ES2443216T3

ES2443216T3 - Proteínas de fusión que comprenden polipéptidos de VPH y péptidos de inmunopotenciación de tratamiento y prevención del cáncer cervicouterino

Info

Publication number: ES2443216T3
Application number: ES06732867.4T
Authority: ES
Inventors: Young Chul Sung; Hyun Tak Jin; Sang Hwan Seo; Sang Hoon Park; Je-In Youn
Original assignee: POSTECH Academy Industry Foundation
Current assignee: POSTECH Academy Industry Foundation
Priority date: 2006-04-19
Filing date: 2006-04-19
Publication date: 2014-02-18
Anticipated expiration: 2026-04-19
Also published as: CN101421306B; JP5345053B2; US8137674B2; PL2010572T3; EP2010572B1; USRE46453E1; KR101180885B1; WO2007119896A1; KR20090007333A; JP2009534027A; US20090305979A1; CN101421306A; EP2010572A4; EP2010572A1

Abstract

Una proteína de fusión, que comprende - un polipéptido de fusión de las proteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano, en el que(1) la sección de la proteína E6 tiene la secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID Nº 3, y(2) la sección de la proteína E7 tiene la secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID Nº 5, - un péptido señal para secretar el polipéptido hacia fuera de la célula, y - un péptido inmunopotenciador elegido del grupo que consiste en un ligando de CD40 y un ligando de Flt3.

Description

Proteínas de fusión que comprenden polipéptidos de VPH y péptidos de inmunopotenciación de tratamiento y prevención del cáncer cervicouterino

Campo de la técnica

La presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende un polipéptido de fusión de E6 y E7 de un virus del papiloma humano (VPH), un péptido señal para secretar el polipéptido de la célula y un péptido inmunopotenciador para un sujeto; un polinucleótido que codifica la proteína de fusión; un vector que contiene el polinucleótido; una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión o el vector; y la proteína de fusión para usar en un procedimiento para tratar una enfermedad causada por un virus del papiloma humano usando la composición farmacéutica.

Técnica anterior

El cáncer cervicouterino se ha convertido el la segunda causa principal de muerte por cáncer, responsable de

250.000 muertes anuales en todo el mundo. Se sabe que el cáncer cervicouterino se debe principalmente a la infección por el virus del papiloma humano (VPH) (zur Hausen, H et al. Biochem Biophys Acta 1996, 1288; F55-F78). Entre los cientos de tipos de VPH, el VPH16 se conoce como la causa principal de cáncer cervicouterino (Mark H et al. J Natl Cancer Inst 1993, 85; 958-964). Entre las proteínas del VOH, las proteínas E6 y E7 desempeñan papeles cruciales en la aparición de cáncer cervicouterino como oncogenes y se ha notificado que son las principales proteínas que se expresan en aproximadamente el 99% de los tumores causados por los VPH. Como resultado, las proteínas E6 y E7 se han convertido en un antígeno diana mayoritario en la preparación de una vacuna para tratar y prevenir el cáncer cervicouterino (von Knebel Doeberitz et al. Int. J. Cancer 1992, 51; 831-834). La E6 previene la apoptosis de las células induciendo la descomposición de una proteína inhibidora de tumores p53, y E7 se une a una proteína de retinoblastoma (Tb) que es un supresor tumoral celular, para inactivar la proteína y, después, para inducir las células a entrar en una fase S en el ciclo celular (Cobrinik et al., Trends Biochem Sci 1992, 17:312-5).

Se realizó un ensayo clínico que usa una composición que expresa una secuencia de bases de ácido nucleico que expresa las proteínas E6 y E7 del VPH16 al mismo tiempo con el fin de tratar el cáncer cervicouterino, pero su efecto terapéutico no fue significativo (Garcia F et al. Obstet Gynecol 2004, 103; 317-326). Además, la publicación de patente internacional WO 2004/030636 divulga un polipéptido de fusión que comprende E6 y E7, en el que E6 está en un extremo amino o un extremo carboxilo, y un polinucleótido que codifica el polipéptido de fusión. No obstante, el polipéptido como se divulga en el presente documento todavía tiene la limitación en el tratamiento del cáncer cervicouterino causado por el VPH.

H. Hauser et al. describen una proteína del choque térmico secretora como molécula dirigida a las células dendríticas: a new strategy to enhance the potency of genetic vaccines (Gene Therapy 2004 (11) 924-932). Una proteína de fusión que comprende un péptido señal, el antígeno E7 del VPH y HSP70 se usa in vivo.

T Daemen et al. describen una estrategia de inmunización contra el cáncer cervicouterino que implica un vector alfavirus que expresa niveles elevados de una proteína de fusión estable de E6 y E7 del virus del papiloma human 16 (Gene Therapy 2002(9) 85-94).

M.C. Cassetti et al. describen la eficacia antitumoral de las partículas de replicón del virus de la encefalitis equina venezolana que codifican genes mutados de E6 y E7 del VPH16 (Vaccine 22 (2004) 520-527).

