ES2436567T3

ES2436567T3 - Polipéptido que tiene actividad de D-lactato deshidrogenasa, un polinucleótido que codifica el polipéptido y procedimiento de preparación de ácido D-láctico

Info

Publication number: ES2436567T3
Application number: ES10783384.0T
Authority: ES
Inventors: Kenji Sawai; Kazumi Suda; Hideki Sawai; Katsushige Yamada; Junya Yamagishi
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2009-06-03
Filing date: 2010-06-02
Publication date: 2014-01-03
Anticipated expiration: 2030-06-02
Also published as: US8822195B2; AU2010255000A1; WO2010140602A1; MY159074A; SG176263A1; CN102459590A; KR20120027354A; US20120070871A1; JP5803106B2; BRPI1008141A2; CA2764448A1; EP2439271B1; EP2439271A1; RU2553563C2; JPWO2010140602A1; EP2439271A4; RU2011152925A; CN102459590B

Abstract

Polipéptido que es cualquiera de los siguientes (A) a (C): (A) polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2; (B) polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 1 ó 2, exceptoque de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido, cuyo polipéptido tiene actividad de Dlactatodeshidrogenasa; y (C) polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de no menos del80% con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2, cuyo polipéptido tiene unaactividad de D-lactato deshidrogenasa.

Description

Polipéptido que tiene actividad de D-lactato deshidrogenasa, un polinucleótido que codifica el polipéptido y procedimiento de preparación de ácido D-láctico.

SECTOR TÉCNICO

La presente invención se refiere a un nuevo polipéptido para la preparación de ácido D-láctico, cuyo polipéptido tiene actividad de D-lactato deshidrogenasa; un polinucleótido que codifica el polipéptido, y un transformante en el que se introduce el polinucleótido. La presente invención también se refiere a un procedimiento de preparación de ácido Dláctico, que comprende cultivar el transformante.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

A partir de la idea de la neutralidad del carbono, se le ha prestado mucha atención a los ácidos polilácticos (PLA), que utilizan un recurso renovable, la biomasa, como material de partida. Los PLA son relativamente baratos y resistentes al calor, teniendo un punto de fusión aproximadamente de 170ºC; por lo tanto, se espera que sean polímeros biodegradables que pueden ser moldeados en fusión. Además, se conoce que un ácido poliláctico estereocomplejo se puede obtener mediante la mezcla de ácido poli-L-láctico y ácido poli-D-láctico (documentos de patente 1 a 3). Se sabe que el ácido poliláctico estereocomplejo presenta un punto de fusión más elevado y mayor cristalizabilidad en comparación con los polímeros individuales y proporciona artículos moldeados útiles tales como artículos moldeados de fibras, de películas y de resina. Para ambos materiales de partida del mismo, ácido L-láctico y ácido D-láctico, existe una demanda de disponer de un procedimiento de preparación de los mismos con alta pureza y alta eficiencia.

En la naturaleza, existen bacterias que producen ácidos lácticos de manera eficiente, tales como las bacterias del ácido láctico, y algunos de los procedimientos de preparación de ácido láctico que utilizan dichas bacterias ya han sido objetivo de una utilización práctica. Se incluye entre los ejemplos de bacterias que producen de forma eficiente ácido L-láctico Lactobacillus delbrueckii. Además, como bacterias que producen de manera eficiente ácido D-láctico, son conocidos microorganismos tales como Sporolactobacillus laevolacticus (documento de patente 4). En cualquiera de estos casos, la cantidad del ácido láctico acumulado alcanzó un alto nivel en el cultivo anaerobio; sin embargo, dado que el ácido D-láctico y el ácido L-láctico se producen como subproductos en la fermentación del ácido L-láctico y en la fermentación del ácido D-láctico, respectivamente, la pureza óptica disminuye. Además, es extremadamente difícil separar estos ácidos lácticos.

Por lo tanto, como procedimiento de preparación de ácido láctico que tiene una pureza óptica elevada, se ha examinado introducir un gen que codifica la L-lactato deshidrogenasa o la D-lactato deshidrogenasa en una levadura que no tiene de forma intrínseca capacidad de producción de ácidos lácticos y someter la levadura a fermentación de ácido L-láctico y de ácido D-láctico (documentos de patente 4 a 6 y documento no de patente 1). Con respecto a la fermentación de ácido L-láctico por la levadura modificada genéticamente, mediante la introducción de un gen muy activo originado a partir de Xenopus laevis que codifica la L-lactato deshidrogenasa, la fermentación de ácido láctico puede llevarse a cabo de manera eficiente con alta pureza óptica (documento de patente 4). Por otro lado, con respecto a la fermentación de ácido D-láctico por la levadura modificada genéticamente, aunque se puede obtener ácido D-láctico que tiene una alta pureza óptica de la misma manera como en el caso de la fermentación de ácido L-láctico, el rendimiento de la misma es un problema (documentos de patente 5 y 6 y documento no de patente 1).

DOCUMENTOS DE LA TÉCNICA ANTERIOR

DOCUMENTOS DE PATENTE

Documento de patente 1: JP S61-36321A Documento de patente 2: JP S63-241024A Documento de patente 3: JP 2000-17163A Documento de patente 4: W02007/043253 Documento de patente 5: JP 2007-074939A Documento de patente 6: W02004/104202

DOCUMENTOS NO DE PATENTE

Documento no de patente 1: Ishida N, y otros, Journal of Bioscience and Bioengineering (2006), 101, 172-7.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

PROBLEMAS A RESOLVER POR LA INVENCIÓN

Un objetivo de la presente invención es llevar a cabo una fermentación de ácido D-láctico altamente productiva utilizando un polipéptido que tiene una actividad de D-lactato deshidrogenasa mayor que la de los polipéptidos convencionales y un polinucleótido que codifica el polipéptido.

MEDIOS PARA RESOLVER LOS PROBLEMAS

Los presentes inventores estudiaron en profundidad una variedad de D-lactato deshidrogenasas para descubrir un polipéptido que aumenta la producción de ácido D-láctico y también tiene una actividad de D-lactato deshidrogenasa para producir sólo una pequeña cantidad de subproducto; y un polinucleótido que codifica el polipéptido, consiguiendo de este modo la presente invención.

Es decir, la presente invención está constituida, por los siguientes modos.

(1): Un polipéptido que es uno cualquiera de los siguientes (A) a (C):

(A): un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2;

(B): un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 1 ó 2, excepto que de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido, cuyo polipéptido tiene actividad de Dlactato deshidrogenasa; y

(C): un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de no menos del 80% con repecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2, cuyo polipéptido tiene una actividad de D-lactato deshidrogenasa.

(2): Un polinucleótido que es uno cualquiera de los siguientes (a) a (e):

(a): un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4;

(b): un polinucleótido que tiene la misma secuencia de nucleótidos tal como se muestra en la SEC ID NO: 3 ó 4, excepto que de 1 a 10 nucleótidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido, cuyo polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de D-lactato deshidrogenasa;

(c): un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas con la totalidad o una parte del polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4 o una cadena complementaria del mismo, cuyo polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de D-LDH;

(d): un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de no menos del 80% con respecto a la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4, cuyo polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de D-lactato deshidrogenasa; y

(e): un polinucleótido que codifica el polipéptido según el punto (1).

(3): Un constructo de ADN en el que están unidos el polinucleótido, según el punto (2), y un promotor capaz de expresar el polinucleótido.

(4): El constructo de ADN, según el punto (3), caracterizado porque el promotor descrito anteriormente es un promotor del gen de la piruvato descarboxilasa 1 (gen PDC1), del gen de la supresión del defecto exponencial 1 (gen SED1) o del gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa 3 (gen TDH3).

(5): El constructo de ADN, según el punto (3) o (4), en el que el promotor descrito anteriormente se selecciona entre cualquiera de los siguientes (I) a (III):

(I): un promotor que tiene con respecto a la secuencia de nucleótidos que se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOs: 5 a 7;

(II): un promotor que tiene una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con con respecto a la secuencia de nucleótidos que se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOs: 5 a 7 o una secuencia de nucleótidos que comprende una parte de las mismas; y

(III) un promotor que tiene la misma secuencia de nucleótidos tal como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOs: 5 a 7, excepto que uno o varios nucleótidos se han eliminado, sustituido y/o añadido.

(6) Un transformante, en el que se introduce el polinucleótido, según el punto (2) o el constructo de ADN, según

cualquiera de los puntos (3) a (5).

(7): Una levadura transformada, en la que se introduce el polinucleótido, según el punto (2) o el constructo de ADN, según cualquiera de los puntos (3) a (5).

(8): La levadura transformada, según el punto (7), en la que, como mínimo, uno entre el gen de la piruvato descarboxilasa 1 (gen PDC1), el gen de la supresión del defecto exponencial 1 (gen SED1) y el gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa 3 (gen TDH3) de la levadura transformada mencionada anteriormente está sustituido con el polinucleótido, según el punto (2) o el constructo de ADN, según cualquiera de los puntos (3) a (5).

(9): La levadura transformada, según el punto (8), en la que, como mínimo, uno de los genes mencionados anteriormente es el gen PDC1.

(10): Un procedimiento de preparación de ácido D-láctico, que comprende la etapa de cultivar el transformante, según el punto (6) o la levadura transformada, según cualquiera de los puntos (7) a (9).

(11): Un transformante, en el que se introduce el polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4, o el homólogo del polinucleótido mostrado en la SEQ IN NO: 3 ó 4, que codifica la D-lactato deshidrogenasa originada de la familia Limulidae o el constructo de ADN en el que el polinucleótido y un promotor capaz de expresar el polinucleótido están unidos.

(12): Una levadura transformada, en la que se introduce el polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4, o el homólogo del polinucleótido mostrado en la SEQ IN NO: 3 ó 4, que codifica la D-lactato deshidrogenasa originada del género de familia Limulidaelimulus o el constructo de ADN en el que el polinucleótido y un promotor capaz de expresar el polinucleótido están unidos.

(13): La levadura transformada, según el punto (12), en la que, como mínimo, uno entre el gen de la piruvato descarboxilasa 1 (gen PDC1), el gen de la supresión del defecto exponencial 1 (gen SED1) y el gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa 3 (gen TDH3) de la levadura transformada descrita anteriormente está sustituido con el polinucleótido descrito anteriormente que codifica la D-lactato deshidrogenasa originada de la familia Limulidae o se introduce el constructo de ADN en el que el polinucleótido y un promotor capaz de expresar el polinucleótido están unidos.

(14): Un procedimiento de preparación de ácido D-láctico, que comprende la etapa de cultivar el transformante, según el punto (11) o la levadura transformada, según el punto (12) ó (13).

EFECTOS DE LA INVENCIÓN

Según la presente invención, se dan a conocer un polipéptido que tiene actividad de D-lactato deshidrogenasa adecuado para la producción fermentativa de ácido D-láctico y un polinucleótido que codifica el polipéptido. Además, mediante la utilización del polinucleótido de la presente invención, se puede obtener fácilmente un transformante capaz de producir gran cantidad de ácido D-láctico, y, a su vez, se puede preparar ácido D-láctico de manera eficiente con alta pureza mediante el cultivo del transformante.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra los procedimientos para la preparación de una de las cepas de levadura SU042, según la presente invención.

La figura 2 muestra los resultados del cultivo continuo de membrana integrada de la cepa de levadura SU042, según la presente invención.

MODO DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN

Los modos de llevar a cabo la presente invención se explicarán a continuación en detalle.

El término "actividad de D-lactato deshidrogenasa” (en adelante, también referido como "D-LDH") es una actividad para convertir nicotinamida adenina dinucleótido reducida (NADH) y ácido pirúvico en ácido D-láctico y de nicotinamida adenina dinucleótido oxidada (NAD+).

La presente invención está caracterizada por incluir un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2 o un homólogo de las mismas, cuyo polipéptido tiene actividad de D-LDH.

El polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2 es un polipéptido que se origina a partir de Limulus polyphemus, que pertenece a la familia Limulidae y género Limulus.

Entre los ejemplos del homólogo del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2 se incluyen un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: 1 ó 2, excepto que de 1 a 10, preferentemente de 1 a 5, más preferentemente 1 ó 2 aminoácidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido, cuyo polipéptido también tiene actividad de D-LDH.

Además, un homólogo del polipéptido mostrado en la SEC ID NO: 1 ó 2 también puede ser un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de no menos del 80%, preferentemente del 90%, más preferentemente no menos del 95% con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2, cuyo polipéptido también tiene actividad de D-LDH. En el presente documento, la identidad de secuencia de una secuencia de aminoácidos puede verificarse fácilmente utilizando BLAST, que es un software ampliamente utilizado en la técnica. Cualquier persona puede utilizar BLAST a través de la página web del NCBI (Centro Nacional para la Información de Biotecnología (“National Center for Biotechnology Information”), y la identidad se puede comprobar fácilmente mediante la utilización de parámetros por defecto.

Además, el homólogo del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2, también puede ser un polipéptido originado de un organismo vivo que pertenece a la familia Limulidae, preferentemente un organismo vivo que pertenece al género Limulus o Tachypleus, más preferentemente de Limulus polyphemus que pertenecen al género Limulus, o Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigas o Tachypleus rotundicauda que pertenecen al género Tachypleus, cuyo polipéptido tiene actividad de D-LDH.

El polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2 se puede extraer de Limulus polyphemus mediante un procedimiento conocido o preparar utilizando un método de síntesis de péptidos conocida. Además, también se puede preparar mediante una técnica de recombinación de genes utilizando un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2. El polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2 también se puede extraer de un organismo vivo que pertenece al género Tachypleus mediante un método o preparar utilizando un método de síntesis de péptidos conocido. Además, también se puede preparar mediante una técnica de recombinación de genes utilizando un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido.

El homólogo del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2, puede tener una actividad de D-LDH mejorada y/o una estabilidad térmica mejorada en comparación con el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2. En el presente documento, el término "una actividad de D-LDH mejorada" se refiere a una mejora en la afinidad por el sustrato y la actividad molecular (Kcat) para el ácido pirúvico y NADH, así como un cambio en el pH óptimo para la actividad enzimática del polipéptido más cerca un pH adecuado para el crecimiento de las células que expresan el polipéptido. Dicho polipéptido puede ser diseñado artificialmente basado en el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2, o se puede aislar de la naturaleza. Además, una mutación puede introducirse al azar en el gen de la D-lactato deshidrogenasa mediante un método de ingeniería molecular evolutiva para cribar un polipéptido preferente a partir de la misma.

