ES2444408T3 - Mediación en la citotoxicidad de células que muestran expresión en superficie de CD44 - Google Patents

Abstract

Anticuerpo monoclonal aislado codificado por un hibridoma depositado en IDAC con el número de acceso 280104-06.

Description

Mediación en la citotoxicidad de células que muestran expresión en superficie de CD44.

La presente invención se refiere al diagnóstico y tratamiento de enfermedades cancerosas, en particular a la mediación en la citotoxicidad de las células tumorales, y más particularmente a la utilización de anticuerpos modificadores de enfermedad cancerosa (AMEC), opcionalmente en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos, como medio para iniciar la respuesta citotóxica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

CD44 en el cáncer: el cultivo de anticuerpos monoclonales contra los glóbulos blancos humanos ha conducido al descubrimiento del antígeno CD44; una glucoproteína de unión a ácido hialurónico (AH) de cadena sencilla expresada en una amplia diversidad de tejidos normales y sobre todos los tipos de células hematopoyéticas. Originalmente se asoció a la activación y direccionamiento específico de los linfocitos. En la actualidad su papel fisiológico putativo incluye también la activación de genes inflamatorios, la modulación del ciclo celular, la inducción de la proliferación celular, la inducción de la diferenciación y el desarrollo, la inducción de la reorganización citoesquelética y la migración celular y la supervivencia/resistencia celular frente a la apoptosis.

En el ser humano, la única copia génica de CD44 se encuentra situada en el brazo corto del cromosoma 11, 11 p13. El gen contiene 19 exones; los primeros 5 son constantes, los siguientes 9 son variantes, los siguientes 3 son constantes y los 2 finales son variantes. El procesamiento diferencial puede conducir a más de 1.000 isoformas diferentes. Sin embargo, en la actualidad se han identificado varias docenas de variantes naturales.

La glucoproteína CD44 estándar consiste de un dominio N-terminal extracelular (que incluye una secuencia líder de 20 aminoácidos (aa), y una región proximal membranal (85 aa)) (270 aa), una región transmembranal (21 aa) y una cola citoplasmática (72 aa). La región extracelular contiene además un módulo de unión en el extremo N-terminal. Esta región presenta una longitud de 92 aa y muestra homología respecto a otras proteínas de unión del AH. Existe una elevada homología entre las formas de ratón y humana de CD44. Las formas variantes de la proteína se insertan en el extremo carboxi-terminal del exón 5 y se localizan extracelularmente al expresarse.

También existe naturalmente una forma soluble sérica de CD44 y puede aparecer a partir de un codón de parada (dentro de la región variable) o por la actividad proteolítica. La activación de las células a partir de una diversidad de estímulos, incluyendo TNF-α, resultando en la liberación del receptor CD44. La liberación del receptor también se ha observado con células tumorales y puede resultar en un incremento de la concentración sérica en el ser humano de CD44 de hasta 10 veces. La concentración sérica elevada de CD44 sugiere malignidad (siendo la excepción el cáncer ovárico).

La forma estándar de CD44 presenta un peso molecular de aproximadamente 37 kD. Las modificaciones posttraduccionales incrementan el peso molecular a 80-90 kD. Entre estas modificaciones se incluyen glucosilaciones amino-terminales N-ligadas al dominio extracelular en los residuos de asparagina, glucosilaciones O-ligadas en los residuos de serina/treonina en el extremo carboxi-terminal del dominio extracelular y adiciones de glucosaminoglicano. Las variantes de procesamiento presentan un tamaño comprendido en el intervalo de entre 80 y 250 kD.

El AH, un polisacárido situado sobre la matriz extracelular (MEC) en los mamíferos, se cree que es el ligando primario de CD44. Sin embargo, se ha encontrado que CD44 se une a proteínas tales como colágeno, fibronectina, laminina, etc. Aparentemente existe una correlación entre la unión de AH y la glucosilación. El antígeno CD44 inactiva (no se une al AH) presenta los niveles más altos de glucosilación, CD44 activa (se une a AH), los más bajos, mientras que CD44 inducible (no se une o se une débilmente a AH a menos que sea activado por citoquinas, anticuerpos monoclonales, factores de crecimiento, etc.) presenta niveles de glcuosilación en algún punto entre las formas activas e inactivas.

CD44 puede mediar algunas de sus funciones a través de rutas de transducción de señales que dependen de la interacción de la célula, el estímulo y el medio ambiente. Entre algunas de estas rutas se incluyen la cascada de señalización de NFκB (que participa en la respuesta inflamatoria), la ruta de transducción de señales Ras-MAPK (que participa en la activación del ciclado y proliferación celulares), la familia de Rho de proteínas (que participa en la reorganización citoesquelética y en la migración celular) y la ruta de señalización relacionada con PI3-K (relacionada con la supervivencia celular). Todas las funciones anteriormente indicadas se encuentran estrechamente asociadas al inicio y progresión de las enfermedades tumorales. También se ha asociado CD44 a la participación en alguna función en el cáncer a través de una diversidad de mecanismos adicionales. Entre ellos se incluyen la presentación de factores de crecimiento, quimoquinas y citoquinas por proteoglicanos de superficie celular presentes sobre la superficie celular de CD44 a receptores que participan en una neoplasia maligna.

Además, la degradación intracelular del AH por hialuronidasas lisosómicas tras la internalización del complejo CD44-AH puede incrementar potencialmente la probabilidad de invasividad tumoral e inducción de la angiogénesis a través del MEC. Además, la transmisión de señales de supervivencia o apoptóticas se ha demostrado que se produce a través del receptor de CD44 estándar o variable. También se ha sugerido que CD44 participa en la diferenciación y migración celulares. Muchos, o todos, dichos mecanismos dependen del medio y de la célula y varios dan lugar a resultados variables. Por lo tanto, se requiere más investigación antes de que puedan extraerse conclusiones.

Con el fin de validar un potencial papel funcional de CD44 en el cáncer, se han realizado estudios de expresión de CD44 para determinar si la expresión diferencial del receptor se correlaciona con la progresión de la enfermeadd. Sin embargo, se han obtenido resultados inconsistentes en una mayoría de tipos tumorales y ello probablemente se debe a una combinación de diferencias entre reactivos, técnicas, clasificación patológica y diferencias entre tipos celulares de los diferentes investigadores. El carcinoma de células renales y el linfoma no de Hodgkin aparentemente es la excepción en el sentido de que los pacientes con tumores de elevada expresión de CD44 consistentemente presentaban tiempos de supervivencia más cortos que sus contrapartidas de expresión baja o nula de CD44.

Debido a su asociación con el cáncer, CD44 ha sido la diana del desarrollo de terapéuticos anticáncer. Todavía existe controversia sobre si resultan necesarias las formas estándares o variantes de CD44 para la progresión tumoral. Existen datos animales in vivo que apoyan ambos puntos de vista y nuevamente podría depender del tipo tumoral e incluso del tipo celular. Entre los diferentes enfoques terapéuticos se incluyen la inyección de proteínas CD44 solubles, hialuronano ADNc sintasa, hialuronidasa, la utilización de cadena antisentido de CD44 y anticuerpos específicos de CD44. Cada enfoque ha conducido a cierto éxito, proporcionando de esta manera apoyo a los terapéuticos anti-CD44 del cáncer.

Se han generado experimentalmente anticuerpos monoclonales específicos de CD44 tanto variantes como estándares, aunque en su mayor parte estos anticuerpos no presentan actividad biológica intrínseca; por el contrario, se unen específicamente al tipo de CD44 que reconocen. Sin embargo, existen algunos que se encuentran activos in vitro o in vivo, aunque generalmente no en ambos casos. Se ha demostrado que varios anticuerpos anti-CD44 median en sucesos celulares. Por ejemplo, el anticuerpo murino A3D8, dirigido contra la forma estándar del antígeno Luterano CD44 de los eritrocitos humanos, se ha demostrado que incrementa la activación de las células T mediada por CDR2 (anticuerpo 9-1) y por CD3 (anticuerpo OKT3); otro anticuerpo anti-CD44 presenta efectos similares. A3D8 también indujo la liberación de IL-1 por monocitos y la liberación de IL-2 por linfocitos T. Resulta interesante que la utilización de A3D8 conjuntamente con fármacos tales como la daunorrubicina, la mitoxantrona y el etopósido inhibió la inducción de la apoptosis en células HL60 y NB4 de LMA al anular la generación del segundo mensajero ceramida. El anticuerpo J173, que no presenta actividad intrínseca y se dirige contra un epítopo similar de los CD44, no inhibió la apoptosis inducida farmacológicamente. El anticuerpo NIH44-1, dirigido contra formas de 85-110 kD y 200 kD de CD44, incrementó la proliferación de las células T a través de una ruta que los autores conjeturan es de entrecruzamiento o agregación de CD44. Conjuntamente no existe evidencia de que anticuerpos tales como los anteriormente indicados resulten adecuados para la utilización como terapéuticos del cáncer, ya que no se dirigen contra el cáncer (por ejemplo no activan linfocitos), inducen la proliferación celular o, utilizados con agentes citotóxicos, inhiben la muerte inducida farmacológicamente de las células de cáncer.

Se han descrito varios anticuerpos anti-CD44 que demuestran efectos antitumorales in vivo. El anticuerpo 1.1ASML, una IgG1 de ratón con diana en la variante v6 de CD44, se ha demostrado que reduce las metástasis en nódulos linfáticos y pulmones del adenocarcinoma pancreático de rata BSp73ASML. La supervivencia de los animales tratados concomitantemente fue incrementada. El anticuerpo sólo resultó eficaz administrado antes de la colonización de los nódulos linfáticos y se planteó que interfería en la proliferación celular en el nódulo linfático. No existía citotoxicidad directa del anticuerpo sobre las células tumorales in vitro y el anticuerpo no incrementada la citotoxicidad mediada por el complemento o la función de las células efectoras inmunológicas. No se ha descrito utilidad del anticuerpo contra las células humanas.

Breyer et al. han descrito la utilización de un anticuerpo disponible comercialmente contra CD44 para interrumpir la progresión de un glioblastoma de rata implantado ortotópicamente. La línea celular de glioblastoma de rata C6 se implantó en el lóbulo frontal y tras 1 semanas se administraron en las ratas 3 tratamiento con anticuerpo mediante inyección intracerebral. Las ratas tratadas mostraron un crecimiento tumoral reducido y un peso corporal más alto que las ratas tratadas con tampón o con control de isotipo. El anticuerpo fue capaz de inhibir la adhesión de las células in vitro a cubreobjetos recubiertos con componentes de la matriz extracelular, pero no presentó ningún efecto citotóxico directo sobre las células. Este anticuerpo no se sometió a ensayo contra células humanas.

Se llevó a cabo un estudio que comparaba la eficacia de un anticuerpo contra los CD44 (IM-7.8.1) y un anticuerpo contra CD44v10 (K926). La línea de melanoma murino altamente metastásica B16F10, que expresa ambas isoformas de CD44, se implantó intravenosamente en ratones. Tras 2 días, se administraron anticuerpos cada tercer día durante todo el estudio. Ambos anticuerpos causaron una reducción significativa de más de 50% del número de metástasis pulmonares; no se observó diferencia significativa entre la eficacia de los dos anticuerpos. El anticuerpo no afectó a la proliferación in vitro, y los autores, Zawadzki et al., conjeturaron que la inhibición del crecimiento tumoral se debía a que el anticuerpo bloqueaba la interacción de CD44 con su ligando. En otro estudio con IM-7.8.1, Zahalka et al. demostraron que el anticuerpo y su fragmento F(ab')2 eran capaces de bloquear la infiltración en nódulos linfáticos por el linfoma LB murino de las células T. Esto proporcionaba un beneficio de supervivencia significativo a los ratones. Wallach-Dayan et al. demostraron que la transfección de LB-RT de linfoma murino, que no forman espontáneamente tumores, con CD44v4-v10 proporcionaba la capacidad de formar tumores. La administración de IM-7.8.1 redujo el tamaño tumoral de las células transfectadas implantadas en comparación con el anticuerpo de control de isotipo. Ninguno de estos estudios demostró utilidad humana de este anticuerpo.

GKW.A3, una IgG2a de ratón, es específico de CD44 humano y evita la formación y las metástasis de un xenoinjerto de melanoma humano en ratones SCID. El anticuerpo se mezcló con la línea celular humana metastásica SMMU-2, y después se inyectó subcutáneamente. Se continuaron los tratamientos durante las 3 semanas siguientes. Tras 4 semanas, sólo 1 de los 10 ratones desarrolló un tumor en el sitio de inyección, en comparación con 100 por cién de los animales no tratados. Los fragmentos F(ab')2 del anticuerpo demostraron la misma inhibición de la formación tumoral, sugiriendo que el mecanismo de acción no dependía de citotoxicidad celular dependiente del complemento

o dependiente de anticuerpos. En el caso de que las células tumorales se inyectasen una semana antes de la primera inyección de anticuerpos, el 80 por ciento de los animales desarrolaba tumores en el sitio primario. Sin embargo, se observó que el tiempo de supervivencia todavía se incrementaba significativamente. Aunque la administración retardada de anticuerpo no presentó ningún efecto sobre la formación de tumor primario, impidió por completo las metástasis en pulmón, riñón, glándula adrenal, hígado y peritoneal que se encontraban presentes en los animales no tratados. Este anticuerpo no presenta ninguna citotoxicidad directa sobre la línea celular in vitro ni interfiere con la proliferación de las células SMMU-2 y aparentemente presenta su efecto principal sobre la formación tumoral mediante sus efectos sobre las metástasis o el crecimiento. Otra característica notable de este anticuerpo es que reconocía todas las isoformas de CD44, lo que sugiere limitadas posibilidades para el uso terapéutico.

Strobel et al. describen la utilización de un anticuerpo anti-CD44 (clón 515) para inhibir la implantación peritoneal de células de cáncer ovárico humano en un modelo de xenoinjerto en el ratón. La línea celular de ovario humana 36M2 fue implantada intraperitonealmente en ratones en presencia del anticuerpo anti-CD44 o anticuerpo de control y seguidamente se administraron tratamientos durante los siguientes 20 días. Tras 5 semanas, se observaron significativamente menos nódulos en la cavidad peritoneal en el grupo tratado con anticuerpos. Los nódulos de tanto el grupo tratado con anti-CD44 como el de tratamiento de control presentaban el mismo tamaño, sugiriendo que tras la implantación de las células, el anticuerpo no presentaba ningún efecto sobre el crecimiento tumoral. Al implantar las células subcutáneamente, tampoco se produjo ningún efecto sobre el crecimiento tumoral, indicando que el anticuerpo mismo no presentaba un efecto antiproliferativo o citotóxico. Además, no se observó ningún efecto del anticuerpo sobre el crecimiento celular in vitro.

VFF-18, también denominado BIWA 1, es un anticuerpo de alta afinidad de la variante v6 de CD44 específico para la región 360-370 del polipéptido. Este anticuerpo ha sido utilizado como conjugado marcado con tecnecio-99m en un ensayo clínico de fase 1 en 12 pacientes. El anticuerpo se sometió a ensayo para seguridad y potencial de reconocimiento celular en pacientes con carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas. Cuarenta horas después de la inyección, el 14 por ciento de la dosis inyectaba fue incorporada por el tumor, con una acumulación mínima en otros órganos, incluyendo el riñón, el bazo y la médula ósea. La unión altamente selectiva al tumor sugiere un papel de este anticuerpo en radioinmunoterapia, aunque la afinidad excepcionalmente elevada de este anticuerpo evitó la penetración en capas más profundas del tumor. Limita adicionalmente la aplicación de BIWA I la inmunogenicidad del anticuerpo murino (11 de 12 pacientes desarrollaron anticuerpo humanos antiratón (HAMA)), la acumulación heterogénea en todo el tumor y la formación de complejos solubles de CD44 y anticuerpo. El documento nº WO 02/094879 da a conocer una versión humanizada de VFF18 diseñada para superar la respuesta HAMA, denominada BIWA 4. Se ha encontrado que BIWA 4 presenta una afinidad de unión a antígeno significativamente más baja que el anticuerpo VFF18 parental. Inesperadamene, el anticuerpo BIWA 4 de afinidad más baja presentaba características de incorporación tumoral superiores que el anticuerpo humanizado VFF-18 BIWA 8 de afinidad más alta. Los anticuerpos BIWA 4 tanto marcados con tecnecio-99m como con renio-186 se evaluaron en un ensayo clínico de fase 1 con 33 pacientes con el fin de determinar la seguridad, tolerancia, acumulación tumoral y dosis tolerada máxima en el caso de BIWA 4 marcado con 186Re. Aparentemente se producía una incorporación relacionada con tumor de BIWA 4 marcado con 99mTc. No se observaron respuestas tumorales con todas las dosis de BIWA 4 marcado con 186Re, aunque varios presentaban enfemedad estable; la toxicidad limitante de dosis se producía a 60 mCi/m2. Se observó una tasa en porcentaje de 50-65 de sucesos adversos en 12 de los 33 pacientes, que se consideró que presentaban sucesos adversos graves (trombocitopenia, leucopenia y fiebre) y de entre ellos 6, todos tratados con BIWA 4 marcado con 186Re, murieron durante el curso del tratamiento o el seguimiento debido a la progresión de la enfermedad. Dos pacientes desarrollaron anticuerpos humanos antihumanos (HAHA). Se llevó a cabo un ensayo de escalado de dosis de fase I de BIWA 4 marcado con 186Re en 20 pacientes. Se observaron mucositis oral y trombocitopenia y leucocitopenia limitadoras de dosis; un paciente desarrolló una respuesta HAHA. Se observó enfermedad estable en 5 pacientes tratados con la dosis más alta, de 60 mCi/m2. Aunque considerado aceptable tanto en seguridad como tolerabilidad para la eficacia conseguida, estos estudios presentaban tasas más altas de sucesos adversos que otras terapias biológicas conjugadas no radioisotópicas en estudios clínicos. La solicitud de patente US nº US 2003/0103985 da a conocer una versión humanizada de VFF-18 conjugada con un maitansinoide, denominada BIW 11, para la utilización en la terapia tumoral. Un anticuerpo VFF 18 humanizado, BIWA 4, conjugado con una toxina, es decir BIWA 1, se encontrado que presenta efectos antitumorales significativos en modelos de ratón de carcinoma epidermoide humano de la vulva, carcinoma de células escamosas de la faringe o carcinoma de mama. La versión no conjugada, BIWA 4, no presentaba efectos antitumorales y la versión conjugada, BIWA 1, no presenta evidencia de seguridad ni eficacia en el ser humano.

Mab U36 es un anticuerpo IgG1 monoclonal murino generado mediante inmunización con células de carcinoma hipofaríngeo humano UM-SCC-22B y selección para cáncer y especificidad de tejido. La caracterización de antígenos mediante clonación de ADNc y el análisis de secuencias identificó el dominio v6 de la variante de procesamiento de CD44 específica de queratinocitos llamada epicano como diana de Mab U36. Los estudios inmunohistoquímicos muestran que el epítopo se restringe a la membrana celular. Además, Mab U36 marcó el 94 por ciento de los carcinomas de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) fuertemente, y dentro de estos tumores la tinción celular era uniforme. Un estudio de 10 pacientes con Mab U36 marcado con 99mTc demostró la acumulación selectiva del anticuerpo de cánceres HNSCC (20,4 +/-12,4 por ciento de la dosis inyectada/kg a los 2 días); no se informó de efectos adversos aunque dos pacientes desarrollaron HAMA. En un estudio de Mab U36 murino radio-yodado se produjeron 3 casos de HAMA en 18 pacientes y la incorporación homogénea selectiva en HNSCC. Con el fin de reducir la antigenicidad de Mab U36 y reducir la tasa de HAMA, se construyó un anticuerpo quimérico. Ni el Mab U36 murino quimérico ni el original presentaba actividad de ADCC. No existe evidencia de actividad funcional nativa de Mab U36. Se utilizó Mab U36 quimérico marcado con 186Re para determinar la utilidad de Mab U36 como agente terapéutico. En este ensayo de escalado dosis de fase 1, 13 pacientes recibieron una dosis exploratoria de Mab U36 quimérico marcado con 99mTc, seguido de Mab U36 quimérico marcado con 186Re. No se produjeron sucesos adversos agudos, aunque tras el tratamiento se observó mielotoxicidad limitadora de dosis (1,5 GBq/m2) en 2 de 3 pacientes y trombocitopenia en un paciente tratado con la dosis tolerada máxima (1,0 GBq/m2). Aunque se produjeron algunos efectos sobre el tamaño tumoral, estos efectos no satisfacían los criterios de respuesta objetiva al tratamiento. Un estudio adicional de Mab U36 quimérico marcado con 186Re utilizó una estrategia de reinfusión de sangre completa estimulada con factor estimulante de colonias de granulocitos para doblar la actividad tolerada máxima a 2,8 Gy. En este estudio de nueve pacientes con diversos tumores de cabeza y cuello, 3 requirieron transfusiones para anemia inducida por fármaco. Otra toxicidad observada incluía mielotoxicidad de grado 3 y mucositis de grado 2. No se informó de respuestas tumorales objetivas, aunque se alcanzó enfermedad estable durante 3 a 5 meses en 5 pacientes. De esta manera, se puede observar que, aunque Mab U36 es un anticuerpo altamente específico, la desventaja de requerir un radioinmunoconjugado para conseguir efectos anticáncer limita su utilidad debido a la toxicidad asociada a la terapia en relación a los efectos clínicos conseguidos.

En resumen, se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales CD44v6 (1.1ASML) y CD44v10 (K926) reducen la actividad metastásica en ratas en las que se ha inyectado un adenocarcinoma pancreático metastásico o ratones en los que se ha inyectado melanoma maligno, respectivamente. Otro anticuerpo anti-CD44v6 (VFF-18 y sus derivados) sólo se ha demostrado que presente efectos antitumorales en conjugación con un maitansinoide o un isótopo radioactivo. También se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales anti-CD44 estándares suprimen la progresión intracerebral por glioblastoma de rata (anti-CD44), la invasión de nódulos linfáticos por linfoma de células T (IM-7.8.1), así como la inhibición de la implantación de una línea celular de cáncer ovárico humano en ratones desnudos (clón 515), la metástasis pulmonar de una línea celular de melanoma de ratón (IM-7.8.1) y la metástasis de una línea celular de melanoma humano en ratones SCID (GKW.A3). El anticuerpo Mab U36 anti-CD44v6 conjugado con isótopo radioactivo y sus derivados presentaban actividad antitumoral en ensayos clínicos que se vieron acompañados de toxicidad significativa. Estos resultados, aunque son estimulantes y apoyan el desarrollo de anticuerpos monoclonales anti-CD44 como potenciales terapéuticos del cáncer, demuestran una eficacia, seguridad

o aplicabilidad limitadas a los cánceres humanos.

De esta manera, en el caso de que se aislase una composición de anticuerpos que mediase en la citotoxicidad de las células cancerosas como función de su nivel de atracción a la expresión en la superficie celular de CD44 sobre dichas células, se haría realidad un procedimiento diagnóstico y terapéutico valioso.

Anticuerpos monoclonales como terapia del cáncer: Cada individuo que se presenta con cáncer es único y presenta un cáncer que es tan diferente de otros cánceres como la identidad misma de la persona. A pesar de ello, la terapia actual trata a todos los pacientes con el mismo tipo de cáncer y en el mismo estadio de la misma manera. Por lo menos en 30% de estos pacientes fracasará la terapia de primera línea, conduciendo de esta manera a rondas adicionales de tratamiento y una probabilidad incrementada de fracaso del tratamiento, metástasis y, finalmente, la muerte. Un enfoque superior al tratamiento sería la personalización de la terapia al individuo particular. La única terapia actual que se presta a la personalización es la cirugía. La quimioterapia y el tratamiento de radiación no pueden ajustarse al paciente y la cirugía por sí misma en la mayoría de casos resulta inadecuada para curar.

Con la aparición de los anticuerpos monoclonales, la posibilidad de desarrollar métodos para personalizar la terapia se ha vuelto real, ya que cada anticuerpo puede dirigirse a un único epítopo. Además, resulta posible producir una combinación de anticuerpos que se dirija a la constelación de epítopos que definen de manera única el tumor de un individuo particular.

Tras identificar que una diferencia significativa entre las células cancerosas y normales es que las células cancerosas contienen antígenos que son específicos de las células transformadas, la comunidad científica ha mantenido desde hace mucho tiempo que pueden diseñarse anticuerpos monoclonales con diana específicamente en células transformadas mediante la unión específicamente a estos antígenos del cáncer; de esta manera, ha surgido la creencia de que los anticuerpos monoclonales pueden servir como "Balas mágicas" para eliminar las células de cáncer. Sin embargo, ahora se reconoce ampliamente que ningún anticuerpo monoclonal individual puede servir en todos los casos de cáncer y que los anticuerpos monoclonales pueden desplegarse, como clase, en forma de tratamientos dirigidos del cáncer. Se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales aislados según las enseñanzas de la presente invención dada a conocer modifican el proceso de la enfermedad cancerosa de una manera que resulta beneficiosa para el paciente, por ejemplo reduciendo la carga tumoral, y se denominan de diversas maneras en la presente memoria como anticuerpos modificadores de la enfermedad cancerosa (AMEC) o anticuerpos "anticáncer".

En la actualidad, el paciente de cáncer habitualmente presenta pocas opciones de tratamiento. El enfoque reglamentado a la terapia del cáncer ha producido mejoras en las tasas globales de supervivencia y morbilidad. Sin embargo, al individuo particular estas estadísticas mejoradas no se correlacionan necesariamente con una mejora de su situación personal.

De esta manera, en el caso de que se proporcionase una metodología que permitiese al médico tratar cada tumor independientemente de otros pacientes en la misma cohorte, podría conseguirse un enfoque único de personalización de la terapia a únicamente ese paciente individual. Dicho curso de terapia idealmente incrementaría la tasa de curación y produciría mejores resultados, satisfaciendo de esta manera una necesidad antigua.

Históricamente se han utilizado anticuerpos policlonales con éxito limitado en el tratamiento de los cánceres humanos. Los linfomas y leucemias han sido tratados con plasma humano, pero se han observado pocas remisiones

o respuestas prolongadas. Además, existe una falta de reproducibilidad y ningún beneficio adicional en comparación con la quimioterapia. Algunos tumores sólidos, tales como los cánceres de mama, los melanomas y los carcinomas de células renales, también han sido tratados con sangre humana, suero de chimpancé, plasma humano y suero de caballo con resultados impredecibles e ineficaces.

