ES2437577T3

ES2437577T3 - Aumento del rendimiento en plantas que sobreexpresan los genes de ACCDP

Info

Publication number: ES2437577T3
Application number: ES06787071.7T
Authority: ES
Inventors: Rodrigo Sarria-Millan; Eric R. Garr; Jamie Haertel; Damian Allen; Bryan Mckersie
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2005-07-18
Filing date: 2006-07-13
Publication date: 2014-01-13
Anticipated expiration: 2026-07-13
Also published as: MX2008000429A; WO2007011625A2; AU2006270321A1; AR054171A1; BRPI0613632A2; CA2614333A1; CN101228277B; ZA200801498B; CA2614333C; AU2006270321B2; CN101228277A; WO2007011625A3; EP1907552B1; EP1907552A2; US8097769B2; US20100071093A1; US20130276172A1

Abstract

Un procedimiento para aumentar el crecimiento de la raíz en condiciones normales o de tensión y/o aumentar latolerancia a la tensión para una tensión ambiental y/o aumentar el rendimiento de una planta de cultivo transgénicaen comparación con la planta de cultivo natural no transformada, en el que el procedimiento comprende aumentar laexpresión de un Polipéptido de tipo 1-Aminociclopropano-1-carboxilato Desaminasa (ACCDP) mediantetransformación de la planta de cultivo con, y sobreexpresión de, un ácido nucleico que codifica el ACCDP, en el queel ACCDP se codifica por un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: a. un polinucleótido que tiene una secuencia como se expone en SEC ID Nº: 1; b. un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEC ID Nº: 2; c. un polinucleótido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con el polinucleótido de a); d. un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con elpolipéptido de b); y e. un polinucleótido cuya secuencia puede derivar de una secuencia polipeptídica codificada por cualquiermolécula de ácido nucleico de a) a d) anterior, debido a la degeneración del código genético; en el que la tensión ambiental se selecciona de una o más del grupo que consiste en salinidad, sequía otemperatura, o combinaciones de las mismas.

Description

Aumento del rendimiento en plantas que sobreexpresan los genes de ACCDP

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad respecto de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº de Serie 60/700.096 presentada el 18 de julio de 2005.

Antecedentes de la Invención

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere en general a secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos que están asociados con el desarrollo de las raíces, que contribuyen al crecimiento vegetal y, en última instancia, afectan a la producción vegetal (es decir rendimiento) bajo condiciones de tensión abiótica o sin tensión. En particular, la presente divulgación se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos que confieren a la planta aumento del crecimiento de la raíz, aumento del rendimiento y/o de tolerancia a la sequía, el frío y/o la salinidad, y el uso de dichos ácidos nucleicos aislados.

Técnica antecedente

El rendimiento de las plantas de cultivo es central para el bienestar de los seres humanos y está afectado directamente por el crecimiento de plantas en el ambiente físico. Tensiones ambientales abióticas, tales como tensión por sequía, tensión por salinidad, tensión por calor y tensión por frío, son factores limitantes importantes del crecimiento y la productividad vegetal. Las pérdidas de cultivo y pérdidas de rendimiento de cultivos importantes tales como soja, arroz, maíz, algodón y trigo provocadas por estas tensiones representan un factor económico y político significativo y contribuyen a escasez de alimentos en muchos países en desarrollo.

La biomasa vegetal es el rendimiento total para cultivos de forraje como alfalfa, maíz de silage y heno. Se han usado muchas representaciones para el rendimiento en cultivos de grano. Las principales entre estas son las estimaciones del tamaño de la planta. El tamaño de la planta puede medirse de muchas maneras dependiendo de la especie y estadio del desarrollo, pero incluyen el peso seco total de la planta, el peso seco por encima del suelo, el peso en fresco por encima del suelo, área de la hoja, volumen del tallo, altura de la planta, diámetro de la roseta, longitud de la hoja, longitud de la raíz, masa de la raíz, número de brotes y número de hojas. Muchas especies mantienen una relación conservativa entre el tamaño de diferentes partes de la planta en un estadio del desarrollo dado. Estas relaciones alométricas se usan para extrapolar a partir de una de estas medidas de tamaño a otra. El tamaño de la planta en un estadio del desarrollo temprano se correlacionará típicamente con el tamaño de la planta más tarde en el desarrollo. Una planta mayor con una mayor área de hoja puede típicamente absorber más luz y dióxido de carbono que una planta más pequeña y por lo tanto aumentará probablemente más en tamaño durante el mismo periodo. Es decir además de la continuación potencial de la ventaja microambiental o genética la planta tenía que conseguir el mayor tamaño inicialmente. Hay un fuerte componente genético para el tamaño de la planta y la velocidad de crecimiento y por lo tanto para una serie de genotipos diversos el tamaño de la planta en una condición ambiental probablemente se correlacione con el tamaño en otra. De este modo se usa un ambiente convencional con una representación para los diversos y dinámicos ambientes encontrados en diferentes localizaciones y momentos por los cultivos en el campo.

El índice de cosecha, la relación de producción de semilla y peso seco por encima del suelo, es relativamente estable en muchas condiciones ambientales y por lo tanto puede obtenerse con frecuencia una correlación robusta entre el tamaño de la planta y la producción de grano. Estos procesos están ligados intrínsecamente porque la mayor parte de la biomasa del grano depende de la productividad fotosintética actual o almacenada por las hojas y el tallo de la planta. Por lo tanto, la selección del tamaño de la planta, incluso en estadios tempranos del desarrollo, se ha usado como un indicador para el potencial futuro. Cuando se ensaya con respecto al impacto de las diferencias genéticas en la tolerancia a la tensión, la capacidad para normalizar propiedades del suelo, temperatura, agua y disponibilidad de nutrientes e intensidad de luz es una ventaja intrínseca de ambientes de invernadero o cámara de crecimiento de plantas en comparación con el campo. Sin embargo, las limitaciones artificiales en el rendimiento debido a la escasa polinización debido a la ausencia de viento o insectos, o insuficiente espacio para crecimiento de cubierta o raíz madura, pueden restringir el uso de estos ambientes controlados para ensayar diferencias de rendimiento. Por lo tanto, las mediciones del tamaño de la planta en el desarrollo temprano, en condiciones normalizadas en una cámara de cultivo o invernadero, son prácticas convencionales para proporcionar indicios de potenciales ventajas para el rendimiento genético.

Durante el ciclo de vida, las plantas se exponen típicamente a condiciones de contenido de agua ambiental reducido. La mayoría de las plantas tienen estrategias evolucionadas para protegerse contra estas condiciones de desecación. Sin embargo, si la gravedad y duración de las condiciones de sequía son demasiado grandes, los efectos sobre el desarrollo, crecimiento, tamaño vegetal y rendimiento de la mayoría de las plantas de cultivo son profundos. La exposición continua a condiciones de sequía provoca alteraciones importantes en el metabolismo de las plantas que conducen en última instancia a la muerte celular y en consecuencia a pérdidas de rendimiento.

El desarrollo de plantas tolerantes a tensión es por lo tanto una estrategia que tiene el potencial de resolver o mediar en al menos algunos de estos problemas. Sin embargo, las estrategias de cultivo de plantas tradicionales para desarrollar nuevas líneas de plantas que muestren resistencia y/o tolerancia a estos tipos de tensiones son relativamente lentas y requieren líneas resistentes específicas para cruzar con la línea deseada. Los recursos

5 limitados de germoplasma para tolerancia a la tensión e incompatibilidad en cruces entre especies vegetales distantemente relacionadas representan problemas significativos encontrados en el cultivo convencional. Adicionalmente, los procesos celulares que conducen a tolerancia a la sequía, frío y salinidad en plantas tolerantes a sequía, frío y/o salinidad modelo son de naturaleza compleja e implican múltiples mecanismos de adaptación celular y numerosas rutas metabólicas. Esta naturaleza multicomponente de la tolerancia a la tensión no solo ha hecho el cultivo con respecto a tolerancia en gran medida infructuoso, sino que también ha limitado la capacidad de obtener por ingeniería genética plantas tolerantes a tensión usando procedimientos biotecnológicos.

Por lo tanto, se necesita la identificación de los genes y proteínas implicados en estos procesos multicomponentes que conducen a aumento del crecimiento y/o aumento de la tolerancia a la tensión. Dilucidar la función de genes expresados en plantas tolerantes a tensión no solamente potenciará nuestro entendimiento de la adaptación vegetal

15 y tolerancia a tensiones ambientales, sino que también puede proporcionar información importante para diseñar nuevas estrategias para la mejora de cultivos.

Las raíces son un órgano importante de las plantas superiores. Los sistemas de las raíces vegetales son fundamentales para el crecimiento y desarrollo apropiado de todas las especies vegetales terrestres. Además de captar agua y nutrientes y proporcionar soporte físico, las raíces median en un intercambio complejo pero escasamente entendido de comunicación entre microbios del suelo y otras plantas. En sistemas agrónomos, la producción se ve afectada por la disponibilidad de agua y nutrientes en el suelo: el crecimiento de las raíces tiene una influencia directa o indirecta en el crecimiento y producción de órganos aéreos, particularmente en condiciones de limitación de nutrientes. Las raíces también son relevantes para la producción de productos vegetales secundarios, tales como compuestos de defensa y hormonas vegetales. El establecimiento de la arquitectura de raíz

25 apropiada es un factor importante para que la planta use eficazmente el agua y los nutrientes disponibles en el ambiente y para maximizar el crecimiento y producción vegetal. Además, en condiciones de sequía, las raíces pueden adaptarse para continuar el crecimiento produciendo y enviando a la vez señales de advertencia tempranas a brotes que inhiben el crecimiento vegetal por encima del suelo.

Además, el crecimiento de raíces mejorado de las plantas de cultivo también potenciará la competividad con plantas de maleza y mejorará el crecimiento en áreas áridas, aumentando la accesibilidad y captación de agua. El crecimiento de la raíz mejorado también es relevante para fines ecológicos, tales como bio-remediación y prevención/detención de la erosión del suelo. Las raíces más largas pueden aliviar no solamente los efectos del agotamiento del agua del suelo sino también mejorar el anclaje de las plantas y su resistencia al volcado reduciendo de este modo su caída. Además, las raíces más largas tienen la capacidad de cubrir un volumen mayor de suelo y

35 mejorar la captación de nutrientes. Por lo tanto, la alteración de la biomasa de las raíces, y en particular el aumento de la longitud de las raíces, mejorará el crecimiento de la planta así como aumentará el rendimiento del cultivo.

Las raíces también son órganos de almacenamiento en varios cultivos de primera necesidad importantes, por ejemplo, en remolacha azucarera, patata, mandioca (yuca), ñames y boniato (batata). Las raíces también son el órgano relevante para consumo en varias verduras (por ejemplo zanahorias, rábano), hierbas (por ejemplo jengibre, kukuma) y plantas medicinales (por ejemplo ginseng). Además, algunos de los productos vegetales secundarios hallados en las raíces tienen importancia económica para la industria química y farmacéutica, por ejemplo, las moléculas básicas para la síntesis de hormonas esteroideas se encuentran en ñames, y las raíces de Lithospermum erythrorhizon producen shikonina, que se usa ampliamente debido a sus propiedades antiinflamatorias, antitumorales y de curación de heridas.

45 La arquitectura de la raíz es un área que ha permanecido en general inexplorada mediante cultivo clásico debido a las dificultades en la evaluación de este rasgo en el campo. Por lo tanto, la biotecnología podría tener un impacto significativo en la mejora de este rasgo.

La estructura de los sistemas de las raíces resulta de una combinación de predisposición genética y ambiente físico. Adicionalmente, los microbios del suelo también pueden tener un efecto beneficioso en el crecimiento de las plantas reduciendo los efectos deletéreos de otros microbios patógenos, produciendo compuestos que promuevan el crecimiento vegetal o aumentando la eficacia de captación de nutrientes del ambiente. Un microbio puede usar uno

o todos de estos mecanismos en diferentes estadios del ciclo de vida de la planta.

La hormona vegetal etileno se ha implicado en un amplio espectro de procesos de crecimiento y desarrollo vegetal. En plantas, 1-minociclopropano-1-carboxilato (ACC) es un precursor biosintético esencial del etileno. Los estudios 55 de finales de los años 70 revelaron que las bacterias del suelo que expresan una ACC desaminasa pueden reducir los niveles de etileno en las plantas conduciendo de este modo a elongación de las raíces (Brown, 1974, Ann. Rev. Phytopathol. 12: 181-197; Honma y Shimomura, 1978, Agric. Biol. Chem. 42: 1825-1831). Estos resultados se apoyaron por experimentos en los que se movilizaron genes que codificaban ACC desaminasa en bacterias no promotoras del crecimiento que a su vez conferían un efecto promotor del crecimiento (Shah y col., 1998, Can. J. Microbiol. 44: 833-843). Más recientemente, se han expresado genes microbianos que codifican ACC desaminasa

directamente en plantas transgénicas y se ha mostrado que promueven la elongación de las raíces (Klee y col., 1991, Plant Cell 3 (11): 1187-93; Reed y col., 1996, J. Ag. Food Chem. 44 (1): 388-394) o el crecimiento en presencia de metales pesados (Grichko V P y col.; Journal of Biotechnology 2000), vol. 81, nº 1; Steams y col. Plant Physiology And Biochemistry, (2005) vol. 43, nº 7).

Aunque se han caracterizado algunos genes que están implicados en las respuestas a tensión en plantas, la caracterización y clonación de genes vegetales que confieren tolerancia a la tensión siguen siendo en gran medida incompletas y fragmentadas. Por ejemplo, ciertos estudios han indicado que la tensión de sequía y salinidad en algunas plantas puede deberse a efectos génicos aditivos, a diferencia de otra investigación que indica que se activan transcripcionalmente genes específicos en tejido vegetativo de plantas en condiciones de tensión osmótica. Aunque generalmente se asume que las proteínas inducidas por tensión tienen un papel en la tolerancia, aún faltan pruebas directas, y las funciones de muchos genes sensibles a tensión se desconocen.

Existe una necesidad, por lo tanto, de identificar genes adicionales expresados en plantas tolerantes a tensión que tengan la capacidad de conferir mayor crecimiento de la raíz, mayor rendimiento y/o tolerancia a la tensión a su planta huésped y a otras especies vegetales. Las plantas tolerantes a tensión de nueva generación tendrán muchas ventajas, tales como un mayor intervalo en el que las plantas de cultivo pueden cultivarse, por ejemplo, reduciendo los requisitos de agua de una especie vegetal.

Sumario de la invención

La divulgación se refiere a ácidos nucleicos aislados que codifican polipéptidos capaces de modular el crecimiento de la raíz, el crecimiento de la planta, el rendimiento y/o la tolerancia a la tensión en condiciones normales o de tensión en comparación con una variedad natural de la planta. La invención se refiere al uso de los ácidos nucleicos aislados que codifican Polipéptidos de tipo 1-AminoCiclopropano-1-Carboxilato Desaminasa (ACCDP) seleccionados del grupo que consiste en

a.: un polinucleótido que tiene una secuencia como se expone en SEC ID Nº: 1;

b.: un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEC ID Nº: 2;

c.: un polinucléotido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con el polinucleótido de a);

d.: un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con el polipéptido de b); y

e.: un polinucleótido cuya secuencia puede derivar de una secuencia polipeptídica codificada por cualquier molécula de ácido nucleico de a) a d) anterior, debido a la degeneración del código genético;

para aumentar en plantas de cultivo el crecimiento de la raíz y/o el rendimiento en condiciones normales o de tensión y/o la tolerancia a la tensión ambiental en comparación con una variedad natural no transformada de la planta, en el que la tensión ambiental se selecciona de una o más del grupo que consiste en salinidad, sequía o temperatura, o combinaciones de las mismas.

Por lo tanto, en una primera realización, la invención se refiere a una planta de cultivo transgénica transformada con, que comprende y sobreexpresa un ácido nucleico, en la que el ácido nucleico comprende un polinucléotido que codifica un Polipéptido de tipo 1-Aminociclopropano-1-carboxilato Desaminasa (ACCDP) seleccionado del grupo que consiste en:

a.: un polinucléotido que tiene una secuencia como se expone en SEC ID Nº: 1;

c.: un polinucléotido que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con el polinucleótido de a) anterior;

d.: un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con el polipéptido de b) anterior; y

y en el que el polinucleótido codifica un ACCDP vegetal, y en el que la expresión del polinucleótido en la planta da como resultado

1.: aumento de la tolerancia a la tensión para una tensión ambiental en comparación con la planta de cultivo natural no transformada, en el que la tensión ambiental se selecciona de una o más del grupo que consiste en salinidad, sequía o temperatura, o combinaciones de las mismas; o

2.: aumento del crecimiento de las raíces en condiciones normales o de tensión en comparación con la planta de cultivo natural no transformada, o

3.: aumento del rendimiento en condiciones normales o de tensión en comparación con la planta de cultivo natural no transformada,

en el que la planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, sorgo, mijo, caña de azúcar, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, Manihot, pimiento, girasol, Tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, especies de Salix, palma aceitera, coco, hierba perenne y una planta de cultivo de forraje.

Preferentemente, el ACCDP es de Arabidopsis thaliana, canola, soja, arroz, trigo, linaza, cebada, girasol o maíz.

En otra realización, la invención se refiere a plantas de cultivo transgénicas que sobreexpresan el ácido nucleico que codifica ACCDP y demuestran un aumento de la longitud de la raíz en condiciones normales o de tensión en comparación con una variedad natural de la planta. En una realización, la sobreexpresión del ácido nucleico que

5 codifica ACCDP en la planta de cultivo demuestra una mayor tolerancia a una tensión ambiental en comparación con una variedad natural de la planta. En otra realización más, la sobreexpresión del ácido nucleico que codifica ACCDP en la planta de cultivo demuestra mayor rendimiento en comparación con una variedad natural de la planta. Se proporciona que la tensión ambiental se selecciona de una o más del grupo que consiste en salinidad, sequía o temperatura, o combinaciones de las mismas. Preferentemente, la tensión ambiental es tensión por sequía.

10 En otra realización más, la invención se refiere a una semilla producida por una planta de cultivo transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica ACCDP, en la que la planta es genéticamente pura con respecto a mayor crecimiento de la raíz, mayor rendimiento y/o mayor tolerancia a la tensión ambiental en comparación con una variedad natural de la planta.

Además la divulgación se refiere a un procedimiento para cultivar plantas de cultivo en una localización agrícola, en

15 el que el procedimiento comprende obtener la planta de cultivo transgénica anteriormente mencionada y cultivar la planta en una localización agrícola.

En un aspecto adicional más, la divulgación se refiere a producto producido por o de las planta transgénicas, sus partes vegetales, o sus semillas, tales como un producto alimentario, pienso, complemento alimentario, complemento de pienso, producto cosmético o producto farmacéutico.

20 En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento para aumentar el crecimiento de la raíz, el rendimiento y/o aumentar la tolerancia a la tensión para una tensión ambiental de una planta de cultivo en condiciones normales

o de tensión en comparación con una variedad natural de la planta, en el que el procedimiento comprende aumentar la expresión de un Polipéptido de tipo 1-Aminociclopropano-1-carboxilato Desaminasa (ACCDP) transformando la planta de cultivo con y sobreexpresión de un ácido nucleico que codifica el ACCDP, en el que el ACCDP se codifica

25 por un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

d. un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con el 30 polipéptido de b); y

e. un polinucleótido cuya secuencia puede derivar de una secuencia polipeptídica codificada por cualquier molécula de ácido nucleico de a) a d) anterior, debido a la degeneración del código genético;

en el que la tensión ambiental se selecciona de una o más del grupo que consiste en salinidad, sequía o temperatura, o combinaciones de las mismas.

35 En otra realización más, la divulgación se refiere a un procedimiento para producir la planta de cultivo transgénico anteriormente mencionada, en el que el procedimiento comprende (a) transformar una célula vegetal con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica ACCDP y (b) generar a partir de la célula vegetal la planta de cultivo transgénica que expresa el polipéptido codificado. Preferentemente, el polinucleótido está unido operativamente a una o más secuencias reguladoras, y la expresión del polinucleótido en la planta da como

40 resultado aumento del crecimiento de la raíz, aumento del rendimiento, y/o aumento de la tolerancia a la tensión ambiental en condiciones normales o de tensión en comparación con una variedad natural de la planta. Preferentemente, la o las secuencias reguladoras incluyen un promotor. Más preferentemente, el promotor es un promotor específico de tejido o regulado por el desarrollo.

En una variación adicional, la divulgación se refiere un ácido que codifica un ACCDP nuevo, aislado, en el que el 45 ácido nucleico comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polinucléotido que tiene una secuencia como se expone en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 2; b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 2;

50 c) un polinucléotido que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como se expone en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 2; d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 2;

55 e) un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de cualquiera de los polinucleótidos de a) a d) anteriores; y f) un polinucleótido complementario de cualquiera de los polinucleótidos de a) a d) anteriores.

En otra realización, la invención se refiere a una planta de cultivo transgénica transformada con, que comprende y que sobreexpresa dichos ácidos nucleicos aislados, y una semilla producida por dicha planta transgénica, en la que la planta transgénica expresa dichos ácidos nucleicos aislados para alterar el fenotipo de las plantas en relación con plantas naturales no transformadas, de modo que la planta transgénica muestre aumento del crecimiento de la raíz,

5 del crecimiento de la planta, del rendimiento y/o de la tolerancia a la tensión en condiciones normales o de tensión en comparación con una variedad natural de la planta.

En otra variación más, la divulgación se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica ACCDP aislado, en el que el ácido nucleico comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

10 a) un polinucléotido que tiene una secuencia como se expone en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2; b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2; c) un polinucléotido que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una

15 secuencia como se expone en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2; d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2;

20 e) un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de cualquiera de los polinucleótidos de a) a d) anteriores; y f) un polinucleótido complementario de cualquiera de los polinucleótidos de a) a d) anteriores.

Preferentemente, el polinucleótido está unido operativamente a una o más secuencias reguladoras. Más preferentemente, la o las secuencias reguladoras incluyen un promotor. Más preferentemente, el promotor es un

25 promotor específico de tejido o regulado por el desarrollo.

En una realización adicional, la divulgación se refiere a una planta transgénica que comprende dicho vector recombinante. Preferentemente, la expresión del ácido nucleico que codifica ACCDP en la planta da como resultado aumento del crecimiento de la raíz, aumento del rendimiento y/o aumento de la tolerancia a la tensión ambiental en comparación con una variedad natural de la planta.

30 La memoria descriptiva describe un procedimiento para identificar un nuevo ACCDP, que comprende (a) elevar una respuesta de anticuerpo específica a un ACCDP, o fragmento del mismo, como se describe posteriormente; (b) explorar material de ACCDP potencial con el anticuerpo, en el que la unión específica del anticuerpo con el material indica la presencia de un ACCDP potencialmente nuevo; y (c) identificar a partir del material unido un nuevo ACCDP en comparación con un ACCDP conocido. Como alternativa, la hibridación con sondas de ácido nucleico como se

35 describe posteriormente puede usarse para identificar nuevos ácidos nucleicos de ACCDP.

En una realización adicional, la invención también se refiere a procedimientos para modificar el crecimiento de la raíz, el rendimiento y/o la tolerancia a la tensión de una planta que comprenden modificar la expresión de un ácido nucleico que codifica ACCDP en la planta. Preferentemente, dicha modificación da como resultado aumento o reducción del crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a la tensión en comparación con una variedad natural

40 de la planta. Preferentemente, el crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a la tensión aumentan en una planta mediante aumento de la expresión de un ácido nucleico que codifica ACCDP.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de AtACCD (SEC ID Nº: 1; At1g48420) usado para la transformación de Arabidopsis, que es de 1246 pb de longitud. La región codificante del gen es de 1203 pb de

45 longitud con el codón de inicio (es decir ATG) y el codón de parada (es decir TAG) subrayados.

La Figura 2 muestra la secuencia de 401 aminoácidos predicha del gen de AtACCD (SEC ID Nº: 2) usado para la transformación de Arabidopsis.

La Figura 3 muestra un esquema del ADN-T de vector binario usado para transformar el gen de AtACCD (SEC ID Nº: 1). LB, límite izquierdo, pAHAS, promotor de AHAS de Arabidopsis; 3’ AHAS, señal de terminación de AHAS; SP,

50 Superpromotor; AtACCD, ADNc de AtACCD; 3’ NOS, señal de terminación; RB, Límite Derecho.

Las Figuras 4A y 4B muestran un análisis de placa de las plantas transgénicas para AtACCD de Arabidopsis (SEC ID Nº: 1). 4A demuestra que todas las líneas mostraron un fenotipo de longitud de raíz aumentada. Las líneas 2, 3, 5, 6 y 9 mostraron un aumento de longitud de raíz más significativo en comparación con los controles naturales. 4B muestra el análisis de nivel génico de las plantas transgénicas para AtACCD que confirma que las plantas de

55 AtACCD mostraron un fenotipo de longitud de raíz aumentada. Basándose en este análisis, las plantas transgénicas para AtACCD mostraron un aumento del 13,8 % en la longitud de la raíz. Tanto en 4A como en 4B, las tablas adjuntas muestran los valores medios reales usados para generar los diagramas de barras.

La Figura 5 muestra el análisis en suelo de raíces de las plantas de AtACCD (SEC ID Nº: 1), en el que se midió la longitud de la raíz de líneas de Arabidopsis de AtACCD.

La Figura 6 muestra el análisis de ANOVA del nivel génico de las plantas transgénicas para AtACCD (SEC ID Nº: 1). Los datos de análisis de todas las líneas transgénicas se combinó para determinar el rendimiento génico global.

5 La Figura 7 muestra el análisis de ANOVA del nivel génico de pesos secos de roseta en las plantas transgénicas para AtACCD (SEC ID Nº: 1).

La Figura 8 muestra los resultados de análisis de tblastn de AtACCD (SEC ID Nº: 2) frente a la base de datos de la secuencia de cultivo patentada. La tabla muestra el porcentaje de identidad de secuencias entre las secuencias de aminoácidos de AtACCD (SEC ID Nº 2) y GmACCD-1 (SEC ID Nº: 355), OsACCD (SEC ID Nº: 353), ZmACCD-1

10 (SEC ID Nº: 351) o TaACCD (SEC ID Nº 357).

La Figura 9 muestra el alineamiento de Blast entre las secuencias de aminoácidos de AtACCD (SEC ID Nº: 2, “Consulta”) y GmACCD (SEC ID Nº: 355, “Sujeto”).

La Figura 10 muestra el alineamiento de Blast entre las secuencias de aminoácidos de AtACCD (SEC ID Nº: 2, “Consulta”) y OsACCD (SEC ID Nº: 353, “Sujeto”).

15 La Figura 11 muestra el alineamiento de Blast entre las secuencias de aminoácidos de AtACCD (SEC ID Nº: 2, “Consulta”) y ZmACCD (SEC ID Nº: 351, “Sujeto”).

La Figura 12 muestra el alineamiento de Blast entre las secuencias de aminoácidos de AtACCD (SEC ID Nº: 2, “Consulta”) y TaACCD (SEC ID Nº: 357, “Sujeto”).

Descripción detallada de la invención

20 La presente invención puede entenderse más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención y los Ejemplos incluidos en el presente documento. Sin embargo, antes de que se desvelen y describan los presentes compuestos, composiciones y procedimientos, debe entenderse que la presente divulgación no se limita a ácidos nucleicos específicos, polipéptidos específicos, tipos celulares específicos, células huésped específicas, condiciones específicas o procedimientos específicos, etc., ya que estos pueden, por

25 supuesto, variar, y las numerosas modificaciones y variaciones en los mismos resultarán evidentes para los expertos en la materia. Debe entenderse también que la terminología usada en el presente documento es para el fin de describir realizaciones específicas solamente y no se pretende que sea limitante.

La presente divulgación se refiere a ACCDP y ácidos nucleicos que codifican ACCDP que son importantes en el aumento del crecimiento de las raíces de las plantas, rendimiento y/o para modular la respuesta de una planta a una 30 tensión ambiental. Más particularmente, la sobreexpresión de estos ácidos nucleicos que codifican ACCDP en una planta de cultivo da como resultado modulación (aumento o reducción, preferentemente aumento) del crecimiento de la raíz, aumento del rendimiento y/o aumento de la tolerancia a una tensión ambiental. Son miembros representativos del género ACCDP AtACCD, ZmACCD, OsACCD, GmACCD y TaACCD. En una realización preferida, todos los miembros del género son enzimas biológicamente activas que pueden convertir ACC a !

35 ketobutirato y amoníaco.

En consecuencia, la presente divulgación abarca una planta de cultivo transgénica que comprende secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas de ACCDP y un procedimiento para producir dicha planta de cultivo transgénica, en la que la expresión del polipéptido ACCDP en la planta da como resultado aumento del crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a una tensión ambiental. En una realización, las secuencias de ACCDP empleadas en los

40 procedimientos, plantas de cultivo y semillas de la invención son de una planta, preferentemente de una planta de Arabidopsis, una planta de canola, una planta de soja, una planta de arroz, una planta de cebada, una planta de girasol, una planta de linaza, una planta de trigo o una planta de maíz. En otra variación de la divulgación, las secuencias de ACCDP son los genes que se resumen en la Tabla 1 y la Tabla 2. Preferentemente, las secuencias de ACCDP desveladas tienen porcentaje de identidad significativo con enzimas de ACCDP conocidas.

