ES2436170T3 - Anticuerpos y péptidos específicos de la integrina alfa II beta3 - Google Patents

Abstract

Un péptido aislado y purificado que comprende de 9 a aproximadamente 50 restos aminoácidos, y que tiene unasecuencia de restos aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, 5, 6 y 7, que tiene unaactividad que inhibe la agregación plaquetaria.

Description

Anticuerpos y péptidos específicos de la integrina alfa II beta3

Campo técnico de la invención

El campo técnico de la presente invención es la agregación plaquetaria. Más en concreto, la presente invención se refiere a anticuerpos y péptidos específicos de integrina, y al uso de estos compuestos para inhibir la agregación plaquetaria.

Antecedentes de la invención

Los inhibidores de la integrina αIIbβ3 son una nueva clase de agente antitrombóticos que inhiben la unión del fibrinógeno a la integrina αIIbβ3, inhibiendo con ello las interacciones entre plaquetas, fundamentales para la formación de trombos plaquetarios (Topol, E. J., Byzova, T. V, y Plow, E. F. (1999), Platelet GPIIb-IIIa blockers, Lancet, 353, 227-231; Coller, B. S. (1997), Platelet GPIIb/ IIIa antagonists: the first anti-integrin receptor therapeutics, J. Clin. Invest., 99, 1467-1471). Los inhibidores de la integrina αIIbβ3 se emplean para el tratamiento de pacientes con síndromes coronarios agudos sin elevación del segmento ST y pacientes sometidos a una intervención coronaria percutánea (Proimos, G. (2001), Platelet aggregation inhibition with glycoprotein IIb-IIIa inhibitors, J. Thromb. Thrombolysis, 11, 99-110). Entre estos inhibidores, el elabciximab (ReoPro, Centocor, Inc., Malvern, Pensilvania, y Eli Lilly & Company, Indianápolis, Indiana) (Coller, B. S. (1997), Platelet CPIIb/IIIa antagonists: the first anti-integrin receptor therapeutics, J. Clin. Invest., 99, 1467-1471), la eptifibatida (INTEGRILIN, COR Therapeutics, Inc., South San Francisco, California, y Key Pharmaceuticals, Inc., Kenilworth, Nueva Jersey) (Phillips, D. R., y Scarborough, R. M. (1997), Clinical pharmacology of eptifibatide, Am. J. Cardiol., 80, 11B-20B; Scarborough, R. M. (1999), Development of eptifibatide, Am. Heart. J., 138, 1093-1104), y el tirofibano (Aggrastat, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, Nueva Jersey) (Vickers, S., Theoharides, A. D., Arison, B., Balani, S. K., Cui, D., Duncan, C. A., Ellis, J. D., Gorham, L. M., Polsky, S. L., Prueksaritanont, T., Ramjit, H. G., Slaughter, D. E., y Vyas, K. P. (1999), In vitro and in vivo studies on the metabolism of tirofiban, Drug Metab. Dispos., 27, 1360-1366) están aprobados clínicamente en EEUU. El abciximab, el primer agente aprobado y el más ampliamente utilizado, es un Fab quimérico con dominios variables de ratón y dominios constantes humanos. Se une a un epitopo adyacente a la región de unión del ligando e inhibe la unión del fibrinógeno mediante impedimento estérico. Se ha divulgado que el abciximab presenta reacción cruzada con la integrina αvβ3 y αMβ2 (Scarborough, R. M. (1999), Development of eptifibatide, Am. Heart J., 138, 1093-1104). La eptifibatida y el tirofibano, por otra parte, son fármacos de molécula pequeña que se unen al sitio de interacción con el ligando RGD de la integrina y son específicos de αIIbβ3. Muestran menor afinidad y unas semividas en la circulación mucho más cortas que el abciximab (Scarborough, R. M. (1999), Development of eptifibatide, Am. Heart. J., 138, 1093-1104; Vickers, S., Theoharides, A. D., Arison, B., Balani, S. K., Cui, D., Duncan, C. A., Ellis, J. D., Gorham, L. M., Polsky, S. L., Prueksaritanont, T., Ramjit, H. G., Slaughter, D. E., y Vyas, K. P. (1999), In vitro and in vivo studies on the metabolism of tirofiban, Drug Metab. Dispos., 27, 1360-1366; McClellan, K. J., y Goa, K. L. (1998), Tirofiban. A review of its use in acute coronary syndromes, Drugs, 56, 1067-1080).

La trombocitopenia aguda es una complicación reconocida del tratamiento con inhibidores de la integrina αIIbβ3. La trombocitopenia, que a menudo es grave (número de plaquetas menor que 50 x 109/l), aparece en 0,5% al 1% de los pacientes que reciben abciximab por primera vez (Berkowitz, S. D., Sane, D. C:, Sigmon, K. N., Shavender, J. H., Harrington, R. A., Tcheng, J. E., Topol, E. J., y Califf, R. M. (1998), Occurrence and clinical significance of thrombocytopenia in a population undergoing high-risk percutaneous coronary revascularization, Evaluation of c7E3 for the Prevention of Ischemic Complications (EPIC) Study Group, J. Am. Coll. Cardiol., 32, 311-319; Jubelirer, S. J., Koenig, B. A., y Bates, M. C. (1999), Acute profound thrombocytopenia following C7E3 Fab (Abciximab) therapy: case reports, review of the literature and implications for therapy, Am. J. Hematol., 61, 205-208; Kereiakes, D. J., Berkowitz, S. D., Lincoff, A. M., Tcheng, J. E., Wolski, K., Achenbach, R., Melsheimer, R., Anderson, K., Califf, R. M., y Topol, E. J. (2000), Clinical correlates and course of thrombocytopenia during percutaneous coronary intervention in the era of abciximab platelet glycoprotein IIb/IIIa blockade, Am. Heart J., 140, 74-80) y en 4% de los pacientes después de una segunda administración (Madan, M., Kereiakes, D. J., Hermiller, J. B., Rund, M. M., Tudor, G., Anderson, L., McDonald, M. B., Berkowitz, S. D., Sketch, M. H., Jr., Phillips, H. R., 3º, y Tcheng, J. E. (2000), Efficacy of abciximab readmiriistration in coronary intervention, Am. J. Cardiol., 85, 435-440; Tcheng, J. E., Kereiakes, D. J., Braden, G. A., Jordan, R. E., Mascelli, M. A., Langrall, M. A., y Effron, M. B. (1999), Readministration of abciximab: interim report of the ReoPro readministration registry, Am. Heart J., 138, S33-38). En ensayos clínicos del tirofibano, la incidencia varía del 0,1% al 0,5%, que es solo el doble de la incidencia observada en pacientes que no reciben el fármaco (The RESTORE Investigators. Randomized Efficacy Study of Tirofiban for Outcomes and Restenosis (1997), Effects of platelet glycoprotein IIb/IIIa blockade with tirofiban on adverse cardiac events in patients with unstable angina or acute myocardial infarction undergoing coronary angioplasty, Circulation, 96, 1445-1453; Platelet Receptor Inhibition in Ischemic Syndrome Management (PRISM) Study Investigators (1998), A comparison of aspirin plus tirofiban with aspirin plus heparin for unstable angina, N. Engl. J. Med., 338, 1498

1505; Platelet Receptor Inhibition in Ischemic Syndrome Management in Patients Limited by Unstable Signs and Symptoms (PRISM-PLUS) Study Investigators (1998), Inhibition of the platelet glycoprotein IIb/IIIa receptor with tirofiban in unstable angina and non-Q-wave myocardial infarction, N. Engl. J. Med., 338, 1488-1497). En el ensayo PURSUIT de eptifibatida, la incidencia fue aproximadamente la misma en pacientes a los que se le administró el fármaco de estudio que en pacientes que recibieron un placebo (McClure, M. W., Berkowitz, S. D., Sparapani, R., Tuttle, R., Kleiman, N. S., Berdan, L. G., Lincoff, A. M., Deckers, J., Diaz, R., Karsch, K. R., Gretler, D., Kitt, M., Simoons, M., Topol, E. J., Califf, R. M., y Harrington, R. A. (1999), Clinical significance of thrombocytopenia during a non-ST-elevation acute coronary syndrome. The platelet glycoprotein IIb/ IIIa in unstable angina: receptor suppression using integrilin therapy (PURSUIT) trial experience, Circulation, 99, 2892-2900). Solo un pequeño subconjunto de pacientes que recibieron eptifibatida presentan una inexplicable trombocitopenia profunda (McClure,

M. W., Berkowitz, S. D., Sparapani, R., Tuttle, R., Kleiman, N. S., Berdan, L. G., Lincoff, A. M., Deckers, J., Díaz, R., Karsch, K. R., Gretler, D., Kitt, M., Simoons, M., Topol, E. J., Califf, R. M., y Harrington, R. A. (1999), Clinical significance of thrombocytopenia during a non-ST-elevation acute coronary syndrome. The platelet glycoprotein IIb/IIIa in unstable angina: receptor suppression using integrilin therapy (PURSUIT) trial experience, Circulation, 99, 2892-2900). La causa de la trombocitopenia inducida por la integrina αIIbβ3 es desconocida, aunque se ha divulgado que los anticuerpos humanos contra los dominios variables de ratón del abciximab, inducidos probablemente por la primera exposición al abciximab, son la causa de la destrucción de las plaquetas en los pacientes que han desarrollado trombocitopenia grave después de recibir abciximab por segunda vez (Curtis, B. R., Swyers, J., Divgi, A., McFarland, J. G., y Aster, R. H. (2002), Thrombocytopenia after second exposure to abciximab is caused by antibodies that recognize abciximab-coated platelets, Blood, 99, 2054-2059).

Las integrinas αvβ3, αvβ5, αIIbβ3 y α5β1 se unen a una diversidad de proteínas adhesivas que contienen el tripéptido Arg-Gly-Asp (RGD). Aprovechando esta característica, se seleccionaron mAb humanos sintéticos que imitan a la proteína adhesiva que contienen un motivo RGD en HCDR3 flanqueado por seis restos aleatorizados, a partir de bancos de anticuerpos mediante presentación de fagos (Barbas, C. F., 3º, Languino, L. R., y Smith, J. W. (1993), High-affinity self-reactive human antibodies by design and selection: targeting the integrin ligand binding site, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10003-10007). Fab-9, el más potente de estos anticuerpos, se une a la integrina αvβ3 casi

1.000 veces mejor que a las integrinas αvβ5 y α5β1. Sin embargo, ninguno de los anticuerpos seleccionados, incluyendo Fab-9, distinguen entre las dos integrinas de β3, αvβ3 y αIIbβ3. Por tanto, se generó un banco de optimización de motivos para determinar si más rondas de modificación y selección sobre el motivo RGD dentro de la HCDR3 de Fab-9 podrían producir un anticuerpo con especificidad por cualquiera de las integrinas αvβ3 o αIIbβ3 (Smith, J. W., Hu, D., Satterthwait, A., Pinz-Sweeney, S., y Barbas, C. F., 3º (1994), Building synthetic antibodies as adhesive ligands for integrins, J. Biol. Chem., 269, 32788-32795). Aunque muchos de los anticuerpos seleccionados mostraron algo de preferencia por la integrina αvβ3 o por la integrina αIIbβ3, todos los anticuerpos continúan uniéndose a ambas integrinas. La mayoría de los anticuerpos seleccionados poseen la secuencia consenso (K/R)XD. De modo interesante, la posición intermedia en el motivo RGD demostró ser muy permisiva. Se descubrió que la Gly puede ser sustituida por Val, Ala, Asn, Arg, Thr, Gln, Asp, Ser, y Trp (Smith, J. W., Hu, D., Satterthwait, A., Pinz-Sweeney, S., y Barbas, C. F., 3º (1994), Building synthetic antibodies as adhesive ligands for integrins, J. Biol. Chem., 269, 32788-32795).

En Puzon-McLaughlin, W., et al. (2000), Journal of Biological Chemistry, 275, 7795-7802, se divulga la interacción de ligandos con la integrina αIIbβ3. También se divulgan tres anticuerpos anti-αIIbβ3 humana que contienen la secuencia RYD similar a RGD en su CDR3 en la cadena pesada y que tienen similitudes estructurales y funcionales con ligandos nativos. Estos mAb inhiben la unión del fibrinógeno a las plaquetas y la agregación de plaquetas dependiente de fibrinógeno.

Breve sumario de la invención

La invención proporciona un inhibidor peptídico de la agregación plaquetaria aislado y purificado, comprendiendo dicho péptido de 9 a aproximadamente 50 restos aminoácidos y teniendo una secuencia de restos aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, 5, 6 y 7. En una realización preferida, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:5-7. En otra realización preferida, el péptido consiste en cualquiera de SEQ ID NO:5-7. En una realización más preferida, el péptido consiste fundamentalmente en cualquiera de SEQ ID NO: 5-7.

En otra realización, la invención contempla un anticuerpo que inmunorreacciona específicamente con la integrina αIIBβ3, y comprende una secuencia de restos aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:8, 25, 26, 27, 28, 29, 30 y 31, en el que la secuencia de restos aminoácidos está dentro de la región determinante de la complementariedad (CDR) HCDR3 del anticuerpo.

En otra realización, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en los anticuerpos denominados en la presente RAD3, RAD4, RAD9, RAD11, RAD12, RAD32, RAD34, RAD87, o RAD88, y presenta inmunorreactividad con la integrina αIIBβ3. En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo humano.

En otra realización, la invención contempla un anticuerpo que tiene inmunorreactividad con la integrina αIIBβ3.

La invención también contempla procedimientos para utilizar los anticuerpos, las inmunoglobulinas y los péptidos de la invención. En una realización, se selecciona un péptido que tiene una secuencia de restos aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, 5, 6 y 7 para su uso para inhibir la agregación plaquetaria.

En otra realización, un anticuerpo que inmunorreacciona específicamente con la integrina αIIBβ3 y comprende una secuencia de restos aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:8, 25, 26, 27, 28, 29, 30 y 31, en el que la secuencia de restos aminoácidos está dentro de una región determinante de la complementariedad HCDR3 del anticuerpo, se emplea para su uso para inhibir la agregación plaquetaria.

La invención también contempla un péptido que tiene una secuencia de restos aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, 5, 6 y 7 para su uso para inhibir la agregación plaquetaria.

La invención contempla también un anticuerpo que inmunorreacciona específicamente con la integrina αIIBβ3 y comprende una secuencia de restos aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:8, 25, 26, 27, 28, 29, 30 y 31, en el que la secuencia de restos aminoácidos está dentro de la región determinante de la complementariedad HCDR3 del anticuerpo, para su uso para inhibir la agregación plaquetaria.

