).
Transformación de plantas con pCGP1616
65 El ADN-T contenido en el plásmido de vector binario pCGP1616 (Figura 11) se introdujo en rosa mediante transformación mediada por Agrobacterium.
El vector binario pCGP1623 (mas/35S: petHf1: ocs 3')
5 El plásmido pCGP1623 (Figura 12) contiene un gen quimérico F3'5'H de petunia (petHf1) bajo el control del casete de expresión contenido en pKIWI101 (Janssen y Gardner, 1989, arriba) que consiste en un fragmento del promotor del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor (35S 5') con una secuencia potenciadora del promotor del gen manopina sintasa (mas) de Agrobacterium y un fragmento del terminador del gen octopina sintasa de Agrobacterium (ocs 3'). El casete quimérico de F3'5'H de petunia está en una orientación en tándem con respecto al gen 35S 5': SuRB del vector binario, pWTT2132 (DNAP) (Figura 6).
Productos intermedios en la preparación del vector binario pCGP1623
El fragmento de ∼1,6 kb del clon de ADNc de F3'5'H de petunia petHf1 contenido en el plásmido pCGP1303 (Figura
15 4) se liberó tras digestión con las endonucleasas de restricción BspHI y SmaI. El fragmento de F3'5'H de petunia petHf1 se purificó y ligó con un fragmento NcoI/EcoRI (extremos reparados) de ∼5,9 kb de pKIWI101 (Janssen y Gardner, 1989, arriba) para producir el plásmido pCGP1619.
Un digestión parcial del plásmido pCGP1619 con la endonucleasa de restricción XhoI liberó un fragmento de 4,9 kb que contenía el casete de expresión mas/35S: petHf1: ocs 3'. El fragmento se purificó y ligó con los extremos SalI de pWTT2132 (DNAP) (Figura 6). La inserción correcta del fragmento en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido se designó pCGP1623 (Figura 12).
Transformación de plantas con pCGP1623
El ADN-T contenido en el plásmido de vector binario pCGP1623 (Figura 12) se introdujo en rosa mediante transformación mediada por Agrobacterium.
El vector binario pCGP1638 (35S 5': petHf1: ocs 3')
El plásmido pCGP1638 (Figura 13) contiene un gen quimérico F3'5'H de petunia (petHf1) bajo el control de un promotor CaMV 35S (35S 5') con un terminador de octopina sintasa (ocs 3'). Una secuencia conductora no traducida
35 en 5' de ∼60 pb del gen de la proteína de unión a clorofila a/b de petunia (gen Cab 22) (Harpster y col., 1988, arriba) está incluido entre el fragmento del promotor CaMV 35S y el clon de ADNc de F3'5'H de petunia petHf1. El casete quimérico de F3'5'H de petunia está en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario, pWTT2132 (Figura 6).
Productos intermedios en la preparación del vector binario pCGP1638
Construcción de pCGP1273
El plásmido pCGP1273 se construyó subclonando un fragmento de HindIII/HpaI de ∼3 kb que contenía el gen 35S 5':
45 GUS: ocs 3' del vector binario pJJ3499 (Jones y col., Transgenic Research, 1: 285-297, 1992) con los extremos HindIII/SmaI del plásmido pBluescript KS II (+) (Stratagene, EE.UU.).
Construcción de pCGP1634
Un fragmento de HindIII/BamHI de ∼3 kb que contenía el gen 35S 5': GUS: ocs 3' de pCGP1273 se aisló luego y se ligó con los extremos HindIII/BamHI del vector de clonación pUC19 (New England Biolabs) para crear el plásmido pCGP1634.
Construcción de pCGP1636
55 El fragmento GUS del plásmido pCGP1634 se eliminó digiriendo pCGP1634 con las endonucleasas de restricción NcoI y XbaI y purificando el fragmento de ∼3,7 kb que contenían el fragmento del promotor 35S 5', el fragmento del terminador ocs 3' y el esqueleto del vector pUC19.
El clon de ADNc de F3'5'H de petunia petHf1 se liberó de pCGP1303 (Figura 4) tras la digestión con las endonucleasas de restricción BspHI y XbaI. El fragmento resultante de ∼1,6 kb se purificó y ligó con el fragmento NcoI/XbaI de ∼3,7 kb de pCGP1634. La inserción correcta del fragmento de F3'5'H de petunia petHf1 se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante que contenía un gen 35S 5': petHf1: ocs 3' se designó pCGP1636.
Construcción de pCGP1638
El gen 35S 5': petHf1: ocs 3' del plásmido pCGP1636 se liberó tras la digestión de pCGP1636 con las endonucleasas de restricción PstI y EcoRI. Los extremos se repararon y el fragmento de ∼2,6 kb se purifico y ligó
5 con los extremos Sam del vector binario, pWTT2132 (DNAP). La inserción correcta del gen 35S 5': petHf1: ocs 3' en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido se designó pCGP1638 (Figura 13).
10 Transformación de plantas con pCG1638
El ADN-T contenido en el plásmido de vector binario pCGP1638 (Figura 13) se introdujo en rosa mediante transformación mediada por Agrobacterium.
15 El vector binario pCGP1860 (RoseCHS 5': petHf1: nos 3')
El plásmido pCGP1860 (Figura 14) contiene un gen quimérico F3'5'H de petunia (petHf1) bajo el control de un fragmento del promotor del gen chalcona sintasa de Rosa hybrida (RoseCHS 5') con un fragmento del terminador del gen nopalina sintasa de Agrobacterium (nos 3'). El casete quimérico F3'5'H de petunia está en una orientación en
20 tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario pWTT2132 (DNAP) (Figura 6).
Productos intermedios en la preparación del vector binario pCGP1860
25 Aislamiento del promotor Rose CHS
Se preparó una biblioteca de ADN genómico de rosa a partir de ADN genómico aislado de hojas jóvenes de Rosa hybrida cv. Kardinal.
30 La biblioteca de ADN genómico de Kardinal se seleccionó con fragmento marcado con 32P del clon de ADNc de CHS de rosa contenido en el plásmido pCGP634. El clon de ADNc de CHS de rosa se aisló seleccionando una biblioteca de ADNc de pétalo preparada a partir de ARN aislado de pétalos de Rosa hybrida cv. Kardinal (Tanaka y col., 1995 arriba) usando un fragmento de ADNc de CHS de petunia como sonda (clon 1F11 contenido en pCGP701, descrito en Brugliera y col., 1994 arriba). Las condiciones son como se describen en Tanaka y col., 1995 (arriba).
35 Se eligió un clon genómico de rosa (roseCHS20λ) para el análisis posterior y se encontró que contenía ∼6,4 kb de secuencia aguas arriba de la metionina de iniciación putativa de la región codificante de CHS de rosa.
Un fragmento de ∼6,4 kb aguas arriba del sitio de iniciación de la traducción se clonó en pBluescript KS (-) 40 (Stratagene) y el plásmido se designó pCGP1114.
El plásmido pCGP1114 se digirió con las endonucleasas de restricción HindIII y EcoRV para liberar un fragmento de 2,7-3,0 kb que se purificó y ligó con los extremos de HindIII/Smal del pUC19 (New England Biolabs). La inserción correcta del fragmento del promotor CHS de rosa se estableció mediante el análisis con endonucleasas de
45 restricción de ADN aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP116. La secuencia de ADN del fragmento del promotor CHS de rosa se determinó usando pCGP1116 como molde (SEQ ID NO:5).
Construcción de pCGP197 (RoseCHS 5': GUS: nos 3' en esqueleto de pUC18)
50 Un fragmento de ∼3,0 kb que contiene el promotor de chalcona sintasa de rosa (RoseCHS 5') se liberó del plásmido pCGP1116 tras la digestión con las endonucleasas de restricción HindIII y Asp718. El fragmento se purificó y ligó con un fragmento HindIIlAsp718 de pJB1 (Bodeau, 1994, arriba) que contenía el esqueleto del vector, βglucuronidasa (GUS) y fragmentos nos 3'. La inserción correcta del fragmento del promotor CHS de rosa aguas
55 arriba de la secuencia codificante de GUS se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP197.
Construcción de pCGP200 (RoseCHS 5': petHf1: nos 3' en esqueleto de pUC18)
60 Un fragmento de 1,8 kb que contiene el fragmento de F3'5'H de petunia (petHf1) se liberó del plásmido pCGP1303 (descrito anteriormente) (Figura 4) tras la digestión con endonucleasas de restricción BspHl y Sacl. El fragmento de F3'5'H de petunia petHf1 se purificó y ligó con los extremos Ncol/Sacl de pCGP197. La inserción correcta del fragmento de F3'5'H de petunia petHf1 entre el promotor CHS de rosa y los fragmentos nos 3' se estableció mediante análisis con endonucleasas de restricción de ADN aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El
65 plásmido resultante fue designando como pCGP200.
Construcción de pCG1860 (RoseCHS 5': petHf1: nos 3' en un vector binario)
Un fragmento de ∼4,9 kb que contenía el casete RoseCHS 5': petHf1: nos 3' se liberó del plásmido pCGP200 tras la
5 digestión con la endonucleasa de restricción BglII. El fragmento se purificó y ligó con los extremos BamHI del vector binario, pWTT2132 (DNAP) (Figura 6). La inserción correcta del fragmento en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB de pWTT2132 se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante se designó pCGP1860 (Figura 13).
Transformación de plantas con pCGP1860
El ADN-T contenido en el plásmido de vector binario pCGP1860 (Figura 14) se introdujo en rosa mediante transformación mediada por Agrobacterium.
15 El vector binario pCGP2123 (CaMV 35S: petHf2: ocs 3')
El plásmido pCGP2123 (Figura 15) contiene un gen quimérico F3'5'H de petunia (petHf2) bajo el control de un promotor CaMV 35S con un fragmento del terminador del gen octopina sintasa de Agrobacterium (ocs 3'). El casete quimérico F3'5'H de petunia está en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario, pCGP1988 (Figura 16).
Productos intermedios en la preparación del vector binario pCGP2123
25 Construcción de pCGP1988 (un derivado del vector binario, pWTT2132)
El vector binario pCGP1988 (Figura 16) se basa en el vector binario pWTT2132 (DNAP) (Figura 6) pero contiene el sitio de clonación múltiple de pNEB193 (The England Biolabs). El plásmido pNEB193 se linealizó inicialmente por digestión con la endonucleasa de restricción EcoRI. Los extremos de nucleótidos protuberantes se repararon y el fragmento de clonación múltiple se liberó tras la digestión con la endonucleasa de restricción Pstl. El fragmento se purificó y ligó con los extremos reparados SalI (extremos reparados)/Pstl del vector binario pWTT2132 (DNAP). La inserción correcta del fragmento de clonación múltiple en pWTT2132 se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante se designó pCGP1988 (Figura 16).
Construcción de pCGP2000 (fragmento del promotor CaMV 35S en pBluescript)
El plásmido pCGP2000 fue un plásmido intermedio que contenía un fragmento del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) en un esqueleto de pBluescript SK (Stratagene, EE.UU.). El fragmento del promotor CaMV 35S de pKIWI101 (Janssen and Gardner 1989, arriba) se liberó tras la digestión con la endonucleasas de restricción Xbal y Pstl. El fragmento de ∼0,35 kb generado se purificó y ligó con los extremos de Xbal/Pstl del vector pBluescript SK. La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido se designó pCGP2000.
45 Construcción de pCGP2105 (fragmentos CaMV 35S 5' y ocs 3' en pBluescript)
El plásmido pCGP2105 (Figura 17) contenía un fragmento del promotor CaMV 35S junto con un fragmento del terminador del gen octopina sintasa de Agrobacterium (ocs 3') ambos de pKIWI101 (Janssen y Gardner, 1989, arriba).
El fragmento ocs 3' de pKIWI101 (Janssen y Gardner, 1989, arriba) se aisló digiriendo primero el plásmido pKIWI101 con la endonucleasa de restricción EcoRI, seguido por reparación de los extremos de nucleótidos protuberantes, y finalmente por digestión con la endonucleasa de restricción Xhol para liberar un fragmento de 1,6 kb. Este fragmento se ligó entonces con los extremos HincII/Xhol de pCGP2000. La inserción correcta del fragmento se estableció por
55 análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido se designó pCGP2105 (Figura 17).
Construcción de pCGP2109 (gen CaMV 35S: petHf2: ocs 3' en pBluescript)
El plásmido pCGP2109 contenía el casete del gen de expresión CaMV 35S: petHf2: ocs 3' en un esqueleto de pBluescript.
El clon de ADNc de F3'5'H de petunia petHf2 de 1,8 kb se liberó de pCGP175 (Holton y col., 1993, arriba) tras la digestión con las endonucleasas de restricción Xbal y SspI. Los extremos de nucleótidos protuberantes se repararon 65 y el fragmento purificado se ligó con los extremos Pstl (extremos reparados/EcoRV de pCGP2105 (descrito anteriormente) (Figura 17). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de
restricción de ARN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido se designó pCGP2109.
Construcción de pCGP2123 (vector binario CaMV 35S: petHf2: ocs 3')
5 El casete CaMV 35S: petHf2: ocs 3' se liberó de pCGP2109 tras la digestión con las endonucleasas de restricción Asp718 y Xbal. Los extremos de nucleótidos protuberantes se repararon y el fragmento resultante de ∼3,7 kb que contenía el gen CaMV 35S: petHf2: ocs 3' se purificó y ligó con los extremos reparados de Asp718 del vector binario, pCGP1988 (Figura 16). La inserción correcta del gen CaMV 35S: petHf2: ocs 3' en una orientación en tándem con
10 respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido se designó pCGP2123 (Figura 15).
Transformación de plantas con pCGP2123
15 El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP2123 (Figura 15) se introdujo en rosa mediante transformación mediada por Agrobacterium.
Ejemplo 5
Análisis de rosas transgénicas
Las rosas transgénicas producidas en los experimentos descritos en el Ejemplo 4 se cultivaron hasta su floración. Las flores se recolectaron y los colores de los pétalos se codificaron usando las cartas de colores de la Real
25 Sociedad Hortícola (RHSCC). Las antocianinas se extrajeron y las antocianidinas (específicamente la presencia de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina) se analizaron por análisis por CCF y/o HPLC. El ARN total también se aisló de tejido de pétalo y se usó análisis de transferencia Northern para detectar transcritos de transgenes F3'5'H de petunia, el gen CHS endógeno de rosa y el transgén SuRB. Los resultados de los análisis transgénicos se resumen en la Tabla 6.
30 Aunque se produjeron más de 250 rosas transgénicas Kardinal (Tabla 6), ninguna produjo flores con un cambio de color. Los análisis por CCF y/o HPLC fracasaron en detectar la acumulación de pigmentos de moléculas de delfinidina o basados en delfinidina confirmando la ausencia de una actividad de F3'5'H eficaz. El posterior análisis por Northern sobre ARN total aislado de tejido de pétalo de estas rosas transgénicas reveló que ni había transcritos
35 F3'5'H de petunia (petHf1 o petHf2) intactos ni, en algunos casos (véanse las notas a pie de página), transcritos degradados. La hibridación de las mismas membranas con el gen marcador de selección (SuRB) o con una sonda de ADNc de CHS de rosa endógena reveló transcritos de hibridación discretos que indicaron que no se había degradado el ARN total aislado. La detección de los transcritos del transgén SuRB confirmó que las rosas eran transgénicas.
40 TABLA 6: Resultados del análisis transgénico de pétalos de rosa transformados con el ADN-T de diversos casetes de expresión del gen F3'5'H de petunia (petHf1 o petHf2)
PLÁSMIDO
GEN F3'5'H EVENTOS DEL ARN
pCGP1452
AmCHS 5': petHf1: petD8 3' 34 0/28 0/341
pCGP1453
Mac: petHf1: mas 3' 16 0/14 0/132
pCGP1457
petD8 5': petHf1: petD8 3' 11 0/11 0/11
pCGP1461
short petFLS 5': petHf1: petFLS 3' 11 0/11 0/11
pCGP1616
petRT 5': petHf1: nos 3' 4 0/4 0/4
pCGP1623
mas/35S: petHf1: ocs 3' 27 0/20 0/123
pCGP1638
CaMV 35S: petHf1: ocs 3' 22 0/14 0/14
pCGP1860
RosaCHS 5': petHf1: nos 3' 15 0/13 0/13
pCGP2123
CaMV 35S: petHf2: ocs 3' 40 0/26 0/10
EVENTOS = número de eventos transgénicos independientes producidos DEL = número de eventos transgénicos en los que se detectaron moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina (por CCF o HPLC) en
45 pétalos con respecto al número total de eventos analizados ARN = número de eventos transgénicos en los que se detectaron transcritos de F3'5'H (petHf1 o petHf2) intactos mediante análisis de transferencia Northern en ARN total aislado de pétalos de rosa con respecto al número total de eventos analizados 1 = Se detectaron transcritos degradados en 5 de los 34 analizados 2 = Se detectaron transcritos degradados en 8 de los 13 analizados
50 3 = Se detectaron transcritos degradados en 8 de los 12 analizados
El hecho de que nunca se detectaran transcritos de F3'5'H de petunia (petHf1 o petHf2) en pétalos de rosas transgénicas transformadas con los ADN-T descritos (Tabla 6) sugirió varias posibilidades:
5 1. que el ARN aislado se había degradado. Este no fue el caso puesto que el ARN se había teñido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz UV. Las bandas de ARN ribosómico visibles intactas se usaron como indicador de la cantidad del ARN aislado. Adicionalmente, la detección de transcritos de longitud larga de los transgenes CHS de rosa y SuRB endógenos confirmó que la preparación de ARN no se había degradado.