45 Tabla 1. Genes de ACCDP, su origen, secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos correspondiente, y su porcentaje de identidad compartida con AtACCD (SEC ID Nº: 2) en el nivel de aminoácidos (algoritmo de Needleman-Wunsch para alineamiento de secuencias global, J. Mol. Biol. 48(3): 443-53; Matriz: Blosum 62; Penalización de apertura de hueco: 10,0; Penalización de extensión de hueco: 2,0)

Columna Nº 1: Columna Nº 2 Columna Nº 3 Columna Nº 4 Columna Nº 5

Nombre del gen: Organismo SEC ID Nº de Nucleótidos SEC ID Nº de Aminoácidos Identidad con AtACCD (%)

AtACCD: Arabidopsis thaliana 1 2 100

(continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación)

Columna Nº 1: Columna Nº 2 Columna Nº 3 Columna Nº 4 Columna Nº 5

BPS_WIPO_PROT|SL 000001.11101: Arabidopsis thaliana 3 70

BPS_WIPO_PROT|US 20040123343A1.1594 74: Oryza sativa 4 5 31

BPS_WIPO_PROT|US 20040214272A1.2274 58: Zea mays 6 7 35

BPS_WIPO_PROT|US 20040214272A1.2274 58: Zea mays 8 9 69

AP_002534: Escherichia coli 10 11 29

NP_142071: Pyrococcus horikoshii 12 13 30

NP_281783: Campylobacter jejuni 14 15 20

NP_288380: Escherichia coli 16 17 31

NP_420839: Caulobacter crescentus 18 19 30

NP_456516: Salmonella enterica 20 21 29

NP_460906: Salmonella typhimurium 22 23 30

NP_488487: Nostoc sp. 24 25 22

NP_577739: Pyrococcus furiosus 26 27 30

NP_669768: Yersinia pestis 28 29 28

NP_707806: Shigella flexneri cepa 2a 30 31 30

NP_744159: Pseudomonas putida 32 33 20

NP_754225: Escherichia coli 34 35 29

NP_794910: Pseudomonas syringae 36 37 27

NP_822695: Streptomyces avermitilis 38 39 29

NP_824185: Streptomyces avermitilis 40 41 21

NP_832957: Bacillus cereus 42 43 30

NP_845541: Bacillus anthracis 44 45 30

NP_891079: Bordetella bronchiseptica 46 47 29

NP_917071: Oryza sativa 48 49 21

NP_979563: Bacillus cereus 50 51 29

XP_366736: Magnaporthe grisea 52 53 28

XP_382854: Gibberella zeae 54 55 24

XP_468034: Oryza sativa 56 57 68

Columna Nº 1: Columna Nº 2 Columna Nº 3 Columna Nº 4 Columna Nº 5

XP_682168: Aspergillus nidulans 58 59 23

XP_748001: Aspergillus fumigatus 60 61 26

XP_749239: Aspergillus fumigatus 62 63 25

XP_782004: Strongylocentrotus purpuratus 64 65 37

XP_783308: Strongylocentrotus purpuratus 66 67 38

XP_787534: Strongylocentrotus purpuratus 68 69 39

XP_797948: Strongylocentrotus purpuratus 70 71 38

XP_959200: Neurospora crassa 72 73 24

YP_011858: Desulfovibrio vulgaris 74 75 26

YP_037315: Bacillus thuringiensis 76 77 30

YP_045480: Acinetobacter sp. 78 79 23

YP_049633: Erwinia carotovora 80 81 31

YP_065241: Desulfotalea psychrophila 82 83 27

YP_065245: Desulfotalea psychrophila 84 85 28

YP_070243: Yersinia pseudotuberculosis 86 87 28

YP_084517: Bacillus cereus 88 89 30

YP_103707: Burkholderia mallei 90 91 27

YP_109214: Burkholderia pseudomallei 92 93 27

YP_150207: Salmonella enterica 94 95 30

YP_164989: Silicibacter pomeroyi 96 97 32

YP_167867: Silicibacter pomeroyi 98 99 33

YP_216944: Salmonella enterica 100 101 30

YP_233469: Pseudomonas syringae 102 103 27

YP_234762: Pseudomonas syringae 104 105 21

YP_234886: Pseudomonas syringae 106 107 24

YP_257395: Pseudomonas fluorescens 108 109 27

YP_264886: Psychrobacter arcticus 110 111 29

YP_271227: Colwellia psychrerythraea 112 113 23

Columna Nº 1: Columna Nº 2 Columna Nº 3 Columna Nº 4 Columna Nº 5

YP_272646: Pseudomonas syringae 114 115 27

YP_273913: Pseudomonas syringae 116 117 22

YP_273996: Pseudomonas syringae 118 119 24

YP_297784: Ralstonia eutropha 120 121 26

YP_300428: Staphylococcus saprophyticus 122 123 32

YP_310154: Shigella sonnei 124 125 29

YP_321891: Anabaena variabilis 126 127 23

YP_335503: Burkholderia pseudomallei 128 129 24

YP_341190: Pseudoalteromonas haloplanktis 130 131 24

YP_345978: Pseudomonas fluorescens 132 133 27

YP_366559: Burkholderia sp. 134 135 30

YP_373615: Burkholderia sp. 136 137 25

YP_389072: Desulfovibrio desulfuricans 138 139 28

YP_391222: Thiomicrospira crunogena 140 141 22

YP_402750: Shigella dysenteriae 142 143 30

YP_407560: Shigella boydii 144 145 31

YP_435720: Hahella chejuensis 146 147 22

YP_439298: Burkholderia thailandensis 148 149 24

YP_454591: Sodalis glossinidius 150 151 26

YP_464642: Anaeromyxobacter dehalogenans 152 153 32

YP_510818: Jannaschia sp. 154 155 26

YP_527135: Saccharophagus degradans 156 157 34

YP_527202: Saccharophagus degradans 158 159 23

YP_541124: Escherichia coli 160 161 29

YP_548994: Polaromonas sp. 162 163 26

YP_550624: Polaromonas sp. 164 165 25

YP_554094: Burkholderia xenovorans 166 167 24

Columna Nº 1: Columna Nº 2 Columna Nº 3 Columna Nº 4 Columna Nº 5

YP_581089: Psychrobacter cryohalolentis 168 169 29

ZP_00105754: Nostoc punctiforme 170 171 22

ZP_00204949: Pseudomonas aeruginosa 172 173 21

ZP_00235416: Bacillus cereus 174 175 30

ZP_00241961: Rubrivivax gelatinosus 176 177 24

ZP_00308173: Cytophaga hutchinsonii 178 179 24

ZP_00378456: Brevibacterium linens 180 181 30

ZP_00378517: Brevibacterium linens 182 183 25

ZP_00422441: Burkholderia vietnamiensis 184 185 24

ZP_00452460: Burkholderia cenocepacia 186 187 24

ZP_00619434: Kineococcus radiotolerans 188 189 29

ZP_00655563: Nocardioides sp. 190 191 26

ZP_00655579: Nocardioides sp. 192 193 24

ZP_00666038: Syntrophobacter fumaroxidans 194 195 28

ZP_00686013: Burkholderia ambifaria 196 197 24

ZP_00695539: Shigella boydii 198 199 29

ZP_00704208: Escherichia coli 200 201 30

ZP_00706049: Escherichia coli 202 203 29

ZP_00715158: Escherichia coli 204 205 29

ZP_00774185: Pseudoalteromonas atlantica 206 207 22

ZP_00774405: Pseudoalteromonas atlantica 208 209 32

ZP_00777501: Pseudoalteromonas atlantica 210 211 28

ZP_00791500: Yersinia pseudotuberculosis 212 213 28

ZP_00799744: Alkaliphilus metalliredigenes 214 215 35

ZP_00808738: Rhodopseudomonas palustris 216 217 30

ZP_00861350: Bradyrhizobium sp. 218 219 24

Columna Nº 1: Columna Nº 2 Columna Nº 3 Columna Nº 4 Columna Nº 5

ZP_00923697: Escherichia coli 220 221 29

ZP_00944339: Ralstonia solanacearum 222 223 24

ZP_00959540: Roseovarius nubinhibens 224 225 25

ZP_00961132: Roseovarius nubinhibens 226 227 30

ZP_00968640: Pseudomonas aeruginosa 228 229 21

ZP_00974363: Pseudomonas aeruginosa 230 231 21

ZP_00976764: Burkholderia cenocepacia 232 233 22

ZP_00978652: Burkholderia cenocepacia 234 235 25

ZP_00983649: Burkholderia dolosa 236 237 25

ZP_01019104: Polaromonas naphthalenivorans 238 239 26

ZP_01027677: Burkholderia mallei 240 241 27

ZP_01035983: Roseovarius sp. 242 243 29

ZP_01037089: Roseovarius sp. 244 245 32

ZP_01050656: Cellulophaga sp. 246 247 24

ZP_01053873: Tenacibaculum sp. 248 249 25

ZP_01060636: Flavobacterium sp. 250 251 24

ZP_01070075: Campylobacter jejuni 252 253 20

ZP_01074915: Marinomonas sp. 254 255 20

ZP_01102706: gamma proteobacterium 256 257 30

ZP_01104195: gamma proteobacterium 258 259 26

ZP_01107544: Flavobacteriales bacterium 260 261 25

ZP_01110185: Alteromonas macleodii 262 263 21

ZP_01116950: Polaribacter irgensii 264 265 24

ZP_01120549: Robiginitalea biformata 266 267 23

ZP_01129787: marine actinobacterium 268 269 24

ZP_01150242: Desulfotomaculum reducens 270 271 28

ZP_01150249: Desulfotomaculum reducens 272 273 29

ZP_01168090: Oceanospirillum sp. 274 275 21

ZP_01184367: Bacillus weihenstephanensis 276 277 31

Columna Nº 1: Columna Nº 2 Columna Nº 3 Columna Nº 4 Columna Nº 5

ZP_01196859: Xanthobacter autotrophicus 278 279 26

ZP_01200770: Xanthobacter autotrophicus 280 281 27

ZP 01201978: Flavobacteria bacterium 282 283 24

ZP_01223813: marine gamma 284 285 34

ZP_01246005: Flavobacterium johnsoniae 286 287 24

ZP_01252717: Psychroflexus torques 288 289 24

ZP_01296455: Pseudomonas aeruginosa 290 291 21

Q1WLF4_RHIME: Rhizobium meliloti 292 293 24

Q2U8N3_ASPOR: Aspergillus oryzae 294 295 27

Q2UA44_ASPOR: Aspergillus oryzae 296 297 25

Q872C9_NEUCR: Neurospora crassa 298 299 26

Q8KJA8_RHILO: Rhizobium loti 300 301 24

Q8W4C7_ARATH: Arabidopsis thaliana 302 303 95

Q9P964_PENCI: Penicillium citrinum 304 305 25

Q9SX74_ARATH: Arabidopsis thaliana 306 307 96

1A1D_BRAJA: Bradyrhizobium japonicum 308 309 24

1A1D_BURMA: Burkholderia mallei 310 311 24

1A1D_CRYNE: Cryptococcus neoformans 312 313 25

1A1D_ENTCL: Enterobacter cloacae 314 315 23

1A1D_PSEFL: Pseudomonas fluorescens 316 317 25

1A1D_PSEPU: Pseudomonas putida 318 319 24

1A1D_PSESO: Pseudomonas sp pseudomonas 320 321 24

1A1D_PSESM: Pseudomonas syringae 322 323 24

1A1D_PSEUD: Pseudomonas sp 324 325 24

1A1D_PYRAB: Pyrococcus abyssi 326 327 30

1A1D_RALSO: Ralstonia solanacearum 328 329 24

1A1D_RHILO: Rhizobium loti 330 331 23

1A1D_RHILV: Rhizobium leguminosarum 332 333 24

Columna Nº 1: Columna Nº 2 Columna Nº 3 Columna Nº 4 Columna Nº 5

1A1D_SCHPO: Schizosaccharomyces pombe 334 335 27

1A1D_THEMA: Thermotoga maritima 336 337 32

1A1D_VARPD: Variovorax paradoxus 338 339 23

DCYD_YERPE: Yersinia pestis 340 341 28

Tabla 2. Genes de ACCDP nuevos, su origen, secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos correspondiente, y su porcentaje de identidad compartido con AtACCD (SEC ID Nº: 2) al nivel de aminoácidos (algoritmo de Needleman-Wunsch para alineamiento de secuencia global, J. Mol. Biol. 48(3): 443-53; Matriz: Blosum 62; Penalización de apertura de hueco: 10,0; Penalización de extensión de hueco: 2,0)

Columna Nº 1: Columna Nº 2 Columna Nº 3 Columna Nº 4 Columna Nº 5

GmACCD-2 (48982441_singleclone): Glycine max 342 343 72

BnACCD (49287365_singleclone): Brassica napus 344 345 86

ZmACCD-2 (62053108_singleclone): Zea mays 346 347 68

ZmACCD-3 (62053108_singlecloneDLM): Zea mays 348 349 57

ZmACCD-1: Zea mays 350 351 69

OsACCD: arroz 352 353 69

GmACCD-1: Glycine max 354 355 74

TaACCD: trigo 356 357 67

5 La presente divulgación abarca además nuevas secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas de ACCDP y su uso para aumentar el crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a una tensión ambiental de una planta. En esta variación de la divulgación, las secuencias de ACCDP son de canola, soja, arroz, trigo o maíz, u homólogos de las mismas. Preferentemente en esta variación de la divulgación, las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas de ACCDP son las de canola, soja, arroz, trigo o maíz como se expone en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas

10 en las Columnas Nº 3 y 4 de la Tabla 2.

La presente invención proporciona una planta de cultivo transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica ACCDP, en la que la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta da como resultado aumento del crecimiento de la raíz, aumento del rendimiento y/o aumento de la tolerancia a una tensión ambiental en comparación con una variedad natural de la planta. En particular, el aumento del crecimiento de la raíz es un 15 aumento en la longitud de las raíces. Puede entenderse que el término “planta” como se usa en el presente documento, dependiendo del contexto, se refiere a plantas completas, células vegetales y partes de plantas incluyendo semillas. Las partes de plantas incluyen, pero sin limitación, tallos, raíces, óvulos, estambres, hojas, embriones, regiones meristémicas, tejido calloso, gametofitos, esporofitos, polen, microsporas y similares. En una variación de la divulgación, la planta transgénica es masculina estéril. También se proporciona una semilla de planta 20 de cultivo producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica ACCDP, en la que la semilla contiene el ácido nucleico que codifica ACCDP, y en la que la planta es genéticamente pura con respecto a aumento del crecimiento de la raíz, aumento del rendimiento y/o aumento de la tolerancia a la tensión ambiental en comparación con una variedad natural de la planta. La invención proporciona además una semilla producida por una planta de cultivo transgénica que expresa un ACCDP, en la que la semilla contiene el ACCDP, y en la que la planta

es genéticamente pura con respecto a aumento del crecimiento de la raíz, aumento del rendimiento y/o aumento de la tolerancia a la tensión ambiental en comparación con una variedad natural de la planta. La divulgación también proporciona un producto producido por o de las plantas transgénicas que expresan el ácido nucleico que codifica ACCDP, sus partes vegetales o sus semillas. El producto puede obtenerse usando diversos procedimientos bien conocidos en la técnica. Como se usa en el presente documento, la palabra “producto” incluye, pero sin limitación, un producto alimentario, pienso, un complemento alimentario, complemento de pienso, producto cosmético o producto farmacéutico. Los productos alimentarios se consideran composiciones usadas para nutrición. Estos también incluyen composiciones para complementar la nutrición. Los piensos animales y complementos de piensos animales, en particular, se consideran productos alimentarios. La divulgación proporciona además un producto agrícola producido por cualquiera de las plantas transgénicas, partes de plantas y semillas de plantas. Los productos agrícolas incluyen, pero sin limitación, extractos vegetales, proteínas, aminoácidos, carbohidratos, grasas, aceites, polímeros, vitaminas y similares.

Como se usa en el presente documento, el término “variedad” se refiere a un grupo de plantas dentro de una especie que comparten caracteres constantes que los separan de la forma típica y de otras posibles variedades dentro de esa especie. Aunque posee al menos un rasgo distintivo, una variedad también se caracteriza por cierta variación entre los individuos dentro de la variedad, basándose principalmente en la segregación Mendeliana de rasgos entre la descendencia de generaciones sucesivas. Se considera que una variedad es “genéticamente pura” para un rasgo particular si es genéticamente homocigota para ese rasgo en la medida en que, cuando la variedad genéticamente pura se autopoliniza, no se observa una cantidad significativa de segregación independiente del rasgo entre la descendencia. En la presente invención, el rasgo surge de la expresión transgénica de una o más secuencias de ADN introducidas en una variedad vegetal.

Se entiende que las plantas de cultivo de acuerdo con la invención incluyen plantas de cultivo dicotiledóneas tales como, por ejemplo, de las familias de las Leguminosas tales como guisante, alfalfa y soja; la familia de las Umbelíferas, particularmente el género Daucus (muy particularmente la especie carota (zanahoria)) y Apium (muy particularmente la especie graveolens variedad dulce (apio)) y muchas otras; la familia de las Solanáceas, particularmente el género Lycopersicon, muy particularmente la especie esculentum (tomate) y el género Solanum, muy particularmente la especie tuberosum (patata) y melongena (berenjena), tabaco y muchas otras; y el género Capsicum, muy particularmente la especie annum (pimiento) y muchas otras; la familia de las Leguminosas, particularmente el género Glycine, muy particularmente la especie max (soja) y muchas otras; y la familia de las Crucíferas, particularmente el género Brassica, muy particularmente la especie napus (colza), campestris (remolacha), oleracea cv Tastie (repollo), oleracea cv Snowball Y (coliflor) y oleracea cv Emperor (brócoli); y el género Arabidopsis, muy particularmente la especie thaliana y muchas otras; la familia de las Compuestas, particularmente el género Lactuca, muy particularmente la especie sativa (lechuga) y muchas otras; y la familia de las Malváceas, particularmente el género Gossypium, muy particularmente la especie conocida como algodón; y la familia de las Fabáceas, particularmente el género Arachis, muy particularmente la especie hypogaea (cacahuete).

Las plantas de cultivo de acuerdo con la invención también incluyen plantas de cultivo monocotiledóneas, tales como, por ejemplo, cereales tales como trigo, cebada, sorgo y mijo, centeno, triticale, maíz, arroz o avena, y caña de azúcar. Se prefieren además árboles tales como manzano, peral, membrillo, ciruelo, cerezo, melocotonero, nectarina, albaricoquero, papaya, mango y otras especies leñosas incluyendo coníferas y árboles de hoja caduca tales como álamo, pino, secuoya, cedro, roble, etc. Se prefieren especialmente Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, colza, soja, maíz, trigo, linaza, patata y Tagetes.

La presente invención describe por primera vez que el ACCDP es útil para aumentar el crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a la tensión ambiental de una planta de cultivo. Como se usa en el presente documento, el término polipéptido se refiere a una cadena de al menos cuatro aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. La cadena puede ser lineal, ramificada, circular, o combinaciones de las mismas. En consecuencia, la presente divulgación posibilita el uso en plantas de cultivo de ACCDP aislados seleccionados de cualquiera de los organismos proporcionados en la Columna Nº 2 de la Tabla 1 y la Tabla 2, y homólogos de los mismos. En realizaciones preferidas de la invención, el ACCDP se selecciona de: 1) los polipéptidos de ACCDP de SEC ID Nº: 2; y 2) homólogos y ortólogos de los mismos. Se definen posteriormente homólogos y ortólogos de las secuencias de aminoácidos.

Los ACCDP de la presente divulgación se producen preferentemente por técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, se clona una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido en un vector de expresión (como se describe posteriormente), se introduce el vector de expresión en una célula huésped (como se describe posteriormente) y el ACCDP se expresa en la célula huésped. El ACCDP puede después aislarse de las células por un esquema de purificación apropiado usando técnicas de purificación de polipéptidos convencionales. Para los fines de la invención, la expresión “polinucleótido recombinante” se refiere a un polinucleótido que se ha alterado, reordenado o modificado por ingeniería genética. Los ejemplos incluyen cualquier polinucleótido clonado, y polinucleótidos que se han ligado o unido a secuencias heterólogas. El término “recombinante” no se refiere a alteraciones de polinucleótidos que resultan de acontecimientos de origen natural, tales como mutaciones espontáneas. Como alternativa a la expresión recombinante, un ACCDP, o péptido del mismo, puede sintetizarse químicamente usando técnicas de síntesis peptídica convencionales. Además, puede aislarse ACCDP nativo de células (por ejemplo, células de Arabidopsis thaliana), por ejemplo usando un anticuerpo anti-ACCDP, que puede

producirse por técnicas convencionales utilizando un ACCDP o fragmento del mismo.

Como se usa en el presente documento, la expresión “tensión ambiental” se refiere a tensión ambiental seleccionada de una o más del grupo que consiste en salinidad, sequía o temperatura, o combinaciones de las mismas, y en particular, puede seleccionarse de una o más del grupo que consiste en alta salinidad, bajo contenido en agua (sequía) o baja temperatura. En una realización más preferida, la tensión ambiental es tensión por sequía. Como se usa también en el presente documento, la expresión “eficacia en el uso de agua” se refiere a la cantidad de materia orgánica producida por una planta dividida por la cantidad de agua usada por la planta para producirla, es decir, el peso seco de una planta en relación con el uso de agua de la planta. Como se usa en el presente documento, la expresión “peso seco” se refiere a todo en la planta distinto del agua, e incluye, por ejemplo, carbohidratos, proteínas, aceites y nutrientes minerales. También debe entenderse que como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, “un” o “una” puede significar uno o más, dependiendo del contexto en el que se use. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “una célula” puede significar que puede utilizarse al menos una célula.

Como se usa también en el presente documento, la expresión “ácido nucleico” y “polinucleótido” se refieren a ARN o ADN que es lineal o ramificado, mono o bicatenario, o un híbrido de los mismos. La expresión también abarca híbridos de ARN/ADN. Estos términos también abarcan una secuencia no traducida localizada en los extremos tanto 3’ y 5’ de la región codificante del gen: al menos aproximadamente 1000 nucleótidos de secuencia cadena arriba desde el extremo 5’ de la región codificante y al menos aproximadamente 200 nucleótidos de secuencia cadena abajo desde el extremo 3’ de la región codificante del gen. También pueden usarse bases menos comunes, tales como inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina y otras para emparejamiento de ribozimas, ARNbc y antisentido. Por ejemplo, se ha mostrado que los polinucleótidos que contienen análogos de propina C-5 de uridina y citidina se unen a ARN con alta afinidad y que son potentes inhibidores antisentido de la expresión génica. También pueden realizarse otras modificaciones, tales como modificación de la cadena principal de fosfodiéster, o el hidroxi-2’ en el grupo de azúcar ribosa del ARN. Los polinucleótidos antisentido y ribozimas pueden consistir enteramente en ribonucleótidos, o pueden contener ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos mezclados. Los polinucleótidos de la divulgación pueden producirse por cualquier medio, incluyendo preparaciones genómicas, preparaciones de ADNc, síntesis in vitro, RT-PCR y transcripción in vitro o in vivo.

Una molécula de ácido nucleico “aislada” es una que está sustancialmente separada de otras moléculas de ácido nucleico, que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico (es decir, secuencias que codifican otros polipéptidos). Preferentemente, un ácido “nucleico” aislado está sin algunas de las secuencias, que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir secuencias localizadas en los extremos 5’ y 3’ del ácido nucleico) en su replicón de origen natural. Por ejemplo, un ácido nucleico clonado se considera aislado. En diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica ACCDP aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula de la que deriva el ácido nucleico (por ejemplo, una célula de Arabidopsis thaliana). Un ácido nucleico también se considera aislado si se ha alterado por intervención humana, o se ha situado en un locus o localización que no es un sitio natural, o si se introduce en una célula por agroinfección. Además, una molécula de ácido nucleico “aislada”, tal como una molécula de ADNc, puede estar sin algo del otro material celular con el que se asocia de forma natural, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente.

Se excluyen específicamente de la definición de “ácidos nucleicos aislados”: cromosomas de origen natural (tales como extensiones cromosómicas), bibliotecas de cromosomas artificiales, bibliotecas genómicas y bibliotecas de ADNc que existen como una preparación de ácido nucleico in vitro o como una preparación de células huésped transfectadas/transformadas, en la que las células huésped son una preparación heterogénea in vitro o están sembradas en placas como una población heterogénea de colonias individuales. También se excluyen específicamente las bibliotecas anteriores en las que un ácido nucleico específico compone menos del 5 % del número de insertos de ácido nucleico en las moléculas de vector. Se excluyen además específicamente preparaciones de ADN genómico de células completas o ARN de células completas (incluyendo preparaciones de células completas que se cortan mecánicamente o se digieren enzimáticamente). Se excluyen aún más específicamente las preparaciones celulares completas halladas como una preparación in vitro o como una mezcla heterogénea separada por electroforesis en las que el ácido nucleico de la divulgación no se ha separado adicionalmente de los ácidos nucleicos heterólogos en el medio de electroforesis (por ejemplo, separando adicionalmente mediante escisión una única banda de una población de bandas heterogénea en un gel de agarosa o transferencia de nailon).

Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente divulgación, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2, o una parte de la misma, puede aislarse usando técnicas de biología molecular convencionales y la información de secuencia proporcionada en el presente documento. Por ejemplo, puede aislarse un ADNc de ACCDP de cualquier biblioteca de cultivo usando toda o una parte de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2. Además, una molécula de ácido nucleico que abarca toda o una parte de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2 puede aislar por la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores oligonucleotídicos diseñados basándose en esta secuencia. Por ejemplo, puede aislarse ARNm de células vegetales (por ejemplo, por el

procedimiento de extracción de guanidinio-tiocianato de Chirgwin y col., 1979, Biochemistry 18: 5294-5299) y puede prepararse ADNc usando transcriptasa inversa (por ejemplo, transcriptasa de MLV de Moloney, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD; o transcriptasa inversa de AMV, disponible de Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Pueden diseñarse cebadores oligonucleotídicos sintéticos para amplificación por reacción en cadena de la polimerasa basándose en la secuencia de nucleótidos como se expone en cualquiera de las secuencias mostradas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2. Puede amplificarse una molécula de ácido nucleico de la invención usando ADNc o, como alternativa, ADN genómico, como un molde y cebadores oligonucleotídicos apropiados de acuerdo con técnicas de amplificación por PCR convencionales. La molécula de ácido nucleico amplificada de este modo puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis de secuencia de ADN. Además, pueden prepararse oligonucleótidos correspondientes a una secuencia de nucleótidos de ACCDP por técnicas sintéticas convencionales, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automático.

Una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la divulgación comprende las secuencias de nucleótidos expuestas en cualquiera de las secuencias mostradas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2. Estos ADNc pueden comprender secuencias que codifican los ACCDP (es decir, la “región codificante”), así como secuencias no traducidas 5’ y secuencias no traducidas 3’. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente divulgación pueden comprender solamente la región codificante de cualquiera de las secuencias proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2, o pueden contener fragmentos genómicos completos aislados de ADN genómico. La presente divulgación también incluye ácidos nucleicos codificantes de ACCDP que codifican ACCDP descritos en el presente documento. Se prefiere un ácido nucleico que codifica ACCDP que codifica ACCDP como se muestra en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2.

Además, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la divulgación puede comprender una parte de la región codificante de cualquiera de las secuencias proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2, por ejemplo, un fragmento que puede usarse como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una parte biológicamente activa de un ACCDP. Las secuencias de nucleótidos determinadas a partir de la clonación del gen de ACCDP de cualquiera de los organismos proporcionados en la Tabla 1 y la Tabla 2 permiten la generación de sondas y cebadores diseñados para su uso en la identificación y/o clonación de homólogos de ACCDP en otros tipos celulares y organismos, así como homólogos de ACCDP de plantas de cultivo y especies relacionadas. La parte de la región codificante también puede codificar un fragmento biológicamente activo de un ACCDP.

Como se usa en el presente documento, se pretende que la expresión “parte biológicamente activa de” un ACCDP incluya una parte, por ejemplo, un dominio/motivo de un ACCDP que participa en la modulación del crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a la tensión en una planta, y más preferentemente, tolerancia a la sequía. Para los fines de la presente invención, la modulación del crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a la tensión se refiere a al menos un aumento o reducción del 10 % en el crecimiento de las raíces, rendimiento y/o tolerancia a la tensión de una planta transgénica que comprende un casete de expresión de ACCDP (o vector de expresión) en comparación con el crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a la tensión de una planta de control no transgénica. Se proporcionan procedimientos para cuantificar el crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a la tensión al menos en los Ejemplos 5, 6 y 17-19 posteriores. En una realización preferida, la parte biológicamente activa de un ACCDP aumenta el crecimiento de la raíz de una planta, preferentemente aumentando la longitud de la raíz.