El documento WO 2004/037175 A2 divulga procedimientos de tratamiento de una enfermedad mediada por el VPH mediante la administración de una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un epítopo de una proteína de VPH de origen natural.

Y-K Cheung et al. describen un tipo de ADN de 16 (VPH16) construido con optimización de codones mejoró la inmunogeneicidad contra la infección por VPH (Vaccine 23 (2004) 629-638).

Seo Sang Hwan et al describen la inducción óptima de las respuestas de linfocitos T CD8+ inducidas por la vacuna del ADN del VPH y el efecto antitumoral terapéutico mediante ingeniería antigénica y electroporación (Vaccine 27 (2009) 5906-5912).

Los presentes inventores han encontrado que una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende un polipéptido de fusión de E6/E7 del VPH unido a un péptido secretor y el ligando de CD40 o el ligando Flt3 como péptido inmunopotenciador mejora las respuestas inmunitarias y es eficaz en el tratamiento y la prevención de los tumores causados por el VPH, de modo que se realiza la presente invención.

Divulgación

Solución de la técnica

Es un objeto de la presente invención proporcionar una proteína de fusión que es altamente eficaz en el tratamiento y la prevención de enfermedades causadas por el VPH.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un polinucleótido que codifica la proteína de fusión.

Es otro objeto más de la presente invención proporcionar un vector recombinante que comprende el polinucleótido.

Es otro objeto más de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica que comprende la proteína 5 de fusión y el vector recombinante.

Es otro objeto más de la presente invención proporcionar la composición farmacéutica para usar en un procedimiento para el tratamiento o prevención de enfermedades causadas por el VPH en un sujeto.

Descripción de las figuras

La Fig. 1 es un gráfico que ilustra los resultados de comparación de las respuestas de linfocitos T CD8+

10 específicos de E7 producidas por la vacunación de ADN plasmídico que expresa Bock, E6Co, E7Co, E67 y E67Co, tE67Co, tFCoE67Co y tE67CoLCo en un modelo de ratón C57BL/6.

La Fig. 2 es un gráfico que ilustra los resultados de comparación de las respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de E6 producidas por la vacunación con simulado, E6Co, E7Co, E67 y E67Co, tE67Co, tFCoE67Co y tE67CoLCo en un modelo de ratón C57BL/6.

15 La Fig. 3 es un gráfico que ilustra los resultados de comparación de los efectos antitumorales profilácticas frente a la inyección subcutánea de células tumorales TC-1 indicada por el incremento del volumen de la masa tumoral en ratones C57BL/6 vacunados con simulado, E6Co, E7Co, E67 y E67Co, tE67Co, tFCoE67Co y tE67CoLCo.

La Fig. 4 es un gráfico que ilustra los resultados de comparación de las respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de E7 producidas por el tratamiento con tE67Co, tFCoE67Co y tE67CoLCo en un modelo de ratón

20 C57BL/6 portador de tumores TC-1.

La Fig. 5 es un gráfico que ilustra los resultados de comparación de las respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de E6 producidas por el tratamiento con tE67Co, tFCoE67Co y tE67CoLCo en un modelo de ratón C57BL/6 portador de tumores TC-1.

La Fig. 6 es un gráfico que ilustra los resultados de comparación de los efectos antitumorales terapéuticos

25 producidos por el tratamiento con simulado, tE67Co, tFCoE67Co y tE67CoLC en un modelo de ratón C57BL/6 portador de tumores TC-1 como modelo terapéutico.

Mejor modo

De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un polipéptido de fusión de E6 y E7 del virus del papiloma humano (VPH), un

30 péptido señal para secretar el polipéptido en la célula y un péptido inmunopotenciador para un sujeto.

Las proteínas E6 y E7 constituyen el polipéptido de fusión de la presente invención son las proteínas antigénicas E6 y E7 derivadas del tipo 16 del virus del papiloma humano (VPH16).

Como se ha descrito, la expresión “polipéptido de fusión de E6 y E7 de un virus del papiloma humano” se refiere a una proteína de fusión de un polipéptido en la que cada una de E6 y E7 tiene una secuencia de aminoácidos de 35 origen natural o E6 y E7 tiene un mutante de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos naturales. Como se usa en el presente documento, el término “mutante” se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de una secuencia de aminoácidos natural sometiendo al menos un residuo de aminoácidos a deleción, inserción, sustitución conservadora o una combinación de los mismos, pero tiene sustancialmente la misma inmumogeneicidad que la del polipéptido E6 y E7 naturales y se puede producir de forma natural o artificial. 40 En la invención, los mutantes se definen como codificados por la SEC ID Nº 3, en la que las cisteínas en las posiciones 63 y 106 están sustituidas por glicinas en la secuencia de aminoácidos que codifica el polipéptido E6 de un virus del papiloma humano de tipo 16 (VPH16) y la SEC ID Nº 5, en la que la cisteína en la posición 24 y el ácido glutámico en la posición 26 están sustituidos por glicinas en la secuencia de aminoácidos que codifica el polipéptido E7 del VPH16. También se describen polipéptidos codificados por la SEC ID Nº: 9, en la que las cisteínas en las

45 posiciones 65 y 108 están sustituidas por glicinas en la secuencia de aminoácidos que codifica el polipéptido E6 del VPH18 y la SEC ID Nº 11, en la que la cisteína en la posición 27 y el ácido glutámico en la posición 29 están sustituidos por glicinas en la secuencia de aminoácidos que codifica el polipéptido E7 del VPH18, que no caracterizan una proteína de acuerdo con la invención.