Se han realizado muchos ensayos clínicos de anticuerpos monoclonales para los tumores sólidos. En los años 1980 se realizaron por lo menos cuatro ensayos clínicos del cáncer de mama humano que produjeron únicamente un respondedor de por lo menos 47 pacientes utilizando anticuerpos contra antígenos específicos o basados en la selectividad de tejidos. No fue hasta 1998 que se realizó un ensayo clínico con éxito utilizando un anticuerpo antiHer2/neu humanizado (Herceptin®) en combinación con cisplatino. En este ensayo se evaluaron 37 pacientes para respuestas, de entre los que aproximadamente un cuarto presentó una tasa de respuesta parcial y otro cuarto presentó una progresión menor de la enfermedad o enfermedad estable. La mediana del tiempo hasta la progresión entre los respondedores fue de 8,4 meses con una mediana de la duración de la respuesta de 5,3 meses.

Herceptin® fue aprobada en 1998 para el uso de primera línea en combinación con Taxol®. Los resultados del ensayo clínico demostraron un incremento de la mediana del tiempo hasta la progresión de la enfermedad para aquellos que recibieron terapia de anticuerpos más Taxol® (6,9 meses) en comparación con los que recibieron sólo Taxol® (3,0 meses). También se produjo un ligero incremento de la mediana de supervivencia; 22 frente a 18 meses para el brazo de tratamiento de Herceptin® más Taxol® frente al brazo de tratamiento de sólo Taxol®. Además, se produjo un incremento del número de tanto respondedores completos (8 frente a 2 por ciento) y respondedores parciales (34 frente a 15 por ciento) en el grupo de combinación de anticuerpo más Taxol® en comparación con Taxol® solo. Sin embargo, el tratamiento con Herceptin® y Taxol® condujo a una incidencia más alta de cardiotoxicidad en comparación con el tratamiento de Taxol® solo (13 frente a 1 por ciento, respectivamente). Además, la terapia de Herceptin® sólo resultó eficaz para pacientes que sobreexpresan (determinado mediante análisis de inmunohistoquímica (IHC)), el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (Her2/neu), un receptor que actualmente no presenta ninguna función conocida o ligando biológicamente importante; aproximadamente 25 por ciento de los pacientes que presentan cáncer de mama metastásico. Por lo tanto, existe una gran necesidad no satisfecha para los pacientes con cáncer de mama. Incluso los que pueden beneficiarse del tratamiento de Herceptin® todavía requerirían quimioterapia y en consecuencia todavía tendrían que sufrir, por lo menos en cierto grado, los efectos secundarios de este tipo de tratamiento.

Los ensayos clínicos que investigan el cáncer colorrectal implicaban anticuerpos contra dianas tanto glucoproteínas como glucolipídicas. Algunos anticuerpos tales como 17-1A, que presenta cierta especificidad para los adenocarcinomas, han sido sometidos a ensayos clínicos de fase 2 en más de 60 pacientes, presentando sólo 1 paciente una respuesta parcial. En otros ensayos, la utilización de 17-1A produjo sólo 1 respuesta completa y 2 respuestas mínimas entre 52 pacientes en protocolos que utilizaban ciclofosfamida adicionalmente. Hasta hoy, los ensayos clínicos de fase III de 17-1a no han demostrado una mayor eficacia como terapia adyuvante para el cáncer de colon de estadio III. La utilización de un anticuerpo monoclonal murino humanizado inicialmente aprobado para la obtención de imágenes tampoco produjo regresión tumoral.

Sólo recientemente se han obtenido resultados positivos de estudios clínicos del cáncer colorrectal utilizando anticuerpos monoclonales. En 2004, ERBITUX® fue aprobado para el tratamiento de segunda línea de pacientes con cáncer colorrectal metastásico que expresaba EGFR que eran refractarios a la quimioterapia basada en irinotecán. Los resultados de tanto un estudio clínico de fase II de dos brazos como de un estudio de un solo brazo demostró que ERBITUX® en combinación con irinotecán presentó una tasa de respuesta de 23 y 15 por ciento, respectivamente, con una mediana de tiempo hasta la progresión de la enfermedad de 4,1 y 6,5 meses, respectivamente. Los resultados de tanto un estudio clínico de fase II de dos brazos como de otro estudio de un solo brazo demostraron que el tratamiento con ERBITUX® por sí solo resultaba en tasas de respuesta de 11 y 9 por ciento, respectivamente, con una mediana de tiempo hasta la progresión de la enfermedad de 1,5 y 4,2 meses, respectivamente.

En consecuencia, tanto en Suiza como en Estados Unidos, el tratamiento de ERBITUX® en combinación con irinotecán, y en los Estados Unidos el tratamiento de ERBITUX® solo, ha sido aprobado como tratamiento de segunda línea de los pacientes de cáncer de colon en los que ha fracasado la terapia de primera línea de irinotecán. Por lo tanto, al igual que Herceptin®, el tratamiento en Suiza sólo está aprobado como combinación de anticuerpos monoclonales y quimioterapia. Además, el tratamiento tanto en Suiza como en US ha sido aprobado sólo para pacientes como terapia de segunda línea. Además, en 2004, AVASTIN® fue aprobado para el uso en combinación con quimioterapia intravenosa a base de 5-fluorouracilo como tratamiento de primera línea del cáncer colorrectal metastásico. Los resultados del estudio clínico de fase III demostraron una prolongación de la mediana de supervivencia de los pacientes tratados con AVASTIN® más 5-fluorouracilo en comparación con los pacientes tratados con 5-fluorouracilo solo (20 meses frente a 16 meses, respectivamente). Sin embargo, nuevamente al igual que Herceptin® y ERBITUX®, el tratamiento sólo está aprobado como combinación de anticuerpos monoclonales y quimioterapia.

Además siguen obteniéndose resultados pobres para el cáncer de pulmón, cerebro, ovario, páncreas, próstata y estómago. Los resultados recientes más prometedores para el cáncer de pulmón de células no pequeñas procede de un ensayo clínico de fase II en el que el tratamiento incluía un anticuerpo monoclonal (SGN-15, dox-BR96, antisialil-LeX) conjugado con el fármaco de eliminación celular doxorrubicina en combinación con el agente quimioterapéutico Taxotere. El Taxotere es la única quimioterapia aprobada por la FDA para el tratamiento de segunda línea del cáncer de pulmón. Los datos iniciales apuntan a una superviviencia global mejorada en comparación con Taxotere solo. De los 62 pacientes que fueron incluidos en el estudio, dos tercios recibieron SGN15 en combinación con Taxotere, mientras que el tercio restante recibió Taxotere solo. Para los pacientes que recibieron SGN-15 en combinación con Taxotere, la mediana de supervivencia global fue de 7,3 meses, comparado con 5,9 meses para los pacientes que recibieron Taxotere solo. La supervivencia global al año y a los 18 meses fue de 29 y 18 por ciento, respectivamente, para los pacientes que recibieron SGN-15 más Taxotere, comparado con 24 y 8 por ciento, respectivamente, para los pacientes que recibieron Taxotere solo. Se han planificado ensayos clínicos adicionales.

Preclínicamente ha habido cierto éxito limitado en la utilización de anticuerpos monoclonales para el melanoma. Muy pocos de estos anticuerpos han alcanzado los ensayos clínicos y hasta hoy ninguno ha sido aprobado o ha demostrado resultados favorables en ensayos clínicos de fase III.

El descubrimiento de nuevos fármacos para tratar las enfermedades resulta dificultado por la no identificación de las dianas relevantes de entre los productos de los 30.000 genes conocidos que inequívocamente contribuyen a la patogénesis de la enfermedad. En la investigación oncológica, las potenciales dianas farmacológicas con frecuencia se seleccionan simplemente por el hecho de que se sobreexpresan en las células tumorales. Las dianas identificadas de esta manera seguidamente se criban para la interacción con una multitud de compuestos. En el caso de las potenciales terapias de anticuerpos, estos compuestos candidatos habitualmente se derivan de métodos tradicionales de generación de anticuerpos monoclonales según los principios fundamentales establecidos por Kohler y Milstein (Nature 256:495-497, 1975; Kohler y Milstein). Se recogieron células de bazo de ratones inmunizados con antígeno (por ejemplo células completas, fracciones celulares, antígeno purificado) y se fusionaron con parejas de hibridoma inmortalizado. Los hibridomas resultantes se cribaron y se seleccionaron para la secreción de anticuerpos que se unían con mayor avidez a la diana. Se han producido muchos anticuerpos terapéuticos y diagnósticos dirigidos contra células de cáncer, incluyendo Herceptin® y RITUXIMAB, utilizando dichos métodos y se han seleccionado basándose en su afinidad. Las desventajas de esta estrategia son dos. En primer lugar, la elección de dianas apropiadas para la unión del anticuerpo terapéutico o diagnóstico se ve limitada por la escasez de conocimientos en torno a los procesos carcinogénicos específicos de tejido y los métodos excesivamente simples que resultan, tal como la selección a partir de la sobreexpresión, por la que se identifican estas dianas. En segundo lugar, la premisa de que la molécula del fármaco que se une al receptor con mayor afinidad habitualmente presenta la probabilidad más alta de iniciar o inhibir una señal, lo que no siempre es el caso.

A pesar de que se han realizado ciertos avances en el tratamiento de los cánceres de mama y de colon, la identificación y desarrollo de terapias de anticuerpos eficaces, en forma de agentes individuales o de cotratamientos, ha resultado inadecuada para todos los tipos de cáncer.

Patentes anteriores:

La patente US nº 5.750.102 da a conocer un procedimiento en el que las células del tumor de un paciente se transfectan con genes del CHM, que pueden clonarse a partir de células o tejido del paciente. A continuación, estas células transfectadas son utilizadas para vacunar al paciente.

La patente US nº 4.861.581 da a conocer un procedimiento que comprende las etapas de obtener anticuerpos monoclonales que son específicos de un componente celular interno de las células neoplásicas y normales del mamífero pero no de componentes externos, marcar el anticuerpo monoclonal, poner en contacto el anticuerpo marcado con tejido de un mamífero que ha recibido terapia para eliminar las células neoplásicas, y determinar la efectividad de la terapia a partir de la medición de la unión del anticuerpo marcado al componente celular interno de las células neoplásicas en degeneración. En la preparación de los anticuerpos dirigidos contra antígenos intracelulares humanos, el cesionario de la patente reconoce que las células malignas representan una fuente conveniente de dichos antígenos.

La patente US nº 5.171.665 proporciona un nuevo anticuerpo y un método para su producción. Concretamente, la patente enseña la formación de un anticuerpo monoclonal que presenta la propiedad de unirse fuertemente a una proteína antigénica asociada a los tumores humanos, por ejemplo los del colon y de pulmón, uniéndose a las células normales en un grado mucho menor.

La patente US nº 5.484.596 proporciona un método de terapia del cáncer que comprende extirpar quirúrgicamente tejido tumoral de un paciente humano de cáncer, tratar el tejido tumoral para obtener células tumorales, irradiar las células tumorales para que sean viables pero no tumorigénicas y utilizar estas células para preparar una vacuna para que el paciente sea capaz de inhibir la recurrencia del tumor primario, inhibiendo simultáneamente las metástasis. La patente enseña el desarrollo de anticuerpos monoclonales, que son reactivos con antígenos de superficie de las células tumorales. Tal como se indica en la col. 4, líneas 45 y siguientes, el cesionario de la patente utiliza células tumorales autóctonas en el desarrollo de inmunoterapia específica activa expresante de anticuerpos monoclonales en neoplasias humanas.

La patente US nº 5.693.763 enseña una glucoproteína antigénica característica de los carcinomas humanos y que no depende del tejido epitelial de origen.

La patente US nº 5.783.186 se refiere a anticuerpos anti-Her2, que indcen apoptosis en las células expresantes de Her2, a líneas celulares de hibridoma productoras de los anticuerpos, a métodos de tratamiento del cáncer que utilizan los anticuerpos y a composiciones farmacéuticas que incluyen dichos anticuerpos.

La patente US nº 5.849.876 describe nuevas líneas celulares de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales contra antígenos mucina purificados a partir de fuentes de tejido tumoral y no tumoral.

La patente US nº 5.869.268 se refiere a un método para generar un linfocito humano productor de un anticuerpo específico de un antígeno deseado, a un método para producir un anticuerpo monoclonal, así como a los anticuerpos monoclonales producidos mediante el método. La patente se refiere particularmente a la producción de un anticuerpo monoclonal anti-HD humano que resulta útil para el diagnóstico y el tratamiento de cánceres.

La patente US nº 5.869.045 se refiere a anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, conjugados de anticuerpos e inmunotoxinas de cadena sencilla que son reactivos con las células humanas de carcinoma. El mecanismo por el que estos anticuerpos funcionan es doble, en el aspecto de que las moléculas son reactivas con antígenos de la membrana celular presentes sobre la superficie de los carcinomas humanos y además en el aspecto de que los anticuerpos presentan la capacidad de internalizarse dentro de las células de carcinoma, tras la unión, haciendo que resulten especialmente útiles para formar conjugados de anticuerpo-fármaco y anticuerpo-toxina. En su forma no modificada los anticuerpos también manifiestan propiedades citotóxicas a concentraciones específicas.

La patente US nº 5.780.033 da a conocer la utilización de autoanticuerpo para la terapia y profilaxis tumorales. Sin embargo, este anticuerpo es un autoanticuerpo antinuclear procedente de un mamífero de edad avanzada. En este caso, se afirma que el autoanticuerpo es un tipo de anticuerpo natural presente en el sistema inmunológico. Debido a que el autoanticuerpo procede de "un mamífero de edad avanzada", no existe ningún requisito de que el autoanticuerpo realmente proceda del paciente bajo tratamiento. Además, la patente da a conocer autoanticuerpos naturales y monoclonales antinucleares procedentes de un mamífero de edad avanzada y una línea celular de hibridoma productora de un autoanticuerpo antinuclear monoclonal.

La patente US nº 5.916.561 da a conocer un anticuerpo específico, VFF-18, y sus variantes dirigido contra la variante exón v6 del gen CD44. Este anticuerpo es una mejora respecto al anticuerpo comparador en el aspecto de que reconoce una variante v6 de CD44 humano y uno la variante v6 del CD44 de rata. Además, este anticuerpo permite ensayos diagnósticos para la expresión de CD44 v6. No se da a conocer ninguna función in vitro o in vivo para este anticuerpo.

La patente US nº 5.616.468 da a conocer un anticuerpo monoclonal, Var3.1, cultivado contra un péptido sintético que contiene una secuencia codificada por el exón 6A humano del gen CD44. Concretamente este anticuerpo no se une a la forma de 90 kD de CD44 humano y se distingue del anticuerpo Hermes-3. Se proporciona un método para la detección de la variante v6 de CD44, así como un método para el cribado y el ensayo de la transformación maligna basado en este antígeno. También se proporciona un método para el cribado para enfermedad inflamatoria basado en al detección del antígeno en el suero.

La patente US nº 5.879.898 da a conocer un anticuerpo específico que se une a un exón de 129 pb de la variante 6 de CD44 humano que produce un péptido de 43 aminoácidos. El anticuerpo monoclonal es producido por varias líneas celulares de hibridoma: MAK<CD44>M-1.1.12, MAK<CD44>M-2.42.3, MAK<CD44>M-4.3.16. El anticuerpo es generado a partir de una proteína de fusión que contiene por lo menos un hexapéptido de la secuencia de aminoácidos del nuevo CD44 v6. Además, se dan a conocer un inmunoensayo para la detección de la variante de exón 6 que puede utilizarse como diagnóstico del cáncer. Es significativo que no se da a conocer ninguna función in vitro o in vivo para este anticuerpo.

La patente US nº 5.942.417 da a conocer un polinucleótido que codifica un polipéptido similar a CDR44 y un método de preparación de una proteína recombinante que utiliza el polinucleótidos y sus variantes. Se reivindican anticuerpos de estos polipéptidos, sin embargo no existen ejemplos específicos y no existen clones depositados que secreten dichos anticuerpos. Las transferencias northen demuestran la aparición del polinucleótido en varios tipos de tejido, pero no existen datos acompañantes de que se produce la traducción y expresión de este polinucleótido. Por lo tanto, no existe evidencia de que puedan producirse anticuerpos contra el producto génico de este polinucleótido, de que estos anticuerpos presenten función in vitro o in vivo ni de que resultarían relevantes a la enfermedad cancerosa humana.

La patente US nº 5.885.575 da a conocer un anticuerpo que reacciona con un epítopo variante de CD44 y métodos de identificación de la variante mediante la utilización del anticuerpo. El polinucleótido aislado codificante de esta variante se aisló a partir de células de rata, y el anticuerpo, mAb1.1ASML, dirigido contra esta variante, reconoce proteínas de pesos moleculares 120 kD, 150 kD, 180 kD y 200 kD. La administración del anticuerpo monoclonal 1.1ASML retrasó el crecimiento y las metástasis de BSp73ASML de rata en ratas isogénicas. Es significativo que 1.1ASML no reconoce los tumores humanos tal como demuestra su falta de reactividad con el carcinoma pulmonar humano de células grandes LCLC97. Se aisló un homólogo humano a partir de LCLC97, pero no se produjo ningún anticuerpo equivalente que reconociese este homólogo. De esta manera, aunque se produjo un anticuerpo específico de un variante de CD44 de rata y se demostró que afectaba al crecimiento y metástasis de los tumores de rata, no existe evidencia del efecto de este anticuerpo contra los tumores humanos. Más concretamente, los inventores señalan que este anticuerpo no reconoce los cánceres humanos.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

A los presentes inventores se les ha concedido la patente US nº 6.180.357, titulada "Individualized Patient Specific Anti-Cancer Antibodies" [Anticuerpos anticáncer individualizados específicos de paciente], referida a un procedimiento para seleccionar anticuerpos anticáncer personalizados individualmente que resultan útiles en el tratamiento de una enfermedad cancerosa.

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado codificado por un hibridoma depositado en IDAC con el número de acceso 280104-06. Está bien reconocido en la técnica que algunas secuencias de aminoácidos pueden modificarse en un polipéptido sin efectos significativos sobre la estructura o la función de la proteína. En la reorganización molecular de los anticuerpos, pueden tolerarse generalmente modificaciones en la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos de la región esquelética. Entre ellas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, sustituciones (resultan preferentes las conservadoras), deleciones o adiciones. Además, se encuentra comprendido dentro del alcance de la presente invención conjugar modalidades quimioterapéuticas estándares, por ejemplo radionucleidos, con AMEC de la presente invención, concentrando de esta manera el uso de dichos quimioterapéuticos. Los AMEC también pueden conjugarse con toxinas, fracciones citotóxicas, enzimas, por ejemplo enzimas conjugados con biotina, o células hematógenas, formando de esta manera un conjugado de anticuerpos.

En la presente memoria se da a conocer el método para producir anticuerpos anticáncer específicos del paciente tal como se enseña en la patente nº US 6.180.357 para aislar líneas celulares de hibridoma que codifican anticuerpos monoclonales modificadores de enfermedad cancerosa. Estos anticuerpos pueden generarse específicamente para un tumor y de esta manera posibilitan la personalización de la terapia para el cáncer. Dentro del contexto de la presente solicitud, los anticuerpos anticáncer con propiedades de eliminación celular (citotóxicas) o de inhibición del crecimiento celular (citostáticas) se denominan en lo sucesivo citotóxicos. Estos anticuerpos pueden utilizarse para ayudar a la estadificación y diagnóstico de un cáncer y pueden utilizarse para tratar las metástasis tumorales. Estos anticuerpos también pueden utilizarse para la prevención del cáncer mediante el tratamiento profiláctico. Al contrario que los anticuerpos generados según los paradigmas tradicionales de descubrimiento de fármacos, los anticuerpos generados de esta manera pueden presentar como diana moléculas y rutas que previamente no se ha demostrado que formen parte integral del crecimiento y/o supervivencia del tejido maligno. Además, la afinidad de unión de estos anticuerpos resulta adecuada a los requisitos para el inicio de los sucesos citotóxicos que podría no resultar adecuada para interacciones de afinidad más fuerte.

La perspectiva de un tratamiento anticáncer individualizado producirá un cambio en la manera de controlar un paciente. Un escenario clínico probable es que se obtenga una muestra del tumor en el momento de la presentación y se guarde. A partir de esta muestra puede tiparse el tumor a partir de un panel de anticuerpos modificadores de enfermedad cancerosa preexistentes. El paciente se estadifica convencionalmente, aunque los anticuerpos disponibles pueden resultar útiles en la estadificación adicional del paciente. El paciente puede tratarse inmediatamente con los anticuerpos existentes y puede producirse un panel de anticuerpos específicos del tumor mediante la utilización de los métodos dados a conocer en la presente memoria o mediante la utilización de bibliotecas de expresión fágica conjuntamente con los métodos de cribado dados a conocer en la presente memoria. Todos los anticuerpos generados se añaden a la biblioteca de anticuerpos anticáncer ya que existe la posibilidad de que otros tumores puedan portar algunos de los mismos epítopos que el que se está tratando. Los anticuerpos producidos según este método pueden resultar útiles para tratar enfermedades cancerosas en aquellos pacientes que presentan cánceres que se unen a estos anticuerpos.

Además de anticuerpos anticáncer, el paciente puede decidir que recibe las terapias actualmente recomendadas como parte de un régimen multimodal de tratamiento. El hecho de que los anticuerpos aislados mediante la presente metodología son relativamente no tóxicos para las células no cancerosas permite utilizar combinaciones de anticuerpos a dosis elevadas, solos o conjuntamente con terapia convencional. El elevado índice terapéutico también permitirá el retratamiento a una escala temporal corta que debería reducir la probabilidad de aparición de células resistentes al tratamiento.

En el caso de que el paciente sea refractorio al curso inicial de terapia o se desarrollen metástasis, el procedimiento de generación de anticuerpos específicos del tumor puede repetirse para el retratamiento. Además, los anticuerpos anticáncer pueden conjugarse con glóbulos rojos obtenidos de ese paciente y reinfusionarse para el tratamiento de las metástasis. Existen pocos tratamientos eficaces para el cáncer metastásico y las metástasis habitualmente presagian un mal resultado con muerte final. Sin embargo, los cánceres metastásicos habitualmente se encuentran bien vascularizados y la administración de anticuerpos anticáncer mediante glóbulos rojos puede presentar el efecto de concentrar los anticuerpos en el sitio del tumor. Incluso antes de las metástasis, la mayoría de células de cáncer dependen del suministro de sangre del huésped para su supervivencia y el anticuerpo anticáncer conjugado con glóbulos rojos también puede resultar eficaz contra los tumores in situ. Alternativamente, los anticuerpos pueden conjugarse con otras células hematógenas, por ejemplo linfocitos, macrófagos, monocitos, células asesinas naturales, etc.

Existen cinco clases de anticuerpos y cada una de ellas se asocia a una función proporcionada por su cadena pesada. Se cree generalmente que la eliminación de las células de cáncer por anticuerpos desnudos se encuentra mediada por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o citotoxicidad dependiente del complemento. Por ejemplo, los anticuerpos IgM e IgG2a murinos pueden activar el complemento humano mediante la unión del componente C1 del sistema del complemento, activando de esta manera la ruta clásica de activación del complemento que puede conducir a la lisis tumoral. Para los anticuerpos humanos, los anticuerpos activadores del complemento más eficaces generalmente son IgM e IgG1. Los anticuerpos murinos de los isotipos IgG2a e IgG3 resultan eficaces en el reclutamiento de células citotóxicos que presentan receptores Fc que conducen a la eliminación celular por parte de monocitos, macrófagos, granulocitos y determinados linfocitos. Los anticuerpos humanos de los isotipos tanto IgG1 como IgG3 median en la ADCC.

Otro posible mecanismo de eliminación del cáncer mediada por anticuerpo podría ser mediante la utilización de anticuerpos que funcionan catalizando la hidrólisis de diversos enlaces químicos en la membrana celular y sus glucoproteínas o glucolípidos asociados, denominados anticuerpos catalíticos.

Existen tres mecanismos adicionales de eliminación de células de cáncer mediada por anticuerpos. El primero es la utilización de anticuerpos como vacuna para inducir al cuerpo a producir una respuesta inmunológica contra el antígeno putativo que reside sobre la célula de cáncer. El segundo es la utilización de anticuerpos con diana en receptores de crecimiento y que interfieren con su función o regulan negativamente ese receptor de manera que su función resulta efectivamente perdida. El tercero es el efecto de dichos anticuerpos sobre la ligación directa de fracciones de superficie celular que puede conducir directamente a la muerte celular, tal como la ligación de receptores de muerte tales como TRAIL R1 ó TRAIL R2, o moléculas de integrina tales como alfa V beta 3 y similares.

La utilidad clínica de un fármaco para el cáncer se basa en el beneficio del fármaco en un perfil de riesgo aceptable para el paciente. En la terapia del cáncer, el beneficio más buscado generalmente ha sido la superviviencia; sin embargo, existen otros beneficios bien conocidos además de prolongar la vida. Entre estos otros beneficios, en los que el tratamiento no afecta negativamente a la supervivencia, se incluyen la paliación de los síntomas, la protección frente a sucesos adversos, la prolongación del tiempo hasta la recurrencia o la supervivencia sin enfermedades y la prolongación del tiempo hasta la progresión. Estos criterios generalmente se aceptan y algunos cuerpos reguladores, tales como la U.S. Food and Drug Administration (F.D.A.), han aprobado fármacos que producen estos beneficios (Hirschfeld et al., Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42:137-143, 2002). Además de estos criterios, está bien reconocido que existen otros criterios de valoración que pueden presagiar estos tipos de beneficio. En parte, el proceso acelerado de aprobación concecido por la F.D.A. estadounidense reconoce que existen variables sustitutivas que probablemente predicen los beneficios para el paciente. Al finales de 2003 se habían aprobado dieciséis fármacos bajo este procedimiento, y de entre ellos, cuatro han continuado el proceso hacia la aprobación completa, es decir, los estudios de seguimiento han demostrado beneficios directos para el paciente según predicen los criterios de valoración indirectos. Un criterio de valoración importante para determinar los efectos de un fármaco sobre un tumor sólido es la evaluación de la carga tumoral mediante la medición de la respuesta al tratamiento (Therasse et al., Journal of the National Cancer Institute 92(3):205-216, 2000). Los criterios clínicos (criterios RECIST) para dicha evaluación han sido promulgados por el grupo de trabajo de criterios de evaluación de la respuesta en tumores sólidos, un grupo de expertos internacionales en cáncer. Los fármacos con un efecto demostrado sobre la carga tumoral, tal como muestran las respuestas objetivas según los criterios RECIST, en comparación con el grupo de control apropiado, tienden finalmente a producir un beneficio directo para el paciente. En el contexto preclínico, la carga tumoral generalmente resulta más fácil de evaluar y documentar. Sobre la base de que los estudios preclínicos pueden traducirse al contexto clínico, los fármacos que producen una supervivencia prolongada en los modelos preclínicos presentarán una utilidad clínica prevista más elevada. De manera análoga a la producción de respuestas positivas al tratamiento clínico, los fármacos que reducen la carga tumoral en el contexto preclínico también pueden presentar un impacto directo significativo sobre la enfermedad. Aunque la prolongación de la supervivencia es el resultado clínico más buscado del tratamiento farmacológico del cáncer, existen otros beneficios que presentan utilidad clínica y resulta evidente que la reducción de la carga tumoral, que podría correlacionarse con un retraso en la progresión de la enfermedad, una supervivencia extendida o ambas, también puede conducir a beneficios directos y presentar un impacto clínico (Eckhardt et al., Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds; ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, páginas 209 a 219, 2003).