10 2. que no hubo iniciación de la transcripción de los genes quiméricos F3'5'H evaluados. Esto era un posibilidad con
algunos de los casetes de expresión analizados, puesto que no se detectaron transcritos de F3'5'H por análisis Northern. Sin embargo, todos los casetes de expresión de F3'5'H de petunia habían demostrado ser funcionales (es decir, producen un transcrito intacto y producen la producción de pigmentos basados en delfinidina) en otras plantas
15 tales como clavel y petunia.
3. que los ARNm de F3'5'H de petunia petHf1 y petHf2 fueron inestables en rosas. Esto también era una
posibilidad puesto que se detectaron transcritos de F3'5'H de petunia degradados por análisis Northern en ARN total
20 aislado de pétalos de algunos eventos. Sin embargo, los ARNm de petHf1 y petHf2 de petunia habían demostrado ser estables en otras plantas tales como clavel y petunia. Tal inestabilidad podría deberse a una traducción aberrante que conduce a reposición de ARNm, alguna característica de la secuencia inherentemente inestable en células de rosa, algún otro factor o factores.
25 Por tanto, hubo una necesidad de encontrar fragmentos de promotor adecuados que condujeran eficazmente a la expresión de genes en pétalos de rosa y encontraran secuencias de F3'5'H adecuadas que produjeran transcritos intactos que se acumulan en pétalos de rosa conduciendo a actividad de F3'5'H funcional y a la producción de pigmentos basados en delfinidina.
30 Ejemplo 6
Evaluación de promotores en rosas
Desarrollo de casetes de expresión del gen GUS
35 La evaluación de los fragmentos de promotor y terminador se llevo a cabo usando el gen indicador GUS. Por tanto, varios promotores se ligaron al gen indicador β-glucuronidasa (GUS) (Jefferson y col., 1987, arriba) y se introdujeron en rosas en un intento por identificar los casetes de expresión que conducen a la iniciación eficaz de la transcripción en flores de rosa).
40 En la Tabla 7 se facilita un resumen de los fragmentos de promotor y terminador evaluados.
TABLA 7: Lista de casetes de expresión del gen quimérico GUS evaluados en rosas
PLÁSMIDO
CASETE DE EXPRESIÓN DE GUS GEN DEL MARCADOR DE SELECCIÓN VECTOR DE ESQUELETO
pCGP1307
petD8 5': GUS: petD8 3' mas 5': nptII: mas 3' pCGN1548
pCGP1506
long petFLS 5': GUS: petFLS 3' nos 5': nptII: nos 3' pBIN19
pCGP1626
chrysCHS 5': GUS: petRT 3' 35S 5': SuRB pWTT2132
pCGP1641
petRT 5': GUS: petRT 3' 35S 5': SuRB pWTT2132
pCGP1861
RosaCHS 5': GUS: nos 3' 35S 5': SuRB pWTT2132
pCGP1953
AmCHS 5': GUS: petD8 3' 35S 5': SuRB pWTT2132
pWTT2084
35S 5': GUS: ocs 3' 35S 5': SuRB pWTT2132
45 El vector binario pCGP1307 (petD8 5': GUS: petD8 3')
El plásmido pCGP1307 (Figura 18) contiene un gen quimérico GUS bajo el control de un fragmento del promotor y terminador del gen PLTP de petunia (petD8 5' y petD8 3', respectivamente). El casete del gen indicador quimérico GUS está en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección mas 5': nptII: mas 3'
50 del vector binario pCGN1548 (McBride y Summerfelt, 1990, arriba).
Productos intermedios en la preparación del vector binario pCGP1307 El fragmento nos 3' de pCGP1101 (véase el Ejemplo 4) se sustituyó con el fragmento petD8 3' de 0,75 kb (Holton, 1992, arriba) para producir el plásmido pCGP1106 que contenía un casete de expresión petD8 5': GUS petD8 3'.
5 El fragmento de 5,3 kb que contenía el casete de expresión petD8 5': GUS: petD8 3' se liberó del plásmido pCGP1106 tras la digestión con las endonucleasas de restricción Hind III y Pstl. El fragmento se purificó y ligó con los extremos HindIII/Pstl del vector binario pCGN1548 (McBride y Summerfelt, 1990, arriba). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN aislado de transformantes resistentes a la gentamicina. El plásmido resultante se designó pCGP1307 (Figura 18).
Transformación de plantas con pCGP1307
El ADN-T contenido en el plásmido de vector binario pCGP1307 (Figura 18) se introdujo en rosa mediante transformación mediada por Agrobacterium.
15 El vector binario pCGP1506 (long petFLS 5': GUS: petFLS 3')
El plásmido pCGP1506 (Figura 19) contiene un gen quimérico GUS bajo el control de fragmentos del promotor y terminador del gen flavonol sintasa de petunia (petFLS 5' y petFLS 3', respectivamente). El casete del gen indicador
20 quimérico GUS está en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección nos 5': nptll: nos 3' del vector binario pBIN19 (Bevan, Nucleic Acids Res 12: 8711-8721, 1984).
Productos intermedios en la preparación del vector binario pCGP1506
25 Un fragmento del promotor FLS de petunia de 4 kb de longitud aguas arriba del sitio de iniciación de la traducción putativo se liberó del plásmido pCGP486 (descrito en el Ejemplo 4) tras la digestión con las endonucleasas de restricción Xhol y Pstl. El fragmento generado se purificó y ligó con los extremos Xhol/Pstl de pBluescript II KS+ (Stratagene, EE.UU.). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción del ADN aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó
30 pCGP715.
Construcción de pCGP494 (casete de expresión long petFLS 5': petFLS3')
Se amplificó por PCR un fragmento de 4,0 kb que contenía el fragmento del promotor FLS de petunia largo usando
35 el plásmido pCGP715 como molde y el cebador T3 (Stratagene, EE.UU.) y un cebador FLS-Nco (5' AAA ATC GAT ACC ATG GTC TTT TTT TCT TTG TCT ATA C 3') (SEQ ID NO:19). El producto de PCR se digirió con las endonucleasas de restricción Xhol y Clal y el fragmento purificado se ligó con los extremos Xhol/Clal de pCGP716 (descrito en el Ejemplo 4). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó
40 pCGP494.
Construcción de pCGP496 (casete de expresión long petFLS 5': GUS: petFLS3')
La secuencia codificante de GUS del plásmido pJB1 (Bodeau, 1994, arriba) se liberó tras la digestión con las
45 endonucleasas de restricción Ncol y Smal. El fragmento GUS generado se purificó y ligó con los extremos Clal (extremo reparados)/NcoI del plásmido pCGP494. La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP496.
50 Construcción de pCGP1506 (vector binario long petFLS 5': GUS: petFLS3')
El plásmido pCGP496 se linealizó inicialmente tras la digestión con la endonucleasa de restricción Xhol. Los extremos de nucleótidos protuberantes se repararon parcialmente (usando solamente dTTP y dCTP en la reacción de reparación) y se liberó un fragmento de 6,7 kb que contenía el casete de expresión del gen long petFLS 5': GUS: 55 petFLS 3' tras la digestión con la endonucleasa de restricción SacI. El fragmento generado se purificó y ligó con los extremos BamHI (extremos parcialmente reparados usando dGTP y dATP en la reacción de reparación)/Sacl del vector binario pBIN19. La inserción correcta del fragmento en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección nos 5': nptII: nos 3' se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la kanamicina. El plásmido resultante se designó pCGP1506
60 (Figura 19).
Transformación de plantas con pCGP1506
El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP1506 (Figura 19) se introdujo en rosa mediante 65 transformación mediada por Agrobacterium.
El vector binario pCGP1626 (chrysCHS 5': GUS: petRT 3')
El plásmido pCGP1626 (Figura 20) contiene un gen quimérico GUS bajo el control del fragmento del promotor del gen chalcona sintasa de crisantemo (chrysCHS 5') y un fragmento del terminador del gen 3RT de petunia (petRT 3') 5 (Brugliera, 1994, arriba). El casete del gen indicador quimérico GUS está en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario pWTT2132 (DNAP) (Figura 6).
Productos intermedios en la preparación del vector binario pCGP1626
Aislamiento del promotor CHS de crisantemo
Se preparó una biblioteca de ADN genómico de crisantemo a partir de ADN genómico aislado de material de hojas jóvenes del Chrysanthemum cv. Hero.
15 La biblioteca de ADN genómico de crisantemo se seleccionó con fragmentos marcador con 32P de un clon de ADNc de CHS de crisantemo (SEQ ID NO:28) (contenido en el plásmido pCGP856) usando condiciones de rigurosidad alta. El plásmido pCGP856 contiene un clon de ADNc de 1,5 kb de CHS aislado de una biblioteca de ADNc de pétalo de ARN aislado de Chrysanthemum cv. Dark Pink Pom Pom.
Se eligió un clon genómico (CHS5) para el posterior análisis y se encontró que contenía ~3 kb de secuencia aguas arriba de la metionina de iniciación putativa de la región codificante de CHS de crisantemo.
Se liberó un fragmento de 4 kb tras la digestión del clon genómico CHS5 con la endonucleasa de restricción HindIII. El fragmento que contenía el promotor CHS de crisantemo se purificó y ligó con los extremos HindIII de pBluescript
25 SK (Stratagene, EE.UU.). La correcta inserción del fragmento se estableció mediante análisis con endonucleasas de restricción de ADN aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP1316.
Un fragmento del promotor CHS de crisantemo de 2,6 kb aguas arriba del sitio de iniciación de la traducción putativo fue se amplificó por PCR usando pCGP1316 como molde y los cebadores “chrysanCHSATG” (5'-GTTAAGGAAGCCATGGGTGT-3') (SEQ ID NO:8) y el cebador inverso M13 (Stratagene, EE.UU.). El cebador “chrysanCHSATG” incorporó una secuencia de reconocimiento de endonucleasas de restricción NcoI en el punto de iniciación de la traducción putativo para facilitar la clonación. El fragmento de PCR se purificó y ligó con los extremos EcoRV (con colas dT) de pBluescript KS (Holton y Graham, Nuc. Acids Res. 19: 1156, 1990). La correcta inserción
35 del fragmento se estableció mediante análisis con endonucleasas de restricción de ADN aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP1620. La secuencia de nucleótidos del fragmento del promotor CHS de crisantemo de contenido en pCGP1620 se representa SEQ ID NO:30.
Construcción de pCGP1622 (chrysCHS 5': GUS: nos 3' en esqueleto de pUC)
Un fragmento de ∼2,5 kb que contenía el promotor CHS de crisantemo se liberó del plásmido pCGP1620 tras la digestión con las endonucleasas de restricción NcoI y PstI. El fragmento se purificó y ligó con un fragmento de NcoI/ PstI de 4,8 kb de pJB1 (Bodeau, 1994, arriba) que contenía el vector de esqueleto con los fragmentos GUS y nos 3'. La correcta inserción del fragmento se estableció mediante análisis con endonucleasas de restricción de ADN
45 aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP1622.
Construcción de pCGP1626 (chrysCHS 5': GUS: nos 3' en vector binario)
Un fragmento de ∼4,6 kb que contenía el casete chrysCHS 5': GUS: nos 3' se liberó del plásmido pCGP1622 tras la digestión con las endonucleasas de restricción PstI y BglII. El fragmento se purificó y ligó con los extremos PstI/ BamHI del vector binario pWTT2132 (DNAP) (Figura 6). La correcta inserción del casete en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB se estableció con endonucleasas de restricción de ADN aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante se designó pCGP1626 (Figura 20).
Transformación de plantas con pCGP1626
El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP1626 (Figura 20) se introdujo en rosa mediante transformación mediada por Agrobacterium.
El vector binario pCGP1641 (petRT 5': GUS: petRT 3')
El plásmido pCGP1641 (Figura 21) contiene un gen quimérico GUS bajo el control de un promotor 3RT de petunia (petRT 5') que cubre 1,1 kb aguas arriba del codón de iniciación de la traducción 3RT putativo con un terminador 65 3RT de petunia (petRT 3') que cubre 2,5 kb aguas abajo del codón de terminación de 3RT. El casete quimérico de GUS está en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del
vector binario, pWTT2132 (DNAP) (Figura 6).
Productos intermedios en la preparación del vector binario pCGP1641
5 Aislamiento del gen 3RT de petunia
El aislamiento del gen 3RT de petunia correspondiente al sitio Rt de P. hybrida se ha descrito en Brugliera, 1994, arriba.
Construcción de pCGP1625 (casete CaMV 35S: GUS: petRT 3')
El plásmido intermedio pCGP1625 contiene un casete CaMV 35S: GUS: petRT 3' en un esqueleto de pUC. El fragmento de 2,5 kb que contenía una secuencia de terminación petRT se liberó del plásmido pCGP1610 (descrito en Brugliera, 1994, arriba) tras la digestión con las endonucleasas de restricción BamHI y SacI. El fragmento se
15 purificó y ligó con el fragmento BglII/SacI de 4,9 kb de pJB1 (Bodeau, 1994, arriba) que contenía el esqueleto de vector y el promotor CaMV 35S y fragmentos GUS. La inserción correcta del fragmento del terminador 3RT de petunia aguas abajo del fragmento GUS se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP1625.
Construcción de pCGP1628 (casete petRT 5': GUS: petRT 3')
Un fragmento del promotor petRT de 1,1 kb se liberó del plásmido pCGP1611 (descrito en Brugliera, 1994, arriba) tras digestión con las endonucleasas de restricción NcoI y PstI. El fragmento purificado se ligó con los extremos NcoI/PstI del fragmento de 7 kb de pCGP1625 que contenía el vector de esqueleto y los fragmentos GUS y petRT 3'.
25 La inserción correcta del fragmento del promotor petRT aguas arriba del fragmento GUS se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP1628.
Construcción de pCGP1641 (vector binario petRT 5': GUS: petRT 3')
Un fragmento de 5,4 kb que contenía el casete petRT 5': GUS: petRT 3' se liberó de pCGP1628 tras la digestión con la endonucleasa de restricción PstI. El fragmento se purificó y ligó con los extremos Pstl del vector binario pWTT2132 (DNAP) (Figura 6). La inserción correcta del fragmento en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de
35 ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante se designó pCGP1641 (Figura 21).
Transformación de plantas con pCGP1641
El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP1641 (Figura 21) se introdujo en rosa mediante transformación mediada por Agrobacterium.
El vector binario pCGP1861 (RoseCHS 5': GUS: nos 3')
45 El plásmido pCGP1861 (Figura 22) contiene un gen quimérico GUS bajo el control de un fragmento del promotor del gen CHS de R. hybrida (RoseCHS 5') con un fragmento del terminador del gen nos de Agrobacterium (nos 3'). El casete del gen indicador quimérico GUS está en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario, pWTT2132 (Figura 6).
Un fragmento de ~5 kb que contenía el casete RoseCHS 5': GUS: nos 3' se liberó de pCGP197 (descrito en el Ejemplo 4) tras la digestión con la endonucleasa de restricción BglII. El fragmento se purificó y ligó con los extremos BamHI del vector binario, pWTT2132 (DNAP). La inserción correcta del fragmento en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante se
55 designó pCGP1861 (Figura 22).
Transformación de plantas con pCGP1861
El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP1861 (Figura 22) se introdujo en rosa mediante transformación mediada por Agrobacterium.
El vector binario pCGP1953 (AmCHS 5': GUS: petD8 3')
El plásmido pCGP1953 (Figura 23) contiene un gen quimérico GUS bajo el control de un fragmento del promotor del
65 gen CHS de Antirrhinum majus (AmCHS 5') con un terminador PLTP de petunia (petD8 3'). El casete del gen indicador quimérico GUS está en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario, pWTT2132 (DNAP) (Figura 6).
Productos intermedios en la preparación del vector binario pCGP1953
5 El plásmido pJB1 (Bodeau, 1994, arriba) se linealizó con la endonucleasa de restricción NcoI. Los extremos de nucleótidos protuberantes se repararon y el fragmento GUS de 1,8 kb se liberó tras la digestión con BamHI. El fragmento GUS se purificó y se ligó con el fragmento XbaI (extremos reparados)/BamHI de 5 kb de pCGP726 que contenía el vector de esqueleto pBluescript y los fragmentos AmCHS 5' y petD8 3' (descritos en el Ejemplo 4). La inserción correcta del fragmento GUS entre los fragmentos AmCHS 5' y petD8 3' se estableció por análisis con
10 endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido se designó pCGP1952.
Un fragmento de 3,8 kb que contenía el casete de expresión AmCHS 5': GUS: petD8 3' se liberó del plásmido pCGP1952 tras la digestión con las endonucleasas de restricción EagI y PstI. Los extremos de nucleótidos
15 protuberantes se repararon y el fragmento purificado se ligó con los extremos reparados de un vector binario pWTT2132 digerido con Asp718 (Figura 6). La inserción correcta del fragmento en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido se designó pCGP1953 (Figura 23).
Transformación de plantas con pCGP1953
5 El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP1953 (Figura 23) se introdujo en rosa mediante transformación mediada por Agrobacterium.