La presente invención se caracteriza por incluir un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4 o un homólogo del mismo, cuyo polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de D-LDH. En el presente documento, el origen del "polinucleótido" no es importante y puede ser un ADNc, ADN genómico, ADN sintético, ARNm, ARN sintético, ARN replicón; sin embargo, es preferentemente un ADN o ARN, más preferentemente ADN. Además, el "polinucleótido" puede ser de hebra sencilla o de doble hebra con una hebra complementaria de la misma. Además, el "polinucleótido" también puede contener un derivado de nucleótido natural o artificial.

El polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4 es un polinucleótido originado de Limulus polyphemus y caracterizado porque codifica un polipéptido que tiene la actividad de D-LDH mencionada anteriormente.

Entre los ejemplos del homólogo del polinucleótido mostrado en la SEQ ID NO: 3 ó 4 se incluyen un polinucleótido que tiene la misma secuencia de nucleótidos tal como se muestra en la SEC ID NO: 3 ó 4, excepto que de 1 a 40, preferentemente de 1 a 30, más preferentemente de 1 a 20, especialmente de manera preferente de 1 a 10, lo más preferente de 1 a 5 nucleótidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido, cuyo polinucleótido también codifica un polipéptido que tiene actividad de D-LDH.

Además, entre los ejemplos del homólogo del polinucleótido mostrado en la SEQ ID NO: 3 ó 4 también se incluyen un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas con la totalidad o una parte del polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID NO: 3 ó 4 o una hebra complementaria del mismo, cuyo polinucleótido también codifica un polipéptido que tiene actividad de D-LDH. En el presente documento, el término "un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas" se refiere, por ejemplo, a un polinucleótido que se hibrida por una técnica de hibridación conocida (Current Protocols I Molecular Biology edic. Ausubel y otros, (1987) Public. John Wily & Sons, Sección 6.3-6.4) o similares utilizando, como sonda o sondas, uno o una serie de polinucleótidos seleccionados que tienen, como mínimo, 20, preferentemente 25, más preferentemente, como mínimo, 30

nucleótidos consecutivos arbitrarios de la secuencia de nucleótidos original. En el presente documento, las condiciones rigurosas se pueden conseguir, por ejemplo, mediante la realización de la hibridación en presencia de 50% de formamida a una temperatura de hibridación de 37ºC, 42ºC para condiciones más rigurosas, 65ºC para condiciones aún más rigurosas, y el lavado del resultante con una solución SSC (salina-citrato de sodio) 0,1x a 2x (composición de la solución SSC 1x: cloruro de sodio 150 mM y citrato de sodio 15 mM).

Además, el homólogo del polinucleótido mostrado en la SEQ ID NO: 3 ó 4 también puede ser un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de no menos del 80%, más preferentemente no menos del 90%, aún más preferentemente no menos del 95% con respecto a la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4, cuyo polinucleótido también codifica un polipéptido que tiene actividad de D-LDH. La identidad de secuencia de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido que se utiliza en el presente documento se puede determinar mediante la utilización del programa BLAST de análisis de genes descrito anteriormente o similares.

Además, el homólogo del polinucleótido mostrado en la SEQ ID NO: 3 ó 4 también puede ser un polinucleótido originado a partir de un organismo vivo que pertenece a la familia Limulidae, preferentemente un organismo vivo que pertenece al género Limulus o Tachypleus, más preferentemente Limulus polyphemus, Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigas o Tachypleus rotundicauda, cuyo polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de D-LDH.

Aunque el polinucleótido descrito anteriormente se puede preparar por clonación a partir de un organismo vivo que pertenece a la familia Limulidae, preferentemente un organismo vivo que pertenece a la familia Limulidae y género Limulus (en lo sucesivo, estos también se denominan de forma colectiva como "Limulus"), también se puede sintetizar químicamente o mediante el empleo de la técnica de Fujimoto y otros. (Hideya Fujimoto, Production method of Synthetic Gene, Plant Cell Engineering Series 7, Plant PCR Experimental Protocol, 1997, Shujunsha Co., Ltd, pág. 95-100), que se conoce como un método de síntesis de ADN de cadena larga. Normalmente, el polinucleótido clonado de Limulus se puede aislar por un método conocido. Entre los ejemplos de dicho método se incluye uno en el que, utilizando un cebador sintetizado sobre la base de una secuencia de ADNc que está altamente conservada en la D-lactato deshidrogenasa, siendo preparado el ADNc a partir de ARN poli A (+) aislado a partir de hemocitos de Limulus, un fragmento parcial se amplifica y se secuencia, y la secuencia completa de la ORF de la misma se determina, a continuación, por métodos 5'RACE y 3'RACE, seguido de la amplificación por PCR para obtener un polinucleótido. Además, la clonación a partir de Limulus también se puede realizar por complementación de la función de D-lactato deshidrogenasa. El principio de los mismos se describe en detalle en DOMINIQUE, G., Appl Environ Microbiol, Estados Unidos (1995), 61, 266-272. De esta manera, el polinucleótido de la presente invención que tiene una secuencia de nucleótidos, una vez determinado, se puede obtener una vez más de hemocitos de Limulus; sin embargo, también puede ser sintetizado químicamente directamente utilizando un aparato de síntesis de ADN.

En el presente documento, el polipéptido o polinucleótido mencionado anteriormente se puede modificar según sea apropiado mediante la introducción de forma apropiada de una sustitución o sustituciones, eliminación o eliminaciones, inserción o inserciones y/o mutación o mutaciones de adición a la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de los mismos utilizando un método de introducción de mutación específica del sitio (Current Protocols I Molecular Biology edic. Ausubel y otros, (1987) Public. John Wily & Sons Sección 8.1-8.5) o similares. Además, dicha modificación de una secuencia de aminoácidos del polipéptido o la secuencia de nucleótidos del polinucleótido no se limita a las realizadas mediante la introducción artificial o síntesis de una mutación, sino que abarca no sólo las que se realizan sobre la base de un tratamiento de mutación artificial, sino también aquellas que se producen de forma natural por una mutación en un aminoácido.

El polinucleótido descrito anteriormente se puede utilizar para la preparación de una célula productora de ácido Dláctico por recombinación de genes. Para que una célula huésped en la que se introduce el polinucleótido de la presente invención por recombinación de genes (en lo sucesivo, también referida como "transformante") sea capaz de producir ácido D-láctico, se requiere que el polipéptido que tiene actividad de D-LDH, que es codificado por el polinucleótido, se exprese en el transformante. En este caso, como un método que permite que se exprese el polipéptido que tiene actividad de D-LDH, es útil la utilización de un constructo de ADN en el que el polinucleótido y un promotor capaz de expresarlo están unidos, es decir, un constructo de ADN en que el polinucleótido está unido al extremo 3 'del promotor, y dicho constructo de ADN también está incluido en la presente invención. El constructo de ADN de la presente invención se puede preparar por un método en el que el polinucleótido (ADN) de la presente invención y un promotor capaz de expresar el polinucleótido cada uno es digerido con una enzima o enzimas de restricción apropiadas y, a continuación, se insertan en un sitio de enzima de restricción o sitio de clonación múltiple del vector de ADN descrito más adelante al que se unirá o por unión del polinucleótido (ADN) de la presente invención y el promotor mediante la realización de PCR.

En un modo preferente del constructo de ADN descrito anteriormente, el constructo de ADN es transportado por un vector tal como un plásmido (ADN), bacteriófago (ADN), retrotransposón (ADN) o cromosoma artificial (por ejemplo, YAC, PAC , BAC o MAC). Dependiendo del modo de introducción del constructo de ADN (dentro o fuera del genoma del huésped) y del tipo de la célula huésped, se seleccionan como apropiado un vector procariota, vector eucariota,

vector de célula de animal o vector de célula de planta, que se conocen en la técnica.

En el presente documento, entre los ejemplos del plásmido vectores lanzadera de Escherichia coli se incluyen levadura de tipo YCp tales como pRS413, pRS415, pRS416, YCp50, pAUR112 y pAUR123; vectores lanzadera de Escherichia coli-levadura de tipo YEp tales como pYES32 y YEp13; vectores lanzadera de Escherichia coli-levadura de tipo YIp tales como pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pAUR101 y pAUR135; plásmidos provenientes de Escherichia coli (por ejemplo, plásmidos de tipo CoIE tales como pBR322, pBR325, pUC18, pUC19, pUC119, pTV118N, pTV119N, pBluescript, pHSG298, pHSG396 y pTrc99A; plásmidos de tipo P1A tales como pACYC177, y pACYC184; y plásmidos de tipo pSC101 tales como pMW118, pMW119, pMW218 y pMW219); y plásmidos provenientes de Bacillus subtilis (tales como pUB110 y pTP5). Entre los ejemplos del bacteriófago se incluyen Afagos (tales como Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, Agt100, gt11 y zap), <X174, M13mp18 y M13mp19. Un ejemplo del retrotransposón es factor Ty del YAC es pYACC2.

El "promotor" en el constructo de ADN descrito anteriormente se refiere a una secuencia de nucleótidos que participa en la iniciación de la transcripción de ARNm de un gen y, normalmente, se refiere a una secuencia aguas arriba del extremo 5' del gen que existe en el cromosoma. La longitud de la secuencia de nucleótidos del promotor es preferentemente de 1 a 3000 pb, más preferentemente de 1 a 1000 pb; sin embargo, no está particularmente restringida siempre y cuando la secuencia de nucleótidos pueda iniciar la transcripción de ARNm del gen que existe aguas abajo. Además, son conocidas una mutación y la función para la mejora de la actividad de transcripción de un promotor y el "promotor" también incluye los que están modificados por un método conocido. El promotor en el constructo de ADN descrito anteriormente no está particularmente limitado siempre y cuando tenga una actividad promotora en el transformante introducido con el constructo de ADN; sin embargo, tal como se describe a continuación, dado que se prefiere que el constructo de ADN de la presente invención sea introducido en una levadura, el promotor es preferentemente funcional en la levadura.

Entre los ejemplos preferentes del funcionamiento del promotor en la levadura se incluyen los del gen de la fosfatasa ácida (PHO5), los genes de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (TDH1, 2 y 3), los genes de la alcohol deshidrogenasa (ADH1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7), los genes relacionados con el metabolismo de la galactosa (GAL1, 7 y 10), el gen de citocromo c (CYC1), el gen de la triosafosfato isomerasa (TPI1), el gen de la fosfoglicerato quinasa (PGK1), el gen de la fosfofructosa quinasa (PFK1) y los genes de la piruvato descarboxilasa ( PDC1, 5, 6), así como los promotores del gen de la enolasa-1 (ENO1), el gen de la proteína 2 relacionada con la pared celular (CWP2) y el gen de la supresión del defecto exponencial 1 (SED1), que se describen y se utilizan en la solicitud internacional PCT/JP 2008/072129 y exhiben una cantidad de expresión génica de no menos de 5 veces de la cantidad de expresión relativa promedio de todos los genes después de 50 horas o más desde el inicio del cultivo de la levadura.

Entre los ejemplos más preferentes del funcionamiento del promotor en levadura se incluyen el promotor PDC1 y promotor TDH3, que se expresan altamente en la vía de fermentación de etanol de la levadura; y el promotor SED1 que está altamente expresado en una levadura cultivada durante un período prolongado, y ejemplos más específicos incluyen el promotor de PDC1 mostrado en la SEQ ID NO: 5, el promotor SED1 mostrado en la SEQ ID NO: 6 y el promotor TDH3 mostrado en la SEC ID NO: 7.

Además, el promotor PDC1, el promotor SED1 o el promotor TDH3, siempre que se mantenga su actividad promotora, también pueden tener la misma secuencia de nucleótidos tal como se muestra en una de las SEQ ID NOs: 5 a 7, respectivamente, excepto que uno o varios, preferentemente de 1 a 40, más preferentemente de 1 a 30, aún más preferentemente 1 o 20, de forma preferente de 1 a 10, lo más preferente de 1 a 5 nucleótidos se han suprimido, sustituidos y/o añadido.

Además, el promotor PDC1, el promotor SED1 o el promotor TDH3, siempre que se mantenga su actividad promotora, también pueden tener una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en una de las SEQ ID NOs : 5 a 7 o una parte de las mismas, respectivamente. En el presente documento, una secuencia de nucleótidos que "se hibrida bajo condiciones rigurosas" se refiere, por ejemplo, a un polinucleótido que se hibrida por una técnica de hibridación conocida (Current Protocols I Molecular Biology. Edic. Ausubel y otros, (1987) Public. John Wily & Sons, Sección 6.3-6.4) o similares utilizando, como sonda o sondas, uno o una serie de polinucleótidos seleccionados que tienen, como mínimo, 20, preferentemente 25, más preferentemente, como mínimo, 30 nucleótidos consecutivos arbitrarios de la secuencia de nucleótidos original. En el presente documento, las condiciones rigurosas se pueden conseguir, por ejemplo, mediante la realización de la hibridación en presencia de 50% de formamida a una temperatura de hibridación de 37ºC, 42ºC para condiciones más rigurosas, 65ºC para condiciones aún más rigurosas, y el lavado del resultante con una solución SSC (salina-citrato de sodio) 0,1x a 2x (composición de la solución SSC 1x: cloruro de sodio 150 mM y citrato de sodio 15 mM).

La presente invención también incluye un transformante obtenido mediante la introducción del polinucleótido descrito anteriormente o constructo de ADN en una célula huésped. La célula huésped no está particularmente limitada siempre que retenga de forma estable el polinucleótido o constructo de ADN y entre los ejemplos de la misma bacterias se incluyen tales como Escherichia coli, Bacillus subtilis y bacterias de ácido láctico; levadura; células de insectos; células de animales; y células de plantas, y la levadura se utiliza preferentemente ya que es resistente a

los ácidos y capaz de crecer incluso cuando el ácido D-láctico es altamente producido mediante la expresión de un polipéptido que tiene actividad de D-LDH.