El polipéptido de fusión de E6 y E7 de un virus del papiloma humano de la presente invención puede estar en forma

50 de un polipéptido de fusión E6/E7, en el que E6 está en el extremo amino con respecto a E7, es decir E6 está seguida de E7 (polipéptido de fusión E6/E7) o en el que E6 está en el extremo carboxilo con respecto a E7, es decir E7 está seguida de E6 (polipéptido de fusión E7/E6). En realizaciones específicas, el polipéptido de fusión puede ilustrarse mediante el polipéptido de fusión E6/E7 del VPH codificado por la SEC ID Nº 7. También se describe el

polipéptido de fusión E6/E7 del VPH18 codificado por la SEC ID Nº: 13.

En la presente invención, la expresión “péptido señal” se refiere a un péptido que consiste en aproximadamente de 20 a 30 aminoácidos, que secreta una proteína expresada dentro de una célula, en concreto una proteína que comprende el polipéptido de fusión E6/E7, hacia fuera de la célula. El péptido señal para secretar el polipéptido fuera de la célula y una secuencia de ácido nucleico que codifica el mismo se denominan “secuencia señal secretora”. Los antígenos E6 y E7 para uso en la presente invención son proteínas expresadas dentro del núcleo de la célula que se han infectado por un virus (una proteína del núcleo) y, como resultado, tiene una inmunidad débil. Por tanto, el péptido señal expresado por la secuencia señal secretora puede inducir la secreción de los antígenos E6 y E7 hacia fuera de la célula para incrementar una respuesta inmunitaria humoral específica del antígeno y una respuesta inmunitaria celular. Por tanto, para el péptido señal para uso en la presente invención se pueden usar secuencias señal secretoras etc. de tPA, VHS gDs y la hormona de crecimiento, pero no se limitan a las mismas. Preferentemente, se puede usar un péptido señal usado en células eucariotas superiores, incluyendo un mamífero, más preferentemente tPA (activador del plasminógeno tisular).

Como se usa en el presente documento, la expresión “péptido inmunopotenciador” se refiere a un péptido que activa las células asociadas con respuestas inmunitarias para incrementar las respuestas inmunitarias (p. ej., las células dendríticas, etc.). Ejemplos de péptidos inmunopotenciadores incluyen un ligando de CD40, un ligando Flt3, una flagelina y OX40. En la presente invención, el ligando de CD40 y el ligando Flt3 se usan individualmente o en una combinación de los mismos. El “ligando Flt3” para uso en la presente invención es un factor que induce la proliferación y la maduración de las células dendríticas (CD), que aumenta una respuesta inmunitaria producida por un antígeno y es altamente eficaz en la reducción de un tumor cuando se fusiona con el antígeno tumoral. Como se usa en el presente documento, la expresión “ligando de CD40” es un ligando que interacciona con CD40 presente sobre las superficies de las células presentadoras de antígeno (CPA), como las células dendríticas, para activar las células dendríticas etc.

Como se usa en el presente documento, el “sujeto” abarca mamíferos tales como un ser humano, un mono, un ratón, un cerdo, una vaca y un conejo, pero no se limita a los mismos.

La proteína de fusión de la presente invención es altamente eficaz en las respuestas inmunitarias específicas de antígeno y en la inhibición de la aparición y el crecimiento de un tumor. De hecho, un polipéptido de fusión de E6 y E7 de un virus del papiloma humano indujo respuestas de linfocitos T CD8+ específicas de E6 y de E7 y mostraron un efecto antitumoral más fuerte que E6 o E7. Además, se descubrió que una proteína de fusión en la que el polipéptido de fusión de E6 y E7 de un virus del papiloma humano está unido con un péptido señal y el péptido inmunopotenciador definido tiene como resultado una respuesta inmunitaria específica del antígeno altamente eficaz e inhibe la aparición y crecimiento de un tumor. En realizaciones específicas, se descubrió que una proteína de fusión en la que el polipéptido de fusión de E6 y E7 de un virus del papiloma humano está unido con tPa como un péptido señal y un ligando de Flt3 y/o un ligando de CD40 como inmunopotenciador es altamente eficaz en una respuesta inmunitaria específica del antígeno, inhibición de la aparición y crecimiento de un tumo e inhibición del tamaño de un tumor en comparación con cada una de E6 y E7 de un virus del papiloma humano. De acuerdo con lo anterior, la proteína de fusión de la presente invención se puede usar para el tratamiento y prevención de un tumor.

Otra realización de la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica la proteína de fusión.