La invención también contempla un anticuerpo que tiene actividad de unión a la integrina αIIbβ3, en el que la unión compite con la actividad de unión de otro anticuerpo, comprendiendo el otro anticuerpo una secuencia de restos aminoácidos dentro de la región determinante de la complementariedad HCDR3 del otro anticuerpo, en el que la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:8, 25, 26, 27, 29, 29, 30 y 31, y en el que la unión se realiza en un ensayo de competición convencional.

Otra realización de la invención contempla una composición farmacéutica que comprende el inhibidor peptídico de la agregación plaquetaria y un vehículo farmacéutico adecuado en una forma adecuada para la administración por vía intravenosa, intraarterial, hacia la circulación linfática, intraperitoneal, transdérmica, subcutánea, intramuscular, hacia el espacio articular, o mediante administración pulmonar. Otra realización contempla una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo que inmunorreacciona específicamente con la integrina αIIbβ3 y un vehículo farmacéutico adecuado.

Otra realización de la invención contempla la utilización del inhibidor peptídico de la agregación plaquetaria como medicamento para el tratamiento para prevenir la trombosis en trastornos seleccionados del grupo que consiste en embolia pulmonar, ataques isquémicos transitorios (TIA), trombosis de venas profundas, cirugía de bypass coronario, y cirugía para insertar una válvula o un vaso prostético en un injerto de vasos autólogo, no autólogo o sintético. Otra realización contempla la utilización del anticuerpo que inmunorreacciona específicamente con la integrina αIIbβ3 como medicamento para un tratamiento para prevenir la trombosis.

En otra realización, el inhibidor peptídico de la agregación plaquetaria también puede utilizarse como medicamento para un tratamiento para prevenir la trombosis en un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en procedimientos de angioplastia realizados con balón, aterectomía coronaria y angioplastia de láser. En otra realización, el anticuerpo que inmunorreacciona específicamente con la integrina αIIbβ3 se emplea como medicamento para un tratamiento para prevenir la trombosis.

En la presente se describe un procedimiento para tratar un sujeto para tratar o prevenir un trastorno de formación de trombos, seleccionándose el trastorno del grupo que consiste en trombosis en embolia pulmonar, ataques isquémicos transitorios (TIA), trombosis de venas profundas, cirugía de bypass coronario, y cirugía para insertar una válvula o un vaso prostético en un injerto de vasos autólogo, no autólogo o sintético, comprendiendo dicho procedimiento administrar al sujeto una cantidad de un péptido que tiene actividad para inhibir con eficacia la agregación plaquetaria para lograr el tratamiento deseado. También se describe un procedimiento para tratar un sujeto para tratar o prevenir un trastorno de formación de trombos, que comprende administrar al sujeto una cantidad de un anticuerpo que inmunorreacciona específicamente con la integrina αIIbβ3 que es eficaz para lograr el tratamiento deseado.

En un aspecto, la presente invención proporciona un inhibidor peptídico de la agregación plaquetaria aislado y purificado. El péptido tiene de 9 a aproximadamente 50 restos aminoácidos y una secuencia de restos aminácidos que se corresponde von V (V/W) CRAD (K/R) RC (ejemplificada por SEQ ID NO:4, 5, 6, y 7). El péptido incluye preferiblemente la secuencia de restos aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:5-7 y, más preferiblemente, tiene la secuencia de restos aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:5-7.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que inmunorreacciona específicamente con la integrina αIIbβ3. El anticuerpo incluye la secuencia de restos aminoácidos V (R/G) V (V/W) CRAD (R/K) RCYAMDV (ejemplificada por SEQ ID NO:8, 25, 26, 26, 28, 29, 30, y 31) dentro de la región determinante de la complementariedad HCDR3 del anticuerpo. Lo más preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo humano. Los

ejemplos de los anticuerpos preferidos son cinco denominados en la presente RAD3, RAD4, RAD9, RAD11, RAD12, RAD32, RAD34, RAD87, o RAD88. La invención también contempla un anticuerpo que tiene la inmunorreactividad de cualquiera de RAD3, RAD4, RAD9, RAD11, RAD12, RAD32, RAD34, RAD87, o RAD88.

En la presente también se describe un procedimiento para inhibir la agregación plaquetaria que incluye la etapa de poner en contacto las plaquetas con una cantidad inhibidora eficaz de un péptido o un anticuerpo de la invención.

También se describe un procedimiento para inhibir la unión del fibrinógeno a las plaquetas, que incluye la etapa de poner en contacto las plaquetas con una cantidad inhibidora eficaz de un péptido o un anticuerpo de la invención.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos que forman una parte de la memoria descriptiva:

La figura 1 demuestra que Fab seleccionados se unen a la integrina αIIbβ3 humana, pero no a otras integrinas humanas que se unen a RGD. Se muestran los resultados de un ELISA basado en las integrinas humanas inmovilizadas αvβ3, αvβ5, αIIbβ3 y α5β1 y el sobrenadante que contiene Fabs solubles expresados por E. coli transfectado con pComb3X. Se empleó para la detección un mAb anti-HA de rata conjugado con HRP.

La figura 2 demuestra que el Fab RAD87 se une a plaquetas humanas pero no a células endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC). Un análisis mediante citometría de flujo demuestra que el Fab RAD87 se une solo a plaquetas humanas, que expresan las dos integrinas αvβ3 y αIIbβ3, pero no a células HUVEC, que expresan principalmente la integrina αvβ3. Por contraste, el Fab abciximab se une a plaquetas y a células HUVEC, lo cual confirma la reactividad cruzada documentada con las dos integrinas β3. El eje de abscisas indica el número de acontecimientos en escala lineal, y el eje de ordenadas la intensidad de fluorescencia en escala logarítmica.

La figura 3 demuestra que el Fab RAD87 y péptidos sintéticos derivados de secuencias de HCDR3 seleccionadas inhiben la interacción entre la integrina αIIbβ3 y fibrinógeno. Se mezcló fibrinógeno biotinilado con (A) diversas concentraciones de Fab RAD87 y abciximab, así como IgG humana reunida como control negativo, y (B) péptidos sintéticos, y se añadio a la integrina αIIbβ3 inmovilizada sobre una placa ELISA. Se empleó estreptavidina-HRP para la detección. Se muestran los valores medios y las desviaciones estándar de tres experimentos independientes.

La figura 4 demuestra que el Fab RAD87 inhibe la agregración plaquetaria ex vivo. Los ensayos de agregación plaquetaria mostrados se derivaron de un lumi-agregómetro de sangre completa. Para cada ensayo se mezclaron 15 μl de disolución de Fab RAD87 (A) o de Fab abciximab (B) con 435 μl de plasma rico en plaquetas para alcanzar una concentración final entre 20 nM y 100 nM. Después se añadió ADP hasta una concentración final de 20 μM y se controló la agregación durante 10 minutos. En (C) se muestran los valores medios y las desviaciones estándar representadas gráficamente de tres experimentos independientes.

La figura 5 demuestra que péptidos sintéticos derivados de las secuencias de HCDR3 seleccionadas inhiben la agregación plaquietaria ex vivo. Se realizaron ensayos de agregación plaquetaria como se describe en la figura 4 en presencia de las concentraciones de péptidos indicadas. Nótese que los tres péptidos cíclicos con el motivo RAD inhiben con gran potencia la agregación plaquetaria (A-C), mientras que el péptido lineal con el motivo RAD y dos péptidos control con un motivo RAD invertido no tienen efecto sobre el fondo (D). Se empleó el Fab abciximab como control positivo en todos los ensayos de agregación plaquetaria.

La figura 6 muestra las secuencias de restos aminoácidos de una parte de la cadena pesada de los anticuerpos de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos que inmunorreaccionan con la integrina αIIbβ3. El término anticuerpo, en sus diversas formas gramaticales, se emplea en la presente para indicar moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a anticuerpos o paratopo. Los ejemplos de moléculas de anticuerpos son moléculas de inmunoglobulinas intactas, moléculas de inmunoglobulinas sustancialmente intactas, y porciones de moléculas de inmunoglobulinas, incluyendo las porciones conocidas en la técnica como Fab, Fab', F(ab')2 y F(v), anticuerpos de dominio único (dAb), construcciones de inmunoglobulinas plegadas y sus fragmentos activos.

Un anticuerpo de la presente invención se prepara y se identifica utilizando la tecnología de presentación de fagos, tal como se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional WO 94/18221). En los ejemplos que aparecen a continuación se ofrece una descripción detallada de estos procedimientos. Un anticuerpo preferido es un anticuerpo humano. La presente invención describe mAb humanos específicos de la integrina αIIbβ3 a partir de un banco de anticuerpos humanos sintéticos recién diseñado. En primer lugar, los dos restos cisteína presentes en los bancos previos se retiraron de HCDR3. La reducción en la longitud

de HCDR3, junto con la eliminación del puente disulfuro, permite potencialmente una mayor flexibilidad estructural en el bucle de HCDR3. La eliminación del puente disulfuro fue estimulada por la observación de que un péptido derivado del HCDR3 de un anticuerpo previamente seleccionado (CSFGRGDIRNC) (SEQ ID NO:1) y su versión lineal GSFGRGDIRNG (SEQ ID NO:2) tienen una eficacia casi idéntica en ensayos de unión de ligandos (Smith, J. W., Hu, D., Satterthwait, A., Pinz-Sweeney, S., y Barbas, C. F., 3º (1994), Building synthetic antibodies as adhesive ligands for integrins, J. Biol. Chem., 269, 32788-32795). En segundo lugar, los inventores escogieron RAD, en lugar de RGD, como motivo central de unión a integrina y aleatorizaron seis restos en la región flanqueante. Un péptido que contiene RAD, GRADSP, se ha utilizado mucho como péptido control inactivo en experimentos en los que se ensayan péptidos que contienen RGD (Wu, M. H., Ustinova, E., y Granger, H. J. (2001), Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules, J. Physiol., 532, 785791; Slepian, M. J., Massia, S. P., Dehdashti, B., Fritz, A., y Whitesell, L. (1998), Beta3-integrins rather than beta1integrins dominate integrin-matrix interactions involved in postinjury smooth muscle cell migration, Circulation, 97, 1818-1827; Guilherme, A., Torres, K., y Czech, M. P. (1998), Cross-talk between insulin receptor and integrin alpha5 beta1 signaling pathways, J. Biol. Chem., 273, 22899-22903; Hautanen, A., Gailit, J., Mann, D. M., y Ruoslahti, E. (1989), Effects of modifications of the RGD sequence and its context on recognition by the fibronectin receptor, J. Biol. Chem., 264, 1437-1442; Adderley, S. R., y Fitzgerald, D. J. (2000), Glycoprotein IIb/IIIa antagonists induce apoptosis in rat cardiomyocytes by caspase-3 activation, J. Biol. Chem., 275, 5760-5766). Sin embargo, el hecho de que los inventores escogiesen RAD a partir de su banco de optimización de motivos (Smith, J. W., Hu, D., Satterthwait, A., Pinz-Sweeney, S., y Barbas, C. F., 3º (1994), Building synthetic antibodies as adhesive ligands for integrins, J. Biol. Chem., 269, 32788-32795), sugiere que los restos flanqueantes determinan si los motivos RAD pueden o no unirse a integrinas. Los inventores establecen la hipótesis de que el motivo RAD, introducido en una región flanqueante aleatorizada, puede aumentar la probabilidad de seleccionar anticuerpos específicos para la integrina αIIbβ3.

En la presente se utilizó la presentación de fagos para seleccionar anticuerpos monoclonales específicos para la integrina αIIbβ3 a partir de un banco de anticuerpos humanos sintéticos basándose en la secuencia de HCDR3 aleatorizada VGXXXRADXXXYAMDV (SEQ ID NO:3). Los anticuerpos seleccionados mostraron una fuerte secuencia de aminoácidos consenso en HCDR3 (V (V/W) CRAD (K/R) RC) (ejemplificada por SEQ ID NO:4, 5, 6, y 7) y una alta especificidad hacia la integrina αIIbβ3, pero no hacia otras integrinas que se unen a RGD, tales como las integrinas αvβ3, αvβ5, y α5β1. Los anticuerpos seleccionados, así como tres péptidos sintéticos VWCRADRRC (SEQ ID NO:5), VWCRADKRC (SEQ ID NO:6), y VVCRADRRC (SEQ ID NO:7), cuyas secuencias se derivan de las secuencias de HCDR3 de los anticuerpos seleccionados, inhibieron con fuerza la interacción entre la integrina αIIbβ3 y el fibrinógeno y la agregación plaquetaria ex vivo. Según los conocimientos de los inventores, estos son los primeros anticuerpos monoclonales totalmente humanos que son específicos para la integrina αIIbβ3 y que pueden inhibir con gran potencia la agregación plaquetaria.

En un aspecto, la presente invención proporciona un inhibidor peptídico de la agregación plaquetaria aislado y purificado. El péptido tiene de 9 a aproximadamente 50 restos aminoácidos y una secuencia de restos aminácidos que se corresponde a V (V/W) CRAD (K/R) RC (ejemplificada por SEQ ID NO:4, 5, 6, y 7). El péptido incluye preferiblemente la secuencia de restos aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:5-7 y, más preferiblemente, tiene la secuencia de restos aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:5-7. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que inmunorreacciona específicamente con la integrina αIIbβ3. El anticuerpo incluye la secuencia de restos aminoácidos V (R/G) V (V/W) CRAD (R/K) RCYAMDV (ejemplificada por SEQ ID NO:8, 25, 26, 26, 28, 29, 30, y 31) dentro de la región determinante de la complementariedad HCDR3 del anticuerpo. El anticuerpo es, lo más preferiblemente, un anticuerpo humano. Los ejemplos de los antticuerpos preferidos son cinco denominados en la presente RAD3, RAD4, RAD9, RAD11, RAD12, RAD32, RAD34, RAD87, o RAD88. La invención también contempla un anticuerpo que tiene la inmunorreactividad de cualquiera de RAD3, RAD4, RAD9, RAD11, RAD12, RAD32, RAD34, RAD87, o RAD88.

En la presente se describe un procedimiento para inhibir la agregación plaquetaria que incluye la etapa de poner en contacto las plaquetas con una cantidad inhibidora eficaz de un péptido o un anticuerpo de la invención.