Las partes biológicamente activas de un ACCDP incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de aminoácidos de un ACCDP, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2, o la secuencia de aminoácidos de un polipéptido idéntico a un ACCDP, que incluye menos aminoácidos que un ACCDP de longitud completa o el polipéptido de longitud completa que es idéntico a un ACCDP, y muestra al menos una actividad de un ACCDP. Típicamente, las partes biológicamente activas (por ejemplo, péptidos que son, por ejemplo, de 5, 10, 15, 20 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100, o más aminoácidos de longitud) comprenden un domino o motivo con al menos una actividad de un ACCDP. Además, otras partes biológicamente activas en las que se suprimen otras regiones del polipéptido pueden prepararse por técnicas recombinantes y evaluarse con respecto a una o más de las actividades descritas en el presente documento. Preferentemente, la parte biológicamente activa de un ACCDP incluye uno o más dominios/motivos seleccionados o partes de los mismos que tienen función para convertir ACC en un ketobutirato y amoníaco.

La divulgación también proporciona polipéptidos de fusión o quiméricos de ACCDP. Como se usa en el presente documento, un “polipéptido quimérico” o “polipéptido de fusión” de ACCDP comprende un ACCDP unido operativamente a un no ACCDP. Un ACCDP se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un ACCDP, mientras que un no ACCDP se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un polipéptido que no es sustancialmente idéntico al ACCDP, por ejemplo, un polipéptido que es diferente del ACCDP y deriva del mismo o un organismo diferente. Con respecto al polipéptido de fusión, la expresión “unido operativamente” pretende indicar que el ACCDP y el no ACCDP están fusionados entre sí de modo que ambas secuencias cumplen la función propuesta atribuida a la secuencia usada. El no ACCDP puede fusionarse con el extremo N terminal o C terminal del ACCDP. Por ejemplo, en una variación de la divulgación, el polipéptido de fusión es un polipéptido de fusión de GST-ACCDP en el que las secuencias de ACCDP están fusionadas con el extremo C terminal de las secuencias de GST. Dichos polipéptidos de fusión pueden facilitar la purificación de ACCDP recombinantes. En otra variación de la divulgación, el polipéptido de fusión es un ACCDP que contiene una secuencia señal heteróloga en su extremo N terminal. En ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), la expresión y/o secreción de un ACCDP puede aumentarse mediante el uso de una

5 secuencia señal heteróloga.

Preferentemente, se produce un polipéptido quimérico o de fusión de ACCDP de la divulgación mediante técnicas de ADN recombinante convencionales. Por ejemplo, se ligan entre sí en fase fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias polipeptídicas de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando extremos romos o escalonados para ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, 10 relleno de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar unión no deseable y ligación enzimática. En otra variación de la divulgación, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automáticos. Como alternativa, puede llevarse a cabo amplificación por PCR de fragmentos génicos usando cebadores de anclaje que den lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden posteriormente hibridarse y volver a

15 amplificarse para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel y col. John Wiley & Sons: 1992). Además, están disponibles en el mercado muchos vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido de GST). Puede clonarse un ácido nucleico que codifica ACCDP en dicho vector de expresión de modo que el resto de fusión esté ligado en fase con el ACCDP.

20 Además de los fragmentos y polipéptidos de fusión de los ACCDP descritos en el presente documento, la presente divulgación incluye homólogos y análogos de ACCDP de origen natural y ácidos nucleicos que codifican ACCDP en una planta. “Homólogos” se define en el presente documento como dos ácidos nucleicos o polipéptidos que tienen secuencias de nucleótidos o aminoácidos similares o “idénticas”, respectivamente. Los homólogos incluyen variantes alélicas, ortólogos, parálogos, agonistas y antagonistas de ACCDP como se definen posteriormente en el presente

25 documento. El término “homólogo” abarca además moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia de nucleótidos que se expone en cualquiera de la SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2 (y partes de las mismas) debido a la degeneración del código genético y por lo tanto codifican el mismo ACCDP que se codifica por la secuencia de nucleótidos correspondiente como se expone en dicha SEC ID Nº proporcionada en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2. Como se usa en el presente documento, un ACCDP de

30 “origen natural” se refiere a una secuencia de aminoácidos de ACCDP que aparece en la naturaleza. Preferentemente, un ACCDP de origen natural comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2.

Un agonista del ACCDP puede conservar sustancialmente las mismas, o un subconjunto, de las actividades biológicas del ACCDP. Un antagonista del ACCDP puede inhibir una o más de las actividades de la forma de origen

35 natural del ACCDP.

Las moléculas de ácido nucleico que corresponden a variantes alélicas naturales y análogos, ortólogos y parálogos de un ADNc de ACCDP pueden aislarse basándose en su identidad con los ácidos nucleicos de ACCDP descritos en el presente documento usando ADNc de ACCDP, o una parte de los mismos, como una sonda de hibridación de acuerdo con técnicas de hibridación convencionales en condiciones de hibridación rigurosas. En una variación 40 alternativa de la divulgación, pueden identificarse homólogos del ACCDP explorando bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncamiento, del ACCDP con respecto a actividad agonista o antagonista de ACCDP. En una variación de la divulgación, se genera una biblioteca abigarrada de variantes de ACCDP por mutagénesis combinatoria en el nivel de ácido nucleico y se codifica por una biblioteca génica abigarrada. Una biblioteca abigarrada de variantes de ACCDP puede producirse, por ejemplo, ligando enzimáticamente una mezcla 45 de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas de modo que sea expresable un conjunto degradado de secuencias de ACCDP potenciales como polipéptidos individuales, o como alternativa, como un conjunto de polipéptidos de fusión mayores (por ejemplo, para presentación de fagos) que contenga el conjunto de secuencias de ACCDP en los mismos. Hay una diversidad de procedimientos que pueden usarse para producir bibliotecas de homólogos de ACCDP potenciales de una secuencia de oligonucleótidos degradada. Puede realizarse síntesis

50 química de una secuencia génica degradada en un sintetizador de ADN automático y el gen sintético se liga después en un vector de expresión apropiado. El uso de un conjunto degradado de genes posibilita la aportación, en una mezcla, de todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de secuencias de ACCDP potenciales. Se conocen en la técnica procedimientos para sintetizar oligonucleótidos degradados.

Además, pueden usarse bibliotecas de fragmentos de las regiones codificantes de ACCDP para generar una

55 población abigarrada de fragmentos de ACCDP para exploración y posterior selección de homólogos de un ACCDP. En una variación de la divulgación, puede generarse una biblioteca de fragmentos de secuencia codificante tratando un fragmento de PCR bicatenario de una secuencia codificante de ACCDP con una nucleasa en condiciones en las que se produce muesca solamente aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN bicatenario, renaturalizando el ADN para formar ADN bicatenario, que puede incluir pares sentido/antisentido con diferentes

60 productos con muescas, retirando partes monocatenarias de dobles cadenas reformadas mediante tratamiento con nucleasa S1, y ligando la biblioteca de fragmento resultante en un vector de expresión. Por este procedimiento, puede derivarse una biblioteca de expresión que codifica fragmentos N terminales, C terminales e internos de

diversos tamaños del ACCDP.

Se conocen en este campo diversas técnicas para explorar productos génicos de bibliotecas combinatorias realizadas mediante mutaciones puntuales o truncamiento, y para explorar bibliotecas de ADNc con respecto a productos génicos que tengan una propiedad seleccionada. Dichas técnicas son adaptables para exploración rápida de las bibliotecas génicas generadas por la mutagénesis combinatoria de homólogos de ACCDP. Las técnicas más ampliamente usadas, que son susceptibles de análisis de alto rendimiento, para explorar bibliotecas génicas grandes típicamente incluyen clonar la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, transformar células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y expresar los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se ha detectado. Puede usarse mutagénesis de conjunto recursiva (REM), una técnica que potencia la frecuencia de mutaciones funcionales en las bibliotecas, en combinación con los ensayos de exploración para identificar homólogos de ACCDP (Arkin y Yourvan, 1992, PNAS 89: 7811-7815; Delgrave y col., 1993, Polypeptide Engineering 6 (3): 327-331). En otra variación de la divulgación, pueden aprovecharse ensayos basados en células para analizar una biblioteca de ACCDP abigarrada, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. La presente divulgación proporciona además un procedimiento para identificar un nuevo ACCDP, que comprende (a) elevar una respuesta de anticuerpo específica a un ACCDP, o un fragmento del mismo, como se describe en el presente documento; (b) explorar material de ACCDP potencial con el anticuerpo, en el que la unión específica del anticuerpo con el material indica la presencia de un ACCDP potencialmente nuevo; y (c) analizar el material unido en comparación con ACCDP conocido, para determinar su novedad.

Como se ha indicado anteriormente, la presente divulgación se refiere a ACCDP y homólogos de los mismos. Para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, la secuencia de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2; y una forma mutante de la misma), las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de un polipéptido para alineamiento óptimo con el otro polipéptido o ácido nucleico). Después se comparan los restos de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos correspondientes. Cuando una posición en una secuencia (por ejemplo, la secuencia de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2) está ocupada por el mismo resto de aminoácido que la posición correspondiente en la otra secuencia (por ejemplo, la secuencia de una forma mutante de la SEC ID Nº correspondiente proporcionada en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2), entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Puede realizarse el mismo tipo de comparación entre dos secuencias de ácido nucleico.

El porcentaje de identidad de secuencia entre las dos secuencias está en función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad de secuencia = números de posiciones idénticas/números totales de posiciones x 100). Preferentemente, los homólogos de aminoácidos aislados útiles en la presente invención son al menos 70-75 %, 75-80 %, 80-85 %, 85-90 % o 90-95 %, y más preferentemente al menos 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más idénticos a una secuencia de aminoácidos completa mostrada en SEC ID Nº:

2. En otra realización más, los homólogos de aminoácidos aislados útiles en la presente invención son al menos 7075 %, 75-80 %, 80-85 %, 85-90 % o 90-95 %, y más preferentemente al menos 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más idénticos a una secuencia de aminoácidos completa codificada por una secuencia de ácido nucleico mostrada en SEC ID Nº: 2.

En otra realización preferida, un homólogo de ácido nucleico aislado usado en la invención comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 70-75 %, 75-80 %, 80-85 %, 85-90 % o 90-95 %, y aún más preferentemente al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más idéntica a una secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº: 1. La longitud preferible de comparación de secuencia para ácidos nucleicos es de al menos 75 nucleótidos, más preferentemente al menos 100 nucleótidos, y más preferentemente la longitud completa de la región codificante. Es aún más preferible que los homólogos de ácido nucleico codifiquen proteínas que tengan homología con SEC ID Nº: 2.

Se prefiere además que el homólogo de ácido nucleico aislado usado en los procedimientos, plantas de cultivo o semilla de la invención codifique un ACCDP que sea al menos 80 % idéntico a una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, y que actúe como un modulador del crecimiento de la raíz, rendimiento y/o una respuesta a la tensión ambiental en una planta, en el que la sobreexpresión del homólogo de ácido nucleico en una planta aumenta el crecimiento de la raíz de la planta, rendimiento y/o la tolerancia de la planta a una tensión ambiental. En una realización preferida adicional, el homólogo de ácido nucleico codifica un ACCDP que puede convertir ACC en !ketobutirato y amoníaco.

Para los fines de la invención, el porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido se determina usando el paquete de software Vector NTI 9.0 (PC) (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA92008). Se usan una penalización de apertura de hueco de 15 y de una penalización de extensión de hueco de 6,66 para determinar el porcentaje de identidad de dos ácidos nucleicos. Se usan una penalización de apertura de hueco de 10 y una penalización de extensión de hueco de 0,01 para determinar el porcentaje de identidad de dos polipéptidos. Todos los otros parámetros se establecen en los ajustes por defecto. Para fines de un alineamiento múltiple (algoritmo de Clustal W), la penalización de apertura de hueco es 10 y la penalización de extensión de hueco es 0,05 con matriz blosum62. Debe entenderse que para los fines de determinar la identidad de

secuencia cuando se compara una secuencia de ADN con una secuencia de ARN, un nucleótido de timidina es equivalente a un nucleótido de uracilo.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que hibrida con el polinucleótido de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2 en condiciones rigurosas. Más particularmente, una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la divulgación es de al menos 15 nucleótidos de longitud e hibrida en condiciones rigurosas con la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2. En otra variación de las divulgaciones, el ácido nucleico es de al menos 30, 50, 100, 250 o más nucleótidos de longitud. Preferentemente, un homólogo de ácido nucleico aislado de la divulgación comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones altamente rigurosas con la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2 y actúa como un modular del crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a la tensión en una planta. En una variación preferida adicional de la divulgación, la sobreexpresión del homólogo de ácido nucleico aislado en una planta aumenta el crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a una tensión ambiental de una planta. En una variación preferida aún más de la divulgación, el homólogo de ácido nucleico aislado codifica un ACCDP que puede convertir ACC a !-ketobutirato y amoníaco.

Como se usa en el presente documento con respecto a hibridación para ADN con una mancha de transferencia de ADN, la expresión “condiciones rigurosas” puede referirse a hibridación durante una noche a 60 ºC en solución de Denhart 10X, SSC 6X, SDS 0,5 % y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 ∀g/ml. Las manchas de transferencia se lavan secuencialmente a 62 ºC durante 30 minutos cada vez en SSC 3X/SDS 0,1 %, seguido de SSC 1X/SDS 0,1 % y finalmente SSC 0,1X/SDS 0,1 %. En una variación preferida de la divulgación, la frase “condiciones rigurosas” se refiere a hibridación en una solución de SSC 6X a 65 ºC. También como se usa en el presente documento, “condiciones altamente rigurosas” se refiere a hibridación durante una noche a 65 ºC en solución de Denhart 10X, SSC 6X, SDS 0,5 % y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 ∀g/ml. Las manchas de transferencia se lavan secuencialmente a 65 ºC durante 30 minutos cada vez en SSC 3X/SDS 0,1 %, seguido de SSC 1X/SDS 0,1 %, y finalmente SSC 0,1X/SDS 0,1 %. Se describen procedimientos para hibridaciones de ácido nucleico en Meinkoth y Wahl, 1984, Anal. Biochem. 138: 267-284; Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel y col. Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York, 1995; y Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, Elsevier, Nueva York, 1993. Preferentemente una molécula de ácido nucleico aislada de la divulgación que hibrida en condiciones rigurosas o altamente rigurosas con una secuencia de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2 corresponde a una molécula de ácido nucleico de origen natural. Como se usa en el presente documento, una molécula de ácido nucleico de “origen natural” se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que aparece en la naturaleza (por ejemplo, codifica un polipéptido natural). En una realización, el ácido nucleico codifica un ACCDP de origen natural.

Usando los procedimientos anteriormente descritos, y otros conocidos por los expertos en la materia, un experto habitual en la materia puede aislar homólogos de los ACCDP que comprenden secuencias de aminoácidos mostradas en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2. Un subconjunto de estos homólogos son las variantes alélicas. Como se usa en el presente documento, la expresión “variante alélica” se refiere a una secuencia de nucleótidos que contiene polimorfismos que conducen a cambios en la secuencia de aminoácidos de un ACCDP y que existen dentro una población natural (por ejemplo, una especie o variedad vegetal). Dichas variaciones alélicas naturales pueden dar como resultado típicamente 1-5 % de varianza en un ácido nucleico de ACCDP. Las variantes alélicas pueden identificarse secuenciando la secuencia de ácido nucleico de interés en varias plantas diferentes, lo que puede llevarse a cabo fácilmente usando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético de ACCDP en esas plantas. Se pretende que todas y cada una de dichas variaciones de ácido nucleico y polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes en un ACCDP que son el resultado de variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de un ACCDP, estén dentro del alcance de la divulgación.

Además, se pretende que las moléculas de ácido nucleico que codifican ACCDP de la misma u otra especie tales como análogos, ortólogos y parálogos de ACCDP, estén dentro del alcance de la presente divulgación. Como se usa en el presente documento, el término “análogos” se refiere a dos ácidos nucleicos que tienen la misma o similar función, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. Como se usa en el presente documento, el término “ortólogos” se refiere a dos ácidos nucleicos de especies diferentes, pero que han evolucionado desde un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican polipéptidos que tienen las mismas o similares funciones. También como se usa en el presente documento, el término “parálogos” se refiere a dos ácidos nucleicos que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos tienen habitualmente diferentes funciones, pero estas funciones pueden estar relacionadas (Tatusov, R.L. y col., 1997, Science 278 (5338): 631-637). Los análogos, ortólogos y parálogos de un ACCDP de origen natural pueden diferir del ACCDP de origen natural por modificaciones postraduccionales, por diferencias de secuencia de aminoácidos, o por ambas. Las modificaciones postraduccionales incluyen derivatización química in vivo e in vitro de los polipéptidos, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación o glucosilación, y dichas modificaciones pueden producirse durante la síntesis de polipéptidos o procesamiento o después del tratamiento con enzimas modificadoras aisladas. En particular, los ortólogos útiles en los procedimientos y plantas de cultivos y semillas de cultivo de la invención generalmente mostrarán al menos 80-85 %, más preferentemente, 85-90 % o 90-95 %, y más preferentemente 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o incluso 99 % de identidad, o 100 % de identidad de secuencia, con toda la secuencia de aminoácidos de ACCDP de origen natural proporcionada en la SEC ID Nº 2, y mostrarán una

5 función similar a un ACCDP y actúan como un modulador del crecimiento y/o una respuesta de tensión ambiental en una planta y/o convierte ACC a !-ketobutirato y amoníaco, en los que dicho ortólogo de ACCDP aumenta el crecimiento y/o la tolerancia a la tensión de una planta. En una realización, los ortólogos de ACCDP pueden convertir ACC a !-ketobutirato y amoníaco.

Además de variantes de origen natural de una secuencia de ACCDP que puede existir en la población, el experto en

10 la materia apreciará adicionalmente que pueden introducirse cambios por mutación en una secuencia de nucleótidos de cualquiera de la SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2, conduciendo de este modo a cambios en la secuencia de aminoácidos del ACCDP codificado, sin alterar la actividad funcional del ACCDP. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de nucleótidos que conduzcan a sustituciones de aminoácidos en restos de aminoácidos “no esenciales” en una secuencia de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la

15 Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2. Un resto de aminoácido “no esencial” es un resto que puede alterarse de la secuencia natural de una de las ACCDP sin alterar la actividad de dicha ACCDP, mientras que un resto de aminoácido “esencial” se requiere para actividad ACCDP. Otros restos de aminoácidos, sin embargo, (por ejemplo, los que no están conservados o están solamente semi-conservados en el dominio que tiene actividad ACCDP) pueden no ser esenciales para la actividad y por lo tanto probablemente sean susceptibles de alteración sin alterar la

20 actividad de ACCDP.

En consecuencia, otro aspecto de la divulgación se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican ACCDP que contienen cambios en restos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad de ACCDP. Dichos ACCDP difieren en la secuencia de aminoácidos de una secuencia contenida en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2, pero conservan al menos una de las actividades de ACCDP descritas 25 en el presente documento. En una variación de la divulgación, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en la que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 50-60 % idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2, más preferentemente al menos aproximadamente 6070 % idénticas de la secuencia de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la 30 Tabla 2, aún más preferentemente al menos aproximadamente 70-75 %, 75-80 %, 80-85 %, 85-90 % o 90-95 % idénticas a la secuencia de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2, y más preferentemente al menos aproximadamente 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a la secuencia de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2. Los homólogos de ACCDP preferidos de la presente invención preferentemente participan en un crecimiento de la raíz, rendimiento y/o

35 una respuesta de tolerancia a la tensión de una planta en una planta, o más particularmente, pueden convertir ACC a !-ketobutirato y amoníaco.

Puede crearse una molécula de ácido nucleico aislada que codifique un ACCDP que tenga identidad de secuencia con una secuencia polipeptídica de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y de la Tabla 2 introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en una secuencia de 40 nucleótidos de cualquiera las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2, de modo que se introduzcan una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en el polipéptido codificado. Pueden introducirse mutaciones en la secuencia de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2 por técnicas convencionales, tales como mutagénesis dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Preferentemente, se realizan sustituciones de aminoácidos conservativas en uno o más restos de aminoácidos no

45 esenciales predichos. Una “sustitución de aminoácido conservativa” es una en la que el resto de aminoácido se reemplaza con un resto de aminoácido que tenga una cadena lateral similar.

Se ha definido en la técnica familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, 50 asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, un resto de aminoácido no esencial predicho en un ACCDP se reemplaza preferentemente con otro resto de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Como alternativa, en otra variación de la divulgación, se 55 pueden introducir mutaciones aleatoriamente en toda o parte de una secuencia codificante de ACCDP, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden explorarse con respecto a una actividad ACCDP descrita en el presente documento para identificar mutantes que conservan actividad ACCDP. Después de la mutagénesis de la secuencia de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2 el polipéptido codificado puede expresarse de forma recombinante y la actividad del polipéptido puede

60 determinarse analizando el crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a la tensión de una planta que expresa el polipéptido descrito al menos en los Ejemplos 5, 6 y 17-19.

Adicionalmente, pueden crearse ácidos nucleicos de ACCDP optimizados. Preferentemente, un ácido nucleico de

ACCDP optimizado codifica un ACCDP que modula el crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a una tensión ambiental de una planta, y más preferentemente aumenta el crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a una tensión ambiental de una planta tras su sobreexpresión en la planta. Como se usa en el presente documento, “optimizado” se refiere a un ácido nucleico que está modificado por ingeniería genética para aumentar su expresión en una planta o animal dado. Para proporcionar ácidos nucleicos de ACCDP optimizados para planta, la secuencia de ADN del gen puede modificarse para 1) comprender codones preferidos por genes vegetales altamente expresados; 2) comprender un contenido de A+T en composición de bases nucleotídicas para el hallado sustancialmente en plantas; 3) formar una secuencia de inicio de la planta; o 4) eliminar secuencias que provoquen desestabilización, poliadenilación inapropiada, degradación y terminación de ARN, o que formen horquillas de estructura secundaria o sitios de corte y empalme de ARN. El aumento de la expresión de ácidos nucleicos de ACCDP en plantas puede conseguirse utilizando la frecuencia de distribución de uso codónico en plantas en general

o en una planta particular. Pueden encontrarse procedimientos para optimizar la expresión de ácidos nucleicos en plantas en los documentos EPA 0359472; EPA 0385962; Solicitud de PCT Nº WO 91/16432; Patente de Estados Unidos Nº 5.380.831; Patente de Estados Unidos Nº 5.436.391; Perlack y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324-3328; y Murray y col., 1989, Nucleic Acids Res. 17: 477-498.

Como se usa en el presente documento, “frecuencia de uso codónico preferido” se refiere a la preferencia mostrada por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Para determinar la frecuencia de uso de un codón particular en un gen, se divide el número de apariciones de ese codón en el gen por el número total de apariciones de todos los codones que especifican el mismo aminoácido en el gen. De forma similar, la frecuencia de uso codónico preferido mostrada por una célula huésped puede calcularse promediando la frecuencia de uso codónico preferido en un gran número de genes expresados por la célula huésped. Es preferible que este análisis se limite a genes que se expresan en gran medida por la célula huésped. El porcentaje de desviación de la frecuencia de uso codónico preferido para un gen sintético del empleado por una célula huésped se calcula en primer lugar determinando el porcentaje de desviación de la frecuencia de uso de un único codón desde la célula huésped seguido de obtener la desviación media de todos los codones. Como se define en el presente documento, este cálculo incluye codones únicos (es decir, ATG y TGG). En términos generales, la desviación media global del uso codónico de un gen optimizado del de una célula huésped se calcula usando la ecuación 1A = n 1 Z Xn –Yn Xn por 100 Z, en la que Xn = frecuencia de uso para el codón n en la célula huésped; Yn = frecuencia de uso para el codón n en el gen sintético; n representa un codón individual que especifica un aminoácido; y el número total de codones es Z. La desviación global de la frecuencia de uso codónico, A, para todos los aminoácidos debería ser preferentemente menor de aproximadamente 25 %, y más preferentemente menor de aproximadamente el 10 %.

Por lo tanto, un ácido nucleico de ACCDP puede optimizarse de modo que su frecuencia de distribución de uso codónico se desvíe, preferentemente, no más del 25 % de la de genes vegetales altamente expresados y, más preferentemente, no más de aproximadamente el 10 %. Además, se tiene en consideración el porcentaje de contenido de G+C de la tercera base degradada (parece que las monocotiledóneas favorecen G+C en esta posición, mientras que las dicotiledóneas no). También se reconoce que el nucleótido XCG (en el que X es A, T, C o G) es el codón menos preferido en dicotiledóneas mientras que el codón XTA se evita tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas. Los ácidos nucleicos de ACCDP optimizados de la presente divulgación también tienen preferentemente índices de evitación de doblete CG y TA que se aproximan mucho a los de la planta huésped seleccionada (por ejemplo, Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, etc.). Más preferentemente estos índices se desvían del huésped en no más de aproximadamente 10-15 %.

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican los ACCDP descritos anteriormente, otro aspecto de la divulgación se refiere a moléculas de ácido nucleico aislado que son antisentido de las mismas. Se cree que los polinucleótidos antisentido inhiben la expresión génica de un polinucleótido diana uniéndose específicamente con el polinucleótido diana e interfiriendo con la transcripción, corte y empalme, transporte, traducción y/o estabilidad del polinucleótido diana. Se describen procedimientos en la técnica anterior para dirigir el polinucleótido antisentido al ADN cromosómico, a un transcrito de ARN primario o a un ARNm procesado. Preferentemente, las regiones diana incluyen sitios de corte y empalme, codones de inicio de la traducción, codones de terminación de la traducción, y otras secuencias dentro de la fase abierta de lectura.

El término “antisentido”, para los fines de la divulgación, se refiere a un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que es suficientemente complementario de todo o una parte del gen, transcrito primario, o ARNm procesado, para interferir con la expresión del gen endógeno. Los polinucleótidos “complementarios” son los que son capaces de formar pares de bases de acuerdo con las reglas de complementariedad de Watson-Crick convencionales. Específicamente, las purinas formarán pares de bases con pirimidinas para formar una combinación de guanina emparejada con citosina (G:C) y adenina emparejada con timina (A:T) en el caso del ADN, o adenina emparejada con uracilo (A:U) en el caso de ARN. Se entiende que dos polinucleótidos pueden hibridar entre sí incluso si no son completamente complementarios entre sí, siempre que cada uno tenga al menos una región que sea sustancialmente complementaria del otro. La expresión “ácido nucleico antisentido” incluye ARN monocatenario así como casetes de expresión de ADN bicatenario que pueden transcribirse para producir un ARN antisentido. Los ácidos nucleicos antisentido “activos” son moléculas de ARN antisentido que son capaces de hibridar selectivamente con un transcrito primario o ARNm que codifica un polipéptido que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con el polipéptido de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2.

El ácido nucleico antisentido puede ser complementario de una cadena codificante de ACCDP completa, o de solamente una parte de la misma. En una variación de la divulgación, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido de una “región codificante” de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica un ACCDP. La expresión “región codificante” se refiere a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen a restos de aminoácidos. En otra variación de la divulgación, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido de una “región no codificante” de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica un ACCDP. La expresión “región no codificante” se refiere a secuencias 5’ y 3’ que flanquean la región codificante que no se traducen a aminoácidos (es decir, también denominadas regiones no traducidas 5’ y 3’). La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria de la región codificante completa de ARNm de ACCDP, pero más preferentemente es un oligonucleótido que es antisentido solamente de una parte de la región codificante o no codificante de ARNm de ACCDP. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario de la región que rodea el sitio de inicio de la traducción de ARNm de ACCDP. Un oligonucleótido antisentido puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos de longitud. Típicamente, las moléculas antisentido de la presente divulgación comprenden un ARN que tiene 60-100 % de identidad de secuencia con al menos 14 nucleótidos consecutivos de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2 o un polinucleótido que codifica un polipéptido de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2. Preferentemente, la identidad de secuencia será al menos 70 %, más preferentemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 % y más preferentemente 99 %.

Un ácido nucleico antisentido de la divulgación puede construirse usando reacciones de síntesis química y ligamiento enzimático usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados de formas diversas diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física de la doble cadena formada entre los ácidos nucleicos antisentido y con sentido, por ejemplo, pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5’-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5metiluracilo, metiléster de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N2-carboxipropil) uracilo, (acp3) w y 2,6-diaminopurina. Como alternativa, el ácido nucleico antisentido puede producirse de forma biológica usando un vector de expresión en el que se ha subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito de ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido para un ácido nucleico de interés, descrito adicionalmente en la siguiente subsección).