25 El vector binario pWTT2084 (35S 5': GUS: ocs 3')
El plásmido pWTT2084 (DNAP) (Figura 24) contiene un gen quimérico GUS bajo el control de un promotor CaMV 35S (35S 5') con un terminador de octopina sintasa (ocs 3'). Una secuencia conductora no traducida en 5' de ∼60 pb
30 del gen de la proteína de unión a clorofila a/b de petunia (gen Cab 22) (Harpster y col., 1988, arriba) se incluye entre el fragmento del promotor CaMV 35S y el clon GUS. El casete quimérico de GUS está en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario, pWTT2084.
Transformación de plantas con pWTT2084
35 El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pWTT2084 (Figura 24) se introdujo en rosa mediante transformación mediada por Agrobacterium.
Análisis transgénico de las rosas transformadas con los casetes de expresión de GUS
40 Se realizó análisis de transferencia Northern sobre el ARN total aislado de pétalos de las etapas de desarrollo 3 a 4 de rosas Kardinal transgénicas transformadas con el ADN-T de diversos casetes de expresión de GUS. No hubo ni acumulación de transcrito ni un transcrito de longitud completa intacto del tamaño esperado de ∼1,8 kb como se detectó por hibridación de transferencia Northern. Se registraron los niveles relativos de transcritos de GUS que se
45 acumularon en los pétalos de rosa (véase la Tabla 8).
TABLA 8: Resumen de análisis Northern de flores de rosa Kardinal transgénica (etapa de yema abierta) que contienen construcciones de GUS
PLÁSMIDO
GEN INDICADOR GUS GEN DEL MARCADOR DE SELECCIÓN NIVELES DE TRANSCRITO DE GUS
pCGP1307
petD8 5': GUS: petD8 3' mas 5': nptII :mas 3' -
pCGP1506
petFLS 5': GUS: petFLS 3' nos 5': nptII: nos 3' -
pCGP1626
chrysCHS 5': GUS: petRT 3' 35S 5 SuRB ++ a +++
pCGP1641
petRT 5': GUS: petRT 3' 35S 5 SuRB -
pCGP1861
RosaCHS 5': GUS: nos 3' 35S 5': SuRB ++++
pCGP1953
AmCHS 5': GUS: petD8 3' 35S 5': SuRB -
pWTT2084
35S 5': GUS: ocs 3' 35S 5': SuRB +++++
-
= no se detectan transcritos 50 + a +++++ = niveles relativos (bajos a altos) de transcrito GUS de longitud completa detectado por análisis de transferencia Northern
Basándose en los resultados anteriores (Tabla 8), los promotores CaMV 35S (35S 5') y CHS de rosa (RoseCHS 5') parecen conducir a niveles relativamente altos de transcripción en pétalos de rosa. El promotor CHS de crisantemo (chrysCHS 5') parece también conducir a altos niveles de transcripción, pero no tan altos como aquellos obtenidos usando promotores CaMV 35S o CHS de rosa. Sorprendentemente, no pareció que los promotores CHS de 5 Antirrhinum (boca de dragón) (AmCHS 5'), 3RT de petunia (petRT 5'), FLS de petunia (petFLS 5') y PLTP de petunia (petD8 5') funcionaran en pétalos de rosa, ya que no se detectaron transcritos GUS con casetes de expresión que incorporaban estos promotores. Sin embargo, previamente se había demostrado que estos mismos promotores fusionados con genes petHf1 y/o GUS funcionaban bien en clavel y petunia conduciendo a niveles de transcrito de longitud completa relativamente altos y, para genes petHf1, la producción de pigmentos de moléculas de delfinidina
10 o basadas en delfinidina. El resultado obtenido con el promotor CHS de Antirrhinum (AmCHS 5') fusionado con el gen GUS fue más sorprendente, ya que pareció que las regiones de promotores de genes homólogos de otras dos especies (rosa y crisantemo) funcionaban relativamente bien en rosas. El promotor CHS de Antirrhinum también se había usado satisfactoriamente junto con F3'5'H de petunia (petHf1) para producir los novedosos claveles de color violeta Florigene Moondust (véase la solicitud de patente internacional nº PCT/AU96/00296).
15 La evaluación de los fragmentos de promotor y terminador fusionados con el gen GUS también proporcionó más pruebas que sugirieron que las secuencias de F3'5'H de petunia petHf1 y petHf2 eran inestables en rosas ya que las construcciones que contenían las secuencias de F3'5'H de petunia ligadas a los promotores CaMV 35S, CHS de rosa y CHS de crisantemo (que funcionan en rosa) no produjeron transcritos de F3'5'H de petunia petHf1 o petHf2
20 intactos en rosas (véase la Tabla 6).
Ejemplo 7
Aislamiento de secuencias de F3'5'H de especies diferentes de petunia
25 Como ya se había probado que las secuencias de F3'5'H de petunia funcionaban en diversas plantas tales como clavel, petunia y tabaco, y finalmente produjeron la producción de pigmentos basados en delfinidina, era razonable asumir que estas secuencias también demostrarían ser funcionales en rosas. Se asumió que la actividad enzimática podía variar dependiendo del antecedente de la especie, de hecho entre cultivares de una especie dada, en el que
30 se introdujo la F3'5'H de petunia. Sin embargo, no había esperanzas de que el ARNm de F3'5'H de petunia recombinante de longitud completa no se acumulara. El análisis de las secuencias de nucleótidos de F3'5'H de petunia (petHf1 y petHf2) no reveló ninguna secuencia que pudiera conducir a inestabilidad y posterior degradación (Johnson y col., en A look beyond transcription, ASPP, USA, Bailey-Serres and Gallie, eds, 1998), límites de corte y empalme intrón: exón (Brendel y col., en A look beyond transcription, ASPP, USA, Bailey-Serres and Gallie, eds,
35 1998), o cualquier secuencia autocatalítica o desencadenante de la degradación informada en la bibliografía científica hasta la fecha (en A look beyond transcription, ASPP, USA, Bailey-Serres and Gallie, eds, 1998). El sorprendente resultado sugirió que había factores específicos para la rosa que produjeron que las secuencias de F3'5'H de petunia fueran inestables.
40 Como no era obvio por qué las secuencias de F3'5'H de petunia eran inestables en rosas pero estables en clavel, petunia o tabaco, se aislaron varias secuencias de F3'5'H a lo largo de una gama de familias en un intento por determinar si cualquier secuencia de F3'5'H era inestable o no en rosas y luego identificar cualquier secuencia de F3'5'H que condujera a la síntesis de transcritos de F3'5'H estables y a actividad de F3'5'H y finalmente a la producción de pigmentos basados en delfinidina en rosas conduciendo a un cambio en el color de la flor.
Construcción de bibliotecas de ADNc de pétalo
Se prepararon bibliotecas de ADNc de pétalo a partir de ARN aislado de pétalos de las etapas de yema a flor abierta a partir de diversas especies de plantas descritas en la Tabla 9. Rosa hybrida se clasifica en la familia Rosaciae,
50 orden Rosales, subclase Rosidae y así se seleccionaron especies que producían pigmentos basados en delfinidina y así contenían una F3'5'H funcional y pertenecían a la subclase Rosidae. Petunia hybrida se clasifica en la familia Solanaceae, orden Solanales, subclase Asteridae y así se seleccionaron especies de la subclase Asteridae que producían pigmentos basados en delfinidina.
55 TABLA 9: Lista de flores a partir de las cuales se aisló ARN total para la preparación de bibliotecas de ADNc de pétalo. Información obtenida de la página web del Centro nacional para información biotecnológica (NCBI) en el buscador Taxonomía (TaxBrowser) a partir de agosto de 2003 A menos que se describa otra cosa, el ARN total se aisló del tejido de pétalo de flores púrpura/azules usando el método de Turpen y Griffith (BioTechniques 4: 11-15, 1986). Se selecciono poli (A)+ ARN del ARN total, usando oligotex-dT™ (Qiagen) o por tres ciclos de cromatografía en celulosa de oligo-dT (Aviv y Leder, Proc. Natl. Acad.
FLOR
ESPECIE FAMILIA ORDEN SUBCLASE
genciana
Gentiana spp. Gentianaceae Gentianales Asteridae
lavanda
Lavandula spp. Lamiaceae Lamiales Asteridae
salvia
Salvia spp. Lamiaceae Lamiales Asteridae
Sollya
Sollya spp. Pittosporaceae Apiales Asteridae
Kennedia
Kennedia spp. Fabaceae Fabales Rosidae
campanilla
Clitoria ternatea Fabaceae Fabales Rosidae
pensamiento
Viola spp. Violaceae Malpighiales Rosidae
5 USA 69: 1408,1972).
En general se utilizó el kit de clonación λZAPII/ Gigapack II (Stratagene, EE.UU.) (Short y col., Nucl Acids Res. 16: 7583-7600, 1988) para construir bibliotecas de ADNc de pétalo direccionales en ZAPII usando aproximadamente 5 μg de poli (A)+ ARN aislado de pétalo como molde. El número total de recombinantes obtenidos fue generalmente
10 del orden de 1 x 105 a 1 x 106.
Después de transfectar células XL1-Blue MRF', las mezclas de ADNc envasadas se sembraron a aproximadamente
50.000 ufp por placa de 15 cm de diámetro. Las placas se incubaron a 37 ºC durante 8 horas, y los fagos se eluyeron en NaCl 100 mM, MgSO4 8 mM, Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, gelatina al 0,01% (p/v) (tampón de
15 almacenamiento de fagos (PSB)) (Sambrook y col., 1989, arriba). Se añadió cloroformo y los fagos se almacenaron a 4 ºC como bibliotecas amplificadas.
En general, aproximadamente 100.000 ufp de las bibliotecas amplificadas se sembraron sobre placas NZY (Sambrook y col., 1989, arriba) a una densidad de aproximadamente 10.000 ufp por placa de 15 cm después de
20 transfectar las células XL1-Blue MRF', y se incubaron a 37 ºC durante 8 horas. Después de la incubación a 4 ºC durante la noche se tomaron elevaciones por duplicado sobre filtros Colony/Plaque Screen™ (DuPont) y se trataron como recomienda el fabricante.
Aislamiento de plásmidos
25 Se usó fago auxiliar R408 (Stratagene, EE.UU.) para escindir fagémidos pBluescript que contenían insertos de ADNc de bibliotecas de ADNc λZAPII o λZAP usando métodos descritos por el fabricante.
Selección de bibliotecas de ADNc de pétalo
30 Antes de la hibridación, elevaciones de placas por duplicado se lavaron en disolución de prelavado (Tris-HCl 50 mM a pH 7,5, NaCl 1 M, EDTA 1 mM, sarcosina al 0.1% (p/v)) a 65 ºC durante 30 minutos; seguido por lavado en hidróxido sódico 0,4 M a 65 ºC durante 30 minutos; luego se lavaron en una disolución de Tris-HCl 0,2 M a pH 8,0, 0,1 x SSC, SDS al 01% (p/v) a 65 ºC durante 30 minutos y finalmente se aclararon en 2 x SSC, SDS al 1,0% (p/v).
35 Las elevaciones de membrana de las bibliotecas de ADNc de pétalo se hibridaron con fragmentos marcados con 32P de un fragmento BspHI/FspI de 1,6 kb de pCGP602 (Figura 2) (SEC ID NO: 1) que contenía el clon de ADNc de F3'5'H de petunia petHf1 (Holton y col., 1993a, arriba).
40 Las condiciones de hibridación incluyeron una etapa de prehibridación en formamida al 10% v/v, NaCl 1 M, sulfato de dextrano al 10% p/v, SDS al 1% p/v a 42 ºC durante al menos 1 hora. Los fragmentos marcados con 32P (cada uno a 1 x 106 cpm/ml) se añadieron luego a la disolución de hibridación y la hibridación continuó a 42 ºC durante 16 horas adicionales. Los filtros se lavaron entonces en 2 x SSC, SDS al 1% p/v a 42 ºC durante 2 x 1 hora y se expusieron a una película Kodak XAR con una pantalla de intensificación a -70 ºC durante 16 horas.
45 Las placas fuertemente hibridantes se recogieron en PSB (Sambrook y col., 1989, arriba) y se volvieron a seleccionar para aislar placas purificadas usando las condiciones de siembra e hibridación como se describen para la selección inicial de la biblioteca de ADNc. Los plásmidos contenidos en los vectores de bacteriófago λZAPII o λZAP se rescataron y se generaron datos de secuencia de los extremos 3' y 5' de los insertos de ADNc. Se
50 identificaron nuevos clones de ADNc de F3'5'H basándose en la similitud de secuencias con el don de ADNc de F3'5'H de petunia petHf1.
A los clones de ADNc aislados se les dieron números de designación de plásmidos como se describe en la Tabla 10.
55 TABLA 10: Números de plásmidos y SEQ ID NO: de clones de ADNc de F3'5'H aislados a partir de diversas especies Construcciones de F3'5'H de Viola (pensamiento)
ESPECIE
CLON NÚMERO DE PLÁSMIDO NÚMERO DE FIGURA SEQ ID NO.
Viola spp.
BP#18 pCGP1959 25 9
Viola spp.
BP#40 pCGP1961 26 11
Salvia spp.
Sal#2 pCGP1995 31 13
Salvia spp.
Sal#47 pCGP1999 32 15
Sollya spp.
Soll#5 pCGP2110 37 17
Kennedia spp.
Kenn#31 pCGP2231 40 26
Clitoria ternatea
BpeaHF2 pBHF2F4 43 20
Gentiana triflora
Gen#48 pG48 47 22
Lavandula nil
LBG pLHF8 51 31
Aislamiento de clones de ADNc de F3'5'H a partir de pétalos de Viola spp. (pensamiento)
5 Se aislaron ARN total y poli (A)+ ARN de pétalos de yemas jóvenes de Viola spp. cultivar pensamiento negro como se ha descrito anteriormente. Se construyo una biblioteca de ADNc de pétalo usando el kit de clonación λZAPII/ Gigapack II (Stratagene, EE.UU.) y se seleccionó como se ha descrito anteriormente. Se identificaron dos clones de de ADNc de F3'5'H de pensamiento de longitud completa (BP#18 (SEQ ID NO:9) en pCGP1959 (Figura 25) y BP#40
10 (SEQ ID NO:11) en pCGP1961 (Figura 26)) por similitud de secuencias con el clon de ADNc de F3'5'H de petunia petHf1 (SEQ ID NO:1). BP#18 y BP#40 compartieron el 82% de identidad al nivel de nucleótidos. La comparación de la secuencia de nucleótidos de los clones de F3'5'H de pensamiento (BP#18 y BP#40) con la de F3'5'H de petunia reveló aproximadamente el 60% de identidad con el clon de F3'5'H de petunia petHf1 y el 62% de identidad con el clon de F3'5'H de petunia petHf2.
Los vectores binarios, pCGP1972 y pCGP1973 (AmCHS 5': BP#18 o BP#40: petD8 3')
Los plásmidos pCGP1972 (Figura 27) y pCGP1973 (Figura 28) contienen el clon de ADNc de F3'5'H de pensamiento (BP#18 y BP#40, respectivamente) entre un fragmento del promotor CHS de A. majus (boca de dragón) CHS
20 (AmCHS 5') y un fragmento del terminador PLTP de petunia (petD8 3'). Los genes quiméricos F3'5'H están en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario, pWTT2132 (DNAP) (Figura 6).
El clon de ADNc de F3'5'H de petunia (petHf1) en pCGP725 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 7) se eliminó
25 digiriendo inicialmente con pCGP725 con la endonucleasa de restricción BamHI. Los extremos se repararon y el plásmido linealizado se digirió adicionalmente con la endonucleasa de restricción XbaI. El fragmento de ~4,9 kb que contenía el vector con los fragmentos AmCHS 5' y petD8 3' se purificó y ligó con el fragmento KpnI (extremos reparados)/XbaI de ~1,6 kb que contenía el clon de ADNc de F3'5'H BP#18 o BP#40 de pensamiento de pCGP1959
o pCGP1961, respectivamente, para producir pCGP1970 y pCGP1971, respectivamente. El casete AmCHS 5':
30 pansy F3'5'H: petD8 3' se aisló entonces a partir de pCGP1970 o pCGP1971 digiriendo inicialmente con la endonucleasa de restricción NotI. Los extremos del plásmido linealizado se repararon y luego se liberaron los genes quiméricos F3'5'H tras la digestión con la endonucleasa de restricción EcoRV. Los fragmentos purificados se ligaron entonces con Asp718 (extremos reparados) del vector binario pWTT2132 (DNAP). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de
35 transformantes resistentes a la tetraciclina. Los plásmidos resultantes se designaron pCGP1972 (Figura 27) y pCGP1973. (Figura 28), respectivamente.
Transformación de clavel y petunia con pCGP1972 y 1973
40 Los ADN-T contenidos en los plásmidos de los vectores binarios pCGP1972 (Figura 27) y pCGP1973 (Figura 28) se introdujeron por separado en los Dianthus caryophyllus cultivares Kortina Chanel y Monte Lisa y Petunia hybrida cv. Skr4 x Sw63 mediante transformación mediada por Agrobacterium.
Los vectores binarios, pCGP1967 y pCGP1969 (CaMV 35S: pansy F3'5'H: ocs 3')
45 Los vectores binarios pCGP1967 (Figura 29) y pCGP1969 (Figura 30) contienen genes quiméricos CaMV 35S: pansy F3'5'H: ocs 3' en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario, pWTT2132 (DNAP) (Figura 6).