Entre los ejemplos de levadura se incluyen los que pertenecen a los géneros Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Hansenura, Yarrowia, Zygosaccharomyces, Torulopsis, Debaryomyces, Issachenkia y Fellomyces; sin embargo, preferentemente, la levadura es una que pertenece al género Saccharomyces, Candida o Kluyveromyces, más preferentemente Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, Candida glabrata, Candida albicans, Candida boidinii, Candida sonorensis, Kluyveromyces lactis o Kluyveromyces marxianus.

Además, en la presente invencion se utiliza preferentemente una levadura poliploide, ya que puede mantener de forma estable una alta productividad de ácido D-láctico durante un período prolongado en condiciones de funcionamiento simples, de manera que el ácido D-láctico puede ser producido de manera estable a un coste bajo. En el presente documento, el término "levadura poliploide" se refiere a una levadura que tiene 2 o más conjuntos de cromosomas en la célula. El número de conjuntos de cromosomas en la levadura poliploide no está particularmente limitado; sin embargo, es preferente una levadura diploide que tiene 2 conjuntos de cromosomas. Entre los ejemplos de levadura poliploide se incluyen levaduras de panadería, levadura de sake, levaduras del vino y levaduras de cerveza que se utilizan con frecuencia en la industria de la fermentación. La levadura poliploide a ser utilizada puede ser una aislada de un entorno natural o una cuyas propiedades están parcialmente modificadas por mutación o recombinación de genes.

Además, en la presente invención, se utiliza preferentemente una levadura prototrófica, ya que no sólo permite la utilización de un medio de cultivo que contiene menos nutrientes que los medios convencionales, es decir, un medio de bajo coste, sino que también permite el mantenimiento estable de un alta productividad de ácido D-láctico durante un período prolongado en condiciones de funcionamiento simples, de manera que el ácido láctico puede ser producido de manera estable a un bajo coste. En el presente documento, el término "auxótrofo" se refiere a que se produjo una mutación en un gen de síntesis de nutrientes de la levadura de tipo salvaje, por alguna razón, lo que resulta en una deficiencia en la capacidad de sintetizar el nutriente. Es decir, la "levadura prototrófica" es una que no tiene el genotipo que muestra auxotrofía o una en la que se complementa dicho genotipo. Entre los ejemplos de un método para la preparación de una levadura prototrófica por reversión de la auxotrofía de una levadura auxótrofa se incluyen un método en el que una auxotrofía se revierte mediante la introducción de un gen de síntesis de nutrientes mediante una técnica de recombinación de genes; y un método en el que se repiten los procesos de apareamiento de levaduras que tienen auxotrofías diferentes entre sí, que permite la formación de ascos y la reversión de una auxotrofía objetivo, hasta que todas las auxotrofías están eventualmente revertidas para obtener una levadura prototrófica. Se hace notar que se puede juzgar si una levadura es prototrófica o no sobre la base de si la levadura es capaz o no de crecer en medio SD, que es un medio mínimo para levaduras.

Además, la levadura es un microorganismo que lleva a cabo de forma vigorosa la fermentación de etanol, y en la vía metabólica del mismo, el ácido pirúvico, que es un producto glucolítico se convierte en acetaldehído mediante la piruvato descarboxilasa, que, a continuación, se convierte en etanol mediante la alcohol deshidrogenasa. Por lo tanto, es preferente que se utilice como huésped una cepa de levadura en la que está destruido el gen de la piruvato descarboxilasa que sirve como punto de partida de la ruta metabólica del etanol, dado que esto permite que el ácido pirúvico, que debe ser metabolizado de forma natural en la ruta metabólica de etanol, sea utilizado en la vía metabólica del ácido D-láctico.

En particular, en el caso de la Saccharomyces cerevisiae, hay tres tipos de genes que codifican una piruvato descarboxilasa: el gen de la piruvato descarboxilasa 1 (PDC1), el gen de la piruvato descarboxilasa 5 (PDC5) y el gen de la piruvato descarboxilasa 6 (PDC6). Entre estos genes, sólo PDC1 y PDC5 se consideran que tienen actividad de piruvato deshidrogenasa en la célula de levadura; por lo tanto, es preferente que se utilice una cepa que tiene destruido el gen PDC1 o el gen PDC5 y es más preferente que se utilice una cepa que tiene destruido el gen PDC1. Además, tal como se describe en el documento JP 2008-048726A, en la cepa que tiene destruido el gen PDC1, es preferente una cepa que tiene un gen PDC5 de tipo mutante que incluye una mutación que resulta en una disminución en la actividad de PDC5, y es más preferente una cepa que tiene el gen PDC5 de tipo mutante sensible a la temperatura. En el presente documento, el "gen PDC5 de tipo mutante sensible a la temperatura” se refiere a un PDC5 de tipo mutante que tiene una propiedad para exhibir una actividad de piruvato descarboxilasa comparable a la del PDC5 de tipo salvaje a una temperatura de cultivo determinada, pero muestra una deleción o disminución de la actividad PDC5 cuando se cambia la temperatura de cultivo a no menos de la temperatura de cultivo determinada. La temperatura de cultivo normal de Saccharomyces cerevisiae es de 28 a 30ºC y es preferente que la temperatura a la que se muestra dicha sensibilidad a la temperatura esté cerca de la temperatura de cultivo normal, ya que esto hace que la cantidad de calor necesaria para cambiar la temperatura de cultivo sea menor, de manera que se puede reducir el coste del cultivo. En particular, es preferente que el PDC5 de tipo mutante sensible a la temperatura exhiba la sensibilidad a la temperatura a una temperatura no inferior a 34ºC.

Entre los ejemplos de un método que permite que un polipéptido que tiene una actividad de D-LDH se exprese en una levadura transformada mediante la introducción del polinucleótido o constructo de ADN de la levadura descritos anteriormente se incluyen, tal como ya se ha descrito, un método en el que un vector que contiene el constructo de

ADN se introduce de forma extracromosómica en una levadura y un método en el que se introduce el polinucleótido

o constructo de ADN en el cromosoma de la levadura, y se pueden emplear ambos métodos.

En el método de introducción del polinucleótido descrito anteriormente en un cromosoma de levadura, se puede utilizar preferentemente un constructo que contiene el polinucleótido de la presente invención y un segmento de ADN para la recombinación homóloga cuya secuencia es homóloga a la del cromosoma de la levadura (en lo sucesivo, también referido como "constructo de ADN para la recombinación homóloga"). El segmento de ADN para la recombinación homóloga tiene una secuencia de ADN que es homóloga a una en la proximidad del sitio diana en el cromosoma de la levadura en la que se va a introducir el polinucleótido de la presente invención. El constructo contiene, como mínimo, uno, preferentemente dos de dichos segmentos de ADN para la recombinación homóloga. En los casos en los que el constructo contiene dos segmentos de ADN para la recombinación homóloga, es preferente que los dos segmentos de ADN para la recombinación homóloga tengan cada uno una secuencia de ADN homóloga con el ADN de la aguas arriba o aguas abajo del sitio diana situado en el cromosoma y que el polinucleótido de la presente invención esté unido entre estos segmentos de ADN.

El método para llevar a cabo la recombinación homóloga utilizando el constructo de ADN para la recombinación homóloga no está particularmente limitado, y se puede emplear un método en el que el constructo de ADN para la recombinación homóloga se amplifica por PCR y el fragmento de PCR resultante es insertado en un plásmido que, a continuación, se introduce en una levadura o un método en el que se introduce el fragmento de PCR en una levadura. Además, se prefiere que el constructo de ADN para la recombinación homóloga contenga un terminador para la regulación de la expresión del polinucleótido de la presente invención. En el presente documento, el "terminador" se refiere a una secuencia que termina la transcripción del ARNm de un gen y, normalmente, se refiere a una secuencia aguas abajo del extremo 3' del gen existente en el cromosoma.

Además, se prefiere que el constructo de ADN para la recombinación homóloga contenga, además del polinucleótido

o el constructo de ADN de la presente invención, un marcador selectivo para realizar la selección de la levadura transformada de forma fácil. Entre los ejemplos del marcador selectivo utilizado en el presente documento se incluyen genes complementarios auxotróficos tales como URA3 y TRP1 y genes de resistencia a fármacos tales como el gen de resistencia G418 y el gen de resistencia a la neomicina.

Un constructo de ADN para la recombinación homóloga que contiene el polinucleótido, el terminador y el marcador selectivo descritos anteriormente se puede preparar por PCR, por ejemplo, según las siguientes etapas 1 a 3.

Etapa 1: Utilizar un plásmido en el que un terminador está unido aguas abajo del polinucleótido de la presente invención como plantilla y los cebadores 1 y 2 como conjunto de cebadores, un fragmento que contiene el polinucleótido de la presente invención y el terminador se amplifica por PCR. El cebador 1 está diseñado de tal manera para añadir una secuencia de no menos de 40 pares de bases complementarias a la secuencia aguas arriba del sitio de diana de introducción, y el cebador 2 está diseñado sobre la base de una secuencia se procedente del plásmido que se encuentra aguas abajo del terminador.

Etapa 2: Utilizar un plásmido que tiene un marcador selectivo, tal como pRS400, pRS424 o pRS426 como plantilla y los cebadores 3 y 4 como conjunto de cebadores, un fragmento que contiene el marcador selectivo se amplifica por PCR. El cebador 3 está diseñado de tal manera que se añada una secuencia de no menos de 30 pares de bases que tiene una homología con una secuencia situada aguas abajo del terminador del fragmento de PCR obtenido en la etapa 1, y el cebador 4 está diseñado de tal forma que se añade una secuencia de no menos de 40 pb correspondientes aguas abajo del sitio diana de introducción.

Etapa 3: Utilizar una mezcla de los fragmentos de PCR obtenidos en las etapas 1 y 2 como plantilla y los cebadores 1 y 4 como conjunto de cebadores, se realiza la PCR para obtener un constructo de ADN para la recombinación homóloga que contiene el polinucleótido de la presente invención, terminador y marcador selectivo de levadura, en el que las secuencias correspondientes a aguas arriba y aguas abajo del sitio diana de introducción se añaden a ambos extremos respectivos.

Con el fin de introducir el constructo de ADN descrito anteriormente para la recombinación homóloga en una levadura, se puede emplear un método tal como transfección, la cotransfección o electroporación. Entre los ejemplos específicos de los mismos se incluyen un método que utiliza acetato de litio y el método de protoplastos.

Al introducir el polinucleótido descrito anteriormente en el cromosoma de levadura mediante recombinación homóloga, la introducción se lleva a cabo de tal manera que el polinucleótido puede ser regulado por un promotor de un gen endógeno ubicado en el cromosoma de la levadura. En este caso, por la introducción del polinucleótido descrito anteriormente, el gen endógeno a ser regulado de forma natural por el promotor puede ser destruido de forma simultánea y el polinucleótido exógeno de la presente invención puede expresarse en lugar de este gen endógeno. Este método es particularmente útil cuando el promotor es un promotor de alta expresión en la levadura tal como se describió anteriormente, y cuando un gen endógeno que funciona para inhibir la vía metabólica del ácido D-láctico de la levadura va a ser destruido.

Entre los ejemplos preferentes del gen endógeno que sirve como diana cuando se introduce el polinucleótido descrito anteriormente en un cromosoma de levadura se incluyen el gen de la fosfatasa ácida (PHO5), los genes de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (TDH1, 2 y 3), los genes de la alcohol deshidrogenasa (ADH1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7), los genes relacionados con el metabolismo de la galactosa (GAL1, 7 y 10), el gen de citocromo c (CYC1), el gen de la triosafosfato isomerasa (TPI1), el gen de la fosfoglicerato quinasa (PGK1), el gen de la fosfofructosa quinasa (PFK1) y los genes de la piruvato descarboxilasa (PDC1, 5, 6), así como los promotores del gen de la enolasa-1 (ENO1), el gen de la proteína 2 relacionado con la pared celular (CWP2) y el gen de la supresión del defecto exponencial 1 (SED1) que se describen y se utilizan en la solicitud internacional PCT/JP 2008/072129 y exhiben una cantidad de expresión génica de no menos de 5 veces de la cantidad de expresión promedio relativa de todos los genes después de 50 horas o más desde el inicio del cultivo de la levadura. En particular, entre los ejemplos más preferentes se incluyen el gen PDC1 y el gen TDH3 que se expresan altamente en la vía de fermentación del etanol de la levadura, y el gen SED1 que está altamente expresado en una levadura cultivada durante un período prolongado. Tal como se ha descrito anteriormente, es aún más preferente que se introduzca el polinucleótido descrito anteriormente de tal manera que se destruya, como mínimo, el gen PDC1 que sirve como punto de partida de la vía de la fermentación del etanol o el gen PDC5, preferentemente el gen PDC1, dado que esto permite que el ácido pirúvico que se metaboliza en la vía metabólica del etanol sea utilizado en la vía metabólica del ácido D-láctico.

Además, como método de introducción del constructo de ADN descrito anteriormente en un cromosoma de levadura, de la misma manera como en el caso de la introducción del polinucleótido descrito anteriormente en un cromosoma de levadura, se puede preparar un constructo de ADN para recombinación homóloga y se introduce en un sitio previsto localizado en el cromosoma por recombinación homóloga. Se hace notar en este caso, dado que el constructo de ADN descrito anteriormente ya contiene un promotor capaz de expresar el polinucleótido descrito anteriormente, no es necesario llevar a cabo la introducción del constructo de ADN de manera que el polinucleótido descrito anteriormente puede ser regulado por un promotor de un gen endógeno ubicado en el cromosoma de la levadura.

En este caso, si el polinucleótido descrito anteriormente o el constructo de ADN se introdujo o no en la posición deseada en el cromosoma de la levadura se puede confirmar mediante PCR o por el método de hibridación Southern. Por ejemplo, la confirmación se puede llevar a cabo mediante la preparación de un ADN de una levadura transformada y la realización de una PCR con un cebador específico del sitio de introducción, seguido por la detección de la banda esperada mediante la realización de la electroforesis para el producto de PCR resultante. Alternativamente, la confirmación se puede llevar a cabo mediante la realización de una PCR con un cebador marcado con un colorante fluorescente o similar. Estos métodos son conocidos por los expertos en la materia.