También se describe un procedimiento para inhibir la unión del fibrinógeno a las plaquetas, que incluye la etapa de poner en contacto las plaquetas con una cantidad inhibidora eficaz de un péptido o un anticuerpo de la invención.

La presente invención describe, en una realización, anticuerpos monoclonales humanos que contienen un sitio de unión según describe en la presente y que se unen específicamente a una molécula diana preseleccionada. La invención también describe líneas celulares que producen los anticuerpos, procedimientos para producir las líneas celulares, y procedimientos para producir los anticuerpos monoclonales humanos.

En la medida en que una proteína de presentación de esta invención sobre una partícula de fágmido es, en realizaciones preferidas, una proteína de fusión entre una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina y un anclaje de la membrana de un fago filamentoso, debe entenderse que la proteína de presentación es, en efecto, una

cadena pesada o ligera de inmunoglobulina modificada en la cual se ha introducido un sitio de unión. Además, en muchas realizaciones, la expresión de la proteína de presentación se prepara sobre la superficie de un fágmido como un heterodímero formado entre péptidos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina, constituyendo una u otra una proteína de fusón con el anclaje de la membrana. Así, cuando se emplea la cadena pesada como proteína de fusión, una proteína de presentación, en realizaciones preferidas, comprende un fragmento Fab que tiene una cadena pesada anclada asociada con una cadena ligera.

La presente invención también describe, en una realización, polinucleótidos que codifican anticuerpos monoclonales humanos que contienen un sitio de unión, según se describe en la presente, y estos anticuerpos monoclonales humanos se unen específicamente a una molécula diana preseleccionada. Los polinucleótidos que codifican los anticuerpos monoclonales humanos pueden secuenciarse para identificar la secuencia polinucleotídica. Los procedimientos para la secuenciación del ADN son muy conocidos en la técnica y pueden utilizarse para practicar cualquiera de las realizaciones de la invención. Los procedimientos pueden emplear enzimas, tales como el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I; SEQUENASE (US Biochemical, Cleveland Ohio), Taq polimerasa (Perkin-Elmer), polimerasa de T7 termoestable (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.), o combinaciones de polimerasas y exonucleasas de corrección, tales como las que se encuentran en el sistema de amplificación ELONGASE (Life Technologies, Gaithersburg Md.). Preferiblemente, la preparación de la secuencia se automatiza con máquinas, tales como Hamilton MICROLAB 2200 (Hamilton, Reno Nev.), el termociclador 200 de Peltier (PTC200, MJ Research, Watertown Mass.) y ABI CATALYST 800 (Perkin-Elmer). Entonces se realiza la secuenciación utilizando los sistemas de secuenciación de ADN ABI 373 o 377 (Perkin-Elmer), el sistema de secuenciación de ADN MEGABACE 1000 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, Calif.), u otros sistemas conocidos en la técnica. Las secuencias resultantes se analizan utilizando una diversidad de algoritmos que son muy conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, F. M. (1997), Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York N.Y, unidad 7.7; Meyers, R. A. (1995), Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, Nueva York N.Y, pp. 856-853).

La preparación de líneas celulares productoras de anticuerpos monoclonales de la invención se describe con más detalle en la presente, y puede realizarse utilizando los procedimientos de mutagénesis de vectores fagmídicos descritos en la presente, y empleando técnicas de selección habituales que permiten la determinación de los patrones de unión elementales del anticuerpo monoclonal de interés, indicativas de que se ha producido un sitio de unión. Así, si el anticuerpo monoclonal humano que se está ensayando se une a la molécula diana preseleccionada, entonces el anticuerpo monoclonal humano que se está ensayando y el anticuerpo monoclonal humano producido por las líneas celulares de la invención se consideran equivalentes.

También es posible determinar, sin experimentación indebida, si un anticuerpo monoclonal humano tiene la misma (es decir, equivalente) especificidad que un anticuerpo monoclonal humano de esta invención, determinando si el primero evita que el segundo se una a una molécula diana preseleccionada. Si el anticuerpo monoclonal humano que se está ensayando compite con el anticuerpo monoclonal de la invención, tal como se muestra mediante una disminución en la unión por el anticuerpo monoclonal humano de la invención en ensayos de competición convencionales para la unión a moléculas diana cuando están presentes en fase sólida, entonces es probable que los dos anticuerpos monoclonales se unan al mismo epitopo o a un epitopo estrechamente relacionado.

Otra forma de determinar si un anticuerpo monoclonal humano tiene la especificidad de un péptido o un anticuerpo monoclonal humano de la invención es preincubar el péptido o el anticuerpo monoclonal humano de la invención con la molécula diana con la que normalmente es reactiva, y después añadir el anticuerpo monoclonal humano que se está ensayando para determinar si el anticuerpo monoclonal humano que se está ensayando es inhibido en su capacidad para unirse a la molécula diana. Si el anticuerpo monoclonal humano que se está ensayando es inhibido, entonces con toda probabilidad tiene la misma especificidad de epitopo, o una especificidad de epitopo funcionalmente equivalente, que el péptido o el anticuerpo monoclonal de la invención.

Otra forma para determinar si un anticuerpo monoclonal humano tiene la especificidad de un anticuerpo monoclonal humano de la invención es determinar la secuencia de restos aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de los anticuerpos en cuestión. Las moléculas de anticuerpos que tienen secuencias de restos aminoácidos idénticas, o funcionalmente equivalentes, en sus regiones CDR tienen la misma especificidad de unión. Los procedimientos para secuenciar péptidos son muy conocidos en la técnica.

La inmunoespecificidad de un anticuerpo, su capacidad de unión a la molécula diana y la afinidad relacionada que muestra el anticuerpo por el epitopo son definidas por el epitopo con el que inmunorreacciona el anticuerpo. La especificidad del epitopo viene definida, al menos en parte, por la secuencia de restos aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina del anticuerpo y, en parte, por la secuencia de restos aminoácidos de la regón variable de cadena ligera.

Se prefiere en particular un anticuerpo monoclonal humano que tenga la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal producido por un microorganismo E. coli o un microorganismo fúngico o una célula de hibridoma o

producido por un vector plasmídico, tal como se describe a continuación en la presente. Estos procedimientos para producir péptidos, polipéptidos, proteínas y anticuerpos son muy conocidos en la técnica. El uso de la expresión "tiene la especificidad de unión de" indica que anticuerpos monoclonales equivalentes muestran las mismas o similares propiedades de inmunorreacción (unión) y compiten por la unión a una molécula diana preseleccionada.

La expresión "variación conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido de origen no sustituido, con la condición de que los anticuerpos que portan el péptido sustituido también se unan a la molécula diana preseleccionada. De modo análogo, otra realización preferida de la invención se refiere a polinucleótidos que codifican los péptidos de cadena pesada y/o ligera indicados anteriormente, y a secuencias polinucleotídicas que son complementarias con estas secuencias polinucleotídicas. Las secuencias polinucleotídicas complementarias incluyen las secuencias que se hibridan con las secuencias polinucleotídicas de la invención bajo condiciones de hibridación rigurosas.

Los anticuerpos monoclonales humanos ofrecen ventajas concretas frente a los anticuerpos monoclonales murinos, en particular en la medida en que pueden utilizarse de modo terapéutico en seres humanos. De modo específico, los anticuerpos humanos no se eliminan de la circulación con tanta rapidez como los antígenos "extraños", y no activan al sistema inmunológico de la misma manera que los antígenos extraños y los anticuerpos extraños.

La invención contempla, en una realización, un anticuerpo monoclonal de esta invención, producido mediante los presentes procedimientos.

En otra realización preferida, la invención contempla una molécula de inmunoglobulina truncada que comprende un fragmento Fab derivado de un anticuerpo monoclonal humano de esta invención. El fragmento Fab, sin el receptor Fc, es soluble y proporciona ventajas terapéuticas respecto a la semivida sérica, y ventajas de diagnóstico respecto a los modos de utilizar el fragmento Fab soluble. La preparación de un fragmento Fab soluble en general es conocida en las técnicas inmunológicas y puede realizarse mediante una diversidad de procedimientos. En la presente se describe un procedimiento preferido para producir un fragmento Fab soluble.

Preferiblemente, un anticuerpo de esta invención inmunorreacciona específicamente con la integrina αIIbβ3. Es decir, un anticuerpo muestra una unión preferente a la integrina αIIbβ3, comparado con otras integrinas. En la presente se describen ejemplos de anticuerpos preferidos y se denominan RAD3, RAD4, RAD9, RAD11, RAD12, RAD32, RAD34, RAD87, o RAD88. Las secuencias de restos aminoácidos de la región VH de estos anticuerpos se indican en la figura 6.

Los anticuerpos monoclonales humanos particularmente preferidos son los que presentan la especificidad de inmunorreacción (unión) de un anticuerpo monoclonal que tiene secuencias de restos aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (H) y ligera (L) de una inmunoglobulina en parejas (H:L), en los que la cadena ligera es la cadena ligera descrita en la presente, y la cadena pesada tiene una de las secuencias mostradas en la figura 6 y sus sustituciones conservativas.

Las sustituciones conservativas son las sustituciones en las que al menos un resto en la secuencia de aminoácidos se ha eliminado y se ha insertado un resto diferente en su lugar. Estas sustituciones en general se realizan según la tabla 2 cuando se desea mantener la actividad de la proteína. La tabla 2 muestra aminoácidos que pueden ser sustituidos por un aminoácido en una proteína y que generalmente se consideran sustituciones conservativas.

Tabla 2 5

Resto

Sustituciones conservativas

Ala

Ser

Arg

Lys

Asn

Gln; His

Asp

Glu

Gln

Asn

Cys

Ser

Glu

Asp

Gly

Pro

His

Asn; Gln

Ile

Leu; Val

Leu

Ile; Val

Lys

Arg; Gln

Met

Leu; Ile

Phe

Met; Leu; Tyr

Ser

Thr; Gly

Thr

Ser; Val

Trp

Tyr

Tyr

Trp; Phe

Val

Ile; Leu

Las sustituciones que son menos conservativas que las que aparecen en la tabla 2 pueden seleccionarse eligiendo restos que diferen más significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o hélice; (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana; o (c) la voluminosidad de la cadena lateral. Las sustituciones de las cuales se espera, en general, que produzcan los mayores cambios en las propiedades de las proteínas serán aquellas en las que (a) un resto hidrófilo, por ejemplo, serilo o treonilo, se sustituye por un resto hidrófobo, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o una prolina se sustituye por cualquier otro resto; (c) un resto que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo o histidilo, se sustituye por un resto electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un resto que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por otro que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina.

Pueden utilizarse diversos procedimientos, tales como un análisis de Scatchard junto con técnicas de radioinmunoensayo, para evaluar la afinidad de los anticuerpos por la integrina. La afinidad se expresa como una constante de asociación, Ka, que se define como la concentración molar del complejo de integrina-anticuerpo dividida entre las concentraciones molares del antígeno libre y el anticuerpo libre bajo condiciones de equilibrio. La Ka determinada para una preparación de anticuerpos policlonales, que son heterogéneos en sus afinidades por múltiples epitopos de integrinas, representa la afinidad media, o avidez, de los anticuerpos por la integrina. La Ka determinada para una preparación de anticuerpos monoclonales, que son monoespecíficos por un epitopo de integrina concreto, representan una verdadera medición de la afinidad. Se prefieren preparaciones de anticuerpos de alta afinidad con una Ka que varía de aproximadamente 109 a 1012 l/mol, para su uso en inmunoensayos en los que el complejo de integrina-anticuerpo debe someterse a manipulaciones rigurosas. Se prefieren preparaciones de anticuerpos de baja afinidad con una Ka que varía de aproximadamente 106 a 107 l/mol, para su uso en la inmunopurificación y procedimientos similares que, en último término, requieren la disociación de la integrina, preferiblemente en forma activa, del anticuerpo (Catty, D. (1988), Antibodies, Volume I: A Practical Approach, IRL Press, Washington, D. C.; y Liddell, J. E. y Cryer, A. (1991), A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y)

La afinidad también puede expresarse como la constante de disociación o Kd. Las afinidades de unión preferidas incluyen las que tienen una constante de disociación Kd menor que 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, o 10-13 M.

En otro aspecto, la invención proporciona un péptido que inhibe la agregación plaquetaria. El péptido tiene de 9 a aproximadamente 50 restos aminoácidos y se deriva de un anticuerpo de esta invención. Preferiblemente, el péptido incluye una secuencia de restos aminoácidos que se corresponde con la fórmula V (V/W) CRAD (K/R) RC (ejemplificada por SEQ ID NO:4, 5, 6, y 7). En los ejemplos que aparecen a continuación se presentan ejemplos de péptidos preferidos.

La presente invención contempla composiciones terapéuticas útiles para practicar los procedimientos terapéuticos descritos en la presente. Las composiciones terapéuticas de la presente invención contienen un vehículo fisiológicamente tolerable junto con al menos una especie de un anticuerpo monoclonal humano o un péptido derivado de este según se describe en la presente, disuelto o dispersado en él como principio activo. En una

realización preferida, la composición terapéutica no es inmunogénica cuando se administra a un paciente humano para objetivos terapéuticos.

Tal como se emplean en la presente, las expresiones "farmacéuticamente aceptable", "fisiológicamente tolerable" y sus variaciones gramaticas, cuando se refieren a composiciones, vehículos, diluyentes y reactivos, se utilizan de modo intercambiable e indican que los materiales son capaces de ser administrados a un ser humano, o sobre un ser humano, sin la producción de efectos fisiológicos no deseable, tales como náuseas, mareos, malestar gástrico y similares.

La preparación de una composición farmacológica que contenga principios activos disueltos o dispersados en ella es bien conocida en la técnica. Generalmente, estas composiciones se prepararn como inyectables estériles, en disoluciones o suspensiones líquidas, acuosas o no acuosas; sin embargo, también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para la disolución o suspensión en líquidos antes del uso. La preparación también puede emulsionarse. Así, una composición que contiene moléculas de anticuerpos puede tomar la forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvo, u otras formas de composiciones.

El principio activo puede mezclarse con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo y en cantidades adecuadas para su uso en los procedimientos terapéuticos descritos en la presente. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, disolución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y sus combinaciones. Además, si se desea, la composición puede contener pequeñas cantidades de sustancias auxiliares, tales como agente humectantes o emulgentes, agentes tamponantes del pH y similares, que potencian la eficacia del principio activo.