En otra variación más de la divulgación, la molécula de ácido nucleico antisentido de la divulgación es una molécula de ácido nucleico !-anomérica. Una molécula de ácido nucleico !-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario en el que, a diferencia de las unidades # habituales, las cadenas se sitúan paralelas entre sí (Gaultier y col., 1987, Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2’-O-metilrribonucleótido (Inoue y col., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue y col., 1987, FEBS Lett. 215: 327-330).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la divulgación se administran típicamente a una célula o se generan in situ de modo que hibriden con o se unan a ARNm celular y/o ADN genómico que codifica un ACCDP para inhibir de este modo la expresión del polipéptido, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser por complementariedad de nucleótidos convencional para formar una doble cadena estable o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se une a dobles cadenas de ADN, mediante interacciones específicas en el surco principal de la doble hélice. La molécula antisentido puede modificarse de modo que se una específicamente a un receptor o un antígeno expresado en una superficie celular seleccionada, por ejemplo, ligando la molécula de ácido nucleico antisentido con un péptido o un anticuerpo que se une a un receptor de superficie celular o antígeno. La molécula de ácido nucleico antisentido puede suministrarse también a células usando los vectores descritos en el presente documento. Para conseguir suficientes concentraciones intracelulares de las moléculas antisentido, se prefieren construcciones de vector en las que la molécula de ácido nucleico antisentido se sitúa bajo el control de un promotor procariota, viral o eucariota (incluyendo vegetal) fuerte.

Como alternativa a polinucleótidos antisentido, pueden usarse ribozimas, polinucleótidos con sentido o ARN bicatenario (ARNbc) para reducir la expresión de un polipéptido de ACCDP. Como se usa en el presente documento, el término “ribozima” se refiere a una enzima basada en ARN catalítico con actividad ribonucleasa que es capaz de escindir un ácido nucleico monocatenario, tal como un ARNm, con el que tiene una región complementaria. Pueden usarse ribozimas (por ejemplo, ribozimas de cabeza de martillo descritas en Haselhoff y Gerlach, 1988, Nature 334: 585-591) para escindir catalíticamente transcritos de ARNm de ACCDP para inhibir de este modo la traducción de ARNm de ACCDP. Una ribozima que tenga especificidad por un ácido nucleico que codifica ACCDP puede

diseñarse basándose en la secuencia de nucleótidos de un ADNc de ACCDP, como se desvela en el presente documento (es decir, cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2) o basándose en una secuencia heteróloga para aislar de acuerdo con procedimientos enseñados en la presente divulgación. Por ejemplo, puede construirse un derivado de un ARN de L-19 IVS de Tetrahymena en el que la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria de la secuencia de nucleótidos para escindir en un ARNm que codifica ACCDP. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 4.987.071 y 5.116.742 de Cech y col. Como alternativa, puede usarse ARNm de ACCDP para seleccionar un ARN catalítico que tenga una actividad ribonucleasa específica de un grupo de moléculas de ARN. Véase, por ejemplo, Bartel, D. y Szostak, J.W., 1993, Science 261: 1411-1418. En una variación preferida de las divulgaciones, la ribozima contendrá una parte que tiene al menos 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 nucleótidos, y más preferentemente 7 u 8 nucleótidos, que tienen 100 % de complementariedad con una parte del ARN diana. Los expertos en la materia conocen procedimientos para preparar ribozimas. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 6.025.167; 5.773.260; y 5.496.698.

El término “ARNbc”, como se usa en el presente documento, se refiere a híbridos de ARN que comprenden dos cadenas de ARN. Los ARNbc pueden ser de estructura lineal o circular. En una variación preferida de la divulgación, el ARNbc es específico de un polinucleótido que codifica el polipéptido de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2 o un polipéptido que tenga al menos 80 % de identidad de secuencia con un polipéptido de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2. Los ARN que hibridan pueden ser sustancial o completamente complementarios. Por “sustancialmente complementarios”, se entiende que cuando los dos ARN que hibridan se alinean de forma óptima usando el programa BLAST como se ha descrito anteriormente, las partes que hibridan son al menos 95 % complementarias. Preferentemente, el ARNbc será de al menos 100 pares de bases de longitud. Típicamente, los ARN que hibridan serán de identidad longitud sin extremos salientes 5’ o 3’ y sin huecos. Sin embargo, pueden usarse ARNbc que tengan salientes 5’ o 3’ de hasta 100 nucleótidos en los procedimientos de la divulgación.

El ARNbc puede comprender ribonucleótidos, análogos de ribonucleótidos tales como restos de 2’-O-metil ribosilo, o combinaciones de los mismos. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 4.130.641 y 4.024.222. Se describe un ARNbc ácido polirriboinosínico: ácido polirribocitidílico en la Patente de Estados Unidos 4.283.393. Se conocen en la técnica procedimientos para preparar y usar ARNbc. Un procedimiento comprende la transcripción simultánea de dos cadenas de ADN complementarias, in vivo, o en una única mezcla de reacción in vitro. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.795.715. En una variación de la divulgación, puede introducirse ARNbc en una planta o célula vegetal directamente por procedimientos de transformación convencionales. Como alternativa, puede expresarse ARNbc en una célula vegetal transcribiendo dos ARN complementarios.

Otros procedimientos para la inhibición de expresión génica endógena, tales como formación de triple hélice (Moser y col., 1987, Science 238: 645-650 y Cooney y col., 1988, Science 241:456-459) y co-supresión (Napoli y col., 1990, The Plant Cell 2: 279-289) se conocen en la técnica. Se han usado ADNc parciales y de longitud completa para la co-supresión de genes vegetales endógenos. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 4.801.340, 5.034.323, 5.231.020 y 5.283.184; Van der Kroll y col., 1990, The Plant Cell 2: 291-299; Smith y col., 1990, Mol. Gen. Genetics 224: 477-481; y Napoli y col., 1990, The Plant Cell 2: 279-289.

Para la supresión con sentido, se cree que la introducción de un polinucleótido con sentido bloquea la transcripción del gen diana correspondiente. El polinucleótido con sentido tendrá al menos 65 % de identidad de secuencia con el gen o ARN vegetal diana. Preferentemente, el porcentaje de identidad es al menos 80 %, 90 %, 95 % o más. El polinucleótido con sentido introducido no necesita ser de longitud completa en relación con el gen o transcrito diana. Preferentemente, el polinucleótido con sentido tendrá al menos 65 % de identidad de secuencia con al menos 100 nucleótidos consecutivos de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2. Las regiones de identidad pueden comprender intrones y/o exones y regiones no traducidas. El polinucleótido con sentido introducido puede estar presente en la célula vegetal de forma transitoria o puede estar integrado de forma estable en un cromosoma vegetal o replicón extracromosómico.

Como alternativa, la expresión génica de ACCDP puede inhibirse dirigiendo secuencias de nucleótidos complementarias de la región reguladora de una secuencia de nucleótidos de ACCDP (por ejemplo, un promotor y/o potenciador de ACCDP) para formar estructuras helicoidales triples que eviten la transcripción de un gen de ACCDP en células diana. Véase en general, Helene, C., 1991, Anticancer Drug Des. 6 (6): 569-84; Helene, C. y col., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36; y Maher, L.J., 1992, Bioassays 14 (12): 807-15.

Además de los ácidos nucleicos y polipéptidos de ACCDP descritos anteriormente, la presente divulgación abarca estos ácidos nucleicos y polipéptidos unidos a un resto. Estos restos incluyen, pero sin limitación, restos de detección, restos de hibridación, restos de purificación, restos de suministro, restos de reacción, restos de unión y similares. Un grupo típico de ácidos nucleicos que tienen restos unidos son las sondas y los cebadores. Las sondas y cebadores típicamente comprenden un oligonucleótido sustancialmente aislado. El oligonucleótido típicamente comprende una región de secuencia de nucleótidos que hibriden en condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 12, preferentemente aproximadamente 25, más preferentemente aproximadamente 40, 50 o 75 nucleótidos consecutivos de una cadena con sentido de la secuencia expuesta en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2; una secuencia antisentido de la secuencia expuesta en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2; o mutantes de origen natural de las mismas. Pueden usarse cebadores basados en una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2 en reacciones de PCR para clonar homólogos de ACCDP. Pueden usarse sondas basadas en las secuencias de nucleótidos de ACCDP para detectar transcritos o secuencias genómicas que las codifican o polipéptidos sustancialmente idénticos. En una variación

5 preferida de las divulgaciones, la sonda comprende además un grupo marcador unido a la misma, por ejemplo, el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor enzimático. Dichas sondas pueden usarse como parte de un kit de ensayo de marcador genómico para identificar células que expresan un ACCDP, tal como midiendo un nivel de un ácido nucleico que codifica ACCDP, en una muestra de células, por ejemplo, detectando de niveles de ARNm de ACCDP o determinando si un gen de ACCDP genómico se ha mutado o suprimido.

En particular, un procedimiento útil para determinar el nivel de transcripción del gen (un indicador de la cantidad de ARNm disponible para traducción al producto génico) es realizar una transferencia de Northern (para referencia, véase, por ejemplo, Ausubel y col., 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: Nueva York). La información de una transferencia de Northen demuestra al menos parcialmente el grado de transcripción del gen transformado.

15 Puede prepararse ARN celular total a partir de células, tejidos u órganos por varios procedimientos, todos bien conocidos en la técnica, tales como el descrito en Bormann, E.R. y col., 1992, Mol. Microbiol. 6: 317-326. Para evaluar la presencia o cantidad relativa de polipéptido traducido a partir de este ARNm, pueden emplearse técnicas convencionales, tales como una transferencia de Western. Estas técnicas se conocen bien por los expertos habituales en este campo. (Véase, por ejemplo, Ausubel y col., 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: Nueva York).

La divulgación proporciona además un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico de ACCDP, en el que la expresión del vector en una célula huésped da como resultado aumento del crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a la tensión ambiental en comparación con una variedad natural de la célula huésped. Como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico 25 capaz de transformar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicar de forma autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) se integran en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped, y de este modo se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes con los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento “vectores de expresión”. En general, los vectores de expresión útiles en técnicas de ADN recombinante están con frecuencia en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, “plásmido” y “vector”

35 se pueden usar de forma intercambiable ya que el plásmido es la forma de vector usada más habitualmente. Sin embargo, se pretende que la divulgación incluya otras formas de vectores de expresión tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos para replicación, adenovirus y virus adenoasociados) que cumplen funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinante de la divulgación comprenden un ácido nucleico de la divulgación en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células huésped para usar para expresión, que están unidas operativamente a la secuencia de ácido nucleico para expresar. Como se usa en el presente documento con respecto a un vector de expresión recombinante, se pretende que “unido operativamente” signifique que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a la secuencia o las 45 secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduzca en la célula huésped). Se pretende que la expresión “secuencia reguladora” incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) y Gruber y Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, eds. Glick y Thompson, Capítulo 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida, incluyendo las referencias en las mismas. Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y las que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solamente en ciertas células huésped o en ciertas condiciones. Se apreciará por los expertos en la materia que el diseño del vector de

55 expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped para transformar, el nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Los vectores de expresión de la divulgación pueden introducirse en células huésped para producir de este modo polipéptidos o péptidos, incluyendo polipéptidos o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describen en el presente documento (por ejemplo, ACCDP, formas mutantes de ACCDP, polipéptidos de fusión, etc.).

Los vectores de expresión recombinantes de la divulgación pueden diseñarse para expresión de ACCDP en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, pueden expresarse genes de ACCDP en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura y otras fúngicas (Véase Romanos, M.A. y col., 1992, Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8: 423-488; van den Hondel,

C.A.M.J.J. y col., 1991, Heterologous gene expression in filamentous fungi, en: More Gene Manipulations in Fungi,

J.W.: Bennet & L.L. Lasure, eds., páginas 396-428: Academic Press: San Diego; y van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J., 1991, Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. y col., eds., páginas. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore y col., 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239-251), ciliados de los tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella y Stylonychia, especialmente del género Stylonychia lemnae con vectores siguiendo un procedimiento de transformación como se describe en la Solicitud de PCT Nº WO 98/01572, y células vegetales multicelulares (Véase Schmidt, R. y Willmitzer, L., 1988, High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, capítulo 6/7, S. 71-119 (1993); F.F. White,

B.: Jenes y col., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung y R. Wu, 128-43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42: 205-225 y referencias citadas en las mismas) o células de mamífero. Se analizan células huésped adecuadas adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990). Como alternativa, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras promotoras T7 y T7 polimerasa.

La expresión de polipéptidos en procariotas se lleva a cabo más frecuentemente con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de polipéptidos de fusión o no de fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a un polipéptido codificado en los mismos, habitualmente al extremo amino terminal del polipéptido recombinante pero también al extremo C terminal o fusionado dentro de regiones adecuadas en los polipéptidos. Dichos vectores de fusión típicamente cumplen tres fines: 1) aumentar la expresión de un polipéptido recombinante; 2) aumentar la solubilidad de un polipéptido recombinante; y 3) ayudar a la purificación de un polipéptido recombinante actuando como un ligando en purificación de afinidad. Con frecuencia, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en el punto de unión del resto de fusión y el polipéptido recombinante para permitir la separación del polipéptido recombinante del resto de fusión posterior a la purificación del polipéptido de fusión. Dichas enzimas, y sus secuencias de reconocimiento afines, incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa.

Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. y Johnson, K.S., 1988, Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutatión S-transferasa (GST), polipéptido de unión a maltosa E o polipéptido A, respectivamente, con el polipéptido recombinante diana. En una variación de la divulgación, la secuencia codificante del ACCDP se clona en un vector de expresión pGEX para crear un vector que codifica un polipéptido de fusión que comprende, del extremo N al C, GST-sitio de escisión de trombina-polipéptido X. El polipéptido de fusión puede purificarse por cromatografía de afinidad usando resina de glutatión-agarosa. Puede recuperarse ACCDP recombinante no fusionado con GST mediante escisión del polipéptido de fusión con trombina.

Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli no de fusión inducibles adecuados incluyen pTrc (Amann y col., 1988, Gene 69: 301-315) y pET 11d (Studier y col., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). La expresión génica diana del vector pTrc se basa en la transcripción por ARN polimerasa del huésped de un promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión de gen diana del vector pET 11d se basa en la transcripción de un promotor de fusión T7 gn10-lac mediado por una ARN polimerasa viral co-expresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral se proporciona por las cepas huésped BL21(DE3) o HMS174(DE3) de un profago residente que alberga un gen T7 gn1 bajo el control transcripcional del promotor lacUV

5.

Una estrategia para maximizar la expresión del polipéptido recombinante es expresar el polipéptido en una bacteria huésped con una capacidad alterada para escindir proteolíticamente el polipéptido recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia del ácido nucleico para insertar en un vector de expresión de modo que los codones individuales para cada aminoácido sean los utilizados preferentemente en la bacteria elegida para expresión, tal como C. glutamicum (Wada y col., 1992, Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). Dicha alteración de secuencias de ácido nucleico de la divulgación puede llevarse a cabo por técnicas de síntesis de ADN convencionales.

En otra variación de la divulgación, el vector de expresión de ACCDP es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari, y col., 1987, EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982, Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz y col., 1987, Gene 54: 113-123) y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Los vectores y procedimientos para construcción de vectores apropiados para su uso en otros hongos, tales como los hongos filamentosos, incluyen los detallados en: C.A.M.J.J. y Punt, P.J., 1991, “Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi”, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, y col., eds., páginas 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.

En la presente divulgación, los ACCDP pueden expresarse en plantas y células vegetales tales como células de plantas unicelulares (por ejemplo algas) (Véase Falciatore y col., 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239-251 y referencias en la misma) y células vegetales de plantas superiores (por ejemplo, los espermatofitos, tales como plantas de cultivo). Puede “introducirse” un ACCDP en una célula vegetal por cualquier medio, incluyendo transfección, transformación o transducción, electroporación, bombardeo de partículas, agroinfección y similares. Un procedimiento de transformación conocido por los expertos en la materia es la inmersión de una planta en floración

5 en una solución de Agrobacterium, en la que la Agrobacterium contiene el ácido nucleico de ACCDP, seguido de cultivo de los gametos transformados.

Otros procedimientos adecuados para transformar o transfectar células huésped incluyendo células vegetales pueden encontrarse en Sambrook, y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. última ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio 10 tales como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland y Davey, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Ya que el aumento del crecimiento y aumento de la tolerancia a la tensión biótica y abiótica son rasgos generales que se desea que se hereden en una amplia diversidad de plantas como maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, sorgo, mijo, caña de azúcar, soja, cacahuete, algodón, colza y canola, Manihot, pimiento, girasol y Tagetes, plantas solanáceas como patata, tabaco, berenjena y tomate, especies de

15 Vicia, guisante, alfalfa, plantas arbustivas (café, cacao, té), especies de Salix, árboles (palma aceitera, coco), hierbas perennes y cultivos de forraje, estas plantas de cultivo también son plantas diana preferidas para una modificación por ingeniería genética como una realización más de la presente invención. Los cultivos de forraje incluyen, pero sin limitación, Hierba de Trigo, Phalaris, Bromo, Leimus, Poa, Dactylis, Alfalfa, Salfoin, Notus, Trébol Negro, Trébol Rojo y Meliloto.

20 En una realización de la presente invención, la transfección de un ACCDP en una planta de cultivo se consigue mediante transferencia génica mediada por Agrobacterium. Puede realizarse transformación de plantas mediada por Agrobacterium usando por ejemplo la cepa GV3101 (pMP90) (Koncz y Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396)

o LBA4404 (Clontech) de Agrobacterium tumefaciens. La transformación puede realizarse mediante técnicas de transformación y regeneración convencionales (Deblaere y col., 1994, Nucl. Acids. Res. 13: 4777-4788; Gelvin, 25 Stanton B. y Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2ª Ed.-Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995.-en Secc., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por ejemplo, la colza puede transformarse mediante transformación de cotiledones o hipocótilo (Moloney y col., 1989, Plant Cell Report 8: 238-242; De Block y col., 1989, Plant Physiol. 91: 694-701). El uso de antibióticos para 30 Agrobacterium y selección de plantas dependen del vector binario y la cepa de Agrobacterium usados para transformación. Normalmente se realiza selección de colza usando kanamicina como el marcador de plantas seleccionable. Puede realizarse transferencia génica mediada por Agrobacterium a lino usando, por ejemplo, una técnica descrita por Mlynarova y col., 1994, Plant Cell Report 13: 282-285. Adicionalmente, puede realizarse transformación de soja usando por ejemplo una técnica descrita en la Patente Europea Nº 0424 047, Patente de 35 Estados Unidos Nº 5.322.783, Patente Europea Nº 0397 687, Patente de Estados Unidos Nº 5.376.543 o Patente de Estados Unidos Nº 5.169.770. Puede conseguirse transformación de maíz por bombardeo de partículas, captación de ADN mediada por polietilenglicol o mediante la técnica de fibra de carburo de silicio. (Véase, por ejemplo, Freeling y Walbot “The maize handbook” Springer Verlag: Nueva York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Se encuentra un ejemplo específico de transformación de maíz en la Patente de Estados Unidos Nº 5.990.387 y puede encontrarse

40 un ejemplo específico de transformación de trigo en la Solicitud de PCT Nº WO 93/07256.

De acuerdo con la presente invención, el ACCDP introducido puede mantenerse en la célula vegetal de forma estable si se incorpora en un replicón autónomo no cromosómico o se integra en los cromosomas vegetales. Como alternativa, el ACCDP introducido puede estar presente en un vector no replicante extracromosómico y puede expresarse de forma transitoria o estar activo de forma transitoria.

45 En una variación de la divulgación, puede crearse un microorganismo recombinante homólogo en el que el ACCDP está integrado en un cromosoma, se prepara un vector que contiene al menos una parte de un gen de ACCDP en el que se ha introducido una deleción, adición o sustitución para de este modo alterar, por ejemplo, interrumpir funcionalmente, el gen de ACCDP. Preferentemente, el gen de ACCDP es cualquiera de los genes de ACCDP proporcionados en la Tabla 1 y la Tabla 2, pero puede ser un homólogo de una planta o levadura relacionada, o

50 incluso de una fuente de mamífero o insecto. En una variación de la divulgación, el vector se diseña de modo que, tras la recombinación homóloga, el gen de ACCDP endógeno se interrumpe funcionalmente (es decir, ya no codifica un polipéptido funcional; también denominado un vector de supresión). Como alternativa, el vector puede diseñarse de modo que, tras la recombinación homóloga, el gen de ACCDP endógeno se muta o altera de otro modo pero codifica aún un polipéptido funcional (por ejemplo, la región reguladora cadena arriba puede alterarse para alterar de

55 este modo la expresión del ACCDP endógeno). Para crear una mutación puntual mediante recombinación homóloga, pueden usarse híbridos de ADN-ARN en una técnica conocida quimeraplastia (Cole-Strauss y col., 1999, Nucleic Acids Research 27 (5): 1323-1330 y Kmiec, 1999, Gene Therapy American Scientist 87 (3): 240-247). Se conocen bien en la técnica procedimientos de recombinación homóloga en Arabidopsis thaliana, por ejemplo, y se contemplan para su uso en el presente documento.

60 Mientras que en el vector de recombinación homóloga, la parte alterada del gen de ACCDP está flanqueada en sus extremos 5’ y 3’ por una molécula de ácido nucleico adicional del gen de ACCDP para posibilitar que se produzca recombinación homóloga entre el gen de ACCDP exógeno portado por el vector y un gen de ACCDP endógeno, en un microorganismo o planta. La molécula de ácido nucleico de ACCDP flanqueante adicional es de suficiente longitud para recombinación homóloga exitosa con el gen endógeno. Típicamente, se incluyen en el vector desde varios cientos de pares de bases hasta kilobases de ADN flanqueante (en los extremos tanto 5’ como 3’) (Véase por ejemplo, Thomas, K.R., y Capecchi, M.R., 1987, Cell 51: 503 para una descripción de vectores de recombinación

5 homóloga). El vector se introduce en un microorganismo o célula vegetal (por ejemplo, mediante ADN mediado por polietilenglicol) y se seleccionan usando técnicas conocidas en este campo células en las que el gen de ACCDP introducido se ha recombinado de forma homóloga con el gen de ACCDP endógeno.

En otra variación de la divulgación, pueden producirse microorganismos recombinantes que contienen sistemas seleccionados que permiten la expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión de un gen de

10 ACCDP en un vector colocándolo bajo el control del operón lac permite la expresión del gen de ACCDP solamente en presencia de IPTG. Dichos sistemas reguladores se conocen bien en la técnica.

Bien si está presente en un vector no replicante extra-cromosómico o un vector que está integrado en un cromosoma, el polinucleótido ACCDP reside preferentemente en un casete de expresión vegetal. Un casete de expresión vegetal contiene preferentemente secuencias reguladoras capaces de dirigir la expresión génica en 15 células vegetales que están unidas operativamente de modo que cada secuencia puede cumplir su función, por ejemplo, terminación de la transcripción por señales de poliadenilación. Son señales de poliadenilación preferidas las que se originan de ADN-t de Agrobacterium tumefaciens tales como el gen 3 conocido como octopina sintasa del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen y col., 1984, EMBO J. 3: 835) o equivalentes funcionales del mismo, pero también son adecuados todos los otros terminadores funcionalmente activos en plantas. Como la expresión génica en plantas 20 con mucha frecuencia no está limitada en los niveles de la transcripción, un casete de expresión vegetal preferentemente contiene otras secuencias unidas operativamente como potenciadores de la traducción tales como la secuencia overdrive que contiene la secuencia líder no traducida 5’ del virus del mosaico del tabaco que potencia la relación de polipéptido por ARN (Gallie y col., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-8711). Los ejemplos de vectores de expresión vegetales incluyen los detallados en: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. y Masterson, R., 1992,

25 New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; y Bevan, M.W., 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

La expresión génica de plantas debería estar unida operativamente a un promotor apropiado que confiere expresión

30 génica de una manera oportuna, específica de célula o específica de tejido. Los promotores útiles en los casetes de expresión empleados en los procedimientos, plantas de cultivo y semillas de la invención incluyen cualquier promotor que sea capaz de iniciar la transcripción en una célula vegetal. Dichos promotores incluyen, pero sin limitación, los que pueden obtenerse de plantas, virus vegetales y bacterias que contienen genes que se expresan en plantas, tales como Agrobacterium y Rhizobium.

35 El promotor puede ser constitutivo, inducible, con preferencia de estadio del desarrollo, preferencia de tipo celular, preferencia de tejido o preferencia de órgano. Los promotores constitutivos están activos en la mayoría de las condiciones. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen los promotores 19S y 35S de CaMV (Odell y col., 1985, Nature 313: 810-812), el promotor 35S de sX CaMV (Kay y col., 1987, Science 236: 1299-1302) el promotor Sep1, el promotor de actina de arroz (McElroy y col., 1990, Plant Cell 2: 163-171), el promotor de actina de

40 Arabidopsis, el promotor de ubiquitina (Christensen y col., 1989, Plant Molec. Biol. 18: 675-689), pEmu (Last y col., 1991, Theor. Appl. Genet. 81: 581-588), el promotor 35S de virus del mosaico de Scrophularia, el promotor Smas (Velten y col., 1984, EMBO J 3: 2723-2730), el superpromotor (Patente de Estados Unidos Nº 5.955.646), el promotor GRP1-8, el promotor de cinamil alcohol deshidrogenasa (Patente de Estados Unidos Nº 5.683.439), promotores del ADN-T de Agrobacterium, tales como el promotor de manopina sintasa, nopalina sintasa y octopina

45 sintasa, la subunidad pequeña de ribulosa bifosfato carboxilasa (ssuRUBISCO), y similares.

Los promotores inducibles están preferentemente activos en ciertas condiciones ambientales, tales como la presencia o ausencia de un nutriente o metabolito, calor o frío, luz, ataque por patógenos, condiciones anaerobias y similares. Por ejemplo, el promotor hsp80 de Brassica se induce por choque término; el promotor PPDK se induce por luz; el promotor PR-1 del tabaco, Arabidopsis, y maíz es inducible por infección con un patógeno; y el promotor 50 Adh1 se induce por hipoxia y tensión de frío. La expresión génica vegetal también puede facilitarse mediante un promotor inducible (Para una revisión, véase Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89-108). Los promotores inducibles químicamente son especialmente adecuados si se quiere que la expresión génica se produzca de una manera específica de tiempo. Son ejemplos de dichos promotores un promotor inducible por ácido salicílico (Solicitud de PCT Nº WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz y col., 1992, Plant J. 2:

55 397-404), y un promotor inducible por etanol (Solicitud de PCT Nº WO 93/21334).

En una realización preferida de la presente invención, el promotor inducible es un promotor inducible por tensión. Para los fines de la invención, los promotores inducibles por tensión están preferentemente activos en una o más de las siguientes tensiones: condiciones subóptimas asociadas con tensiones por salinidad, sequía, temperatura, metales, químicos, patógenos y oxidativos. Los promotores inducibles por tensión incluyen, pero sin limitación, 60 Cor78 (Chak y col., 2000, Planta 210: 875-883; Hovath y col., 1993, Plant Physiol. 103: 1047-1053), Cor15a (Artus y col., 1996, PNAS 93 (23): 13404-09), Rci2A (Medina y col., 2001, Plant Physiol. 125: 1655-66; Nylander y col., 2001,

Plant Mol. Biol. 45: 341-52; Navarre y Goffeau, 2000, EMBO J. 19: 2515-24; Capel y col., 1997, Plant Physiol. 115: 569-76), Rd22 (Xiong y col., 2001, Plant Cell 13: 2063-83; Abe y col., 1997, Plant Cell 9: 1859-68; Iwasaki y col., 1995, Mol. Gen. Genet. 247: 391-8), cDet6 (Lang y Palve, 1992, Plant Mol. Biol. 20: 951-62), ADH1 (Hoeren y col., 1998, Genetics 149: 479-90), KAT1 (Nakamura y col., 1995, Plant Physiol. 109: 371-4), KST1 (Müller-Röber y col., 1995, EMBO 14: 2409-16), Rha1 (Terryn y col., 1993, Plant Cell 5: 1761-9; Terryn y col., 1992, FEBS Lett. 299 (3): 287-90), ARSK1 (Atkinson y col., 1997, Nº de Referencia de GenBank L22302 y Solicitud de PCT Nº WO 97/20057), PtxA (Plesch y col., Nº de Referencia de GenBank X67427), SbHRGP3 (Ahn y col., 1996, Plant Cell 8: 1477-90), GH3 (Liu y col., 1994, Plant Cell 6: 645-57), el promotor del gen PRP1 inducible por patógeno (Ward y col., 1993, Plant. Mol. Biol. 22: 361-366), el promotor de hsp80 inducible por calor del tomate (Patente de Estados Unidos Nº 5187267), promotor de alfa-amilasa inducible por frío de la patata (Solicitud de PCT Nº WO 96/12814), o el promotor pinII inducible por herida (Patente Europea Nº 375091). Para otros ejemplos de promotores inducibles por sequía, frío y salinidad, tales como el promotor RD29A, véase Yamaguchi-Shinozalei y col., 1993, Mol. Gen. Genet. 236: 331-340.