La presente invención también incluye un procedimiento de preparación de ácido D-láctico, que comprende la etapa de cultivar el transformante descrito anteriormente. Cuando se cultiva el transformante descrito anteriormente, la expresión de un polipéptido que tiene actividad de D-LDH es proporcionada nuevamente o mejorada en el transformante y, por lo tanto, la vía metabólica del ácido D-láctico es proporcionada nuevamente o mejorada. Como resultado, se puede obtener ácido D-láctico llevando a cabo la etapa de separación de ácido D-láctico del cultivo. El término "cultivo" tal como se utiliza en el presente documento abarca un sobrenadante de cultivo, así como el transformante y homogeneizado del mismo.

El método de cultivo del transformante descrito anteriormente no está particularmente limitado y se emplea un método conocido. Por ejemplo, como método de cultivo de la levadura transformada descrita anteriormente, se puede emplear el que se describe en "M.D. Rose y otros, `Methods In Yeast Genetics´, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990)" o similares. En el presente documento, en los casos en que un plásmido que contiene el constructo de ADN o constructo de ADN para recombinación homóloga descritos anteriormente contiene un marcador selectivo, mediante el cultivo del transformante descrito anteriormente en un medio libre de nutrientes o medio suplementado con fármacos en dependencia del marcador selectivo, se puede seleccionar un transformante deseado.

Como medio en el que se cultiva el transformante descrito anteriormente, siempre que contenga una fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales inorgánicas y similares, que se pueden utilizar por el transformante y permite el cultivo eficiente del mismo, se puede utilizar cualquier medio natural o medio sintético. Por ejemplo, en el caso de una levadura transformada, se pueden utilizar como fuente de carbono, carbohidratos tales como glucosa, fructosa, sacarosa, galactosa, maltosa, rafinosa, trehalosa, sorbosa, celobiosa, lactosa, melibiosa, melezitosa, inulina, xilosa, arabinosa, ribosa, ramnosa, glucosamina, eritritol, ribitol, manitol, glucitol, salicina y almidón; ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico y ácido cítrico, y alcohol tal como etanol y propanol. Como fuente de nitrógeno, se pueden utilizar además de sales de amonio de un ácido inorgánico u orgánico tales como amoniaco, cloruro de amonio, sulfato de amonio, acetato de amonio y fosfato de amonio y otros compuestos que contienen nitrógeno, peptona, extracto de carne, licor de maceración de maíz y similares. Como compuesto inorgánico, se pueden utilizar fosfato monopotásico, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro de sodio, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, sulfato de cobre, carbonato de calcio y similares.

En el cultivo del transformante descrito anteriormente, por lo general, la condición del mismo se establece en una en

la que se obtiene una buena productividad de ácido láctico, que va desde una condición aeróbica, tal como el cultivo con agitación o cultivo con aireación y agitación, a una condición anaeróbica en la que no se realiza la aireación, y el cultivo se lleva a cabo preferentemente bajo una condición microaeróbica o condición anaeróbica. El cultivo se puede llevar a cabo a una temperatura de cultivo de 25 a 37ºC; sin embargo, es preferente una temperatura de 28 a 35ºC. Dado que el pH del cultivo disminuye a medida que el ácido D-láctico se acumula en el medio, también se puede neutralizar por una sustancia alcalina tal como hidróxido de calcio, carbonato de calcio, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco acuoso o amoniaco gaseoso. Además, con el fin de facilitar la purificación posterior del ácido láctico, el cultivo también puede llevarse a cabo sin dicha neutralización. Por otra parte, el método de cultivo no está particularmente limitado siempre que se pueda producir el ácido D-láctico de interés por fermentación, y se puede emplear el cultivo discontinuo, cultivo discontinuo alimentado, cultivo quimiostato, cultivo continuo o similares. Preferentemente, el cultivo se lleva a cabo por cultivo discontinuo o el cultivo continuo que utiliza una membrana que se describe en el documento WO2007/097260, en el que el cultivo de fermentación se separa en un filtrado y un no filtrado utilizando una membrana de separación que no es propensa a la obstrucción y se recoge un producto de fermentación deseado del filtrado, y, al mismo tiempo, el filtrado no se retiene o se hace fluir nuevamente hacia el cultivo de fermentación.

El método de medición del ácido D-láctico obtenido en el cultivo descrito anteriormente no está particularmente limitado, y entre lo ejemplos del mismo se incluyen un método que utiliza HPLC y un método que utiliza el F-Kit (fabricado por Roche).

El ácido D-láctico contenido en el cultivo de fermentación descrito anteriormente se puede separar y purificar por una combinación de aquellos métodos conocidos convencionalmente de concentración, destilación, cristalización y similares, y entre los ejemplos de los mismos se incluyen un método en el que el pH del líquido de fermentación filtrado y separado se ajusta a no más de 1, seguido por extracción con éter dietílico, acetato de etilo o similares; un método en el que se permite que el ácido láctico se adsorba a una resina de intercambio iónico seguido por lavado y elución; un método en el que se permite que el ácido láctico reaccione con un alcohol en presencia de un catalizador ácido para obtener un éster, que se destila a continuación; un método en el que el ácido láctico se cristaliza en forma de una sal de calcio o sal de litio, y un método de separación y purificación en el que se utilizan en combinación el nanofiltro que se describe en el documento WO2009/004922 y la destilación.

EJEMPLOS

Los modos de llevar a cabo la presente invención se describirán a continuación mediante ejemplos; sin embargo, estos modos son solamente ejemplos de la presente invención y la presente invención no se limita a los mismos.

(Ejemplo 1) Secuenciación de nucleótidos de los polinucleótidos provenientes de Limulus polyphemus que codifican un polipéptido que tiene actividad de D-LDH (en adelante, referido como "genes D-LDH provenientes de Limulus polyphemus")

Para la preparación de los ADNc de Limulus polyphemus, se purificó ARN poli A (+). El ARN poli A (+) se aisló a partir de hemocitos de Limulus polyphemus. Se separó ARN total de los hemocitos de Limulus polyphemus (adquiridos de Marine Biological Laboratory (EE.UU.)) según el método AGPC (véase Experimental Medicine Vol. 9 (1991), pág.1937-1940). El ARN poli A (+) se aisló a partir del ARN total separado de este modo utilizando "OligotexdT30 Super Kit" (fabricado por Takara Bio Inc.). A continuación, mediante la utilización de "Superscript II Reverse Transcriptase" (fabricado por Invitrogen) y oligo d (T) como cebador, se sintetizaron los ADNc. A continuación, mediante la utilización de la solución de reacción obtenida de este modo como plantilla y los oligo ADN que se muestran en las SEC ID NO: 8 y 9 como cebadores, cuyos oligo ADN se diseñaron prestando atención a las secuencias de ADN altamente conservadas en los genes de D-LDH, se realizó la PCR para amplificar las secuencias parciales de los genes D-LDH provenientes de Limulus polyphemus. La PCR se realizó bajo las siguientes condiciones: 95ºC (3 minutos); {95ºC (30 segundos) – 45ºC (30 segundos) – 72ºC (30 segundos)} x 35 ciclos; 72ºC (5 minutos). A continuación, los fragmentos de ADN amplificados de este modo se verificaron mediante electroforesis utilizando gel de agarosa al 1,0%, y después de la purificación de un fragmento amplificado de 600 pb utilizando "QIA quick Gel extraction kit" (fabricado por Qiagen), este fragmento se clonó en un vector de plásmido "pGEMt-easy" (fabricado por Promega) y se secuenció el ADN. La secuenciación de nucleótidos se realizó utilizando "Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit" (fabricado por Applied Biosystems), según el método de Sanger. Como resultado, se obtuvieron dos tipos de secuencias parciales (D-LDH1 y D-LDH2) que se cree que corresponden a los genes de D-LDH provenientes de Limulus polyphemus.

A continuación, utilizando los métodos 5' RACE y 3' RACE, se clarificaron todas las secuencias ORF de D-LDH1 y D-LDH2. El 5' RACE se realizó por el método siguiente. En primer lugar, se mezclaron 50 µl del oligo ADN que se muestra en la SEC ID NO: 10 (para D-LDH1) o la SEC ID NO: 11 (para D-LDH2) que se ajustó a 100 µM, 50 unidades de T4 polinucleótido quinasa (fabricado por Takara Bio Inc.), 10 µl de tampón de quinasa 10x (Tris-HCl 500 mM pH 7,6, MgCl2 100 mM, DTT 50 mM, espermidina 1 mM, EDTA 1 mM), 1 µl de ATP 100 mM y 34 µl de agua destilada y se dejó reposar a 37ºC durante 1 hora para fosforilar el extremo 5' del oligo ADN, y este oligo ADN se purificó mediante la realización de un tratamiento de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico y precipitación con etanol. A continuación, mediante la utilización del ARN poli A (+) de Limulus polyphemus como plantilla, "Superscript II

Reverse Transcriptase" (fabricado por Invitrogen) y el oligo ADN fosforilado descrito anteriormente como cebadores, se sintetizó ADNc. A continuación, el ADNc de hebra única se concatemerizó por reacción de ligación utilizando "5’-Full RACE Core Set" (fabricado por Takara Bio Inc.) y la primera PCR se realizó utilizando el ADNc concatemerizado preparado de este modo como plantilla y los oligo ADN que se muestran en las SEC ID NO: 12 y 13 (para D-LDH1)

o los que se muestran en las SEQ ID NO: 14 y 15 (para D-LDH2) como cebadores. Además, la segunda PCR se realizó utilizando la solución de reacción resultante como plantilla y los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 16 y 17 (para D-LDH1) o los que se muestran en las SEQ ID NO: 18 y 19 (para D-LDH2) como cebadores. La verificación y purificación de los fragmentos amplificados y las secuencias de nucleótidos de los mismos se realizó tal como se ha descrito anteriormente.

El 3' RACE se realizó por el método siguiente. En primer lugar, mediante la utilización del ARN poli A (+) de Limulus polyphemus como plantilla, "Superscript II Reverse Transcriptase" (fabricado por Invitrogen) y oligo d (T) como cebador, se sintetizó ADNc. A continuación, mediante la utilización de esta solución de reacción como plantilla y el oligo d (T) y el oligo ADN que se muestra en la SEC ID NO: 13 (para D-LDH1) o la SEC ID NO: 15 (para D-LDH2) como cebadores, se llevó a cabo la primera PCR. Además, la segunda PCR se realizó utilizando la solución de reacción resultante como plantilla y los oligo d (T) y el oligo de ADN que se muestra en la SEC ID NO: 17 (para D-LDH1) o la SEC ID NO: 19 (para D-LDH2) como cebadores. La verificación y purificación de los fragmentos amplificados y las secuencias de nucleótidos de los mismos se realizaron tal como se ha descrito anteriormente.

La secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) del gen D-LDH1 proveniente de Limulus polyphemus y la secuencia ORF de ADNc (SEQ ID NO: 3), o la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de D-LDH2 y la secuencia ORF de ADNc (SEQ ID NO: 4) se determinaron por ligación de las secuencias obtenidas en el método descrito anteriormente. Se hace notar en este caso que las identidades de secuencia entre las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO: 1 y 2 y entre las secuencias de nucleótidos que se muestran en las SEQ ID NO: 3 y 4 se determinaron por BLAST y fueron del 93% y 82%, respectivamente.

(Ejemplo 2) Construcción de un plásmido que expresa los genes D-LDH provenientes de Limulus polyphemus

Mediante la utilización, como conjunto de cebadores, de los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 20 y 21

o los que se muestran en las SEQ ID NO: 22 y 23, que corresponden respectivamente al ORF del lado 5' y ORF del lado 3' del gen D-LDH1 y del gen D-LDH2 que se secuenciaron en el ejemplo 1 y se cree que son los genes D-LDH provenientes de Limulus polyphemus (en lo sucesivo, referidos como "gen Lp. D-LDH1" y "gen Lp. D-LDH2", respectivamente) y, como plantilla, el ADNc sintetizado a partir del ARN poli A (+) de Limulus polyphemus, se realizó una PCR para clonar los genes. Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo se digirieron con las enzimas de restricción XhoI y NotI y se introdujeron en los sitios de escisión del vector de expresión de levadura pTRS11 (que porta el promotor TDH3 y gen marcador selectivo URA3; véase el documento JP 2006-280368A: se hace notar en este caso, en este documento, el promotor y el terminador TDH3 se indican como promotor y el terminador GAPDH), que fueron digeridos de la misma manera con las enzimas de restricción XhoI y NotI, para preparar vectores plasmídicos que contienen un constructo de ADN en el que el promotor de TDH3 y el gen Lp. D-LDH1 o el gen Lp. D-LDH2 están unidos. En lo sucesivo, estos vectores plasmídicos son referidos como "pTRS205" (que porta Lp. D-LDH1) y "pTRS206" (que porta Lp. D-LDH2). En este caso, el vector pTRS11 se preparó por digestión del vector pNV11 (véase Nature, vol. 357, 25 de junio de 1992 pág. 700) con la enzima de restricción XhoI y, después de la eliminación de los insertos, permitir que sea autoligado.

(Ejemplo 3) Introducción del plásmido que expresa los genes D-LDH provenientes de Limulus polyphemus en levadura

Se introdujeron pTRS205 y pTRS206 obtenidos tal como se describe en el ejemplo 2 en la cepa SW029-1B de la levadura Saccharomyces cerevisiae (genotipo: MATa ura TRP (Lpdc1::TRP1) his ade lys leu) (en lo sucesivo, referida como "cepa SW029-1B"). La introducción de los plásmidos se llevó a cabo mediante un método de acetato de litio utilizando "YEASTMAKER Yeast Transformation System" (fabricado por Clonetech) (para más detalles, véase el protocolo adjunto). La cepa SW029-1B utilizada como huésped es una cepa que carece de capacidad de síntesis de uracilo y, por la acción del gen URA3 marcador selectivo de pTRS205 y 206, la levadura transformada en la que se introdujeron pTRS205 y pTRS206 se puede seleccionar en un medio sin uracilo. La introducción de los vectores de expresión del gen D-LDH en los transformantes obtenidos de esta manera se confirmó mediante la extracción de ADN genómico que contiene ADN plasmídico a partir de los transformantes cultivados en un medio líquido sin uracilo utilizando un kit de extracción de ADN genómico "Dr. GenTLE" (fabricado por Takara Bio Inc.) y la realización de PCR utilizando el ADN genómico extraído de este modo como plantilla. Como cebadores, se emplearon los que fueron utilizados para la clonación de los genes de D-LDH provenientes de Limulus polyphemus, respectivamente. Como resultado, se confirmó que cada uno de los genes D-LDH provenientes de Limulus polyphemus se introdujeron respectivamente en todas las células de levadura transformadas.