50 Productos intermedios en la preparación de los vectores binarios pCGP1967 y pCGP1969
Los plásmidos pCGP1959 (Figura 25) y pCGP1961 (Figura 26) se linealizaron inicialmente tras la digestión con la endonucleasa de restricción KpnI. Los extremos de nucleótidos protuberantes Kpnl se repararon y los clones de ADNc de F3'5'H de pensamiento, BP#18 y BP#40, se liberaron tras la digestión con la endonucleasa de restricción PstI. Los fragmentos de ∼1,6 kb generados se ligaron con un fragmento EcoRI (extremos reparados)/PstI de ∼5,9 kb de pKIWI101 (Janssen y Gardner, 1989, arriba). La correcta inserción de cada fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. Los plásmidos resultantes se designaron pCGP1965 y pCGP1966, respectivamente.
5 Los plásmidos pCGP1965 y pCGP1966 se digirieron inicialmente parcialmente con la endonucleasa de restricción XhoI. Los fragmentos resultantes se digirieron adicionalmente con la endonucleasa de restricción Xbal. Los extremos de nucleótidos protuberantes se repararon y los fragmentos de 3,6 kb que contenían los genes quiméricos CaMV 35S: pansy F3'5'H: ocs 3' se aislaron y ligaron con los extremos reparados Asp718 de pWTT2132 (Figura 6). La correcta inserción de cada fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. Los plásmidos resultantes se designaron pCGP1967 (Figura 29) y pCGP1969 (Figura 30), respectivamente.
Transformación de rosa con pCGP1967 y pCGP1969
15 Los ADN-T contenidos en los plásmidos de los vectores binarios pCGP1967 (Figura 29) y pCGP1969 (Figura 31) se introdujeron por separado en Rosa hybrida cv. Kardinal y Soft Promise mediante transformación mediada por Agrobacterium. El ADN-T contenido en los plásmidos de los vectores binarios pCGP1969 (Figura 31) también se introdujo en Rosa hybrida cv. Pamela y Medeo mediante transformación mediada por Agrobacterium,
Construcciones de F3'5'H de salvia
Aislamiento de un clon de ADNc de F3'5'H de pétalos de Salvia spp.
25 Se aislaron ARN total y poli (A)+ ARN de yemas de pétalos jóvenes de Salvia spp. (comprados en un vivero) como se ha descrito anteriormente. Se construyo una biblioteca de ADNc de pétalo usando el kit de clonación λZAPII/ Gigapack II (Stratagene, EE.UU.). Se identificaron dos clones de ADNc de F3'5'H de salvia de longitud completa (Sal#2 (SEQ ID NO:13) en pCGP1995 (Figura 31) y Sal#47 (SEQ ID NO:15) en pCGP1999 (Figura 32)) por similitud de secuencias con el clon de ADNc de F3'5'H de petunia petHf1. Sal#2 y Sal#47 comparten el 95% de identidad al nivel de nucleótidos. La comparación de la secuencia de nucleótidos de clones de F3'5'H de salvia (Sal#2 y Sal#47) con la de F3'5'H de petunia reveló aproximadamente el 57% de identidad con el clon de F3'5'H de petunia petHf1 (SEQ ID NO:1) y el 58% de identidad con el clon F3'5'H de petunia petHf2 (SEQ ID NO:3).
Los vectores binarios, pCGP2121 y pCGP2122 (AmCHS 5': Salvia F3'5'H #2 o #47: petD8 3')
35 Los plásmidos pCGP2121 (Figura 33) y pCGP2122 (Figura 34) contienen los clones de ADNc de F3'5'H de salvia (Sal#2 y Sal#47, respectivamente) entre un fragmento del promotor CHS de boca de dragón (AmCHS 5') y un fragmento del terminador PLTP de petunia (petD8 3') en tándem con el casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario pWTT2132 (DNAP) (Figura 6).
El clon de ADNc de F3'5'H de petunia (petHf1) en pCGP725 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 7) se eliminó digiriendo inicialmente con pCGP725 con la endonucleasa de restricción BamHI. Los extremos se repararon y el plásmido linealizado se digirió adicionalmente con la endonucleasa de restricción XbaI. El fragmento de ~4,9 kb que contenía el vector con los fragmentos AmCHS 5' y petD8 3' se purificó y ligó con el fragmento XhoI/BamHI (extremos
45 reparados) de ~1,6 kb de pCGP1995 (Figura 31) que contenía el fragmento F3'5'H#2 o XhoI/EcoRI (extremos reparados) de pCGP1999 de salvia (Figura 32) que contenía F3'5'H #47 de salvia, respectivamente para producir pCGP2116 y pCGP2117, respectivamente
El casete AmCHS 5': salvia F'3'5'H: petD8 3' se aisló a partir de pCGP2116 o pCGP2117 digiriendo inicialmente con la endonucleasa de restricción NotI. Los extremos de los plásmidos linealizados se repararon y luego los casetes del gen quimérico F3'5'H se liberaron tras la digestión con la endonucleasa de restricción EcoRV. Los fragmentos purificados de ~3,6 kb se ligaron entonces con los extremos Asp718 reparados del vector binario pCGP1988 (Figura 16) (descrito en el Ejemplo 4). La correcta inserción de cada fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. Los plásmidos resultantes
55 se designaron pCGP2121 (Figura 33) y pCGP2122 (Figura 34), respectivamente.
Transformación de clavel y petunia con pCGP2121 y pCGP2122
Los ADN-T contenidos en los plásmidos de los vectores binarios pCGP2121 (Figura 33) y pCGP2122 (Figura 34) se introdujeron por separado en Dianthus caryophyllus cultivares Kortina Chanel y Monte Lisa y Petunia hybrida cv. Skr4 x Sw63 mediante transformación mediada por Agrobacterium.
Los vectores binarios, pCGP2120 y pCGP2119 (CaMV 35S: salvia F3'5'H: ocs 3')
65 Los vectores binarios pCGP2120 (Figura 35) y pCGP2119 (Figura 36) contienen casetes del gen quimérico CaMV 35S: salvia F3'5'H: ocs 3' en tándem con el casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario pCGP1988 (Figura 16).
Productos intermedios en la preparación del vector binarios pCGP2120 y pCGP2119
5 Los plásmidos pCGP1995 (Figura 31) y pCGP1999 (Figura 32) se linealizaron inicialmente tras la digestión con la endonucleasa de restricción XhoI. Los extremos de nucleótidos XhoI se repararon y los clones de ADNc de F3'5'H de salvia Sal#2 o Sal#47 se liberaron luego tras la digestión con la endonucleasa de restricción EcoRI. En el caso de pCGP1995 se realizó una digestión parcial con EcoRI. Los fragmentos de ∼1,7 kb se ligaron con los extremos ClaI (extremos reparados)/EcoRI de pCGP2105 (Figura 17). La correcta inserción de cada fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. Los plásmidos resultantes se designaron pCGP2112 y pCGP2111, respectivamente.
Los plásmidos pCGP2112 y pCGP2111 se digirieron con las endonucleasas de restricción XhoI y XbaI. Los extremos de nucleótidos protuberantes resultantes se repararon y los fragmentos de ~3,6 kb que contenían los
15 genes quiméricos CaMV 35S: salvia F3'5'H: ocs 3' se aislaron y ligaron con los extremos Asp718 reparados del vector binario pCGP1988 (descrito en el Ejemplo 4). La correcta inserción de cada fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. Los plásmidos resultantes se designaron pCGP2120 (Figura 35) y pCGP2119 (Figura 36), respectivamente.
Transformación de rosa con pCGP2120 y pCGP2119
Los ADN-T contenidos en los plásmidos de los vectores binarios pCGP2120 (Figura 35) y pCGP2119 (Figura 36) se introdujeron por separado en Rosa hybrida cv. Kardinal mediante transformación mediada por Agrobacterium.
25 Construcciones de F3'5'H de Sollya
Aislamiento de un clon de ADNc de F3'5'H a partir de pétalos de Sollya spp.
Se aislaron ARN total y poli (A)+ ARN de yemas de pétalos jóvenes de Sollya spp. (comprados en un vivero) como se ha descrito anteriormente. Se construyó una biblioteca de ADNc de pétalo usando el kit de clonación λZAPII/ Gigapack II (Stratagene, EE.UU.). Se identificó un clon de longitud completa de ADNc de F3'5'H de Sollya (Soll#5 (SEQ ID NO:17) en pCGP2110 (Figura 37)) por similitud de secuencias con el clon de ADNc de F3'5'H de petunia petHf1. La comparación de la secuencia de nucleótidos del clon de F3'5'H de Sollya con la de F3'5'H de petunia
35 reveló aproximadamente el 48% de identidad con el clon de F3'5'H de petunia petHf1 (SEQ ID NO:1) y el 52% de identidad con el clon de F3'5'H de petunia petHf2 (SEQ ID NO:3).
El vector binario pCGP2130 (AmCHS 5': Sollya F3'5'H: petD8 3')
El plásmido pCGP2130 (Figura 38) contiene el clon de ADNc de F3'5'H de Sollya Soll#5 entre un fragmento del promotor CHS de boca de dragón (AmGHS 5') y un fragmento del terminador PLTP de petunia (petDB 3') en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario pCGP1988 (Figura 16).
45 El clon de ADNc de F3'5'H de petunia (petHf1) en pCGP725 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 7) se eliminó digiriendo inicialmente con pCGP725 con las endonucleasas de restricción XbaI y BamHI. Los extremos se repararon el fragmento de ∼4,9 kb que contenía el vector con los fragmentos AmCHS 5' y petD8 3' se purificó y ligó con los extremos reparados del fragmento Asp718/PstI de ~1,6 kb de pCGP2110 que contenía el clon de ADNc de F3'5'H de Sollya para producir pCGP2128. La inserción correcta del fragmento de F3'5'H de Sollya en tándem con los fragmentos AmCHS 5' y petD8 3' se confirmó por mapeo con endonucleasas de restricción.
El casete del gen AmCHS 5': sollya F3'5'H: petD8 3' se aisló entonces a partir de pCGP2128 digiriendo inicialmente con la endonucleasa de restricción NotI. Los extremos del plásmido linealizado se repararon y el gen quimérico F3'5'H se liberó entonces tras la digestión con la endonucleasa de restricción EcoRV. El fragmento purificado de
55 ~3,5 kb se ligó entonces con Asp718 (extremos reparados) del vector binario pCGP1988 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 16). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante se designó pCGP2130 (Figura 38).
Transformación de clavel y petunia con pCGP2130
El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP2130 (Figura 38) se introdujo en Dianthus caryophyllus cultivares Kortina Chanel y Monte Lisa y Petunia hybrida cv. Skr4 x Sw63 mediante transformación mediada por Agrobacterium.
El vector binario pCGP2131 (CaMV 35S: sollya F3'5'H: ocs 3')
El vector binario pCGP2131 (Figura 39) contiene un gen quimérico CaMV 35S: sollya F3'5'H: ocs 3' en tándem con el casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario pCGP1988 (Figura 16).
5 Productos intermedios en la preparación del vector binario pCGP2131
El plásmido pCGP2110 se linealizó inicialmente tras la digestión con la endonucleasa de restricción Asp718. Los extremos de nucleótidos protuberantes se repararon y el clon de ADNc de F3'5'H de Sollya se liberó tras la digestión con la endonucleasa de restricción PstI. El fragmento de ∼1,7 kb se ligó con los extremos EcoRV/Pstl de pCGP2105
10 (Figura 17). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP2129.
Un fragmento de 3,6 kb que contenía el gen quimérico CaMV 35S: sollya F3'5'H: ocs 3' se liberó tras la digestión con las endonucleasas de restricción Asp718 y XbaI. Los extremos de nucleótidos protuberantes se repararon y el
15 fragmento purificado se ligó con los extremos Asp718 reparados del vector binario pCGP1988 (Figura 16). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante se designó pCGP2131 (Figura 39).
Transformación de rosa con pCGP2131
20 El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP2131 (Figura 39) se introdujo en Rosa hybrida cv. Kardinal mediante transformación mediada por Agrobacterium.
Construcciones de F3'5'H de Kennedia 25
Aislamiento de un clon de ADNc de F3'5'H de pétalos de Kennedia spp.
Se aislaron ARN total y poli (A)+ ARN a partir de yemas de pétalos jóvenes de Kennedia spp. (compradas en un vivero) como se ha descrito anteriormente. Se construyó una biblioteca de ADNc de pétalo usando el kit de
30 clonación λZAPII/ Gigapack II (Stratagene, EE.UU.). Se identificó un clon de ADNc de F3'5'H de Kennedia de longitud completa (Kenn#31 en pCGP2231 (Figura 40)) (SEQ ID NO:26) por similitud de secuencias con el clon de ADNc de F3'5'H de petunia petHf1. La comparación de la secuencia de nucleótidos del clon de F3'5'H de Kennedia con la de F3'5'H de petunia reveló aproximadamente el 64% de identidad con el clon de F3'5'H de petunia petHf1 (SEQ ID NO:1) y el 60% de identidad con el clon de F3'5'H de petunia petHf2 (SEQ ID NO:3).
El vector binario pCGP2256 (AmCHS 5': Kennedia F3'5'H: petD8 3')
El plásmido pCGP2256 (Figura 41) contiene el clon de ADNc de F3'5'H de Kennedia (Kenn#31) entre un fragmento del promotor CHS de boca de dragón (AmCHS 5') y un fragmento del terminador PLTP de petunia (petD8 3') en
40 tándem con el casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario pCGP1988 (Figura 16).
El clon de ADNc de F3'5'H de petunia (petHf1) en pCGP725 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 7) se eliminó digiriendo inicialmente con pCGP725 con las endonucleasas de restricción XbaI y BamHI. Los extremos se repararon el fragmento de ∼4,9 kb que contenía el vector con los fragmentos AmCHS 5' y petD8 3' se purificó y ligó
45 con los extremos reparados de los fragmentos XhoI/BamHI de ~1,8 kb de pCGP2231 que contenía el clon de ADNc de F3'5'H de Kennedia para producir pCGP2242. La inserción correcta del fragmento de F3'5'H de Kennedia en tándem con los fragmentos AmCHS 5' y petD8 3' se confirmó mediante el mapeo con endonucleasas de restricción.
El casete AmCHS 5': Kennedia F3'5'H: petD8 3' se aisló entonces de pCGP2242 digiriendo con las endonucleasas
50 de restricción NotI y EcoRI. Los extremos se repararon y el fragmento purificado de ∼3,7 kb se ligó entonces con los extremos Asp718 reparados del vector binario pCGP1988 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 16). La correcta inserción del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante se designó pCGP2256 (Figura 41).
55 Transformación de petunia con pCGP2256
El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP2256 (Figura 41) se introdujo en Petunia hybrida cv. Skr4 x Sw63 mediante transformación mediada por Agrobacterium.
60 El vector binario pCGP2252 (CaMV 35S: Kennedia F3'5'H: ocs 3')
El vector binario pCGP2252 (Figura 42) contiene un gen quimérico CaMV 35S: Kennedia F3'5'H: ocs 3' en tándem con el casete marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario pCGP1988 (Figura 16).
65 Productos intermedio en la preparación del vector binario pCGP2252 El plásmido pCGP2231 se linealizó inicialmente tras la digestión con la endonucleasa de restricción XhoI. Los extremos de nucleótidos protuberantes se repararon y el clon de ADNc de F3'5'H de Kennedia se liberó tras la digestión con la endonucleasa de restricción PstI. El fragmento de ∼1,7 kb se ligó con los extremos ClaI (extremos reparados)/Pstl de pCGP2105 (Figura 17). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con
5 endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP2236.
Un fragmento de 3,6 kb que contenía el casete del gen quimérico CaMV 35S: kennedia F3'5'H: ocs 3' se liberó del plásmido pCGP2236 tras la digestión con las endonucleasas de restricción XhoI y NotI. Los extremos de nucleótidos protuberantes se repararon y el fragmento purificado se ligó con los extremos Asp718 reparados del vector binario pCGP1988 (Figura 16). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante se designó pCGP2252 (Figura 42).
15 Transformación de rosa con pCGP2252
El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP2252 (Figura 42) se introdujo en Rosa hybrida cv. Kardinal mediante transformación mediada por Agrobacterium.
Construcciones de F3'5'H de campanilla
Aislamiento de un clon de ADNc de F3'5'H de pétalos de Clitoria ternatea (campanilla)
Construcción de la biblioteca de ADNc de pétalo de campanilla
25 Una variedad azul de Clitoria ternatea (campanilla, las semillas fueron amablemente proporcionadas por el Jardín Botánico de Osaka) se cultivó en un campo en Osaka. El ARN total se aisló de pétalos frescos y pigmentados en la etapa de pre-antesis como se ha descrito anteriormente. Se preparo el poli A+ ARN usando Oligotex (Takara) según la recomendación del fabricante. Se construyó una biblioteca de ADNc de pétalo de campanilla a partir de poli A+ ARN usando un kit de síntesis de λZAP-ADNc direccional (Stratagene, EE.UU.) siguiendo los protocolos del fabricante.