Los promotores con preferencia del estadio del desarrollo se expresan preferentemente en ciertos estadios del desarrollo. Los promotores con preferencia de tejido y órgano incluyen los que se expresan preferentemente en ciertos tejidos u órganos, tales como hojas, raíces, semillas o xilema. Los ejemplos de promotores con preferencia de tejido y preferencia de órgano incluyen, pero sin limitación, con preferencia de fruto, preferencia de óvulo, preferencia de tejido masculino, preferencia de semilla, preferencia de integumento, preferencia de tubérculo, preferencia de tallo, preferencia de pericarpio y preferencia de hoja, preferencia de estigma, preferencia de polen, preferencia de antera, preferencia de pétalo, preferencia de sépalo, preferencia de pedicelo, preferencia de silicua, preferencia de tronco, preferencia de raíz, preferencia y similares. Los promotores con preferencia de semillas se expresan preferentemente durante el desarrollo y/o germinación de la semilla. Por ejemplo, los promotores con preferencia de semilla pueden tener preferencia de embrión, preferencia de endospermo y preferencia de tegumento. Véase, Thompson y col., 1989, BioEssays 10: 108. Los ejemplos de promotores con preferencia de semilla incluyen, pero sin limitación, celulosa sintasa (celA), Cim1, gamma-zeína, globulina 1, zeína de 19 kD de maíz (cZ19B1) y similares.

Otros promotores adecuados con preferencia de tejido o preferencia de órgano incluyen el promotor del gen de napina de colza (Patente de Estados Unidos Nº 5.608.152), el promotor de USP de Vicia faba (Baeumlein y col., 1991, Mol. Gen. Genet. 225 (3): 459-67), el promotor de oleosina de Arabidopsis (Solicitud de PCT Nº WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (Patente de Estados Unidos Nº 5.504.200), el promotor de Bce4 Brassica (Solicitud de PCT Nº WO 91/13980), o el promotor de legumina B4 (LeB4; Baeumlein y col., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9), así como promotores que confieren expresión específica de semilla en plantas monocotiledóneas como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Son promotores adecuados importantes el promotor del gen lpt2 o lpt1 de la cebada (Solicitud de PCT Nº WO 95/15389 y Solicitud de PCT Nº 95/23230) o los descritos en la Solicitud de PCT Nº WO 99/16890 (promotores del gen de hordeína de cebada, gen de glutelina de arroz, gen de orizina de arroz, gen de prolamina de arroz, gen de gliadina de trigo, gen de glutelina de trigo, gen de glutelina de avena, gen de kasirina de sorgo y gen de secalina de centeno).

Otros promotores útiles en los casetes de expresión empleados en los procedimientos, plantas de cultivo o semillas de la invención incluyen, pero sin limitación, el promotor de proteína de unión a/b de clorofila mayor, promotores de histonas, el promotor de Ap3, el promotor de #-conglicina, el promotor de napina, el promotor de lecitina de soja, el promotor de zeína de 15 kD de maíz, el promotor de zeína de 22 kD, el promotor de zeína de 27 kD, el promotor de zeína g, los promotores Waxy, shrunken 1, shrunken 2 y bronze, el promotor Zm13 (Patente de Estados Unidos Nº 5.086.169), los promotores de poligalacturonasa de maíz (PG) (Patentes de Estados Unidos Nº 5.412.085 y 5.545.546) y el promotor de SGB6 (Patente de Estados Unidos Nº 5.470.359), así como promotores sintéticos u otros naturales.

Puede obtenerse flexibilidad adicional en el control de la expresión génica heteróloga en plantas usando dominios de unión de ADN y elementos de respuesta de fuentes heterólogas (es decir, dominios de unión de ADN de fuentes no vegetales). Un ejemplo de dicho dominio de unión a ADN heterólogo es el dominio de unión a ADN LexA (Brent y Ptashne, 1985, Cell 43: 729-736).

La divulgación proporciona además un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de ACCDP de la divulgación clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de ADN está unida operativamente a una secuencia reguladora de una manera que permite la expresión (mediante transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido de un ARNm de ACCDP. Pueden seleccionarse secuencias reguladoras unidas operativamente a una molécula de ácido nucleico clonada en la orientación antisentido que dirigen la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una diversidad de tipo celulares. Por ejemplo, pueden seleccionarse promotores y/o potenciadores virales, o secuencias reguladoras que dirigen la expresión constitutiva directa, específica de tejido o específica de tipo celular de ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado en el que se producen ácidos nucleicos antisentido bajo el control de una región reguladora de alta eficacia. La actividad de la región reguladora puede determinarse por el tipo celular en el que se introduce el vector. Para un análisis de la regulación de la expresión génica usando genes antisentido, véase Weintraub, H. y col., 1986, Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews -Trends in Genetics, Vol. 1(1), y Mol y col., 1990, FEBS Letters

268:427-430.

Otro aspecto de la divulgación se refiere a células huésped en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la divulgación. Las expresiones “célula huésped” y “célula huésped recombinante” se usan de forma intercambiable en el presente documento. Se entiende que dichas expresiones se refieren no solamente a la célula objeto particular sino que también se aplican a la descendencia o descendencia potencial de dicha célula. Debido a que pueden realizarse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a la mutación o las influencias ambientales, dicha descendencia puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero estar incluida aún dentro del alcance de la expresión como se usa en el presente documento. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, un ACCDP puede expresarse en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insecto, células fúngicas o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS), algas, ciliados, células vegetales, hongos u otros microorganismos como C. glutamicum. Se conocen por los expertos en la materia otras células huésped adecuadas.

Una célula huésped de la divulgación, tal como una célula huésped procariota o eucariota en cultivo, puede usarse para producir (es decir, expresar) un ACCDP. En consecuencia, la divulgación proporciona además procedimientos para producir ACCDP que usan las células huésped de la divulgación. En una variación de la divulgación, el procedimiento comprende cultivar la célula huésped de la divulgación (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un ACCDP o en cuyo genoma se ha introducido un gen que codifica un ACCDP natural o alterado) en un medio adecuado hasta que se produce el ACCDP. En otra variación de la divulgación, el procedimiento comprende además aislar ACCDP del medio o la célula huésped.

Otro aspecto de la divulgación se refiere a ACCDP aislados y partes biológicamente activas de los mismos. Un polipéptido “aislado” o “purificado” o parte biológicamente activa del mismo está sin parte del material celular cuando se produce por técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La frase “sustancialmente sin material celular” incluye preparaciones de ACCDP en las que el polipéptido está separado de parte de los componentes celulares de las células en las que se produce de forma natural o recombinante. En una variación de la divulgación, la frase “sustancialmente sin material celular” incluye preparaciones de un ACCDP que tiene menos de aproximadamente el 30 % (en peso seco) de material no ACCDP (también denominado en el presente documento “polipéptido contaminante”), más preferentemente menos de aproximadamente el 20 % de material no ACCDP, aún más preferentemente menos de aproximadamente el 10 % de material no ACCDP, y más preferentemente menos de aproximadamente el 5 % de material no ACCDP.

Las moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, homólogos de polipéptidos, polipéptidos de fusión, cebadores, vectores y células huésped descritos en el presente documento pueden usarse en uno o más de los siguientes procedimientos: identificación de cualquiera de los organismos proporcionados en la Columna Nº 2 de la Tabla 1 y la Tabla 2 y organismos relacionados; mapeo de organismos relacionados con cualquiera de los organismos proporcionados en la Columna Nº 2 de la Tabla 1 y la Tabla 2; identificación y localización de las secuencias de interés de cualquiera de los organismos proporcionados en la Columna Nº 2 de la Tabla 1 y la Tabla 2; estudios evolutivos; determinación de regiones de ACCDP requeridas para la función; modulación de una actividad de ACCDP; modulación del metabolismo de una o más funciones celulares; modulación del transporte transmembrana de uno o más compuestos; modulación de la resistencia a tensión; y modulación de la expresión de ácidos nucleicos de ACCDP. En una realización de estos procedimientos, el ACCDP puede convertir ACC en !-ketobutirato y amoníaco.

Las moléculas de ácido nucleico de ACCDP de acuerdo con la divulgación tienen una diversidad de usos. Lo que es más importante, las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos usadas en la presente invención pueden usarse para transformar plantas, particularmente plantas de cultivo, induciendo de este modo tolerancia a tensiones tales como sequía, alta salinidad y frío. La presente invención proporciona por lo tanto una planta de cultivo transgénico transformada por un ácido nucleico de ACCDP, en la que la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta da como resultado aumento del crecimiento de la raíz y/o tolerancia a la tensión ambiental en comparación con una variedad natural de la planta. La planta de cultivo transgénico puede ser una monocotiledónea o una dicotiledónea. La invención proporciona además que la planta pueda seleccionarse de maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, sorgo, mijo, caña de azúcar, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, Manihot, pimiento, girasol, Tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, especies de Salix, palma aceitera, coco, hierba perenne y cultivos de forraje, por ejemplo.

En particular, la presente invención describe el uso de la expresión de ácidos nucleicos que codifican ACCDP para modificar por ingeniería genética plantas con crecimiento de la raíz aumentado, rendimiento aumentado y/o que son tolerantes a la sequía, tolerantes a salinidad y/o tolerantes al frío. Esta estrategia se ha demostrado en el presente documento usando AtACCD (SEC ID Nº: 1) en Arabidopsis thaliana y maíz, pero su aplicación no se restringe a este gen o a estas plantas. En consecuencia, la invención proporciona una planta de cultivo transgénico que contiene un ACCDP como se define en SEC ID Nº: 2 o un homólogo del mismo como se define en el presente documento, en el que la planta tiene crecimiento de la raíz aumentado, rendimiento aumentado y/o tolerancia aumentada a una tensión ambiental seleccionada de una o más del grupo que consiste en sequía, salinidad aumentada o temperatura aumentada o reducida. En realizaciones preferidas, la tensión ambiental es sequía. En otras realizaciones preferidas, el crecimiento de la raíz aumentado es un aumento de la longitud de la raíz, preferentemente en

condiciones limitantes de agua.

La divulgación también proporciona un procedimiento para producir una planta de cultivo transgénico que contiene un ácido nucleico que codifica ACCDP, en el que la expresión del ácido o los ácidos nucleicos en la planta da como resultado aumento del crecimiento de la raíz, aumento del rendimiento y/o aumento de la tolerancia a la tensión 5 ambiental en comparación con una variedad natural de la planta que comprende: a) introducir en una célula vegetal un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de ACCDP y b) generar a partir de la célula vegetal una planta transgénica con un aumento del crecimiento de la raíz, aumento del rendimiento y/o aumento de la tolerancia a la tensión ambiental en comparación con una variedad natural de la planta. La célula vegetal incluye, pero sin limitación, un protoplasto, célula productora de gametos y una célula que regenera una planta completa. Como se 10 usa en el presente documento, el término “transgénico” se refiere a cualquier planta, célula vegetal, callo, tejido vegetal o parte de planta que contiene todo o parte de al menos un polinucleótido recombinante. En muchos casos, todo o parte del polinucleótido recombinante está integrado de forma estable en un cromosoma o elemento extracromosómico estable, de modo que se pasa a generaciones sucesivas. En una variación preferida, el ácido nucleico de ACCDP codifica una proteína que comprende el polipéptido de cualquiera de las SEC ID Nº

15 proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla 2.

La presente invención también proporciona un procedimiento para modular el crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a la tensión ambiental de una planta que comprende modificar la expresión de un ácido nucleico que codifica ACCDP en la planta en el que el crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a la tensión ambiental de la planta aumentan aumentando la expresión de un ACCDP como se ha descrito anteriormente en el presente 20 documento. La expresión de un ACCDP puede modificarse por cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia. La planta de cultivo puede transformarse con un vector que contenga cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican ACCDP descritos anteriormente. La invención posibilita que dicho promotor pueda tener preferencia de tejido, estar regulado por el desarrollo, ser inducible por tensión, o una combinación de los mismos. La expresión de ACCDP como se define en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 4 de la Tabla 1 y la Tabla

25 2 en plantas diana puede conseguirse, pero sin limitación, por uno de los siguientes ejemplos: (a) promotor constitutivo, (b) promotor inducible por tensión, (c) promotor inducido por producto químico y (d) sobreexpresión de promotor modificado por ingeniería genética con, por ejemplo, factores de transcripción derivados de dedos de cinc (Greisman y Pabo, 1997, Science 275: 657).

La transcripción del ACCDP puede modularse usando patrones de transcripción derivados de dedos de cinc (ZFP)

30 como se describe en Greisman y Pabo, 1997, Science 275: 657 y fabricados por Sangamo Biosciences, Inc. Estos ZFP comprenden tanto un dominio de reconocimiento de ADN como un dominio funcional que provoca activación o represión de un ácido nucleico diana tal como un ácido nucleico de ACCDP. Por lo tanto, pueden crearse ZFP activadores y represores que reconocen específicamente los promotores de ACCDP descritos anteriormente y usarse para aumentar o reducir la expresión de ACCDP en una planta, modulando de este modo el rendimiento y/o

35 la tolerancia a la tensión de la planta. La presente divulgación también incluye identificación de los homólogos de ácidos nucleicos que codifican ACCDP como se define en cualquiera de las SEC ID Nº proporcionadas en la Columna Nº 3 de la Tabla 1 y la Tabla 2 en una planta diana, así como el promotor del homólogo. La divulgación también proporciona un procedimiento para aumentar la expresión de un gen de interés dentro de una célula huésped en comparación con una variedad natural de la célula huésped, en el que el gen de interés se transcribe en

40 respuesta a un ACCDP, que comprende: (a) transformar la célula huésped con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica ACCDP y (b) expresar el ACCDP dentro de la célula huésped, aumentando de este modo la expresión del gen transcrito en respuesta al ACCDP, en comparación una variedad natural de la célula huésped.

Además de introducir las secuencias de ácido nucleico de ACCDP en plantas transgénicas, estas secuencias

45 también pueden usarse para identificarse que un organismo es cualquiera de los organismos proporcionadas en la Columna Nº 2 de la Tabla 1 y la Tabla 2, o un pariente cercano de los mismos. Además, pueden usarse para identificar la presencia de cualquiera de los organismos proporcionados en la Columna Nº 2 de la Tabla 1 y la Tabla 2, o un pariente de los mismos en una población mixta de organismos. La divulgación se refiere a las secuencias de ácido nucleico de varios genes de cualquiera de los organismos proporcionados en la Columna Nº 2 de la Tabla 1 y

50 la Tabla 2; explorando el ADN genómico extraído de un cultivo de una población única o mixta de organismos en condiciones rigurosas con una sonda que abarca una región de un gen particular que es único para el organismo correspondiente de acuerdo con la Tabla 1 y la Tabla 2, se puede determinar si este organismo está presente.

Además, las moléculas de ácido nucleico y polipéptidos de acuerdo con la divulgación pueden actuar como marcadores para las regiones específicas del genoma. Esto tiene utilidad no solamente en el mapeado del genoma, 55 sino también en estudios funcionales de los polipéptidos codificados por dicho genoma. Por ejemplo, para identificar la región del genoma a la que se une un polipéptido de unión a ADN de un organismo particular, el genoma del organismo podría digerirse, y los fragmentos incubarse con el polipéptido de unión a ADN. Los fragmentos que se unan al polipéptido pueden explorarse adicionalmente con las moléculas de ácido nucleico de la divulgación, preferentemente con marcadores fácilmente detectables. La unión de dicha molécula de ácido nucleico con el 60 fragmento del genoma permite la localización del fragmento en el mapa genómico de dicho organismo y, cuando se realice múltiples veces con diferentes enzimas, facilita una determinación rápida de la secuencia de ácido nucleico a la que se une el polipéptido. Además, las moléculas de ácido nucleico de la divulgación pueden ser suficientemente

idénticas a las secuencias de especies relacionadas de modo que estas moléculas de ácido nucleico pueden actuar como marcadores para la construcción de un mapa genómico en plantas relacionadas.

Las moléculas de ácido nucleico de ACCDP de la divulgación también son útiles para estudios estructurales polipeptídicos y evolutivos. Los procesos de conversión de aminoácidos en los que participan las moléculas de la divulgación se utilizan por una amplia diversidad de células procariotas y eucariotas; comparando las secuencias de las moléculas de ácido nucleico de la presente divulgación con las que codifican enzimas similares de los organismos, puede evaluarse la relación evolutiva de los organismos. De forma similar, dicha comparación permite una evaluación de qué regiones de la secuencia se conservan y cuáles no, que puede ayudar a determinar las regiones del polipéptido que son esenciales para el funcionamiento de la enzima. Este tipo de determinación es valiosa para estudios de ingeniería de polipéptidos y puede proporcionar un indicio de lo que el polipéptido puede tolerar con respecto a mutagénesis sin perder función.

La manipulación de las moléculas de ácido nucleico de ACCDP de la divulgación puede dar como resultado la producción de ACCDP que tienen diferencias funcionales de los ACCDP naturales. Estos polipéptidos pueden mejorarse en eficacia o actividad, pueden estar presentes en mayores números en la célula de lo que es habitual, o pueden reducirse en eficacia o actividad.

Hay varios mecanismos por los que la alteración de un ACCDP útil en los procedimientos, plantas de cultivo o semillas de la invención puede afectar directamente al crecimiento de la raíz, rendimiento y/o respuesta a la tensión y/o tolerancia a la tensión. En el caso de plantas que expresan ACCDP, la enzima podría actuar para estimular la elongación de la raíz secuestrando e hidrolizando ACC de semillas en germinación, reduciendo de este modo el nivel de ACC y en consecuencia reduciendo el nivel de etileno en las semillas. Para muchas plantas, el etileno estimula la germinación. Se ha observado que si la concentración de etileno permanece alta después de la germinación, se inhibe la elongación de las raíces (Jackson (1991), páginas 159-181 en A.K. Matoo y J.C. Suttle (ed.) The Plant Hormone Ethylene, CRC Press, Boca Raton, FL). Por lo tanto, la reducción de las concentraciones de etileno en semillas después de la germinación conduce a un aumento de la longitud de las raíces, y mejora de la eficacia en el uso del agua de las plantas.

El efecto de la modificación genética de las plantas, C. glutamicum, hongos, algas o ciliados en el crecimiento de la raíz y/o de la tolerancia a la tensión puede evaluarse cultivando el microorganismo modificado o la planta en condiciones no idóneas y analizando después las características de crecimiento y/o el metabolismo de la planta. Dichas técnicas de análisis se conocen bien por los expertos en la materia, e incluyen peso seco, peso húmedo, síntesis de polipéptidos, síntesis de carbohidratos, síntesis de lípidos, velocidades de evapotranspiración, rendimiento de planta y/o cultivo general, floración, reproducción, formación de semillas, crecimiento de la raíz, velocidades de respiración, velocidades de fotosíntesis, etc. (Applications of HPLC in Biochemistry en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm y col., 1993 Biotechnology, vol. 3, Capítulo III: Product recovery and purification, páginas 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. y col., 1988, Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. y Cabral, J.M.S., 1992, Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. y Henry, J.D., 1988, Biochemical separations, en: Ulmann’ s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Capítulo 11, páginas 1-27, VCH: Weinheim; y Dechow, F.J., 1989, Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Por ejemplo, los vectores de expresión de levaduras que comprenden los ácidos nucleicos desvelados en el presente documento, o fragmentos de los mismos, pueden construirse y transformarse en Saccharomyces cerevisiae usando protocolos convencionales. Las células transgénicas resultantes pueden ensayarse después con respecto a fallo o alteración de su aumento de crecimiento y/o tolerancia a tensiones de sequía, salinidad y temperatura. De forma similar, pueden construirse vectores de expresión vegetales que comprenden los ácidos nucleicos desvelados en el presente documento, o fragmentos de los mismos, y transformarse en una célula vegetal apropiada tal como Arabidopsis, soja, colza, maíz, trigo, Medicago truncatula, etc. usando protocolos convencionales. Las células transgénicas resultantes y/o plantas derivadas de las mismas pueden ensayarse después con respecto a fallo o alteración de su aumento de crecimiento de la raíz y/o tolerancia a tensiones de sequía, salinidad y temperatura.

Adicionalmente, las secuencias desveladas en el presente documento, o fragmentos de las mismas, pueden usarse para generar mutaciones de supresión en los genomas de diversos organismos, tales como bacterias, células de mamífero, células de levadura y células vegetales (Girke, T., 1998, The Plant Journal 15: 39-48). Las células con supresión resultantes pueden después evaluarse con respecto a su capacidad para tolerar diversas condiciones de tensión, su respuesta a diversas condiciones de tensión y los efectos sobre el fenotipo y/o genotipo de la mutación. Para otros procedimientos de inactivación génica, véase Patente de Estados Unidos Nº 6.004.804 “Non-Chimeric Mutational Vectors” y Puttaraju y col., 1999, Spliceosome -mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy, Nature Biotechnology 17: 246-252.

No se pretende que las estrategias de mutagénesis anteriormente mencionadas para ACCDP que dan como resultado aumento del crecimiento de la raíz, rendimiento y/o tolerancia a la tensión sean limitantes; resultarán fácilmente evidentes para un experto en la materia variaciones sobre estas estrategias. Usando dichas estrategias, e incorporando los mecanismos desvelados en el presente documento, las moléculas de ácidos nucleicos y

polipéptidos de la divulgación pueden utilizarse para generar algas, ciliados, plantas, hongos u otros microorganismos como C. glutamicum que expresan moléculas de ácido nucleico y polipéptidos de ACCDP mutado de modo que se mejoren el crecimiento de la raíz y/o la tolerancia a la tensión.

La presente divulgación también proporciona anticuerpos que se unen específicamente a un ACCDP, o una parte del mismo, como se codifica por un ácido nucleico descrito en el presente documento. Pueden realizarse anticuerpos por muchos procedimientos bien conocidos (Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, “Antibodies; A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1988)). Brevemente, puede inyectarse antígeno purificado en un mamífero en una cantidad y en intervalos suficientes para inducir una respuesta inmunitaria. Los anticuerpos pueden purificarse directamente, o pueden obtenerse células del bazo del animal. Las células pueden fusionarse después con una línea celular inmortal y explorarse con respecto a secreción de anticuerpos. Los anticuerpos pueden usarse para explorar bibliotecas de clones de ácido nucleico con respecto a células que secretan el antígeno. Después pueden secuenciarse los clones positivos. (Véase, por ejemplo, Kelly y col., 1992, Bio/Technology 10: 163-167; Bebbington y col., 1992, Bio/Technology 10: 169-175).

Las expresiones “se une selectivamente” y “se une específicamente” con el polipéptido se refieren a una reacción de unión que es determinante de la presencia del polipéptido en una población heterogénea de polipéptidos y otros productos biológicos. Por lo tanto, en condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos específicos unidos a un polipéptido particular no se unen en una cantidad significativa con otros polipéptidos presentes en la muestra. La unión selectiva de un anticuerpo en dichas condiciones puede requerir un anticuerpo que se selecciona con respecto a su especificidad por un polipéptido particular. Puede usarse una diversidad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos que se unen selectivamente con un polipéptido particular. Por ejemplo, se usan de forma rutinaria inmunoensayos de ELISA de fase sólida para seleccionar anticuerpos selectivamente inmunorreactivos con un polipéptido. Véase Harlow y Lane, “Antibodies, A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, (1988), para una descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones que podrían usarse para determinar la unión selectiva.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales de diversos huéspedes. Puede encontrarse una descripción de técnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales en Stites y col., eds., “Basic and Clinical Immunology,” (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., Cuarta Edición) y referencias citadas en la misma, y en Harlow y Lane, “A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, 1988.

En la presente solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones. Las divulgaciones de todas estas publicaciones y las referencias citadas dentro de esas publicaciones en sus totalidades son útiles para describir más completamente el estado de la técnica a la que concierne la presente invención.

La invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse de ningún modo como limitantes del alcance de la misma.

Ejemplos

Ejemplo 1

Aislamiento de ADN total de material vegetal

Los detalles para el aislamiento de ADN total se refieren al desarrollo de un gramo de peso en freso del material vegetal. Los materiales usados incluyen los siguientes tampones: tampón de CTAB: bromuro de N-cetil-N,N,Ntrimetilamonio (CTAB) 2 % (p/v); Tris HCl 100 mM pH 8,0; NaCl 1,4 M; EDTA 20 mM; tampón de N-Laurilsarcosina: N-laurilsarcosina 10 % (p/v); Tris HCl 100 mM pH 8,0; y EDTA 20 mM.

El material vegetal se trituró en nitrógeno líquido en un mortero para proporcionar un polvo fino y se transfirió a recipientes de Eppendorf de 2 ml. El material vegetal congelado se cubrió después con una capa de 1 ml de tampón de descomposición (1 ml de tampón de CTAB; 100 ∀l de tampón de N-laurilsarcosina, 20 ∀l de #-mercaptoetanol y 10 ∀l de solución de proteinasa K, 10 mg/ml) y se incubó a 60 ºC durante una hora con agitación continua. El homogeneizado obtenido se distribuyó en dos recipientes Eppendorf (2 ml) y se extrajo dos veces agitando con el mismo volumen de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Para separación de fases, se llevó a cabo centrifugación a 8000 x g y temperatura ambiente durante 15 minutos en cada caso. El ADN se precipitó después a -70 ºC durante 30 minutos usando isopropanol helado. El ADN precipitado se sedimentó a 4 ºC y 10.000 g durante 30 minutos y se resuspendió en 180 ∀l de tampón TE (Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969309-6). Para purificación adicional, el ADN se trató con NaCl (concentración final 1,2 M) y se precipitó de nuevo a 70 ºC durante 30 minutos usando dos veces el volumen de etanol absoluto. Después de una etapa de lavado con etanol a 70 %, el ADN se secó y se captó posteriormente en 50 ∀l de H2O + RNAsa (concentración final de 50 mg/ml). El ADN se disolvió durante una noche a 4 ºC, y la digestión con RNAsa se llevó a cabo posteriormente a 37 ºC durante 1 hora. El almacenamiento del ADN tuvo lugar a 4 ºC.

Ejemplo 2

Preparación de ARN total y ADNc de material vegetal de Arabidopsis

Se aisló AtACCD preparando ARN de hojas de Arabidopsis usando el minikit de aislamiento de ARN (kit Qiagen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se realizaron reacciones de transcripción inversa y amplificación del ADNc como se describe a continuación.

1. Usar 2 ·l de preparación de ARN (0,5 – 2,0 ·g) en una reacción de Dnasa de 10 ·l, mover el tubo a 37 ºC durante 5 15 minutos, añadir 1 ·l de EDTA 25 mM, y después calentar la reacción a 65 ºC durante 15 minutos.

a.: Tampón (10X: Tris 200 mM, KCl 500 mM, MgCl2 20 mM) – 1 ·l

b.: ARN –2·l

c.: Dnasa (10 U/·l)-1 ·l

d.: H2O – 6 ·l

: 10 2. Usar 1 ·l de la reacción anterior en una reacción a temperatura ambiente, y calentar a 65 ºC durante 5 minutos.

a.: ARN cortado con Dnasa (0,025-0,1 ·g dependiendo de la cantidad de partida)-1 ·l

b.: dNTP 10 mM –1·l

c.: Cebador (10 ·M)-1 ·l

d.: H2O – hasta 10 ·l

: 15 3. Preparar una mezcla de reacción con restos reactivos en un tubo separado

a.: Tampón SuperScript II RT (10X)-2 ·l

b.: MgCl225 mM – 4·l

c.: DTT (0,1 M) –2·l

d.: Inhibidor de Rnasa Rnase Out (40 U/·l)-1 ·l

: 20 4. Añadir la mezcla de reacción de 9 ·l a la solución de ARN desnaturalizada y mantener a 42 ºC durante 2 minutos.

5. Añadir 1 ·l de SuperScript II RT (50 U/·l) e incubar a 42 ºC durante 50 minutos.

5. Terminar la reacción a 70 ºC durante 15 minutos.

7.: Opcional: añadir 1 ·l de RNasaH a la reacción para retirar el ARN.

8.: Realizar PCR como se haría usando 1-2 ·l del nuevo ADNc.

25 Recogida de tejido, aislamiento ARN y construcción de biblioteca de ADNc

Se cultivaron plantas de cultivo en una diversidad de condiciones y tratamientos, y se recogieron diferentes tejidos en diversos estadios del desarrollo. El cultivo de la planta y la recogida se realizó de una manera estratégica de modo que la probabilidad de recoger todos los genes expresables en al menos una o más de las bibliotecas resultantes se maximiza. El ARNm se aisló como se ha descrito anteriormente de cada una de las muestras

30 recogidas y se construyeron bibliotecas de ADNc. No se usaron etapas de amplificación en el procedimiento de producción de biblioteca para minimizar la redundancia de los genes dentro de la muestra y conservar información de expresión. Todas las bibliotecas se generaron 3’ del ARNm purificado en columnas de oligo dT. Se seleccionaron aleatoriamente colonias de la transformación de la biblioteca de ADNc en E. coli y se colocaron en placas de microtitulación.

35 Amplificación por PCR de insertos de ADNc y aplicación puntual

Los insertos de ADNc de cada clon de las placas de microtitulación se amplificaron por PCR. Se aisló ADN plasmídico de las colonias de E. coli y después se aplicaron puntualmente las membranas. No fue necesaria etapa de purificación antes de aplicar puntualmente muestras a membranas de nailon.