El polinucleótido de la presente invención se puede preparar mediante un procedimiento de síntesis química o tecnología de ingeniería genética. Los procedimientos de síntesis química son conocidos para un experto en la técnica y se pueden usar cualquiera de los procedimientos. Además, se puede adquirir de un sintetizador o fabricante comercial. En el caso en el que se prepare mediante tecnología de ingeniería genética, por ejemplo fragmentos de ácido nucleico que codifican polipéptidos de fusión conocidos comercialmente de E6 y E7, péptido señal y péptido inmunopotenciador, respectivamente, y la unión de los fragmentos para que encajen con los marcos. En la técnica se conoce un procedimiento para obtener los fragmentos de ácido nucleico y un experto en la técnica puede unirlos con una enzima de restricción adecuada. Se divulga un procedimiento para preparar un polinucléotido mediante síntesis química.

Otra realización más de la presente invención se refiere a un vector recombinante que comprende el polinucleótido polinucleótido.

Como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una construcción genética que comprende un ADN extraño que se ha insertado en un genoma que codifica un polipéptido. Como se usa en el presente documento, la frase “vector de expresión” se refiere a un vector en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia señal secretora, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de E6 y E6 de un virus del papiloma humano y una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido inmunopotenciador, o similar, se insertan en un genoma y ejemplos de los mismos incluyen un vector plasmídico, un vector cósmico, un bacteriófago, un vector levadura y un vector virus, tal como un vector adenovirus, un vector retrovirus, un vector asociado a adenovirus.

Como se usa en el presente documento, la expresión “secuencia señal secretora” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido que secreta hacia fuera de la célula un antígeno tumoral expresado dentro de

una célula y permite su reconocimiento por las células inmunitarias y ejemplos de los mismos incluyen secuencias señal secretoras como tPA, VHS gDs y una hormona de crecimiento. Preferentemente, se puede usar una secuencia señal secretora usada en células eucariotas superiores de un mamífero, más preferentemente tPA (activador del plasminógeno tisular). Además, la secuencia señal secretora para uso en la presente invención se puede usar después de sustituir con un codón que tiene una frecuencia de expresión alta en una célula huésped.

Como se usa en el presente documento, la expresión “secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido inmunopotenciador” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido que incrementa una respuesta inmunitaria mediante la activación de las células asociadas con respuestas inmunitarias (p. ej., las células dendríticas, etc.). Ejemplos de péptidos inmunopotenciadores incluyen un ligando de CD40, un ligando de Flt3, una flagelina y OX40. En la presente invención, el ligando de CD40 y el ligando de Flt3 se usan individualmente o en una combinación de los mismos. La secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido inmunopotenciador se puede usar después de sustituir con un codón que tiene una frecuencia de expresión alta en una célula huésped.

El polinucleótido contenido en el vector recombinante de la presente invención se puede sustituir con un codón que tiene una frecuencia de expresión alta en una célula huésped. Como se usa en el presente documento, la expresión “sustitución con un codón que tiene una frecuencia de expresión alta en una célula huésped” u “optimización de codones” se refiere a la sustitución de un codón con una preferencia elevada en algunos huéspedes entre los codones que designan los aminoácidos tras la transcripción y la traducción de ADN en una proteína en una célula huésped, teniendo un codón una preferencia mayor y, por tanto, aumentando la eficiencia de la expresión del aminoácido o la proteína codificados por los ácidos nucleicos. En el presente documento, la expresión “célula huésped” abarca una célula procariota o una célula eucariota y las células eucariotas incluyen una célula eucariota inferior, tal como un hongo y una levadura, así como una célula eucariota superior, tal como un mamífero.

El polinucleótido que codifica el polipéptido de fusión de E6 y E7 de un virus del papiloma humano, que está contenido en el vector recombinante de la presente invención, se ha sustituido con algunas de las secuencias de ácido nucleico que codifican E6 y E7 para evitar la generación de oncogeneicidad, además de la optimización de codones.

Para el polipéptido de fusión de E6 y E7 de un virus del papiloma humano de la presente invención, la expresión de E6 y E7 en un polipéptido de fusión que se va a usar como inmunógeno con más eficacia induce un efecto antitumoral, en comparación con la expresión individual de E6 y E7 para usar como inmunógeno. Además, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión de E6 y E7 sustituido con un codón que tiene una frecuencia de expresión alta en una célula huésped con más eficacia induce una respuesta inmunitaria específica del antígeno en comparación con el insustituido. Además, con mutaciones de modo que alguna secuencia de ácido nucleico de E6 y E7 está sustituida para evitar oncogeneicidad se puede inducir una respuesta inmunitaria eficaz. En realizaciones específicas, las secuencias de ácido nucleico del polipéptido de fusión E6/E7 que tiene una fusión con los polipéptidos de E6 y E7 del VPH16 optimizados por codones y mutados se representan en la SEC ID Nº 7. Adicionalmente, la coexpresión del polipéptido de fusión E6/E7 y un péptido señal mediante una secuencia señal secretora y el péptido inmunopotenciador aumenta la eficacia de una respuesta inmunitaria específica del antígeno e inhibe el tamaño y la aparición de un tumor en comparación con la expresión de la aparición de un tumor en comparación con la expresión del polipéptido de fusión E6/E7 solo.