Selección de una biblioteca de ADNc de campanilla para un clon de ADNc de F3'5'H
35 La biblioteca de ADNc de pétalo de campanilla se seleccionó con clon de ADNc de F3'5'H de petunia petHf1 marcado con DIG como se ha descrito previamente (Tanaka y col., Plant Cell Physiol. 37: 711-716, 1996). Se identificaron dos clones de ADNc que mostraron alta similitud de secuencias con la de F3'5'H de petunia petHf1. El plásmido que contenía el clon de ADNc más largo se designó pBHF2 y se secuencio el clon de ADNc. El alineamiento entre las secuencias de aminoácidos deducidas del clon de F3'5'H de campanilla y el clon de F3'5'H de petunia petHf1 (SEQ ID NO:2) reveló que el ADNc de F3'5'H de campanilla (contenido en pBHF2) no representó un ADNc de longitud completa y careció de las 2 primeras bases del codón de iniciación putativo. Estas dos bases junto con un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción BamHI se añadieron al clon de ADNc usando PCR y un cebador sintético, 5'-GGGATCCAACAATGTTCCTTCTAAGAGAAAT-3' [SEQ ID NO:25] como se ha descrito previamente (Yonekura-Sakakibara y col., Plant Cell Physiol. 41: 495-502, 2000). El fragmento resultante se digirió
45 con las endonucleasas de restricción BamHI y PstI y se recuperó el fragmento de ADN posterior de aproximadamente 200 pb. El fragmento de ADN se ligó con un fragmento de 3,3 kb de pBHF2 digerido con BamHI/ EcoRI para producir pBHF2F (Figura 43). Se confirmo que la secuencia de ADN excluía errores cometidos durante la PCR (SEQ ID NO:20). La comparación de la secuencia de nucleótidos del clon de F3'5'H de campanilla (SEQ ID NO:20) con la de F3'5'H de petunia reveló aproximadamente el 59% de identidad con el clon de F'3'5'H de petunia petHf1 (SEQ ID NO:1) y el 62% de identidad con el clon de F3'5'H de petunia petHf2 (SEQ ID NO:3).
El vector binario pCGP2135 (AmCHS 5': butterfly pea F3'5'H: petD8 3')
El plásmido pCGP2135 (Figura 44) contiene el clon de ADNc de F3'5'H de campanilla entre un fragmento del
55 promotor CHS de boca de dragón (AmCHS 5') y un fragmento del terminador PLTP de petunia (petD8 3') en tándem con el casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario pCGP1988 (Figura 16).
El clon de ADNc de F3'5'H de petunia (petHf1) en pCGP725 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 7) se eliminó digiriendo inicialmente con pCGP725 con las endonucleasas de restricción XbaI y BamHI. Los extremos se repararon el fragmento de ∼4,9 kb que contenía el vector con los fragmentos AmCHS 5' y petD8 3' se purificó y ligó con los extremos reparados del fragmento XhoI/ BamHI de ~1,6 kb de pBHF2F (Figura 43) que contenía el clon de ADNc de F3'5'H de campanilla para producir pCGP2133. La inserción correcta del fragmento de F3'5'H de campanilla en tándem con los fragmentos AmCHS 5' y petD8 3' se confirmó mediante el mapeo con endonucleasas de restricción.
65 El casete AmCHS 5': butterfly pea F3'5'H: petD8 3' se aisló entonces a partir de pCGP2133 digiriendo inicialmente con la endonucleasa de restricción NotI. Los extremos del plásmido linealizado se repararon y el gen quimérico F3'5'H se liberó tras la digestión con la endonucleasa de restricción EcoRV. El fragmento purificado de ~3,6 kb se ligó entonces con los extremos Asp718 reparados del vector binario pCGP1988 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 16). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de
5 plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante se designó pCGP2135 (Figura 44).
Transformación de clavel y petunia con pCGP2135
10 El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP2135 (Figura 44) se introdujo en Dianthus caryophyllus cultivares Kortina Chanel y Monte Lisa y Petunia hybrida cv. Skr4 x Sw63 mediante transformación mediada por Agrobacterium.
El vector binario pBEBF5 (eCaMV 35S: butterfly pea F3'5'H: nos 3')
15 El vector binario pBE2113-GUS contiene una región codificante GUS entre un promotor CaMV 35S potenciado y un terminador nos en un vector binario pBI121 (Mitsuhara y col., 1996, arriba). El plásmido pBE2113-GUS se digirió con la endonucleasa de restricción Sacl. Los extremos de nucleótidos protuberantes se repararon y luego se ligaron con un ligador SaII para dar pBE2113-GUSs. El fragmento BamHI-XhoI de 1,8 kb de pBHF2F se ligó con pBE2113
20 GUSs digerido con BamHI/SalI para crear pBEBF5 (Figura 45).
Transformación de rosa con pBEBF5
El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pBEBF5 (Figura 45) se introdujo en Rosa hybrida cultivar 25 lavanda mediante transformación mediada por Agrobacterium.
El vector binario pCGP2134 (CaMV 35S: butterfly pea F3'5'H: ocs 3')
El vector binario pCGP2134 (Figura 46) contiene un casete del gen quimérico CaMV 35S: butterfly pea F3'5'H: ocs 3' 30 en una orientación en tándem con el casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario pCGP1988 (Figura 16).
Productos intermedios en la preparación del vector binario pCGP2134
35 El clon de ADNc de F3'5'H de campanilla se liberó tras la digestión del plásmido pBHF2F (Figura 43) con las endonucleasas de restricción XhoI y BamHI. Los extremos de nucleótidos protuberantes se repararon y el fragmento de ∼1,7 kb se ligó con los extremos PstI (extremos reparados)/EcoRV de pCGP2105 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 17). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP2132.
40 Un fragmento de ~3,6 kb que contenía el casete del gen quimérico CaMV 35S: butterfly pea F3'5'H: ocs 3' se liberó tras la digestión con las endonucleasas de restricción XhoI y XbaI. Los extremos de nucleótidos protuberantes se repararon y el fragmento purificado se ligó con los extremos Asp718 reparados del vector binario pCGP1988 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 16). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con
45 endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante se designó pCGP2134 (Figura 46).
Transformación de rosa con pCGP2134
50 El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP2134 (Figura 46) se introdujo en Rosa hybrida cv. Kardinal mediante transformación mediada por Agrobacterium.
Construcción de F3'5'H de genciana
55 Aislamiento de un clon de ADNc de F3'5'H de pétalos de Gentiana triflora (genciana)
Construcción y selección de una biblioteca de ADNc de pétalo de genciana
El aislamiento de un ADNc de genciana que codifica F3'5'H ha sido descrito previamente (Tanaka y col., 1996,
60 arriba) y está contenido dentro del plásmido pG48 (Figura 47). La comparación de la secuencia de nucleótidos del clon de F3'5'H de genciana (Gen#48) (SEQ ID NO:22) contenido en el plásmido pG48 (Figura 47) con el de F3'5'H de petunia reveló aproximadamente el 61% de identidad con el clon de F3'5'H de petunia petHf1 (SEQ ID NO:1) y el 64% de identidad con el clon de F3'5'H de petunia petHf2 (SEQ ID NO:3).
65 El vector binario pCGP1498 (AmCHS 5': gentia F3'5'H: petD8 3')
El plásmido pCGP1498 (Figura 48) contiene el clon de ADNc de F3'5'H de genciana (Gen#48) entre un fragmento del promotor CHS de boca de dragón (AmCHS 5') y un fragmento del terminador PLTP de petunia (petD8 3') en tándem con el casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario pWTT2132 (Figura 6).
5 El clon de ADNc de F3'5'H de petunia (petHf1) en pCGP725 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 7) se eliminó digiriendo inicialmente con pCGP725 con las endonucleasas de restricción XbaI y BamHI. Los extremos fueron reparados, el fragmento de ∼4,9 kb que contenía el vector con los fragmentos AmCHS 5' y petD8 3' se purificó y ligó con los extremos reparados del fragmento XhoI/ BamHI de ∼1,7 kb de pG48 (Figura 47) que contenía el clon de ADNc de F3'5'H de genciana para producir pCGP1496. La inserción correcta del fragmento de F3'5'H de genciana
10 en tándem con los fragmentos AmCHS 5' y petD8 3' se confirmó mediante el mapeo con endonucleasas de restricción.
El casete AmCHS 5': gentia F3'5'H: petD8 3' se aisló entonces a partir de pCGP1496 digiriendo inicialmente con la endonucleasa de restricción NotI. Los extremos de nucleótidos protuberantes del plásmido linealizado se repararon y
15 luego el gen quimérico F3'5'H se liberó tras la digestión con la endonucleasa de restricción EcoRV. El fragmento purificado de ~3,6 kb se ligó entonces con los extremos Asp718 reparados del vector binario pWTT2132 (Figura 6). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante se designó pCGP1498 (Figura48).
20 Transformación de clavel y petunia con pCGP1498
El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP1498 (Figura 48) se introdujo en Dianthus caryophyllus cultivares Kortina Chanel y Monte Lisa y Petunia hybrida cv. Skr4 x Sw63 mediante transformación mediada por Agrobacterium.
El vector binario pBEGHF48 (eCaMV 35S: gentia F3'5'H: nos 3')
El clon de ADNc de F3'5'H de genciana se liberó tras la digestión del plásmido pG48 con las endonucleasas de restricción BamHI y XhoI. El fragmento de ADN de ∼1,7 kb resultante se aisló y ligó con pBE2113-GUSs digerido con 30 BamHI/SalI (Mitsuhara y col., 1996, arriba) para crear pBEGHF48 (Figura 49).
Transformación de rosa con pBEGHF48
El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pBEGHF48 (Figura 49) se introdujo en Rosa hybrida cv. 35 Lavanda mediante transformación mediada por Agrobacterium.
El vector binario pCGP1982 (CaMV 35S: gentia F3'5'H: ocs 3')
El vector binario pCGP1982 (Figura 50) contiene un casete del gen quimérico CaMV 35S: gentia F3'S'H: ocs 3' en 40 tándem con el casete del gen marcador de selección 35S 5': SuRB del vector binario pWTT2132 (Figura 6).
Productos intermedios en la preparación del vector binario pCGP1982
El plásmido pG48 (Figura 47) se linealizó tras la digestión con la endonucleasa de restricción Asp718. Los extremos
45 de nucleótidos protuberantes se repararon y el clon de ADNc de F3'5'H de genciana (Gen#48) se liberó tras la digestión con la endonucleasa de restricción BamHI. El fragmento de ∼1,7 kb se ligó con el fragmento EcoRI (extremos reparados)/ BamHI de 5,95 kb de pKIWI101 (Janssen y Gardner, 1989, arriba). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de restricción de ADN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó pCGP1981.
50 Un fragmento de ∼3,6 kb que contenía el casete del gen quimérico CaMV 35S: gentia F3'5'H: ocs 3' se liberó tras la digestión del plásmido pCGP1981 con las endonucleasas de restricción XhoI y XbaI. Los extremos de nucleótidos protuberantes se repararon y el fragmento purificado se ligó con los extremos reparados del vector binario digerido por Asp718, pWTT2132. La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis con endonucleasas de
55 restricción de ARN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante se designó pCGP1982 (Figura 50).
Transformación de rosa con pCGP1982
60 El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP1982 (Figura 50) se introdujo en Rosa hybrida cv. Kardinal mediante transformación mediada por Agrobacterium.
Construcciones de F3'5'H de lavanda
65 Aislamiento de un clon de ADNc de F3'5'H de pétalos de Lavandula nil (lavanda) Construcción de biblioteca de ADNc de pétalo de lavanda
Se compraron de una floristería flores cortadas de una variedad violeta de Lavandula nil. Se aisló ARN total de
5 pétalos frescos y pigmentados como se ha descrito anteriormente. Se preparo poli A+ ARN usando Oligotex (Takara) según las recomendaciones del fabricante. Se construyó una biblioteca de ADNc de pétalo de lavanda a partir de poli A+ ARN usando un kit de síntesis de λZAP-ADNc direccional (Stratagene, EE.UU.) siguiendo los protocolos del fabricante.
10 Selección de una biblioteca de ADNc de lavanda para un clon de ADNc de F3'5'H
La biblioteca de ADNc de pétalo de lavanda se seleccionó con clon de ADNc de F3'5'H de petunia petHf1 marcado con DIG como se ha descrito previamente (Tanaka et al.1996, arriba). Se identificó un clon de ADNc (LBG) que mostró alta similitud con F3'5'H de petunia petHf1 y el plásmido se designó pLHF8 (Figura 51). La secuencia de
15 nucleótidos del clon de ADNc de F3'5'H de lavanda (LBG) se designó SEQ ID NO:31.
La comparación de la secuencia de nucleótidos del clon de F3'5'H de lavanda con la de los clones de ADNc de F3'5'H de petunia reveló aproximadamente el 59% de identidad con el clon de F3'5'H de petunia petHf1 (SEQ ID NO:1) y el 60% de identidad con el clon petHf2 de petunia (SEQ ID NO:3).
El vector binario pBELF8 (eCaMV 35S: lavender F3'5'H: nos 3')
El plásmido de pLHF8 (Figura 51) se digirió con las endonucleasas de restricción BamHI y XhoI para liberar un fragmento de ADN de ∼1,8 kb. El fragmento purificado de ~1,8 kb de pLHF8 se ligó entonces con los extremos
25 digeridos con BamHI-SalI del plásmido pBE2113-GUSs (descrito anteriormente) para crear pBELF8 (Figura 52).
Transformación de rosa con pBELF8
El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pBELF8 (Figura 52) se introdujo en Rosa hybrida cultivar 30 Lavanda mediante transformación mediada por Agrobacterium.
Ejemplo 8
Análisis de clavel, petunia y rosa transgénicos
35 Las plantas transgénicas producidas en los experimentos descritos en el Ejemplo 7 se cultivaron hasta su floración. Las flores se recolectaron y los colores de los pétalos se codificaron usando las cartas de colores de la Real Sociedad Hortícola (RHSCC). Las antocianinas se extrajeron y las antocianidinas se analizaron por análisis espectrofotométrico, CCF y/o HPLC. El ARN total también se aisló de tejido de pétalo de las etapas apropiadas del
40 desarrollo de las flores y se usó análisis de transferencia Northern para detectar transcritos de transgenes F3'5'H. Los resultados de los análisis transgénicos se resumen en las Tablas 11, 12 y 13.
Clavel
45 Los genes F3'5'H descritos en el Ejemplo 7 se evaluaron para su capacidad para conducir a la producción de pigmentos basados en delfinidina en pétalos de clavel. Se usaron dos cultivares de clavel, Kortina Chanel (KC) y Monte Lisa (ML) en los experimentos de transformación. El cultivar de clavel Kortina Chanel produce flores de color rosa que normalmente acumulan antocianinas basadas en cianidina. Por tanto, este cultivar contiene una actividad de F3'H y DFR de clavel que necesitaría una F3'5'H introducida para competir por el sustrato. El cultivar de clavel
50 Monte Lisa produce flores de color rojo ladrillo que normalmente acumulan antocianinas basadas en pelargonidina. Se cree que este cultivar carece de actividad de F3'H completamente funcional y contiene una DFR que es capaz de actuar sobre DHK y por lo tanto una F3'5'H introducida solamente se necesitaría para competir con la DFR endógena por el sustrato.
55 TABLA 11: Resultados de análisis transgénicos de pétalos de claveles transformados con ADN-T que contiene casetes de expresión del gen F3'5'H (AmCHS 5': F3'5'H: petD8 3')
F3'5'H
pCGP cv. nº tg CCF+ HPLC+ Mayor % de del % prom de del Northern+
Salvia#2
2121 KC 22 2/16 3/4 12,5% 7% nd
ML
21 17/18 9/9 76% 57% 14/15
Salvia#47
2122 KC 23 6/12 8/8 29% 12% nd
ML
25 21/22 17/17 88% 56% 12/14
Sollya
2130 KC 30 22/27 17/17 35% 11% nd
ML
23 14/15 14/14 76% 49% 13/14
Campanilla
2135 KC 22 0/16 0/1 nd nd nd
ML
24 19/20 13/13 23% 10% 14/14
Genciana
1498 KC 22 0/14 nd nd nd 7/8
ML
2 2/2 1/1 nd nd 1/2
BP#18 de pensamiento
1972 KC 26 18/20 12/12 14% 9% 19/19
ML
21 15/16 8/8 80% 66% 14/16
BP#40 de pensamiento
1973 KC 26 11/15 7/8 18% 8% 13/17
ML
33 19/22 20/20 72% 52% 12/15
petHf1 de petunia
1452 KC 104 41/64 nd 3,5% 1,3% 15/17
ML
48 39/41 26/26 75% 30% 12/13
petHf2 de petunia
1524 ML 27 18/19 17/17 81% 41% 12/14
F3'5'H = secuencia de F3'5'H contenida en el ADN-T pCGP = número de plásmido pCGP del vector binario usado en el experimento de transformación
cv. = cultivar KC = cultivar de clavel Kortina Chanel (línea de cianidina)
5 ML = cultivar de clavel Monte Lisa (línea de pelargonidina) nº tg = número total de transgénicos producidos CCF+ = número de eventos individuales en los que se detectaron moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en pétalos (como se determina por CCF) con respecto al número total de eventos individuales analizados HPLC+ = número de eventos individuales en los que se detectaron moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en pétalos (como se
10 determina por HPLC) con respecto al número de eventos individuales analizados Mayor % de del = mayor % de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina detectadas en los pétalos para la población de eventos transgénicos % prom = % promedio de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina detectadas en los pétalos para la población de eventos transgénicos
15 Northern = número de eventos individuales en los que se detectaron los transcritos de F3'5H intactos específicos por análisis de transferencia Northern en el ARN total aislado de pétalos con respecto al número total de eventos analizados nd = no hecho
Los resultados sugieren que todas las secuencias de F3'5'H evaluadas (petHf1 de petunia, petHf2 de petunia, Sal#2
20 de salvia, Sal#47 de salvia, Sol#5 de Sollya, BpeaHF2 de campanilla, BP#18 de pensamiento, BF#40 de pensamiento y Gen#48 de genciana) fueron estables en clavel y produjeron la producción de novedosos pigmentos basados en delfinidina en flores de clavel. Los transcritos intactos de cada F3'5'H se detectaron por análisis de transferencia Northern en ARN total aislado de pétalos de los claveles transgénicos.