(Ejemplo 4) Ensayo de productividad de ácido D-láctico 1

Mediante la utilización de las cepas SW029-1B de Saccharomyces cerevisiae obtenidas tal como se describe en el ejemplo 3 en el que se introdujeron pTRS205 y 206 (en lo sucesivo, referidas como "cepa SW029-1B/pTRS205" y

"cepa SW029-1B/pTRS206, respectivamente ), se llevó a cabo el ensayo de productividad de ácido D-láctico.

Se añadió medio SC3 que tenía la composición que se muestra en la tabla 1 de la que se eliminó uracilo (medio SC3-Ura) en tubos de ensayo en una cantidad de 10 ml. Una pequeña cantidad de cada cepa se inoculó en el mismo y se cultivó durante la noche a 30ºC (precultivo). A continuación, se añadieron 10 ml de medio SC3-Ura en tubos de ensayo y 100 µl de cada uno de los medios de precultivo obtenidos de este modo fue inoculado, seguido por el cultivo a 30ºC con agitación (cultivo principal). Después de 40 horas desde el inicio del cultivo principal, los medios de cultivo se centrifugaron y se midió el ácido láctico contenido en los sobrenadantes resultantes por HPLC en las siguientes condiciones: Columna: "Shim-Pack SPR-H" (fabricada por Shimadzu Corporation) Fase móvil: ácido p-toluenosulfónico 5 mM (caudal = 0,8 ml/min) Solución de reacción: ácido p-toluenosulfónico 5 mM, BisTris 20 mM, EDTA-2Na 0,1 mM (caudal = 0,8 ml/min) Método de detección: conductividad eléctrica Temperatura: 45ºC.

Además, sobre la base de los resultados de la medición de las concentraciones de ácido D-láctico y ácido L-láctico por el método de HPLC en las siguientes condiciones, se calculó la pureza óptica del ácido D-láctico utilizando las siguientes ecuaciones. Columna: "TSK-gel enantio LI" (marca registrada: fabricada por Tosoh Corporation) Fase móvil: Solución de sulfato de cobre acuoso 1 mM Caudal: 1,0 ml/min Método de detección: UV 254 nm Temperatura: 30ºC Pureza óptica (% e.e.) = 100 x (D – L)/(D + L) Pureza óptica (%) = 100 x D/(D + L) En las ecuaciones anteriores, L representa la concentración de ácido L-láctico y D representa la concentración de ácido D-láctico.

[Tabla 1]

Glucosa: 100 g/l

Sulfato de amonio: 1,5 g/l

Base nitrogenada de levadura sin aminoácidos y sulfato de amonio (fabricado por Difco): 1,7 g/l

19 aminoácidos estándar distintos de leucina: 152 mg/l

Leucina: 760 mg/l

Inositol: 152 mg/l

p-aminobenzoato: 16 mg/l

Adenina: 40 mg/l

Uracilo: 152 mg/l

Como resultado, la concentración del ácido D-láctico acumulado fue de 13 g/l para la cepa SW029-1B/pTRS205 y 12 g/l para la cepa SW029-1B/pTRS206. Además, sólo se detectó ácido D-láctico en los medios de cultivo y el nivel de ácido L-láctico no fue mayor que el límite de detección. Se confirmó que la levadura transformada fue capaz de producir ácido D-láctico mediante la introducción en la misma de los genes D-LDH clonados de Limulus polyphemus.

(Ejemplo 5) Introducción de los genes D-LDH provenientes de Limulus polyphemus en el cromosoma de la levadura

Mediante las siguientes etapas 1 a 3, se preparó un constructo de ADN para la recombinación homóloga, que tiene los genes D-LDH provenientes de Limulus polyphemus.

[Etapa 1]

Mediante la utilización como plantillas de pTRS205 que porta el gen Lp. Gen D-LDH1 y pTRS206 que porta el gen Lp. D-LDH2, que se obtuvieron en el ejemplo 2, y los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 24 y 25 o los que se muestran en las SEQ ID NO: 26 y 25 como conjunto de cebadores, se realizó una PCR para amplificar fragmentos de ADN de aproximadamente 1,1 kb que contienen cada uno de los genes D-LDH. En este caso, los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 24 y 26 se han diseñado de tal manera que se añade una secuencia que tiene una homología con la región de 65 pb aguas arriba del gen PDC1.

[Etapa 2]

A continuación, mediante la utilización como plantilla del plásmido pRS424 (número de acceso en GenBank: U03453) y los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 27 y 28 como conjunto de cebadores, se realizó una PCR para amplificar un fragmento de ADN de aproximadamente 1,4 kb que contenía el gen TRP1, que es un marcador de selección de levadura. En este caso, el oligo ADN que se muestra en la SEC ID NO: 28 se diseñó de

tal manera que se añade una secuencia que tiene una homología con la región de 65 pb aguas abajo del gen PDC1.

[Etapa 3]

Después de separar los fragmentos de ADN por electroforesis en gel de agarosa al 1%, se purificaron utilizando "QIA quick Gel extraction kit" (fabricado por Qiagen). Mediante la utilización de una mezcla de los fragmentos de 1,1 kb obtenidos de este modo que contienen los genes D-LDH respectivos y el fragmento de 1,4 kb que contenía el gen TRP1 como plantilla y los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 24 y 28 o los que se muestran en las SEQ ID NO: 26 y 28 como conjunto de cebadores, se realizó una PCR para amplificar una constructo de ADN de aproximadamente 2,5 kb utilizado para la recombinación homóloga en el que cada uno de los genes D-LDH, terminador TDH3 y gen TRP 1 estaban unidos.

El constructo de ADN para la recombinación homóloga preparado de la manera descrita anteriormente se transformó en la cepa SW092-2D de Saccharomyces cerevisiae (en lo sucesivo, referida como "cepa SW092-2D"), que es una cepa NBRC10505 de Saccharomyces cerevisiae (en lo sucesivo, referida como "cepa NBRC10505") en el que está revertida la auxotrofía de lisina.

La cepa SW092-2D se preparó por el método siguiente. Mediante la utilización del ADN genómico de la cepa BY4741 de Saccharomyces cerevisiae fabricado por Funakoshi Corporation como plantilla y los oligonucleótidos (SEQ ID NO: 29 y 30) como conjunto de cebadores, se realizó una PCR para amplificar un fragmento de PCR de aproximadamente 2 kb correspondiente a la primera mitad de el gen LYS2. Después de separar el fragmento de PCR por electroforesis en gel de agarosa al 1% y purificarlo según un método convencional, el fragmento de PCR se transformó en la cepa NBRC10505 para cancelar la mutación ámbar en el gen LYS2. Mediante el cultivo de la cepa de levadura en un medio sin lisina, se seleccionó un transformante en el que se revirtió la capacidad de síntesis de lisina (cepa NBRC10505(LYS2)). Con el fin de confirmar que el transformante obtenido de este modo es una levadura en la que se ha cancelado la mutación ámbar en el gen LYS2, se llevaron a cabo las siguientes etapas. En primer lugar, se obtuvieron células diploides por apareamiento del transformante obtenido de este modo con la cepa LO0GY7 de Saccharomyces cerevisiae que tiene el gen LYS2 de tipo salvaje y las células diploides se cultivaron en un medio de formación de ascos para permitir la formación de ascos. Los ascos resultantes se anatomizaron utilizando un micromanipulador para obtener las células haploides respectivas (tétrada) y la auxotrofía se examinó para cada una de las células haploides. Se confirmó que todas las células haploides obtenidas de este modo tienen capacidad de síntesis de lisina. La cepa NBRC10505(LYS2) obtenida de este modo y la cepa NBRC10506 se aparearon y los ascos resultantes se anatomizaron utilizando un micromanipulador para obtener la cepa SW092-2D (genotipo: MATa ura3 leu2 trp1 his3 ade2 LYS2).

La cepa SW092-2D se transformó con el constructo de ADN descrito anteriormente para la recombinación homóloga y se cultivó en un medio sin triptófano para seleccionar las levaduras transformadas. Las levaduras transformadas obtenidas de este modo son referidas en lo sucesivo como "cepa SW092-2D (Lpdc1::Lp.D-LDH1-TRP1)" y "cepa SW092-2D (Lpdc1::Lp.D-LDH2-TRP1)".

(Ejemplo 6) Ensayo de productividad de ácido D-láctico 2

Mediante la utilización de la cepa SW092-2D (Lpdc1::Lp.D-LDH1-TRP1), la cepa SW092-2D (Lpdc1::Lp.D-LDH2-TRP1) y un fermentador de mini-jarra (fabricado por B.E. Marubishi Co., Ltd., 5 L), se evaluó su fermentación.

Se añadió el medio SC3 que se muestra en la tabla 1 a un tubo de ensayo en una cantidad de 10 ml y una pequeña cantidad de cada cepa se inoculó en el mismo y se cultivaron durante toda la noche a 30ºC (pre-precultivo). A continuación, a 45 ml de medio de SC3 colocado en un matraz Erlenmeyer, se añadieron 5 ml del medio de preprecultivo obtenido de este modo y se cultivó a 30ºC durante otras 8 horas (precultivo). Toda la cantidad del medio de precultivo obtenido de este modo se inoculó en 1 L de medio SC3 colocado en el fermentador de mini-jarra y se cultivó durante 30 horas. A continuación se muestran las condiciones de cultivo:

pH: pH 5 Aireación: 100 ml/min Agitación: 120 rpm Neutralizador: hidróxido de sodio 1N.

La cantidad del medio de cultivo al final del periodo de cultivo y las concentraciones de ácido D-láctico y de glucosa en el medio de cultivo se midieron mediante "Glucose Test Wako C" (marca registrada) (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) para determinar el rendimiento de ácido láctico con respecto al sacárido sobre la base de la glucosa añadida, calculado a partir del ácido láctico medido de este modo y las concentraciones de glucosa. Como resultado, se confirmó que SW092-2D (Lpdc1::Lp.D-LDH1-TRP1) y SW092-2D (Lpdc1::Lp.D-LDH2-TRP1) produjeron ácido D-láctico con un rendimiento de ácido láctico con respecto al sacárido del 45% y 42%, respectivamente.

(Ejemplo comparativo 1) Clonación del gen D-LDH proveniente de bacteria de ácido láctico y evaluación de la fermentación

Como gen D-LDH capaz de realizar de manera eficiente la producción fermentativa de ácido D-láctico en levadura transformada, es conocido el gen D-LDH proveniente de la cepa ATCC 9135 de Leuconostoc mesenteroides se conoce (véase la solicitud internacional WO2004/104202). Por clonación de este gen D-LDH (en lo sucesivo, referido como "gen Lm. D-LDH") y su introducción en la levadura para permitir la fermentación, se examinó la actividad de D-LDH del gen Lm. D-LDH mediante la comparación con la del gen Lp. D-LDH1 o Lp. D-LDH2 gen provenientes de Limulus polyphemus.

Mediante la utilización de un conjunto de cebadores (SEQ ID NO: 31 y 32) que fueron diseñados por referencia a las secuencias de nucleótidos descritas en la solicitud internacional WO2004/104202 y la cepa ATCC 9135 como plantilla, se clonó el gen Lm. D-LDH mediante PCR de colonias (utilizando "KOD-Plus-polymerase" fabricado por Toyobo Co., Ltd.). Después de la purificación del fragmento amplificado por PCR obtenido de este modo y la fosforilación del extremo del mismo con "T4 Polynucleotide Kinasa" (fabricado por Takara Bio Inc.), el fragmento se ligó al vector pUC118 (que había sido digerido con una enzima de restricción HincII y el corte superficie había sido desfosforilado). La ligación se llevó a cabo utilizando "DNA Ligation kit Ver.2" (fabricado por Takara Bio Inc.). Se transformó DH5a de Escherichia coli con el plásmido producto de la ligación y se recogió el ADN de plásmido para obtener un plásmido en el que se subclonó el gen Lm. D-LDH. El plásmido pUC118 obtenido de este modo en el que se insertó el gen Lm. D-LDH fue digerido con las enzimas de restricción XhoI y NotI, y los fragmentos de ADN resultantes se insertaron cada uno en el sitio de escisión XhoI/NotI del vector pTRS11 para la expresión en levadura. De esta manera, se obtuvo el plásmido pTRS207 que expresa el gen Lm. D-LDH.

A continuación, el gen Lm. D-LDH se introdujo en el locus del gen de PDC1 en el cromosoma de la cepa SW092-2D de Saccharomyces cerevisiae de la misma manera que en el ejemplo 5, excepto que se utilizó pTRS207 como plantilla y se utilizó el conjunto de cebadores que se muestra en la SEC ID NO: 33 en lugar del cebador que se muestra en la SEQ ID NO: 24 ó 26. La levadura transformada preparada de este modo es referida en lo sucesivo como "SW092-2D (Lpdc1::Lm. D-LDH-TRP1)". A continuación, de la misma manera que en el ejemplo 6, se evaluó la productividad de D-lactato mediante cultivo discontinuo. Como resultado, el rendimiento con respecto al sacárido por SW092-2D (Lpdc1::Lm. D-LDH-TRP1) fue del 38%. El resultado se muestra en la tabla 2 junto con los resultados del ejemplo 6.