Mediante la utilización sustancial del procedimiento de la patente US nº 6.180.357, se obtuvo el anticuerpo monoclonal de ratón H460-16-2 tras la inmunización de los ratones con células procedentes de una biopsia de tumor pulmonar de un paciente. El antígeno H460-16-2 se expresaba sobre la superficie celular de un amplio abanico de líneas celulares humanas procedentes de diferentes orígenes de tejido. La línea celular de cáncer de mama MDAMB-231 (MB-231) y la línea celular de cáncer de piel A2058 eran susceptibles de los efectos citotóxicos de H460-162in vitro.

El resultado de la citotoxicidad de H460-16-2 contra las células MB-231 en cultivo resultó adicionalmene extendida por su actividad antitumoral hacia estas células de cáncer al trasplantarse en ratones. Los modelos preclínicos de xenoinjerto tumoral se consideran predictores válidos de eficacia terapéutica.

En el modelo preventivo in vivo de cáncer de mama humano, el tratamiento de H460-16-2 resultó significativamente (p<0,0001) más eficaz en la supresión del crecimiento tumoral durante el periodo de tratamiento que un anticuerpo de isotipo de control. Al final de la etapa de tratamiento, los ratones que habían recibido H460-16-2 presentaban tumores que crecieron a sólo 1,3 por ciento del grupo de control. Durante el periodo de seguimiento posterior al tratamiento, los efectos de tratamiento de H460-16-2 eran sostenidos y el volumen tumoral medio en los grupos tratados continuó siendo significativamente más pequeño que los controles hasta el final de la etapa de medición. Utilizando la supervivencia como medida de la eficacia de los anticuerpos, se estimó que el riesgo de muerte en el grupo de tratamiento de H460-16-2 era aproximadamente 71 por ciento del grupo de control de tampón de anticuerpo (p=0,028) 70 días después del tratamiento. Estos datos demuestran que el tratamiento de H460-16-2 proporcionó un beneficio de supervivencia en comparación con los grupos tratados con control. El tratamiento de H460-16-2 aparentemente era seguro, ya que no indujo ningún signo de toxicidad, incluyendo un peso corporal reducido y distrés clínico. De esta manera, el tratamiento de H460-16-2 resultó eficaz ya que retrasó el crecimiento tumoral e incrementó la supervivencia en comparación con los grupos tratados con control en un modelo bien establecido de cáncer de mama humano.

Además, H460-16-2 demostró actividad antitumoral contra las células MB-231 en un modelo tumoral in vivo establecido. Se comparó el tratamiento con H460-16-2 con el fármaco quimioterapéutico estándar, cisplatino, y se demostró que los grupos de tratamiento de cisplatino y H460-16-2 presentaban volúmenes tumorales medios significativamente (p<0,001) más pequeños en comparación con los grupos tratados con tampón de dilución de anticuerpo o con anticuerpo de isotipo de control. El tratamiento de H460-16-2 medió en la supresión tumoral que era aproximadamente dos tercios la de la quimioterapia de cisplatino, aunque sin la pérdida de peso (19,2 por ciento) significativa (p<0,003) y el distrés clínico, incluyendo 2 muertes asociadas al tratamiento asociadas al tratamiento de cisplatino. La actividad antitumoral de H460-16-2 y su toxicidad mínima lo convierten en un agente terapéutico anticáncer atractivo.

En el periodo post-tratamiento, H460-16-2 mostró un beneficio de supervivencia significativo (p<0,02), ya que el riesgo de muerte en el grupo de H460-16-2 era aproximadamente la mitad del riesgo en el grupo de anticuerpo de isotipo de control >70 días después del tratamiento. El beneficio de supervivencia observado continuó más allá de los 120 días post-tratamiento, cuando el 100 por ciento de los ratones de control de isotipo y de los tratados con cisplatino había muerto, en comparación con 67 por ciento del grupo de tratamiento de H460-16-2. H460-16-2 mantuvo la supresión tumoral mediante el retraso del crecimiento tumoral en un 26 por ciento comparado con el grupo de anticuerpo de isotipo de control. A los 31 días post-tratamiento, H460-16-2 había limitado el tamaño tumoral al reducir el crecimiento tumoral en un 48 por ciento, comparado con el grupo de isotipo de control, lo que es comparable a la reducción de 49 por ciento observada al final del tratamiento. En el modelo tumoral establecido de cáncer de mama, estos resultados indican el potencial de H460-16-2 de mantener la supresión tumoral más allá de la etapa de tratamiento y demuestran la capacidad del anticuerpo de reducir la carga tumoral y de incrementar la supervivencia en un mamífero.

Además de los efectos beneficios en el modelo tumoral in vivo establecido de cáncer de mama, el tratamiento de H460-16-2 en combinación con un fármaco quimioterapéutico (cisplatino) presentó actividad antitumoral contra las células PC-3 en un modelo de cáncer de próstata in vivo establecido. Mediante la utilización de una prueba t apareada, el tratamiento de H460-16-2 más cisplatino resultó significativamente más eficaz en la supresión del crecimiento tumoral poco después del periodo de tratamiento que el control de tampón (p<0,0001), que el tratamiento de cisplatino solo (p=0,004) o que el tratamiento de H460-16-2 solo (p<0,0001). Al final de la etapa de tratamiento, los ratones que habían recibido H460-16-2 más cisplatino presentaban tumores que crecieron a sólo 28,5 por ciento del grupo de tampón de control. Para los modelos de xenoinjerto PC-3 SCID, el peso corporal puede utilizarse como indicador indirecto de progresión de la enfermedad. Los ratones en todos los grupos experimentaron una pérdida severa de peso. En este estudio, los ratones en todos los grupos mostraron una pérdida de peso de aproximadamente 23 a 35 por ciento al final del periodo de tratamiento. El grupo tratado con H460-16-2 mostró el grado más pequeño de pérdida de peso (21,7 por ciento). Tras el tratamiento, el día 48, no se había producido ningún incremento significativo de pérdida de peso asociada al tratamiento de H460-16-2 y cisplatino en comparación con el control de tampón (p=0,5042). De esta manera, el tratamiento de H460-16-2 resultó eficaz ya que retrasó el crecimiento tumoral e incrementó la supervivencia en comparación con los grupos tratados con control en un modelo bien establecido de cáncer de mama humano.

Con el fin de validar el epítopo H460-16-2 como diana farmacológica, previamente se determinó la expresión del antígeno H460-16-2 en tejidos humanos normales. Este trabajo se extendió mediante comparación con los anticuerpos anti-CD44, clones L178 y BU75. Mediante tinción IHQ con H460-16-2 se observó que la mayoría de los tejidos no expresaba el antígeno H460-16-2, incluyendo las células de los órganos vitales, tales como el hígado, los riñones (excepto por la tinción marginal de las células epiteliales tubulares), el corazón y los pulmones. Los resultados de la tinción de los tejidos indican que H460-16-2 mostraba una unión restringida a diversos tipos celulares, pero sí se unía a macrófagos infiltrantes, linfocitos y fibroblastos. El anticuerpo BU75 mostró un patrón de tinción similar. Sin embargo, se produjo por lo menos una diferencia notable; la tinción de los linfocitos era más intensa con BU75 que con H460-16-2.

La localización del antígeno H460-16-2 y la determinación de su prevalencia dentro de la población, tal como entre los pacientes de cáncer de mama, resulta importante para evaluar el uso terapéutico de H460-16-2 y el diseño de ensayos clínicos eficaces. Para examinar la expresión del antígeno H460-16-2 en los tumores de mama de pacientes de cáncer, se cribaron previamente muestras de tejido tumoral de 50 pacientes individuales de cáncer de mama para la expresión del antígeno H460-16-2 y se compararon con L178, BU75 y el anticuerpo anti-Her2 c-erbB2. Los resultados de estos estudios eran similares y mostraron que el 62 por ciento de las muestras de tejido presentaron tinción positiva para el antígeno H460-16-2 mientras que el 73 por ciento de los tejidos de tumor mamario era positivo para el epítopo BU75. La expresión de H460-16-2 en las muestras de pacientes aparentemente era específica de las células de cáncer, ya que la tinción se restringía a las células malignas. H46016-2 tiñó 4 de 10 muestras de tejido normal de pacientes de cáncer de mama mientras que BU75 tiñó 8. La expresión de tumores mamarios de tanto el antígeno H460-16-2 como el antígeno BU75 aparentemente se localizaba principalmente en la membrana celulas de las células malignas, conviertiendo a CD44 en una diana atractiva para la terapia. Se evaluó adicionalmente la expresión de H460-16-2 basándose en la expresión en tumor mamario de los receptores de las hormonas estrógeno y progesterona, las cuales desempeñan un papel importante en el desarrollo, tratamiento y pronóstico de los tumores de mama. No era evidente ninguna correlación entre la expresión del antígeno H460-16-2 y la expresión de los receptores de estrógeno o de progesterona. Al analizar los tumores basándose en su estadio, o grado en el que había avanzado el cáncer, nuevamente no se observó ninguna correlación clara entre la expresión del antígeno H460-16-2 y el estadio tumoral. Se obtuvieron resultados similares con BU75. En comparación con c-erbB-2, H460-16-2 mostró un perfil de tinción completamente diferente, en el que el 52 por ciento de las muestras de tejido de tumor mamario que eran positivas para el antígeno H460-16-2 eran negativas para la expresión de Her2, indicando que se dirigía a satisfacer una necesidad terapéutica todavía no satisfecha de los pacientes de cáncer de mama. También se observaron diferencias en la intensidad de tinción entre las secciones de tejido de tumor mamario que eran positivas tanto para H460-16-2 como para Her2. El anticuerpo cerbB-2 también teñía positivamente una de las secciones de tejido mamario normal.

Para extender adicionalmente el beneficio terapéutico potencial de H460-16-2, también se determinó previamente la frecuencia y localización del antígeno en diverssos tejidos de cáncer humano y se comparó con el clon L178.La mayoría de estos tipos tumorales también eran positivos para el antígeno L178. Al igual que con el tejido de tumor mamario humano, la localización de H460-16-2 y L178 se producía sobre la membrana de las células tumorales. Sin embargo, se producía sustancialmente más localización membranal con L178 que con el anticuerpo H460-16-2. Además, de los tipos tumorales que fueron teñidos tanto por H460-16-2 como por L178, el 43 por ciento de los tejidos mostró una intensidad de tinción más elevada con el anticuerpo L178.

Aparentemente no existe ninguna forma de CD44 que se corresponda exactamente con los datos de IHQ presentados en la presente memoria, según las comparaciones realizadas con los datos de IHQ de la literatura. La forma estándar de CD44 normalmente se expresa en el cerebro humano; el antígeno H460-16-2, no. Los anticuerpos dirigidos contra las isoformas pan-CD44 no tiñen el hígado (incluyendo las células de Kuppfer) y tiñen positivamente las glándulas endometriales en todas las etapas del ciclo reproductivo. El antígeno H460-16-2 se encuentra claramente presente sobre las células de Kuppfer y sólo se encuentra presente sobre las glándulas endometriales secretorias del ciclo reproductivo. El antígeno H460-16-2 se encuentra claramente presente sobre macrófagos del tejido y sólo las formas variantes V4/5 y V8/9 muestra tinción ocasional de los macrófagos. El patrón de unión similar aunque distinto observado con H460-16-2 en comparación con L178 anti-CD44 y ahora B775 indica que el antígeno H460-16-2 es un epítopo único de CD44.

Tal como se ha dado a conocer anteriormetne, los datos bioquímicos adicionales también indican que el antígeno reconocido por H460-16-2 es una de las formas de CD44. Ello se ve apoyado por los estudios que demuestran que un anticuerpo monoclonal (L178) reactivo con CD44 identifica las proteínas que se unen a H460-16-2 según la inmunoprecipitación. Los estudios de transferencia western también sugieren que el epítopo de CD44 reconocido por H460-16-2 no se encontraba presente sobre v6 ó v10. El epítopo de H460-16-2 también se distingue por ser carbohidrato y dependiente de la conformación, mientras que muchos anticuerpos anti-CD44 se dirigen contra partes peptídicas de CD44. Estos resultados de IHQ y bioquímicos demuestran que H460-16-2 se une a una variante del antígeno CD44. De esta manera, la mayor parte de la evidencia demuestra que H460-16-2 media en efectos anticáncer mediante ligamiento de un epítopo carbohidrato único dependiente de la conformación que se encuentra presente sobre una variante de CD44. Para el propósito de la presente invención, dicho epítopo se define como una "fracción antigénica de CD44" caracterizado por su capacidad de unirse a un anticuerpo monoclonal codificado por la línea celular de hibridoma H460-16-2, fragmentos de unión antigénicos del mismo o conjugados de anticuerpos de los mismos.

Con el fin de aclarar adicionalmente el mecanismo subyacente a los efectos anticáncer de H460-16-2, se llevaron a cabo ensayos de unión de ácido hialurónico (AH). Se determinó que resulta necesaria una concentración media de 1,87 (+/-1,01) microgramos/ml de H460-16-2 para inhibir la adhesión de las células MDA-MB-231 a AH en un 50 por ciento. Estos resultados indican que H460-16-2 interactúa con, por lo menos en parte, la región o regiones de CD44 que son responsables de la unión a AH y en consecuencia podría mediar sus efectos anticáncer mediante la regulación negativa de la angiogénesis o la invasividad tumoral mediante el CEM.

Además de los ensayos de unión de AH, se llevó a cabo un experimento de ciclado celular con el fin de determinar si los efectos anticáncer in vitro e in vivo de H460-16-2 se debían a la regulación del ciclo celular. Tras 24 horas y con 20 mg/ml de H460-16-2, se produjo un incremento del número de células MDA-MB-231 apoptóticas en comparación con el control de isotipo. Este efecto aparentemente también era dependiente de la dosis. Por lo tanto, la eficacia de H460-16-2 también podría deberse, por completo o en parte, a sus capacidades inductoras de apoptosis.

En conjunto, estos datos demuestran que el antígeno H460-16-2 es un antígeno asociado al cáncer y se expresa en el ser humano y es una diana de cáncer patológicamente relevante. Además, estos datos demuestran además la unión del anticuerpo H460-16-2 a tejidos de cáncer humanos y puede utilizarse apropiadamente para ensayos que pueden ser diagnósticos, predictivos de terapia, o pronósticos. Además, la localización en la membrana celular de este antígeno es indicativa del estatus del cáncer de la célula debido a la falta de expresión del antígeno en la mayoría de las células no malignas, y esta observación permite utilizar este antígeno, su gen o derivados, su proteína o sus variantes, en ensayos que pueden ser diagnósticos, predictivos de terapia, o pronósticos.

Otros estudios, que implican la utilización de anticuerpos anti-CD44, presentan limitaciones del potencial terapéutico que no son mostradas por H460-16-2. H460-16-2 demuestra actividad antitumoral tanto in vitro como in vivo. Los anticuerpos descritos anteriormente, tales como MAK<CD44>M-1.1.12, MAK<CD44>M-2.42.3 y MAK<CD44>M4.3.16, no presentan citotoxicidad in vitro o in vivo, y VFF-18 y Mab U36 no muestran citotoxicidad tumoral intrínseca. Además, otros anticuerpos anti-CD44 que han demostrado efectos tumorales in vivo también presentan determinadas limitaciones que no resultan evidentes con H460-16-2. Por ejemplo, ASML1.1, K926, los anti-CD44 e IM-78.1 muestran actividad antitumoral in vivo contra tumores de rata y murinos cultivados en modelos de xenoinjerto, respectivamente. H460-16-2 demuestra actividad antitumoral en un modelo de cáncer humano. H46016-2 también se dirige contra CD44 humano, mientras que algunos anticuerpos tales como ASML1.1 reconocen únicamente CD44 de rata. El anticuerpo anti-CD44 del clon 515 ihibe la implantación tumoral peritoneal de una línea celular ovárica humana pero no impide o inhibe el crecimiento tumoral. H460-16-2 es capaz de inhibir el crecimiento de los tumores mamarios humanos en un modelo de xenoinjerto de ratón SCID. GKW.A3 es un anticuerpo monoclonal anti-CD44 humano capaz de inhibir el crecimiento tumoral de un melanoma metastizante humano cultivo en ratones en un modelo preventivo aunque no establecido. H460-16-2 ha demostrado una actividad antitumoral significativa en modelos de xenoinjerto murino tanto preventivos como establecidos de cáncer de mama humano. En consecuencia, resulta bastante evidente que H460-16-2 presenta propiedades antitumorales superiores en comparación con anticuerpos anti-CD44 descritos anteriormente. Presenta actividad antitumoral in vitro e in vivo demostrada en un tumor mamario humano en ratones SCID y presenta como diana el CD44 humano. También muestra actividad en un modelo preventivo y establecido (más relevante clínicamente) de cáncer de mama humano y muestra actividad con cisplatino en un modelo establecido de cáncer de próstata humano.

Globalmente, la presente exposición enseña la utilización del antígeno H460-16-2 como diana para un agente terapéutico, que tras su administración reduce la carga tumoral de un cáncer que expresa el antígeno en un mamífero (retrasando de esta manera la progresión de la enfermedad) y también puede conducir a una supervivencia prolongada del mamífero tratado. La presente exposición enseña además la utilización de un CDMAB (H460-16-2) y sus derivados, dirigidamente a su antígeno, para reducir la carga tumoral de un cáncer que expresa el antígeno en un mamífero y prolongar la supervivencia de un mamífero que porta tumores que expresan este antígeno. Además, la presente exposición enseña que tras la unión a su antígeno, H460-16-2 puede interferir con la capacidad de una célula de cáncer de interactuar con el ácido hialurónico y también puede causar que una célula de cáncer experimente apoptosis. Además, la presente exposición también enseña la utilización de la detección del antígeno H460-16-2 en células cancerosas que pueden resultar útiles para el diagnóstico, la predicción de la terapia y el pronóstico de mamíferos que portan tumores que expresan dicho antígeno.

La presente exposición describe el desarrollo y utilización de H460-16-2 desarrollado mediante el procedimiento descrito en la patente US nº 6.180.357 e identificado a partir de su efecto en un ensayo citotóxico, del crecimiento tumoral no establecido y establecido en modelos animales y de la prolongación del tiempo de supervivencia en aquellos que sufren de enfermedad cancerosa. La presente invención describe además el desarrollo y uso de AR37A335.8 desarrollado mediante el procedimiento descrito en la patente US nº 6.180.357 e identificado por su efecto en un ensayo citotóxico y en la prevención profiláctica del crecimiento tumoral en modelos animales. La presente exposición representa un avance en el campo del tratamiento del cáncer en el aspecto de que describe, por primera vez, anticuerpos desnudos que se unen específicamente a un epítopo o epítopos presentes sobre la molécula diana, CD44, y que también presentan propiedades citotóxicas in vitro contra células tumorales malignas pero no células normales, y que también median directamente en la inhibición del crecimiento y extensión tumorales en modelos in vivo de cáncer humano. Esto constituye un avance en relación a cualquier otro anticuerpo anti-CD44 anteriormente descrito, ya que no se ha descrito ninguno con propiedades similares. Proporciona además un avance en el campo ya que demuestra claramente, y por primera vez, la participación directa de CD44 en sucesos asociados al crecimiento y desarrollo de determinados tipos de tumor. Representa además un avance en la terapia del cáncer ya que presenta el potencial de mostrar propiedades anticáncer similares en pacientes humanos. Un avance adicional es que la inclusión de estos anticuerpos en una biblioteca de anticuerpos anticáncer incrementará la posibilidad de reconocer específicamente tumores que expresan diferentes marcadores antigénicos mediante la determinación de la combinación apropiada de diferentes anticuerpos anticáncer, con el fin de encontrar el más eficaz en el reconocimiento e inhibición del crecimiento y desarrollo de los tumores.

Globalmente, la presente exposición enseña la utilización del antígeno H460-16-2 como diana para un agente terapéutico, que tras su administración reduce la carga tumoral de un cáncer que expresa el antígeno en un mamífero y también puede conducir a una supervivencia prolongada del mamífero tratado. La presente exposición enseña además la utilización de un CDMAB (H460-16-2 y AR37A335.8) y sus derivados, ligandos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, dirigidamente a su antígeno, para reducir la carga tumoral de un cáncer que expresa el antígeno en un mamífero y prolongar la supervivencia de un mamífero que porta tumores que expresan este antígeno. Además, la presente exposición también enseña la utilización de la detección de los antígenos H46016-2 y AR37A335.8 en células cancerosas que pueden resultar útiles para el diagnóstico, la predicción de la terapia y el pronóstico de mamíferos que portan tumores que expresan dicho antígeno.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en la presente memoria se describe un método para producir anticuerpos modificadores de enfermedad cancerosa (AMEC) cultivados contra células cancerosas derivadas de un individuo particular, o una o más líneas de células de cáncer, las AMEC de las cuales son citotóxicas con respecto a las células de cáncer, siendo simultáneamente relativamente no tóxicos para las células no cancerosas, con el fin de aislar líneas celulares de hibridoma y los anticuerpos monoclonales aislados correspondientes y fragmentos de unión a antígeno de los mismos para los que dichas líneas celulares de hibridoma se encuentran codificadas.

En la presente memoria se describen anticuerpos modificadores de enfermedad cancerosa, ligandos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En la presente memoria se describen anticuerpos modificadores de enfermedad cancerosa y ligandos cuya citotoxicidad se encuentra mediada por toxicidad celular dependiente de anticuerpos.

En la presente memoria se describen anticuerpos modificadores de enfermedad cancerosa y ligandos cuya citotoxicidad se encuentra mediada por toxicidad celular dependiente del complemento.

En la presente memoria se describen anticuerpos modificadores de enfermedad cancerosa y ligandos cuya citotoxicidad es una función de su capacidad de catalizar la hidrólisis de enlaces químicos celulares.

En la presente memoria se describen anticuerpos modificadores de enfermedad cancerosa o ligandos que resultan útiles en un ensayo de unión para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento del cáncer.

Resultarán evidentes objetivos y ventajas de la presente invención a partir de la descripción siguiente, en la que se proporcionan, a título ilustrativo y de ejemplo, determinadas realizaciones de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 compara la citotoxicidad en porcentaje y los niveles de unión de los sobrenadantes de hibridoma AR37A335.8 contra las líneas celulares PC-3, LnCap y CCD-27sk.

La figura 2 es una comparación de AR37A335.8 con los controles positivos y negativos en un ensayo de citotoxicidad.

La figura 3 representa la unión de AR37A335.8 y el control anti-EGFR a líneas celulares de cáncer y normales. Los datos se encuentran tabulados, presentando la intensidad de fluorescencia media como factor de incremento respecto al control de isotipo.

La figura 4 incluye histogramas de FACS representativos de AR37A335.8 y anticuerpos anti-EGFR dirigidos contra una línea celular de cáncer y no de cáncer.

La figura 5 demuestra el efecto de AR37A335.8 sobre el crecimiento tumoral en un modelo de cáncer de mama MDA-MB-231 profiláctico. Las líneas discontinuas verticales indican el periodo durante el que se administró el anticuerpo. Los puntos de datos representan medias +/-SEM.

La figura 6 demuestra el efecto de AR37A335.8 sobre el peso corporal en un modelo de cáncer de mama MDA-MB231 profiláctico. Los puntos de datos representan medias +/-SEM.

La figura 7 demuestra el efecto de AR37A335.8 sobre el crecimiento tumoral en un modelo de cáncer de colon SW1116 profiláctico. Las líneas discontinuas verticales indican el periodo durante el que se administró el anticuerpo. Los puntos de datos representan medias +/-SEM.

La figura 8 demuestra el efecto de AR37A335.8 sobre el peso corporal en un modelo de cáncer de colon SW1116 profiláctico. Los puntos de datos representan medias +/-SEM.

Figura 9. Transferencia western de muestras obtenidas de la fracción de membranas totales de células MDA-MB231 (carril 1) y de lisados de células completas de las líneas celulares PC-3 (carril 2) y CCD-27sk (carril 3), sondeadas con AR37A335.8 y H460-16-2.

Figura 10. Transferencia western de un complejo inmunológico preparado mediante inmunoprecipitación, con el anticuerpo anti-CD44 H460-16-2, a partir de la fracción de membranas totales de la línea celular MDA-MB-231. Los carriles individuales de la transferencia se sondearon con AR37A335.8 (carril 1), H460-16-2 (carril 2) o con el anticuerpo de isotipo de control (carril 3).

La figura 11 es un resumen de la unión de H460-16-2 en una micromatriz de tumor prostático humano y tejido normal.

Figura 12. Micrografías representativas que muestran el patrón de unión sobre el tejido tumoral prostático obtenido con H460-16-2 (A) o el anticuerpo de isotipo de control (B) y en tejido prostático normal obtenido con H460-16-2 (C)

o el anticuerpo de isotipo de control (D) de una micromatriz de tejidos humanos. H460-16-2 mostraba una fuerte tinción positiva para las células tumorales y una tinción débil para fibroblastos estromales en el tejido normal. Magnificación: 200X.

La figura 13 es un resumen de la unión de H460-16-2 en una micromatriz de tumor hepático humano y tejido normal.

Figura 14. Micrografías representativas que muestran el patrón de unión sobre el tejido tumoral hepático obtenido con H460-16-2 (A) o el anticuerpo de isotipo de control (B) y en tejido hepático no neoplásico obtenido con H460-162 (C) o el anticuerpo de isotipo de control (D) de una micromatriz de tejidos humanos. H460-16-2 mostró una fuerte tinción positiva de las células tumorales y se encontraba limitada a la tinción de las células sinusoidales (flechas negras) y de los linfocitos infiltrantes (flechas verdes) en el tejido hepático no neoplásico. Magnificación: 200X.

La figura 15 es un resumen del número de células apoptóticas en xenoinjertos de tumor MDA-MB-231 tras el tratamiento de H460-16-2 ó de tampón según se determinó mediante un ensayo TUNEL o tinción de H-E.