25 Petunia
Los genes F3'5'H descritos en el Ejemplo 7 se evaluaron para su capacidad para conducir a la producción de pigmentos basados en delfinidina en pétalos de petunia. El híbrido Skr4 x SW63 de P. hybrida F1 que es homocigoto recesivo para Hf1 y Hf2 se usó en los experimentos de transformación. Aunque Skr4 x SW63 es homocigoto 30 recesivo para Hf1 y Hf2, estas mutaciones no bloquean completamente la producción de F3'5'H endógena (véase la patente de EE.UU. nº 5.349.125) y se producen bajos niveles de malvidina para dar al borde del pétalo un color lila pálido. La malvidina es el derivado metilado de las moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina de pigmento 3'5'-hidroxilado (Figuras 1A y 1B). Se usó análisis espectrofotométrico como medida de antocianinas totales que se acumulan en pétalos de las flores de petunia transgénica. El elevado nivel de antocianinas y/o el cambio de color
35 detectado se usaron como guía para la eficacia del gen F3'5'H en evaluación.
TABLA 12: Resultados de análisis transgénicos de pétalos de plantas de P. hybrida cv. Skr4 x SW63 transformadas con ADN-T que contiene los casetes de expresión del gen F3'5'H (AmCHS 5': F3'5'H: petD8 3')
F3'5'H
pCGP nº tg CCF+ Col t A/c Mejor Prom. Northern+ Mejor color
control
na na na na na 144-250 0 75C
#48 de genciana
1498 22 3/5 18/20 nd 6/6 72B/78A
Campanilla
2135 24 18/20 22/24 23/24 4427 2397 nd 74A/78A
Kennedia
2256 24 22/24 22/24 22/24 4212 2592 nd 74A/78A
#2 de salvia
2121 24 21/24 21/24 21/24 2471 1730 nd 78A
#47 de salvia
2122 19 17/19 16/19 16/19 2634 1755 nd 78A/80A
#5 de Sollya
2130 22 14/16 13/16 13/16 3446 1565 nd 78A
BP#18 de pensamiento
1972 22 nd 20/22 nd nd nd 9/9 74A/B
BP#40 de pensamiento
1973 19 8/8 18/19 18/20 2583 1556 nd 74/78A
petHf1 de petunia
484 16 nd 9/16 8/15 2683 1250 nd 74A/B
petHf2 de petunia
1524 20 nd 18/20 8/8 4578 2357 8/8 74A/B
F3'5'H = secuencia de F3'5'H contenida en el ADN-T pCGP = número de plásmido pCGP del vector binario usado en el experimento de transformación nº tg = número total de transgénicos producidos CCF+ = número de eventos individuales en los que se detectó malvidina en las flores (a un nivel por encima de la referencia de Skr4 x Sw63)
5 (como se determina por CCF) con respecto al número total de eventos individuales analizados Col = número de eventos individuales que produjeron flores con un color de flor alterado en comparación con el control con respecto al número total examinado t A/c = número de eventos individuales que tuvieron un elevado nivel de antocianinas en pétalos como se mide por análisis espectrofotométrico de extractos crudos con respecto al número de eventos individuales analizados (en μ moles/g)
10 Mejor = mayor cantidad de antocianina como se mide por análisis espectrofotométrico de extractos crudos de una flor de un evento individual (en μ moles/g) Prom. = la cantidad promedio de antocianina detectada como se mide por análisis espectrofotométrico de extractos crudos de una flor en la población de flores transgénicas analizadas (en μ moles/g) Northern = número de eventos individuales en los que se detectaron los transcritos de F3'5'H intactos específicos por análisis de transferencia
15 Northern en ARN total aislado de pétalos con respecto al número total de eventos analizados Mejor color = cambio de color más espectacular registrado para la población transgénica nd = no hecho na = no aplicable
20 La introducción de los casetes de expresión del gen F3'5'H en Skr4 x SW63 condujo a un cambio espectacular del color de la flor de lila pálido a púrpura con un espectacular aumento en la producción de malvidina en los pétalos.
El resultado sugiere que todas las secuencias de F3'5'H probadas (petHf1 de petunia, petHf2 de petunia, Sal#2 de salvia; Sal#47 de salvia, Sol#5 de Sollya, BpeaHF2 de campanilla, BP#18 de pensamiento, BP#40 de pensamiento,
25 Gen#48 de genciana, Kenn#31 de Kennedia) fueron estables en pétalos de petunia y produjeron la complementación de la mutación Hf1 o Hf2 en la línea de petunia Skr4 x SW63 conduciendo a niveles espectacularmente elevado de acumulación de malvidina con un cambio de color simultáneo.
Rosa
30 Los genes F3'5'H descritos en el Ejemplo 7 se evaluaron para su capacidad para conducir a la producción de pigmentos basados en delfinidina en pétalos de rosa. Se usó una selección de tres cultivares de rosa, Kardinal (Kard), Soft Promise (SP) o Lavanda (Lav) en los experimentos de transformación. El cultivar de rosa Kardinal produce flores de color rojo que normalmente acumulan antocianinas basadas en cianidina. Por tanto, este cultivar
35 contiene actividades de F3'H y DFR de rosa que necesitaría la F3'5'H introducida para competir por el sustrato. El cultivar de rosa Lavanda produce flores de color rosa claro que normalmente acumulan antocianinas basadas en cianidina. Por tanto, este cultivar actividades de F3'H y DFR de rosa funcionales que necesitaría la F3'5'H introducida para competir por el sustrato. El cultivar de rosa Soft Promise produce flores de color albaricoque que normalmente acumulan pelargonidina. Se cree que este cultivar carece de una actividad de F3'H de rosa
40 completamente funcional y contiene una DFR que es capaz de actuar sobre DHK y así la F3'5'H introducida solamente se requeriría para competir con la DFR endógena de rosa por el sustrato.
TABLA 13: Resultados de análisis transgénicos de pétalos de rosas transformadas con ADN-T que contienen casetes de expresión del gen F3'5'H (CaMV 35S: F3'5'H: ocs 3')
F3'5'H
plásmido Cult nº tg CCF + HPLC+ Mayor % de del % prom de del Northern+
2 de salvia
pCGP2120 Kard 30 18/20 21/21 12% 5% 18/18
47 de salvia
pCGP2119 Kard 22 11/16 9/9 7,1% 2% 12/15
Sollya
pCGP2131 Kard 27 0/23 2/2 1% 0,5% 6/6
Campanilla
pCGP2134 Kard 29 0/15 nd na na 0/9
pBEBF5
Lav 25 nd 0/25 0% 0% nd
Genciana
pCGP1482 Kard 27 0/23 nd na na 0/23
pBEGHF48
Lav 23 nd 0/23 0% 0% 0/23
BP18 de pensamiento
pCGP1967 Kard 56 30/33 33/34 58% 12% 21/21
SP
36 21/24 18/18 65% 35% 16/21
BP40 de pensamiento
pCGP1969 Kard 22 15/15 15/15 24% 9% 16/16
SP
37 17/17 16/17 80% 54% 11/13
petHf1 de petunia
pCGP1638 Kard 22 0/21 nd na na 0/16
pCGP1392
Lav 34 nd 0/34 0% 0% nd
petHf2 de petunia
pCGP2123 Kard 41 0/26 nd na na 0/10
Lavender
pBELF8 Lav 28 nd 4/28 4% 3,5% nd
F3'5'H = secuencia de F3'5'H contenida en el ADN-T plásmido = el número de plásmido del vector binario usado en el experimento de transformación Cult = cultivar de Rosa hybrida Kard = Kardinal
5 SP = Soft Promise Lav = Lavanda nº tg = nº de eventos transgénicos independientes producido CCF+ = número de eventos individuales que acumularon moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina detectables (como se determina por CCF) en los pétalos con respecto al número total de eventos individuales analizados
10 HPLC+ = número de eventos individuales que acumularon moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina detectables (como se determina por HPLC) en los pétalos con respecto al número de eventos individuales analizados Northern = número de eventos individuales en los que se detectaron los transcritos de F3'5H intactos específicos por análisis de transferencia Northern en el ARN total aislado de pétalos con respecto al número total de eventos analizados nd = no hecho
15 Los resultados sugieren sorprendentemente que no todas las secuencias de F3'5'H evaluadas (petHf1 de petunia, petHf2 de petunia, Sal#2 de salvia, Sal#47 de salvia, Sol#5 de Sollya, BpeaHF2 de campanilla, BP#18 de pensamiento, BP#40 de pensamiento, Gen#48 de genciana, Kenn#31 de Kennedia y Lavender LBG) fueron funcionales en la rosa. En efecto, los transcritos de las secuencias de F3'5'H introducidas aisladas de Clitoria
20 ternatea (campanilla), Gentiana triflora (genciana) y Petunia hybrida (petunia) fracasaron en acumularse en pétalos de rosa. Solamente los transcritos de F3'5'H de longitud completa de pensamiento, salvia, Kennedia, Sollya y lavanda se acumularon en pétalos de rosa. Sin embargo, aunque los transcritos de F3'5'H de Kennedia se acumularon en pétalos de rosa, no hubo ni acumulación de la enzima ni la enzima producida fue tanto no funcional como fue incapaz de competir con las enzimas F3'H y DFR de rosa endógenas para permitir la producción de
25 pigmentos de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina. De las secuencias de F3'5'H evaluadas, solamente las secuencias de F3'5'H derivadas de clones de ADNc de Salvia spp. (Sal#2 y Sal#47), Viola spp. (BP#18 y BP#40), Sollya spp. (Soll#5) y Lavandula nil (LBG) produjeron la producción de pigmentos basados en moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en pétalos de rosa. Basándose en los porcentajes relativos de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina producidas en pétalos de rosa, las secuencias de F3'5'H de pensamiento (BP#18
30 y BP#40) se revelaron como las más eficaces de aquellas evaluadas en la producción de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en pétalos de rosa.
Introducción de la secuencia de F3'5'H de Viola spp. en Rosa hybrida cv. Medeo y Pamela
35 Como se ha descrito en la introducción, la copigmentación con otros flavonoides, posterior modificación de la molécula de antocianidina y el pH de la vacuola, impactan sobre el color producido por las antocianinas. Por tanto, la selección de los cultivares de rosa con niveles relativamente altos de flavonoles y pH vacuolar relativamente alto produciría colores de flor más azules tras la producción de pigmentos de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina.
40 El cultivar de rosa Medeo generalmente produce flores de color crema a albaricoque pálido (RHSCC 158C a 159A). El análisis por HPLC de las antocianidinas y los flavonoles que se acumulan en los pétalos de la rosa Medeo reveló que los pétalos acumulan altos niveles de flavonoles (2,32 mg/g de canferol, 0,03 mg/g de quercetina) y niveles muy bajos de antocianinas (0,004 mg/g de cianidina, 0,004 mg/g pelargonidina). El pH vacuolar estimado de pétalos de
45 Medeo es aproximadamente 4,6.
El cultivar de rosa Pamela produce flores de color blanco a rosa muy pálido. Acumula similarmente bajos niveles de antocianina y niveles relativamente altos de flavonoles.
50 El ADN-T contenido en la construcción pCGP1969 (Figura 30) que incorpora el clon de F3'5'H de pensamiento, BP#40, también se introdujo en los cultivares de rosa Medeo y Pamela produciendo la producción de más del 90% de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en estas rosas y conduciendo a un cambio espectacular del color y a flores de colores novedosos. El cambio de color más espectacular en las flores transgénicas de Medeo fue a un color púrpura/violeta de RHSCC 70b, 70c, 80c, 186b. El cambio de color más espectacular en las flores
5 transgénicas de Pamela fue a un color púrpura/violeta de RHSCC 71c, 60c, 71a, 80b.
En conclusión, se revelaron dos hallazgos inesperados cuando las secuencias de genes que habían demostrado conducir a funcionalidad en petunia y clavel se introdujeron en rosas.
10 Primero, las secuencias de F3'5'H de petunia petHf1 (y petHf2) que habían producido la producción de colores novedosos en clavel y que también habían demostrado que conducían a la síntesis de una enzima funcional en petunia no condujeron a la acumulación de transcrito de longitud completa (o intacto) (como es detectable por análisis de transferencia Northern) en pétalos de rosa. En efecto, no hubo ni acumulación de transcrito de longitud completa o intacto ni los transcritos que se detectaron se degradaron y se vieron como manchas de bajo MW (o de
15 migración rápida) en transferencias de ARN indicando la presencia de ARN de hibridación heterólogo de bajo MW. Por tanto, con el fin de encontrar una secuencia de F3'5'H que se acumulara en rosa y condujera a una enzima funcional, se aislaron varias secuencias de F3'5'H. De nuevo no fue obvio qué secuencia conduciría a una enzima activa en pétalos de rosa. Todas las secuencias de F3'5'H aisladas se probaron para funcionalidad en clavel y/o petunia y todas condujeron a la acumulación de transcritos intactos y a la producción de una actividad de F3'5'H
20 funcional. Sin embargo, solamente las secuencias de F3'5'H de pensamiento (BP#18 y BP#40), salvia (Sal#2 y Sal#47), Sollya (Soll#5), Kennedia (Kenn#31) y lavanda (LBG) produjeron la acumulación de transcritos de longitud completa intactos y solamente las de pensamiento (BP#18 y BP#40), salvia (Sal#2 y Sal#47), Sollya (Soll#5) y lavanda (LBG) produjeron la producción de una enzima funcional en rosa como se mide por la síntesis de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina.
25 En segundo lugar, no fue obvio qué promotores serían eficaces en rosa. Los casetes de promotor que se habían probado y habían demostrado que eran funcionales en flores de clavel y petunia no condujeron a la acumulación de transcritos detectables en pétalos de rosa. De los promotores probados en rosa, solamente los promotores CaMV 35S, RoseCHS 5', ChrysCHS 5', mas 5' y nos 5' condujeron a una acumulación de transcritos GUS o nptII o SuRB
30 intactos y detectables en pétalos de rosa.
La Tabla 14 muestra un resumen de los resultados obtenidos cuando se evalúan secuencias de F3'5'H de diversas especies en petunia, clavel y rosa.
35 TABLA 14: Resumen de la eficacia de las secuencias de F3'5'H en petunia, clavel y rosa
F3'5'H
Petunia Clave Rosa
Mal
ARN Del ARN Del ARN
Kennedia (Kenn#31)
+ nd nd nd - +
Genciana (Gen#48)
+ + + + - -
Salvia (Sal#2)
+ nd + + + +
Salvia (Sal#47)
+ nd + + + +
Sollya (Sol#5)
+ nd + + + +
Campanilla (BpeaHF2)
+ nd + + - -
Pensamiento (BP#18)
+ + + + + +
Pensamiento (BP#40)
+ nd + + + +
Petunia (petHf1)
+ + + + - -
Petunia (petHf2)
+ + + + - -
Lavanda (LBG)
nd nd nd nd nd +
nd = no hecho Mal = malvidina detectada en pétalos como se analiza por CCF Del = moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina detectadas en pétalos como se analiza por CCF o HPLC
+ = sí 40 - = no
Ejemplo 9
Uso de secuencias de F3'5'H de pensamiento en especies diferentes de rosa 45
Gerbera
De los ejemplos anteriores fue evidente que las secuencias de F3'5'H de pensamiento, BP#18 y BP#40, produjeron la actividad de F3'5'H funcional y condujeron a la producción de altos niveles de moléculas de delfinidina o basadas 5 en delfinidina en rosas y claveles.
El ADN-T de la construcción binaria pCGP1969 (descrita en el Ejemplo 8) (Figura 30) que contenía el casete de expresión del gen quimérico CaMV 35S: pansy BP#40 F3'5'H: ocs 3' se introdujo en el cultivar de gerbera Boogie mediante transformación mediada por Agrobacterium, para probar la funcionalidad de la secuencia de F3'5'H de
10 pensamiento en gerbera.
De los seis eventos producidos hasta la fecha, uno (#23407) ha producido flores con un cambio espectacular de color (RHSCC 70c) en comparación con el color de la flor de control (RHSCC 38a, 38c).
15 El cambio de color de los pétalos de la gerbera transgénica se ha correlacionado con la presencia de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina como se detecta por CCF.
Otras especies
20 Con el fin de producir pigmentos de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en plantas que normalmente no producen pigmentos basados en delfinidina y no contienen flavonoide 3',5'-hidroxilasa, construcciones que contienen un gen F3'5'H (tales como, pero no se limitan a un gen quimérico F3'5'H de Viola spp. y/o Salvia spp. y/o Sollya spp. y/o Lavandula spp. y/o Kennedia spp.) se introducen en una especie que normalmente no produce pigmentos basados en delfinidina. Tales plantas pueden incluir, pero no se limitan a clavel, crisantemo, gerbera,
25 orquídeas, Euphorbia, Begonia y manzana.