[Tabla 2]

Nombre de la cepa: SW092-2D (Lpdc1::Lp. D-LDH1-TRP1 SW092-2D (Lpdc1::Lp. D-LDH2-TRP1 SW092-2D (Lpdc1::Lm. D-LDH-TRP1

Rendimiento de ácido láctico con respecto al sacárido (%): 45 42 38

(Ejemplo de referencia 1) Preparación de una levadura en la que se introduce el gen L-LDH proveniente de Xenopus laevis

Según el método descrito en el documento JP 2008-029329A, se preparó la levadura en la que se introdujo el gen L-LDH proveniente de Xenopus laevis (gen X. L-LDH) en el locus del gen PDC1. En este caso, como levadura que se utiliza para la introducción del gen en el cromosoma, se utilizó una cepa NBRC10506 en la que la auxotrofía de adenina está revertida (cepa SU013-1D). La cepa SU013-1D se preparó por el método siguiente. Mediante la utilización del plásmido pRS422 como plantilla y los oligonucleótidos (SEQ ID NO: 34 y 35) como conjunto de cebadores, se realizó una PCR para amplificar un fragmento de PCR de aproximadamente 2 kb correspondiente al gen ADE2. Después de separar el fragmento de PCR por electroforesis en gel de agarosa al 1% y purificarlo según un método convencional, el fragmento de PCR se transformó para cancelar la mutación en el gen ADE2. Mediante el cultivo de la cepa de levadura en un medio sin adenina, se seleccionó un transformante en el que se revirtió la capacidad de síntesis de adenina.

Con el fin de confirmar que el transformante obtenido de este modo es una levadura en la que se canceló la mutación en el gen ADE2, se llevaron a cabo las siguientes etapas. En primer lugar, las células diploides se obtuvieron por apareamiento del transformante obtenido de este modo con la cepa LO0GY77 de Saccharomyces cerevisiae que tenía el gen ADE2 de tipo salvaje y las células diploides se cultivaron en un medio de formación de ascos para permitir la formación de los ascos. Los ascos resultantes se anatomizaron utilizando un micromanipulador para obtener las respectivas células haploides (tétrada) y se examinó la auxotrofía para cada una de las células haploides. Se confirmó que todas las células haploides obtenidas de este modo tenía la capacidad de síntesis de adenina. La cepa NBRC10506 (ADE2) obtenida de este modo y la cepa NBRC10505 se aparearon y los ascos resultantes se anatomizaron utilizando un micromanipulador para obtener la cepa SU013-1D (genotipo: MATa ura3 leu2 trp1 his3 ADE2 lys2). La levadura transformada obtenida de este modo es referida en lo sucesivo como "cepa SU013-1D (Lpdc1::X. L-LDH-TRP1)".

(Ejemplo 7, ejemplo comparativo 2) ensayo de productividad de ácido D-láctico 3

La cepa SU013-1D (Lpdc1::X. L-LDH-TRP1) preparada en el ejemplo de referencia 1 se apareó con cada una de las cepas SW092-2D (Lpdc1::Lp. D-LDH1- TRP1), la cepa SW092-2D (Lpdc1::Lp. D-LDH2-TRP1) y la cepa SW092-2D (Lpdc1::Lm. D-LDH-TRP1), que se prepararon en el ejemplo 5 y en el ejemplo comparativo 1, preparando de este modo levaduras diploides que tenían el gen L-LDH y el gen D-LDH heterocigótico en el locus del gen PDC1. Las levaduras diploides preparadas de este modo son referidas en lo sucesivo como "cepa Lp1-X, cepa Lp2-X y cepa Lm-X, respectivamente".

A continuación, la cepa Lp1-X, la cepa Lp2-X y la cepa Lm-X se cultivaron en lotes bajo las mismas condiciones que en el ejemplo 5, y se evaluó la pureza óptica del ácido láctico producido (tabla 3).

[Tabla 3]

Nombre de la cepa: Lp1-X Lp2-X Lm-X

Rendimiento de ácido D-láctico (%): 48,3 47,5 43,8

Pureza óptica de ácido D-láctico (%): 52,3 51,7 44,4

Como resultado, la levadura que tenía el gen D-LDH proveniente de Limulus polyphemus produjo ácido D-láctico con una pureza óptica de no menos de 50%, mientras que la pureza óptica del ácido D-láctico producido por la levadura que tenía el gen D-LDH proveniente de Leuconostoc mesenteroides fue de 44,4%. Dado que el rendimiento con respecto al sacárido en el que cada levadura produce ácido D-láctico y la pureza óptica de los mismos se cree que es proporcional a la actividad de D-LDH en las levaduras transformadas con el gen D-LDH, a partir de los resultados que se muestran en las tablas 2 y 3, se confirmó que, cuando se introduce en la levadura, el gen D-LDH proveniente de Limulus polyphemus codifica un polipéptido que tenía una actividad mayor que la de un polipéptido codificado por el gen D-LDH proveniente de Leuconostoc mesenteroides.

(Ejemplo 8) Introducción de múltiples copias del gen D-LDH en el cromosoma de la levadura y preparación de la levadura PDC5 de tipo mutante sensible a la temperatura

A continuación, se evaluó la preparación de una levadura en la que se introdujo el gen D-LDH proveniente de Limulus polyphemus también en los locus de otros genes diferentes al locus del gen PDC1 con el fin de mejorar aún más el rendimiento de ácido D-láctico, y se introdujo el gen D-LDH en el gen TDH3 cuyo efecto de introducción se describe en el documento JP 2008-029329A y el locus del gen SED1 cuyo efecto de introducción se describe en la solicitud internacional PCT/JP 2008/072129. Además, se introdujo también el gen PDC5 de tipo mutante sensible a la temperatura que se describe en el documento JP 2008-048726A.

[Introducción del gen D-LDH en el locus del gen TDH3]

Para la introducción en el locus del gen TDH3, de la misma manera que en el método de preparación de pTRS150 que se describe en el documento JP 2008-029329A, se preparó un plásmido pTRS208 en el que se sustituyó el terminador TDH3 de pTRS205 que porta el gen Lp. Gen D-LDH1 con el terminador ADH1. A continuación, mediante la utilización de la SEC ID NO: 36 en lugar de la SEC ID NO: 8 del documento JP 2008-029329A como cebador y pTRS208 como plantilla, se obtuvo un constructo de ADN para la recombinación homóloga a ser utilizado para la introducción en el locus del gen TDH3.

Como levadura en la que se introdujo el constructo de ADN descrito anteriormente para la recombinación homóloga, se empleó una cepa prototrófica de leucina de la cepa SU013-1D (cepa SW087-2C). El método de preparación de la cepa SW087-2C se describe a continuación. Mediante la utilización del plásmido pRS425 como plantilla y los oligonucleótidos (SEQ ID NO: 37 y 38) como conjunto de cebadores, se realizó una PCR para amplificar un fragmento de PCR de aproximadamente 2 kb correspondiente al gen LEU2. Después de separar el fragmento de PCR por electroforesis en gel de agarosa al 1% y purificarlo según un método convencional, el fragmento de PCR purificado de este modo se transformó en la cepa SU013-1D para cancelar la mutación en el gen LEU2. Mediante el cultivo de la cepa de levadura en un medio sin leucina, se seleccionó un transformante en el que se revirtió la capacidad de síntesis de la leucina. Con el fin de confirmar que el transformante obtenido de este modo es una levadura en la que se ha cancelado la mutación en el gen LEU2, se llevaron a cabo las siguientes etapas. En primer lugar, se obtuvieron células diploides por apareamiento del transformante obtenido de este modo con la cepa LO0GY77 de Saccharomyces cerevisiae que tiene el gen LEU2 de tipo salvaje y las células diploides se cultivaron en un medio de formación de ascos para permitir la formación de los ascos. Los ascos resultantes se anatomizaron utilizando un micromanipulador para obtener las células haploides respectivas (tétrada) y se examinó la auxotrofía para cada una de las células haploides. Todas las células haploides obtenidas de este modo se confirmó que tenían la capacidad de síntesis de leucina. La cepa SU013-1D (LEU2) obtenida de este modo y la cepa NBRC10505 se aparearon y los ascos resultantes se anatomizaron utilizando un micromanipulador para obtener la cepa SW087-2C (genotipo: MATa ura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 lys2).

La cepa SW087-2C se transformó con el constructor de ADN descrito anteriormente para la recombinación homóloga y se cultivó en un medio sin uracilo para la selección para obtener una levadura transformada en la que se

introdujo el gen Lp. D-LDH1 en el locus del gen TDH3. La levadura transformada obtenida de este modo es referida en lo sucesivo como "cepa SW087-2C (LTDH3::Lp. D-LDH-URA3)".

[Introducción del gen D-LDH en el locus del gen SED1]

La introducción en el locus del gen SED1 se llevó a cabo mediante la modificación del método descrito en el ejemplo 2 de la solicitud internacional PCT/JP 2008/072129. Es decir, mediante la utilización de pTRS205 en lugar de pTRS102 como plantilla para la PCR y la SEC ID NO: 39 en lugar de la SEC ID NO: 14 de la publicación de la solicitud internacional descrita anteriormente como cebador, se obtuvo un constructo de ADN para la recombinación homóloga a ser utilizado para la introducción en el locus del gen SED1.

Como levadura en la que se introduce el constructo de ADN descrito anteriormente para la recombinación homóloga, se empleó la cepa SW092-7D cepa (genotipo: MATa ura3 leu2 trp1 his3 ADE2 LYS2), que se obtuvo en el apareamiento de la cepa NBRC10505 (LYS2) preparada en el ejemplo 5 con la cepa NBRC10506 (ADE2) preparada en el ejemplo de referencia 1 y mediante la separación por anatomización de los ascos resultantes con un micromanipulador.

La cepa SW092-7D se transformó con el constructo de ADN descrito anteriormente para la recombinación homóloga y se cultivó en un medio sin histidina para la selección para obtener una levadura transformada en la que se introdujo el gen Lp. D-LDH1 en el locus del gen SED1. La levadura transformada obtenida de este modo es referida en lo sucesivo como "cepa SW092-7D (LSED1::Lp.D-LDH-HIS3)".

[Introducción del gen PDC5 de tipo mutante sensible a la temperatura (pdc5ts-9)]

Como levadura en la que se introdujo el gen PDC5 de tipo mutante sensible a la temperatura, se empleó la cepa SW015 de levadura que tenía el gen PDC5 de tipo mutante sensible a la temperatura (pdc5ts-9), que se describe en el documento JP 2008-048726A. Mediante el apareamiento de la cepa SW015 con la cepa SW087-2C y la separación por anatomización de los ascos resultantes con un micromanipulador, se obtuvo la cepa SW095-4B (genotipo: MATa ura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 lys2 pdc5ts-9 Lpdc1::TRP1 ). Además, mediante el apareamiento de la cepa SW095-4B con la cepa SW092-2D y la separación por anatomización de los ascos resultantes con un micromanipulador, se obtuvo la cepa SW098-21B (genotipo: MATa ura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 LYS2 pdc5ts-9).

[Introducción del gen D-LDH en los locus de los genes PDC1, TDH3 y SED1 e introducción del gen PDC5 de tipo mutante sensible a la temperatura (pdc5ts-9)]

Mediante la utilización de la cepa SW092-2D (LPDC1::Lp. D-LDH1-TRP1), la cepa SW087-2C (LTDH3::Lp. D-LDH1-URA3), SW092-7D (LTDH3::Lp. D-LDH1-HIS3) y SW098-21B, preparadas de esta manera, se repitió el apareamiento dipoide y producción tétrada para obtener la cepa SU042 que contenía el gen Lp. D-LDH1 en los locus de los genes PDC1, TDH3 y SED1 y el PDC5 de tipo mutante sensible a la temperatura (pdc5ts-9), siendo la cepa SU042 diploide y no auxótrofa para adenina, leucina y lisina. Los procedimientos para la preparación de la cepa SU042 se muestran en la figura 1.

(Ejemplo 9) Ensayo de preparación de ácido D-láctico 4

Mediante la utilización de la cepa SU042 preparada tal como se describe en el ejemplo 8, se ensayó la productividad de ácido D-láctico mediante cultivo discontinuo. Como medio, se empleó el medio SC3 que se muestra en la tabla 1

o un medio de azúcar en bruto (100 g/l "Yutosei" (fabricado por Muso Co., Ltd.), 1,5 g/l de sulfato de amonio). En primer lugar, la cepa SU042 se cultivó durante toda la noche con agitación en 5 ml de medio SC3 o medio de azúcar en bruto en un tubo de ensayo (pre-precultivo). En un matraz Sakaguchi de 500 ml, se inoculó el medio de preprecultivo resultante en 50 ml de medio SC3 fresco o medio de azúcar en bruto y se cultivó durante 24 horas con agitación (precultivo). Se añadió a un fermentador de mini-jarra (fabricado por Able Co., Ltd., 2 L), 1l de medio SC3 o medio de azúcar en bruto, y se ajustó la temperatura (32ºC) y se controló el pH (pH 5, hidróxido de calcio 5N). El cultivo se llevó a cabo con aireación y agitación (a 200 ml/min y 400 rpm, respectivamente). Como resultado, el cultivo en el medio SC3 terminó en 30 horas y el rendimiento con respecto al sacárido fue de 63%. Además, el cultivo en el medio de azúcar en bruto terminó en 50 horas y el rendimiento con respecto al sacárido fue de 70%. A partir de estos resultados, se confirmó que el rendimiento de la fermentación de ácido D-láctico fue mejorada por la introducción del gen Lp. D-LDH1 en los locus de los genes PDC1, TDH3 y SED1 y la introducción de la mutación sensible a la temperatura en el gen PDC5.

(Ejemplo 10) Ensayo de productividad de ácido D-láctico mediante cultivo continuo

Se evaluó un cultivo continuo de la cepa SU042 utilizando la membrana de separación que se describe en el documento WO2007/097260. Como medio, se utilizó un medio de azúcar en bruto (75 L"Yutosei" (fabricado por Muso Co., Ltd.), 1,5 g/l de sulfato de amonio). A continuación se muestran las condiciones de cultivo: Capacidad de los recipientes de fermentación: 2 (l)

Volumen del medio de cultivo: 1,5 (l) Membrana de separación utilizada: filtro de membrana de PVDF (que se describe en el ejemplo de referencia 2 del documento WO2007/097260) Área de filtración eficaz del elemento de separación por membrana: 120 cm2 Ajuste de la temperatura: 32(ºC) Volumen de aireación en el recipiente de reacción de fermentación: 0,02 aire (l/min), gas de nitrógeno 0,18 (l/min) Velocidad de agitación en el recipiente de reacción de fermentación: 800 (rpm) Ajuste del pH: se ajustó a pH 5 con hidróxido de calcio 5N Esterilización: el recipiente de cultivo que incluye el elemento de membrana de separación y el medio utilizado se esterilizaron todos en autoclave a 121ºC durante 20 minutos.