Ejemplo 3

40 Clonación de AtACCD

El ADNc aislado como se ha descrito en el Ejemplo 2 se usó para clonar el gen de AtACCD por RT-PCR. Se usaron los siguientes cebadores: El cebador directo fue 5’ -5’ GGGGTCGACGAAGCAATGAGAGGACGAAGCT -3’ (SEC ID Nº: 358). El cebador inverso fue 5’ -GGGTTAATTAACAGATTTTGTTGTGCTAGAAC -3’ (SEC ID Nº: 359). Las reacciones de PCR para la amplificación incluyeron: tampón de PCR 1x, dNTP 0,2 mM, 100 ng de ADN de

45 Arabidopsis thaliana, 25 pmol de cebador inverso, 2,5 u de ADN polimerasa Pfu o Herculasa.

Se realizó PCR de acuerdo con condiciones convencionales y los protocolos del fabricante (Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, termociclador Biometra T3). Los parámetros para la reacción fueron: 1 ciclo de 3 minutos a 94 ºC; seguido de 25 ciclos de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 55 ºC y 1,5 minutos a 72 ºC.

50 Los fragmentos amplificados se extrajeron después del gel de agarosa con un Kit de Extracción en Gel QIAquick (Qiagen) y se ligaron en el vector TOPO pCR 2.1 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se transformaron vectores recombinantes en células Top10 (Invitrogen) usando condiciones convencionales (Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring

Harbor, NY). Se seleccionaron células transformadas en agar LB que contenía carbenicilina 100 ∀g/ml, 0,8 mg de Xgal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-#-D-galactósido) y 0,8 mg de IPTG (isopropiltio-#-D-galactósido) cultivadas durante una noche a 37 ºC. Se seleccionaron colonias blancas y se usaron para inocular 3 ml de LB líquido que contenía ampicilina 100 ∀g/ml y se cultivaron durante una noche a 37 ºC. Se extrajo el ADN plasmídico usando el Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realizaron análisis de clones posteriores y mapeo de restricción de acuerdo con técnicas de biología molecular convencionales (Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Los clones se secuenciaron, lo que confirmó que la identidad del gen clonado era idéntica a la secuencia depositada en la base de datos de Arabidopsis thaliana (SEC ID Nº: 1). La secuencia de aminoácidos deducida de AtACCD se muestra en la SEC ID Nº: 2.

El gen de AtACCD se clonó después en un vector binario y se expresó bajo el Superpromotor (Figura 3). El Superpromotor es constitutivo, pero preferente en raíces (Patentes de Estados Unidos Nº 5.428.147 y 5.217.903).

Ejemplo 4

Transformación de plantas de Arabidopsis

Se generaron plantas de Arabidopsis thaliana transgénica (Col) por el procedimiento de infiltración por inmersión (Bechtold y col., Sci. Paris Life Sci. 316: 1194-1199). Los vectores binarios se transformaron en cepa de Agrobacterium C58C1 o pMP90 usando electroporación. Se dejó crecer un cultivo de las Agrobacterium transformadas, y las bacterias se resuspendieron en medio de infiltración por inmersión (MS 1/2, sacarosa 5 %, MES 0,5 mg/ml, pH 5,7 y con 200 ppm de Silwet L-77 (Semillas de Lehle) añadidas). Cada cultivo se usó para transformar 3 macetas de plantas Arabidopsis Col0 de aproximadamente 5 semanas de edad sumergiendo las macetas 5 minutos cada una en cultivos de Agrobacterium resuspendidos. Las plantas se cultivaron después para siembra en condiciones de Arabidopsis convencionales (23 ºC día/20 ºC noche, 18 horas días y 65 % de humedad). Se exploraron las semillas T1 en placas de MS usando Pursuit 100 nM (BASF).

Exploración de plantas transformadas

Las semillas T1 se esterilizaron de acuerdo con protocolos convencionales (Xiong y col., 1999, Plant Molecular Biology Reporter 17: 159-170). Las semillas se seleccionaron en medio Murashige ½ y Skoog (MS) (Sigma-Aldrich), agar 0,6 % y complementado con sacarosa 1 % y benomilo 2 ∀g/ml (Sigma-Aldrich). Las semillas en las placas se vernalizaron durante cuatro días a 4 ºC. Las semillas se germinaron en una cámara climática a una temperatura del aire de 22 ºC e intensidad de la luz de 40 micromoles-1m2 (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25) y ciclo de longitud del día de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Las plántulas transformadas se seleccionaron después de 14 días y se transfirieron a medio MS ½ complementado con agar 0,5 %, sacarosa 1 % y se permitió que se recuperaran durante cinco a siete días.

Las semillas de la generación T2 se usaron para análisis de raíces vegetales en suelo e in vitro.

Ejemplo 5

Análisis de raíz in vitro de plantas de Arabidopsis transformadas

Para el análisis de la raíz in vitro de las plantas transformadas, se usaron placas cuadradas que medían 12 cm x 12 cm. Para cada placa, se usaron 52 ml de medio MS (sales de MS 0,5X, sacarosa 0,5 %, tampón MES 0,5 g/l, Phytagar 1 %) sin selección. Se permitió que las placas se secaran en la campana estéril durante una hora para reducir la condensación futura.

Se esterilizaron alícuotas de semillas en frascos de vidrio con etanol durante 5 minutos, se retiró el etanol y se permitió que las semillas se secaran en la campana estéril durante una hora. Las semillas se aplicaron puntualmente en las placas usando el Dispositivo Vacuseed (Lehle). En el diseño experimental, cada placa contenía plantas transgénicas tanto naturales como AtACCD. Por lo tanto, cada línea se comparó siempre con los controles cultivados en la misma o las mismas placas para explicar la variación microambiental. Después de aplicar las semillas puntualmente en las placas, las placas se envolvieron con Ventwrap y se colocaron verticalmente en rejillas en la oscuridad a 4 ºC durante cuatro días para estratificar las semillas. Las placas se transfirieron a una Cámara de Cultivo Percival C5 y se colocaron verticalmente durante 14 días. Las condiciones de la cámara de cultivo fueron de 23 ºC día/21 ºC noche y 16 horas día/8 horas noche.

Para la recogida de datos se usó un explorador de lecho plano de alta resolución. Se realizó análisis de las raíces usando el paquete de software WinRhizo.

Los resultados de estos experimentos también se analizaron al nivel génico. Para hacer esto, se promedió la longitud de la raíz de todas las plantas para todas las líneas transgénicas y se comparó frente a la media de las plantas naturales. La presencia del transgén y el número de copias de los acontecimientos se determinaron dirigiendo el terminador NOS en PCR a tiempo real. Los Cebadores NOS usados para el análisis fueron: cebador

Directo 5’-TCCCCGATCGTTCAAACATT-3’ (SEC ID Nº: 360), cebador Inverso 5’-CCATCTCATAAATAACGTCATGCAT-3’ (SEC ID Nº: 361). Las reacciones se procesaron en una placa óptica de 96 pocillos (Applied Biosystems, 4314320) y las reacciones de control endógeno y gen de interés se procesaron en la misma placa simultáneamente. Se realizó una mezcla maestra para ambos conjuntos de cebadores. Las mezclas maestras y la placa de 96 pocillos para el ensayo deberían mantenerse en hielo. Se incluyen cálculos para 52 reacciones, lo que es adecuado para la mitad de la placa con uso de un pipeteador multicanal. Se usó el kit Eurogentec, (cat Nº RTSNRT032X-1) y las reacciones se prepararon usando las recomendaciones del fabricante. Se usó un GeneAmp 5700 para procesar las reacciones y recoger datos.

Resultados

Los resultados muestran que las plantas de AtACCD transgénicas evaluadas en las placas tienen un fenotipo de raíz más larga. La Figura 4A muestra los resultados de las plantas cultivadas en placas verticales por cada línea. La mayoría de las líneas transgénicas de AtACCD exploradas mostraron un fenotipo de raíz más larga en comparación con raíces de planta de control natural. El fenotipo se observó más claramente en las líneas 2, 3, 5, 6 y 9.

El análisis a nivel génico de las plantas transgénicas para AtACCD, como se ve en la Figura 4B, confirmó que las plantas de AtACCD mostraron un fenotipo de longitud de raíz aumentada. Basándose en este análisis, las plantas de Arabidopsis transgénicas para ACCDP mostraron un aumento del 13,8 % en la longitud de la raíz.

Ejemplo 6

Análisis de raíz en suelo de plantas de Arabidopsis transformadas

Para análisis de raíz en suelo, las semillas se incluyeron a 4 ºC durante 2 días en agua y se plantaron directamente en el suelo sin selección. Se usaron Deepots (Hummert D40) con un sedimento de turba saturado (Jiffy 727) en la base y se llenaron con Metromix saturada de agua. Después de plantar, las macetas se cubrieron con envoltura de plástico para evitar el secado. Las plantas se cultivaron usando solamente agua presente en la preparación del medio, ya que el agua en el suelo de estas macetas grandes es suficiente para 3 semanas de crecimiento, y promueve el crecimiento rápido de la raíz. La envoltura de plástico de las macetas se retiró después de 12 días y se documentaron los datos morfológicos. El día 17 se recogieron las partes aéreas de la planta, se secaron a 65 ºC durante 2 días y se midió el peso seco. Para examinar las raíces, el sedimento de turba se empujó hacia la parte superior de la maceta para retirar el suelo y las raíces como una unidad. Después se separó el suelo de las raíces en una bandeja y se midió la longitud máxima de la raíz.

Para determinar el impacto del fenotipo de la raíz en los tejidos sobre el suelo de las plantas transgénicas, se midió el peso seco de la roseta y se comparó frente a las plantas naturales.

Resultados

También se evaluaron las raíces de las líneas de AtACCD en suelo como se ha descrito anteriormente. Los resultados indicaron que las plantas transgénicas mostraban un fenotipo de raíz más larga cuando las plantas se cultivan en suelo (Figuras 5 y 6). En general, todas las líneas de AtACCD analizadas mostraron aumento del crecimiento en el ensayo basado en el suelo. Las líneas 2, 4, 7, 10 y 11 mostraron el mayor aumento en la longitud de la raíz (Figura 5). La Figura 6 muestra la ANOVA del rendimiento global del gen de AtACCD, que demuestra que las plantas transgénicas para AtACCD rindieron significativamente mejor que los controles naturales.

Se midió el peso seco de la roseta y se muestra el análisis de ANOVA de los resultados en la Figura 7. No se observaron diferencias significativas entre las plantas transgénicas y los controles naturales. Por lo tanto, la biomasa de la roseta no parece estar afectada por la sobreexpresión del gen de AtACCD.

Ejemplo 7

Identificación de homólogos para AtACCD

Los algoritmos usados en la presente invención incluyen: FASTA (Búsquedas de bases de datos de secuencias muy sensibles con estimaciones de la significación estadística: Pearson, 1990, Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA, Methods Enzymol. 183: 63-98); BLAST (Búsquedas de bases de datos de secuencias muy sensibles con estimaciones de significación estadística; Altschul y col., Basic local alignment search tool, Journal of Molecular Biology 215: 403-10); PREDATOR (Predicción de estructura secundaria de alta precisión de secuencias individuales y múltiples; Frishman y Argos, 1997, 75 % accuracy in protein secondary structure prediction. Proteins

27: 329-335); CLUSTALW (Alineamiento de múltiples secuencias; Thompson y col., 1994, CLUSTALW (improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice), Nucleic Acids Research 22: 4673-4680); TMAP (Predicción de región transmembrana de múltiples secuencias alineadas; Persson y Argos, 1994, Prediction of transmembrane segments in proteins utilizing multiple sequence alignments, J. Mol. Biol. 237:182-192); ALOM2 (Predicción de región transmembrana de secuencias individuales; Klein y col., Prediction of protein function from sequence properties: A discriminate analysis of a database. Biochim. Biophys. Acta 787: 221-226 (1984). Versión 2 del Dr. K. Nakai);

PROSEARCH (Detección de patrones de secuencia de proteína PROSITE; Kolakowski y col., 1992, ProSearch: fast searching of protein sequences with regular expression patterns related to protein structure and function. Biotechniques 13, 919-921); BLIMPS (Búsquedas de similitud frente a una base de datos de bloques sin huecos, Wallace y Henikoff, 1992); PATMAT (un programa de búsqueda y extracción para consultas de secuencia, patrón y bloque y bases de datos, CABIOS 8: 249-254. Escrito por Bill Alford).

Se encontraron homólogos del gen de AtACCD en las bases de datos públicas y patentadas. Estos homólogos se evaluaron para determinar el nivel de relación con AtACCD. El programa tblastn de la familia de BLAST de algoritmos se usó para comparar la secuencia proteica de AtACCD frente a las bases de datos de cultivo patentadas traducidas en las seis fases de lectura. Se encontraron secuencias con homología significativa en cada biblioteca de cultivo. El porcentaje de identidad de secuencia en el nivel de aminoácidos de cada secuencia en comparación con AtACCD se muestra en la Columna Nº 5 de la Tabla 1 y la Tabla 2.

Los alineamientos de BLAST a nivel de aminoácidos entre AtACCD (SEC ID Nº: 2) y ACCDP de cultivos tales como soja, arroz, maíz y trigo se muestran en las Figuras 9-12. Se considera que el ACCDP de soja, arroz, maíz y trigo como se muestra en las Figuras 9-12 es de longitud completa. Las secuencias de longitud completa para las secuencias parciales restantes pueden obtenerse usando secuencias de cebadores basadas en las secuencias de ADNc parciales desveladas usando técnicas de biología molecular convencionales (Véase Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Ejemplo 8

Modificación por ingeniería genética de plantas de soja sobreexpresando el gen de ACCDP

Las semillas de soja se esterilizan en superficie con 70 % de etanol durante 4 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, seguido de Clorox 20 % (v/v) complementado con Tween 0,05 % (v/v) durante 20 minutos con agitación continua. Después, las semillas se aclaran 4 veces con agua destilada y se colocan en papel de filtro estéril húmedo en una placa de Petri a temperatura ambiente durante 6 a 39 horas. Los tegumentos se retiran y se separan los cotiledones del eje embrionario. El eje embrionario se examina para asegurar que la región meristémica no esté dañada. Los ejes embrionarios escindidos se recogen en una placa de Petri estéril semiabierta y se secan al aire hasta un contenido de humedad menor del 20 % (peso en fresco) en una placa de Petri sellada hasta su uso posterior.

Se prepara un cultivo de Agrobacterium tumefaciens a partir de una única colona en medio sólido LB más agentes de selección apropiados seguido de cultivo de la colonia individual en medio LB líquido hasta una densidad óptica a 600 nm de 0,8. Después, el cultivo de bacterias se sedimenta a 7000 rpm durante 7 minutos a temperatura ambiente, y se resuspende en medio MS complementado con acetosiringona 100 ∀M. Los cultivos bacterianos se incuban en este medio pre-inducción durante 2 horas a temperatura ambiente antes de su uso. El eje de embriones de siembra zigóticos de soja a contenido de humedad de aproximadamente el 15 % se empapa durante 2 horas a temperatura ambiente con el cultivo de suspensión de Agrobacterium preinducido. Los embriones se retiran del cultivo de empapado y se transfieren a placas de Petri que contienen medio MS sólido complementado con sacarosa al 2 % y se incuban durante 2 días en oscuridad a temperatura ambiente. Como alternativa, los embriones se sitúan sobre papel de filtro estéril húmedo (medio MS líquido) en una placa de Petri y se incuban en las mismas condiciones descritas anteriormente. Después de este periodo, los embriones se transfieren a medio MS sólido o líquido complementado con carbenicilina 500 mg/l o cefotaxima 300 mg/l para destruir las Agrobacterium. El medio líquido se usa para humectar el papel de filtro estéril. Los embriones se incuban durante 4 semanas a 25 ºC, bajo un fotoperiodo de 12 horas y 150 ∀mol m-2s-1. Una vez que las plántulas producen raíces, estas se transfieren a suelo metromix estéril. El medio de las plantas in vitro se retira por lavado antes de transferir las plantas al suelo. Las plantas se mantienen bajo una cobertura de plástico durante 1 semana para favorecer el proceso de aclimatación. Después las plantas se transfieren a una sala de cultivo en la que se incuban a 25 ºC, bajo intensidad de luz de 150 ∀mol m-2s-1 y foto período de 12 horas durante aproximadamente 80 días.

Las plantas transgénicas se exploran con respecto a su mejor crecimiento de la raíz y/o tolerancia a la tensión, demostrando que la expresión del transgén confiere aumento del crecimiento de la raíz, tolerancia a la tensión y/o aumento de la eficacia en el uso del agua.

Ejemplo 9

Modificación por ingeniería genética de plantas de colza/canola sobreexpresando el gen de ACCDP

El procedimiento de transformación de plantas descrito en el presente documento es aplicable a Brassica y otros cultivos. Se esterilizan en superficie semillas de canola con etanol al 70 % durante 4 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, seguido de Clorox 20 % (v/v) complementado con Tween 0,05 % (v/v) durante 20 minutos, a temperatura ambiente con agitación continua. Después, las semillas se aclaran 4 veces con agua destilada y se colocan en papel de filtro estéril húmedo en una placa de Petri a temperatura ambiente durante 18 horas. Después se retiran los tegumentos y las semillas se secan al aire durante una noche en una placa de Petri estéril semiabierta. Durante este periodo, las semillas pierden aproximadamente el 85 % de su contenido de agua.

Las semillas se almacenan después a temperatura ambiente en una placa de Petri sellada hasta su uso posterior. Las construcciones de ADN y empapado de embriones son como se describe en el Ejemplo 10. Se analizan muestras de las plantas transgénicas primarias (TO) por PCR para confirmar la presencia de ADN-T. Estos resultados se confirman por hibridación de Southern en la que el ADN se somete a electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y se transfiere a una membrana de nailon cargada positivamente (Roche Diagnostics). El Kit de Síntesis de Sondas PCR DIG (Roche Diagnostics) se usa para preparar una sonda marcada con digoxigenina por PCR, y se usa como recomienda el fabricante.

Las plantas transgénicas se exploran con respecto a su tolerancia a la tensión y/o crecimiento de la raíz mejorado, que demuestra que la expresión transgénica confiere aumento del crecimiento de la raíz, tolerancia a la tensión y/o aumento en la eficacia del uso del agua.

Ejemplo 10

Modificación por ingeniería genética de plantas de maíz sobreexpresando el gen ACCDP

Se realiza transformación de maíz (Zea Mays L.) con el gen de interés con el procedimiento descrito por Ishida y col., 1996, Nature Biotech. 14745-50. Se co-cultivan embriones inmaduros con Agrobacterium tumefaciens que portan vectores “súper binarios” y se recuperan plantas transgénicas mediante organogénesis. Este procedimiento proporciona una eficacia de transformación de entre el 2,5 % y el 20 %. Las plantas transgénicas se exploran con respecto a su tolerancia a la tensión y/o crecimiento de raíz mejorado, que demuestra que la expresión transgénica confiere aumento del crecimiento de la raíz, tolerancia a la tensión y/o aumento en la eficacia del uso del agua.

Ejemplo 11

Modificación por ingeniería genética de plantas de arroz sobreexpresando el gen de ACCDP

La transformación de arroz con el gen de interés puede emprenderse por técnicas de transferencia génica directa utilizando protoplastos o bombardeo de partículas. La transformación mediada por protoplastos se ha descrito para tipos Japonica y tipos Indica (Zhang y col., 1988, Plant Cell Rep. 7: 379-384; Shimamoto y col., 1989, Nature 338:274-277; Datta y col., 1990, Biotechnology 8:736-740). Ambos tipos también pueden transformarse rutinariamente usando bombardeo de partículas (Christou y col., 1991, Biotechnology 9: 957-962). Las plantas transgénicas se exploran con respecto a su tolerancia a la tensión y/o crecimiento de la raíz mejorado, que demuestra que la expresión transgénica confiere aumento del crecimiento de la raíz, tolerancia a la tensión y/o aumento en la eficacia del uso del agua.

Ejemplo 12

Identificación de genes homólogos y heterólogos

Pueden usarse secuencias génicas para identificar genes homólogos o heterólogos de bibliotecas de ADNc o genómicas. Los genes homólogos (por ejemplo clones de ADNc de longitud completa) pueden aislarse mediante hibridación de ácidos nucleicos usando por ejemplo bibliotecas de ADNc. Dependiendo de la abundancia del gen de interés, se siembran de 100.000 hasta 1.000.000 de bacteriófagos recombinantes y se transfieren a membranas de nailon. Después de desnaturalización con álcali, el ADN se inmoviliza en la membrana mediante, por ejemplo, reticulación de UV. La hibridación se lleva a cabo en condiciones de alta rigurosidad. En solución acuosa, se realiza hibridación y lavado a una fuerza iónica de NaCl 1 M y una temperatura de 68 ºC. Se generan sondas de hibridación mediante, por ejemplo, marcaje de transcripción de muesca radioactivo (32P) (High Prime, Roche, Mannheim, Alemania). Las señales se detectan mediante autorradiografía.

Los genes parcialmente homólogos o heterólogos que están relacionados pero no son idénticos pueden identificarse de una manera análoga al procedimiento anteriormente descrito usando condiciones de lavado e hibridación de baja rigurosidad. Para hibridación acuosa, la fuerza iónica se mantiene normalmente a NaCl 1 M mientras que la temperatura se reduce progresivamente de 68 a 42 ºC.

El aislamiento de las secuencias génicas con homologías (o identidad/similitud de secuencia) solamente en un dominio definido de por ejemplo 10-20 aminoácidos puede llevarse a cabo usando sondas oligonucleotídicas radiomarcadas sintéticas. Los oligonucleótidos radiomarcados se preparan por fosforilación del extremo 5’ de dos oligonucleótidos complementarios con polinucleótido quinasa T4. Los oligonucleótidos complementarios se hibridan y ligan para formar concatémeros. Los concatémeros bicatenarios se radiomarcan después mediante, por ejemplo, transcripción de muesca. La hibridación normalmente se realiza a condiciones de baja rigurosidad usando concentraciones de oligonucleótidos altas.

Solución de hibridación de oligonucleótidos:

SSC 6 x

fosfato sódico 0,01 M

EDTA 1 mM (pH 8)

SDS 0,5 %

ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 ∀g/ml

leche en polvo desgrasada 0,1 %

Durante la hibridación, la temperatura se reduce por etapas a 5-10 ºC por debajo de la Tm del oligonucleótido estimada, o hasta la temperatura ambiente, seguido de etapas de lavado y autorradiografía. Se realiza lavado con baja rigurosidad, tal como 3 etapas de lavado usando SSC 4 x. Se describen detalles adicionales en Sambrook, J. y col., 1989, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press o Ausubel, F.M. y col., 1994, “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons.

Ejemplo 13

Identificación de genes homólogos explorando bibliotecas de expresión con anticuerpos

Pueden usarse clones de ADN-c para producir proteína recombinante por ejemplo en E. coli (por ejemplo sistema Qiagen QIAexpress pQE). Después las proteínas recombinantes se purifican por afinidad de forma normal mediante cromatografía de afinidad de Ni-NTA (Qiagen). Después se usan proteínas recombinantes para producir anticuerpos específicos por ejemplo usando técnicas convencionales para inmunización de conejos. Los anticuerpos se purifican por afinidad usando una columna de Ni-NTA saturada con el antígeno recombinante como se describe en Gu y col., 1994, BioTechniques 17: 257-262. El anticuerpo puede usarse para explorar bibliotecas de ADNc de expresión para identificar genes homólogos o heterólogos mediante una exploración inmunológica (Sambrook, J. y col., 1989, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press o Ausubel, F.M. y col., 1994, “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons).

Ejemplo 14

Mutagénesis in vivo

Puede realizarse mutagénesis in vivo de microorganismos mediante el pase de ADN plasmídico (o de otro vector) a través de E. coli u otros microorganismos (por ejemplo, Bacillus spp. o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae) que estén alterados en sus capacidades para mantener la integridad de su información genética. Las cepas mutantes típicas tienen mutaciones en los genes para el sistema de reparación de ADN (Por ejemplo, mutHLS, mutD, mutT, etc.; para referencia, véase Rupp, W.D., 1996, DNA repair mechanisms, en: Escherichia coli and Salmonella, páginas 2277-2294, ASM: Washington). Dichas cepas se conocen bien por los expertos en la materia. El uso de dichas cepas se ilustra, por ejemplo, en Greener, A. y Callahan, M., 1994, Strategies 7: 32-34. La transferencia de moléculas de ADN mutadas en plantas se realiza preferentemente después de selección y ensayo en microorganismos. Las plantas transgénicas se generan de acuerdo con diversos ejemplos dentro de la ejemplificación del presente documento.

Ejemplo 15

Análisis in vitro de la función de genes de Arabidopsis en organismos transgénicos

La determinación de actividades y parámetros cinéticos de las enzimas está bien establecida en la técnica. Los experimentos para determinar la actividad de cualquier enzima alterada dada deben adaptarse a la actividad específica de la enzima natural, lo que está dentro de la capacidad de un experto en la materia. Pueden encontrarse visiones de conjunto acerca de enzimas en general, así como detalles específicos con respecto a estructura, cinética, principios, procedimientos, aplicaciones y ejemplos para la determinación de muchas actividades enzimáticas, por ejemplo, en las siguientes referencias: Dixon, M., y Webb, E.C., 1979, Enzymes. Longmans: London; Fersht, 1985, Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: Nueva York; Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L., 1982, Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D., ed., 1983, The Enzymes, 3ª ed. Academic Press: Nueva York; Bisswanger, H., 1994, Enzymkinetik, 2ª ed. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Graßl, M., eds., 19831986, Methods of Enzymatic Analysis, 3ª ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; y Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 1987, vol. A9, Enzymes. VCH: Weinheim, páginas 352-363.

La actividad de las proteínas que se unen a ADN puede medirse por varios procedimientos bien establecidos, tales como ensayos de desplazamiento de banda de ADN (también llamados ensayos de retardo de gel). El efecto de dichas proteínas en la expresión de otras moléculas puede medirse usando ensayos de genes indicadores (tales como el descrito en Kolmar, H. y col., 1995, EMBO J. 14: 3895-3904 y referencias citadas en el mismo). Se conocen bien sistemas de ensayo de genes indicadores y están establecidos para aplicaciones en células tanto procariotas como eucariotas, usando enzimas tales como #-galactosidasa, proteína verde fluorescente y varias otras.

La determinación de actividad de proteínas de transporte en membrana puede realizarse de acuerdo con técnicas tales como las descritas en Gennis, R.B., 1989, Pores, Channels and Transporters, en Biomembranes, Molecular Structure and Function, páginas 85-137, 199-234 y 270-322, Springer: Heidelberg.

Ejemplo 16

Purificación del producto deseado a partir de organismos transformados

Puede realizarse recuperación del producto deseado de material vegetal, hongos, algas, ciliados, células de C. glutamicum u otras células bacterianas transformadas con las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento, o el sobrenadante de los cultivos anteriormente descritos por diversos procedimientos bien conocidos en la técnica. Si el producto deseado no se secreta de las células, las células pueden recogerse del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y las células pueden lisarse por técnicas convencionales, tales como fuerza mecánica o sonificación. Los órganos de las plantas pueden separarse mecánicamente de otros tejidos u órganos. Después de homogeneización, se retiran los residuos celulares por centrifugación, y la fracción de sobrenadante que contiene las proteínas solubles se conserva para purificación adicional del compuesto deseado. Si el producto se secreta de células deseadas, después las células se retiran del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y la fracción de sobrenadante se conserva para purificación adicional.

La fracción de sobrenadante de uno de los procedimientos de purificación se somete a cromatografía con una resina adecuada, en la que la molécula deseada se conserva en una resina de cromatografía mientras que muchas de las impurezas en la muestra no, o en la que las impurezas se conservan por la resina mientras que la muestra no. Dichas etapas de cromatografía pueden repetirse como sea necesario, usando la misma o diferentes resinas de cromatografía. Un experto en la materia conocerá bien la selección de resinas de cromatografía apropiadas en su aplicación más eficaz para una molécula particular para purificar. El producto purificado puede concentrarse por filtración o ultrafiltración, y almacenarse a una temperatura a la que la estabilidad del producto se maximiza.

Hay una amplia serie de procedimientos de purificación conocidos en la técnica y el procedimiento de purificación precedente no pretende ser limitante. Dichas técnicas de purificación se describen, por ejemplo, en Bailey, J.E. y Ollis, 1986, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: Nueva York. Adicionalmente, la identidad y pureza de los compuestos aislados pueden evaluarse por técnicas convencionales en este campo. Estas incluyen cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), procedimientos espectroscópicos, procedimientos de tinción, cromatografía en capa fina, NIRS, ensayo enzimático o de forma microbiológica. Dichos procedimientos de análisis se revisan en: Patek y col., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova y col., 1996, Biotekhnologiya 1: 27-32; y Schmidt y col., 1998, Bioprocess Engineer. 19:67-70; Ulmann’ s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 1996, vol. A27, VCH: Weinheim, páginas 89-90, páginas 521-540, páginas 540-547, páginas 559-566, 575-581, y páginas 581-587; Michal, G., 1999, Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley y Sons; Fallon, A. y col., 1987, Applications of HPLC in Biochemistry en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17.