Figura 16. Productos de RT-PCR de ARNm de H460-16-2. Se amplificaron las reacciones de cadena ligera (panel A) utilizando el cebador directo MuIgκVL 5’-F (carril 1) o MuIgκVL 5’-C (carril 2). La reacción de cadena pesada (panel B) se amplificó utilizando una mezcla de cebadores directos MuIgVH 5’-A, B, C, D y F. Ambas reacciones de cadena ligera (panel A, carriles 1 y 2) mostraron una banda fuerte en 450 pb, así como una banda más débil en 850 pb. La banda en 450 pb es la banda diana que contiene el gen H460-16-2 Vk. La reacción de cadena pesada (panel B, carril 1) muestra una banda fuerte en 500 pb y una banda débil en 1.000 pb. La banda en 500 pb es la banda diana que corresponde al gen H460-16-2 Vh.

Figura 17. Plásmidos digeridos con EcoRI de E. coli transformado con pCR2.1 (H460-16-2 Vk). Se indica el número de clon en la parte superior. El primer número indica el cebador directo utilizado (1 para MuIgκVL5’-F y 2 para MuIgκVL5’-C’), y el segundo número indica el número de clon (1-5). El marcador de peso molecular se indica a la izquierda. La flecha indica la posición de las inserciones deseadas de H460-16-2 Vk.

Figura 18. Plásmidos digeridos con EcoRI de E. coli transformado con pCR2.1 (H460-16-2 Vh). Se indica el número de clon en la parte superior. El marcador de peso molecular se indica a la izquierda. Los clones 1, 2, 3, 4, 5 y 8 muestran la banda de 500 pb deseada, que corresponde al gen H460-16-2 Vh. Figura 19. Datos brutos de secuencia para los clones de pCR2.1 (H460-16-2 Vh).

Figura 20. Plásmidos digeridos con EcoRI de E. coli transformado con pCR2.1 (H460-16-2 Vh). Se indica el número de clon en la parte superior. El marcador de peso molecular se indica a la izquierda. La flecha indica la posición de las inserciones deseadas de H460-16-2 Vh.

Figura 21. Datos brutos de secuencia para los clones de pCR2.1 (H460-16-2 Vk) y pCR2.1 (H460-16-2 Vh).

Figura 22. Mapa esquemático de plásmido del vector pHC-huCgI (también denominado pCH-huIg1). La región

constante de Cγ1 humano se encuentra situada entre los sitios de restricción HindIII y XhoI. Se muestran los

marcadores de selección para bacterias (ampicilina) y para las células de mamífero (neomicina). Este plásmido fue proporcionado por G.R. McLean et al.

Figura 23. Secuencias de los cebadores.

Figura 24. Amplificación por PCR de pCH-huIg1 (panel A, carril 1), H460-16-2 Vk (panel A, carril 2) y H460-16-2 Vh (panel B, carril 1). La amplificación por PCR añadió los sitios de restricción apropiados a los moldes existentes. Se añadió un sitio BsiWI inmediatamente cadena abajo del sitio HindIII existente del vector pCH-huIgI. La banda en

1.100 pb (carril 1) es la región amplificada del plásmido entre los sitios HindIII y XbaI. Se añadió un sitio NheI en el extremo 5' y un sitio NotI en el extremo 3' del gen H460-16-2 Vk. Se añadió un sitio NheI en el extremo 5' y un sitio BsiWI en el extremo 3' del gen. Los tamaños resultantes de las bandas H460-16-2 Vk (panel A, carril 2) y H460-16-2 Vh (panel B, carril 1) son similares a los de los genes originales, ~450 pb, ya que se añadieron muy pocos nucleótidos.

Figura 25. Digestión de región constante de cadena pesada humana del producto de PCR IgG1 (carril 1) y el plásmido pCH-huIg1 (carril 2). El panel A es una única digestión con HindIII. El panel B es una doble digestión con HindIIi y XhoI. El tamaño del producto de PCR (carril 1) no cambió entre digestiones (paneles A y B) respecto a ~1.000 pb, ya que se eliminaron muy pocos nucleótidos en la digestión. El plásmido pCH-huIg1 (carril 2) resultó completamente linearizado por HindIII (panel A). Una banda del mismo tamaño que el producto de PCR digerido apareció tras la doble digestión del plásmido (carril 2, panel B), aproximadamente 1.000 pb. Ésta es la parte del plásmido que debe ser sustituida por el producto de PCR, que contiene el nuevo sitio BsiWI.

Figura 26. pCH-huIg1 digerido con BsiWI con sitio de corte alterado. Se añadió un sitio de restricción BsiWI a pCHhuIg1 para facilitar la clonación de H460-16-2 (que presenta un sitio HindIII interno). Se aislaron plásmido a partir de células E. coli transformadas con los plásmidos alterados y digeridos con BsiWI para determinar si se había incorporado el sitio de corte. El número de clon se indica en la parte superior de cada carril, excepto en el caso del carril 11, que es un plásmido de control no digerido (clon nº 5). Todos los clones excepto el 4 y el 8 resultaron linearizados por la digestión, lo que confirma que contienen el nuevo sitio de corte. Los clones 4 y 8 presentan la misma apariencia que el carril 11, el control no cortado, indicando que no contienen el nuevo sitio de corte.

Figura 27. Mapa esquemático de plásmido del vector pCL-huCk. La región constante de Ck humano se encuentra situada entre los sitios de restricción NotI y XhoI. La región variable se encuentra entre los sitios NheI y NotI. Se muestran los marcadores de selección para bacterias (ampicilina) y para las células de mamífero (puromicina). Este plásmido fue proporcionado por G.R. McLean et al.

Figura 28. pCL-huCk y H460-16-2 Vk digeridos con BgI II y NotI. Tanto el plásmido pCL-huCk (carril 1) como el producto de PCR H460-16-2 Vk (carril 2) se digirieron con BgI II y NotI para facilitar la clonación. El plásmido digerido (carril 1) aparece como una banda grande, que es el esqueleto del plásmido, y una banda de ~400 pb, que es la región variable de cadena ligera que debe sustituirse por H460-16-2 Vk. El producto de PCR de H460-16-2 Vk (carril 2) también aparece como ~400 pb, el tamaño previsto de la región variable de cadena ligera.

Figura 29. H460-16-2 Vh y pCH-huIg1 digeridos con BsiW I y Nhe I. El panel A muestra el producto de PCR de H460-16-2 Vh digerido con BsiW I y Nhe I en 450 pb. El panel B muestra pCH-huIg1 digerido con BsiW I (carril 1) y BsiW I y NheI (carril 2). La digestión única de pCH-huIg1 (panel B, carril 1) aparece como una banda grande, mientras que la doble digestión aparece como una banda grande con una inserción de 450 pb (panel B, carril 2), que corresponde a la región variable de cadena pesada que debe sustituirse por H460-16-2 Vh.

Figura 30. Plásmidos aislados a partir de E. coli transformado con pCL-huCk (H460-16-2 Vk) y digerido con Bgl II y NotI analizados en un gel de agarosa al 1%. El número en la parte superior del carril indica el número de clon. Todos los clones excepto el nº 1 muestran la inserción deseada de ~400 pb, que corresponde al gen H460-16-2 Vk.

Figura 31. Plásmidos aislados a partir de E. coli transformado con pCH-huIgI (H460-16-2 Vh) y digerido con BsiW I y Nhe I analizados en un gel de agarosa al 1,2%. El número en la parte superior del carril indica el número de clon. Todos los clones presentan la inserción deseada de 450 pb, que corresponde al gen H460-16-2 Vh.

Figura 32. Esquema plasmídico del vector de expresión pNEF38 (ICOS, Seattle, WA). Los genes H460-16-2 Vk quiméricos se clonaron en el sitio de clonación múltiple (SCM) utilizando los sitios de restricción MluI y XbaI. El marcador de selección de este plásmido es el gen de resistencia a la neomicina (NeoR), que proporciona a las células transfectadas la capacidad de crecer en presencia de Geneticin® (sulfato de G418).

Figura 33. Esquema plasmídico del vector de expresión pDEF38 (ICOS, Seattle, WA). Los genes H460-16-2 Vh quiméricos se clonaron en el sitio de clonación múltiple (SCM) utilizando los sitios de restricción MluI y XbaI. El marcador de selección de este plásmido es el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR), que proporciona a las células deficientes en DHFR transfectadas la capacidad de crecer en ausencia de timidina e hipoxantina.

Figura 34. Productos de PCR quiméricos H460-16-2 Vk (panel A) y VH (panel B) para cambiar los sitios de restricción analizados en geles de agarosa al 1,2% y al 1,0%, respectivamente. La reacción de PCR de la cadena ligera quimérica (panel A, carril 1) rindió una unica banda en ~800 pb, que corresponde al tamaño esperado de las regiones combinadas variable ligera (420 pb) y constante (320 pb). La reacción de PCR de la cadena pesada (panel B) rindió una unica banda en ~1500 pb, que corresponde al tamaño esperado de tanto la región variable pesada (450 pb) como la región constante (990 pb).

Figura 35. Plásmidos aislados a partir de E. coli transformados con pNEF38 (H460-16-2 Vk) (panel A) y pDEF38 (H460-16-2 Vh) (panel B) digeridos con XbaI y MulI. Los plásmidos de cadena pesada (panel B) también se sometieron a triple digestión con XhaI, MulI y BsiW I (carriles 1B, 2B, 4B y 6B). Para los plásmidos de cadena ligera (panel A) todos los clones excepto el nº 3 presentaban la inserción deseada de 750 pb, que corresponde a las regiones variable y constante de cadena ligera. Para los plásmidos de cadena pesada, las digestiones con XbaI y MluI (panel B, carriles 1A, 2A y 6A) mostraban inserciones de 1.500 pb, que correspondían a las regiones variable y constante de cadena pesada. Los plásmidos de cadena pesada digeridos con XbaI, MluI y BsiW I (panel B, carriles 1B, 2B y 6B) mostraban bandas en 1000 pb y 500 pb, que corresponden a las regiones constante y variable de cadena pesada, respectivamente. El clon 4 (panel B) no apareció en absoluto, indicando que existía un problema con el diseño de la reacción.

Figura 36. Datos brutos de secuencia para los clones de pNEF38 (H460-16-2 Vk) y pDEF38 (H460-16-2 Vh).

Figura 37. Mapa de pMPGCR5IgG1-Vk+hH460. R&B poli A: Señal de poliadenilación de β-globina de conejo; phCMV: promotor de citomegalovirus; Ad TpI: líder tripartito de adenovirus; P2 (6): dominio de unión para el transactivador cumato (cTA); IgG1-Vhh460: secuencia codificante de la cadena pesada de H460-16-2; VkH460: secuencia codificante de la cadena ligera de H460-16-2; BK T 3': porción del antígeno T grande del virus BK; TK: timidina quinasa; enh MPL: intensificador del promotor tardío mayor de adenovirus.

Figura 38. Mapa de pMPGCR5B43k.

Figura 39. Mapa de pkCR5B43G3.

Figura 40. Cuantificación mediante transferencia western de H460-16-2 (isotipo IgG1) producido por los diferentes clones (carriles 1 a 6: 0, 25, 50, 100, 150 y 200 ng de IgG humana, respectivamente; carril 7: clón 17; carril 8: clón 71; carril 9: clón 80; carril 10: clón 6'; carril 11: clón 47'; carril 12: clón 147'; carril 13: 100 ng de H460-16-2 puro; carril 14: 10 microlitros de suero de hibridoma).

Figura 41. Cuantificación mediante SDS-PAGE de H460-16-2 (isotipo IgG1) producido por los diferentes clones (carriles 1 a 5: 50, 100, 150, 200 y 0 ng de IgG humana, respectivamente; carril 6: clón 17; carril 7: clón 71; carril 8: clón 80; carril 9: clón 6'; carril 10: clón 47'; carril 11: clón 147'; carril 12: 100 ng de IgG humana con sobrenadante celular; carril 13: 100 ng de H460-16-2 puro; carril 14: 10 microlitros de suero de hibridoma).

Figura 42. Mapa de pMPGCR5VK+h460-IgG2. R&B poli A: Señal de poliadenilación de β-globina de conejo; phCMV: promotor de citomegalovirus; Ad TpI: líder tripartito de adenovirus; P2 (6): dominio de unión para el transactivador cumato (cTA); Vh-H460IgG2 : secuencia codificante de la cadena pesada de H460-16-2; Vk-H460: secuencia codificante de la cadena ligera de H460-16-2. BK T: porción del antígeno T grande del virus BK; TK: timidina quinasa; enh MPL: intensificador del promotor tardío mayor de adenovirus.

Figura 43: Lista de cebadores utilizados para construir el isotipo IgG2 quimérico de H460-16-2.

Figura 44. Expresión del isotipo IgG2 de H460-16-2 mediante transferencia western tras la primera ronda de clonación. Se resuspendieron 250.000 células de los clones seleccionados en 500 microlitros de medio. Tras 24 horas a 37ºC, se analizaron 10 microlitros de sobrenadante mediante transferencia western utilizando un anticuerpo antihumano conjugado con HRP.

Figura 45. Se sembraron en placas células de diferentes subclones a una densidad de 5,0x105 células/ml a 37ºC. Al alcanzar las células una densidad de 1,5 a 2,0x106 células/ml, se transfirieron a 30ºC. Tras 7 días a 30ºC, se analizó la cantidad indicada de sobrenadante mediante SDS-PAGE, seguido de la tinción con naranja-flúor de Coomassie. Se indica la cantidad (ng/microlitro) de anticuerpo producido.

Figura 46. Caracterización de los clones quiméricos (ch)ARH460-16-2-IgG1 mediante transferencia western en fracciones de membranas totales de células MDA-MB-231.

Figura 47. Caracterización de los clones quiméricos (ch)ARH460-16-2-IgG2 mediante transferencia western en fracciones de membranas totales de células MDA-MB-231.

Figura 48. Análisis de la concentración de anticuerpo mediante SDS-PAGE seguido de tinción con naranja-flúor de Coomassie del anticuerpo producido por el clon 6' de CHOcTA.

Figura 49. Análisis de la concentración de anticuerpo mediante SDS-PAGE seguido de tinción con naranja-flúor de Coomassie del anticuerpo producido por el clon 40B7.

La figura 50 muestra el efecto del tratamiento con H460-16-2, (ch)ARH460-16-2-IgG1 y (ch)ARH460-16-2-IgG2 sobre el crecimiento tumoral en un modelo de ratón de cáncer de mama humano. El volumen tumoral se presenta como media de grupo ± SEM. Las líneas discontinuas verticales indican el primer y último día de dosificación.

La figura 51 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpos monoclonales sobre el peso corporal durante el periodo de estudio. El peso corporal se presenta como media de grupo ± SEM.

La figura 52 representa los efectos apoptóticos totales de los anticuerpos murino y quimérico de H460-16-2 obtenidos en dos (2) experimentos de tinción con anexina-V separados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En general, los términos o expresiones siguientes presentan la definición indicada en su uso en la descripción resumida, descripción, ejemplos y reivindicaciones.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y concretamente cubre, por ejemplo, anticuerpos monoclonales individuales (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizadores, anticuerpos desinmunizados, murinos, quimerizados y humanizados), composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos de cadena sencilla, inmunoconjugados y fragmentos de anticuerpos (ver posteriormente).

La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos exceptos por posibles mutaciones naturales que pueden encontrarse presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, ya que se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante de un antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales resultan ventajosos en el aspecto de que pueden sintetizarse sin contaminación con otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica el caráter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que deben utilizarse según la presente invención pueden prepararse mediante el método del hibridoma (murino o humano), descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495, 1975, o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos fágicos utilizando técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991, y en Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581597, 1991, por ejemplo.

Los "fragmentos de anticuerpos comprenden una parte de un anticuerpo intacto, comprendiendo preferentemente la región de unión a antígeno o variable del mismo. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpos se incluyen anticuerpos de longitud menor a la completa, fragmentos Fab, Fb', F(ab')2 y Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla, anticuerpos de cadena sencilla, moléculas de anticuerpos de dominio único, proteínas de fusión, proteínas recombinantes y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de uno o más fragmentos de anticuerpo.

Un anticuerpo "inacto" es uno que comprende una región variable de unión a antígeno así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de cadena pesada CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo dominios constantes de secuencia nativa humanos) o variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo intacto presenta una o más funciones efectoras.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos se dividen en "clases": existen cinco clases principales de anticuerpo intacto: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y algunas de ellas pueden dividirse adicionalmente en "subclases" (isotipos), por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpo se denominan α, δ, ε, γ y m, respectivamente. Las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulina son bien conocidas.

Las "funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Entre los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo se incluyen la unión de C1q, la citotoxicidad dependiente del complemento, la unión de receptor de Fc, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis, la regulación negativa de los receptores de superficie celular (por ejemplo receptores de células B, BCR), etc.

La expresión "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan receptores de Fc (FcR) (por ejemplo células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen anticuerpos unidos sobre una célula diana y posteriormente provocan la lisis de la célula diana. Las células primarias para mediar la ADCC, las células NK,

expresan únicamente FcγRIII, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcγRIII. La expresión de FcR

sobre las células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3, en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92, 1991. Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de intrés, puede llevarse a cabo un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la patente US nº 5.500.362 ó nº 5.821.337. Entre las células efectoras útiles para dichos ensayos se incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo en un modelo animal, tal como se da a conocer en Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656, 1998.

Las "células efectoras" son leucocitos que expresan uno o más FcR y llevan a cabo funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan por lo menos FcγRIII y llevan a cabo una función efectora de ADCC. Entre los ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC se incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), células T citotóxicas y neutrófilos, siendo preferentes las PBMC y las células NK. Las células efectoras pueden aislarse a partir de una fuente nativa de las mismas, por ejemplo de sangre o PBMC tal como se indica en la presente memoria.

Las expresiones "receptor de Fc" o "FcR" se utilizan para referirse a un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferente es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferente es uno que se

une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcγRI, FcγRII y FcγRIII,

incluyendo variantes alélicas y formas de procesamiento alternativo de dichos receptores. Entre los receptores

FcγRII se incluyen FcγRIIA (un "receptor activador") y FcγRIIB (un "receptor inhibidor"), que presentan secuencias

de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. El receptor

activador FcγRIIA contiene un motivo de activación de inmunorreceptor basado en tirosinas (ITAM) en su dominio citoplasmático. El receptor inhibidor FcγRIIB contiene un motivo de inhibición de inmunorreceptor basado en tirosinas (ITIM) en su dominio citoplasmático (ver revisión en Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234, 1997). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods 4:25-34, 1994; y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41, 1995. Otros FcR, incluyendo los que serán identificados en el futuro, se encuentran comprendidos en el término "FcR" en la presente memoria. El término incluye además el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587, 1976, y Kim et al., Eur. J. Immunol. 24:2429, 1994).

La expresión "citotoxicidad dependiente del complemento", o "CDC", se refiere a la capacidad de una molécula de lisar una diana en presencia del complemento. La ruta de activación del complemento es iniciada por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo a un anticuerpo) acomplejado con un antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, puede llevarse a cabo un ensayo de CDC, por ejemplo tal como el descrito en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163, 1996.

El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas partes de los dominios variables difieren extensivamente en su secuencia entre anticuerpos y se utiliza en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se encuentra distribuida uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Se encuentra concentrada en tres segmentos denominados regiones hipervariables, en los dominios variables de tanto cadena ligera como cadena pesada. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco (FR). Cada uno de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprende cuatro FR, que adoptan en gran medida una

configuración de hoja β, conectados mediante tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en

algunos casos forman parte, de la estructura de hoja. Las regiones hipervariables en cada cadena son mantenidas en estrecha proximidad por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno sino que muestran diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

La expresión "región hipervariable" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a los residuos aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo los residuos 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) y 89 a 97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31 a 35 (H1), 50 a 65 (H2) y 95 a 102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo los residuos 2632 (L1), 50 a 52 (L2) y 91 a 96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) y 96 a 101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901917, 1987. Los residuos de “región marco” o residuos “FR” son aquellos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable tal como se definen en la presente memoria. La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizar con facilidad. El tratamiento con pepsina rinde un fragmento F(ab')2, que presenta dos sitios de unión a antígeno y todavía es capaz de entrecruzar antígeno.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de antígeno y de unión a antígeno completos. Esta región consiste de un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en asociación no covalente estrecha. En esta configuración, las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan definiendo un sitio de unión a antígeno sobre la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis regiones hipervariables proporcionan especificidad de unión de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprenda únicamente tres regiones hipervariables específicas de un antígeno) presenta la capacidad de reconocer y unirse a un antígeno, aunque a una menor afinidad que el sitio de unión completo. El fragmento Fab contiene además el dominio constante de la cadena ligear y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos cuantos residuos en el extremo carboxi-terminal del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en la presente memoria para Fab', en la que el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes portan por lo menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente fueron producidos como parejas de fragmentos Fab' que presentaban cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden clasificarse en dos tipos

claramente diferenciados, denominados kappa (κ) y lambda (λ), basándose en la secuencia de aminoácidos de sus

dominios constantes.

Los fragmentos "Fv de cadena sencilla", o "scFv", comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en los que estos dominios se encuentran presentes en una única cadena polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende además un conector polipéptido entre los dominios VH y VL que permite que scFv forme la estructura deseada para la unión de antígenos. Para una revisión de scFv, ver Plückthun, en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore, editores, Springer-Verlag, New York, páginas 269 a 315, 1994.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo los fragmentos un dominio pesado variable (VH) conectado con un dominio ligero variable (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante la utilización de un conector excesivamente corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza que los dominios se emparejen con los dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen en mayor detalle en, por ejemplo, nº EP 404.07, nº WO 93/11161, y en Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993.

Un anticuerpo “aislado” es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su

ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y entre ellos se incluyen enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que por lo menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no se encontrará presente. Sin embargo, habitualmente el anticuerpo aislado se prepará mediante por lo menos una etapa de purificación.

Un anticuerpo "que se une" a un antígeno de interés, por ejemplo la fracción antigénica CD44, es uno capaz de unirse a la fracción antigénica con suficiente afinidad para que el anticuerpo resulte útil como agente terapéutico con diana en la célula que expresa el antígeno. En el caso de que el anticuerpo sea uno que se une a la fracción antigénica CD44, habitualmente se unirá a la fracción antigénica CD44 con preferencia a otros receptores, y no incluye la unión incidental, tal como el contacto con Fc no específico o la unión a modificaciones post-traduccionales comunes a otros antígenos y puede ser uno que no reaccione cruzadamente en grado significativo con otras proteínas. Los métodos para la detección de un anticuerpo que se une a un antígeno de interés son bien conocidos de la técnica y entre ellos pueden incluirse, aunque sin limitación, ensayos tales como FACS, ELISA celular y transferencia western.

Tal como se utilizan en la presente memoria, las expresiones “célula”, “línea celular” y “cultivo celular” se utilizan intercambiablemente y la totalidad de dichas expresiones incluye la progenie. También debe interpretarse que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o naturales. Se encuentra incluida la progenie mutante que presenta la misma función o actividad biológica según el cribado realizado para la célula originalmente transformada. Resultará claro a partir del contexto en qué casos se pretenden utilizar las diferentes denominaciones.

El término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en el que el objetivo es impedir o enlentecer (reducir) la condición o trastorno patológico diana. Entre los que requieren tratamiento se incluyen aquellos que ya presentan el trastorno, así como aquellos con tendencia a presentar el trastorno o en los que debe evitarse el trastorno. Por lo tanto, podría haberse diagnosticado el trastorno en el mamífero que debe tratarse en la presente memoria o podría estar predispuesto o ser susceptible de sufrir el trastorno.

Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza

típicamente por el crecimiento o muerte celulares no reguladas. Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, aunque sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o neoplasias malignas linfoides. Entre los ejemplos más particulares de dichos cánceres se incluyen el cáncer de células escamosas (por ejemplo el cáncer epitelial de células escamosas), el cáncer pulmonar, incluyendo el cáncer pulmonar de células pequeñas, el cáncer pulmonar de células no pequeñas, el adenocarcinoma de pulmonar y el carcinoma pulmonar escamoso, el cáncer de peritoneo, el cáncer hepatocelular, el cáncer gástrico o de estómago, incluyendo el cáncer gastrointestinal, el cáncer pancreático, el glioblastoma, el cáncer cervical, el cáncer ovárico, el cáncer hepático, el cáncer de vejiga, el hepatoma, el cáncer de mama, el cáncer de colon, el cáncer rectal, el cáncer colorrectal, el carcinoma endometrial o uterino, el carcinoma de glándulas salivares, el cáncer de riñón o renal, el cáncer de próstata, el cáncer vulvar, el cáncer de tiroides, el carcinoma hepático, el carcinoma anal, el carcinoma peneano, así como el cáncer de cabeza y cuello.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico que resulta útil en el tratamiento del cáncer. Entre los agentes quimioterapéuticos se incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo, tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro de óxido mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carnomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostana, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedores de ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatona; glucósido aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2’,2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por ejemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y docetaxel (TAXOTERE®, Aventis, Rhone-Pou-lenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriormente indicados. También se encuentran incluidos en dicha definición agentes antihormonales que actúan regulando o inhibiendo la acción hormonal sobre tumores tales como antiestrógenos, incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, aromatasa inhibidora de 4(5)-imidazolas, 4hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston), y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprólido y goserelina, y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriormente indicados.

El término "mamífero" para los fines del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, ratones, ratones SCID o desnudos o cepas de ratones, animales domésticos o de granja, y animales de zoológico, de competición o de compañía, tales como ovejas, perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente el mamífero en la presente memoria es el ser humano.

Los "oligonucleótidos" son polidesoxinucleótidos de cadena sencilla o de doble cadena de longitud corta que se sintetizan químicamente mediante métodos conocidos (tales como las técnicas de fosfotriéster, de fosfito, o de fosforamidita, utilizando técnicas en fase sólida tales como las descritas en la patente EP nº 266.032, publicada el 4 de mayo de 1988, o mediante intermediarios H-fosfonato de desoxinucleósido, tal como describen Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14:5399-5407, 1986. A continuación se purifican en geles de poliacrilamida.

A menos que se indique lo contrario, la expresión "fracción antigénica CD44" cuando se utiliza en la persente memoria se refiere a la glucoproteína de unión al ácido hialurónico (AH) de cadena sencilla, también denominada receptor hialuronato, H-CAM, gp85 y Hermes.

Un anticuerpo que induce "apoptosis" es uno que induce la muerte celular programada según determina la unión de anexina V, la fragmentación del ADN, el encogimiento celular, la dilatación del retículo endoplasmático, la fragmentación celular y/o la formación de vesículas membranales (denominadas cuerpos apoptóticos).