El vector recombinante de la presente invención puede comprender un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión en forma adaptada para la expresión de los ácidos nucleicos que codifican la proteína de fusión de la presente invención en la célula huésped. Es decir, el vector recombinante de la presente invención comprende al menos una secuencia reguladora a usar para la expresión, para seleccionar en base a las células huésped y la secuencia reguladora está unida operativamente con una secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. La expresión “unido operativamente a” se refiere a una secuencia de nucleótidos que está unida a la secuencia reguladora para su expresión (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in Vitro o en una célula huésped). Con la expresión “secuencia reguladora” se pretende incluir un promotor, un potenciador y otros elementos reguladores (p. ej., señal de poliadenilación). La secuencia reguladora abarca una que dirige un ácido nucleico deseado que se va a expresar de forma constitutiva y una que dirige un ácido nucleico deseado que se va a expresar únicamente en una célula huésped específica (p. ej., secuencia reguladora específica de tejido) en una serie de células huésped. Un experto en la técnica entenderá que el diseño del vector de expresión puede variar en función de los factores, tales como la selección de las células huésped que se van a transformar, y los niveles de expresión de una proteína deseada. El vector de expresión de la presente invención se puede introducir en una célula huésped para expresar la proteína de fusión.

El vector de la presente invención se puede preparar mediante, por ejemplo, una tecnología de ADN de recombinación estándar y las tecnologías de ADN de recombinación estándar incluyen, por ejemplo, la unión de un extremo romo y un extremo pegajoso, el tratamiento con una enzima de restricción para proporcionar un extremo adecuado, la eliminación de un grupo fosfato mediante el tratamiento con una fosfatasa alcalina para evitar una unió inespecífica, y la unión enzimática de una ADN ligasa de T4. Cada uno de los ADN que codifican péptidos señal, los polipéptidos de fusión de E6 y E7 de un virus del papiloma humano y péptidos inmunopotenciadores, que se obtienen mediante un procedimiento químico, o una tecnología de ingeniería genética, se pueden recombinar con un vector que contiene una secuencia reguladora adecuada para proporcionar el vector de la presente invención. Ek

vector que contiene la secuencia reguladora puede estar disponible comercialmente o se puede preparar, y, en la presente invención se preparó usando pGX10, que es un vector usado para preparar una vacuna como se divulga en la publicación de solicitud de patente coreana nº 2003-47667.

Otra realización más de la presente invención se refiere a un vector recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el polinucleótido E6/E7 de SEC ID Nº 7, que tiene optimización de codones, y la sustitución de ácidos nucleicos que codifican algunos aminoácidos. También se describe la SEC ID Nº 13.

El vector recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 7 o la SEC ID Nº 13 puede comprender además una secuencia señal secretora y una secuencia de aminoácidos que codifica un péptido inmunopotenciador. Ejemplos de la secuencia señal secretora incluyen las secuencias señal secretoras de tPA, VHS, gDs y una hormona de crecimiento, preferentemente secuencias señal secretoras usadas en eucariotas superiores, tales como un mamífero, y, más preferentemente, tPa (activador del plasminógeno tisular). Ejemplos de la secuencia mencionada anteriormente que codifica el péptido inmunopotenciador incluyen secuencias de aminoácidos que codifican un ligando de CD40, un ligando de Flt3, una flagelina y OX40. Al menos un péptido inmunopotenciador se puede seleccionar de la lista anterior de péptidos que se pueden usar y, preferentemente, el péptido se puede seleccionar individualmente para usar. En la presente invención, el ligando de CD40 y el ligando de Flt3 se usan individualmente o en una combinación de los mismos. Además, la secuencia señal secretora y la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido inmunopotenciador están, preferentemente, sustituidos con un codón que tiene una frecuencia de expresión alta en una célula huésped. En realizaciones específicas, el tPa contiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 1, el ligando de Flt3 contiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 15, el ligando de CD40 contiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 17.

En otra realización, el vector recombinante de la presente invención se puede usar para la producción de la proteína de fusión de la presente invención, como vector para transferencia génica para terapia génica o como ingrediente farmacéuticamente activo que se va a administrar a un sujeto tal cual.

Otra realización más de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento y prevención de una enfermedad causada por un virus del papiloma humano en un sujeto (que comprende la proteína de fusión de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En la presente invención, ejemplos del sujeto incluyen un mamífero, tal como un ser humano, un mono y un ratón, pero no se limitan a estos. Ejemplos de las enfermedades causadas por el virus incluyen cáncer cervicouterino, condiloma acuminado y verrugas.

Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables en la composición de la presente invención incluyen lactosa, glucosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma arábiga, alginato, gelatina, fosfato cálcico, silicato cálcico, celulosa, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, talco, estearato de magnesio y aceite mineral. La composición puede incluir adicionalmente un lubricante, un agente humectante, un agente aromatizante, un emulsionante, un conservante y similares.