La composición terapéutica de la presente invención puede incluir sales farmacéuticamente aceptables de sus componentes. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las slaes de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres del péptido) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos, tales como ácido acético, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y de bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares.

Los vehículos fisiológicamente tolerables son muy conocidos en la técnica. Los ejemplos de vehículos líquidos son disoluciones acuosas estériles que no contienen materiales además de los principios activos y el agua, o contienen un tampón, tal como fosfato de sodio a un valor de pH fisiológico, disolución salina fisiológica o ambos, tal como disolución salina tamponada con fosfato. Además, los vehículos acuosos pueden contener más de una sal tamponante, así como sales, tales como cloruro de sodio y potasio, dextrosa, propilenglicol, polietilenglicol y otros solutos.

Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas además del agua o con la exclusión del agua. Los ejemplos de estas otras fases líquidas son la glicerina, aceites vegetales, tales como aceite de algonodero, ésteres orgánicos, tales como oleato de etilo, y emulsiones de agua en aceite.

Una composición terapéutica contiene un anticuerpo monoclonal humano de la presente invención, generalmente en una cantidad de al menos 0,1% en peso del anticuerpo por peso de la composición terapéutica total. Un porcentaje en peso es una proporción en peso del anticuerpo a la composición total. Así, por ejemplo, 0,1% en peso es 0,1 gramos de anticuerpo por 100 gramos de composición total.

Preferiblemente, una composición terapéutica que contiene anticuerpos generalmente contiene de aproximadamente 10 microgramos (μg) por mililitro (ml) a aproximadamente 100 miligramos (mg) por ml de anticuerpo como principio activo por volumen de la composición, y más preferiblemente contiene de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml (es decir, de aproximadamente 0,1% a 1% en peso).

Una composición terapéutica en otra realización contiene un péptido de la presente invención, generalmente en una cantidad de al menos 0,1% enpeso del péptido por peso de la composición terapéutica total. Un porcentaje en peso es una proporción en peso del péptido a la composición total. Así, por ejemplo, 0,1% en peso es 0,1 gramos de péptido por 100 gramos de composición total.

Preferiblemente, una composición terapéutica que contiene péptidos generalmente contiene de aproximadamente 10 microgramos (μg) por mililitro (ml) a aproximadamente 100 miligramos (mg) por ml de péptido como principio activo por volumen de la composición, y más preferiblemente contiene de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml (es decir, de aproximadamente 0,1% a 1% en peso).

En otro aspecto, la presente invención contempla las composiciones y los compuestos de la invención para su uso en los procedimientos terapéuticos descritos en la presente. A la vista del beneficio de la utilización de anticuerpos

monoclonales humanos in vivo en pacientes humanos, los anticuerpos descritos en la presente están particularmente bien adaptados para un uso in vivo como reactivo terapéutico para bloquear o inhibir la función de la molécula diana a la cual se une el anticuerpo. Los péptidos derivados de los anticuerpos monoclonales descritos en la presente también se contemplan para su uso en los procedimientos terapéuticos. El procedimiento comprende poner en contacto una muestra, de la cual se cree que contiene la molécula diana, con una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal humano o un péptido de esta invención que se une a la molécula diana.

Para las modalidades in vivo, el procedimiento comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efica de una composición fisiológicamente tolerable que contiene un anticuerpo monoclonal humano o un péptido de la invención.

Los intervalos de dosificación para la administración de los anticuerpos monoclonales y los péptidos de la invención son los intervalos que sean lo suficientemente grandes para producir el efecto deseado, en el que los síntomas de la enfermedad mediados por la molécula diana se mejoran. La dosificación no debe ser tan grande como para provocar efectos secundarios adversos, tales como síndromes de hiperviscosidad, edema pulmonar, insuficiencia cardíaca congestiva y similares. En general, la dosificación variará según la edad, el trastorno, el sexo y el alcance de la enfermedad en el paciente, y puede ser determinada por los expertos en la técnica. La dosificación puede ser ajustada por el médico encargado si se produce cualquier complicación.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de esta invención generalmente es una cantidad del anticuerpo que, cuando se administra en una composición fisiológicamente tolerable, es suficiente para lograr una concentración plasmática de aproximadamente 0,1 microgramos (μg) por mililitro (ml) a aproximadamente 100 μg/ml, preferiblemente de aproximadamente 1 μg/ml a aproximadamente 5 μg/ml, y normalmente de aproximadamente 5 μg/ml. Dicho de otro modo, la dosificación puede variar de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, lo más preferiblemente de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, en una o más administraciones de dosis diarias, de uno o varios días.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de esta invención es generalmente una cantidad del péptido que, cuando se administra en una composición fisiológicamente tolerable, es suficiente para lograr una concentración plasmática de aproximadamente 0,1 microgramos (μg) por mililitro (ml) a aproximadamente 100 μg/ml, y preferiblemente de aproximadamente 1 μg/ml a aproximadamente 10 μg/ml. Dicho de otro modo, la dosificación puede variar de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg, y preferiblemente de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, en una o más administraciones de dosis diarias, de uno o varios días.

Los anticuerpos monoclonales humanos o los péptidos de la invención pueden administrarse por vía parenteral mediante inyección o mediante infusión gradual a lo largo de un periodo de tiempo. Aunque, en el cuerpo, la molécula diana generalmente es accesible mediante administración sistémica y, por tanto, se trata con mayor frecuencia mediante una administración intravenosa de las composiciones terapéuticas, se contemplan otros tejidos y medios de administración cuando exista la probabilidad de que el tejido diana contenga la molécula diana. Así, los anticuerpos monoclonales humanos o los péptidos de la invención pueden administrarse por vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavitaria, transdérmica, y pueden administrarse por medios peristálticos.

Las composiciones terapéuticas que contienen un anticuerpo monoclonal humano o un péptido de la invención se administran de modo convencional por vía intravenosa, tal como mediante inyección de una dosis unitaria, por ejemplo. La expresión "dosis unitaria", cuando se emplea haciendo referencia a una composición terapéutica de la presente invención, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificación unitaria para el sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de principo activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido, es decir, vehículo o portador.

Las composiciones se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad que se va a administrar depende del sujeto que se va a tratar, de la capacidad del sistema del sujeto para utilizar el principio activo, y del grado de efecto terapéutico deseado. Las cantidades precisas del ingrediente activo que se van a administrar dependen del criterio del médico y son particulares de cada individuo. Sin embargo, en la presente se describen intervalos de dosificación adecuados para la aplicación sistémica y dependen de la vía de administración. Los regímenes adecuados para la administración también son variables, pero son tipificados por una administración inicial, seguida de dosis repetidas a intervalos de una o más horas con la posterior inyección u otra administración. Como alternativa, se contempla una infusión intravenosa continua suficiente para mantener las concentraciones en la sangre en los intervalos especificados para las terapias in vivo.

Puede utilizarse un anticuerpo monoclonal humano anti-integrina αIIbβ3 o un péptido derivado de este que contiene un sitio de unión a la integrina αIIbβ3 para modular in vivo o in vitro la función de la integrina αIIbβ3 sobre las plaquetas. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal humano o el péptido puede utilizarse en una composición farmacéuticamente aceptable que, cuando se administra a un sujeto humano en una cantidad eficaz, es capaz de inhibir la agregación de las plaquetas y, con ello, disminuir la tasa de formación de trombos. Así, la administración in vivo de un anticuerpo monoclonal humano anti-integrina αIIbβ3 que inhibe la agregación plaquetaria puede utilizarse in vivo para modular cualquier respuesta fisiológica iniciada por la adhesión plaquetaria, tal como la coagulación y algunas respuestas inflamatorias.

Cuando este procedimiento se realiza in vivo, una cantidad eficaz de una composición de anticuerpos o péptidos que contiene un diluyente fisiológicamente tolerable y moléculas de anticuerpos que inmunorreaccionan con la integrina αIIbβ3 y que inhiben la agregación plaquetaria se administra por vía intravenosa a un mamífero, y el mamífero se mantiene durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que las moléculas de los anticuerpos inmunorreaccionen con cualquier integrina αIIbβ3 presente y formen un producto de inmunorreacción, y para permitir que el sitio de unión que contiene el péptido se una a la integrina αIIbβ3 y forme un complejo de péptido-receptor, de modo que el ligando normal ya no pueda unirse al receptor.

Los anticuerpos específicos de la integrina αIIbβ3 de esta invención son útiles como agentes terapéuticos antitrombóticos. Los anticuerpos (o sus fragmentos) pueden utilizarse para inhibir la agregación plaquetaria y la formación de trombos. Los anticuerpos también pueden utilizarse para inhibir las variaciones de flujo cíclicas que son provocadas por la agregación plaquetaria y que puede preceder a la formación o la reformación de trombos. Los anticuerpos pueden utilizarse en una diversidad de situaciones en las que debe evitarse la formación o la reformación (reoclusión) de trombos. Por ejemplo, el anticuerpo puede administrarse a un individuo (por ejemplo, un mamífero, tal como un ser humano) para prevenir la trombosis en la embolia pulmonar, ataques isquémicos transitorios (TIA), trombosis de venas profundas, cirugía de bypass coronario, y cirugía para insertar una válvula o un vaso prostético (por ejemplo, en un injerto de vasos autólogo, no autólogo o sintético). Los anticuerpos de la presente invención también pueden administrarse a un individuo para prevenir la agregación plaquetaria y la trombosis en procedimiento de angioplastia realizados con balón, aterectomía coronaria, angioplastia de láser u otros procedimientos adecuados. Los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse antes de un procedimiento de angioplastia (preangioplastia), durante la angioplastia o después de la angioplastia (posangioplastia). Este tratamiento puede prevenir la trombosis y, con ello, reducir la tasa de complicaciones trombóticas después de una angioplastia, tal como la muerte, infarto de miocardio o acontecimientos isquémicos recurrentes que necesiten PTCA o cirugía de bypass coronario.

La agregación de las plaquetas activa la cascada de la coagulación y produce una red de fibrina más estable y un coágulo oclusor, que puede ser lisado por agentes trombolíticos. El anticuerpo puede administrarse a un individuo (por ejemplo, un ser humano) solo o junto con un agente trombolítico, tal como un activador del plasminógeno (por ejemplo, un activador del plasminógeno tisular, uroquinasa o estreptoquinasa, un activador del plasminógeno tisular recombinante) o un anticoagulante o un agente antiplaquetas, tal como aspirina, heparina o un anticoagulante de cumarina (por ejemplo, warfarina), para prevenir o reducir la reoclusión que puede producirse después de una trombolisis y para acelerar la lisis de los coágulos. El anticuerpo o el fragmento puede administrarse antes, al mismo tiempo o después de la administración del agente trombolítico o anticoagulante, en cantidades suficientes para prevenir la agregación plaquetaria que puede producir una reoclusión.

Una cantidad eficaz (por ejemplo, una cantidad suficiente para la inhibición de la agregación plaquetaria y, con ello, la inhibición de la formación de trombos) del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo puede administrarse por vía parenteral, preferiblemente por vía intravenosa, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como disolución salina estéril. Puede incluirse un medio tamponado. La formulación de anticuerpos puede contener suficientes aditivos adicionales, tales como un estabilizante (por ejemplo, Polysorbate 80, USP/NF). El anticuerpo puede administrarse en una única dosis, de modo continuo o en múltiples infusiones (por ejemplo, una inyección en embolada, seguida de una infusión continua). Como alternativa, el anticuerpo puede administrarse mediante un mecanismo de liberación controlada (por ejemplo, mediante un polímero o un sistema de administración en parches) o mediante cualquier otro procedimiento adecuado. La cantidad que se va a administrar dependerá de una diversidad de factores, tales como los síntomas clínicos, el peso del individuo, y si se están administrando otros fármacos (por ejemplo, agentes trombolíticos).

Las inmunoglobulinas específicas de la integrina αIIbβ3, de esta invención también son útiles para la formación de imágenes de trombos. Para este objetivo, en general se prefieren fragmentos de anticuerpos. Tal como se describió anteriormente, puede diseñarse un gen de cadena pesada quimérico en forma truncada para producir un fragmento de inmunoglobulina quimérica (por ejemplo, Fab, Fab', o F(ab')2) para la formación de imágenes de inmunocentelleo. Estas moléculas pueden marcarse de modo directo o a través de un agente quelante acoplado, tal como DTPA, con radioisótopos tales como 131Yodo, 125Yodo, 99Tecnecio o 111Indio, para producir agentes de radioinmunocentelleo. Como alternativa, puede introducirse un dominio de unión a un radiometal (quelante) en el

sitio del anticuerpo quimérico para proporcionar un sitio para el marcaje. Así, puede diseñarse una inmunoglobulina como una proteína que tiene una región variable específica de plaquetas no humana, una región constante humana (preferiblemente truncada), y umn dominio de unión a metales derivado de una proteína de unión a metales, tal como metalotioneína.

La inmunoglobulina específica de la integrina αIIbβ3 se administra a un paciente sospechoso de tener un trombo. Después de un tiempo suficiente para permitir que la inmunoglobulina marcada se localice en el sitio del trombo, la señal generada por el marcador se detecta mediante un dispositivo de fotobarrido, tal como una cámara gamma. La señal detectada después se convierte en una imagen del trombo. La imagen hace posible localizar el trombo in vivo y diseñar una estrategia terapéutica apropiada.

Los siguientes ejemplos ilustran ejemplos de realizaciones de la presente invención y no limitan la memoria descriptiva ni las reivindicaciones de ningún modo.

Ejemplos

Línea celular, proteínas y péptidos

Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) se obtuvieron en Biowhittaker (Walkersville, MA) y se cultivaron en medio EGM-2 (Biowhittaker) suministrado con las células. La integrina αIIbβ3 se obtuvo en Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN). Las integrinas αvβ3 y αvβ5 se obtuvieron en Chemicon (Temecula, CA). El fibrinógeno humano se obtuvo en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Los péptidos utilizados en este estudio fueron sintetizados por Peptron (Taejon, Corea). El fibrinógeno humano y los péptidos se biotinilaron utilizando EZ-LinkPFP-biotina (Pierce, Rockford, IL) siguiendo las instrucciones del fabricante. El abciximab (ReoPro) fue obtenido en Eli Lilly (Indianápolis, IN).