En primer lugar, la cepa SU042 se cultivó a 30ºC durante la noche con agitación en 10 ml del medio de azúcar en bruto en un tubo de ensayo (pre-pre-precultivo). La cantidad total del medio de cultivo obtenido de esta manera se inoculó a 100 ml de medio de azúcar en bruto fresco y se cultivó en un matraz Sakaguchi de 500 ml durante 24 horas a 30 ºC con agitación (pre-precultivo). El medio de pre-precultivo resultante se inoculó en 1,5 l del medio de azúcar en bruto cargado en un recipiente de cultivo continuo de tipo de membrana integrada (el aparato que se muestra en la figura 2 del documento WO2007/097260). La extracción del medio de cultivo mediante una bomba peristáltica (200 ml/h) se inició 50 horas después del inicio del cultivo, y el cultivo se continuó hasta 400 horas para medir la concentración de ácido láctico, que es la sustancia producida, y la tasa de producción de ácido láctico. Los resultados se muestran en la figura 2. Se observa en este caso que la tasa de producción de ácido láctico durante el cultivo continuo se calculó utilizando la siguiente ecuación 1.

Tasa de producción de ácido láctico (g/l·h) = concentración de producto en el líquido extraído (g/l) x velocidad de extracción del medio de cultivo de la fermentación (l/h) ÷ volumen de líquido funcional del aparato (l)...(Ecuación 1)

Como resultado del cultivo continuo utilizando la membrana de separación, se confirmó que el rendimiento de ácido D-láctico con respecto al sacárido se mejoró adicionalmente hasta aproximadamente el 85% y que la tasa de producción de ácido D-láctico se mejoró hasta 7,5 g/l·h.

(Ejemplo 11) Introducción de D-LDH de Limulus polyphemus en Candida utilis

A continuación, utilizando Candida utilis, que es una levadura Crabtree negativa, se examinó el ácido D-láctico.

(a) Preparación de un vector para la introducción del gen D-LDH de Limulus polyphemus

En primer lugar, se construyó un vector para introducir el gen D-LDH proveniente de Limulus polyphemus en el locus del gen PDC1 en el cromosoma de Candida utilis. La cepa NBRC0988 de Candida utilis (en lo sucesivo, referido como "NBRC0988") se inoculó en medio YPD (1% de extracto de levadura Bacto, 2% de Bacto-peptona, 2% de glucosa) y se cultivaron durante toda la noche a 30ºC. A partir de las células de levadura obtenidas de este modo, se extrajo ADN genómico según un método convencional y se utilizó como plantilla en la PCR posterior. En primer lugar, utilizando los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 40 y 41 como conjunto de cebadores, se amplificó un fragmento que contiene la región terminadora del gen PDC1. Se hace notar en este caso que, a menos que se especifique lo contrario, se utilizó KOD-plus- (fabricado por Toyobo Co., Ltd.) como ADN polimerasa según el protocolo adjunto. Después de digerir el fragmento obtenido de esta manera de aproximadamente 1 kb con una enzima de restricción BssHI y purificarlo, el producto resultante se ligó al pBluescriptIISK(+) que había sido digerido previamente con la enzima de restricción BssHI de la misma manera. El plásmido obtenido de esta manera es referido en lo sucesivo como "pKS01".

A continuación, de la misma manera, utilizando el ADN genómico de NBRC0988 como plantilla y los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 42 y 43 como conjunto de cebadores, se realizó una PCR para amplificar un fragmento que contiene el promotor PGK. El fragmento obtenido de esta manera de aproximadamente 1 kb se purificó y se utilizó en los experimentos posteriores. A continuación, utilizando el plásmido pLC1-hph que tenía el gen hph capaz de impartir resistencia contra higromicina B, que es un tipo de sustancia antibiótico como plantilla y los oligo ADN que se muestran en las SEC ID NO: 44 y 45 como conjunto de cebadores, se realizó una PCR para amplificar un fragmento que contenía el gen hph, que, a continuación, se purificó para obtener un fragmento de aproximadamente 1,1 kb. Además, utilizando el ADN genómico de NBRC0988 como plantilla y los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 46 y 47 como conjunto de cebadores, se realizó una PCR para amplificar un fragmento que contiene el terminador GAP, que, a continuación, se purificó para obtener un fragmento de aproximadamente 500 pb.

El fragmento que contiene el promotor PGK, el fragmento que contenía el gen hph y el fragmento que contiene el terminador de GAP que se obtuvieron en la forma descrita anteriormente se mezclaron, y utilizando los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 48 y 49 como conjunto de cebadores, se realizó una PCR para amplificar un fragmento en el que el promotor de PGK, el gen hph y el terminador GAP estaban unidos. Después de fosforilar el extremo del fragmento obtenido de este modo de aproximadamente 2,6 kb, el fragmento se ligó con el pUC118, que había sido digerido con HincII y desfosforilado. El plásmido obtenido de esta manera es referido en lo sucesivo como

"pKS02".

A continuación, de la misma manera, utilizando el ADN genómico de NBRC0988 como plantilla y los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 50 y 51 como conjunto de cebadores, se realizó una PCR para amplificar un fragmento que contiene el terminador PGK, que, a continuación, se purificó para obtener un fragmento de aproximadamente 500 pb. Además, utilizando el pKS02 obtenido de la manera descrita anteriormente como plantilla y los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 52 y 53 como conjunto de cebadores, se realizó una PCR para amplificar un fragmento en el que el promotor PGK, el gen hph y el terminador GAP estaban unidos, que, a continuación, se purificó para obtener un fragmento de aproximadamente 2,6 kb.

El fragmento que contiene el terminador PGK y el fragmento en el que estaban unidos el promotor de PGK, el gen hph y el terminador GAP, cuyos fragmentos se obtuvieron en la forma descrita anteriormente, se mezclaron, y utilizando los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 50 y 53 como conjunto de cebadores, se realizó una PCR para amplificar un fragmento en el que el terminador PGK, el promotor PGK, el gen hph y el terminador GAP estaban unidos. Después de digerir el fragmento obtenido de esta manera de aproximadamente 3 kb con las enzimas de restricción BamHI y ClaI y purificarlo, el producto resultante se ligó al pKS02 que había sido previamente digerido con las enzimas de restricción BamHI y ClaI de la misma manera. El plásmido obtenido de esta manera es referido en lo sucesivo como "pKS03".

A continuación, de la misma manera, utilizando el ADN genómico de NBRC0988 como plantilla y los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 54 y 55 como conjunto de cebadores, se realizó una PCR para amplificar un fragmento que contiene la región promotora de PDC1, que, a continuación, se purificó para obtener un fragmento de aproximadamente 2,1 kb. Además, utilizando el pTRS205 preparado en el ejemplo 2 como plantilla y los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 56 y 57 como conjunto de cebadores, se realizó una PCR para amplificar un fragmento que contenía el gen D-LDH proveniente de Limulus polyphemus, que, a continuación, se purificó para obtener un fragmento de aproximadamente 1 kb.

El fragmento que contenía la región del promotor PDC1 y el fragmento que contenía el gen D-LDH proveniente de Limulus polyphemus, que se obtuvieron en la forma descrita anteriormente, se mezclaron, y utilizando los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 54 y 57 como conjunto de cebadores, se realizó una PCR para amplificar un fragmento en el que el fragmento que contiene la región del promotor PDC1 y el fragmento que contenía el gen D-LDH proveniente de Limulus polyphemus estaban unidos. Después de digerir el fragmento obtenido de este modo de aproximadamente 3,1 kb con las enzimas de restricción NotI y BgIII y purificarlo, el producto resultante se ligó al pKS03 que había sido previamente digerido con las enzimas de restricción NotI y BamHI de la misma manera. El plásmido obtenido de esta manera es referido en lo sucesivo como "pKS04".

(b) Introducción del gen D-LDH de Limulus polyphemus en el locus del gen PDC1

El pKS04 obtenido de la manera descrita anteriormente se digirió con la enzima de restricción BglII y se introdujo en NBRC0988 por el método de electroporación. Una pequeña cantidad de células se inoculó en medio YPD y se cultivaron durante toda la noche a 30ºC. Después de centrifugar el cultivo para descartar el sobrenadante, las células se lavaron con agua esterilizada y sorbitol 1 M y finalmente se suspendieron en sorbitol 1 M. A continuación, después de mezclar las células y el pKS04 digerido con la enzima de restricción BglII y dejar la mezcla resultante en hielo durante 5 minutos, la mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación y se sometió a electroporación a una capacitancia de 25 µF, voltaje de 0,75 kV y resistencia de 800 O. A continuación, la mezcla se transfirió a medio YPD que contiene sorbitol 1 M y se cultivó a 30ºC durante aproximadamente 4 horas y, a continuación, se aplicó a medio YPD suplementado con 600 µg/l de higromicina B. A partir de la cepa resistente a la higromicina B resultante, se extrajo el genoma de la misma, y mediante la verificación de que los fragmentos de aproximadamente 3 kb y 2 kb fueron cada uno amplificados por PCR utilizando los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 54 y 57 y SEQ ID NO: 56 y 51 como conjuntos de cebadores respectivos, se confirmó que se obtuvo una levadura transformada en la que el gen de D-LDH proveniente de Limulus polyphemus se introdujo en el locus del gen PDC1. La levadura transformada obtenida de este modo es referida en adelante como "cepa CuLpLDH".

(Ejemplo comparativo 2) Introducción de D-LDH proveniente de bacteria de ácido láctico en Candida utilis

De la misma manera que en el ejemplo 11, se introdujo el gen de D-LDH proveniente de una bacteria de ácido láctico, Leuconostoc mesenteroides. Cabe señalar en este caso, sin embargo, que se empleó el oligo ADN que se muestra en la SEC ID NO: 58 en lugar del que se muestra en la SEC ID NO: 55, utilizado en el ejemplo 11. Además, se utilizó pTRS207 obtenido en el ejemplo comparativo 1 como plantilla en lugar de pTRS205, obtenido en el ejemplo 2 y se utilizaron los oligo ADN que se muestran en las SEQ ID NO: 59 y 60 en lugar de los que se muestran en las SEQ ID NO: 56 y 57. El plásmido obtenido de esta manera es referido en lo sucesivo como "pKS05".

El plásmido obtenido de la manera descrita anteriormente se introdujo en la cepa NBRC0988 de la misma manera que en el ejemplo 11. La cepa obtenida de este modo, en la que el gen de D-LDH proveniente de una bacteria de ácido láctico, Leuconostoc mesenteroides, se introdujo en el locus del gen PDC1 es referida en lo sucesivo como como "cepa CuLmLDH".

(Ejemplo 12, ejemplo comparativo 3) Ensayo de productividad de D-láctico en Candida utilis

Utilizando la cepa CuLpLDH y la cepa CuLmLDH preparadas en el ejemplo 11 y el ejemplo comparativo 2, respectivamente, se evaluó su productividad de ácido D-láctico. Se añadió medio YPD en una cantidad de 50 ml a un matraz de Sakagushi de 500 ml, y se inocularon las cepas CuLpLDH y CuLmLDH en el mismo en pequeñas cantidades y se cultivó a 30ºC durante la noche con agitación (precultivo). Después de recoger el medio de cultivo y lavar con medio YPD fresco, el medio de cultivo se colocó y se cultivó en un fermentador de mini-jarra al que se añadió 1 L de medio YPD10 (que contiene 10% de glucosa). Las condiciones de cultivo se muestran a continuación:

Cantidad de inoculación inicial: inoculado a OD600 = 10 pH: pH 6 Aireación: 100 ml/min Agitación: 120 rpm Neutralizador: hidróxido de calcio 1N Temperatura de cultivo: 35ºC.

El cultivo se llevó a cabo durante 40 horas y se analizó la concentración de ácido láctico y la concentración de glucosa del medio de cultivo a las 40 horas. La glucosa se había consumido por completo. Además, tal como se muestra en la tabla 4, a partir de los resultados del análisis de la productividad por el consumo de glucosa (rendimiento con respecto a sacárido) y la pureza óptica del ácido D-láctico, se encontró que la levadura (Candida utilis) introducida con el gen de D-LDH es capaz de producir ácido D-láctico por fermentación y la cepa CuLpLDH introducida con el gen de D-LDH proveniente de Limulus polyphemus tenía un mayor rendimiento.

(Ejemplo 13, ejemplo comparativo 4) Ensayo de productividad de D-láctico 2 en Candida utilis

A continuación, utilizando las cepas CuLpLDH y CuLmLDH, se evaluó la productividad de ácido D-láctico utilizando xilosa, que es una pentosa, como fuente de azúcar. Se añadió medio YPD en una cantidad de 50 ml a un matraz de Sakagushi de 500 ml, y se inocularon las cepas CuLpLDH y CuLmLDH en el mismo en pequeñas cantidades y se cultivó a 30ºC durante la noche con agitación (precultivo). Después de recoger el medio de cultivo y lavar con medio YPD fresco, el medio de cultivo se colocó y se cultivó en un fermentador de mini-jarra al que se añadió 1 L de medio YPX10 (1% de extracto de levadura, 2% de bacto-peptona, 4% de xilosa). Las condiciones de cultivo se muestran a continuación:

Cantidad de inoculación inicial: inoculado a OD600 = 10 pH: pH 6 Aireación: 100 ml/min Agitación: 120 rpm Neutralizador: hidróxido de calcio 1N Temperatura de cultivo: 30ºC.

El cultivo se llevó a cabo durante 60 horas y se analizó la concentración de ácido láctico y la concentración de xilosa del medio de cultivo a las 60 horas. La xilosa se había consumido por completo. Además, tal como se muestra en la tabla 4, a partir de los resultados del análisis de la productividad por el consumo de xilosa (rendimiento con respecto a sacárido) y la pureza óptica del ácido D-láctico, se encontró que la levadura (Candida utilis) introducida con el gen de D-LDH era capaz de producir ácido D-láctico por fermentación utilizando xilosa como material de partida y la cepa CuLpLDH introducida con el gen de D-LDH proveniente de Limulus polyphemus tenía un mayor rendimiento.