Ejemplo 17

Exploración de tolerancia a la salinidad

Ensayo de salinidad en placa de MS

Las plántulas se transfieren a papel de filtro empapado en MS ½ y se colocan en agar 0,6 % MS ½ complementado con benomilo 2 ∀g/ml la noche antes de la exploración de tensión. Para la exploración de tensión, el papel de filtro con las plántulas se mueve a pilas de papel de filtro estéril, empapadas en NaCl 50 mM, en una placa de petri. Después de dos horas, el papel de filtro con las plántulas se retira a pilas de papel de filtro estéril, empapado con NaCl 200 mM, en una placa de petri. Después de dos horas, el papel de filtro con las plántulas se mueve a pilas de papel de filtro estéril, empapado en NaCl 600 mM, en una placa de petri. Después de 10 horas, las plántulas se mueven a placas de petri que contienen agar 0,6 % MS ½ complementado con benomilo 2 ∀g/ml. Las plántulas se puntúan después de 5 días, demostrando que la expresión transgénica confiere tolerancia a la salinidad.

Ensayo en suelo para tolerancia a la salinidad

Las semillas de plantas para ensayar se esterilizan (lejía 100 %, Triton X 0,1 % durante cinco minutos dos veces y aclaradas cinco veces con ddH2O). Las semillas se siembran en placas con medio no de selección (MS 1/2, phytagar 0,6 %, MES 0,5 g/l, sacarosa 1 %, benamilo 2 ∀g/ml).

Se permite que las semillas germinen durante aproximadamente diez días. En el estadio de 4-5 hojas, las plantas transgénicas se siembran en macetas de 5,5 cm de diámetros llenas de suelo suelto (Metromix 360, Scotts) humectado con fertilizante 20-20-20 1g/l (Peters Professional, Scotts).

Se permite que las plantas crezcan (22 ºC, luz continua) durante aproximadamente siete días, regando según sea necesario. Cuando las plantas están a punto de producir semilla, el agua se retira de la bandeja y se inicia el ensayo. Para comenzar el ensayo, se añaden tres litros de NaCl 100 mM y MS 1/8 a la bandeja bajo las macetas. A la bandeja que contiene las plantas de control se añaden tres litros de MS 1/8. Después de 10 días, se proporciona agua a las plantas tratadas con NaCl y de control. Diez días después, se fotografían las plantas.

Ejemplo 18

Exploración de tolerancia a la sequía

Se transfieren plántulas T1 y T2 a papel de filtro estéril, seco, en una placa de petri y se permite que se desequen durante dos horas a HR (humedad relativa) del 80 % en una Cabina de Cultivo Sanyo MLR-350H, micromoles-1m2 (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25). La HR se reduce después a 60 % y las plántulas se desecan adicionalmente durante ocho horas. Las plántulas se retiran después y se colocan en placas de agar 0,6 % MS ½ complementadas por benomilo 2 ∀g/ml y se puntúan después de cinco días.

Las plantas transgénicas se exploran con respecto a su tolerancia a sequía mejorada que demuestra que la expresión transgénica confiere tolerancia a la sequía.

Ejemplo 19

Exploración de tolerancia a la congelación

Las plántulas se mueven a placas de petri que contienen agar 0,6 % MS ½ complementado con sacarosa 2 % y benomilo 2 ∀g/ml. Después de cuatro días, las plántulas se incuban a +4 ºC durante 1 hora y después se cubren con hielo raspado. Las plántulas se colocan después en una Cámara Ambiental Environmental Specialist ES2000 y se incuban durante 3,5 horas comenzando a -1,0 ºC reduciendo -1 ºC cada hora. Las plántulas se incuban después a 5,0 ºC durante 24 horas y después se permite que se descongelen a +5 ºC durante 12 horas. El agua se retira por vertido y las plántulas se puntúan después de cinco días.

Las plantas transgénicas se exploran con respecto a su tolerancia a frío mejorada que demuestra que la expresión transgénica confiere tolerancia al frío.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> BASF PLant Science GmbH Sarria-Millan, Rodrigo Garr, Eric R Haertel, Jamie Allen, Damian McKersie, Bryan

<120> AUMENTO DEL RENDIMIENTO EN PLANTAS QUE SOBREEXPRESAN LOS GENES DE ACCDP

<130> PF2063015105

<150> US 60/700.096

<151>

<160> 361

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 1246

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (16)..(1221)

<400> 1

<210> 2

<211> 401

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

<210> 3

<211> 284

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 3

5: <210> 4 <211> 1083 <212> ADN <213> Escherichia coli

10: <220> <221> CDS <222> (1) .. (1083)

<400> 4

15 20: "000" <210> 5 <211> 360 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 5 "000"

25: <210> 6 <211> 893 <212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> CDS

<222> (79) .. (702)

<400> 6

<210> 7

<211> 207

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 7

5

<210> 8

<211> 1455

<212> ADN

<213> Zea mays

10

<220>

<221> CDS

<222> (85) .. (1272)

15: <400> 8

<210> 9

<211> 395

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 9

<210> 10

<211> 987 5 <212> ADN

<213> Escherichia coli W3110

<220>

<221> CDS 10 <222> (1) .. (987)

<223> transl_table=11

<400> 10

"000" 5

<210> 11

<211> 328

<212> PRT

<213> Escherichia coli W3110 10

<400> 11 "000"

<210> 12 15 <211> 987

<212> ADN

<213> Pyrococcus horikoshii OT3

<220> 20 <221> CDS

<222> (1) .. (987)

<223> transl_table=11

<400> 12 25 "000"

<210> 13

<211> 328

<212> PRT 30 <213> Pyrococcus horikoshii OT3

<400> 13 "000"

35 <210> 14

<211> 876

<212> ADN

<213> Campylobacter jejuni subsp. jejuni NCTC 11168

40 <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (876)

<223> transl_table=11

45 <400> 14 "000"

<210> 15

<211> 291 50 <212> PRT

<213> Campylobacter jejuni subsp. jejuni NCTC 11168

<400> 15

"000" 55

<210> 16

<211> 1083

<212> ADN

<213> Escherichia coli 0157:H7 EDL933 60

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1083)

<223> transl_ table=11 65

<400> 16 "000"

<210> 17 5 <211> 360

<212> PRT

<213> Escherichia coli 0157:H7 EDL933

<400> 17 10 "000"

<210> 18

<211> 1002

<212> ADN 15 <213> Caulobacter crescentus CB15

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1002) 20 <223> transl_table=11

<400> 18 "000"

25 <210> 19

<211> 333

<212> PRT

<213> Caulobacter crescentus CB15

30 <400> 19 "000"

<210> 20

<211> 987 35 <212> ADN

<213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi cepa CT18

<220>

<221> CDS 40 <222> (1) .. (987)

<223> transl_table=11

<400> 20

"000" 45

<210> 21

<211> 328

<212> PRT

<213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi cepa CT18 50

<400> 21 "000"

<210> 22 55 <211> 987

<212> ADN

<213> Salmonella typhimurium LT2

<220> 60 <221> CDS

<222> (1) .. (987)

<223> transl_ table=11

<400> 22 65 "000"

5: <210> 23 <211> 328 <212> PRT <213> Salmonella typhimurium LT2 <400> 23 "000"

<210> 24 <211> 948 <212> ADN <213> Nostoc sp. PCC 7120

15: <220> <221> CDS <222> (1) .. (948) <223> transl_ table=11

<400> 24 "000"

25: <210> 25 <211> 315 <212> PRT <213> Nostoc sp. PCC 7120

<400> 25 "000"

<210> 26 <211> 1065 <212> ADN <213> Pyrococcus furiosus DSM 3638

35: <220> <221> CDS <222> (1) .. (1065) <223> trans1_table=11

<400> 26 "000"

45: <210> 27 <211> 354 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus DSM 3638

<400> 27 "000"

55: <210> 28 <211> 1020 <212> ADN <213> Yersinia pestis KIM <220> <221> CDS <222> (1) .. (1020) <223> transl_ table=11

<400> 28 "000"

65: <210> 29 <211> 339 <212> PRT

<213> Yersinia pestis KIM

5 10 15: <400> 29 "000" <210> 30 <211> 1083 <212> ADN <213> Shigella flexneri 2a cepa 301 <220> <221> CDS <222> (1) .. (1083) <223> transl_ table=11 <400> 30 "000"

20: <210> 31 <211> 360 <212> PRT <213> Shigella flexneri 2a cepa 301

25: <400> 31 "000"

30: <210> 32 <211> 894 <212> ADN <213> Pseudomonas putida KT2440

35: <220> <221> CDS <222> (1) .. (894) <223> transl_ table=11

<400> 32 "000"

40: <210> 33 <211> 297 <212> PRT <213> Pseudomonas putida KT2440

45: <400> 33 "000"

50: <210> 34 <211> 987 <212> ADN <213> Escherichia coli CFT073

55: <220> <221> CDS <222> (1) .. (987) <223> transl_table=11

60 65: <400> 34 "000" <210> 35 <211> 328 <212> PRT <213> Escherichia coli CFT073

<400> 35 "000"

<210> 36 5 <211> 999

<212> ADN

<213> Pseudomonas syringae pv. tomate cepa DC3000

<220> 10 <221> CDS

<222> (1) .. (999)

<223> transl_ table=11

<400> 36 15 "000"

<210> 37

<211> 332

<212> PRT 20 <213> Pseudomonas syringae pv. tomate cepa DC3000

<400> 37 "000"

25 <210> 38

<211> 981

<212> ADN

<213> Streptomyces avermitilis MA-4680

30 <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (981)

<223> transl_ table=11

35 <400> 38 "000"

<210> 39

<211> 326 40 <212> PRT

<213> Streptomyces avermitilis MA-4680

<400> 39

"000" 45

<210> 40

<211> 936

<212> ADN

<213> Streptomyces avermitilis MA-4680 50

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (936)

<223> transl_ table=11 55

<400> 40 "000"

<210> 41 60 <211> 311

<212> PRT

<213> Streptomyces avermitilis MA-4680

<400> 41 65 "000"

5: <210> 42 <211> 996 <212> ADN <213> Bacillus cereus ATCC 14579 <220> <221> CDS <222> (1) .. (996) <223> transl_ table=11

<400> 42 "000"

15: <210> 43 <211> 331 <212> PRT <213> Bacillus cereus ATCC 14579

<400> 43 "000"

25: <210> 44 <211> 996 <212> ADN <213> Bacillus anthracis cepa Ames

<220> <221> CDS <222> (1) .. (996) <223> transl_ table=11

35: <400> 44 "000" <210> 45 <211> 331 <212> PRT <213> Bacillus anthracis cepa Ames

<400> 45 "000"

45: <210> 46 <211> 1026 <212> ADN <213> Bordetella bronchiseptica RB50

<220> <221> CDS <222> (1) .. (1026) <223> transl_ table=11

55: <400> 46 "000"

<210> 47 <211> 341 <212> PRT <213> Bordetella bronchiseptica RB50

<400> 47 "000"

65: <210> 48 <211> 1224

<212> ADN

<213> Oryza sativa (grupo de cultivar japonica)

<220> 5 <221> CDS

<222> (1) .. (1224)

<400> 48 "000"

<210> 49

<211> 407

<212> PRT

<213> Oryza sativa (grupo de cultivar japonica) 15

<400> 49 "000"

<210> 50

<211> 996

<212> ADN

<213> Bacillus cereus ATCC 10987

<220> 25 <221> CDS

<222> (1) .. (996)

<223> transl_table=11

<400> 50 "000"

<210> 51

<211> 331

<212> PRT 35 <213> Bacillus cereus ATCC 10987

<400> 51 "000"

<210> 52

<211> 1206

<212> ADN

<213> Magnaporthe grisea 70-15

45 <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1206)

<400> 52 "000"

<210> 53

<211> 401

<212> PRT 55 <213> Magnaporthe grisea 70-15

<400> 53 "000"

<210> 54

<211> 984

<212> ADN

<213> Gibberella zeae PH-1

65 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(984)

5 10: <400> 54 "000" <210> 55 <211> 327 <212> PRT <213> Gibberella zeae PH-1 <400> 55 "000"

15: <210> 56 <211> 1158 <212> ADN <213> Oryza sativa (grupo de cultivar japonica)

20: <220> <221> CDS <222> (1) .. (1158)

25 30: <400> 56 "000" <210> 57 <211> 385 <212> PRT <213> Oryza sativa (grupo de cultivar japonica) <400> 57 "000"

35: <210> 58 <211> 1011 <212> ADN <213> Aspergillus nidulans FGSC A4

40: <220> <221> CDS <222> (1) .. (1011)

45 50: <400> 58 "000" <210> 59 <211> 336 <212> PRT <213> Aspergillus nidulans FGSC A4 <400> 59 "000"

55: <210> 60 <211> 1200 <212> ADN <213> Aspergillus fumigatus Af293

60: <220> <221> CDS <222> (1) .. (1200)

65: <400> 60 "000"

5: <210> 61 <211> 399 <212> PRT <213> Aspergillus fumigatus Af293 <400> 61 "000"

10: <210> 62 <211> 1053 <212> ADN <213> Aspergillus fumigatus Af293

15: <220> <221> CDS <222> (1) .. (1053)

20 25: <400> 62 "000" <210> 63 <211> 350 <212> PRT <213> Aspergillus fumigatus Af293 <400> 63 "000"

30: <210> 64 <211> 1248 <212> ADN <213> Strongylocentrotus purpuratus

35: <220> <221> CDS <222> (1) .. (1248)

40 45: <400> 64 "000" <210> 65 <211> 415 <212> PRT <213> Strongylocentrotus purpuratus <400> 65 "000"

50: <210> 66 <211> 1137 <212> ADN <213> Strongylocentrotus purpuratus

55: <220> <221> CDS <222> (1)..(1137)

60 65: <400> 66 "000" <210> 67 <211> 378 <212> PRT <213> Strongylocentrotus purpuratus

<400> 67 "000"

5: <210> 68 <211> 1155 <212> ADN <213> Strongylocentrotus purpuratus

<220> <221> CDS <222> (1) .. (1155)

15: <400> 68 "000" <210> 69 <211> 384 <212> PRT <213> Strongylocentrotus purpuratus

<400> 69 "000"

25: <210> 70 <211> 1155 <212> ADN <213> Strongylocentrotus purpuratus

<220> <221> CDS <222> (1) .. (1155)

35: <400> 70 "000" <210> 71 <211> 384 <212> PRT <213> Strongylocentrotus purpuratus

<400> 71 "000"

45: <210> 72 <211> 1017 <212> ADN <213> Neurospora crassa N150

<220> <221> CDS <222> (1) .. (1017)

55: <400> 72 "000" <210> 73 <211> 338 <212> PRT <213> Neurospora crassa N150

<400> 73 "000"

65: <210> 74 <211> 999 <212> ADN

<213> Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris cepa Hildenborough

<220>

<221> CDS 5 <222> (1) .. (999)

<223> trans1_table=11

<400> 74 "000"

<210> 75

<211> 332

<212> PRT

<213> Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris cepa Hildenborough 15

<400> 75 "000"

<210> 76

<211> 996

<212> ADN

<213> Bacillus thuringiensis serovar konkukian cepa 97-27

<220> 25 <221> CDS

<222> (1) .. (996)

<223> transl_ table=11

<400> 76 "000"

<210> 77

<211> 331

<212> PRT 35 <213> Bacillus thuringiensis serovar konkukian cepa 97-27

<400> 77 "000"

<210> 78

<211> 885

<212> ADN

<213> Acinetobacter sp. ADP1

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (885)

<223> transl_ table=11

<400> 78 "000"

<210> 79 55 <211> 294

<212> PRT

<213> Acinetobacter sp. ADP1

<400> 79 "000"

<210> 80

<211> 1014

<212> ADN 65 <213> Erwinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043 <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1014)

<223> transl_ table=11

<400> 80 "000"

<210> 81

<211> 337

<212> PRT

<213> Erwinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043

<400> 81 "000"

<210> 82

<211> 999

<212> ADN

<213> Desulfotalea psychrophila LSv54

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (999)

<223> transl_table=11

<400> 82 "000"

<210> 83

<211> 332

<212> PRT

<213> Desulfotalea psychrophila LSv54

<400> 83 "000"

<210> 84

<211> 1035

<212> ADN

<213> Desulfotalea psychrophila LSv54

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1035)

<223> transl_ table=11

<400> 84 "000"

<210> 85

<211> 344

<212> PRT

<213> Desulfotalea psychrophila LSv54

<400> 85 "000"

<210> 86

<211> 993

<212> ADN

<213> Yersinia pseudotuberculosis IP 32953

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (993) <223> transl_ table=11

<400> 86 "000"

<210> 87

<211> 330

<212> PRT

<213> Yersinia pseudotuberculosis IP 32953

<400> 87 "000"

<210> 88

<211> 996

<212> ADN

<213> Bacillus cereus E33L

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (996)

<223> transl_ table=11

<400> 88 "000"

<210> 89

<211> 331

<212> PRT

<213> Bacillus cereus E33L

<400> 89 "000"

<210> 90

<211> 1020

<212> ADN

<213> Burkholderia mallei ATCC 23344

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1020)

<223> transl_ table=11

<400> 90 "000"

<210> 91

<211> 339

<212> PRT

<213> Burkholderia mallei ATCC 23344

<400> 91 "000"

<210> 92

<211> 1020

<212> ADN

<213> Burkholderia pseudomallei K96243

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1020)

<223> transl_ table=11

<400> 92 "000"

<210> 93

<211> 339

<212> PRT

<213> Burkholderia pseudomallei K96243

<400> 93 "000"

<210> 94

<211> 987

<212> ADN

<213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A cepa ATCC

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (987)

<223> transl_ table=11

<400> 94 "000"

<210> 95

<211> 328

<212> PRT

<213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A cepa ATCC

<400> 95 "000"

<210> 96

<211> 1020

<212> ADN

<213> Silicibacter pomeroyi DSS-3

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1020)

<223> transl_ table=11

<400> 96 "000"

<210> 97

<211> 339

<212> PRT

<213> Silicibacter pomeroyi DSS-3

<400> 97 "000"

<210> 98

<211> 1158

<212> ADN

<213> Silicibacter pomeroyi DSS-3

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1158)

<223> transl_ table=11

<400> 98 "000"

<210> 99

<211> 385

<212> PRT

<213> Silicibacter pomeroyi DSS-3

<400> 99 "000"

<210> 100

<211> 987

<212> ADN

<213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis cepa

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (987)

<223> transl_table=11

<400> 100 "000"

<210> 101

<211> 328

<212> PRT

<213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis cepa

<400> 101 "000"

<210> 102

<211> 999

<212> ADN

<213> Pseudomonas syringae pv. syringae B728a

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (999)

<223> transl_table=11

<400> 102 "000"

<210> 103

<211> 332

<212> PRT

<213> Pseudomonas syringae pv. syringae B728a

<400> 103 "000"

<210> 104

<211> 945

<212> ADN

<213> Pseudomonas syringae pv. syringae B728a

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (945)

<223> transl_table=11

<400> 104 "000"

<210> 105

<211> 314

<212> PRT

<213> Pseudomonas syringae pv. syringae B728a

<400> 105 "000"

<210> 106

<211> 1017

<212> ADN

<213> Pseudomonas syringae pv. syringae B728a

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_table=11

<400> 106 "000"

<210> 107

<211> 338

<212> PRT

<213> Pseudomonas syringae pv. syringae B728a

<400> 107 "000"

<210> 108

<211> 996

<212> ADN

<213> Pseudomonas fluorescens Pf-5

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (996)

<223> transl_ table=11

<400> 108 "000"

<210> 109

<211> 331

<212> PRT

<213> Pseudomonas fluorescens Pf-5

<400> 109 "000"

<210> 110

<211> 1023

<212> ADN

<213> Psychrobacter arcticus 273-4

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1023)

<223> transl_ table=11

<400> 110 "000"

<210> 111

<211> 340

<212> PRT

<213> Psychrobacter arcticus 273-4

<400> 111 "000"

<210> 112

<211> 960

<212> ADN

<213> Colwellia psychrerythraea 34H

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (960)

<223> transl_ table=11

<400> 112 "000"

<210> 113

<211> 319

<212> PRT

<213> Colwellia psychrerythraea 34H

<400> 113 "000"

<210> 114

<211> 999

<212> ADN

<213> Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (999)

<223> transl_ table=11

<400> 114 "000"

<210> 115

<211> 332

<212> PRT

<213> Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A

<400> 115 "000"

<210> 116

<211> 945

<212> ADN

<213> Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (945)

<223> transl_ table=11

<400> 116 "000"

<210> 117

<211> 314

<212> PRT

<213> Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A

<400> 117 "000"

<210> 118

<211> 1017

<212> ADN

<213> Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017) <223> transl_ table=11

<400> 118 "000"

<210> 119

<211> 338

<212> PRT

<213> Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A

<400> 119 "000"

<210> 120

<211> 1017

<212> ADN

<213> Ralstonia eutropha JMP134

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> trans1_table=11

<400> 120 "000"

<210> 121

<211> 338

<212> PRT

<213> Ralstonia eutropha JMP134

<400> 121 "000"

<210> 122

<211> 987

<212> ADN

<213> Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus ATCC 15305

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (987)

<223> trans1_table=11

<400> 122 "000"

<210> 123

<211> 328

<212> PRT

<213> Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus ATCC 15305

<400> 123 "000"

<210> 124

<211> 987

<212> ADN

<213> Shigella sonnei Ss046

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (987)

<223> trans1_table=11

<400> 124 "000"

<210> 125

<211> 328

<212> PRT

<213> Shigella sonnei Ss046

<400> 125 "000"

<210> 126

<211> 924

<212> ADN

<213> Anabaena variabilis ATCC 29413

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (924)

<223> transl_ table=11

<400> 126 "000"

<210> 127

<211> 307

<212> PRT

<213> Anabaena variabilis ATCC 29413

<400> 127 "000"

<210> 128

<211> 1017

<212> ADN

<213> Burkholderia pseudomallei 1710b

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 128 "000"

<210> 129

<211> 338

<212> PRT

<213> Burkholderia pseudomallei 1710b

<400> 129 "000"

<210> 130

<211> 909

<212> ADN

<213> Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (909)

<223> transl_ table=11 <400> 130 "000"

<210> 131

<211> 302

<212> PRT

<213> Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125

<400> 131 "000"

<210> 132

<211> 1005

<212> ADN

<213> Pseudomonas fluorescens PfO-1

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1005)

<223> transl_ table=11

<400> 132 "000"

<210> 133

<211> 334

<212> PRT

<213> Pseudomonas fluorescens PfO-1

<400> 133 "000"

<210> 134

<211> 1080

<212> ADN

<213> Burkholderia sp. 383

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1080)

<223> transl_ table=11

<400> 134 "000"

<210> 135

<211> 359

<212> PRT

<213> Burkholderia sp. 383

<400> 135 "000"

<210> 136

<211> 1017

<212> ADN

<213> Burkholderia sp. 383

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 136 "000"

<210> 137

<211> 338

<212> PRT

<213> Burkholderia sp. 383

<400> 137 "000"

<210> 138

<211> 1002

<212> ADN

<213> Desulfovibrio desulfuricans G20

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1002)

<223> transl_ table=11

<400> 138 "000"

<210> 139

<211> 333

<212> PRT

<213> Desulfovibrio desulfuricans G20

<400> 139 "000"

<210> 140

<211> 945

<212> ADN

<213> Thiomicrospira crunogena XCL-2

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (945)

<223> transl_ table=11

<400> 140 "000"

<210> 141

<211> 314

<212> PRT

<213> Thiomicrospira crunogena XCL-2

<400> 141 "000"

<210> 142

<211> 1083

<212> ADN

<213> Shigella dysenteriae Sd197

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1083)

<223> transl_ table=11

<400> 142 "000"

<210> 143

<211> 360

<212> PRT

<213> Shigella dysenteriae Sd197

<400> 143 "000"

<210> 144

<211> 1083

<212> ADN

<213> Shigella boydii Sb227

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1083)

<223> transl_ table=11

<400> 144 "000"

<210> 145

<211> 360

<212> PRT

<213> Shigella boydii Sb227

<400> 145 "000"

<210> 146

<211> 942

<212> ADN

<213> Hahella chejuensis KCTC 2396

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (942)

<223> transl_table=11

<400> 146 "000"

<210> 147

<211> 313

<212> PRT

<213> Hahella chejuensis KCTC 2396

<400> 147 "000"

<210> 148

<211> 1017

<212> ADN

<213> Burkholderia thailandensis E264

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 148 "000"

<210> 149

<211> 338

<212> PRT

<213> Burkholderia thailandensis E264

<400> 149 "000"

<210> 150

<211> 993

<212> ADN

<213> Sodalis glossinidius cepa ’morsitans’

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (993)

<223> transl_ table=11

<400> 150 "000"

<210> 151

<211> 330

<212> PRT

<213> Sodalis glossinidius cepa ‘morsitans’

<400> 151 "000"

<210> 152

<211> 1023

<212> ADN

<213> Anaeromyxobacter dehalogenans 2CP-C

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1023)

<223> transl_ table=11

<400> 152 "000"

<210> 153

<211> 340

<212> PRT

<213> Anaeromyxobacter dehalogenans 2CP-C

<400> 153 "000"

<210> 154

<211> 1029

<212> ADN

<213> Jannaschia sp. CCS1

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1029)

<223> transl_ table=11

<400> 154 "000"

<210> 155

<211> 342

<212> PRT

<213> Jannaschia sp. CCS1

<400> 155 "000"

<210> 156 <211> 1011

<212> ADN

<213> Saccharophagus degradans 2-40

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1011)

<223> transl_ table=11

<400> 156 "000"

<210> 157

<211> 336

<212> PRT

<213> Saccharophagus degradans 2-40

<400> 157 "000"

<210> 158

<211> 978

<212> ADN

<213> Saccharophagus degradans 2-40

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (978)

<223> transl_ table=11

<400> 158 "000"

<210> 159

<211> 325

<212> PRT

<213> Saccharophagus degradans 2-40

<400> 159 "000"

<210> 160

<211> 987

<212> ADN

<213> Escherichia coli UTI89

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (987)

<223> transl_ table=11

<400> 160 "000"

<210> 161

<211> 328

<212> PRT

<213> Escherichia coli UTI89

<400> 161 "000"

<210> 162

<211> 1038

<212> ADN

<213> Polaromonas sp. JS666 <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1038)

<223> transl_ table=11

<400> 162 "000"

<210> 163

<211> 345

<212> PRT

<213> Polaromonas sp. JS666

<400> 163 "000"

<210> 164

<211> 1029

<212> ADN

<213> Polaromonas sp. JS666

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1029)

<223> transl_table=11

<400> 164 "000"

<210> 165

<211> 342

<212> PRT

<213> Polaromonas sp. JS666

<400> 165 "000"

<210> 166

<211> 1017

<212> ADN

<213> Burkholderia xenovorans LB400

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 166 "000"

<210> 167

<211> 338

<212> PRT

<213> Burkholderia xenovorans LB400

<400> 167 "000"

<210> 168

<211> 1023

<212> ADN

<213> Psychrobacter cryohalolentis K5

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1023) <223> transl_ table=11

<400> 168 "000"

<210> 169

<211> 340

<212> PRT

<213> Psychrobacter cryohalolentis K5

<400> 169 "000"

<210> 170

<211> 975

<212> ADN

<213> Nostoc punctiforme PCC 73102

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (975)

<400> 170 "000"

<210> 171

<211> 324

<212> PRT

<213> Nostoc punctiforme PCC 73102

<400> 171 "000"

<210> 172

<211> 900

<212> ADN

<213> Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(900)

<400> 172 "000"

<210> 173

<211> 299

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14

<400> 173 "000"

<210> 174

<211> 996

<212> ADN

<213> Bacillus cereus G9241

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (996)

<223> transl_ table=11

<400> 174 "000"

<210> 175

<211> 331

<212> PRT

<213> Bacillus cereus G9241

<400> 175 "000"

<210> 176

<211> 1017

<212> ADN

<213> Rubrivivax gelatinosus PM1

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<400> 176 "000"

<210> 177

<211> 338

<212> PRT

<213> Rubrivivax gelatinosus PM1

<400> 177 "000"

<210> 178

<211> 909

<212> ADN

<213> Cytophaga hutchinsonii

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (909)

<400> 178 "000"

<210> 179

<211> 302

<212> PRT

<213> Cytophaga hutchinsonii

<400> 179 "000"

<210> 180

<211> 1026

<212> ADN

<213> Brevibacterium linens BL2

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1026)

<400> 180 "000"

<210> 181

<211> 341

<212> PRT

<213> Brevibacterium linens BL2

<400> 181 "000"

<210> 182

<211> 1017

<212> ADN

<213> Brevibacterium linens BL2

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<400> 182 "000"

<210> 183

<211> 338

<212> PRT

<213> Brevibacterium linens BL2

<400> 183 "000"