Generación de bancos

Se preparó el ARN total de la médula ósea de seis donantes sanos utilizando TRI REAGENT (Molecular Research Center, Cincinnati, OH). La primera hebra de ADNc se sintetizó utilizando el sistema de preamplificación SUPERSCRIPT con cebado de oligo(dT) (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Un fragmento de ADNc que codifica parte de FR3, HCDR3 aleatorizado, y FR4 de VH unido a CH1 se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores neo-rad-f (GTG TAT TAC TGT GCG AGA GTG GGG NNK NNK NNK CGT GCC GAC NNK NNK NNK TAC GCT ATG GAC GTC TGG GGC) (SEQ ID NO:9) y dpseq (AGAAGC GTA GTC CGG AAC GTC) (SEQ ID NO:10) y el vector de fágmido pComb3X-TT (Barbas, C. F., 3º, Burton, D. R., Scott, J. K., y Silverman, G. J. (2001), Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) como

molde. Para la amplificación del fragmento de ADNc que codifica FR1 a FR3 de VH, el ADNc de médula ósea humana preparado se sometió a una PCR utilizando los cebadores DP-47N-term (GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA) (SEQ ID NO:11) y DP-47FR3 (CAC TCT CGC ACA GTAATA CAC GGC CGT GTC CTC GGC TCT) (SEQ ID NO:12). Todas las amplificaciones se realizaron bajo condiciones de PCR convencionales utilizando Taq polimerasa (Pharmacia, Piscataway, NJ). Los dos fragmentos de ADNc se ensamblaron mediante PCR de extensión de solapamiento utilizando los cebadores lead-VH (GGC CAT GGC TGG TTG GGC AGC) (SEQ ID NO:13) y dp-Ex (GAG GAG GAG GAG GAG GAG AGAAGC GTA GTC CGG AAC GTC) (SEQ ID NO:14). Un ADNc de cadena ligera kappa human DPK-26 previamente seleccionado en el vector de fágmido pComb3X se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores ompseq (AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG) (SEQ ID NO:15) y leadB (GGC CAT GGC TGG TTG GGC AGC) (SEQ ID NO:16). Los ADNc que codifican el banco de fragmentos de cadena pesada y la cadena ligera se condensaron mediante PCR de extensión de solapamiento utilizando los cebadores ompseq y dp-Ex. El banco que codifica Fab resultante se digirió con Sfi I (Roche, Indianápolis, IN), se acopló en el vector de fágmido pComb3X, y se transformó en la cepa ER2537 de E. coli (New England Biolabs, Beverly, MA) según se ha descrito (Barbas, C. F., 3º, Burton,

D. R., Scott, J. K., y Silverman, G. J. (2001), Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Selección del banco

Se realizó un total de siete rondas de inmunoadsorción (Barbas, C. F., 3º, Burton, D. R., Scott, J. K., y Silverman, G.

J. (2001), Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). Primero se realizaron cinco rondas de inmunoadsorción contra la integrina αIIbβ3 humana inmovilizada utilizando 100 ng de proteína en 50 μl de tampón de metal (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 137 mM, KCl 1 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1 mM y MnCl2 1 mM) para el revestimiento, Tween 20 al 0,05% en TBS (disolución salina tamponada con Tris) para el lavado, y tripsina 10 mg/ml (Becton-Dickson, Franklin Lakes, NJ) en TBS para la elución. Se emplearon placas de 96 pocillos Costar 3690 (Corning, NY) para la inmunoadsorción. La tripsinización se realizó durante 30 min a 37 ºC. Para la sexta ronda de inmunoadsorción, se emplearon 25 ng de proteína en tampón de metal para el revestimiento, y Tween 20 al 0,5% en PBS para el lavado. Para la séptima ronda de

inmunoadsorción, se emplearon 12,5 ng de proteína para el revestimiento. La placa se lavó cinco veces en la primera ronda, diez veces en la segunda y tercera ronda, y 15 veces en las cuatro rondas restantes. Se controló el agrupamiento de fagos de salida de cada ronda mediante ELISA de fagos empleando anti-M13 de oveja conjugado con peroxidasa de rábano (Pharmacia) como anticuerpo secundario. Después de la última ronda de inmunoadsorción, los fagos se produjeron a partir de clones individuales cultivados en placas de salida y se ensayó la unión a integrina αIIbβ3 mediante ELISA de fagos según se ha descrito (Barbas, C. F., 3º, Burton, D. R., Scott, J. K., y Silverman, G. J. (2001), Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Reorganización de la cadena ligera y selección

Se amplificaron ADNc que codifican Vκ y Vλ a partir del ADNc de médula ósea humana preparado utilizando un panel de cebadores previamente publicado (Barbas, C. F., 3º, Burton, D. R., Scott, J. K., y Silverman, G. J. (2001), Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York), que comprende cebadores sentido que se hibridan con secuencias que codifican los aminoácidos N-terminales de las diversas familias de Vκ y Vλ, y cebadores inversos que se hibridan con secuencias que codifican los aminoácidos Cterminales de FR4 de Vκ y Vλ, respectivamente, que están muy conservados (Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., y Foeller, C. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, Natl. Inst. Health, Bethesda). Las secuencias codificadoras de Cκ y Cλ se prepararon como se ha descrito previamente (Barbas, C. F., 3º, Burton, D. R., Scott, J. K., y Silverman, G. J. (2001), Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) y se condensaron con las secuencias codificadoras de Vκ y Vλ, respectivamente, mediante una PCR de extensión de solapamiento utilizando los cebadores RSC-F (GAG GAG GAG GAG GAG GAG GCG GGG CCC AGG CGG CCG AGC TC) (SEQ ID NO: 17) y lead-B (GGC CAT GGC TGG TTG GGC AGC) (SEQ ID NO: 18). Se emplearon dos estrategias de clonación para reemplazar la cadena ligera kappa humana DP-26 en el Fab seleccionado. En una estrategia, el ADNc de la cadena ligera kappa humana DPK-26 se retiró del agrupamiento de vectores de fágmidos obtenido después de la última ronda de inmunoadsorción mediante una digestión de restricción con SacI y XabI (New England Biolabs). Después, el banco que codifica las cadenas ligeras humanas se digirió con las mismas enzimas de restricción, se acopló en el vector de fágmido preparado, y se transformó en la cepa ER2537 de E. coli. En la segunda estrategia, el ADNc que codifica el fragmento de cadena pesada se amplificó a partir del agrupamiento de vectores de fágmidos obtenido después de la última ronda de inmunoadsorción utilizando los cebadores lead-HV y dpseq, y se condensó con el banco que codifica las cadenas ligeras humanas mediante una PCR de extensión de solapamiento utilizando los cebadores ompseq y dp-EX. El banco que codifica Fab resultante se digirió con SfiI, se acopló en el vector de fágmido pComb3X, y se transformó en la cepa ER2537 de E. coli según se ha descrito previamente (Barbas, C. F., 3º, Burton, D. R., Scott, J. K., y Silverman, G. J. (2001), Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). Después de mezclar los dos bancos de cadenas ligeras, se realizaron tres rondas de inmunoadsorción, cada una con 12,5 ng de integrina αIIbβ3 humana revestida. La placa se lavó 15 veces en cada ronda. Después de la última ronda de inmunoadsorción, se produjeron fagos a partir de clones individuales cultivados sobre placas de salida y se ensayaron para la unión a la integrina αIIbβ3 mediante ELISA de fagos, según se ha descrito previamente (Barbas, C. F., 3º, Burton, D. R., Scott, J. K., y Silverman, G. J. (2001), Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Elisa

Para la producción de Fab soluble se siguieron procedimientos publicados (Barbas, C. F., 3º, Burton, D. R., Scott, J. K., y Silverman, G. J. (2001), Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). Brevemente, se dejó que colonias seleccionadas crecieran en 5 ml de supercaldo durante 6 h a 37 ºC. El crecimiento continuó durante la noche después de añadir IPTG (isopropil-beta-Dtiogalactopiranósido, Sigma-Aldrich) hasta una concentración final de 1 mM. Para cada pocillo de una placa de 96 pocillos Costar 3690, 100 ng de la integrina αIIbβ3 en 50 μl de tampón de metal se revistieron a 4 ºC durante la noche. La placa se bloqueó mediante la adición de leche desnatada al 3% (en p/v) en TBS, seguido de una incubación durante 1 h a 37 ºC. Después se añadieron secuencialmente 50 μl del sobrenadante del cultivo diluido con el mismo volumen de leche desnatada al 3% (en p/v) en TBS, 50 μl de mAb ant-HA de rata conjugado con peroxidasa de rábano 3F10 (Roche) diluido hasta 1 μg/ml en leche desnatada al 3% en TBS, y 50 μl de disolución de sustrato ABTS (Barbas, C. F., 3º, Burton, D. R., Scott, J. K., y Silverman, G. J. (2001), Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). Antes de añadir los reactivos, la placa se lavó cinco veces con Tween 20 al 0,05% en TBS. La placa se incubó durante 1 h a 37 ºC en cada etapa. Para comprobar la reactividad cruzada del Fab seleccionado, se realizaron ensayos en paralelo con las integrinas revestidas αvβ3, αvβ5, y α5β1 utilizando las mismas condiciones que las descritas anteriormente.

Ensayo de inhibición de la unión de fibrinógeno

Se revistieron los pocillos de una placa de 96 pocillos Costar 3690 con 100 ng de la integrina αIIbβ3 en 50 μl de tampón de metal a 4 ºC durante la noche. La placa se lavó dos veces con agua y se bloqueó con 160 μl de leche desnatada al 3% (en p/v) en TBS durante 1 hora a 37 ºC. Después de haber lavado brevemente la placa con agua, se añadieron a cada pocillo 50 μl de sobrenadante del cultivo que contiene Fab, Fab RAD87 purificado y abciximab,

o péptidos sintéticos mezclados con 50 μl de fibrinógeno biotinilado 1,2 μM en leche desnatada al 3% (en p/v) en TBS. Las concentraciones finales se ajustaron entre 1,3 x 10-8 M y 8,0 x 10-7 M de Fab, y entre 8,9 x 10-8 M y 9,1 x 10-5 M de péptidos sintéticos. Después de una incubación durante 2 h a 37 ºC, seguido de diez lavados con agua y cinco lavados con Tween 20 al 0,05% en TBS, se añadieron 50 μl de estreptavidina-HRP 0,5 μg/ml (Pierce) diluido en leche desnatada al 3% (en p/v) en TBS, y se incubó durante 1 h a 37 ºC. Después de lavar como se indicó anteriormente, se añadieron 50 μl de disolución de sustrato ABTS (Barbas, C. F., 3º, Burton, D. R., Scott, J. K., y Silverman, G. J. (2001), Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). El experimento se repitió tres veces en cada concentración para obtener el valor medio y la desviación estándar.

Citometría de flujo

Se extrajo sangre periférica de un voluntario sano y se recogió en un tubo ACD (Becton Dickinson, San José, CA). Las HUVEC se trataron durante 5 min con tripsina al 0,05% (en p/v), EDTA 0,53 mM (Life Technologies), se recogieron mediante centrifugación a 500 g durante 2 min, y se resuspendieron en BSA al 1% (en p/v) en PBS (disolución salina tamponada con fosfato). Después, se añadió el Fab RAD87 o Fab abciximab a las células resuspendidas en 40 μl de BSA al 1% (en p/v) en PBS o 40 μl de sangre periférica para alcanzar una concentración final de 0,2 μM. Después de una incubación durante 40 min a temperatura ambiente, seguido de dos lavados con BSA al 1% (en p/v) en PBS, se añadieron 10 μl de anticuerpos policlonales anti-IgG humana conjugados con FITC (Sigma-Aldrich) diluidos en 750 μl de BSA al 1% (en p/v) en PBS y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente. Después de lavar dos veces con BSA al 1% (en p/v) en PBS se realizó una citometría de flujo utilizando un instrumento FACstar de Becton Dickinson (San José, CA).

Ensayo de agregación plaquetaria

Se recogió sangre humana periférica como se describió anteriormente. Se obtuvo un plasma rico en plaquetas (PRP) a partir de la sangre periférica recogida mediante centrifugación a 135 g durante 15 min. Una posterior centrifugación a 1.500 g durante 15 m produjo un plasma pobre en plaquetas (PPP). Mezclando el PRP y el PPP, se preparó un plasma acondicionado de 300.000-350.000 plaquetas por 1 μl de plasma. A 435 μl del plasma acondicionado se le añadieron los mAb RAD87, abciximab y péptidos disueltos en 15 μl de PBS hasta una concentración final de entre 20 nM y 100 nM de mAb y de entre 0,4 μM y 90 μM de péptidos. El ensayo de agregación plaquetaria se realizó como se ha descrito previamente (Klinkhardt, U., Kirchmaier, C. M., Westrup, D., Breddin, H. K., Mahnel, R., Graff, J., Hild, M., y Harder, S. (2000), Differential in vitro effects of the platelet glycoprotein IIb/IIIa inhibitors abxicimab or SR121566A on platelet aggregation, fibrinogen binding and platelet secretory parameters, Thromb. Res., 97, 201-207) utilizando un lumiagregómetro de sangre completa (Chrono-log, Havertown, PA). Se controló la impedancia de cada muestra hasta que se estableció una línea de base estable (<5 mV de deriva por minuto). Para inducir la agregación plaquetaria se añadieron 9 μl de una disolución de ADP hasta alcanzar una concentración final de 20 μM. El aumento en la impedancia a través de un par de electrodos a lo largo del tiempo se transmitió a través de una interfase hasta un ordenador personal para el análisis (AGGRO/LINK, Chrono-log).