Ejemplo 10
Características de las secuencias de F3'5'H evaluadas en petunia, clavel y rosa
30 La regulación génica en los eucariotas se facilita, en términos simples, por varios factores que interaccionan con una gama de secuencias proximales y distales a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido dado. Los casetes de expresión manipulados para la introducción en plantas para la generación de uno o más rasgos se basan en el entendimiento de la regulación génica en eucariotas en general y, en casos seleccionados, en plantas en
35 particular. Los elementos esenciales incluyen una serie de secuencias de regulación de la transcripción normalmente, pero no exclusivamente, localizadas aguas arriba o en 5' con respecto al punto de iniciación de la transcripción. Tales elementos se describen normalmente como potenciadores y promotores, siendo estos últimos proximales al punto de la iniciación de la transcripción. Inmediatamente aguas abajo de o en 3' con respecto a la iniciación del punto de transcripción está una región variable de ADN transcrito que indica la región no traducida 5'
40 (5'utr) que desempeña una función en la estabilidad del transcrito y la eficiencia de traducción. Tales secuencias, cuando se manipulan en casetes de expresión, son frecuentemente quiméricas y pueden derivarse de secuencias que se producen naturalmente adyacentes a la secuencia codificante y/o adyacentes a una secuencia de promotor dada. La secuencia codificante (algunas veces alterada por intrones) se encuentra en 3' con respecto a la 5'utr seguida por una 3'utr importante para la estabilidad del transcrito (ARNm) y la eficiencia de traducción. Las
45 secuencias 3' con respecto al extremo de la región codificante y 3' con respecto a la misma 3'utr indican secuencias de terminador. Todos estos elementos constituyen un casete de expresión. Al hacer comparaciones directas entre los promotores u otros elementos es importante mantener la uniformidad en los elementos restantes de un casete de expresión. De ahí que cuando se comparó la eficacia de diversas secuencias de F3'5'H fuera posible confinar las secuencias que conducen a inestabilidad y posterior autodegradación de ARNm manipulado y la ausencia resultante
50 de productos tri-hidroxilados (derivados de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina) con respecto la región que codifica F3'5'H y no otros elementos en el casete de expresión tales como, por ejemplo, las secuencias 5'utr y/o 3'utr.
En un intento por identificar motivos o similitudes entre las secuencias de F3'5'H que produjeron transcritos de
55 longitud completa que se detectan en ARN total aislado de flores de rosa, y finalmente la producción de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina, se realizaron comparaciones a través de una gama de parámetros. Éstos incluyeron identidades de secuencias a niveles de ácido nucleico y aminoácidos, alineamientos de secuencia, clasificaciones taxonómicas, % de nucleótidos A o T presentes en la secuencia,% de codones con una A o una T en la tercera position, etc.
Clasificación taxonómica
Se examino la taxonomía de cada especie de las que se aislaron las secuencias de F3'5'H (Tabla 15). Parece que no hubo una relación obvia entre la clasificación de subclases y si las secuencias de F3'5'H produjeron o no un
65 transcrito intacto y la posterior producción de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en rosas.

Tabla 15: Clasificaciones taxonómicas de las especies de las que se aislaron las secuencias de F3'5'H y si el uso de las secuencias produjo o no un transcrito intacto en pétalos de rosa que fuera detectable por análisis de transferencia de ARN
Flor
Especie Familia Orden Subclase Transcrito intacto Delfinidina en pétalos de rosa
genciana
Gentiana triflora Gentianaceae Gentianales Asteridae NO NO
lavanda
Lavandula nil Lamiaceae Lamiales Asteridae SÍ SÍ
salvia
Salvia spp. Lamiaceae Lamiales Asteridae SÍ SÍ
Sollya
Sollya spp. Pittosporaceae Apiales Asteridae SÍ SÍ
petunia
Petunia hybrida Solanaceae Solanales Asteridae NO NO
Kennedia
Kennedia spp. Fabaceae Fabales Rosidae SÍ NO
campanilla
Clitoria ternatea Fabaceae Fabales Rosidae NO NO
pensamiento
Viola spp. Violaceae Malpighiales Rosidae SÍ SÍ
rosa
Rosa hybrida Rosaciae Rosales Rosidae na na
Transcrito intacto = ARNm de F3'5'H de longitud completa detectado por análisis de transferencia Northern en ARN total aislado de pétalos de 5 rosas transgénicas
Comparación de secuencias de nucleótidos de F3'5'H
Las identidades de secuencias de nucleótidos entre cada una de las secuencias de F3'5'H evaluadas se
10 determinaron usando el programa ClustalW (Thompson y col., 1994, arriba) dentro del programa de aplicación MacVector™ versión 6.5.3 (Oxford Molecular Ltd., Inglaterra) (Tabla 16). No hubo diferencias obvias entre las secuencias de F3'5'H que produjeron la detección de transcritos de longitud completa intactos de ARN aislado de pétalos de rosa y aquellos que no la produjeron.
15 Tabla 16: Porcentaje de identidad de secuencias de ácidos nucleicos entre las secuencias de nucleótidos de F3'5'H aisladas de diversas especies. Las secuencias de F3'5'H que produjeron transcritos intactos que se detectaron en ARN aislado de pétalos de rosa están subrayadas y en cursiva
BP18
BP40 Lav Sal47 Sal2 soll Kenn Bpea Gent PetHf1 PetHf2
BP18
100 82 60 61 62 51 60 62 62 59 62
BP40
100 60 57 58 50 59 62 58 60 62
Lav
100 68 68 48 57 57 58 59 60
Sa147
100 95 48 56 57 59 57 58
Sal2
100 49 57 58 60 57 59
Soll
100 48 50 50 48 51
Kenn
100 70 56 64 60
Bpea
100 59 59 62
Gent
100 61 64
PetHf1
100 84
PetHf2
100
Comparación de secuencias de nucleótidos traducidas de F3'5'H
20 También se determinaron las identidades y similitudes de secuencias de nucleótidos traducidas entre cada una de las secuencias de F3'5'H evaluadas usando el programa ClustalW (Thompson y col., 1994, arriba) dentro del programa de aplicación MacVector™ versión 6.5.3 (Oxford Molecular Ltd., Inglaterra) (Tabla 17). No hubo diferencias obvias entre las secuencias de F3'5'H que produjeron la detección de transcritos de longitud completa
25 intactos en ARN aislado de pétalos de rosa y aquellos que no la produjeron.

Tabla 17: Porcentaje de identidad y similitud de secuencias de aminoácidos (entre paréntesis) entre secuencias de F3'5'H aisladas de diversas especies. Las secuencias de F3'5'H que produjeron transcritos intactos que se detectaron en ARN aislado de pétalos de rosa están subrayadas y en cursiva
BP18
BP40 Lav Sal47 Sal2 Soll Kenn Bpea Gent PetHf1 PetHf2
BP18
100 91 (94) 65 (77) 65 (76) 65 (76) 44 (63) 69 (83) 64 (75) 69 (80) 74 (85) 74 (85)
BP40
100 67 (89) 66 (77) 66 (77) 46 (64) 69 (82) 64 (75) 68 (79) 74 (85) 75 (86)
Lav
100 75 (86) 75 (86) 45 (63) 63 (79) 59 (74) 66 (80) 68 (82) 69 (83)
Sal47
100 98 45 (65) 64 (78) 60 (72) 64 (76) 68 (79) 69 (81)
Sal2
100 45 (65) 64 (78) 60 (72) 63 (75) 68 (79) 69 (81)
Soll
100 46 (66) 41 (61) 44 (62) 46 (67) 46 (66)
Kenn
100 72 (80) 65 (75) 71 (83) 72 (83)
Bpea
100 69 (81) 65 (75) 65 (74)
Gent
100 73 (82) 73 (82)
PetHf1
100 93 (95)
PetHf2
100
Porcentaje de nucleótidos A o T en las secuencias de ADN de F3'5'H.
Hay algunas pruebas que sugieren que la selección de los codones influye en la tasa de traducción y degradación de ARNm. Ciertos codones se usan menos frecuentemente que otros y esto puede estar relacionado con la 10 abundancia de ARNt isoaceptor. Los ARN de transferencia correspondientes a codones raros son menos abundantes en E. coli y levadura que los ARNt correspondientes a codones preferidos (van Hoof y Greeen, Plant Molecular Biology, 35: 383-387, 1997). Ejemplos de uso alterado de codones y de producción de un gen más “similar a plantas” son el gen de la toxina B.t. bacteriana (revisado en Diehn y col., Genet Engin, 18: 83-99, 1996) y el gen gfp de medusa (Haseloff y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 94: 2122-2127, 1997). Sin embargo, como se comenta en 15 van Hoff y Green, (1997) (arriba), el efecto de eliminar los codones raros en los genes B.t. aumentó el contenido de GC, eliminando así secuencias ricas en AU que pueden ser responsables del reconocimiento inapropiado de intrones y sitios de poliadenilación, además de eliminar determinantes de la inestabilidad. La alteración del uso de codones en el gen gfp de medusa también produjo la eliminación de un intrón críptico (Haseloff y col., 1996, arriba). Los estudios que examinan el efecto del uso de codones y los elementos de inestabilidad generalmente se han 20 limitado a diferencias entre los genes aislados de especies en diferentes reinos, es decir, bacteriano frente a levadura frente a animal frente a vegetal. Dentro del reino vegetal se han observado diferencias entre las dicotiledóneas y las monocotiledóneas. Estudios sobre plantas transgénicas han sugerido que los fragmentos de promotor usados para conducir la expresión génica en plantas dicotiledóneas no son tan eficaces cuando se usan en plantas monocotiledóneas (véase Galun y Breiman, Transgenic Plants, Imperial College Press, Londres, Inglaterra, 25 1997). Las diferencias en la metilación y en la expresión final de un transgén de DFR en Petunia hybrida (dicotiledónea) se detectaron cuando un ADNc de DFR de maíz (monocotiledónea) se comparó con un ADNc de DFR de gerbera (dicotiledónea) (Elomaa y col., Molecular and General Genetics, 248: 649-656, 1995). La conclusión fue que el ADNc de DFR de gerbera tenía un mayor contenido de AT (menor contenido de GC) y era más “compatible” con la organización genómica de la petunia evitando que fuese reconocido como un gen exógeno y por
30 tanto silenciado por metilación (la rosa junto con el clavel y la petunia son dicotiledóneas y los genes F3'5'H probados se aislaron todos de plantas dicotiledóneas). Estos puntos sirven para ilustrar que los mecanismos de degradación y estabilidad no son entendidos en detalle y que aparecen diferencias entre plantas y otros reinos y dentro del reino vegetal.
35 Se examinó el contenido de A y T en los ADNc de F3'5'H evaluados junto con los de los genes de la ruta de los flavonoides (F3'H, DFR, CHS, FLS) que se habían aislado de rosa (Tabla 18). También se examinó la tercera posición de cada codón (dentro del marco de lectura abierto) y se calculó el porcentaje de codones con una A o una T en la tercera posición (Tabla 18).
40 Tabla 18: Resumen de la cantidad en porcentaje de los dinucleótidos A o T en las secuencias de F3'5'H aisladas y si la F3'5'H produjo o no transcritos de longitud completa que se detectaron en pétalos de rosa por análisis de transferencia Northern
SEQ de F3'5'H
% de AT % de A o T en 3ª ARN Delfinidina
BP#18 de Viola
50 40 SÍ SÍ
BP#40 de Viola
51 35 SÍ SÍ
#2 de salvia
48 33 SÍ SÍ
#47 de salvia
48 34 SÍ SÍ
#5 de Sollya
54 54 SÍ SÍ
LBG de lavanda
50 37 SÍ* SÍ
#31 de Kennedia
54 47 SÍ NO
petHf1 de petunia
61 66 NO NO
petHf2 de petunia
59 65 NO NO
#48 de genciana
57 57 NO NO
#HF2 de campanilla
57 53 NO NO
F3'H de rosa
47 34 ** na
CHS de rosa
52 42 ** na
DFR de rosa
53 46 ** na
FLS de rosa
56 43 ** na
% de AT = % de nucleótidos que son A o T en la secuencia de ácidos nucleicos % de A o T en 3ª = porcentaje de codones que tienen una A o una T en la tercera posición ARN = si un transcrito de ARNm de longitud completa se detectó o no por análisis de transferencia Northern en ARN total aislado de pétalos de rosa
5 Del = si las moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina se detectaron o no por CCF o HPLC en pétalos de rosa SÍ* = aunque no se realizó el análisis de transferencia Northern de las rosas transgénicas transformadas con los casetes de expresión de F3'5'H de lavanda, puede suponerse que el transcrito de longitud completa se produce ya que se detectaron moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en los pétalos de rosa. F3'H de rosa (descrito en la solicitud de patente interna nº PCT/AU97/00124)
10 DFR de rosa (Tanaka y col., 1995, arriba) FLS de rosa (número de acceso de GenBank AB038247) CHS de rosa (número de acceso de GenBank AB038246)
El contenido de AT de las cuatro secuencias de rosa (arriba) que codifican enzimas de la ruta de los flavonoides tuvo
15 un contenido de AT de entre el 47 y el 56%. En general, el contenido de AT de las secuencias de F3'5'H que produjeron transcritos intactos en pétalos de rosa estuvo entre el 48 y el 54%. Sin embargo, las secuencias de F3'5'H que no produjeron transcritos intactos que se acumulaban en pétalos de rosa tuvieron generalmente un mayor contenido de AT de entre el 57 y el 6%. De ahí que el contenido de AT de los genes F3'5'H introducidos en rosa pueda ser un factor en si un transcrito intacto se acumula o no en pétalos de rosa y así conduce a la producción
20 de F3'5'H y moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina.
La base de nucleótido en la tercera posición de cada codón de las cuatro secuencias de rosa que codifican enzimas de la ruta de los flavonoides fue generalmente una A o una T en del 34 al 46% de los codones. En general, las secuencias de F3'5'H que produjeron transcritos intactos en pétalos de rosa contuvieron una A o una T en la tercera
25 posición de cada codón en del 33 al 54% de los codones. Sin embargo, las secuencias de F3'5'H que no produjeron transcritos intactos que se acumularan en pétalos de rosa generalmente contuvieron una A o una T en la tercera posición de cada codón en del 53 al 66% de los codones. Así, el porcentaje de codones con una A o una T en la tercera posición de los genes F3'5'H introducidos en la rosa puede ser también un factor en si un transcrito intacto se acumula o no en pétalos de rosa y así conduce a la producción de F3'5'H y moléculas de delfinidina o basadas en
30 delfinidina.
Puede ser que alterando el contenido global de los nucleótidos A y/o T en cualquier secuencia de ADN de F3'5'H que no produzca transcrito intacto en rosa tal como, pero no limita a, petHf1 de Petunia hybrida, petHf2 de Petunia hybrida, BpeaHF2 de Clitoria ternatea (campanilla) o Gen#48 de Gentiana triflora (genciana), hasta un nivel más
35 consistente con el encontrado en genes de rosa, transcritos intactos se acumulen y produzcan la traducción eficaz de transcritos de F3'5'H y así la acumulación de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en pétalos de rosa. Una manera de alterar el contenido de AT de la secuencia de ADN sin alterar la secuencia de aminoácidos es elegir como diana la generación de la tercera posición de cada codón.
40 Aquellos expertos en la materia apreciarán que la invención descrita en el presente documento es susceptible a variaciones y modificaciones distintas de aquellas específicamente descritas. Debe entenderse que la invención incluye todas aquellas variaciones y modificaciones que se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones.
Bibliografía
A look beyond transcription, ASPP, USA, Bailey-Serres and Gallie, eds, 1998 Altschul y col., J. Mol. Biol. 215(3): 403-410, 1990. Altschul y col., Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402. 1997. Ausubel y col., “Current Protocols in Molecular Biology” John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Capítulo 15. Aviv y Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408, 1972. Bevan, Nucleic Acids Res 12: 8711-8721, 1984. Bonner y Laskey, Eur. J. Biochem. 46: 83, 1974. Bodeau, Molecular and genetic regulation of Bronze-2 and other maize anthocyanin genes. Disertación, Universidad
de Stanford, EE.UU., 1994 Brendel y col., en A look beyond transcription, ASPP, USA, Bailey-Serres and Gallie, eds, 1998. Brouillard y Dangles, en: The Flavonoids - Advances in Research since 1986. Harborne, J.B. (ed), Chapman and
Hall, Londres, RU, 1-22, 1993. Brugliera y col., Plant J. 5: 81-92, 1994. Brugliera, Characterization of floral specific genes isolated from Petunia hybrida. RMIT, Australia. Tesis doctoral,
1994. Bullock y col., Biotechniques 5: 376, 1987. Comai y col., Plant Mol. Biol. 15: 373-381, 1990. Depicker y col., J Mol. and Appl. Genetics 1: 561-573, 1982. Diehn y col., Genet Engin, 18: 83-99, 1996 Elomaa y col., Molecular and General Genetics, 248: 649-656, 1995 Franck y col., Cell 21: 285-294, 1980. Galun y Breiman, Transgenic Plants, Imperial College Press, Londres, Inglaterra, 1997 Guilley y col., Cell 30: 763-773. 1982. Hanahan, J. Mol. Biol. 166: 557, 1983. Harpster y col., MGG 212: 182-190, 1988. Haseloff y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 94: 2122-2127, 1997 Holton y Cornish, Plant Cell 7: 1071-1083, 1995. Holton y Graham, Nuc. Acids Res. 19: 1156, 1990. Holton y col., Nature 366: 276-279, 1993a. Holton y col., Plant J. 4: 1003-1010, 1993b Holton, Isolation and characterization of petal specific genes from Petunia hybrida. Tesis doctoral, Universidad de
Melbourne, Australia, 1992 Huang y Miller, Adv. Appl. Math. 12: 373-381, 1991.