La composición de la presente invención se puede administrar a un sujeto por cualquiera de diversas vías, incluidas las vías intravenosa, intramuscular, oral, transdérmica, transcutánea, intranasal, intratraqueal y subcutánea, pero no se limitan a las mismas. La composición de la presente invención se puede administrar indirectamente en un sujeto administrando la composición en un cultivo celular in Vitro y cuando se administra a células cultivadas en un cuerpo del sujeto. La composición de la presente invención se puede administrar por vía sistémica o tópica.

La composición de la presente invención puede formularse en formas de dosificación oral, incluyendo, entre otras, gránulos, polvos, soluciones, comprimidos, cápsulas, jarabe seco y similares, o formas de dosificación parenteral incluidas inyecciones. La composición de la presente invención está, preferentemente, en la forma de dosificación de soluciones o inyecciones.

La cantidad eficaz de la proteína de fusión de la presente invención como ingrediente activo puede variar de aproximadamente 0,05 a 500 mg/kg de peso corporal, preferentemente de 0,5 a 50 mg/kg de peso corporal, y se puede administrar en una sola dosis o en dosis divididas. No obstante, debe entenderse que la cantidad del ingrediente activo administrado se determinará a la luz de varios factores relevantes, incluida la afección que se va a tratar, la edad y el peso de un paciente, y la gravedad de los síntomas del paciente y, por tanto, no debe interpretase que la dosis anterior limita el alcance de la invención de ningún modo.

Otra realización más de la presente invención se refiere a la composición farmacéutica de la presente invención para uso en un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad causada por un virus del papiloma humano en un sujeto, que comprende una etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la presente invención.

La composición farmacéutica de la presente invención, la eficacia, el modo de administración y la cantidad de administración de la composición como se ha descrito anteriormente. Ejemplos del sujeto incluyen un mamífero, tal como un ser humano, un mono, un ratón, un cerdo, una vaca y un conejo, pero no se limita a los mismos.

A continuación en el presente documento, la presente invención se describirá con referencia a los ejemplos. No obstante, los ejemplos siguientes se proporcionan únicamente con fines ilustrativos de la presente invención y no

deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente invención.

Modo de la invención

Ejemplo 1: Construcción del ADN de pGX10/tE67Co

Las abreviaturas usadas en los ejemplos de la presente invención tienen los significados siguientes:

“Co” significa una secuencia de ácido nucleico optimizada por codines; "tPa" o "t" significa una secuencia señal secretora de un activador del plasminógeno tisular, “F” significa un ligando de Flt3 y una “L” significa un ligando de CD40.

La secuencia señal secretora optimizada por codones tPa que contiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 1 se sintetizó químicamente. En los extremos se añadieron los sitios EcoRI-KpnI (5') y Eco47III-NheI (3'). El HPV16E6E7 optimizado por codones que contiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 7 se sintetizó químicamente y en los extremos se añadieron los sitios Eco47III-NheI (5') y AscI-XhoI (3') para facilitar la inserción en el vector. Además, a la unión de E6 y E7 se añadió un sitio BamHI. Con el fin de eliminar la propiedad de producir oncogeneicidad, en E6, el codón 63 (cisteína) se sustituyó por glicina y el codón 106 (cisteína) se sustituyó por un codón designado glicina (SEC ID Nº 3). En E7, el codón 24 (cisteína) se sustituyó por glicina y el codón 26 (glutamina) se sustituyó por un codón designado glicina (SEC ID Nº 5). Un vector para la preparación de una vacuna de ADN, pGX10 (en la publicación de solicitud de patente coreana nº 2003-0047667) se trató con las enzimas EcoRI y NheI para unir la secuencia señal secretora sintetizada, tPa, usando una ligasa. El resultante se escindió usando las enzimas NheI y XhoI para unir con HPV16E6E7 usando una ligasa para preparar pGX10/tE67Co.

Ejemplo 2: Construcción del ADN de pGX10/tFCoE67Co

La secuencia señal secretora optimizada por codones tPa que contiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 1 y el Flt3L optimizado por codones que contiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 15 se sintetizaron químicamente en forma ligada. En los extremos se añadieron los sitios KpnI (5') y EcoRV (3') para facilitar la inserción en el vector. El pGX10/tE67Co preparado en el ejemplo 1 se trató con las enzimas KpnI y Eco47III y solo se eliminó la secuencia señal secretora, tPa. Después tFCo se unió usando una ligasa para preparar pGx10/tFCoE67Co.

Ejemplo 3: Construcción del ADN de pGX10/tE67CoLCo

El CD40L optimizado por codones que contiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 17 se sintetizó químicamente. En los extremos se añadieron los sitios AscI (5') y XhoI (3') para facilitar la inserción en el vector. El pGX10/tE67Co preparado en el ejemplo 1 se trató con las enzimas AscI y XhoI y el solo CD40LCo se unió usando una ligasa para preparar pGX10/tE67CoLCo.