Los anticuerpos monoclonales en la presente memoria incluyen concretamente anticuerpos "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, con la condición de que muestren la actividad biológica deseada (patente US nº 4.816.567 y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984).

La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-CD44 que es una forma quimerizada del anticuerpo monoclonal codificado por un hibridoma depositado en el IDAC con el número de acceso 280104-06, en el que la totalidad de las regiones CDR del anticuerpo anti-CD44 quimerizado corresponden a las regiones CDR del anticuerpo según la reivindicación 1 y en el que el anticuerpo anti-CD44 quimerizado inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 y en el que el anticuerpo anti-CD44 quimerizado presenta propiedades citotóxicas in vitro contra células tumorales malignas pero no células normales y en el que dicho anticuerpo anti-CD44 quimerizado media en la inhibición del crecimiento tumoral y extensión de la supervivencia en modelos in vivo de cáncer humano.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo receptor se sustituyen por residuos de las CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo, que presentan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de región marco (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por residuos de FR no humano correspondientes. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran en las secuencias de FR del anticuerpo receptor ni en las secuencias de FR importadas. Estas modificaciones se llevan a cabo para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. El anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables en los que la totalidad de las CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de los residuos de FR son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana.

La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-CD44 que es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal codificado por un hibridoma depositado en el IDAC con el número de acceso 280104-06, en el que la totalidad de las regiones CDR del anticuerpo anti-CD44 quimerizado corresponden a las regiones CDR del anticuerpo según la reivindicación 1 y en el que el anticuerpo anti-CD44 quimerizado inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 y en el que el anticuerpo anti-CD44 quimerizado presenta propiedades citotóxicas in vitro contra células tumorales malignas pero no células normales y en el que dicho anticuerpo anti-CD44 quimerizado media en la inhibición del crecimiento tumoral y extensión de la supervivencia en modelos in vivo de cáncer humano.

Los anticuerpos "des-inmunizados" son inmunoglobulinas que son no inmunogénicas, o menos inmunogénicas, en una especie dada. La des-inmunización puede conseguirse mediante alteraciones estructurales del anticuerpo. Puede utilizarse cualquier técnica de des-inmunización conocida por el experto en la materia. Una técnica adecuada para des-inmunizar anticuerpos se describe, por ejemplo, en el documento WO nº 00/34317, publicado el 15 de junio de 2000.

La "homología" se define como el porcentaje de residuos en la secuencia variante de aminoácidosc que son idénticos tras alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para alcanzar el máximo porcentaje de homología. Los métodos y programas informáticos para la alineación son bien conocidos de la técnica.

En la totalidad de la presente memoria, las líneas celulares de hibridoma, así como los anticuerpos monoclonales aislados que se producen a partir de las mismas, se denominan alternativamente según su denominación interna, H460-16-2 y AR37A335.8, o denominación en el depósito, ATCC nº de acceso PTA-4621 ó IDAC 280104-06, respectivamente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "ligando" incluye una fracción que muestra especificidad de unión para un antígeno diana y que puede ser una molécula de anticuerpo intacta y cualquier molécula que presente por lo menos una región de unión a antígeno o parte de la misma (es decir, la parte variable de una molécula de anticuerpo), por ejemplo una molécula de Fv, una molécula de Fab, una molécula de Fab', una molécula de F(ab')2, un anticuerpo biespecífico, una proteína de fusión o cualquier molécula manipulada genéticamente que reconozca específicamente y se una al antígeno unido al anticuerpo monoclonal aislado producido por la línea celular de hibridoma denominada ATCC nº de acceso PTA-4621 ó IDAC 280104-06 (antígeno ATCC nº PTA-4621 ó IDAC 2801004-06) Tal como se utiliza en la presente memoria, "región de unión a antígeno" se refiere a una parte de la molécula que reconoce el antígeno diana.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "inhibe competitivamente" se refiere a que puede reconocer y unirse a un sitio determinante al que se dirige el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma denominada PTA-4621 ó IDAC 280104-06 (el anticuerpo PTA-4621 ó IDAC 280104-06) utilizando ensayos de competición convencionales de anticuerpo recíproco (Belanger L., Sylvestre C. y Dufour D., Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta 48:15, 1973).

Tal como se utiliza en la presente memoria, "antáigeno diana" es el antígeno PTA-4621 ó IDAC 280104-06 ó partes del mismo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un "inmunoconjugado" se refiere a cualquier molécula o ligando tal como un anticuerpo unido química o biológicamente a una citotoxina, agente radioactivo, enzima, toxina, fármaco antitumoral o agente terapéutico. El anticuerpo puede encontrarse unido a la citotoxina, agente radioactivo, fármaco antitumoral o agente terapéutico en cualquier sitio a lo largo de la molécula con la condición de que pueda unirse a su diana. Entre los ejemplos de inmunoconjugados se incluyen conjugados químicos de anticuerpo-toxina y proteínas de fusión de anticuerpo-toxina.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una "proteína de fusión" se refiere a cualquier proteína quimérica en la que una región de unión a antígeno se encuentra conectada con una molécula biológicamente activa, por ejemplo una toxina, enzima o proteína farmacológica.

Con el fin de que la invención descrita en la presente memoria se entiende más completamente, se proporciona la descripción siguiente.

La presente exposición describe ligandos (es decir, ligandos PTA-4621 ó IDAC 280104-06) que reconocen y se unen específicamente al antígeno PTA-4621 ó IDAC 280104-06.

El ligando puede ser el anticuerpo IDAC 280104-06.

En otras realizaciones, el ligando es un fragmento de unión a antígeno que puede ser una molécula Fv (tal como una molécula Fv de cadena sencilla), una molécula Fab, una molécula Fab', una molécula F(ab')2, una proteína de fusión, un anticuerpo biespecífico, un heteroanticuerpo o cualquier molécula recombinante con la región de unión a antígeno del anticuerpo PTA-4621 ó IDAC 280104-06. El ligando de la invención se dirige al epítopo al que se dirige el anticuerpo monoclonal PTA-4621 ó IDAC 280104-06.

El ligando de la invención puede modificarse, es decir, mediante modificaciones de aminoácidos dentro de la molécula, de manera que se producen moléculas derivadas. La modificación química también es posible.

Las moléculas derivadas conservan la propiedad funcional del polipéptido, es decir, la molécula con dichas sustituciones todavía podrá permitir la unión del polipéptido al antígeno IDAC 280104-06 ó partes del mismo.

Entre estas sustituciones de aminoácidos se incluyen, aunque sin limitarse necesariamente a ellas, las sustituciones de aminoácidos conocidas en la técnica como "conservadoras".

Por ejemplo, es un principio bien establecido de la química de las proteínas que determinadas sustituciones de aminoácidos denominadas "sustituciones de aminoácidos conservadoras" pueden llevarse a cabo con frecuencia en una proteína sin alterar la conformación o la función de la proteína.

Entre dichos cambios se incluyen sustituir cualquier de entre isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrofóbicos: ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Otras sustituciones también pueden considerarse conservadoras, según el ambiente del aminoácido particular y su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, la glicina (G) y la alanina (A) con frecuencia pueden ser intercambiables, al igual que la alanina y la valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrofóbica, con frecuencia puede intercambiarse por leucina e isoleucina, y en ocasiones por valina. La lisina (K) y la arginina (R) con frecuencia son intercambiables en sitios en los que la característica significativa del residuo aminoácido es su carga y la diferencia de pK de estos dos residuos aminoácidos no es significativa. Todavía otros cambios pueden considerarse "conservadores" en ambientes particulares.

Dado un anticuerpo, un experto ordinario en la materia podrá generar un ligando competitivamente inhibidor, por ejemplo un anticuerpo competidor, que es uno que reconoce el mismo epítopo (Belanger et al., 1973). Un método comprendería inmunizar con un inmunógeno que expresa el antígeno reconocido por el anticuerpo. La muestra puede incluir, aunque sin limitarse a ellos, un tejido, una o más proteínas aisladas o una o más líneas celulares. Los hibridomas resultantes pueden cribarse utilizando un ensayo competitivo, que es uno que identifica los anticuerpos que inhiben la unión del anticuerpo de ensayo, tal como ELISA, FACS o inmunoprecipitación. Otro método utiliza bibliotecas de expresión fágica y el enriquecimiento cíclico por "panning" para anticuerpos que reconocen dicho antígeno (Rubinstein et al., 2003). En cualquiera de los casos, se seleccionan los hibridomas basándose en su capacidad de competir y ganar en la unión del anticuerpo original a su antígeno diana. Por lo tanto, dichos hibridomas presentarían la característica de reconocer el mismo antígeno que el anticuerpo original y más concretamente reconocerían el mismo epítopo.

EJEMPLO 1

Producción de hibridoma -línea celular de hibridoma AR37A335.8

Se depositó la línea celular de hibridoma AR37A335.8, según el Tratado de Budapest, en el International Depository Authority of Canada (IDAC), Bureau of Microbiology, Health Canada, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada, R3E 3R2, el 28 de enero de 2004, bajo el número de acceso 280104-06. Según 37 CFR 1.808, los depositantes garantizan que todas las restricciones impuestas sobre la disponibilidad para el público de los materiales depositados será irrevocablemente levantada tras la concesión de una patente.

Para producir el hibridoma que produce el anticuerpo anticáncer AR37A335.8, se preparó en PBS una suspensión fresca de células individuales de la línea celular de cáncer de próstata PC-3 que había sido cultivada como tumor sólido en ratones SCID. Se preparó adyuvante IMMUNEASYT™ (Qiagen, Venlo, Países BAjos) para la utilización mediante mezcla suave. Se inmunizaron ratones BALB/c de cinco a siete semanas de edad por vía subcutánea con 2 millones de células en 50 microlitros de adyuvante de antígeno. Se utilizó adyuvante de antígeno recién preparado para reforzar los ratones inmunizados por vía intraperitoneal, 2 y 5 semanas después de la inmunización inicial, con 2 millones de células en 50 microlitros. Se utilizó un bazo para la fusión tres días después de la última inmunización. Los hibridomas se prepararon fusionando los esplenocitos aislados con parejas de mieloma NSO-1. Los sobrenadantes de las fusiones se sometieron a ensayo para la subclonación de los hibridomas.

Para determinar si los anticuerpos secretados por las células de hibridoma eran del isotipo IgG o IgM, se utilizó un ensayo ELISA. Se añadieron a las placas de ELISA durante la noche 100 microlitros/pocillo de IgG de cabra antiratón + IgM (H+L) a una concentración de 2,4 microgramos/ml en tampón de recubrimiento (tampón de carbonato 0,1 M/bicarbonato, pH 9,2 a 9,6) a 4ºC. Las placas se lavaron tres veces en tampón de lavado (PBS + Tween al 0,05%). Se añadieron a la placa 100 microlitos/pocillo de tampón de bloqueo (leche al 5% en tampón de lavado) durante 1 hora a temperatura ambiente y después tres veces en tampón de lavado. Se añadieron 100 microlitros/pocillo de sobrenadante de hibridoma y la placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado y se añadió una dilución 1/100.000 de conjugado de IgG o IgG de cabra antiratón con peroxidasa de rábano picante (diluido en PBSA que contenía leche al 5%), 100 microlitros/pocillo. Tras incubar la placa durante 1 hora a temperatura ambiente, la placa se lavó tres veces con tampón de lavado. Se incubaron 100 microlitros/pocillo de solución de TMB durante 1 a 3 minutos a temperatura ambiente. Se terminó la reacción de color mediante la adición de 100 microlitros/pocillo de H2SO4 2 M y la placa se leyó a 450 nm con un lector de placas HTS7000 de Perkin-Elmer. Tal como se indica en la figura 1, el hibridoma AR37A335.8 secretaba principalmente anticuerpos del isotipo IgG.

Para determinar la subclase de anticuerpo secretada por las células de hibridoma, se llevó a cabo un experimento de isotipado utilizando un kit de isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Se añadió a un tubo de ensayo sobrenadante de hibridoma que contenía anticuerpos (en una dilución 1:10 con TBS-T) con una tira de isotipado que portaba anticuerpo de cabra específico para los diferentes tipos de cadena peptídica. Se agitó el tubo durante 15 minutos. A continuación la tira se lavó dos veces con TBS-T durante 5 minutos bajo agitación. Se añadió un anticuerpo antiratón específico de especie marcado con peroxidasa (en una dilución

1:500 con TBS-T) al tubo de ensayo durante 15 minutos, con el fin de detectar el anticuerpo monoclonal unido al anticuerpo de cabra en la tira. A continuación la tira se lavó nuevamente dos veces con TBS-T durante 5 minutos bajo agitación. El anticuerpo marcado con peroxidasa unido a la tira seguidamente se detectó utilizando un sistema de sustrato de peroxidasa. Se disolvió una tableta de 30 mg de 4-cloro-1-naftol en 10 ml de etanol frío y se diluyó una gota de solución de peróxido de hidrógeno (al 30% v/v) en 50 ml de TBS. Se combinaron las dos soluciones inmediatamente antes de la utilización y se añadieron 3 ml a la tira de isotipado durante 15 minutos bajo agitación. A continuación se descartó la solución de sustrato y la tira se lavó tres veces con 5 ml de agua destilada bajo agitación. La tira de tipado seguidamente se extrajo del tubo de ensayo y se analizó para obtener los resultados. El anticuerpo anticáncer AR37A335.8 era del isotipo IgG2b, lambda.

Tras una ronda de dilución limitante, se sometieron a ensayo los sobrenadantes de hibridoma para anticuerpos que se unían a las células diana en un ensayo ELISA celular. Se sometieron a ensayo dos líneas celulares de cáncer de próstata humano y 1 línea celular de piel normal humana: PC-3, LnCap y CCD-27sk, respectivamente. Las células sembradas en placa se fijaron previamente a la utilización. Las placas se lavaron tres veces con PBS que contenía MgCl2 y CaCl2 a temperatura ambiente. Se añadieron 100 microlitros de paraformaldehído al 2% diluidos en PBS a cada pocillo durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se descartaron. Las placas se lavaron nuevamente con PBS que contenía MgCl2 y CaCl2 tres veces a temperatura ambiente. El bloqueo se llevó a cabo con 100 microlitros/pocillo de leche al 5% en tampón de lavado (PBS + Tween al 0,05%) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado y el sobrenadante del hibridoma se añadió a 100 microlitos/pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado y se añadieron 100 microlitros/pocillo de una dilución 1/25.000 de conjugado de IgG de cabra antiratón con peroxidasa de rábano picante (diluido en PBSA que contenía leche al 5%). Tras 1 hora de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado y se incubaron 100 microlitros/pocillo de sustrato TMB durante 1 a 3 minutos a temperatura ambiente. Se terminó la reacción de color mediante la adición de 100 microlitros/pocillo de H2SO4 2 M y la placa se leyó a 450 nm con un lector de placas HTS7000 de Perkin-Elmer. Los resultados tabulados en la figura 1 se expresan como número de veces sobre el nivel de fondo en comparación con un control de isotipo de IgG del propio laboratorio que previamente había demostrado no unirse a las líneas celulares sometidas a ensayo. Los anticuerpos del hibridoma AR37A335.8 mostraron unión sustancial a la línea celular de cáncer de próstata PC-3 y a la línea celular de piel CCD-27sk. AR37A335.8 no mostró ninguna unión detectable a otra línea celular de cáncer de próstata LnCap.

Conjuntamente con el ensayo para la unión de anticuerpo, se sometió a ensayo el efecto citotóxico de los sobrenadantes de hibridoma en las mismas líneas celulares: PC-3, LnCap y CCD-27sk. Se obtuvo calceína AM de Molecular Probes (Eugene, OR). Los ensayos se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante con los cambios descritos de manera general posteriormente. Las células se sembraron en placa antes del ensayo a la densidad apropiada predeterminada. Tras 2 días, se transfirieron 100 ml del sobrenadante de las placas de microtitulación de hibridoma a las placas celulares y se incubaron en un incubador con 5 por ciento de CO2 durante 5 días. Los pocillos que sirvieron de controles positivos se aspiraron hasta vaciarlos y se añadieron 100 microlitros de azida sódica (NaN3) o cicloheximida. Tras 5 días de tratamiento, las placas se vaciaron mediante inversión y se secaron con material absorbente. Se dispensó DPBS (solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato) a temperatura ambiente que contenía MgCl2 y CaCl2 en cada pocillo desde una botella dosificadora multicanal, se golpeó suavemente 3 veces y se vacío mediante inversión y después se secó con material absorbente. Se añadieron a cada pocillo 50 microlitros del pigmento calceína fluorescente diluido en DPBS que contenía MgCl2 y CaCl2 a cada pocillo y se incubó a 37ºC en un incubador con 5% de CO2 durante 30 minutos. Las placas se leyeron en un lector de placas de fluorescencia HTS7000 de Perkin-Elmer y los datos se analizaron en Microsoft Excel. Se tabulan los resultados en la figura 1. El hibridoma AR37A335.8 produjo citotoxicidad específica de 16 por ciento en células LnCap, que era 21 y 30 por ciento de la citotoxicidad obtenida con los controles positivos de azida sódica y cicloheximida, respectivamente. Los resultados de la figura 1 demuestran que los efectos citotóxicos de AR37A335.8 no eran proporcionales a los niveles de unión sobre los tipos de célula cancerosa. Se produjo un nivel mayor de citotoxicidad en las células LnCap que en las células PC-3, aunque el nivel de unión en las células PC-3 era más elevado. Por lo tanto, el nivel de unión no era necesariamente predictivo del resultado de ligación de anticuerpo de su antígeno afín, y era un resultado no evidente. Lo anterior sugiere que el contexto de la ligación de los anticuerpos en diferentes células determina la citotoxicidad y no simplemente la unión del anticuerpo. Tal como se tabula en la figura 1, AR37A335.8 no produjo citotoxicidad en la línea celular normal CCD-27sk. Los agentes citotóxicos no específicos conocidos cicloheximida y NaN3 generalmente produjeron citotoxicidad tal como se esperaba.

EJEMPLO 2

Producción de anticuerpos:

Se produjo anticuerpo monoclonal AR37A335.8 mediante el cultivo del hibridoma en matraces CL-1000 (BD Biosciences, Oakville, ON) con recolecciones y siembras dos veces a la semana. Se siguieron procedimientos estándares de purificación de anticuerpos con proteína G-sefarosa 4 Fast Flow (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC). Se encuentra comprendido dentro del alcance de la presente invención utilizar anticuerpos monoclonales que son humanos, desinmunizados, humanizados, quimerizados o murinos.

Se comparó AR37A335.8 con varios controles tanto positivos (anti-EGFR (C225, IgG1, kappa, 5 microgramos/ml, Cedarlane, Hornby, ON), cicloheximida (CHX, 0,5 micromolar, Sigma, Oakville, ON) y NaN3 (al 0,1%, Sigma, Oakville, ON) y negativos (MPC-11 (especificidad antigénica desconocida, IgG2b, kappa, 20 microgramos/ml, BD Biosciences, Oakville, ON), así como un control de diluyente de tampón en un ensayo de citotoxicidad (figura 2). Se sometieron a ensayo líneas celulares de cáncer de colon (DLD-1 y Lovo) y ovárico (OVCAR-3) y pulmonar no de cáncer (todos de ATCC, Manassas, VA). Se obtuvo calceína AM de Molecular Probes (Eugene, OR). Los ensayos se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante con los cambios descritos de manera general posteriormente. Las células se sembraron en placa antes del ensayo a la densidad apropiada predeterminada. Tras 2 días, se diluyeron en medio 100 microlitros de anticuerpo purificado o de controles y después se transfirieron a las placas celulares y se incubaron en un incubador con 5 por ciento de CO2 durante 5 días. A continuación se vaciaron las placas mediante inversión y se secaron con material absorbente. Se dispensó DPBS a temperatura ambiente que contenía MgCl2 y CaCl2 en cada pocillo desde una botella dosificadora multicanal, se golpeó suavemente 3 veces y se vacío mediante inversión y después se secó con material absorbente. Se añadieron a cada pocillo 50 microlitros del pigmento calceína fluorescente diluido en DPBS que contenía MgCl2 y CaCl2 a cada pocillo y se incubó a 37ºC en un incubador con 5% de CO2 durante 30 minutos. Las placas se leyeron en un lector de placas de fluorescencia HTS7000 de Perkin-Elmer y se analizaron los datos en Microsoft Excel y los resultados se tabularon en la figura 2. Cada anticuerpo recibió una puntuación de entre 5 y 50 basada en la citotoxicidad media observada en cuatro experimentos sometidos a ensayo por triplicado, y una puntuación de entre 25 y 100 basada en la variabilidad observada entre ensayos. La sumida de estas dos puntuaciones (la puntuación de citotoxicidad) se presenta en la figura 2. Una puntuación de citotoxicidad superior o igual a 55 se consideró positiva en la línea celular sometida a ensayo. El anticuerpo AR37A335.8 produjo citotoxicidad en las líneas celulares de cáncer de colon Lovo y DLD-1 respecto a los controles tanto de isotipo como negativo de tampón. El anticuerpo AR37A335.8 no produjo citotoxicidad en la línea celular de cáncer ovárico OVCAR-3. Resulta importante que AR37A335.8 no produjo citotoxicidad específica contra la línea celular no de cáncer Hs888.Lu, indicando que el anticuerpo era específico de las células de cáncer. Los agentes citotóxicos químicos indujeron su citotoxicidad no específica esperada.

La unión de los anticuerpos AR37A335.8 al panel anteriormente indicado de líneas celulares humanas de cáncer y normales se evaluó mediante citometría de flujo (FACS). Las células se prepararon para FACS inicialmente mediante lavado de la monocapa celular con DPBS (sin Ca++ ni Mg++). A continuación, se utilizó tampón de disociación celular (INVITROGEN, Burlington, ON) para desprender las células de sus placas de cultivo celular a 37ºC. Tras la centrifugación y la recolección, las células se resuspendieron en DPBS que contenía MgCl2, CaCl2 y 2 por ciento de suero fetal bovino a 4ºC (medio de tinción) y se contaron, se dividieron en alícuotas hasta la densidad celular apropiada, se peletizaron las células y se resuspendieron en medio de tinción a 4ºC en presencia de anticuerpo de ensayo (AR37A335.8) o anticuerpos de control (control de isotipo, anti-EGFR) a una concentración de 20 microgramos/ml sobre hielo durante 30 minutos. Previamente a la adición de anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488, las células se lavaron una vez con medio de tinción. El anticuerpo conjugado con Alexa Fluor 488 en medio de tinción seguidamente se añadió durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron una última vez y se resuspendieron en medio de fijación (medio de tinción que contenía 1,5% de paraformaldehído). Se realizó el recuento celular mediante citometría de flujo, analizando las muestras en un FACScan con el software CellQuest (BD Biosciences, Oakville, ON). Se fijó la dispersión directa (FSC) y lateral (SSC) de las células ajustando las ganancias de voltaje y de amplitud en los detectores de FSC y SSC. Los rectores del canal de fluorescencia (FITC) se ajustaron pasando las células teñidas únicamene con anticuerpos secundario conjugado con Alexa Fluor 488, de manera que las células presentaban un pico uniforme con una mediana de intensidad de fluorescencia de aproximadamente 1 a 5 unidades. Para cada muestra, se adquirieron aproximadamente 10.000 células fijadas teñidas para el análisis y en la figura 3 se presentan los resultados.

La figura 3 presenta el factor de incremento de la intensidad media de fluorescencia respecto al control de isotipo. Para la figura 4 se compilaron histogramas representativos de los anticuerpos AR37A335.8. AR37A335.8 mostraba unión a todas las líneas celulares sometidas a ensayo. Estos datos demuestran que AR37A335.8 muestra especificidad funcional en el aspecto de que, aunque se produjo una clara unión a todos los tipos de cáncer sometidos a ensayo, sólo se observó citotoxicidad asociada con las células de cáncer de colon Lovo y DLD-1.

EJEMPLO 3

Experimentos con tumores in vivo con células MDA-MB-231

En referencia a las figuras 5 y 6, se implantaron en ratones SCID hembra de 4 a 6 semanas de edad 5 millones de células de cáncer de mama humano (MDA-MB-231) en 100 microlitros de solución salina inyectada por vía subcutánea en la nuca. Los ratones se asignaron aleatoriamente a 2 grupos de tratamiento de 5. El día después de la implantación se administraron por vía intraperitoneal 20 mg/kg de anticuerpo de ensayo AR37A335.8 ó control de tampón en cada cohorte en un volumen de 300 microlitros tras la dilución a partir de la concentración de la solución madre con un diluyente que contenía KCl 2,7 mM, KH2PO4 1 mM, NaCl 137 mM y Na2HPO4 20 mM. A continuación, se administraron las muestras de anticuerpo y de control una vez a la semana durante la totalidad del estudio, un total de 8 dosis, de la misma manera. Se midió el crecimiento tumoral aproximadamente cada séptimo dia utilizando un calibrador. Se registraron los pesos corporales de los animales una vez a la semana durante la totalidad del estudio. Al final del estudio se eutanizaron todos los animales siguiendo las directrices de CCAC.

AR37A335.8 redujo marcadamente el crecimiento tumoral en el modelo profiláctico in vivo de MDA-MB-231 de cáncer de mama humano. El día 55 después de la implantación, 5 días después de la última dosis de tratamiento, el volumen tumoral medio del grupo tratado con AR37A335.8 era 98,8 por ciento más bajo que el volumen tumoral en el grupo tratado con tampón de control (figura 5). El volumen tumoral al final del estudio era significativamente diferente que el del control (p=0,0064, prueba t).

No se observaron signos clínicos de toxicidad durante todo el estudio. El peso corporal medido a intervalos semanales era una variable indicadora de buen estado de salud y retraso del desarrollo. Tal como se observa en la figura 6, los pesos corporales de los grupos tanto de control como tratados con AR37A335.8 durante el curso del estudio.

En conclusión, AR37A335.8 fue bien tolerado y redujo la carga tumoral en este modelo de xenoinjerto de cáncer mama humano.

EJEMPLO 4

Experimentos con tumores in vivo con células SW1116

En referencia a las figuras 7 y 8, se implantaron en ratones SCID hembra de 4 a 6 semanas de edad 5 millones de células de cáncer de colon humano (SW1116) en 100 microlitros de solución salina inyectada por vía subcutánea en la nuca. Los ratones se asignaron aleatoriamente a 2 grupos de tratamiento de 5. El día después de la implantación se administraron por vía intraperitoneal 20 mg/kg de anticuerpo de ensayo AR37A335.8 ó control de tampón en cada cohorte en un volumen de 300 microlitros tras la dilución a partir de la concentración de la solución madre con un diluyente que contenía KCl 2,7 mM, KH2PO4 1 mM, NaCl 137 mM y Na2HPO4 20 mM. A continuación, se administraron las muestras de anticuerpo y de control una vez a la semana durante la totalidad del estudio, un total de 8 dosis, de la misma manera. Se midió el crecimiento tumoral aproximadamente cada séptimo dia utilizando un calibrador. Se registraron los pesos corporales de los animales una vez a la semana durante la totalidad del estudio. Al final del estudio se eutanizaron todos los animales siguiendo las directrices de CCAC.