Inoue y col., Gene 96: 23-28, 1990. Janssen y Gardner, Plant Molecular Biology, 14: 61-72, 1989 Jefferson, y col., EMBO J. 6: 3901-3907, 1987. Johnson y col., In A look beyond transcription, ASPP, USA, Bailey-Serres and Gallie, eds, 1998. Karn y col., Gene 32: 217-224, 1984. Lazo y col. Bio/Technology 9: 963-967, 1991. Lee y col., EMBO J. 7: 1241-1248, 1988. Lu y col., Bio/Technology 9: 864-868, 1991. Marchant y col., Molecular Breeding 4: 187-194, 1998. Marmur y Doty, J. Mol. Biol. 5: 109, 1962. McBride y Summerfelt, Plant Molecular Biology 14: 269-276, 1990. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1964. Mitsuhara y col., Plant Cell Physiol. 37: 49-59, 1996. Mol y col., Trends Plant Sci. 3: 212-217, 1998. Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8): 2444-2448, 1988. Plant Molecular Biology Labfax, Croy (ed), Bios scientific Publishers, Oxford, RU, 1993. Plant Molecular Biology Manual (2ª edición), Gelvin and Schilperoot (eds), Kluwer Academic Publisher, Los Países
Bajos, 1994. Robinson y Firoozabady, Scientia Horticulturae 55: 83-99, 1993. Rout y col., Scientia Horticulturae 81: 201-238, 1999. Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY,
EE.UU., 1989.
Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2001 Seitz y Hinderer, Anthocyanins. En: Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Constabel, F. and Vasil, I.K.
(eds.), Academic Press, New York, EE.UU., 5: 49-76, 1988. Short y col., Nucl. Acids Res. 16: 7583-7600, 1988. Sommer y Saedler, Mol Gen. Gent., 202: 429-434, 1986. Strack y Wray, In: The Flavonoids - Advances in Research since 1986. Harborne, J.B. (ed), Chapman and Hall,
Londres, RU, 1-22, 1993. Tanaka y col., Plant Cell Physiol. 36: 1023-1031, 1995. Tanaka y col., Plant Cell Physiol. 37: 711-716, 1996. Thompson y col., Nucleic Acids Research 22: 4673-4680, 1994. Turpen y Griffith, BioTechniques 4: 11-15, 1986. van Hoof y Green, Plant Molecular Biology, 35: 383-387, 1997
Winkel-Shirley, Plant Physiol. 126: 485-493, 2001a.
Winkel-Shirley, Plant Physiol. 127: 1399-1404, 2001b.
5 Yonekura-Sakakibara y col., Plant Cell Physiol. 41: 495-502, 2000.
Listado de secuencias
<110> International Flower Developments Pty. Ltd. 10 <120> Secuencias genéticas de flavonoide 3',5'-hidroxilasa y usos de las mismas
<130> 42.20.86861/01
<150> AU 2002951088
<151>
<150> AU 2002952835 15 <151>
<160> 32
<170> PatentIn versión 3.1
<210> 1
<211> 1812 20 <212> ADN
<213> petunia
<400> 1
<210> 2
<211> 506
<212> PRT
<213> petunia
<400> 2
<210> 3
<211> 1756
<212> ADN
<213> petunia
<400> 3 <210> 4
<211> 508
<212> PRT
<213> petunia
<400> 4
<210> 5
<211> 2934
<212> ADN
<213> rosa
<400> 5
<210> 6
<211> 24
<212> ADN 5 <213> petunia
<400> 6 gttctcgagg aaagataata caat 24
<210> 7
<211> 20 10 <212> ADN
<213> petunia
<400> 7 caagatcgta ggactgcatg 20
<210> 8 15 <211> 20
<212> ADN
<213> crisantemo
<400> 8
gttaaggaag ccatgggtgt 20 20 <210> 9
<211> 1648
<212> ADN
<213> viola
<400> 9
<210> 10
<211> 506
<212> PRT
<213> viola
<400> 10
<210> 11
<211> 1782 5 <212> ADN
<213> viola
<220>
<221> misc_feature
<222> (307)..(307) 10 <223> n = cualquier nucleótido
<400> 11
<210> 12
<211> 506
<212> PRT
<213> viola
<400> 12
<210> 13
<211> 1659
<212> ADN
<213> salvia
<400> 13 <210> 14
<211> 520
<212> PRT
<213> salvia
<400> 14
<210> 15
<211> 1617
<212> ADN
<213> salvia
<400> 15 <210> 16
<211> 518
<212> PRT
<213> salvia
<400> 16
<210> 17
<211> 1730
<212> ADN 5 <213> sollya
<220>
<221> misc_feature
<222> (1372)..(1372)
<223> n = cualquier nucleótido 10 <400> 17
<210> 18
<211> 521
<212> PRT
<213> sollya
<400> 18
<210> 19
<211> 37
<212> ADN 5 <213> petunia
<400> 19 aaaatcgata ccatggtctt tttttctttg tctatac 37
<210> 20
<211> 1748 10 <212> ADN
<213> clitoria
<400> 20
<210> 21
<211> 525
<212> PRT
<213> clitoria
<400> 21
<210> 22
<211> 1684
<212> ADN
<213> genciana
<400> 22
<210> 23 10 <211> 516
<212> PRT
<213> genciana
<400> 23
<210> 24
<211> 3731
<212> ADN
<213> petunia
<400> 24
<210> 25
<211> 31
<212> ADN 5 <213> clitoria
<400> 25 gggatccaac aatgttcctt ctaagagaaa t 31
<210> 26
<211> 1831 10 <212> ADN
<213> kennedia
<400> 26
<210> 27
<211> 513
<212> PRT
<213> kennedia
<400> 27
<210> 28
<211> 1374
<212> ADN
<213> crisantemo
<400> 28
<210> 29
<211> 398
<212> PRT
<213> crisantemo
<400> 29
<210> 30
<211> 2979
<212> ADN 5 <213> crisantemo
<220>
<221> misc_feature
<222> (2051)..(2051)
<223> n = cualquier nucleótido 10 <400> 30
<210> 31
<211> 1778
<212> ADN
<213> lavendula
<400> 31 <210> 32
<211> 520
<212> PRT
<213> lavendula
<400> 32

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una molécula de ácido nucleico aislada para su uso como promotor que es operable en tejido de pétalo de rosa que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:30 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencias con SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:30 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con al menos una de SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:30 o un complemento de las mismas bajo condiciones de alta rigurosidad.
  2. 2.
    La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que la molécula de ácido nucleico está seleccionada de SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:30.
  3. 3.
    La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 ó 2 operativamente ligada a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F3'5'H), en la que la secuencia de nucleótidos está seleccionada de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:31 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencias con SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:31 o una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con al menos una de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:31 o un complemento de las mismas bajo condiciones de alta rigurosidad, en la que la expresión de dicha molécula de ácido nucleico que codifica una F3'5'H en un tejido de pétalo produce niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina como se mide por una técnica cromatográfica.
  4. 4.
    Un método de producción de una planta transgénica que puede sintetizar una F3'5'H, comprendiendo dicho método transformar establemente una célula de una planta con una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 3, en condiciones que permitan la eventual expresión de dicha secuencia de nucleótidos, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cultivar dicha planta transgénica durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos.
  5. 5.
    Un método de producción de una planta transgénica con actividad de F3'5'H reducida, comprendiendo dicho método transformar establemente una célula de una planta con una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 3, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cultivar dicha planta transgénica durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos.
  6. 6.
    Una planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma que comprende una molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o que comprende un nivel alterado de expresión de una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3 con respecto al nivel de expresión en una planta no genéticamente modificada, preferentemente en la que la planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma presentan flores alteradas o inflorescencia.
  7. 7.
    La planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma de la reivindicación 6, en la que la parte de planta está seleccionada del grupo que comprende sépalo, bráctea, pecíolo, pedúnculo, ovario, anteras, flores, frutos, frutos secos, raíces, tallos, hojas y semillas.
  8. 8.
    La planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma de la reivindicación 6 ó 7, en la que la planta está seleccionada del grupo que comprende rosa, clavel, lisianthus, petunia, lirio, pensamiento, gerbera, crisantemo, geranio, Torenia, Begonia, Cyclamen, Nierembergia, Catharanthus, Pelargonium, orquídea, uva, manzana, Euphorbia y Fuchsia, preferentemente rosa.
  9. 9.
    El uso de una molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la fabricación de: (i) una planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma; o (ii) una construcción genética que puede expresar F3'5'H o regular por disminución una enzima F3'5'H indígena en una planta.
  10. 10.
    Una molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico aislada como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tiene una función de expresión de novo, expresión en exceso, supresión de sentido, inhibición antisentido, actividad de ribozima, minizima y ADNzima, inducción de RNAi o inducción de metilación.
  11. 11.
    Un extracto de las flores de una planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.
  12. 12.
    Un organismo procariota o eucariota no humano que lleva una molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 extracromosómicamente en forma de plásmido.
  13. 13.
    Uso de una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 3 en la identificación o amplificación y
    clonación de material genético que codifica una F3'5'H.
  14. 14.
    Uso de una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 ó 2 ó 3 en la identificación o amplificación y clonación de material genético que define un promotor de chalcona sintasa.
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Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4798574B2 (ja) * 2002-08-30 2011-10-19 サントリーホールディングス株式会社 フラボノイド３’，５’ヒドロキシラーゼ遺伝子配列およびその使用法
AU2003901797A0 (en) 2003-04-14 2003-05-01 Agresearch Limited Manipulation of condensed tannin biosynthesis
AU2004264488B2 (en) * 2003-08-13 2008-10-02 Suntory Holdings Limited Process for producing rose with modified color
AU2006213213B2 (en) * 2005-02-14 2010-10-28 Suntory Holdings Limited Transgenic plant for detecting environmental chemicals
CN1329517C (zh) * 2005-09-22 2007-08-01 华南师范大学 深圳5号非洲菊的转基因技术
US20100306877A1 (en) * 2006-02-17 2010-12-02 International Flower Development Proprietary Limited Flavonoid glucosyltransferase and use of same
CN101454447A (zh) 2006-06-01 2009-06-10 教会高等教育科研与病人护理协会 与细胞pH相关的植物核酸及其用途
JP5285304B2 (ja) * 2007-03-15 2013-09-11 石原産業株式会社 ツユクサのフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子
TW200845888A (en) * 2007-03-29 2008-12-01 Int Flower Dev Pty Ltd Process for generation of surface chimera transgenic plants
JP5144347B2 (ja) 2007-04-26 2013-02-13 石原産業株式会社 花色を改変したコチョウランの製造方法
KR101168421B1 (ko) * 2007-06-20 2012-07-25 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 플라본 및 말비딘을 함유하는 장미 및 그 생산 방법
JPWO2008156214A1 (ja) * 2007-06-20 2010-08-26 インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド フラボン及びデルフィニジンを含むバラ及びその生産方法
JP5500556B2 (ja) * 2007-11-15 2014-05-21 サントリーホールディングス株式会社 変更された花部を有する遺伝子改変植物
AU2008323623B2 (en) * 2007-11-15 2015-01-22 Suntory Holdings Limited Genetically modified chrysanthemums
US20110107463A1 (en) 2007-12-07 2011-05-05 Suntory Holdings Limited Transgenic plant capable of flowering at low light intensity
NZ564691A (en) * 2007-12-21 2010-03-26 Nz Inst Plant & Food Res Ltd Glycosyltransferases, polynucleotides encoding these and methods of use
WO2010050605A1 (ja) * 2008-10-27 2010-05-06 インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド フラボノイド合成に関わるサイネリア由来の染色体ｄｎａとその用途
USPP21595P3 (en) 2008-12-19 2010-12-28 International Flower Developments Pty Ltd. Dianthus plant named ‘Floriagate’
EP2947083A1 (en) * 2009-03-27 2015-11-25 Suntory Holdings Limited Novel compound contained in blue rose
US9074215B2 (en) 2009-04-24 2015-07-07 Incorporated Adminstrative Agency, National Agriculture and Food Research Organization Method for production of chrysanthemum plant having delphinidin-containing petals
JP5697041B2 (ja) * 2009-04-24 2015-04-08 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 修飾されたアントシアニンを花弁に含有するキク植物を生産する方法
USPP21515P2 (en) 2009-05-26 2010-11-23 International Flower Developments Pty Ltd. Dianthus plant named ‘Florijade’
CA2810812A1 (en) 2010-09-17 2012-03-22 Suntory Holdings Limited Method for producing lilies containing delphinidin in the petals thereof
EP2818548A4 (en) 2012-02-24 2015-07-29 Suntory Holdings Ltd PROMOTER FROM TORENIA WITH EFFECT IN FLOWER LEAVES
RU2640248C2 (ru) * 2012-04-16 2017-12-27 Сантори Холдингз Лимитед Новый ген флавоноид 3,5-гидроксилазы колокольчика и его применение
JP2014158456A (ja) * 2013-02-21 2014-09-04 Toyama Prefecture 合理的代謝フロースイッチングした形質転換植物培養細胞及びそれを用いた生合成法
US20150124336A1 (en) * 2013-06-25 2015-05-07 Public Service Solutions, Inc. Wide spectrum optical systems and devices implementing first surface mirrors
WO2015134807A1 (en) * 2014-03-06 2015-09-11 Salk Institute For Biological Studies Polyketide synthase variants and uses thereof
CN104313040A (zh) * 2014-10-20 2015-01-28 上海交通大学 一种明日叶查尔酮合成酶基因的序列
CN106047920A (zh) * 2016-06-03 2016-10-26 北京农学院 一种快捷的观赏海棠组培苗瞬时基因沉默的方法
CN106755308B (zh) * 2016-11-22 2020-05-26 中国农业科学院茶叶研究所 筛选高二羟基儿茶素茶树的类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记及其应用、应用方法
EP3950067A1 (en) 2019-03-29 2022-02-09 Suntory Holdings Limited Ltbp-1 expression promoting composition and method for screening for substance having ltbp-1 expression promoting function
KR20220081975A (ko) * 2019-10-14 2022-06-16 코나겐 인크. 에리오딕티올의 생합성
CN112391300B (zh) * 2020-11-04 2022-08-23 江南大学 水飞蓟来源的黄酮3β-羟化酶及其辅酶的应用
CN114015703B (zh) * 2021-10-21 2023-05-26 浙江大学杭州国际科创中心 油菜BnC3H基因在提高植物生物自发光强度中的应用
CN113862288B (zh) * 2021-10-25 2023-06-20 杭州市农业科学研究院 三叶青ThF3’5’H基因及其应用
CN114196685A (zh) * 2021-12-21 2022-03-18 扬州大学 玉米茎秆穿刺强度基因ZmFLS2及其分子标记的应用
CN116042692A (zh) * 2022-09-30 2023-05-02 山东和正生态农业开发有限公司 一种萱草的遗传转化方法及其应用
CN117757815A (zh) * 2023-12-11 2024-03-26 昆明理工大学 一种华丽龙胆vigs体系的构建方法及其应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0387246A (ja) * 1988-05-30 1991-04-12 Sumitomo Rubber Ind Ltd タイヤのグルービング装置およびグルービング方法
PL170326B1 (pl) * 1991-07-11 1996-11-29 Int Flower Dev Pty Ltd S posób wytwarzania rosliny transgenicznej PL
KR100245488B1 (ko) * 1992-03-02 2000-02-15 히라타 다다시 신규 식물 유전자
WO1993020206A1 (en) * 1992-03-27 1993-10-14 International Flower Developments Pty. Ltd. Genetic sequences encoding flavonoid pathway enzymes and uses therefor
EP0703982A1 (en) * 1993-05-20 1996-04-03 INTERNATIONAL FLOWER DEVELOPMENTS Pty. Ltd. Transgenic flowering plants
AUPN298895A0 (en) * 1995-05-16 1995-06-08 International Flower Developments Pty Ltd Transgenic plants exhibiting altered flower colour and methods for producing same
AUPN838696A0 (en) * 1996-03-01 1996-03-21 Florigene Limited Genetic sequences encoding flavonoid pathway enzymes and uses therefor
JPH11178572A (ja) 1997-12-22 1999-07-06 Iwate Prefecture リンドウカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター
AUPP526898A0 (en) * 1998-08-14 1998-09-10 Florigene Limited A plant regulatory gene
JP4798574B2 (ja) * 2002-08-30 2011-10-19 サントリーホールディングス株式会社 フラボノイド３’，５’ヒドロキシラーゼ遺伝子配列およびその使用法
US9202621B2 (en) 2011-11-03 2015-12-01 Power-One, Inc. Slotted bobbin magnetic component devices and methods
US9104412B2 (en) 2012-12-28 2015-08-11 International Business Machines Corporation Mobile device offloading its task to a peer device when available power is below a threshold level

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