Medición de la afinidad

La constante de disociación de los Fab RAD87 y abciximab hacia la integrina αIIbβ3 se determinó con un ELISA competitivo, según se ha descrito previamente (Djavadi-Ohaniance, L., Goldberg, M. E., y Firguet, B. (1996), Measuring antibody affinity in solution, en Antibody Engineering (McCafferty, J., Hoogenboom, H. R., y Chiswell, J., eds.), pp. 77-98, IRL Press, Oxford; Y, K., Chung, J., Kim, H., Kim, I., Jung, H., Kim, J., Choi, I., Suh, P., y Chung, H. (1999), Expression and characterization of anti-NCA-95 scFv (CEA 79 scFv) in a prokaryotic expression vector modified to contain a SfiI and NotI site, Hybridoma, 18, 243-249). Brevemente, los pocillos de una placa de 96 pocillos Costar 3690 se revistieron con 250 ng de la integrina αIIbβ3 en 50 μl de tampón de metal a 4 ºC durante la noche. La placa se lavó conco veces con agua y se bloqueó con 160 μl de BSA al 2% en PBS durante 2 horas a 37 ºC. El Fab RAD87 o el Fab abciximab purificado se mezcló con la integrina αIIbβ3 hasta alcanzar una concentración final de 2 x 10-10 M. Las concentraciones finales de la integrina αIIbβ3 se ajustaron entre 1 x 10-7 M y 1 x 10-10 M. Estas mezclas se incubaron durante la noche para permitir alcanzar el equilibrio. Después de lavar brevemente la placa con agua, las mezclas de anticuerpo-antígeno se añadieron a los pocillos y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. La placa se lavó tres veces con Tween 20 al 0,05% en PBS antes de añadir anticuerpo anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano 200 ng/ml (Pierce). Después de una incubación a temperatura ambiente durante 1 h, la placa se lavó cinco veces con Tween 20 al 0,05% en PBS antes de añadir 50 μl de disolución de sustrato ABTS (Barbas, C. F., 3º, Burton, D. R., Scott, J. K., y Silverman, G. J. (2001), Phage Display:

A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). Después de una incubación a 37 ºC durante 2 h, la reacción se detuvo mediante la adición de 50 μl de HCl 3 N. Se midió la absorbancia de cada pocillo a 405 nm en un lector de placas de ELISA. Se trazó una gráfica de Scatchard con υ/[Ag] en el eje de ordenadas y υ en el eje de abscisas. [Ag] es la concentración del antígeno libre; υ es la fracción del anticuerpo unido, que se obtiene dividiendo la absorbancia en presencia de una concentración definida de antígeno soluble entre la absorbancia en ausencia de antígeno soluble. La pendiente de una línea recta en la gráfica de Scatchard es igua a 1/Kd.

Generación y selección de un banco de Fab humanos sintéticos/no expuestos híbrido

El objetivo de este estudio es generar anticuerpos humanos sintéticos que discriminan entre la integrina αIIbβ3 y otras integrinas que se unen a RGD, en especial la integrina αvβ3, mediante el injerto de un motivo RAD flanquedo en ambos lados por tres restos aminoácidos aleatorizados en HCRD3. En primer lugar, se empleó un motivo RAD, en lugar de un motivo RGD, como secuencia de reconocimiento central. En segundo lugar, se retiró un puente disulfuro CX9C que rodea a la secuencia de reconocimiento central en ambos estudios previos. En tercer lugar, el banco de HCDR3 sintético se injertó en un banco de VH humano no expuesto amplificado a partir de ADNc de médula ósea humana. Así, además de su aleatorización en HCDR3, se introdujo un segundo nivel de complejidad del banco mediante la diversificación de VH.

Se generó un banco de anticuerpos humanos con la secuencia de HCDR3 aleatorizada VGXXXRADXXXYAMDV (SEQ ID NO:3), en la que X es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales habituales, en el vector de fágmido pComb3X. VH, el fragmento que codifica FR1 a FR3 del dominio variable de cadena pesada, se amplificó mediante PCR utilizando cebadores específicos del gen de cadena pesada variable humano DP-47 y ADNc de médula ósea humana de seis donantes sanos como molde. Este banco de fragmentos de cadena pesada sintéticos/no expuestos híbrido inicialmente se apareó con una cadena ligera kappa humana DPK-26 previamente seleccionada. El banco de Fab resultante se clonó en el vector de fágmido pComb3X, produciendo una complejidad de 1 x 109 transformantes independientes. Clones elegidos de forma aleatoria del banco no seleccionado confirmaron la variedad deseada en secuencias de VH y HCDR3. Después de siete rondas de inmunoadsorción sobre la integrina αIIbβ3 inmovilizada, más del 80% de los clones seleccionados se unían a la integrina αIIbβ3, tal como se analizó mediante ELISA de fagos (Barbas, C. F., 3º, Burton, D. R., Scott, J. K., y Silverman, G. J. (2001), Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Las secuencias que codifican el fragmento de cadena pesada seleccionadas se sometieron a una segunda etapa de selección basada en la reordenamiento de la cadena ligera. Para esto, la cadena ligera kappa humana DPK-26 fue sustituida por un banco de cadenas ligeras kappa y lambda humanas amplificado a partir de ADNc de médula ósea humana. El banco de cadenas ligeras humanas no expuestas resultante de nuevo se clonó en el vector de fágmido pComb3X, produciendo una complejidad de 7 x 108 transformantes independientes. Después de tres rondas de inmunoadsorción sobre la integrina αIIbβ3 humana inmovilizada, todos los clones seleccionados se unían a la integrina αIIbβ3, según se analizó mediante ELISA de fagos.

Diez clones individuales que mostraron la unión más fuerte se analizaron posteriormente mediante secuenciación de ADN. Todos los clones menos uno contenían un bucle constreñido por un puente disulfuro en HCDR3 con la secuencia consenso V (V/W) CRAD (K/R) RC (SEQ ID NO:4) (tabla 2). La excepción, el clon RAD1, tenía la correspondiente secuencia THSRADRRE (SEQ ID NO:1) (tabla 2). Todos los clones mostraron un fragmento de cadena pesada VH DP-47. Mientras que cuatro clones presentaban la cadena ligera kappa humana DPK-26 original, seis clones presentaban cadenas ligeras kappa o lambda humanas derivadas del banco de cadenas ligeras humanas no expuestas.

Caracterización bioquímica y funcional de Fab humanos seleccionados

Se ensayaron Fab expresados a partir de los diez clones seleccionados para determinar su reactividad con integrinas que se unen a RGD mediante ELISA. Todos los Fab se unen con fuerza a la integrina αIIbβ3 humana, pero no a las integrinas humanas αvβ3, α5β1, y αvβ5 (figura 1). Para comprobar su reactividad hacia la integrina αIIbβ3 nativa expresada sobre la superficie de plaquetas humanas, todos los Fab se analizaron posteriormente mediante citometría de flujo. Se descubrió que todos los Fab seleccionados se unían a plaquetas humanas, mientras que los Fab irrelevantes no. Puesto que la interacción entre la integrina αIIbβ3 y el fibrinógeno es mediada, en parte, por el motivo RGD, después se ensayó si los Fab seleccionados podían inhibir esta interacción proteína-proteína. Para este objetivo, se estableció un ensayo ELISA competitivo basado en la integrina αIIbβ3 inmovilizada, fibrinógeno biotinilado y avidina-HRP. Los Fab seleccionados se mezclaron con el fibrinógeno biotinilado a diferentes concentraciones y despueés se incubaron con la integrina αIIbβ3 inmovilizada. Se empleó avidina-HRP para detectar el fibrinógeno biotinilado unido a la integrina αIIbβ3 inmovilizada. Todos los Fab seleccionados mostraron una potente inhibición de la interacción de la integrina αIIbβ3 y el fibrinógeno.

Después los inventores se centraron en el Fab RAD87, que demostró la unión más fuerte a la integrina αIIbβ3 (figura

1). El Fab RAD87 se expresó en E. coli y se purificó como se ha descrito previamente (Barbas, C. F., 3º, Burton, D. R., Scott, J. K., y Silverman, G. J. (2001), Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). Tal como reveló una citometría de flujo, el Fab RAD87 se une solo a plaquetas humanas pero no a células HUVEC, que principalmente expresan la integrina αvβ3 (figura 2). Por contraste, el Fab abciximab (ReoPro, Eli Lilly, Indianápolis, IN) se une a las plaquetas y a las células HUVEC (figura 2), lo cual confirma su reactividad cruzada documentada con las dos integrinas β3 (Bougie, D. W., Wilker, P. R., Wuitschick, E. D., Curtis, B. R., Malik, M., Levine, S., Lind, R. N., Pereira, J., y Aster, R. H. (2002), Acute thrombocytopenia after treatment with tirofiban or eptifibatide is associated with antibodies specific for ligandoccupied GPIIb/IIIa, Blood, 100, 2071-2076). El Fab RAD87 bloquea la interacción entre la integrina αIIbβ3 y el fibrinógeno de una manera dependiente de la dosis, con una CI50 de 8,0 x 10-8 M. En un experimento paralelo, el Fab abciximab mostró una CI50 de 9,0 x 10-8 M (figura 3A, tabla 3). Basándose en un ELISA competitivo (Suzuki, K., Sato, K., Kamohara, M., Kaku, S., Kawasaki, T., Yano, S., e Iizumi, Y. (2002), Comparative studies of a humanized anti-glycoprotein IIb/IIIa monoclonal antibody, YM337, and abciximab on in vitro antiplatelet effect and binding properties, Biol. Pharm. Bull., 25, 1-006-1012; Co, M. S., Yano, S., Hsu, R. K., Landolfi, N. F., Vasquez, M., Cole, M., Tso, J. T., Bringman, T., Laird, W., Hudson, D., et al. (1994), A humanized antibody specific for the platelet integrin gpIIb/IIIa, J. Immunol., 152, 2968-2976), el valor de Kd de la interacción del Fab RAD87 monovalente/integrina αIIbβ3 era de 3,3 x 10-9 M (tabla 3). El mismo ensayo produjo un valor de Kd de 1,1 x 10-9 M para la interacción del Fab abciximab monovalente/integrina αIIbβ3, comparado con el valor publicado de 6,2 x 10-9 M (tabla 3) (Tam, S. H., Sassoli, P. M., Jordan, R. E., y Nakada, M. T. (1998), Abciximab (ReoPro, chimeric 7E3 Fab) demonstrates equivalent affinity and functional blockade of glycoprotein IIb/IIIa and alpha (v) beta3 integrins, Circulation, 98, 10851091).

Puesto que la interacción entre la integrina αIIbβ3 y el fibrinógeno es una etapa fundamental para la agregación plaquetaria, los inventores ensayaron si el Fab RAD87 puede inhibir la agregación plaquetaria ex vivo. La agregación plaquetaria fue inducida y controlada mediante un agregómetro plaquetario mediante la adición de ADP hasta una concentración final de 20 μM a plasma acondicionado preparado a partir de sangre periférica. Se descubrio que el Fab RAD87 inhibía con gran potencia la agregación plaquetaria, con una CE50 de 60 nM o 3 μg/ml (figura 4, tabla 3). En un experimento paralelo, se determinó que la CE50 del Fab abciximab era de 45 nM, habiéndose divulgado previamente que era de 34 nM (Klinkhardt, U., Kirchmaier, C. M., Westrup, D., Breddin, H. K., Mahnel, R., Graff, J., Hild, M., y Harder, S. (2000), Differential in vitro effects of the platelet glycoprotein IIb/IIIa inhibitors abxicimab or SR121566A on platelet aggregation, fibrinogen binding and platelet secretory parameters, Thromb. Res., 97, 201-207) cuando la agregación plaquetaria se induce a una concentración de ADP 5 μM.

Caracterización bioquímica y funcional de péptidos sintéticos derivados de secuencias de HCDR3 seleccionadas

Se sintetizaron de modo químico cuatro nonapéptidos cuyas secuencias se derivaron de las secuencias de HCDR3 seleccionadas del Fab de unión a integrina αIIbβ3. Este panel incluye tres péptidos cíclicos, VWCRADKRC (SEQ ID NO:6), VWCRADRRC (SEQ ID NO:5), y VVCRADRRC (SEQ ID NO:7), y el péptido lineal THSRADRRE (SEQ ID NO:19). Utilizando el ensayo de ELISA competitivo descrito anteriormente, se descubrió que todos los péptidos cíclicos inhibían la interacción entre la integrina αIIbβ3 y el fibrinógeno en un intervalo de concentración micromolar. El péptido lineal, así como tres péptidos control (dos con un motivo RAD invertido, VVCDARRRC (SEQ ID NO:20) y THSDARRRE (SEQ ID NO:21), y uno con una secuencia no relacionada) no inhibían la interacción proteínaproteína en el mismo intervalo de concentración (figura 3B). Se determinó que la CI50 de los péptidos cíclicos más potentes, VWCRADRRC (SEQ ID NO:5) y VWCRADKRC (SEQ ID NO:6) era de 1,2 x 10-6 M y 4,2 x 10-6 M, respectivamente. La CI50 del péptido cíclico VVCRADRRC, cuya secuencia se deriva del Fab RAD87, era de 1,1 x 10-5 M, que es dos órdenes de magnitud mayor que la correspondiente CI50 obtenida para el Fab RAD87 (figura 3B).

La figura 5 muestra el ensayo de agregación plaquetaria ex vivo en presencia de diversas concentraciones de VWCRADRRC (SEQ ID NO:5) (A), VVCRADRRC (SEQ ID NO:7) (B), VWCRADKRC (SEQ ID NO:6) (C), y THSDARRRE (SEQ ID NO:19) y los péptidos control (D). De modo sorprendente, los tres péptidos cíclicos, pero no el péptido lineal ni los péptidos control, inhibían completamente la agregación plaquetaria a una concentración de 90 μM. En correlación con el ensayo de interacción de la integrina αIIbβ3/fibrinógeno, el péptido cíclico VWCRADRRC (SEQ ID NO:5), el único péptido que inhibe la agregación plaquetaria a una concentración tan baja como 9 μM (figura 5A), de nuevo demostró ser el inhibidor más potente.

Aunque su aplicación potencial como fármacos antitrombóticos se solapa con el abciximab, los anticuerpos RAD descritos en la presente tienen varias características distintivas. En primer lugar, son anticuerpos humanos, por lo que es menos probable que induzcan una respuesta inmunológica en los pacientes. En segundo lugar, al igual que los peptidomiméticos y péptidos RGD (Xiong, J. P., Stehle, T., Zhang, R., Joachimiak, A., Frech, M., Goodman, S. L., y Arnaout, M. A. (2002), Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3 in complex with an Arg-Gly-Asp ligand, Science, 296, 151-155), los anticuerpos RAD bloquean directamente el sitio de unión a RGD de la integrina αIIbβ3. Por contraste, se cree que el mecanismo del acoplamiento de la integrina αIIbβ3 por el abaciximab,

que no contiene un motivo RGD o similar a RGD, implica un impedimento estérico o alostérico, en lugar de un bloqueo directo del sitio de unión a RGD. En tercer lugar, los anticuerpos RAD se unen selectivamente a la integrina αIIbβ3, mientras que el abciximab no diferencia entre las integrinas αvβ3 y αIIbβ3. La reactividad cruzada del abciximab es análoga a los anticuerpos sintéticos de unión a integrina previos de los inventores (Barbas, C. F., 3º, Languino, L. R., y Smith, J. W. (1993), High-affinity self-reactive human antibodies by design and selection: targeting the integrin ligand binding site, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10003-10007; Smith, J. W., Hu, D., Satterthwait, A., Pinz-Sweeney, S., y Barbas, C. F., 3º (1994), Building synthetic antibodies as adhesive ligands for integrins, J. Biol. Chem., 269, 32788-32795).