El tratamiento con AR37A335.8 resultó en la inhibición del crecimiento tumoral en el modelo profiláctico in vivo de SW1116 de cáncer de colon humano. El día 55 después de la implantación, 5 días después de la última dosis de tratamiento, el volumen tumoral medio en el grupo tratado con AR37A335.8 era 48,7 por ciento menor que el volumen tumoral en el grupo tratado con el control de tampón (figura 7). El tratamiento con AR37A335.8 resultó en un volumen tumoral que era significativamente inferior al del control (p=0,0055).

No se observaron signos clínicos de toxicidad durante todo el estudio. El peso corporal medido a intervalos semanales era una variable indicadora de buen estado de salud y retraso del desarrollo. Tal como se observa en la figura 8, los pesos corporales de los grupos tanto de control como tratados con AR37A335.8 durante el curso del estudio. Tampoco existían diferencias de peso corporal entre los dos grupos al final del periodo de tratamiento (día 48) o al final del periodo de seguimiento posterior al tratamiento (día 63).

Por lo tanto, AR37A335.8 resultó bien tolerado y redujo la carga tumoral en este modelo de xenoinjerto de cáncer de colon humano.

EJEMPLO 5

Determinación de la reactividad cruzada entre AR37A335.8 y anti-CD44 H460-16-2

Se sondearon transferencias western de fracciones de membranas totales y de lisados de células completas, con el anticuerpo monoclonal AR37A335.8 y con el anticuerpo monoclonal anti-CD44 H460-16-2. Brevemente, se analizaron 20 microgramos de fracción de membranas totales aislada de células MDA-MB-231 en cultivo y 40 microgramos de lisado de células completas preparado a partir de células PC-3 y CCD27sk en cultivo, mediante electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida al 10%, bajo condiciones no reductoras. Tras la electrotransferencia a membranas de PVDF, se sondearon los filtros con los anticuerpos AR37A355.8 y H460-16-2, siguiendo un protocolo estándar de transferencia western. Los resultados de la transferencia western sondeados con el anticuerpo monoclonal AR37A335.8 revelaron una fuerte similitud con la obtenida con el anticuerpo monoclonal anti-CD44 H460-16-2 (figura 9), sugiriendo que ambos anticuerpos podrían reconocer el mismo antígeno, es decir, CD44. Con el fin de determinar si AR37A335.8 reacciona cruzadamente con la molécula de CD44, se utilizó como sonda en una transferencia western de un complejo inmunoprecipitado obtenido con el anti-CD44 H460-16-2 a partir de la fracción de membranas totales de células en cultivo. Brevemente se incubaron 300 microgramos de fracción de membranas totales de MDA-MB-231 (1 mg/ml concentración final de proteínas) con perlas de proteína G-sefarosa conjugada con H460-16-2 durante 2 horas a 4ºC. Tras el lavado, las perlas se sometieron a ebullición en 1X tampón para muestras SDS-PAGE no reductor y la muestra se analizó mediante electroforesis en un gel preparativo de poliacrilamida al 10%. Tras la electrotransferencia a una membrana de PVDF, se sondearon carriles individuales en la membrana con los anticuerpos AR37A335.8, H460-16-2 y con un control de isotipo de IgG1 según un protocolo de transferencia western estándar. Se utilizaron todos los anticuerpos primarios a una concentración de 5 microgramos/ml. La imagen de la membrana resultante (figura 10) muestra que tanto AR37A335.8 y H460-16-2 reaccionan cruzadamente con el mismo antígeno, demostrando por lo tanto que el anticuerpo AR37A335.8 también reconoce un epítopo contenido dentro de la molécula de CD44.

EJEMPLO 6

Tinción de tejido de tumor de próstata humano

Se llevaron a cabo estudios de IHQ para evaluar adicionalmente la unión de H460-16-2 a tejido de tumor de próstata humano. Previamente se llevaron a cabo estudios de optimización de IHQ con el fin de determinar las condiciones para experimentos adicionales. Se produjeron y se purificaron tal como se ha indicado anteriormente anticuerpos monoclonales H460-16-2.

La unión de los anticuerpos a 53 tejidos de tumor de próstata humano y 3 tejidos de próstata normales se llevó a cabo utilizando una micromatriz de tejidos prostáticos normal y tumoral humanos (Imgenex, San Diego, CA). Se desparafinaron secciones de tejido mediante secado en un horno a 58ºC durante 1 hora y se desparafinaron mediante inmersión en xileno 5 veces durante 4 minutos cada vez en jarras de Coplin. Tras el tratamiento por una serie de lavados gradados de etanol (100%-75%), las secciones se rehidrataron en agua. Los portaobjetos se sumergieron en tampón citrato 10 mM a pH 6 (Dako, Toronto, Ontario), después se irradiaron con microondas a potencia alta, media y baja durante 5 minutos cada vez y finalmente se sumergieron en PBS frío. A continuación, los portaobjetos se sumergieron en solución al 3% de peróxido de hidrógeno durante 6 minutos, se lavaron con PBS tres veces durante 5 minutos cada vez, se secaron, se incubaron con solución de bloqueo universal (Dako, Toronto, Ontario) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se diluyeron H460-16-2, anticuerpo monoclonal de ratón antiantígeno prostático específico de membrana (PSMA, clon 1D11, North West Biotherapeutics, Bothell, WA) o anticuerpo de isotipo de control (dirigido contra la glucosa oxidasa de Aspergillus niger, un enzima que ni se encuentra presente ni es inducible en tejidos de mamífero; Dako, Toronto, Ontario) en tampón de dilución de anticuerpos (Dako, Toronto, Ontario) hasta su concentración de trabajo (5 microgramos/ml para cada anticuerpo excepto para anti-PSMA, que se diluyó hasta 2 microgramos/ml) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron con PBS 3 veces durante 5 minutos cada vez. La inmunorreactividad de los anticuerpos primarios se detectó/visualizó con anticuerpos secundarios conjugados con HRP tal como se suministran (Dako Envision System, Toronto, Ontario) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras esta etapa, los portaobjetos se lavaron con PBS 3 veces durante 5 minutos cada vez y se reveló una reacción de color mediante adición de solución de sustrato cromógeno DAB (tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina, Dako, Toronto, Ontario) para la tinción de inmunoperoxidasa durante 10 minutos a temperatura ambiente. El lavado de los portaobjetos en agua corriente terminó la reacción cromogénica. Tras la contratinción con hematoxilina de Meyer (Sigma Diagnostics, Oakville, ON), los portaobjetos se deshidrataron con etanoles gradados (75%-100%) y se enjuagaron con xileno. Utilizando medio de montaje (Dako Faramount, Toronto, Ontario), se cubrieron los portaobjetos con cubreobjetos. Los portaobjetos se examinaron microscópicamente utilizando un Axiovert 200 (Ziess Canada, Toronto, ON) y se captaron imágenes digitales y se almacenaron utilizando el software de imágenes Northern Eclipse (Mississauga, ON). Se leyeron los resultados, se puntuaron y fueron interpretados por un histopatólogo.

La figura 11 presenta un resumen de los resultados de la tinción con H460-16-2 de una matriz de tejidos prostáticos humanos normales y tumorales. A partir de la tabla, 19/53 (36%) de los tumores sometidos a ensayo eran positivos para H460-16-2. H460-16-2 era específico para las células tumorales y fibroblastos del estroma. La localización celular era mayoritariamente membranosa y membranosa citoplasmática con o sin localización luminal. El porcentaje de células positivas se encontraba comprendido entre <10% y 50%, indicando una unión heterogénea del anticuerpo a las células tumorales. La relación de la unión de los anticuerpos a los estadios tumorales no pudo evaluarse correctamente debido a una discrepancia entre el número de tumores en los diferentes estadios tumorales, siendo 1/1 (100%), 4/12 (33%), 0/2 (0%) y 11/33 (33%) en los estadios I, II, III y IV, respectivamente.

Se produjo una unión más elevada a un tumor con puntuación de Gleason de G3-G4 (36%) que a uno de G1-G2 (25%). La puntuación de Gleason es un sistema de gradar el cáncer de próstata. El sistema de gradado de Gleason asigna un grado a cada uno de las dos áreas más grandes de cáncer en las muestras de tejido. Los grados están comprendidos entre 1 y 5, siendo 1 el menos agresivo y 5 el más agresivo. Los tumores de grado 3, por ejemplo, pocas veces presentan metástasis, aunque las metástasis son comunes con el grado 4 ó 5. Los dos grados seguidamente se suman para producir una puntuación de Gleason. Una puntuación de 2 a 4 se considera de grado bajo; 5 a 7, de grado intermedio, y 8 a 10, de grado elevado. Un tumor con una puntuación de Gleason baja típicamente crece suficientemente despacio para que no suponga una amenaza significativa para el paciente durante su vida.

Las 3 secciones de tejido prostático normal eran positivas para el anticuerpo. Sin embargo, la especificidad de tejido era para el mioepitelio y los fibroblastos del estroma y no afectó al epitelio glandular. La figura 12 demuestra la heterogeneidad de la unión de H460-16-2 a los tumores prostáticos sometidos a ensayo: 10/53, 6/53, 3/53 tumores positivos, en las categorías de <10-10%, <50-50> y >50%, respectivamente. Como resultado de su unión a las células de cáncer de próstata, el beneficio terapéutico de H460-16-2 puede extenderse potencialmente al tratamiento del cáncer de próstata.

EJEMPLO 7

Tinción de tejido de tumor hepático humano

Con el fin de evaluar adicionalmente la unión de H460-16-2 a tejidos de tumor hepático humano, el anticuerpo se sometió a ensayo en una matriz de tejidos de tumor hepático (Imgenex, San Diego, CA). Se proporciona la información siguiente para cada paciente: edad, sexo, órgano y diagnóstico. El procedimiento de tinción utilizado fue el mismo que el dado a conocer en el Ejemplo 6. Se utilizó el mismo anticuerpo de control negativo que el indicado anteriormente. El anticuerpo de control positivo utilizado fue anti-AFP (alfa-1-fetoproteína; clon AFP-11, Abcam, Cambridge, MA). Todos los anticuerpos se utilizaron a una concentración de trabajo de 5 microgramos/ml, excepto para anti-AFP, que se utilizó a una concentración de trabajo de 10 microgramos/ml.

Tal como se da a conocer en la figura 13, el anticuerpo H460-16-2 mostró unión a 21/49 (43%) de los cánceres hepáticos sometidos a ensayo, incluyendo 11/37 (30%) de los primarios, 7/8 (88%) de carcinomas hepatocelulares metastásicos, 1/2 (50%) de los primarios y 2/2 (100%) de los colangiocarcinomas metastásicos. El anticuerpo mostró una unión significativamente más elevada a tumores avanzados en estadios III y IV en comparación con los estadios tempranos I y II (p=0,03) [estadio I, 0/2 (0%); estadio II, 2/17 (12%); estadio III, 8/16 (50%) y estadio IV (75%)]. H460-16-2 era específico de las células tumorales y células inflamatorias infiltrantes. La localización celular era principalmente membranosa. Algunos tumores también mostraron un patrón de tinción citoplasmática difusa. El anticuerpo se unió a 9/9 de los tejidos hepáticos no neoplásicos (figura 14). Sin embargo, la unión se encontraba restrigida a las células sinusoidales y linfocitos infiltrantes. El antígeno H460-16-2 aparentemente se expresa específicamente sobre tejido tumoral hepático avanzado. Por lo tanto, 11460-16-2 presenta potencial como fármaco terapéutico en el tratamiento del cáncer hepático.

EJEMPLO 8

Estudio de apoptosis en tejido tumoral de xenoinjerto de MDA-MB-231 derivado de ratones SCID tratados con H460

H460-16-2 demostró la capacidad de producir supresión del crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de MDA-MB-231 preventivo y establecido in vivo. Utilizando FACS, H460-16-2 también ha demostrado un efecto sobre el ciclado de las células MDA-MB-231 y este efecto ha conducido a un incremento dependiente de la dosis del número de células apoptóticas. Con el fin de aclarar adicionalmente el mecanismo de acción de H460-16-2, se investigó el efecto del tratamiento de H460-16-2 en la apoptosis en los tumores de MDA-MB-231 cultivados in vivo en un modelo de xenoinjerto de cáncer de mama.

Al final del periodo de tratamiento en un modelo establecido de MDA-MB-231 de cáncer de mama humano, los ratones en el grupo de H460-16-2 mostraron un volumen tumoral medio que era 68,8% del volumen en el grupo tratado con control de tampón (proceso similar al dado a conocer en el Ejemplo 10). Dos días después del final del tratamiento, se seleccionaron aleatoriamente 4 ratones de cada grupo y se recolectaron los tumores. Los tumores recolectados se cortaron por la mitad y se fijaron en formalina tamponada al 10%. Tras la fijación, el tejido se recortó adicionalmente, proporcionando una sección de aproximadamente 2 mm de tumor para la inclusión en parafina. Se realizaron esfuerzos razonables para que se encontrarse representada la sección transversal completa del tumor. Se incluyeron los tejidos en parafina, se seccionaron y se montaron sobre portaobjetos para la tinción en el laboratorio de investigación clínica en el Toronto General Hospital (Toronto, ON).

Se evaluó la apoptosis en las secciones de tejido utilziando el kit de detección de apoptosis in situ ApopTag® Plus Peroxidase (S7101) de Chemicon International (Temecula, CA). El kit ApopTag se basa en el ensayo TUNEL y examina la apoptosis mediante evaluación de la fragmentación del ADN. Se utilizó la desoxinucleotidil-transferasa terminal (TdT) para marcar en el extremo los fragmentos con digoxigenín-dNTP. La digoxigenin-dNTP incorporada se detectó utilizando un reactivo de peroxidasa anti-digoxigenina. El protoclo seguido fue el descrito de manera general en el manual proporcionado con el kit. La tinción de ApopTag y la morfología celular se visualizaron utilizando microscopía óptica. Para cada sección, se utilizaron 4 regiones separadas del área viable del tumor para el recuento de las células teñidas. Se procuró no centrarse en las regiones necróticas del tumor. Los recuentos de las 4 regiones separadas se sumaron, proporcionando un recuento total representativo de esa sección. Se repitieron los recuentos 3 veces para cada sección (centrándose cada vez en 4 regiones). Los totales obtenidos de los 3 recuentos se utilizaron para obtener una media para la sección. A continuación, se calcularon recuentos medios para los diferentes grupos de tratamiento. Tal como se muestra en la figura 15, el grupo de control de tampón rindió una puntuación total media de 31,5 células (±14,62), mientras que el grupo tratado con H460-16-2 rindió una puntuación total media de 42,5 células (±3,70). Por lo tanto, existe una tendencia hacia la apoptosis incrementada con tratamiento de H460-16-2 determinada utilizando un ensayo TUNEL.

Las secciones en serie de los tumores teñidos con ApoTag posteriormente se tiñeron con H-E y éstas se examinaron para detectar células apoptóticas utilizando criterios morfológicos tales como la deleción de células individuales, el encogimiento celular y la compactación de la cromatina en una masa densa. Se realizaron recuentos de las células que cumplían estos criterios, tal como se describe en la sección anterior, proporcionando recuentos medios para los grupos de tratamiento. Se incluyó un portaobjetos de control positivo (de tejido de una glándula mamaria de roedor normal post-lactante de 3 a 5 días) en el kit y se tiñó conjuntamente con los portaobjetos de ensayo. Tal como se muestra en la figura 15, el grupo de control de tampón rindió una puntuación total media de 17 células (±5,29), mientras que el grupo tratado con H460-16-2 rindió una puntuación total media de 22,5 células (±4,20). Por lo tanto, existe una tendencia hacia la apoptosis incrementada con el tratamiento de H460-16-2, determinada a partir de la morfología celular.

EJEMPLO 9

Quimerización de H460-16-2

1.0 Clonación de genes de región variable en vectores de secuenciación

Para facilitar la producción de anticuerpos quiméricos, los genes codificantes de las regiones variables de las cadenas tanto pesada como ligera se clonaron separadamente en el vector comercial de secuenciación pCR2.1.

1.1 Aislamiento de ARNm

Se aisló ácido ribonucleico mensajero (ARNm) a partir de un cultivo confluyente de células de hibridoma H460-16-2 de banco de células primario utilizando el kit de purificación de ARNm QuickPrepTM Micro (GE Healthcare, Piscataway, NJ). El ARNm se almacenó a 80ºC hasta que se requiriese para su uso posterior.

1.2 Amplificación por RT-PCR de genes de región variable

Se llevaron a cabo reacciones separadas para amplificar las regiones variables de las cadenas ligera y pesada. La reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR) sintetizó ácido desoxinucleico complementario (ADNc) a partir del molde de ARNm, y después amplificó específicamente el gen diana.

Para la cadena ligera, se calentó 1 microlitro de ARNm a 65ºC durante 10 minutos y después se enfrió sobre hielo. Se prepararon reacciones de RT-PCR utilizando RT-PCR SuperScriptTM One-Step con Taq Platinum® (Invitrogen, Burlington, ON) con 12,5 microlitros de mezcla de reacción 2xRT-PCR (Invitrogen, Burlington, ON), 1 microlitro de cebador MuIgκVL5’-F 20 pmoles/microlitros (Novagen, Mississauga, ON), 1 microlitro de cebador MuIgκVL3’-1 20 pmoles/microlitro (Novagen, Mississauga, ON), mezcla de 0,5 microlitros de RT/Taq Platinum (Invitrogen, Burlington, ON), 0,4 microlitros de MgSO4 50 mM (Invitrogen, Burlington, ON) y agua hasta 25 microlitros. También se preparó un segundo conjunto de reacciones tal como anteriormente, excepto en que el cebador directo utilizado era el cebador MulgκVL5’-C (Novagen, Mississauga, ON) en lugar de MuIgκVL5’-F. Las reacciones se calentaron en el termociclador durante 40 minutos a 50ºC, seguido de 94ºC durante 2 minutos. Se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) durante 30 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto. Finalmente, los productos de PCR se calentaron a 72ºC durante 10 minutos y después se almacenaron a 4ºC. El producto de PCR se purificó utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN, Mississauga, ON).

Para la cadena pesada, se calentó 1 microlitro de ARNm a 65ºC durante 10 minutos y después se enfrió sobre hielo. Se prepararon reacciones de RT-PCR utilizando RT-PCR SuperScriptTM One-Step con Taq Platinum® (Invitrogen, Burlington, ON) con 12,5 microlitros de mezcla de reacción 2xRT-PCR (Invitrogen, Burlington, ON), 1 microlitro de cebador MuIgVH5’-a 5 pmoles/microlitros (Novagen, Mississauga, ON), 1 microlitro de cebador MuIgVH5’-B 10 pmoles/microlitro (Novagen, Mississauga, ON), cebador MuIgVH5’-C (Novagen, Mississauga, ON), 1 microlitro de cebador MuIgVH5’-D 5 pmoles/microlitro (Novagen, Mississauga, ON), 1 microlitro de cebador MuIgVH5’-F 5 pmoles/microlitro (Novagen, Mississauga, ON), 1 microlitro de cebador MuIgGVH3’-2 5 pmoles/microlitro (Novagen, Mississauga, ON), 0.5 microlitros de mezcla de RT/Taq Platinum® (Invitrogen, Burlington, ON), 0,4 microlitros de MgSO4 50 mM (Invitrogen, Burlington, ON) y agua hasta los 25 microlitros. Las reacciones se calentaron en el termociclador durante 40 minutos a 50ºC, seguido de 94ºC durante 2 minutos. Se llevó a cabo la reacción en cadena de PCR durante 30 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto. Finalmente, los productos de PCR se calentaron a 72ºC durante 10 minutos y después se almacenaron a 4ºC.

La figura 16 muestra el resultado de las reacciones de RT-PCR. Se amplificaron las reacciones de cadena ligera (panel A) utilizando el cebador directo MuIgκVL 5’-F (carril 1) o MuIgκVL 5’-C (carril 2). La reacción de cadena pesada (panel B) se amplificó utilizando una mezcla de cebadores directos MuIgVH 5’-A, B, C, D y F. Ambas reacciones de cadena ligera (panel A, carriles 1 y 2) mostraron una banda fuerte en 450 pb, así como una banda más débil en 850 pb. La banda en 450 pb es la banda diana que contiene el gen H460-16-2 Vk. La reacción de cadena pesada (panel B, carril 1) muestra una banda fuerte en 500 pb y una banda débil en 1.000 pb. La banda en 500 pb es la banda diana que corresponde al gen H460-16-2 Vh. Todos los productos de PCR se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN, Mississauga, ON).

1.3 Clonación en vectores de secuenciación

Se clonaron separadamente productos de PCR purificados de cadenas ligera y pesada en vectores pCR2.1 utilizando el kit TOPO TA Cloning® (Invitrogen, Burlington, ON). Las reacciones tanto de cadena ligera como pesada contenían 2 microlitros sdel producto de PCR purificado apropiado. Los plásmidos se transformaron en E. coli One Shot@ MAX Efficiency™ DH5α™-T1R (Invitrogen, Burlington, ON), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para las transformaciones de tanto cadena ligera como cadena pesada se utilizaron 2 microlitros de reacciones de ligación.

Se sembraron en placa 30 microlitros de células transformadas de cada reacción en agar-caldo Lennox L (LB) precalentado (Sigma, Oakville, ON) que contenían 50 microgramos/ml de ampicilina (Sigma, Oakville, ON) y 40 microlitros de 40 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido (X-gal, Caledon Laboratories, Georgetown, ON) en N,N-dimetilformamida (Caledon Laboratories, Georgetown, ON). Se invirtieron las placas y se incubaron a 37ºC durante la noche.

Se seleccionaron cinco clones blancos individuales de cada una de las placas transformadas con H460-16-2 Vk y diez clones blancos individuales procedentes de la placa transformada con H460-16-2 Vh se seleccionaron y se utilizaron para inocular 4 ml de caldo LB (Sigma, Oakville, ON) que contenía 50 microgramos/ml de ampicilina (Sigma, Oakville, ON). Los cultivos se cultivaron durante la noche a 37ºC bajo agitación a 200 rpm. Se aislaron los plásmidos de cada cultivo utilizando el kit miniprep QIAprep Spin (QIAGEN, Mississauga, ON).

Los plásmidos recuperados se digirieron con EcoRI para determinar el tamaño de la inserción. Los digeridos de H460-16-2 Vk contenían 5 microlitros de plásmido, 0,02 microlitros de EcoRI 50 U/microlitro (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC), 1,5 microlitros de 10X tampón H (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC), 1,5 microlitros de albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1% y 6,98 microlitros de agua. Los digeridos de H460-16-2 Vk contenían 5 microlitros de plásmido, 0,04 microlitros de EcoRI 50 U/microlitro (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC), 1,5 microlitros de 10X tampón H (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC), 1,5 microlitros de BSA al 0,1% (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC) y 6,96 microlitros de agua. Los plásmidos se digirieron a 37ºC durante 1 hora. Se analizaron 5 microlitros de cada plásmido digerido en un gel de agarosa al 1,0%.

La figura 17 muestra plásmidos pCR2.1 (H460-16-2 Vk) digeridos con EcoRI. Los números de clon se indican en la parte superior. El primer número indica el cebador directo utilizado (1 para MuIgκVL5’-F y 2 para MuIgκVL5’-C), y el segundo número indica el número de clon (1-5). La banda fuerte aproximadamente en 5.000 pb es el esqueleto del vector pCR2.1. Todos los clones excepto 2-4 presentaban bandas en 500 pb, el tamaño esperado de la inserción de H460-16-2 Vk (indicada mediante una flecha).

La figura 18 muestar los plásmidos pCR2.1 (H460-16-2 Vh) digeridos con EcoRI. Los clones 1, 2, 3, 4, 5 y 8 muestran la banda de 500 pb deseada, que corresponde al gen H460-16-2 Vh.

Algunos de los plásmidos que contenían inserciones del tamaño apropiado (Vk 1-1, Vk 1-2, Vk 1-3, Vk 2-1, Vk 2-2, Vk 2-3, Vh 1, Vh 4 y Vh 5) se secuenciaron en las instalaciones de biología molecular principales de York University (Toronto, ON). Las secuencias se proporcionan en la figura 19. La secuencia de H460-16-2 Vk correcta se encontró en los clones 1-1, 1-2 y 1-3. Los clones Vk restantes contenían un gen de inmunoglobulina aberrante. Se utilizó el clón 1-1 (pVkH460-16-2 nº 1-1) para la construcción del plásmido quimérico H460-16-2/IgG2. Todos los clones de H460-16-2 Vh contenían la secuencia de H460-16-2 Vh correcta. Los plásmidos con la secuencia correcta se almacenaron a -30ºC para aplicaciones futuras.

1.4 Clonación de H460-16-2 VH en el vector de secuenciación (para la construcción de IgG2 quimérico)

Se utilizó el ARNm anterior para amplificar el gen H460-14-2 Vh. Para la cadena pesada, se calentó 1 microlitro de ARNm a 65ºC durante 10 minutos y después se enfrió sobre hielo durante 2 minutos. Se prepararon reacciones de RT-PCR utilizando RT-PCR SuperScriptTM One-Step con Taq Platinum® (Invitrogen, Burlington, ON) con 12,5 microlitros de mezcla de reacción 2xRT-PCR (Invitrogen, Burlington, ON), 1 microlitro de cebador MuIgVH5’-A 5 pmoles/microlitros (Novagen, Mississauga, ON), 1 microlitro de cebador MuIgVH5’-B 10 pmoles/microlitro (Novagen, Mississauga, ON), 1 microlitro de cebador MuIgVH5’-D 5 pmoles/microlitro (Novagen, Mississauga, ON), 1 microlitro de cebador MuIgVH5’-F 5 pmoles/microlitro (Novagen, Mississauga, ON), 1 microlitro de cebador MuIgGVH3’-2 5 pmoles/microlitro (Novagen, Mississauga, ON), 0.5 microlitros de mezcla de RT/Taq Platinum® (Invitrogen, Burlington, ON), 0,4 microlitros de MgSO4 50 mM (Invitrogen, Burlington, ON) y agua hasta los 25 microlitros. Las reacciones se calentaron en el termociclador durante 40 minutos a 50ºC, seguido de 94ºC durante 2 minutos. Se llevó a cabo la reacción en cadena de PCR durante 30 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto. Finalmente, los productos de PCR se calentaron a 72ºC durante 10 minutos y después se almacenaron a 4ºC. El producto de PCR se purificó utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN, Mississauga, ON) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se clonó el producto de PCR purificado de cadena pesada en el vector pCR2.1 utilizando el kit TOPO TA Cloning® (Invitrogen, Burlington, ON). La reacción contenía 1 microlitro de producto de PCR purificado. Se utilizaron 2 microlitros de reacción de ligación para transformar E. coli One Shot@ MAX Efficiency™ DH5α®-T1R (Invitrogen, Burlington, ON). Se sembraron en placa 30 microlitros de células transformadas de en agar-caldo Lennox L (LB) precalentado (Sigma, Oakville, ON) que contenían 50 microgramos/ml de ampicilina (Sigma, Oakville, ON) y 40 microlitros de 40 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido (X-gal, Caledon Laboratories, Georgetown, ON) en N,N-dimetilformamida (Caledon Laboratories, Georgetown, ON). Se invirtieron las placas y se incubaron a 37ºC durante la noche.