Ejemplo 4: Confirmación de los efectos de prevención del cáncer cervicouterino de pGX10/tE67Co, pGX10/tFCo67Co, y pGX10/tE67CoLCo

Para confirmar los efectos de la prevención del cáncer cervicouterino, pGX10/tE67Co, pGx10/tFCoE67Co y pGX10/tE67CoLCo se inyectaron por vía intramuscular en un ratón C57BL/6, respectivamente, dos veces en una cantidad de 50 μg cada cuatro semanas y pGX10, pGX10/E6Co, pGX10/E7Co, pGX10/E67Co, y pGX10/E67 se inyectaron por vía intramuscular en los grupos control en la misma cantidad y con el mismo intervalo. Se extrajo el bazo del ratón a las 6,5 semanas después de la inyección intramuscular inicial y en una placa que se había recubierto con 50 μ de un anticuerpo anti-IFN-γ de ratón (BD Pharmingen, Sandiego, CA) a 3 μg/ml, se colocaron 1 × 106 células junto con IL-2 y los epítopos de linfocitos T CD8 E6 o E7 (E648-57; EVYDFAFRDL, E749-57; RAHYNIVTF, Peptron, Korea). Se cultivaron en un incubador (Forma, Minnesota, EE.UU.) a 37ºC y 5% de CO2 durante 24 horas. La placa se lavó con PBST y, después, se colocaron 50 μl de un anticuerpo de detección de IFN-γ (BD Pharmingen, Sandiego, CA) que tiene una biotina colgante a 2 μg/ml y se cultivó a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 horas. Después, se lavó con PBST y se añadieron 50 μl de estreptavidina-AKP (fosfatasa alcalina) que se habían diluido hasta 1:2.000 y el resultante se cultivó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavó con PBST y después se añadieron 50 μl de la mezcla de 66 μl de NBT (Promega, Madison, WT) y se añadieron 33 μl de BCIP (Promega, Madison, WT) en 10 ml de un tampón fosfato alcalino al resultante para que reaccionaran entre sí. Para obtener una expresión de color transparente mediante la reacción, el producto se introdujo en un incubador a 37 ºC durante aproximadamente 30 minutos y se lavó con agua destilada (AD) y el número de manchas generadas se registró en un lector (véanse la Fig. 1 y 2).

Usando un epítopo de linfocitos T CD8 de E6 y un epítopo de linfocitos T CD8 de E7 se midió una respuesta inmunitaria de linfocitos T específica de E6/E7 usando ELISPOT y, como resultado, se descubrió que pGX10/E67Co inducía un mayor grado de la respuesta inmunitaria específica del antígeno que pGX10/E67, lo que indica que la optimización de codones es más eficaz para potenciar la respuesta inmunitaria específica del antígeno. Además, se descubrió que pGX10/tE67Co inducía un mayor grado de la respuesta inmunitaria de linfocitos T CD8 que pGX10/E67Co, lo que indica que la secuencia señal secretora, tPa, también es eficaz para mejorar la respuesta inmunitaria específica del antígeno Además, se encontró que pGX10/tE67CoLCo inducía un menor grado de la respuesta inmunitaria específica de E6 que pGX10/tE67Co, pero incluía sustancialmente el mismo grado de respuesta específica de E7, en comparación con los otros grupos control, lo que indica que es eficaz para potenciar la respuesta inmunitaria. Se confirmó que pGX10/tFE67Co es más eficaz para la inducción de la respuesta inmunitaria específica de E6 y E7.

A las 6,5 semanas tras la inyección inicial, una célula tumoral que expresa E6 y E7 del VPH16, TC-1, se inyectó por vía subcutánea a un sujeto a 5 × 105 células y se midió el incremento en los volúmenes de la célula tumoral (véase 5 la Fig. 3). En particular, en la respuesta inmunitaria específica de E6-y E7, el producto de fusión, E67Co, indujo un menor grado de respuesta inmunitaria en comparación con cada uno de E6Co y E7Co (véanse las Fig. 1 y 2), pero mostró un efecto anticanceroso más alto en la célula tumoral TC-1 inyectada. Esto indica que el producto de fusión E67 es mejor para el efecto anticanceroso, ya que puede inducir respuestas inmunitarias contra dos antígenos tumorales, E6 y E7, de forma simultánea, en lugar que la respuesta inmunitaria individual contra uno de ellos incluso

10 cuando la respuesta es fuerte. Se observó que el tumor no se producía en el ratón al que se había inyectado pGX10/tE67Co, pGX10/tFCoE67Co y pGX10/tE67CoLCo a los 24 días de la inyección de una célula tumoral, pero el volumen de un tumor aumentó de forma espectacular en el otro grupo control desde el punto de tiempo del día 9 tras la inyección de una célula tumoral. Por tanto, se puede confirmar que pGX10/tE67Co, pGX10/tFCoE67Co, y pGX10/tE67CoLCo tienen una capacidad mayor de prevenir el cáncer cervicouterino.