La trombocitopenia aguda cuya causa es desconocida es uno de los principales problemas de seguridad con los inhibidores de la integrina αIIbβ3. Tal como se mencionó anteriormente, se ha divulgado que los anticuerpos humanos contra los dominios variables de ratón del abciximab son la principal causa de destrucción de plaquetas en pacientes que desarrollan trombocitopenia grave después de haber recibido abciximab por segunda vez (Curtis,

B. R., Swyers, J., Divgi, A., McFarland, J. G., y Aster, R. H. (2002), Thrombocytopenia after second exposure to abciximab is caused by antibodies that recognize abciximab-coated platelets, Blood, 99, 2054-2059). Este descubrimiento puede hacer necesaria una mayor humanización del abciximab mediante el injerto de sus CDR sobre el marco de dominios variables humanos (Rader, C., Ritter, G., Nathan, S., Elia, M., Gout, I., Jungbluth, A. A., Cohen, L. S., Welt, S., Old, L. J., y Barbas, C. F., 3º (2000), The rabbit antibody repertoire as a novel source for the generation of therapeutic human antibodies, J. Biol. Chem., 275, 13668-13676). Sin embargo, si a esto no le acompaña un ajuste fino del marco basado en información estructural detallada del anticuerpo, esta estrategia de injerto de CDR a menudo produce anticuerpos con una afinidad muy reducida por el antígeno, como en el caso del anticuerpo monoclonal anti-integrina αIIbβ3 YM337, que en la actualidad se está evaluando en ensayos clínicos (Suzuki, K., Sato, K., Kamohara, M., Kaku, S., Kawasaki, T., Yano, S., e Iizumi, Y. (2002), Comparative studies of a humanized anti-glycoprotein IIb/IIIa monoclonal antibody, YM337, and abciximab on in vitro antiplatelet effect and binding properties, Biol. Pharm. Bull., 25, 1006-1012; Co, M. S., Yano, S., Hsu, R. K., Landolfi, N. F., Vasquez, M., Cole, M., Tso, J. T., Bringman, T., Laird, W., Hudson, D., et al. (1994), A humanized antibody specific for the platelet integrin gpIIb/IIIa, J. Immunol., 152, 2968-2976). Puesto que los anticuerpos RAD están formados enteramente por secuencias humanas, excepto por el HCDR3 sintético, se espera que sean menos inmunogénicos que los anticuerpos quiméricos o humanizados. Sin embargo, es posible la inducción de anticuerpos anti-idiotípicos humanos por los anticuerpos RAD de la invención. Puesto que los anticuerpos anti-idiotípicos en la circulación pueden competir con la integrina αIIbβ3 de plaquetas por la unión del anticuerpo RAD, en lugar de unirse a la superficie de las plaquetas a través de los anticuerpos RAD, es razonable suponer que no provocarán una trombocitopenia grave. Un interesante descubrimiento reciente ha sido que los anticuerpos humanos que reconocen selectivamente la integrina αIIbβ3 cuando forma complejos con el tirofibano y la eptifibatida aparecen en un número muy limitado de pacientes que desarrollan una trombocitopenia grave después de ser tratados con fármacos de molécula pequeña (Bougie, D. W., Wilker, P. R., Wuitschick, E. D., Curtis, B. R., Malik, M., Levine, S., Lind, R. N., Pereira, J., y Aster, R. H. (2002), Acute thrombocytopenia after treatment with tirofiban or eptifibatide is associated with antibodies specific for ligand-occupied GPIIb/IIIa, Blood, 100, 2071-2076). En este contexto, sigue siendo posible que los anticuerpos RAD provoquen trombocitopenia mediante la inducción de la presentación de epitopos inmunogénicos sobre la integrina αIIbβ3, puesto que su modo de unión imita a los fármacos de molécula pequeña.

Varios anticuerpos monoclonales (mAb) de ratón específicos para la integrina αIIbβ3, que incluyen LJ-CP3, OPG2, and PAC-1 (Puzon-McLaughlin, W., Kamata, T., y Takada, Y. (2000), Multiple discontinuous ligand-mimetic antibody binding sites define a ligand binding pocket in integrin alpha (IIb) beta (3), J. Biol. Chem., 275, 7795-7802; Kamata, T., Irie, A., Tokuhira, M., y Takada, Y. (1996), Critical residues of integrin alphaIIb subunit for binding of alphaIIbbeta3 (glycoprotein IIb-IIIa) to fibrinogen and ligand-mimetic antibodies (PAC-1, OP-G2, and LJ-CP3), J. Biol. Chem., 271, 18610-18615; Prammer, K. V, Boyer, J., Ugen, K., Shattil, S. J., y Kieber-Emmons, T. (1994), Bioactive Arg-Gly-Asp conformations in anti-integrin GPIIb-IIIa antibodies, Receptor, 4, 93-108; Tomiyama, Y., Brojer, E., Ruggeri, Z. M.., Shattil, S. J., Smiltneck, J., Gorski, J., Kumar, A., Kieber-Emmons, T., y Kunicki, T. J. (1992), A molecular model of RGD ligands. Antibody D gene segments that direct specificity for the integrin alpha IIb beta 3, J. Biol. Chem., 267, 18085-18092; Niiya, K., Hodson, E., Bader, R., Byers-Ward, V, Koziol, J. A., Plow, E. F., y Ruggeri, Z. M. (1987), Increased surface expression of the membrane glycoprotein IIb/IIIa complex induced by platelet activation. Relationship to the binding of fibrinogen and platelet aggregation, Blood, 70, 475-483; Bennett, J. S., Hoxie, J. A., Leitman, S., F., Vilaire, G., y Cines, D. B. (1983), Inhibition of fibrinogen binding to stimulated human platelets by a monoclonal antibody, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 2417-2421) contienen un motivo RYD en HCDR3. La unión de estos mAb de ratón a la integrina αIIbβ3 puede ser completamente bloqueada por los péptidos RGD, lo cual sugiere que su motivo RYD media en una interacción directa con el sitio de unión de RGD. De modo interesante, el mAb de ratón 16N7C2, que contiene un motivo RGD en HCDR3, no diferencia entre las integrinas β3 (Deckmyn, H., Stanssens, P., Hoet, B., Declerck, P. J., Lauwereys, M., Gansemans, Y., Tornai, I., y Vermylen, J. (1994), An echistatin-like Arg-Gly-Asp (RGD)-containing sequence in the heavy chain CDR3 of a murine monoclonal antibody that inhibits human platelet glycoprotein IIb/IIIa function, Br. J. Haematol., 87, 562-571). Así, de un modo similar al motivo RAD sintético de los inventores, el motivo RYD nativo, en algunos contextos, proporciona un

reconocimiento selectivo de la integrina αIIbβ3. Sin embargo, por contraste con los anticuerpos RAD sintéticos, ninguno de LJ-CP3, OPG2, o PAC-1 contiene un puente disulfuro en HCDR3 que muestre un motivo de tipo RGD (Tomiyama, Y, Brojer, E., Ruggeri, Z. M., Shattil, S. J., Smiltneck, J., Gorski, J., Kumar, A., Kieber-Emmons, T., y Kunicki, T. J. (1992), A molecular model of RGD ligands. Antibody D gene segments that direct specificity for the integrin alpha IIb beta 3, J. Biol. Chem., 267, 18085-18092), lo cual sugiere una limitación en la diversidad estructural que puede ser obtenida mediante la recombinación de VDJ o una selección contra los puentes disulfuro en HCDR3. Previamente, los inventores han seleccionado anticuerpos humanos con un motivo RGD o un motivo que imita a RGD sintéticamente injertado en HCDR3 para la unión a las integrinas αvβ3 y αIIbβ3 (Barbas, C. F., 3º, Languino, L. R., and Smith, J. W. (1993), High-affinity self-reactive human antibodies by design and selection: targeting the integrin ligand binding site, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10003-10007; Smith, J. W., Hu, D., Satterthwait, A., Pinz- Sweeney, S., yd Barbas, C. F., 3º (1994), Building synthetic antibodies as adhesive ligands for integrins, J. Biol. Chem., 269, 32788-32795; Barbas, C. F., 3º (1993), Recent advances in phage display, Curr. Opin. Biotechnol., 4, 526-530). Ninguno de los anticuerpos seleccionados era exclusivamente específico para cualquiera de las integrinas. En un intento de seleccionar anticuerpos con mayor especificidad, los inventores generaron un nuevo banco de anticuerpos humanos sintéticos con la secuencia de HCDR3 aleatorizada VGXXXRADXXXYAMDV (SEQ ID NO:3). Además de reemplazar el motivo RGD por un motivo RAD, una importante distinción del nuevo banco es la eliminación de un puente disulfuro CX9C que abarca al motivo de unión a integrina y sus restos flanqueantes en bancos previos. De modo interesante, la selección del nuevo banco contra la integrina αIIbβ3 produce un nuevo puente disulfuro que muestra un motivo del tipo CX5C que se encuentra en 90% de las secuencias de anticuerpos seleccionadas. Esta estructura de bucle más pequeña, cuya selección dentro del puente disulfuro CX9C previo hubiera sido muy improbable, o imposible, produce una selectividad excepcional hacia la integrina αIIbβ3.

Las restricciones estructurales de los motivos XXXRADXXX (SEQ ID NO:22) seleccionados dentro de HCDR3 empujó a los inventores a diseccionarlos del andamiaje del anticuerpo y evaluar sus propiedades funcionales. Tres péptidos sintéticos que muestran el motivo RAD dentro de un puente disulfuro CX5C, VWCRADRRC (SEQ ID NO:5), VWCRADKRC (SEQ ID NO:6), y VVCRADRRC (SEQ ID NO:7), pero no el péptido sintético lineal THSRADRRE (SEQ ID NO:19), inhiben la unión de los anticuerpos RAD seleccionados a la integrina αIIbβ3, la unión del fibrinógeno a la integrina αIIbβ3, así como la agregación plaquetaria. Se han seleccionado antagonistas peptídicos para la integrina αIIbβ3 a partir de bancos de péptidos mediante presentación de fagos (O’Neil, K. T., Hoess, R. H., Jackson, S. A., Ramachandran, N. S., Mousa, S. A., y DeGrado, W. F. (1992), Identification of novel peptide antagonists for GPIIb/IIIa from a conformationally constrained phage peptide library, Proteins, 14, 509-515; Koivunen, E., Wang, B., y Ruoslahti, E. (1995), Phage libraries displaying cyclic peptides with different ring sizes: ligand specificities of the RGD-directed integrins, Biotechnology (NY), 13, 265-270; Koivunen, E., Restel, B. H., Rajotte, D., Lahdenranta, J., Hagedom, M., Arap, W., y Pasqualini, R. (1999), Integrin-binding peptides derived from phage display libraries, Methods Mol. Biol., 129, 3-17). Se emplearon bancos de péptidos constreñidos del tipo CX5C, CX6C, CX7C, y CX9. Sin embargo, sólos los bancos de péptidos CX6C y CX7C producen ligantes para la integrina αIIbβ3. Las secuencias seleccionadas pueden clasificarse en dos grupos: las que contienen un motivo RGD y las que contienen un motivo similar a RGD, en las que el resto glicina o arginina de RGD ha sido reemplazado. La glicina central ha sido sustituida por una diversidad de restos aminoácidos diferentes, tales como serina, treonina, leucina, alanina, glutamina, histidina, y metionina. Dos péptidos, CRADVPLC (SEQ ID NO:23) y CMSRADRPC (SEQ ID NO:24) contienen un motivo RAD. Las secuencias que contienen RGD seleccionadas sobre la integrina αIIbβ3 se diferencian de las seleccionadas sobre la integrina αvβ3 y α5β1 en que sus restos aromáticos Trp, Phe, o Tyr están enriquecidos en la posición inmediatamente C-terminal al motivo RGD. Además, varias secuencias contienen uno o dos restos básicos fuera del motivo RGD. Sin embargo, ninguna de las secuencias peptídicas seleccionadas comparte similitud con las secuencias de HCDR3 seleccionadas por los inventores VWCRADKRC (SEQ ID NO:6), VWCRADRRC (SEQ ID NO:5), y VVCRADRRC (SEQ ID NO:7). Nótese el hecho de que el banco de péptidos CX5C, que incluye la secuencia consenso central CX5C de los inventores CRAD (K/R) RC, no produce ningún péptido de unión a la integrina αIIbβ3, lo cual sugiere que los restos N-terminales VW o VV en las secuencias de HCDR3 seleccionadas por los inventores desempeñan un papel esencial en la interacción con la integrina αIIbβ3.

La presentación de fagos de bancos de péptidos y de anticuerpos se ha convertido en una tecnología convencional para una diversidad de aplicaciones en la investigación y el desarrollo (Barbas, C. F., 3º, Burton, D. R., Scott, J. K., y Silverman, G. J. (2001), Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Kay, B. K., Kasanov, J., y Yamabhai, M. (2001), Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries, Methods, 24, 240-246; Sidhu, S. S. (2000), Phage display in pharmaceutical biotechnology, Curr. Opin. Biotechnol., 11, 610-616). La presentación de bancos de péptidos dentro del dominio variable de inmunoglobulinas de anticuerpos fusiona estas tecnologías, proporcionando una conexión intrigante entre el descubrimiento de fármacos de peptidomimétidos, péptidos y anticuerpos. En la presente se demuestra la eficacia de esta estrategia para generar nuevos anticuerpos y péptidos anti-receptor específicos. La colocación de péptidos de unión y/o bioactivos dentro del andamiaje del anticuerpo o su generación dentro del andamiaje prevé el desarrollo rápido de agentes inmunológicos que puedan utilizarse como herramientas biológicas o productos terapéuticos (Barbas, C. F., 3º (1993), Recent advances in phage display, Curr. Opin. Biotechnol., 4, 526-530). A menudo, los propios péptidos tienen una actividad comprometida in vivo y su unión es difícil de controlar, aunque su presentación dentro del contexto de un anticuerpo soluciona los problemas de detección, así como los problemas asociados con la proteolisis de péptidos y su rápida eliminación, puesto que los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos muestran un comportamiento farmacocinético relativamente predecible. Cuando se

5 desee, por ejemplo, en un entorno de cáncer, la región Fc del anticiuerpo puede conferir propiedades de destrucción celular a la secuencia peptídica como resultado del acoplamiento de un efector inmunológico. Los inventores creen que esta estrategia puede aplicarse a una amplia gama de péptidos con actividad de unión para generar con rapidez reactivos inmunológicos útiles (Brown, K. C. (2000), New approaches for cell-specific targeting: identification of cell-selective peptides from combinatorial libraries, Curr. Opin. Chem. Biol., 4,16-21).