[Tabla 4]

Ejemplo 12: Ejemplo 13 Ejemplo comparativo 3 Ejemplo comparativo 4

Nombre de la cepa: CuLpLDH CuLpLDH CuLmLDH CuLmLDH

Fuente de azúcar: glucosa xilosa glucosa xilosa

Rendimiento de ácido D-láctico con respecto al sacárido (%): 29 23 22 17

Pureza óptica del ácido D-láctico (% e.e.): 99,9 99,9 99,9 99,9

APLICABILIDAD INDUSTRIAL

Mediante la presente invención, se hace posible producir de forma estable ácido D-láctico a un bajo coste, y dado que el ácido D-láctico producido tiene una alta pureza óptica, es preferentemente utilizado como materia prima para polímeros.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> TORAY INDUSTRIES, INC.

5 <120> Polipéptido que tiene actividad D-lactato deshidrogenasa, polinucléotido que codifica el mismo polipéptido y procedimiento para preparar D-lactato

<130> 10029 10 <160> 60

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1 15 <211> 326

<212> PRT

<213> Limulus polyphemus

<400> 1 20

<210> 2

<211> 326

<212> PRT

<213> Limulus polyphemus

<400> 2

<210> 3

<211> 981

<212> ADN

<213> Limulus polyphemus

<400> 3

<210> 4 10 <211> 981

<212> ADN

<213> Limulus polyphemus

<400> 4

<210> 5

<211> 1000

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 5

<210> 6

<211> 1000

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae 15

<400> 6

<210> 7

<211> 1000

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 7

5: <210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

10: <220> <223> cebador <400> 8 atcdchacya tstcbgtggg 20

15: <210> 9 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial

20: <220> <223> cebador

25: <400> 9 ggytcdggva ccatyac 17

30: <210> 10 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

35: <400> 10 ttgccattct tgagggcctc atagagg 27

40: <210> 11 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

45: <220> <223> cebador

<400> 11 gctgcacaac tccaccacgg ctgg: 24

50 55: <210> 12 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador

<400> 12

tcagctcagc tacggagtca gtgg: 24

5: <210> 13 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 13 actattgttg gtttgtggca gaag: 24

15: <210> 14 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

25: <400> 14 taagttctgc tactgagtca gtgg 24

<210> 15 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

35: <220> <223> cebador <400> 15 tagaagaatt tttgattctg cctg 24

<210> 16 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

45: <220> <223> cebador

<400> 16 aacatcggga gtgttgctga ccgc: 24

55: <210> 17 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 17 agagtggatc tactcttgga gtccac: 26

65: <210> 18 <211> 24 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador 5

<400> 18 tacgtcagga gtgttactta caac 24

<210> 19

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

15 <220>

<223> cebador

<400> 19 agagtggatc tactcttgga gtccac 26

<210> 20

<211> 30

<212> ADN 25 <213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 20 atgcctcgag atgagcaaac caaaggtatt 30

<210> 21 35 <211> 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 21 atgcgcggcc gcttatggca tgggaacagg 30

<210> 22

<211> 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 22 55 atgcctcgag atgagcaagc ccaaagtatt 30

<210> 23

<211> 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador 65

<400> 23

atgcgcggcc gcttatggca tttgaactgg: 30

5: <210> 24 <211> 75 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 24 attattattt tctactcata acctcacgca aaataacaca gtcaaatcaa tcaaaatgag: 60

15: caaaccaaag gtatt 75

<210> 25 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

25: <220> <223> cebador <400> 25 aggcgtatca cgaggccctt 20

<210> 26 <211> 75 <212> ADN <213> Artificial

35: <220> <223> cebador

<400> 26 attattattt tctactcata acctcacgca aaataacaca gtcaaatcaa tcaaaatgag: 60

caagcccaaa gtatt: 75

45: <210> 27 <211> 60 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 27 gaattaattc ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct agattgtact gagagtgcac: 60

55: <210> 28 <211> 80 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

65: <400> 28 tatttttcgt tacataaaaa tgcttataaa actttaacta ataattagag attaaatcgc 60

ctgtgcggta tttcacaccg: 80

5: <210> 29 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 29 gacaattctg gttaggtcca agag: 24

15: <210> 30 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

25: <400> 30 ttaagctgct gcggagcttc cacg 24

<210> 31 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial

35: <220> <223> cebador <400> 31 ccctcgagat gaagattttt gcttacggc 29

<210> 32 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial

45: <220> <223> cebador

<400> 32 ccgcggccgc ttaatattca acagcaatag c: 31

55: <210> 33 <211> 85 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 33 tctcaattat tattttctac tcataacctc acgcaaaata acacagtcaa atcaatcaaa: 60

atgaagattt ttgcttacgg cattc: 85

65: <210> 34

<211> 22 <212> ADN <213> Artificial

5: <220> <223> cebador

10: <400> 34 atggattcta gaacagttgg ta 22

15: <210> 35 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

20: <400> 35 ttacttgttt tctagataag ct 22

25: <210> 36 <211> 75 <212> ADN <213> Artificial

30: <220> <223> cebador

<400> 36 ttagttttaa aacaccaaga acttagtttc gaataaacac acataaacaa acaaaatgag: 60

35: caaaccaaag gtatt 75

40: <210> 37 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

45: <220> <223> cebador <400> 37 atgtctgccc ctaagaagat cg 22

50: <210> 38 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial

55: <220> <223> cebador

60: <400> 38 ttaagcaagg attttcttaa cttc 24

65: <210> 39 <211> 75 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

5: <400> 39 atttatagtc gtaactacaa agacaagcaa aataaaatac gttcgctcta ttaagatgag 60

caaaccaaag gtatt: 75

<210> 40 <211> 68 <212> ADN <213> Artificial

15: <220> <223> cebador

<400> 40 actcgcgcgc aagatctaag cggccgctaa tggatccaat aatcgatgct gtctttcttc: 60

ttcatggg: 68

25: <210> 41 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 41 actcgcgcgc aagatctgaa cttctccaac aggtagc: 37

35: <210> 42 <211> 99 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

45: <400> 42 cggccgccag ctgaagcttc gtacgctgca ggtcgacaac ccttaatata acttcgtata 60

atgtatgcta tacgaagtta tcctttgctg tgttctacc: 99

<210> 43 <211> 68 <212> ADN <213> Artificial

55: <220> <223> cebador

<400> 43 tcgatcagaa acttctcgac agacgtcgcg gtgagttcag gctttttcat ctttatccgc: 60

cagtatgt: 68

65: <210> 44 <211> 50 <212> ADN

<213> Artificial

5: <220> <223> cebador <400> 44 atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga 50

10: <210> 45 <211> 69 <212> ADN <213> Artificial

15: <220> <223> cebador

20: <400> 45 catgaggatc ataatttata acgtaatccc ataaataaaa gtcatacaat ctattccttt gccctcgga 60 69

25: <210> 46 <211> 50 <212> ADN <213> Artificial

30: <220> <223> cebador

<400> 46 attgtatgac ttttatttat gggattacgt tataaattat gatcctcatg: 50

35 40: <210> 47 <211> 83 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador

45: <400> 47 taggccacta gtggatctga tatcacctaa taacttcgta tagcatacat tatacgaagt 60

tattcattca tccctcacta tcg: 83

50: <210> 48 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

55: <220> <223> cebador

60: <400> 48 ggccgccagc tgaagcttcg 20

65: <210> 49 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

5: <400> 49 aggccactag tggatctgat 20

<210> 50 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial

15: <220> <223> cebador <400> 50 actcggatcc ctgcaagcta ctttgtaatt aaacaaataa cggg 44

<210> 51 <211> 80 <212> ADN <213> Artificial

25: <220> <223> cebador

<400> 51 ggagactctt cacactgttg gcgtctatga ttcaagattg tcagtttcca tcgtggattg: 60

gaatagatct ggtgaccttg: 80

35: <210> 52 <211> 90 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 52 acaactattc caatccacga tggaaactga caatcttgaa tcatagacgc caacagtgtg: 60

45: aagagtctcc agctgaagct tcgtacgctg 90

<210> 53 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

55: <220> <223> cebador <400> 53 actcggccgg ccatcgatca ctagtggatc tgatatcacc 40

<210> 54 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial

65: <220> <223> cebador

<400> 54 actcgcggcc gctctagaca ccaactttga agataggg: 38

5: <210> 55 <211> 64 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

15: <400> 55 aatacctttg gtttgctcat ggtatcgatt gttttagttt tgtttgtttg ttgtgtataa 60

cggg: 64

<210> 56 <211> 64 <212> ADN <213> Artificial

25: <220> <223> cebador

<400> 56 cccgttatac acaacaaaca aacaaaacta aaacaatcga taccatgagc aaaccaaagg: 60

tatt: 64

35: <210> 57 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 57 actcagatct tcattatggc atgggaacag gagtt: 35

45: <210> 58 <211> 64 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

55: <400> 58 ccgtaagcaa aaatcttcat ggtatcgatt gttttagttt tgtttgtttg ttgtgtataa 60

cggg: 64

<210> 59 <211> 64 <212> ADN <213> Artificial

65: <220> <223> cebador

<400> 59 cccgttatac acaacaaaca aacaaaacta aaacaatcga taccatgaag atttttgctt: 60

5: acgg 64

10: <210> 60 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial

15: <220> <223> cebador <400> 60 actcagatct tcattaatat tcaacagcaa tagct 35

20

Claims

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido que es cualquiera de los siguientes (A) a (C):

5 (A) polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2;

(B)

polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 1 ó 2, excepto que de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido, cuyo polipéptido tiene actividad de Dlactato deshidrogenasa; y

(C)

polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de no menos del

10 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID NO: 1 ó 2, cuyo polipéptido tiene una actividad de D-lactato deshidrogenasa.
2. Polinucleótido que es cualquiera de los siguientes (a) a (e):

15 (a) polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4;

(b)

polinucleótido que tiene la misma secuencia de nucleótidos tal como se muestra en la SEC ID No: 3 ó 4, excepto que de 1 a 40 nucleótidos se han sustituido, eliminado, insertado y/o añadido, cuyo polinucleótido codifica un polipéptido que tiene actividad de D-lactato deshidrogenasa;

(c)

polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas con la totalidad o una parte del polinucleótido que tiene la

20 secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4 o una cadena complementaria del mismo, cuyo polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una actividad de D-LDH;

(d) polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de no menos del 80% con respecto a la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4, cuyo polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una actividad de D-lactato deshidrogenasa; y

25 (e) polinucleótido que codifica el polipéptido, según la reivindicación 1.
3. Constructo de ADN en el que están relacionados el polinucleótido, según la reivindicación 2, y un promotor capaz de expresar dicho polinucleótido.

30 4. Constructo de ADN, según la reivindicación 3, caracterizado porque dicho promotor es un promotor del gen de la piruvato descarboxilasa 1 (gen PDC1), del gen supresor del defecto exponencial 1 (gen SED1) o del gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa 3 (gen TDH3).
5. Constructo de ADN, según la reivindicación 3 ó 4, en el que dicho promotor se selecciona entre cualquiera de 35 los siguientes (I) a (III):

(I)

promotor que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOs: 5 a 7;

(II)

promotor que tiene una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con respecto a la

secuencia de nucleótidos que se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOs: 5 a 7 o una secuencia de nucleótidos 40 que comprende una parte de las mismas; y

(III) promotor que tiene la misma secuencia de nucleótidos tal como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOs: 5 a 7, excepto que uno o varios nucleótidos se han eliminado, sustituido y/o añadido.
6. Transformante en el que se introduce el polinucleótido, según la reivindicación 2, o el constructo de ADN, según 45 cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.
7. Levadura transformada, en la que se introduce el polinucleótido, según la reivindicación 2, o el constructo de ADN, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

50 8. Levadura transformada, según la reivindicación 7, en la que, como mínimo, uno entre el gen de la piruvato descarboxilasa 1 (gen PDC1), el gen de la supresión del defecto exponencial 1 (gen SED1) y el gen gliceraldehído3-fosfato deshidrogenasa 3 (gen TDH3) de dicha levadura transformada se sustituye con el polinucleótido, según la reivindicación 2, o el constructo de ADN, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

55 9. Levadura transformada, según la reivindicación 8, en la que, como mínimo, uno de dichos genes es el gen PDC1.
10. Procedimiento de preparación de ácido D-láctico, que comprende la etapa de cultivar el transformante, según la

reivindicación 6, o la levadura transformada, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9. 60
11. Transformante en el que se introduce un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4, o el homólogo del polinucleótido mostrado en la SEQ ID NO: 3 ó 4 que codifica la D-lactato deshidrogenasa originada de la familia Limulidae o un constructo de ADN en el que dicho polinucleótido y un promotor capaz de expresar dicho polinucleótido están unidos.

65 12. Levadura transformada, en la que se introduce el polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3 ó 4, o el homólogo del polinucleótido mostrado en la SEQ ID NO: 3 ó 4 que codifica la D-lactato deshidrogenasa originada de la familia Limulidae o un constructo de ADN en el que dicho polinucleótido y un promotor capaz de expresar dicho polinucleótido están unidos.
13. Levadura transformada, según la reivindicación 12, en la que, como mínimo, uno entre el gen de la piruvato descarboxilasa 1 (gen PDC1), el gen de la supresión del defecto exponencial 1 (gen SED1) y el gen gliceraldehído3-fosfato deshidrogenasa 3 (gen TDH3) de dicha levadura transformada se sustituye con el polinucleótido que codifica dicha D-lactato deshidrogenasa originada de la familia Limulidae o se introduce dicho constructo de ADN, en

10 el que dicho polinucleótido y un promotor capaz de expresar dicho polinucleótido están unidos.
14. Procedimiento de preparación de ácido D-láctico, que comprende la etapa de cultivar el transformante, según la reivindicación 11, o la levadura transformada, según la reivindicación 12 ó 13.