15 Ejemplo 5: Confirmación de los efectos del tratamiento del cáncer cervicouterino de pGX10/tE67Co, pGX10/tFCoE67Co, pGX10/tE67CoLCo

Para confirmar los efectos del tratamiento del cáncer cervicouterino de pGX10/tE67Co, pGX10/tFCoE67Co, pGX10/tE67CoLCo, las células tumorales TC-1 se inyectaron por vía subcutánea a un ratón C57BL/6 a 5 × 105 células, respectivamente, y se inyectaron por vía intramuscular en una cantidad de 50 μg los días 3 y 8 después de 20 iniciar la inyección de las células tumorales TC-1. A partir del día de la inyección de las células tumorales (día 0), se observó el cambio en los volúmenes de la masa tumoral hasta el día 21 y el día 22 se extrajo el bazo del ratón y se midieron los grados de inducción de una respuesta inmunitaria de linfocitos T CD8 que es específica de los antígenos contra E6 y E7 del mismo modo (ELISPOT) que se ha descrito en el ejemplo 4. En comparación con pGX10 como grupo control, se indujo un mayor grado de la respuesta inmunitaria específica del antígeno en los

25 ratones tratados con pGX10/tE67Co, pGX10/tFCoE67Co y pGX10/tE67CoLCo y, en particular, se midió un grado más alto de la respuesta inmunitaria en el ratón tratado con pGX10/tFCoE67Co, lo que indica que pGX10/tFCoE67Co tiene una eficacia elevada de inducción de una respuesta inmunitaria anticancerosa (véanse las Fig. 4 y 5).

Se encontró que los ratones tratados inmunitariamente con pGX10/tE67Co, pGX10/tFCoE67Co y pGX10/tE67CoLCo contra las células tumorales TC-1 mostraban una reducción significativa en el volumen de un tumor en comparación

30 con el ratón tratado con pGX10, como el grupo control. Además, se encontró que el volumen de un tumor aumentó continuamente hasta el día 12 tras la inyección de las células tumorales y, después de esto, el volumen comenzó a disminuir y, en particular, se encontró que en los ratones tratados inmunitariamente con pGX10/tFCoE67Co y pGX10/tE67CoLCo, el volumen de un tumor fue sustancialmente cero el día 21, lo que indica que tiene un efecto de tratamiento del cáncer cervicouterino (véase la Fig. 6).

Listado de secuencias

<110> POSTECH FOUNDATION Genexine inc.

<120> Composiciones que comprenden polipéptidos del VPH y péptidos inmunopotenciadores para el tratamiento y 5 prevención del cáncer cervicouterino

<130> PCTA9604-245

<160> 18 10

<170> KopatentIn 1.71

<210> 1 15 <211> 75

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> secuencia señal optimizada por codones del activador de plasminógeno tisular

<400> 1 25

<210> 2 30 <211> 75

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

35 <220>

<223> Activador de plasminógeno tisular

<400> 2 40

45 <210> 3

<211> 477

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 3

<210> 4 10 <211> 477

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> E6 de VPH16

<400> 4

<210> 5

<211>: 297 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 5

<210> 6

<211>: 297 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 6

<210> 7

<211>: 789 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> E6E7 de VPH16 mutados y optimizados por codones 10

<400> 7 <210> 8

<211> 789 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> E6E7 de VPH16 10

<400> 8

<210> 9

<211>: 555 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 9

<210> 10

<211>: 555 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> E6 de VPH18 10

<400> 10

<210> 11

<211> 318

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<400> 11

<210> 12 10 <211> 318

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> E7 de VPH18

<400> 12

<210> 13

<211> 888

<212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> E6E7 de VPH18 mutados y optimizados por codones

<400> 13

10 <210> 14

<211> 888

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> E6E7 de VPH18

<400> 14

<210> 15

<211> 474 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> FIt3L optimizado por codones 10

<400> 15 <210> 16

<211> 474 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> FIt3L 10

<400> 16

<210> 17

<211> 732 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CD40L optimizado por codones 10

<400> 17 <210> 18

<211> 732 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CD40L 10

<400> 18

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión, que comprende -un polipéptido de fusión de las proteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano, en el que

(1) la sección de la proteína E6 tiene la secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID Nº 3, y

5 (2) la sección de la proteína E7 tiene la secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID Nº 5, -un péptido señal para secretar el polipéptido hacia fuera de la célula, y -un péptido inmunopotenciador elegido del grupo que consiste en un ligando de CD40 y un ligando de Flt3.
2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el péptido señal es el péptido señal secretor de tPa.
3. La proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, que comprende la secuencia de aminoácidos 10 -codificada por la SEC ID Nº 7.
4.

La proteína de fusión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que -el péptido inmunopotenciador es un ligando de Flt3 codificado por la SEC ID Nº 15, o -el péptido inmunopotenciador es un ligando de CD40 codificado por la SEC ID Nº 17.
5.

Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

15 6. Un vector recombinante que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 5.
7. El vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 6,

-

en el que la secuencia que codifica el polipéptido de fusión de E6 y E7 está optimizado por codones para un mamífero para incrementar la tasa de expresión génica y/o

-

en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido inmunopotenciador está optimizado por 20 codones para un mamífero para incrementar la tasa de expresión génica y/o

-

en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el señal está optimizada por codones para un mamífero para incrementar la tasa de expresión génica.
8. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y

-

la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y/o 25 -el vector recombinante de la reivindicación 6.
9. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8 o una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, -para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia, y/o

-

para su uso en el tratamiento y/o prevención del cáncer cervicouterino. 30