10 Tabla 1. Secuencias de HCDR3 procedentes de bancos de anticuerpos humanos sintéticos seleccionados contra integrinas β3

Fab anti-gp120

VGP YSW DDS PDQ NYYMDV

Banco de Faba

VGC XXX RGD XXX CYYMDV

Fab-4

--- TGQ --- WRS ------

Fab-7

--- TYG --- TRN ------

Fab-8

--- PIP --- WRE ------

Fab-9

--- SFG --- IRN ------

Fab-10

--- TMG --- ERN ------

Fab-9

VGC SFG RGD IRN CYYMDV

Banco de MTFb

VGC SFG XXX XRN CYYMDV

MTF-2

--- --- RTD Q-I ------

MTF-10

--- --- KGD N-I ------

MTF-32

--- --- RRD E-- ------

MTF-40

--- --- RND S-- ------

MTF-1

--- --- RVD D-- ------

MTF-12

--- --- RAD R-- ------

MTF-15

--- --- RSV D-- ------

MTF-7

--- --- KRD M-- ------

MTF-13

--- --- RWD A-- ------

MTF-14

--- --- RQD V-- ------

MTF-20

--- --- RDD G-- ------

Banco de RAD

VR XXX RAD XXX YAMDV

a Barbas et al. (18); b Smith et al. (19)

Tabla 2. Secuencias de RAD del banco de Fab seleccionadas contra la integrina αIIbβ3 Tabla 3. Comparación del Fab RAD87 y Fab abciximab 5

Fab

VH HCDR3 VL

RAD1

VH3 DP-47 VRTHSRADRREYRMDV VKIII DPK22/A27

RAD3

VH3 DP-47 VRVVCRADRRCYAMDV VKVI DPK26/A26

RAD4

VH3 DP-47 VGVWCRADRRCYRMDV VKVI DPK26/A26

RAD9

VH3 DP-47 VRVVCRADRRCYAMDV VKIII Vg/38K

RAD11

VH3 DP-47 VGVWCRADRRCYAMDV VkVI DPK26/A26

RAD12

VH3 DP-47 VRVVCRADRRCYAMDV VL8 8a.88E1/DPL21

RAD32

VH3 DP-47 VGVWCRADKRCYAMDV VKIII 3A9

RAD34

VH3 DP-47 VRVVCRADRRCYAMDV VL3 V2-14

RAD87

VH3 DP-47 VGVVCRADRRCYAMDV VL2 2c.118D9/v1-2

RAD88

VH3 DP-47 VRVWCRADKRCYAMDV VKVI DPK26/A26

Fab

Kd a CI50 b CE50 c

RAD87

3,3 x 10-9 M 8,0 x 10-8 M 60 nM

Abciximab

1,1 x 10-9 M 9,0 x 10-8 M 45 nM

a Constante de disociación para la unión de la integrina αIIbβ3 humana. b Concentración requerida para 50% de inhibición en un ensayo de interacción del fibrinógeno humano y la integrina αIIbβ3 humana. c Concentración requerida para 50% de inhibición en un ensayo de agregación de plaquetas humanas.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> The Scripps Research Institute

<120> ANTICUERPOS Y PÉPTIDOS ESPECÍFICOS DE LA INTEGRINA ALFA.IIb.BETA.3.

<130> 12142 EP PAB

<140> documento EP 04812819.3

<141>

<150> documento US 60/526.859

<151>

<150> documento PCT/US2004/040381

<151> 2004-12-03

<160> 72

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Parte de HCDR3

<400> 1

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Parte de HCDR3

<400> 2

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> VARIANTE

<222> (3, 4, 5, 9, 10, 11)

<223> codificado por una secuencia de ADN aleatorizada: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr

<400> 3

<210> 4

<211> 9

<212> PRT <213> Artificial sequence

<220>

<223> Parte consenso de HCDR3

<400> 4

<210> 5

<211> 9

<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Parte consenso de HCDR3

15 <400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Parte consenso de HCDR3

<400> 6

25 <210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Parte consenso de HCDR3

<400> 7

<210> 8 35 <211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 40 <223> Parte consenso de CDR

<400> 8

<210> 9

<211> 72

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221>

característica_misc 5 <222> (25, 26, 28, 29, 31, 32, 43, 44, 46, 47, 49, 50)

<223> cebador neo-rad-f; codificado por la secuencia de ADN aleatorizada: a, g, c, t

<220>

<221>

característica_misc 10 <222> (27, 30, 33, 45, 48, 51)

<223> cebador neo-rad-f; codificado por la secuencia de ADN aleatorizada: g, t

<400> 9

15

<210> 10 <211> 21 <212> ADN

20

<213> Secuencia artificial <220> <223> cebador dpseq

<400> 10

25 30

agaagcgtag tccggaacgt c <210> 11 <211> 57 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> cebador DP-47N-term 21

35

<400> 11 gctgcccaac cagccatggc cgaggtgcag ctgttggagt ctgggggagg cttggta 57

40

<210> 12 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial

45

<220> <223> cebador DP-47FR3 <400> 12

cactctcgca cagtaataca cggccgtgtc ctcggctct

39

50

<210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

55

<220> <223> cebador lead-VH

<400> 13

ggccatggct ggttgggcag c

21

5

<210> 14 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> cebador dp-EX <400> 14

gaggaggagg aggaggagag aagcgtagtc cggaacgtc

39

15

<210> 15 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> cebador ompseq

<400> 15

25

aagacagcta tcgcgattgc agtg 24

30

<210> 16 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador leadB

35

<400> 16

ggccatggct ggttgggcag c

21

40

<210> 17 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial

45

<220> <223> cebador RSC-F

<400> 17

50 55

gaggaggagg aggaggaggc ggggcccagg cggccgagct c <210> 18 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> cebador lead-B 41

60

<400> 18 ggccatggct ggttgggcag c 21

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> péptido con el motivo RAD invertido

<400> 20

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> péptido con el motivo RAD invertido

<400> 21

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1, 2, 3, 7, 8, 9)

<223> codificado por la secuencia de ADN aleatorizada: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr

<400> 22

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> péptido con el motivo RAD

<400> 23

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> péptido con el motivo RAD

<400> 24

10 <210> 25

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> parte consenso de CDR

<400> 25

<210> 26 20 <211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 25 <223> parte consenso de CDR

<400> 26

<210> 27

<211> 16 30 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> parte consenso de CDR 35

<400> 27

<210> 28

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> parte consenso de CDR

<400> 28

<210> 29

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Parte consenso de CDR

<400> 29

15 <210> 30

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> parte consenso de CDR

<400> 30

<210> 31 25 <211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> parte consenso de CDR

<400> 31

<210> 32

<211> 118 35 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de RAD87 40

<400> 32

<210> 33

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de RAD9

<400> 33

10 <210> 34

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <220>

<223> parte de RAD12

<400> 34

<210> 35

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de RAD34

<400> 35

10 <210> 36

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <220>

<223> parte de RAD3

<400> 36

<210> 37

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de RAD32

<400> 37

10 <210> 38

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <220>

<223> parte de RAD88

<400> 38

<210> 39

<211> 119

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de RAD1

<400> 39

10 <210> 40

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <220>

<223> motivo RGD

<400> 40

<210>

41 20 <211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> motivo RAD

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<223> motivo RYD

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de RAD1

<400> 43

<210> 44

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de RAD3

<400> 44

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de RAD4

<400> 45

<210> 46

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de RAD9

<400> 46

<210>

47 5 <211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 10 <223> parte de RAD11

<400> 47

<210> 48

<211> 9 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de RAD12 20

<400> 48

<210> 49

<211> 9

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de RAD32

30 <400> 49

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de RAD34

<400> 50

40 <210> 51

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

45 <220>

<223> parte de RAD87

<400> 51

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de RAD88

<400> 52

<210> 53

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de Fab anti-gp120

<400> 53

<210> 54

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIANTE

<222> (4, 5, 6, 10, 11, 12)

<223> parte del banco de Fab; Ala, cys, Asp, Glu, Phe Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr

<400> 54

<210> 55

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de Fab-4

<400> 55

<210> 56

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de Fab-7

<400> 56

<210> 57

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de Fab-8

15 <400> 57

<210> 58

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20

<220>

<223> parte de Fab-9

<400> 58 25 <210> 59

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30 <220>

<223> parte de Fab-10

<400> 59

<210> 60 35 <211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 40 <221> VARIANTE

<222> (7,8 9,10)

<223> parte del banco de MTF; Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr

45 <400> 60 <210> 61

<211> 18

<212> PRT 5 <213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de MTF-2

10 <400> 61

<210> 62

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de MTF-10

<400> 62

20 <210> 63

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25 <220>

<223> parte de MTF-32

<400> 63

<210> 64 30 <211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 35 <223> parte de MTF-40

<400> 64

<210> 65

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de MTF-1

<400> 65

<210> 66

<211> 18

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de MTF-12

15 <400> 66

<210> 67

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de MTF-15

<400> 67

25 <210> 68

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30 <220>

<223> parte de MTF-7

<400> 68

<210> 69 35 <211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 40 <223> parte de MTF-13

<400> 69

<210> 70

<211> 18

<212> PRT 5 <213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de MTF-14

10 <400> 70

<210> 71

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> parte de MTF-20

<400> 71

20 <210> 72

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25 <220>

<221> VARIANTE

<222> (3, 4, 5, 9, 10, 11)

<223> parte del banco de RAD; Ala, Cys, Asp, Glu, Phe Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr,

Val, Trp, Tyr 30

<400> 72

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Un péptido aislado y purificado que comprende de 9 a aproximadamente 50 restos aminoácidos, y que tiene una secuencia de restos aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, 5, 6 y 7, que tiene una actividad que inhibe la agregación plaquetaria.
2. 2.- El péptido de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de restos aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:5-7. 3.- El péptido de la reivindicación 2, que consiste en cualquiera de SEQ ID NO:5-7.
3. 4.- El péptido de la reivindicación 2, que consiste fundamentalmente en cualquiera de SEQ ID NO:5-7. 5.- Un anticuerpo que inmunorreacciona específicamente con la integrina αIIbβ3, y que comprende una secuencia de restos aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, 25, 26, 27, 28, 29, 30 y 31, en el que la secuencia de restos aminoácidos está dentro de la región determinante de la complementariedad HCDR3 del anticuerpo.
4. 6.- El anticuerpo de la reivindicación 5, seleccionado del grupo que consiste en:

   i) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la secuencia VRVVCRADRRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VKVI DPK26/A26; ii) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la

   secuencia VGVWCRADRRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VKVI DPK26/A26;

   iii) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la secuencia VRVVCRADRRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VKIII Vg/38K; iv) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la

   secuencia VGVWCRADRRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VkVI DPK26/A26;

   v) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la secuencia VRVVCRADRRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VL8 8a.88E1/DPL21; vi) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la

   secuencia VGVWCRADKRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VKIII 3A9;

   vii) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la secuencia VRVVCRADRRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VL3 V2-14; viii) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la

   secuencia VGVVCRADRRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VL2 2c.118D9/v1-2; y

   ix) un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende VH3 DP-47, una HCDR3 que comprende la secuencia VRVWCRADKRCYAMDV, y un dominio VL que comprende VKVI DPK26/A26; y que presenta inmunorreactividad con la integrina αIIbβ3. 7.- El anticuerpo de la reivindicación 5 que es un anticuerpo humano. 8.- Un anticuerpo que tiene la inmunorreactividad del anticuerpo de la reivindicación 6. 9.- Un péptido de la reivindicación 1 o un anticuerpo de la reivindicación 5, para su uso como medicamento. 10.- Un anticuerpo de la reivindicación 5 para su uso como medicamento para un tratamiento para prevenir la

   trombosis. 11.- Un anticuerpo que tiene actividad de unión a la integrina αIIbβ3, en el que la unión compite con la actividad de unión de otro anticuerpo, comprendiendo el otro anticuerpo una secuencia de restos aminoácidos dentro de una

   región determinante de la complementariedad del otro anticuerpo, en el que la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:8, 25, 26, 27, 28, 29, 30 y 31, y en el que la unión se realiza en un ensayo de competición convencional.
5. 12.- Un polinucleótido aislado y purificado que codifica un péptido que comprende de 9 a aproximadamente 50 5 restos aminoácidos, y que tiene una secuencia de restos aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, 5, 6 y 7, y el péptido tiene una actividad que inhibe la agregación plaquetaria.
6. 13.- Un vector que comprende el polinucléotido de la reivindicacón 12.
7. 14.- Una célula hospedante que comprende el vector de la reivindicación 13.
8. 15.- Un procedimiento de uso de un polinucleótido para producir una proteína, comprendiendo el procedimiento:

   10 a) cultivar la célula hospedante de la reivindicación 14 bajo condiciones para la expresión de proteínas; y

   b) recuperar la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, 5, 6 y 7 a partir del cultivo de células hospedantes.
9. 16.- Una composición farmacéutica que comprende el péptido de la reivindicación 1 o el anticuerpo de la reivindicación 5 o la reivindicación 11, y un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado en una forma

   15 adecuada para la administración por vía intravenosa, intraarterial, en la circulación linfática, intraperitoneal, transdérmica, subcutánea, intramuscular, en el espacio articular, o mediante administración pulmonar.
10. 17.- Un anticuerpo según la reivindicación 11 para su uso como medicamento.
11. 18.- Un péptido según la reivindicación 1 o un anticuerpo de la reivindicación 5 o la reivindicación 11, para su uso como medicamento para un tratamiento para prevenir la trombosis en trastornos seleccionados del grupo que

    20 consiste en embolia pulmonar, ataques isquémicos transitorios (TIA), trombosis de venas profundas, cirugía de bypass coronario, y cirugía para insertar una válvula o un vaso prostético en un injerto de vasos autólogo, no autólogo o sintético.
12. 19.- Un péptido según la reivindicación 1 o un anticuerpo de la reivindicación 5 o la reivindicación 11, para su uso como medicamento para un tratamiento para prevenir la trombosis en un procedimiento seleccionado del grupo que

    25 consiste en procedimientos de angioplastia realizados con balón, aterectomía coronaria y angioplastia de láser.