Se seleccionaron diez clones de la placa transformada con H460-16-2 VH y se utilizaron para inocular 4 ml de caldo LB que contenía 50 microgramos/ml de ampicilina. Los cultivos se cultivaron durante la noche a 37ºC bajo agitación a 200 rpm. Se aislaron los plásmidos de cada cultivo utilizando el kit miniprep QIAprep Spin (QIAGEN, Mississauga, ON) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los plásmidos recuperados se digirieron con EcoRI para determinar el tamaño de la inserción. Los digeridos de H460-16-2 Vk contenían 5 microlitros de plásmido, 0,04 microlitros de EcoRI 50 U/microlitro (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC), 1,5 microlitros de 10X tampón H (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC), 1,5 microlitros de BSA al 0,1% (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC) y 6,96 microlitros de agua. Los plásmidos se digirieron a 37ºC durante 1 hora. Se analizaron 5 microlitros de cada plásmido digerido en un gel de agarosa al 1,0%.

Los clones nº 3 y nº 1 aparentemente presentaban la inserción esperada de 500 pb. Se seleccionaron diez clones más de la placa de E. coli transformada con pCR2.1 (H460-16-2 VH) con el fin de obtener más clones con la inserción correcta. Los clones se utilizaron para inocular caldo LB tal como se ha indicado anteriormente. Los plásmidos se aislaron a partir de los cultivos tal como se ha indicado anteriormente, y después se digirieron con EcoRI tal como se ha indicado anteriormente.

La figura 20 muestra digestiones con EcoRI de plásmidos pCR2.1 (H460-16-2 Vh). La banda fuerte aproximadamente en 5.000 pb es el esqueleto del vector pCR2.1. El clon nº 17 presentaba una banda en 500 pb, el tamaño esperado de la inserción de H460-16-2 VH (indicada mediante una flecha).

Los plásmidos que contenían inserciones del tamaño apropiado (Vh nº 1, Vh nº 3 y Vh nº 17) se secuenciaron en las instalaciones principales de biología molecular de York University (Toronto, ON). Se proporcionan las secuencias en la figura 21. La secuencia de H460-16-2 Vh correcta se encontró en los clones 3 y 17. El clon 3 (pVhH460-16-2 nº 3) se utilizó para la construcción del plásmido quimérico H460-16-2/IgG2. Los plásmidos con la secuencia correcta se almacenaron a -30ºC para aplicaciones futuras.

2.0 Clonación de genes de H460-16-2 murinos en los vectores promotores de CMV que contenían genes región constante humana

Con el fin de crear constructos murinos-humanos de anticuerpo quimérico IgG1, se clonaron genes de la región variable de H460-16-2 murino en plásmidos que contenían genes de región constante humana. Estos vectores promotores de CMV se obtuvieron de G.R. McLean et al. Los vectores se denominaron originalmente pHC-huCg1 y pLC-huCk. En la presente memoria se denominaron pCH-hulg1 y pCL-huCk.

2.1 Cambio del sitio de enzima de restricción de pCH-hulg1

El mapa plasmídico del vector promotor de CMV de la cadena pesada (pCH-hulg1) se proporciona en la figura 22. El gen variable de H460-16-2 Vh se clonó entre los sitios de restricción NheI e HindIII. Debido a un sitio HindIII interno dentro del gen H460-16-2 Vh, el sitio HindIII en el vector se cambió a BsiW I.

Se diseñaron cebadores de PCR en el propio laboratorio para facilitar esta clonación y fueron sintetizados por Gibco BRL (Burlington, ON). Se proporcionan las secuencias de cebador en la figura 23. Se combinó 1 microlitro de plásmido pCH-hulg1 purificado (G.R. McLean, Bronx, NY) con 1 microlitro de 20 pmoles/microlitro de cebador pCHhuBsiWI, 1 microlitro de 20 pmoles/microlitro de cebador BGH, 0,2 microlitros de MgCl2 50 mM (Invitrogen, Burlington, ON) y 22 microlitros de mezcla de PCR Platinum® Supermix (Invitrogen, Burlington, ON). La reacción se incubó en un termociclador a 94ºC durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 94ºC de 1 minuto, 58ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto. Finalmente, la reacción se incubó a 72ºC durante 10 minutos y después se almacenó a 4ºC.

Se aplicaron cuatro microlitros de producto de PCR en un gel de agarosa al 1,0 por ciento, tal como se muestra en la figura 24. El panel A, carril 1, es la región amplificada por PCR del plásmido pCH-hulg1 que contiene la región constante de cadena pesada humana de IgG1. Una banda aparece en ~1.100 pb, que es el tamaño esperado. El producto de PCR restante se purificó utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN, Mississauga, ON).

Tanto el producto de PCR purificado como el plásmido pCH-hulg1 purificado fueron digeridos con HindIII y XhoI para facilitar la ligación. La digestión del producto de PCR contenía 46 microlitros de producto de PCR purificado, 6 microlitros de 10x tampón M (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC), 6 microlitros de BSA al 0,1% (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC) y 2 microlitros de 15 U/microlitro de HindIII (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC). La digestión del plásmido contenía 4 microlitros de pCH-hulg1 1,4 microgramos/microlitro, 6 microlitros de 10x tampón M (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC), 6 microlitros de BSA al 1 por ciento (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC), 42 microlitros de agua y 2 microlitros de 15 U/microlitro de HindIII (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC). Las digestiones se incubaron a 37ºC durante 2 horas. Se extrajeron alícuotas pequeñas (2 microlitros de reacción de producto de PCR y 3 microlitros de reacción del plásmido) y se guardaron para comprobar la progresión de la digestión en un gel de agarosa. A las digestiones restantes se añadieron 3,2 microlitros de NaCl 1 M, 2,5 microlitros de Tris-HCl 1 M, pH 7,4, y 3 microlitros de 8 U/microlitro de XhoI (New England Biolabs, Ipswich, MA). Las reacciones se incubaron adicionalmente a 37ºC durante 2 horas. Se extrajo otra alícuota pequeña de cada digestión y se guardó para analizar en un gel de agarosa.

La figura 25 muestra el producto de PCR digerido y el plásmido. Se produjo muy poco cambio de tamaño del producto de PCR tras la digestión (carril 1, paneles A y B), tal como se esperaba, debido al número muy bajo de pares de bases extraído de cada extremo. La digestión HindIII única del plásmido (panel A, carril 2) muestra el tamaño del plásmido linearizado (de mayor tamaño que el marcador de peso molecular). La doble digestión de HindIII y XhoI (panel B) muestra el esqueleto plasmídico de gran tamaño y la sección de ~1.000 pb que se ha extraído mediante digestión y que se sustituirá con el producto de PCR digerido. El producto de PCR digerido restante se purificó utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN, Mississauga, ON) y el esqueleto plasmídico restante se purificó a partir de un gel de agarosa al 1% utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN, Mississauga, ON).

El producto de PCR digerido y el esqueleto plasmídico se ligaron entre sí en una proporción molar 4:1. La reacción contenía 233 ng de esqueleto plasmídico digerido, 162 ng de producto de PCR digerido, 4 microlitros de 5X tampón de ligación (Gibco BRL, Burlington, ON), 4 microlitros de ADN ligasa de T4 1 U/microlitro (Gibco BRL, Burlington, ON) y 9,33 microlitros de agua. La reacción se incubó a 16ºC durante la noche y después a 70ºC durante 15 minutos para inactivar el enzima. Se transformaron 2 microlitros de la reacción de ligación en 50 microlitros de células de E. coli One Shot@ MAX Efficiency® DH5α™-T1R (Invitrogen, Burlington, ON) mediante incubación sobre hielo durante 30 minutos, a 42ºC durante 2 minutos y después nuevamente sobre hielo durante 5 minutos. Se añadieron 250 microlitros de medio S.O.C. (Invitrogen, Burlington, ON) y las células transformadas se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Se sembraron en placa cien microlitros de células sobre placas de agar LB precalentado (Sigma, Oakville, ON) que contenía 50 microgramos/ml de ampicilina (Sigma, Oakville, ON) y se incubaron durante la noche a 37ºC.

Se seleccionaron diez colonias individuales de las células transformadas y se utilizaron para inocular 4 ml de caldo LB (Sigma, Oakville, ON) que contenía 50 mg/ml de ampicilina (Sigma, Oakville, ON) y se incubaron durante la noche a 37ºC bajo agitación a 200 rpm. Se aislaron los plásmidos de cultivos de durante la noche utilizando el kit miniprep QIAprep Spin (QIAGEN, Mississauga, ON). Los plásmidos aislados se digirieron con BsiW I con el fin de identificar qué clones habían incorporado el nuevo sitio de corte. Los digeridos que contenían 3 microlitros de plásmido purificado, 2 microlitros de 10X tampón NE 2 (New England Biolabs, Ipswich, MA), 1 microlitro de 3 U/microlitro de BsiW I (New England Biolabs, Ipswich, MA) y agua hasta los 20 microlitros. Los digeridos se incubaron a 37ºC durante 2 horas, y después se aplicaron 5 microlitros del plásmido digerido a un gel de agarosa al 1%, tal como se muestra en la figura 26. Todos los clones excepto el 4 y el 8 se linearizaron con la digestión, indicando que habían incorporado el nuevo sitio de corte BsiW I. El carril 1 muestra una alícuota no digerida del clón 5 como plásmido circular de control. Los clones 1, 2, 5 y 7 se secuenciaron en York University (Toronto, ON). Los 6 clones presentaban la secuencia deseada y se almacenaron a -30ºC para la utilización en el futuro.

2.2 Genes de inserción de ARH460-16-2 Vκ and VH en pCL-huCk y pCH-hulg1

Con el fin de facilitar la clonación de los genes de H460-16-2 Vk y Vh en pCL-huCk y pCH-hulg1, respectivamente, se requirió la inserción de sitios de restricción en cada extremo de los genes. Para la cadena ligera, se añadió un sitio Bgl II en el extremo 5' y un sitio HindIII en el extremo 3'. Para la cadena pesada, se añadió un sitio Nhe I en el extremo 5' y un sitio BsiW I en el extremo 3'. Las secuencias de los cebadores utilizados en estas reacciones de PCR se proporcionan en la figura 23. El mapa plasmídico de pCL-huCk (también denominado pLC-huCk) se proporciona en la figura 27. Aunque no aparece en la figura, existe un sitio Bgl II entre las regiones líder y variable en el vector pCL-huCk.

Para la cadena ligera, se combinó 1 microlitro de 150 ng/microlitro de plásmido purificado a partir de pCR2.1 (H46016-2 Vk) M nº 1-1 (ver anteriormente, 'M' indica banco de células maestro) con 1 microlitro de 20 pmoles/microlitro de cebador 5' de H460-16-2 Vk, 1 microlitro de 20 pmoles/microlitro de Vk 3' NotI, 0,2 microlitros de MgCl2 50 mM (Invitrogen, Burlington, ON) y 22 microlitros de mezcla para PCR Platinum® Supermix (Invitrogen, Burlington, ON). Para la cadena pesada, se combinó 1 microlitro de 40 ng/microlitro de plásmido purificado a partir de pCR2.1 (H46016-2 Vh) nº 1 (ver anteriormente) con 1 microlitro de 25 pmoles/microlitro de cebador H460-16-2 Vh 5' NheI, 1 microlitro de 25 pmoles/microlitro de cebador Vh 3' BsiWI y 47 microlitros de mezcla para PCR Supermix High Fidelity (Invitrogen, Burlington, ON). La reacción de la cadena ligera se incubó a 94ºC durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 94ºC de 1 minuto, 58ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto, seguido de 72ºC durante 7 minutos. La reacción de la cadena pesada se incubó de manera similar, aunque a 55ºC para la temperatura de apareamiento (en lugar de 58ºC).

La figura 24 muestra una alícuota de cada reacción de PCR aplicada en un gel de agarosa al 1,0%. El gen H460-162 Vk (panel A, carril 2) también aparece como bandas próximas a 400 pb, el tamaño previsto de la región variable de cadena ligera. El gen H460-16-2 Vh (panel B, carril 1) también aparece como una banda próxima a 450 pb, el tamaño previsto de la región variable de cadena pesada. Los productos de PCR restantes se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR QIAQuick (QIAGEN, Mississauga, ON) y después se digirieron con los enzimas apropiados para facilitar la ligación en los plásmidos.

Para la cadena ligera, se digirieron tanto pCL-huCk como el producto de PCR H460-16-2 Vk con Bgl II y Not I con el fin de facilitar la clonación. Se combinaron 40 microlitros del producto de PCR H460-16-2 Vk con 6 microlitros de 10x tampón NE 3 (New England Biolabs, Ipswich, MA), 0,6 microlitros de 100 x BSA (New England Biolabs, Ipswich, MA), 2 microlitros de 10 U/microlitro de Bgl II (New England Biolabs, Ipswich, MA), 2 microlitros de 10 U/microlitro de NotI y agua hasta los 60 microlitros. Para el plásmido de cadena ligera, se preparó una reacción equivalente que contenía 8 microlitros de pCL-huCK (G.R. McLean, Bronx, NY) en lugar del producto de PCR. Se incubaron ambas reacciones a 37ºC durante 3 horas. Se aplicó una alícuota del vector e inserción digeridos en un gel de agarosa al 1,2%, tal como se muestra en la figura 28. El esqueleto del vector pCL-huCK linearizado (carril 1) aparece como una banda grande, mientras que la región variable de cadena ligera extraída del vector aparece como una banda en 400 pb. El gen H460-16-2 Vk digerido (carril 2) también aparece en 400 pb. El plásmido pCL-huCk linearizado restante se aplicó a un gel al 1,0 por ciento y se purificó utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN, Mississauga, ON). El producto de PCR H460-16-2 Vk digerido restante se purificó utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN, Mississauga, ON).

Para la cadena pesada, se digirieron tanto el plásmido pCH-hulg1 con el sitio BsiW I añadido (ver anteriormente) y el producto de PCR H460-16-2 Vh, con BsiW I y Nhe I, con el fin de facilitar la clonación. La reacción del plásmido contenía 0,7 microlitros de ADN de pCHhulg1 (BsiW I) nº 1, 2 microlitros de 10x tampón NE 2 (New England Biolabs, Ipswich, MA), 0,4 microlitros de 10 U/microlitro de BsiW I (New England Biolabs, Ipswich, MA) y agua hasta 20 microlitros. También se preparó una reacción equivalente que contenía 12,1 microlitros de producto de PCR purificado de H460-16-2 Vh en lugar de plásmido. Se incubaron las reacciones a 55ºC durante la noche y seguidamente se extrajo una alícuota de 5 microlitros de la digestión del plásmido para su comprobación en un gel. Se añadieron 0,2 microlitros de 100 x BSA (New England Biolabs, Ipswich, MA) y 1 microlitro de 5 U/microlitro de Nhe I (New England Biolabs, Ipswich, MA) a ambas reacciones y se incubaron adicionalmente a 37ºC durante la noche. Se extrajeron 5 microlitros adicionales y se utilizaron para aplicar en un gel para comprobar la digestión. La figura 29 muestra los resultados de la digestión realizada en geles al 1,2 por ciento. El unico digerido de BsiW I (panel B, carril 1) muestra el plásmido linearizado. La doble digestión con BsiW I y Nhe I (panel B, carril 2) muestra el esqueleto del plásmido en forma de una banda grande y la región variable de cadena pesada en 450 pb. Esta banda más pequeña debe sustituirse con 450 pb de producto de PCR H460-16-2 Vh digerido (panel A, carril 1). El plásmido digerido restante se aplicó a un gel al 1,2 por ciento y se purificó utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN, Mississauga, ON). El producto de PCR H460-16-2 Vh digerido restante se purificó utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN, Mississauga, ON).

El producto de PCR H460-16-2 Vk digerido se ligó en el plásmido pCL-huCk linearizado. Se combinaron 220 ng de pCL-huCk digerido con 66 ng de H460-16-2 Vk digerido, 4 microlitros de 5X tampón de ligasa (Gibco BRL, Burlington, ON), 4 microlitros de ADN ligasa de T4 1 U/microlitro (Gibco BRL, Burlington, ON) y agua hasta los 20 microlitros. La reacción se incubó durante la noche a 16ºC y después se incubó a 70ºC durante 10 minutos para inactivar por calor el enzima. Se transformaron 2 microlitros de la reacción de ligación en 50 microlitros de células de

E. coli One Shot@ MAX Efficiency® DH5α™-T1R (Invitrogen, Burlington, ON) mediante incubación sobre hielo durante 30 minutos, a 42ºC durante 2 minutos y después nuevamente sobre hielo durante 5 minutos. Se añadieron 250 microlitros de medio S.O.C. (Invitrogen, Burlington, ON) y las células transformadas se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Se sembraron en placa treinta microlitros de células sobre placas de agar LB precalentado (Sigma, Oakville, ON) que contenía 50 microgramos/ml de ampicilina (Sigma, Oakville, ON) y se incubaron durante la noche a 37ºC.

Se preparó una reacción de ligación de la cadena pesada que contenía 250 ng de pCH-hulg1 digerido, 84 ng de producto de PCR H460-16-2 Vh digerido, 4 microlitros de 5X tampón de ligasa (Gibco BRL, Burlington, ON), 1 microlitro de ADN ligasa de T4 1 U/microlitro (Gibco BRL, Burlington, ON) y agua hasta los 20 microlitros. La reacción se incubó durante la noche a 16ºC y después a 65ºC durante 10 minutos para inactivar por calor el enzima. Se transformó 1 microlitro de la reacción de ligación en 25 microlitros de células de E. coli One Shot@ MAX Efficiency® DH5α™-T1R (Invitrogen, Burlington, ON) mediante incubación sobre hielo durante 30 minutos, a 42ºC durante 2 minutos y después nuevamente sobre hielo durante 5 minutos. Se añadieron 250 microlitros de medio

S.O.C. (Invitrogen, Burlington, ON) y las células transformadas se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Se sembraron en placa 30 microlitros de células sobre placas de agar LB precalentado (Sigma, Oakville, ON) que contenía 50 microgramos/ml de ampicilina (Sigma, Oakville, ON) y se incubaron durante la noche a 37ºC.

Se seleccionaron ocho clones individuales de la placa con pCL-huCk transformado (H460-16-2 Vk) y seis clones individuales procedentes de la placa con pCH-hulg1 transformado (H460-16-2 Vh) y se utilizaron para inocular 4 ml de caldo 2-YT (Gibco BRL, Burlington, ON) que contenía 50 microgramos/ml de ampicilina (Sigma, Oakville, ON). Se aislaron los plásmidos de cultivos de durante la noche utilizando el kit miniprep QIAprep Spin (QIAGEN, Mississauga, ON) y se digirieron para garantizar que era la inserción del tamaño correcto. Se prepararon reacciones de la cadena ligera con 3 microlitros del plásmido, 1,5 microlitros de 10X tampón NE 3 (New England Biolabs, Ipswich, MA), 0,15 microlitros de 100 x BSA (New England Biolabs, Ipswich, MA), 2 microlitros de 10 U/microlitro de Bgl II, 2 microlitros de 10 U/microlitro de NotI y 9,65 microlitros de agua, y se incubaron a 37ºC durante 3 horas. Se prepararon reacciones de la cadena pesada mediante la combinación de 2 microlitros de plásmido con 2 microlitros de 10X tampón NE 2 (New England Biolabs, Ipswich, MA), 0,4 microlitro de 10 U/microlitro de BsiW I (New EnglandBiolabs, Ipswich, MA) y agua hasta los 20 microlitros. Éstas se incubaron a 55ºC durante 2 horas y después se añadieron 2 microlitros de 10 X BSA (New England Biolabs, Ipswich, MA) y 0,8 microlitros de 5 U/microlitro de Nhe I. Las reacciones se incubaron adicionalmente a 37ºC durante 2 horas.

Las figuras 30 y 31 muestran los resultados de las digestiones anteriormente indicadas de pCL-huCk (H460-16-2 Vk) y pCH-hulg 1 (H460-16-2 Vh), respectivamente. Todos los clones de cadena ligera (figura 30) excepto el nº 1 muestran la inserción deseada de 400 pb, que corresponde al gen H460-16-2 Vk. Todos los clones de cadena pesada (figura 31) contenían la inserción deseada de 450 pb, que corresponde al gen H460-16-2 Vh. Basándose en estos resultados, se secuenciaron los clones 3, 4, 6, 7 y 8 de pCL-huCk (H460-16-2 Vk) y los clones 4 y 6 de pCHhulg1 (H460-16-2 Vh) en York University (Toronto, ON). Todos los clones secuenciados presentaban la secuencia deseada y los plásmidos se almacenaron a -80ºC para la utilización en el futuro.

3.0 Clonación de ARH460-16-2 de cadenas ligera y pesada quimerizado en vectores de expresión CHEF1 A continuación se clonaron la región variable murina y constante humana de la cadena ligera (H460-16-2 Vk) en el vector de expresión CHEF1 pNEF38 y la región variable murina y constante humana de la cadena pesada (H460-162 Vh) se clonaron en el vector de expresión CHEF1 pDEF38. Se proporcionan los mapas plasmídicos en las figuras 32 y 33.

En el resto de la presente memoria, el término Ch-ARH460-16-2 Vk se refiere a la combinación del gen H460-16-2 de cadena variable ligera y región constante de cadena ligera humana derivado del plásmido pCL-huCk. El término Ch-ARH460-16-2 Vk se refiere a la combinación del gen H460-16-2 de cadena variable pesada y la región de cadena pesada de IgG1 derivada del plásmido pCH-hulg1 I.

3.1 Cambio de los sitios de restricción para la clonación en vectores CHEF1

Los sitios de restricción flanqueantes de los genes Ch-ARH460-16-2 en los vectores promotores de CMV requirieron la alteración para facilitar la subclonación en los vectores de expresión CHEF1. Las regiones líder, variable y constante en los constructos promotores de CMV se amplificaron por PCR utilizando cebadores que introducían los sitios de restricción deseados. Se proporcionan las secuencias de los cebadores en la figura 23.

Para la cadena ligera, se preparó una reacción de PCR utilizando 1,4 microlitros de 73 ng/microlitro de ADN de pCLhuCk (ARH460-16-2 Vk) nº 3 (ver anteriormente), 1,0 microlitro de 25 pmoles/microlitro de cebador pCL-huCk 5' MluI, 1,7 microlitros de 15 pmoles/microlitro de cebador BGH y 20,9 microlitros de mezcla para PCR Supermix High Fidelity (Invitrogen, Burlington, ON). Para la cadena pesada, se preparó una reacción de PCR utilizando 0,5 microlitros de 0,27 microgramos/microlitro de ADN de pCH-hulg1 (ARH460-16-2 Vh) nº 4 (ver anteriormente), 1,7 microlitros de 15 pmoles/microlitro de cebador Vh 5' NheI/MluI, 1,7 microlitros de 15 pmoles/microlitro de cebador BGH y 21,1 microlitros de mezcla para PCR Supermix High Fidelity (Invitrogen, Burlington, ON). Se incubaron las reacciones de las cadenas pesada y ligera a 94ºC durante 2 minutos, seguido de 25 ó 30 ciclos de 94ºC de 30 minutos, 55ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 2 minutos, respectivamente. Se aplicó una alícuota de cada reacción en un gel de agarosa, tal como se muestra en la figura 34. El producto de PCR Ch-ARH460-16-2 Vk (panel A, carril 1) aparece como una banda de 800 pb, el tamaño esperado de la región de cadena ligera variable murina H460-16-2 Vk y constante humana. El producto de PCR Ch-ARH460-16-2 Vh (panel B, carril 1) aparece como una banda en 1.500 pb, que es el tamaño esperado de la región de cadena pesada murina H460-16-2 Vh y constante humana.

3.2 Clonación de genes H460-16-2 quiméricos en vectores CHEF1

El producto de PCR restante se purificó utilizando un kit de purificación de PCR MinElute (QIAGEN, Mississauga, ON) y después se digirió conjuntamente con vectores CHEF1 con los enzimas de restricción apropiados para la clonación. Las reacciones contenían 1 microgramo de ADN (producto de PCR purificado Ch-ARH460-16-2 Vk, producto de PCR Ch-ARH460-16-2 Vh purificado, pNEF38 (ICOS, Seattle, WA) o pDEF38 (ICOS, Seattle, WA)), 2 microlitros de 10X tampón NE 2 (New England Biolabs, Ipswich, MA), 2 microlitros de 10X BSA (New England Biolabs, Ipswich, MA), 0,2 microlitros de 20 U/microlitro de XbaI (New England Biolabs, Ipswich, MA) y agua hasta los 20 microlitros. Las reacciones se incubaron durante la noche a 37ºC y después se añadieron 0,8 microlitros de Tris-HCl 1 M, pH 7,4, 1,0 microlitro de NaCl 1 M y 0,4 microlitros de 10 U/microlitro de Mlu I (New England Biolabs, Ipswich, MA) y se incubó adicionalmente a 37ºC durante 6 horas. Los productos de PCR digeridos se purificaron utilizando el kit MinElute Reaction Cleanup (QIAGEN, Mississauga, ON) y los vectores digeridos se purificaron utilizando un kit QIAEX II Reaction Cleanup (QIAGEN, Mississauga, ON).