<210> 184

<211> 1017

<212> ADN

<213> Burkholderia vietnamiensis G4

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> trans1_table=11

<400> 184 "000"

<210> 185

<211> 338

<212> PRT

<213> Burkholderia vietnamiensis G4

<400> 185 "000"

<210> 186

<211> 1017

<212> ADN

<213> Burkholderia cenocepacia AU 1054

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 186 "000"

<210> 187

<211> 338

<212> PRT

<213> Burkholderia cenocepacia AU 1054

<400> 187 "000"

<210> 188

<211> 969

<212> ADN

<213> Kineococcus radiotolerans SRS30216

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (969)

<223> transl_ table=11

<400> 188 "000"

<210> 189

<211> 322

<212> PRT

<213> Kineococcus radiotolerans SRS30216

<400> 189 "000"

<210> 190

<211> 969

<212> ADN

<213> Nocardioides sp. JS614

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (969)

<223> transl_ table=11

<400> 190 "000"

<210> 191

<211> 322

<212> PRT

<213> Nocardioides sp. JS614

<400> 191 "000"

<210> 192

<211> 969

<212> ADN

<213> Nocardioides sp. JS614

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (969)

<223> transl_table=11

<400> 192 "000"

<210> 193

<211> 322

<212> PRT

<213> Nocardioides sp. JS614

<400> 193 "000"

<210> 194

<211> 999

<212> ADN

<213> Syntrophobacter fumaroxidans MPOB

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (999)

<223> transl_ table=11

<400> 194 "000"

<210> 195

<211> 332

<212> PRT

<213> Syntrophobacter fumaroxidans MPOB

<400> 195 "000"

<210> 196

<211> 1017

<212> ADN

<213> Burkholderia ambifaria AMMD

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 196 "000"

<210> 197

<211> 338

<212> PRT

<213> Burkholderia ambifaria AMMD

<400> 197 "000"

<210> 198

<211> 987

<212> ADN

<213> Shigella boydii BS512

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (987)

<400> 198 "000"

<210> 199

<211> 328

<212> PRT

<213> Shigella boydii BS512

<400> 199 "000"

<210> 200

<211> 1029

<212> ADN

<213> Escherichia coli E24377A

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1029) <400> 200 "000"

<210> 201

<211> 342

<212> PRT

<213> Escherichia coli E24377A

<400> 201 "000"

<210> 202

<211> 987

<212> ADN

<213> Escherichia coli HS

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(987)

<400> 202 "000"

<210> 203

<211> 328

<212> PRT

<213> Escherichia coli HS

<400> 203 "000"

<210> 204

<211> 987

<212> ADN

<213> Escherichia coli B7A

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(987)

<400> 204 "000"

<210> 205

<211> 328

<212> PRT

<213> Escherichia coli B7A

<400> 205 "000"

<210> 206

<211> 957

<212> ADN

<213> Pseudoalteromonas atlantica T6c

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (957)

<223> transl_ table=11

<400> 206 "000"

<210> 207

<211> 318

<212> PRT

<213> Pseudoalteromonas atlantica T6c

<400> 207 "000"

<210> 208

<211> 993

<212> ADN

<213> Pseudoalteromonas atlantica T6c

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (993)

<223> transl_ table=11

<400> 208 "000"

<210> 209

<211> 330

<212> PRT

<213> Pseudoalteromonas atlantica T6c

<400> 209 "000"

<210> 210

<211> 999

<212> ADN

<213> Pseudoalteromonas atlantica T6c

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (999)

<223> transl_ table=11

<400> 210 "000"

<210> 211

<211> 332

<212> PRT

<213> Pseudoalteromonas atlantica T6c

<400> 211 "000"

<210> 212

<211> 1020

<212> ADN

<213> Yersinia pseudotuberculosis IP 31758

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1020)

<400> 212 "000"

<210> 213

<211> 339

<212> PRT

<213> Yersinia pseudotuberculosis IP 31758

<400> 213 "000"

<210> 214

<211> 984

<212> ADN

<213> Alkaliphilus metalliredigenes QYMF

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (984)

<223> transl_ table=11

<400> 214 "000"

<210> 215

<211> 327

<212> PRT

<213> Alkaliphilus metalliredigenes QYMF

<400> 215 "000"

<210> 216

<211> 1053

<212> ADN

<213> Rhodopseudomonas palustris BisA53

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1053)

<223> transl_ table=11

<400> 216 "000"

<210> 217

<211> 350

<212> PRT

<213> Rhodopseudomonas palustris BisA53

<400> 217 "000"

<210> 218

<211> 1020

<212> ADN

<213> Bradyrhizobium sp. BTAi1

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1020)

<223> transl_ table=11

<400> 218 "000"

<210> 219

<211> 339

<212> PRT

<213> Bradyrhizobium sp. BTAi1

<400> 219 "000"

<210> 220

<211> 987

<212> ADN

<213> Escherichia coli 101-1

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(987)

<400> 220 "000"

<210> 221

<211> 328

<212> PRT

<213> Escherichia coli 101-1

<400> 221 "000"

<210> 222

<211> 1017

<212> ADN

<213> Ralstonia solanacearum UW551

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 222 "000"

<210> 223

<211> 338

<212> PRT

<213> Ralstonia solanacearum UW551

<400> 223 "000"

<210> 224

<211> 1011

<212> ADN

<213> Roseovarius nubinhibens ISM

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1011)

<223> transl_ table=11

<400> 224 "000"

<210> 225

<211> 336

<212> PRT

<213> Roseovarius nubinhibens ISM

<400> 225 "000"

<210> 226

<211> 1017

<212> ADN

<213> Roseovarius nubinhibens ISM

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 226 "000"

<210> 227

<211> 338

<212> PRT

<213> Roseovarius nubinhibens ISM

<400> 227 "000"

<210> 228

<211> 900

<212> ADN

<213> Pseudomonas aeruginosa C3719

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(900)

<400> 228 "000"

<210> 229

<211> 299

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa C3719

<400> 229 "000"

<210> 230

<211> 900

<212> ADN

<213> Pseudomonas aeruginosa 2192

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(900)

<400> 230 "000"

<210> 231

<211> 299

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa 2192

<400> 231 "000"

<210> 232

<211> 957

<212> ADN

<213> Burkholderia cenocepacia PC184

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(957)

<400> 232 "000"

<210> 233

<211> 318

<212> PRT

<213> Burkholderia cenocepacia PC184

<400> 233 "000"

<210> 234

<211> 1017

<212> ADN

<213> Burkholderia cenocepacia PC184

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<400> 234 "000"

<210> 235

<211> 338

<212> PRT

<213> Burkholderia cenocepacia PC184

<400> 235 "000"

<210> 236

<211> 1017

<212> ADN

<213> Burkholderia dolosa AU0158

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<400> 236 "000"

<210> 237

<211> 338

<212> PRT

<213> Burkholderia dolosa AU0158

<400> 237 "000"

<210> 238

<211> 1092

<212> ADN

<213> Polaromonas naphthalenivorans CJ2

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1092)

<223> transl_ table=11

<400> 238 "000"

<210> 239

<211> 363 <212> PRT

<213> Polaromonas naphthalenivorans CJ2

<400> 239 "000"

<210> 240

<211> 1020

<212> ADN

<213> Burkholderia mallei 10229

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1020)

<400> 240 "000"

<210> 241

<211> 339

<212> PRT

<213> Burkholderia mallei 10229

<400> 241 "000"

<210> 242

<211> 957

<212> ADN

<213> Roseovarius sp. 217

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (957)

<223> transl_ table=11

<400> 242 "000"

<210> 243

<211> 318

<212> PRT

<213> Roseovarius sp. 217

<400> 243 "000"

<210> 244

<211> 1017

<212> ADN

<213> Roseovarius sp. 217

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 244 "000"

<210> 245

<211> 338

<212> PRT

<213> Roseovarius sp. 217 <400> 245 "000"

<210> 246

<211> 909

<212> ADN

<213> Cellulophaga sp. MED134

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (909)

<223> transl_ table=11

<400> 246 "000"

<210> 247

<211> 302

<212> PRT

<213> Cellulophaga sp. MED134

<400> 247 "000"

<210> 248

<211> 939

<212> ADN

<213> Tenacibaculum sp. MED152

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (939)

<223> transl_ table=11

<400> 248 "000"

<210> 249

<211> 312

<212> PRT

<213> Tenacibaculum sp. MED152

<400> 249 "000"

<210> 250

<211> 948

<212> ADN

<213> Flavobacterium sp. MED217

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (948)

<223> transl_ table=11

<400> 250 "000"

<210> 251

<211> 315

<212> PRT

<213> Flavobacterium sp. MED217

<400> 251 "000"

<210> 252

<211> 876

<212> ADN

<213> Campylobacter jejuni subsp. jejuni 260.94

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (876)

<223> transl_ table=11

<400> 252 "000"

<210> 253

<211> 291

<212> PRT

<213> Campylobacter jejuni subsp. jejuni 260.94

<400> 253 "000"

<210> 254

<211> 900

<212> ADN

<213> Marinomonas sp. MED121

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (900)

<223> transl_ table=11

<400> 254 "000"

<210> 255

<211> 299

<212> PRT

<213> Marinomonas sp. MED121

<400> 255 "000"

<210> 256

<211> 1008

<212> ADN

<213> gamma proteobacterium KT 71

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1008)

<223> transl_ table=11

<400> 256 "000"

<210> 257

<211> 335

<212> PRT

<213> gamma proteobacterium KT 71

<400> 257 "000"

<210> 258

<211> 978

<212> ADN

<213> gamma proteobacteria KT 71

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (978)

<223> transl_table=11

<400> 258 "000"

<210> 259

<211> 325

<212> PRT

<213> gamma proteobacteria KT 71

<400> 259 "000"

<210> 260

<211> 927

<212> ADN

<213> Flavobacteriales bacterium HTCC2170

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (927)

<223> transl_ table=11

<400> 260 "000"

<210> 261

<211> 308

<212> PRT

<213> Flavobacteriales bacterium HTCC2170

<400> 261 "000"

<210> 262

<211> 924

<212> ADN

<213> Alteromonas macleodii "ecotipo Deep"

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (924)

<223> transl_table=11

<400> 262 "000"

<210> 263

<211> 307

<212> PRT

<213> Alteromonas macleodii "ecotipo Deep"

<400> 263 "000"

<210> 264

<211> 927

<212> ADN

<213> Polaribacter irgensii 23-P

<220> <221> CDS

<222> (1) .. (927)

<223> transl_table=11

<400> 264 "000"

<210> 265

<211> 308

<212> PRT

<213> Polaribacter irgensii 23-P

<400> 265 "000"

<210> 266

<211> 906

<212> ADN

<213> Robiginitalea biformata HTCC2501

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (906)

<223> transl_ table=11

<400> 266 "000"

<210> 267

<211> 301

<212> PRT

<213> Robiginitalea biformata HTCC2501

<400> 267 "000"

<210> 268

<211> 1008

<212> ADN

<213> actinobacteria marina PHSC20C1

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1008)

<223> transl_ table=11

<400> 268 "000"

<210> 269

<211> 335

<212> PRT

<213> actinobacteria marina PHSC20C1

<400> 269 "000"

<210> 270

<211> 1005

<212> ADN

<213> Desulfotomaculum reducens MI-1

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1005)

<223> transl_ table=11 <400> 270 "000"

<210> 271

<211> 334

<212> PRT

<213> Desulfotomaculum reducens MI-1

<400> 271 "000"

<210> 272

<211> 1005

<212> ADN

<213> Desulfotomaculum reducens MI-1

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1005)

<223> transl_ table=11

<400> 272 "000"

<210> 273

<211> 334

<212> PRT

<213> Desulfotomaculum reducens MI-1

<400> 273 "000"

<210> 274

<211> 924

<212> ADN

<213> Oceanospirillum sp. MED92

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (924)

<223> transl_ table=11

<400> 274 "000"

<210> 275

<211> 307

<212> PRT

<213> Oceanospirillum sp. MED92

<400> 275 "000"

<210> 276

<211> 996

<212> ADN

<213> Bacillus weihenstephanensis KBAB4

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (996)

<223> transl_ table=11

<400> 276 "000"

<210> 277

<211> 331

<212> PRT

<213> Bacillus weihenstephanensis KBAB4

<400> 277 "000"

<210> 278

<211> 996

<212> ADN

<213> Xanthobacter autotrophicus Py2

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (996)

<223> transl_table=11

<400> 278 "000"

<210> 279

<211> 331

<212> PRT

<213> Xanthobacter autotrophicus Py2

<400> 279 "000"

<210> 280

<211> 996

<212> ADN

<213> Xanthobacter autotrophicus Py2

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (996)

<223> transl_ table=11

<400> 280 "000"

<210> 281

<211> 331

<212> PRT

<213> Xanthobacter autotrophicus Py2

<400> 281 "000"

<210> 282

<211> 966

<212> ADN

<213> Flavobacteria bacterium BBFL7

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (966)

<223> transl_ table=11

<400> 282 "000"

<210> 283

<211> 321

<212> PRT

<213> Flavobacteria bacterium BBFL7

<400> 283 "000"

<210> 284

<211> 993

<212> ADN

<213> gamma proteobacteria marina HTCC2207

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (993)

<223> transl_ table=11

<400> 284 "000"

<210> 285

<211> 330

<212> PRT

<213> gamma proteobacteria marina HTCC2207

<400> 285 "000"

<210> 286

<211> 909

<212> ADN

<213> Flavobacterium johnsoniae UW101

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (909)

<223> transl_table=11

<400> 286 "000"

<210> 287

<211> 302

<212> PRT

<213> Flavobacterium johnsoniae UW101

<400> 287 "000"

<210> 288

<211> 951

<212> ADN

<213> Psychroflexus torquis ATCC 700755

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (951)

<223> transl_table=11

<400> 288 "000"

<210> 289

<211> 316

<212> PRT

<213> Psychroflexus torquis ATCC 700755

<400> 289 "000"

<210> 290

<211> 933

<212> ADN

<213> Pseudomonas aeruginosa PA7

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(933)

<400> 290 "000"

<210> 291

<211> 310

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa PA7

<400> 291 "000"

<210> 292

<211> 1020

<212> ADN

<213> Rhizobium meliloti

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1020)

<223> transl_ table=11

<400> 292 "000"

<210> 293

<211> 339

<212> PRT

<213> Rhizobium meliloti

<400> 293 "000"

<210> 294

<211> 1056

<212> ADN

<213> Aspergillus oryzae

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1056)

<400> 294 "000"

<210> 295

<211> 351

<212> PRT

<213> Aspergillus oryzae

<400> 295 "000"

<210> 296

<211> 1206

<212> ADN

<213> Aspergillus oryzae

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1206)

<400> 296 "000"

<210> 297

<211> 401

<212> PRT

<213> Aspergillus oryzae

<400> 297 "000"

<210> 298

<211> 1116

<212> ADN

<213> Neurospora crassa

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1116)

<400> 298 "000"

<210> 299

<211> 371

<212> PRT

<213> Neurospora crassa

<400> 299 "000"

<210> 300

<211> 1014

<212> ADN

<213> Rhizobium loti

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1014)

<223> transl_ table=11

<400> 300 "000"

<210> 301

<211> 337

<212> PRT

<213> Rhizobium loti

<400> 301 "000"

<210> 302

<211> 1149

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1149)

<400> 302

<210> 303

<211> 382

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 303

<210> 304

<211> 1083 5 <212> ADN

<213> Penicillium citrinum

<220>

<221> CDS 10 <222> (1) .. (1083)

<400> 304

"000"

5: <210> 305 <211> 360 <212> PRT <213> Penicillium citrinum

10 15: <400> 305 "000" <210> 306 <211> 1245 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1) .. (1245)

20: <400> 306

<210> 307

<211> 414

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 307

5 <210> 308

<211> 1014

<212> ADN

<213> Bradyrhizobium japonicum

10 <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1014)

<223> transl_ table=11

<400> 308 "000"

<210> 309

<211> 337

<212> PRT

<213> Bradyrhizobium japonicum

<400> 309 "000"

<210> 310

<211> 1017

<212> ADN

<213> Burkholderia mallei

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 310 "000"

<210> 311

<211> 338

<212> PRT

<213> Burkholderia mallei

<400> 311 "000"

<210> 312

<211> 1038

<212> ADN

<213> Cryptococcus neoformans

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1038)

<400> 312 "000"

<210> 313

<211> 345

<212> PRT

<213> Cryptococcus neoformans

<400> 313 "000"

<210> 314

<211> 1017

<212> ADN

<213> Enterobacter cloacae

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 314 "000"

<210> 315

<211> 338

<212> PRT

<213> Enterobacter cloacae

<400> 315 "000"

<210> 316

<211> 1017

<212> ADN

<213> Pseudomonas fluorescens

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 316 "000"

<210> 317

<211> 338

<212> PRT

<213> Pseudomonas fluorescens

<400> 317 "000"

<210> 318

<211> 1017

<212> ADN

<213> Pseudomonas putida

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 318 "000"

<210> 319

<211> 338

<212> PRT

<213> Pseudomonas putida

<400> 319 "000"

<210> 320

<211> 1017

<212> ADN

<213> Pseudomonas sp

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 320 "000"

<210> 321

<211> 338

<212> PRT

<213> Pseudomonas sp

<400> 321 "000"

<210> 322

<211> 1017

<212> ADN

<213> Pseudomonas syringae pv

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 322 "000"

<210> 323

<211> 338

<212> PRT

<213> Pseudomonas syringae pv

<400> 323 "000"

<210> 324

<211> 1017

<212> ADN

<213> Pseudomonas sp

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 324 "000"

<210> 325

<211> 338

<212> PRT

<213> Pseudomonas sp

<400> 325 "000"

<210> 326

<211> 993

<212> ADN

<213> Pyrococcus abyssi

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (993)

<223> transl_table=11

<400> 326 "000"

<210> 327

<211> 330

<212> PRT

<213> Pyrococcus abyssi

<400> 327 "000"

<210> 328

<211> 1017

<212> ADN

<213> Ralstonia solanacearum

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 328 "000"

<210> 329

<211> 338

<212> PRT

<213> Ralstonia solanacearum

<400> 329 "000"

<210> 330

<211> 1014

<212> ADN

<213> Rhizobium loti

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1014)

<223> transl_ table=11

<400> 330 "000"

<210> 331

<211> 337

<212> PRT

<213> Rhizobium loti

<400> 331 "000"

<210> 332

<211> 1020

<212> ADN

<213> Rhizobium leguminosarum bv

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1020)

<223> transl_ table=11

<400> 332 "000"

<210> 333

<211> 339

<212> PRT

<213> Rhizobium leguminosarum bv

<400> 333 "000"

<210> 334

<211> 1017

<212> ADN

<213> Schizosaccharomyces pombe

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<400> 334 "000"

<210> 335

<211> 338

<212> PRT

<213> Schizosaccharomyces pombe

<400> 335 "000"

<210> 336

<211> 939

<212> ADN

<213> Thermotoga maritima

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (939)

<223> transl_table=11

<400> 336 "000"

<210> 337

<211> 312

<212> PRT

<213> Thermotoga maritima

<400> 337 "000"

<210> 338

<211> 1017

<212> ADN

<213> Variovorax paradoxus

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1017)

<223> transl_ table=11

<400> 338 "000"

<210> 339

<211> 338

<212> PRT

<213> Variovorax paradoxus

<400> 339 "000"

<210> 340

<211> 993

<212> ADN

<213> Yersinia pestis

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (993)

<223> transl_table=11

<400> 340 "000"

<210> 341

<211> 330

<212> PRT

<213> Yersinia pestis

<400> 341 "000"

<210> 342

<211> 1406

<212> ADN

<213> Glycine max

<220>

<221> CDS

<222> (68) .. (1207)

<400> 342

<210> 343

<211> 379

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 343

<210> 344

<211> 1315 5 <212> ADN

<213> Brassica napus

<220>

<221> CDS 10 <222> (14) .. (1138)

<400> 344

<210> 345

<211> 374

<212> PRT

<213> Brassica napus

<400> 345

<210> 346

<211> 1389

<212> ADN 10 <213> Zea mays

<220>

<221> CDS

<222> (42) .. (1229) 15

<400> 346

<210> 347

<211> 395

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 347

<210> 348

<211> 1429 5 <212> ADN

<213> Zea mays

<220>

<221> CDS 10 <222> (284) .. (1228)

<400> 348

<210> 349

<211> 314

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 349

<210> 350

<211> 1383 5 <212> ADN

<213> Zea mays

<220>

<221> CDS 10 <222> (42) .. (1226)

<400> 350

<210> 351

<211> 395

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 351

<210> 352

<211> 1402 5 <212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> CDS 10 <222> (38) .. (1192)

<400> 352

<210> 353

<211> 385

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 353

<210> 354

<211> 1406

<212> ADN

<213> Glycine max 10

<220>

<221> CDS

<222> (68) .. (1204)

<400> 354

<210> 355

<211> 379

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 355

<210> 356

<211> 1463 5 <212> ADN

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> CDS 10 <222> (21) .. (1280)

<400> 356

<210> 357

<211> 420

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 357

<210> 358

<211> 31

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Cebador directo de AtACCD

<400> 358 ggggtcgacg aagcaatgag aggacgaagc t 31

<210> 359

<211> 32

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Cebador inverso de AtACCD

<400> 359 gggttaatta acagattttg ttgtgctaga ac 32

<210> 360

<211> 20

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Cebador directo de terminador NOS

<400> 360 tccccgatcg ttcaaacatt 20

<210> 361

<211> 25

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Cebador inverso de terminador NOS

<400> 361 ccatctcata aataacgtca tgcat 25

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para aumentar el crecimiento de la raíz en condiciones normales o de tensión y/o aumentar la tolerancia a la tensión para una tensión ambiental y/o aumentar el rendimiento de una planta de cultivo transgénica en comparación con la planta de cultivo natural no transformada, en el que el procedimiento comprende aumentar la expresión de un Polipéptido de tipo 1-Aminociclopropano-1-carboxilato Desaminasa (ACCDP) mediante transformación de la planta de cultivo con, y sobreexpresión de, un ácido nucleico que codifica el ACCDP, en el que el ACCDP se codifica por un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

a.

un polinucleótido que tiene una secuencia como se expone en SEC ID Nº: 1;

b.

un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEC ID Nº: 2;

c.

un polinucleótido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con el polinucleótido de a);

d.

un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con el polipéptido de b); y

e.

un polinucleótido cuya secuencia puede derivar de una secuencia polipeptídica codificada por cualquier molécula de ácido nucleico de a) a d) anterior, debido a la degeneración del código genético;

en el que la tensión ambiental se selecciona de una o más del grupo que consiste en salinidad, sequía o temperatura, o combinaciones de las mismas.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la planta se transforma con un vector que comprende un ácido nucleico aislado, en el que el ácido nucleico comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

a.

un polinucleótido que tiene una secuencia como se expone en SEC ID Nº: 1;

b.

un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEC ID Nº: 2;

c.

un polinucleótido que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con el polinucleótido de a);

d.

un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con el polipéptido de b); y

e.

un polinucleótido cuya secuencia puede derivar de una secuencia polipeptídica codificada por cualquier molécula de ácido nucleico de a) a d) anterior, debido a la degeneración del código genético.
3.

El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el ácido nucleico está unido operativamente a un promotor y en el que el promotor tiene preferencia de tejido, está regulado por el desarrollo, es inducible por tensión, o una combinación de los mismos.
4.

El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el promotor con preferencia de tejido tiene preferencia de raíz.
5.

Una planta de cultivo transgénica transformada con, que comprende y que sobreexpresa un ácido nucleico, en la que el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica un Polipéptido de tipo 1-Aminociclopropano-1carboxilato Desaminasa (ACCDP) seleccionado del grupo que consiste en:

a.

un polinucleótido que tiene una secuencia como se expone en SEC ID Nº: 1;

b.

un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEC ID Nº: 2;

c.

un polinucleótido que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con el polinucleótido de a);

d.

un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con el polipéptido de b); y

e.

un polinucleótido cuya secuencia puede derivar de una secuencia polipeptídica codificada por cualquier molécula de ácido nucleico de a) a d) anterior, debido a la degeneración del código genético;

y en la que el polinucleótido codifica un ACCDP vegetal, y en la que la expresión del polinucleótido en la planta da como resultado

1.

aumento de la tolerancia a la tensión para una tensión ambiental en comparación con la planta de cultivo natural no transformada, en el que la tensión ambiental se selecciona de una o más del grupo que consiste en salinidad, sequía o temperatura, o combinaciones de las mismas; o
2.

aumento del crecimiento de la raíz en condiciones normales o de tensión en comparación con la planta de cultivo natural no transformada, o
3.

aumento del rendimiento en condiciones normales o de tensión en comparación con la planta de cultivo natural no transformada,

en el que la planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, sorgo, mijo, caña de azúcar, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, Manihot, pimiento, girasol, Tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, especies de Salix, palma aceitera, coco, hierba perenne y una planta de cultivo de forraje.
6.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la planta es una monocotiledónea o dicotiledónea.
7.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, sorgo, mijo, caña de azúcar, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, Manihot, pimiento, girasol, Tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, especies de Salix, palma aceitera, coco, hierba perenne y una planta de cultivo de forraje.
8.

Una semilla de planta de cultivo producida por la planta de cultivo transgénica de la reivindicación 5, en la que la semilla comprende el ácido nucleico aislado.
9.

La semilla de la reivindicación 8, en la que la semilla es de estirpe pura para

a.

aumento de la tolerancia a la tensión para una tensión ambiental en comparación con la variedad natural no transformada de la semilla, en el que la tensión ambiental se selecciona de una o más del grupo que consiste en salinidad, sequía o temperatura, o combinaciones de las mismas; o

b.

un aumento del crecimiento de la raíz en condiciones normales o de tensión en comparación con una variedad natural no transformada de la semilla,

c.

aumento del rendimiento en condiciones normales o de tensión en comparación con la planta de cultivo natural no transformada.
10.

Uso de un ácido nucleico que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

a.

un polinucleótido que tiene una secuencia como se expone en SEC ID Nº: 1;

b.

un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEC ID Nº: 2;

c.

un polinucleótido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con el polinucleótido de a);

d.

un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con el polipéptido de b); y

e.

un polinucleótido cuya secuencia puede derivar de una secuencia polipeptídica codificada por cualquier molécula de ácido nucleico de a) a d) anterior, debido a la degeneración del código genético;

para aumentar en plantas de cultivo el crecimiento de la raíz y/o el rendimiento en condiciones normales o de tensión y/o la tolerancia a la tensión ambiental en comparación con una variedad natural no transformada de la planta, en la que la tensión ambiental se selecciona de una o más del grupo que consiste en salinidad, sequía o temperatura, o combinaciones de las mismas.

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Gen

Longitud de la Raíz (mm) Error Diferencias del Control

ID

MEDIA LS típico P

WT

132,8 8,0 -

1.1 AtACCD

164,3 6,0 0,0055

Figura 7

Gen

Peso Seco del Brote (g) Error Diferencias del Control

ID

MEDIA LS típico P

WT

0,0123 0,0013 -

AtACCD

0,0135 0,0010 0,8197

Figura 8

Gen de Consulta

Aciertos de Tblasn (Nombre de los genes y SEC ID) Porcentaje de identidad Longitud (aa)

AtACCD (SEC ID Nº: 2, 401 aa)

GmACCD-1 (SEC ID Nº: 355) OsACCD (SEC ID Nº: 353) ZmACCD-1 (SEC ID Nº: 351) TaACCD (SEC ID Nº: 357) 74 69 69 67 388 381 380 401

Figura 9

>Contigl481_48982441Dec03 1406pb 11m + 48982441.f_115_1|Soja|Lib:AC040|cluID:7088|varlD:1077 3|RTA56564033F.1.15.1 Longitud = 1406

Puntuación = 591 bits (1523), Expectativa = e-168 Identidades= 288/388 (74 %), Positivos = 332/388 (85 %). Fase = +2

Figura 10

>Contigl9555_30859453Dec03 1402pb 8m +
30859453.f_f17_1|Arroz|Lib:AC003t|cluID:706|varlD:779|RT A56560012F.f.17.1 Longitud = 1402

Puntuación = 560 bits (1442), Expectativa = e-159 Identidades= 266/381 (69 %), Positivos = 318/381 (83 %) Fase = +2

Figura 11

>Contigl4714_57817161Dec03 1383pb 4m +
57817161.f_h20_1 |Maíz|Lib:AC080|cluID:57802|varlD:6856 1|RTA56568132F.h.20.1 Longitud =1383

Puntuación = 560 bits (1442), Expectativa = e-159 Identidades= 265/380 (69 %), Positivos = 319/380 (83 %) Fase = +3

Figura 12

>Contig15977_54201209Dec03 1463pb 5m +
54201209.f_kc01_1|Trigo|Lib:AC062|cluID:9364|varlD:69571 |RTA56566095F.k.01.1 Longitud = 1463

Puntuación = 558 bits (1439), Expectativa = e-159 Identidades= 269/401 (67 %), Positivos = 324/401 (80 %), Huecos = 5/401 (1 %) Fase = +3