Se ligó Ch-ARH460-16-2 Vk en pNEF38 en una proporción molar 5:1. Se combinaron 25 ng de pNEF38 digerido con 69 ng de producto de PCR Ch-ARH460-16-2 Vk digerido, 4 microlitros de 5X tampón de reacción de ligasa (Invitrogen, Burlington, ON), 0,5 microlitros de ADN ligasa de T4 1 U/microlitro (Invitrogen, Burlington, ON) y agua hasta los 20 microlitros. Se preparó una reacción equivalente de la cadena pesada utilizando 25 ng de pDEF38 digerido y 66 ng de producto de PCR Ch-ARH460-16-2 Vh digerido. Las reacciones se incubaron durante la noche a 16ºC durante la noche y después a 65ºC durante 10 minutos para inactivar el enzima. La reacción de ligación de la cadena pesada se purificó utilizando el kit QIAEX II Reaction Cleanup (QIAGEN, Mississauga, ON).

Las reacciones de ligación se transformaron en E. coli mediante la adición de 3 microlitros de solución salina diluida (Invitrogen, Burlington, ON) y 2 microlitros de reacción de ligación a 50 microlitros de E. coli One Shot® TOP10 Electrocomp™ (Invitrogen, Mississauga, ON). Las células se transfirieron a cubetas de 1 mm preenfriadas y se cargaron en un electroporaron durante 5 milisegundos a 1.700 V. Inmediatamente se añadió 1 ml de medio S.O.C. (Invitrogen, Burlington, ON) y después las células se incubaron a 37ºC durante 1 hora, agitando a 200 rpm. Se sembraron en placa 200 microlitros de células sobre placas de agar LB precalentado que contenía 50 microgramos/ml de ampicilina y se incubaron durante la noche a 37ºC.

Se seleccionaron seis colonias individuales de cada placa y se utilizaron para inocular 4 ml de caldo 2YT (Invitrogen, Burlington, ON) que contenía 50 microgramos/ml de ampicilina (Sigma, Oakville, ON) y se incubaron durante la noche a 37ºC bajo agitación a 200 rpm. Se aislaron los plásmidos de los cultivos de durante la noche resultantes, utilizando el kit miniprep QIAprep (QIAGEN, Mississauga, ON). Los plásmidos de la cadena ligera se digirieron con XbaI y Mlu I con el fin de identificar qué clones contenían la inserción del tamaño correcto. Las digestiones contenían 1 microgramo de ADN plasmídico, 2 microlitros de 10X tampón NE 2 (New England Biolabs, Ipswich, MA), 2 microlitro de 10 X BSA (New England Biolabs, Ipswich, MA), 0,2 microlitros de 20 U/microlitro de XbaI (New England Biolabs, Ipswich, MA) y agua hasta los 20 microlitros. Las reacciones se incubaron durante la noche a 37ºC y después se añadieron 0,8 microlitros de Tris-HCl 1 M, pH 7,4, 1,0 microlitro de NaCl 1 M y 0,4 microlitros de 10 U/microlitro de Mlu I (New England Biolabs, Ipswich, MA) y se incubó adicionalmente a 37ºC durante 6 horas. Los plásmidos de la cadena pesada se digirieron con XbaI, MluI e HindIII. Se combinaron 100 ng de ADN plasmídico con 2 microlitros de 10X tampón NE 2 (New England Biolabs, Ipswich, MA), 2 microlitros de 10 X BSA (New England Biolabs, Ipswich, MA), 0,2 microlitros de 20 U/microlitro de XbaI (New England Biolabs, Ipswich, MA) y agua hasta los 20 microlitros. Las reacciones se incubaron durante la noche a 37ºC y después se añadieron 0,8 microlitros de Tris-HCl 1 M, pH 7,4, 1,0 microlitro de NaCl 1 M y 0,4 microlitros de 10 U/microlitro de Mlu I y se incubó adicionalmente a 37ºC durante 6 horas. Se extrajo una pequeña alícuota de la digestión para aplicar en un gel y se añadieron 2 microlitros de 10X tampón NE 2 (New England Biolabs, Ipswich, MA), 0,3 microlitros de 15 U/microlitro de HindIII y 7,7 microlitros de agua. Las reacciones se incubaron a 37ºC durante 6 horas.

Los plásmidos digeridos se aplicaron en geles de agarosa al 1,2 por ciento, tal como se observa en la figura 35. Para los plásmidos de la cadena ligera (panel A) todos los clones excepto el nº 3 presentaban la inserción deseada de 750 pb, que corresponde a las regiones de cadena ligera variable y constante. Para los plásmidos de cadena pesada, las digestiones con XbaI y MluI (panel B, carriles 1A, 2A y 6A) mostraban inserciones de 1.500 pb, que correspondían a las regiones variable y constante de cadena pesada. Los plásmidos de cadena pesada digeridos con XbaI, MluI y BsiW I (panel B, carriles 1B, 2B y 6B) mostraban bandas en 1000 pb y 500 pb, que corresponden a las regiones constante y variable de cadena pesada, respectivamente. El clon 4 (panel B) no apareció en absoluto, indicando que existía un problema con el diseño de la reacción.

Basándose en estos resultados, se secuenciaron los clones 1, 2 y 4 de la cadena ligera y los clones 1, 2 y 6 de la cadena pesada en York University (Toronto, ON). Se proporcionan las secuencias en la figura 36. El clon de la cadena ligera pNEF38 (Ch-ARH460-16-2 Vk) nº 4 y el clon de la cadena pesada pDEF38 (Ch-ARH460-16-2 Vh) nº 2 presentan las secuencias correctas y se utilizaron para construir los constructos quiméricos de H460-16-2.

4.0 Clonación inicial para producir (ch)ARH460-16-2/IgG1

4.1 Construcción de pMPGCR5IgG1-Vk+hH460

Este plásmido contiene las cadenas ligera y pesada del isotipo de IgG1 quimérico de H460-16-2 (Ch-ARH460-16-2 Vh y Ch-ARH460-16-2 Vk) regulado por el promotor inducible con cumato (CR5). Además, este plásmido contiene resistencia a la higromicina para la selección de los clones estables (figura 37). Este plásmido fue producido construyendo en primer lugar los dos plásmidos intermediarios indicados a continuación.

A) Contrucción de pMPGCR5VkH460Ascld

El fragmento de ADN codificante de la cadena ligera del anticuerpo B43 se extrajo de pMPGCR5B43k (figura 38) mediante digestión con BamHI. Tras la creación de extremos romos y el tratamiento con fosfatasa bovina intestinal (FBI), se ligó el vector de ADN con un fragmento de ADN codificante de la cadena ligera obtenido mediante digestión de pNEF38 (Ch-ARH460-16-2 Vk) nº 4 con XbaI y BsiWI, seguido del tratamiento con ADN polimerasa de T4 para crear extremos romos.

B) Construcción de pCR5IgG1VhH460AscI

El fragmento de ADN codificante de la cadena pesada de B43 se extrajo de pKCR5B43G3 (figura 39) mediante digestión con HindIII. Tras crear extremos romos con la ADN polimerasa de T4 y el tratamiento con FBI, se ligó el vector de ADN con un fragmento de ADN codificante de la cadena pesada aislada mediante la digestión de pDEF38 (Ch-ARH460-16-2 VH) nº 2 con XbaI y PacI. Antes de la ligación se crearon extremos romos en el fragmento ADN con la ADN polimerasa de T4.

C) Ensamblaje final

Se extrajo el casete de expresión de cadena pesada (promotor, secuencia codificante, señal poliA) de pCR5IgC1 VhH460AscI mediante digestión con AscI y se insertó en el sitio AscI de pMPGCR5VkH460Ascld, que se desfosforiló mediante tratamiento con FBI antes de la ligación. En la figura 37 se proporciona un mapa del constructo resultante (pMPGCR5IgG1-Vk+hH460).

5.0 Producción de clones que expresan H460-16-12 quimérico

Se obtuvó un vial de CHO-SF(a) de Gibco BRL (Burlington, ON) y se descongeló en medio CD-CHO (Gibco BRL, Burlington, ON) suplementado con L-glutamina 4 mM en mayo de 2000. Las células se cultivaron durante 10 días en medio CD-CHO suplementado con L-glutamina 4 mM y se prepararon cultivos congelados en suero de feto bovino al 90% (Hyclone, Logan, UT) y DMSO al 10%. Las células CHOcTA que expresaban establemente el transactivador cumato (cTA) se generaron mediante transfección de células CHO-SF(a) con pMPG-BFP/CMV-cTA/tk-neo linearizado, utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen, Burlington, ON) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Tres días después, se incubaron las células transfectadas en presencia de G418 (1,2 mg/ml) y cuatro semanas después, un pool de células resistentes a G418 se transfectó con pAdCR5GFPq. Dos días después, se separaron las células de expresión más elevada de GFP en un citómetro de flujo láser multiparámetro EPICSTM V (modelo 752, Beckman-Coulter, Hialeah, FL) y se transfirieron a placas de 96 pocillos a una densidad de una célula por pocillo en presencia de 1,2 mg/ml de G418. Se recolectaron los clones confluyentes, se expandieron y la cantidad de cTA sintetizada por las células se determinó indirectamente mediante la medición de la intensidad de GFP mediante citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo Coulter EPICSTM XI (Beckman-Coulter, Hialeah, FL) 24 horas después de la infección con un vector adenovírico que expresaba GFP regulado por el promotor CR5 (AdCR5GFPq). Se llevó a cabo una segunda ronda de clonación mediante la transferencia de células individuales de los clones que eran más fluorescentes tras la transducción con AdCR5GFPq en placas de 96 pocillos utilizando un micromanipulador celular (Caron et al., 2000). Las células se cultivaron en ausencia de G418 y se recolectaron las colonias confluyentes y se expandieron. La cantidad de cTA producido por estas células se evaluó indirectamente mediante citometría de flujo mediante la medición de la intensidad de GFPq producido tras la infección con AdCR5GFPq. Se expandió uno de los subclones más productivos (CHOcTA-5F-1). Se generó un pequeño banco celular y se guardó congelado en nitrógeno líquido.

Se descongelaron las células CHO-SF(b) (Invitrogen, Burlington, ON) y se cultivaron en 50 ml de medio CD CHO (Invitrogen, Burlington, ON) suplementado con suplemento 1X HT (Invitrogen, Burlington, ON), L-glutamina 4 mM (Invitrogen, Burlington, ON) a 37ºC. Tras 3 pases, se preparó un banco de 22 viales congelados utilizando DMSO al 10% (Invitrogen, Burlington, ON) tal como se describe posteriormente. El banco celular se sometió a ensayo para la presencia de micoplasmas en INRS-Institut Armand-Frappier, Montréal, QC. No se detectaron micoplasmas. Las células CHOcTA que expresaban establemente el transactivador cumato (cTA) se generaron mediante transfección de células CHO-SF(b) con pMPG-/tk-neo/cymR_VP16-nls linearizado, utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen, Burlington, ON) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Al día siguiente, las células se separaron en una placa de 96 pocillos a una concentración de 10.000 ó 5.000 células por pocillo en presencia de G418 (1,2 mg/ml). Tres a cuatro semanas después se recolectaron las colonias resistentes y se expandieron. La cantidad de cTA sintetizado por las células se determinó indirectamente mediant medición de la intensidad de GFP mediante citometría de flujo 24 horas después de la infección con un vector adenovírico que expresaba GFP regulado por el promotor CR5 (AdCR5GFPq). Un mes y tres semanas después de la transfección inicial se llevó a cabo una segunda ronda de clonación mediante la transferencia de células individuales de uno de los clones que eran más fluorescentes tras la transducción con AdCR5GFPq (CHO cTA nº 10) en placas de 96 pocillos utilizando un micromanipulador celular (Caron et al., 2000). Las células se cultivaron en ausencia de G418 y se recolectaron las colonias confluyentes (tres a cuatro semanas después) y se expandieron. La cantidad de cTA producido por estas células se evaluó indirectamente mediante citometría de flujo mediante la medición de la intensidad de GFPq producido tras la infección con AdCR5GFPq. Se expandió uno de los subclones más productivos (CHOcTA-10-9). Se generó un pequeño banco celular y se guardó congelado en nitrógeno líquido. El banco celular se sometió a ensayo para la presencia de micoplasmas en INRS-Institut Armand-Frappier. No se detectaron micoplasmas.

Las células CHO que expresaban el transactivado cumato (CHO cTA, clón 10-9 y 5F-1) se transfectaron con pMPGCR5IgG1-Vk+hH460 linearizado (digestión con SspI) utilizando el reactivo lipofectamina 2000. Al día siguiente, las células se transfirieron a placas de 96 pocillos a diferentes concentraciones (10.000 ó 5.000 células/pocillo). En este punto temporal se añadieron 600 mg/ml de higromicina B al medio. Tras dos a tres semanas, se analizó el sobrenadante de las colonias resistentes (378 clones) para la presencia de anticuerpo IgG1 mediante ELISA (la cuantificación determinada mediante ELISA y mediante transferencia western sólo era una estimación aproximada de la producción de los anticuerpos, debido a que el estándar utilizado para la cuantificación (IgG humana purificada) era diferente de la IgG1 quimérica de H460-16-12 producida por las células). Un total de 104 clones produjeron cantidades detectables de anticuerpo.

A continuación se amplificaron doce clones y se sometieron a ensayo para la expresión del anticuerpo mediante transferencia western y SDS-PAGE utilizando un ensayo de productividad de 24 horas. La producción de anticuerpo también se evaluó en lotes de cultivo a 30ºC durante 6 a 13 días (figuras 40 y 41). La producción se llevó a cabo a 30ºC debido a que el promotor CR5 es mucho más fuerte a esta temperatura.

Seis de los clones eran 17, 71, 80, 6', 47' y 147'. Se generaron los clones 17, 71 y 80 utilizando CHOcTA-10-9 y se generaron los clones 6', 47' y 147' utilizando CHOcTA-5F1. Estos 6 clones secretaron 4 a 6 pg/célula/día a 37ºC según estimación mediante tinción Fluo-Orange de Coomassie utilizando la IgG humana como estándar.

6.0 Clonación inicial para producir (ch)ARH460-16-2/IgG2

6.1 Construcción de pMPGCR5VK+h460-IgG2.

Este plásmido contiene las cadenas ligera y pesada del isotipo de IgG2 quimérico de H460-16-2 regulado por el promotor inducible con cumato (CR5). Además, este plásmido contiene resistencia a la higromicina para la selección de los clones estables (figura 42). Este plásmido se produjo mediante varias etapas de PCR y subclonación que se describen a continuación.

A) Quimerización de la cadena ligera (construcción de pMPGCR5VkH460)

Se aisló un fragmento de ADN (PCR B) codificante de la región variable de la cadena ligera de H460-16-2 mediante PCR utilizando el plásmido pVkH460-16-2 nº 1-1 y los cebadores ARvarlc y jctvar-k nº 3 (figura 43). Se aisló por PCR un fragmento de ADN (PCR A) codificante de la región constante de la cadena ligera kappa humana de IgG, utilizando el plásmido pMPGB43k y los cebadores ARKappa y jctk-var nº 3 (figura 43). Se ensambló la región variable con la región constante mediante PCR utilizando los fragmentos PCR B y PCR A como molde y los cebadores Arvarlc y ARkappa. El fragmento de ADN resultante (PCR C) se digirió con BamHI y se ligó en pMPGCR5B43k (figura 38) previamente digerido con BamHI para eliminar la cadena ligera B43. Antes de la ligación, el vector linearizado se desfosforiló mediante tratamiento con fosfatasa bovinal intestinal (FBI). El vector resultante se denominó pMPGCR5VkH460koz. La cadena ligera completa se envió para la secuenciación. Se obtuvo la secuencia de nucleótidos esperada excepto por una mutación dentro de la secuencia de Kosak. Esta mutación se corrigió intercambiando la región variable de pMPGCR5vKH460koz con la región variable de pMPGCR5kH460wrongjct (ver posteriormente) mediante la digestión de ambos plásmidos con KpnI y mediante ligación de los fragmentos de ADN correctos entre sí. El plásmido resultante se denominó pMPGCR5VkH460 y se confirmó mediante secuenciación la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera.

B) Contrucción de pMPGCR5VkH460wrongjct

Este plásmido contiene una cadena ligera quimérica de H460-16-2 con una unión diferente entre las regiones variable y constante. Para construir este plásmido, se aisló un fragmento de ADN (PCR B1) codificante de la región variable de la cadena ligera de H460-16-2 mediante PCR utilizando el plásmido pVkH460-16-2 nº 1-1 y los cebadores ARvarlc y ARjctvar-k (figura 30). Se aisló por PCR un fragmento de ADN (PCR A1) codificante de la región constante de la cadena ligera kappa humana de IgG, utilizando el plásmido pMPGB43k y los cebadores ARKappa y ARjctk-var (figura 43). Se ensambló la región variable con la región constante mediante PCR utilizando los fragmentos PCR B1 y PCR A1 como molde y los cebadores Arvar1c y ARkappa. A continuación, el fragmento de ADN resultante (PCR C1) se digirió con BamHI y se ligó en pMPGCR5B43k (figura 38) previamente digerido con BamHI para eliminar la cadena ligera B43. Antes de la ligación, el vector se desfosforiló mediante tratamiento con FBI. El vector resultante se denominó pMPGCR5VkH460wrongjctkoz. La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera se confirmó mediante secuenciación.

C) Quimerización de la cadena pesada (construcción de pKCR5IgG2VhH460)

Se aisló un fragmento de ADN (PCR D) codificante de la región variable de la cadena pesada de H460-16-2 mediante PCR utilizando el plásmido pVhH460-16-2 nº 3 y los cebadores ARIgGvarlc y ARhvarswa (figura 43). El producto de PCR se digirió con ApaI y se ligó con un fragmento de ADN de 4,6 kb codificante de la región constante de la IgG2 humana. Este vector se obtuvo mediante digestión de pkHc (BRI, NRC, Montréal, QC) con ApaI seguido del tratamiento con FBI. El plásmido resultante se denominó pKIgG2-VhH460.

La cadena pesada completa codificada por pKIgG2-VhH460 se liberó mediante digestión con SwaI y se clonó en pKCR5B43G3 (figura 39) previamente digerido con HindIII para eliminar la cadena pesada B43. Antes de la ligación se crearon extremos romos del plásmido mediante tratamiento con la ADN polimerasa de T4 y se desfosforiló con FBI. El plásmido resultante se denominó pKCR5IgG2VhH460wrongjct y se confirmó mediante secuenciación la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada completa. La unión entre las cadenas variable y ligera de la IgG2 quimérica era inusual. Por ello se decidió modificarlo. Se amplificó por PCR un fragmento de ADN que contenía la unión correcta de pKCR5IgG2VhH460wrongjct utilizando los cebadores ApaICR5 e IgG2TVSSASTK (figura 43). El fragmento de PCR se digirió con ApaI y se clonó en pKCR5 IgG2VhH460wrongjct previamente digerido con ApaI. Antes de la ligación, el fragmento de 4,6 kb se desfosforiló mediante tratamiento con FBI. El plásmido resultante se denominó pKCR5IgG2VhH460 y se confirmó mediante secuenciación la secuencia de nucleótidos de la IgG2 quimérico.

D) Ensamblaje final del vector de expresión de IgG2

Se extrajo el casete de expresión de cadena pesada (promotor, secuencia codificante, señal poliA) de pKCR5IgG2VhH460 mediante digestión con AscI y se insertó en el sitio AscI de pMPGCR5VkH460, que se desfosforiló mediante tratamiento con FBI antes de la ligación. La secuencia de nucleótidos completa de las cadenas pesada y ligera se confirmó mediante secuenciación. En la figura 42 se presenta un mapa del constructo resultante (pMPGCR5VK+h460-IgG2).

7.0

Producción de clones iniciales

Se transfectaron células CHO-cTa (clón 10-9) en medio sin suero químicamente definido con el plásmido que expresa el anticuerpo IgG2 quimérico, pMPGCR5VK+h460-IgG2 (figura 42) y se generaron clones estables en presencia de higromicina. Se analizaron 374 clones mediante ELISA para la expresión del anticuerpo IgG2. 80 clones eran positivos para la expresión del anticuerpo. La cantidad de anticuerpo secretado por los 58 clones más productivos se analizó mediante transferencia western o SDS-PAGE (figura 44). Los clones más productivos producían entre 5 y 10 pg/célula/día a 37ºC. Los 6 clones eran: clones 40, 50, 51, 52, 54 y 56.

8.0

Selección de clones de alta producción

Los clones 40, 50, 51, 54 y 56 se subclonaron utilizando el micromanipulador (aproximadamente 50 células por clón) en ausencia de presión selectiva. Se sometió a ensayo el nivel de producción de 51 subclones mediante análisis de transferencia western o mediante SDS-PAGE seguido de tinción Fluo-Orange de Coomassie (figura 45). Los subclones más productivos eran los siguientes, con la cantidad de anticuerpo producida a 37ºC indicada entre paréntesis: 40F8 (11), 40B7 (7), 56B9 (7), 40F7 (7), 56E9 (5), 40E11 (5), 40D9 (6), 56B8 (6), 56F11 (4) y 54E10 (3).

9.0

Ensayo de sobrenadantes

El sobrenadante de cada clón quimérico de IgG1 e IgG2 se utilizó como sonda de transferencia western con el fin de determinar si se encontraban presentes IgG capaces de detectar el antígeno diana para el anticuerpo H460-16-2 murino (CD44). Se sometió a ebullición una muestra que contenía 300 microgramos de fracción de membranas totales de células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 y se analizó mediante SDS-PAGE (gel preparativo, acrilamida al 10%)/inmunotransferencia western. Se sondearon las transferencias western con dilución 1:2 de los sobrenadantes de cultivo celular (con leche desnatada al 10% en TBST) siguiendo el procedimiento estándar de transferencia western. Los resultados indican que todos los sobrenadantes (de clones secretores de IgG1 quimérico e IgG2 quimérico) podían detectar CD44, con una señal que era similar a la obtenida con el MAb parental murino, a concentraciones (calculadas) similares (5 microgramos/ml, figuras 46 y 47).

10.0

Producción en biorreactores del clon seleccionado

El clon 6' de IgG1 quimérico aparentemente es el clon de secreción más elevada según el análisis de SDS-PAGE y se unión de una manera similar a H460-16-2 murino sobre preparaciones de membranas de células MDA-MB-231 en una transferencia western. Por lo tanto, se utilizó el clón 6' para producir el anticuerpo en cultivo por lotes en matraces de agitación a 30ºC. La concentración del anticuerpo en los lotes se evaluó mediante SDS-PAGE seguido de tinción Fluo-Orange de Coomassie (figura 48). El volumen de los diferentes lotes y la concentración de anticuerpo eran los siguientes: lote super22Nov: 1,6 l, 150 mg/L; lote N3: 0.65 l, 200 mg/l; lote N4: 0.65 l, 100 mg/l y lotes N5 y N6: 0.8 l, 200 mg/l. Clón 6’ se utilizó para todos los estudios futuros de IgG1 quimérico y se denomina (ch)ARH460-16-2-IgG1.

El clon 40B7 de IgG2 quimérico aparentemente era el clon de secreción más elevada según el análisis de SDS-PAGE y se unión de una manera similar a H460-16-2 murino sobre preparaciones de membranas de células MDAMB-231 en una transferencia western. Por lo tanto, el clón 40B7 se produjo en cantidades mayores (figura 49). Se produjeron 20 litros de medio que contenía aproximadamente 140 mg/litro de anticuerpo. La concentración del anticuerpo en el medio se determinó mediante SDS-PAGE seguido de tinción utilizando FluOrange de Coomassie. Se utilizó el clón 40B7 para todos los estudios futuros de IgG2 quimérico y se denomina (ch)ARH460-16-2-IgG2.

EJEMPLO 10

Experimentos con tumores in vivo con células MDA-MB-231

En referencia a las figuras 50 y 51, se implantaron en ratones SCID hembra de 4 a 6 semanas de edad 5 millones de células de cáncer de mama humano (MDA-MB-231) en 100 microlitros de solución salina inyectada por vía subcutánea en la nuca. Se midió el crecimiento tumoral con un calibrador cada semana. Al alcanzar la mayoría de la cohorte un volumen tumoral medio de 91 mm3 (intervalo de 55 a 143 mm3) 35 días después de la implantación, los ratones se dividieron en bloques según el tamaño tumoral. Los ratones de los bloques se asignaron aleatoriamente a los 4 grupos de tratamiento (10 en cada grupo) de manera que el volumen tumoral medio en cada grupo no fuese significativamente diferentes al de los otros. Se administraron por vía intraperitoneal los anticuerpos de ensayo H460-16-2, (ch)ARH460-16-2-IgG1, (ch)ARH460-16-2-IgG2 ó control de tampón en cada cohorte dosificando 15 mg/kg de los anticuerpos en un volumen de 300 microlitros tras la dilución a partir de la concentración de la solución madre con un diluyente que contenía KCl 2,7 mM, KH2PO4 1 mM, NaCl 137 mM y Na2HPO4 20 mM. A continuación se administraron los anticuerpos 3 veces a la semana durante un total de 10 dosis de la misma manera hsta el día 57 después de la implantación. Se midió el crecimiento tumoral aproximadamente cada séptimo día con un calibrador hasta el día 62 después de la implantación o hasta que los animales individuales alcanzasen los parámetros de evaluación de CCAC. Se registraron los pesos corporales de los animales una vez a la semana durante la totalidad del estudio. Al final del estudio se eutanizaron todos los animales siguiendo las directrices de CCAC.

Tal como se muestra en la figura 50, tanto H460-16-2 murino como (ch)ARH460-16-2-IgG1 redujeron el crecimiento tumoral en un modelo in vivo establecido de MDA-MB-231 del cáncer de mama humano. El día 62, 5 días después de la administración de la última dosis, el tratamiento con H460-16-2 resultó en una inhibición del crecimiento tumoral del 39% (T/C media=57%). Esta reducción del crecimiento tumoral era significativamente diferente del control (p=0,0037). El anticuerpo quimérico (ch)ARH460-16-2-IgG1 resultó en una inhibición incrementada del crecimiento tumoral del 64% (T/C media=26,9%, p<0,0001). En contraste, la versión de IgG2 del anticuerpo quimérico, (ch)ARH460-16-2-IgG2, no mostró inhibición del crecimiento tumoral en comparación con el control de tampón (ICT=0%, T/C media=122%, p=0,7264).

No se observaron signos clínicos de toxicidad durante todo el estudio. El peso corporal medido a intervalos semanales era una variable indicadora de buen estado de salud y retraso del desarrollo. La figura 51 presenta los resultados del peso corporal de cada uno de los grupos tratados durante el curso del estudio. No se observaron cambios significativos de peso corporal en los ratones del grupo tratado con H460-16-2 ó con (ch)ARH460-16-2-IgG2 en comparación con el grupo de control de tampón. Sin embargo, se produjo una reducción significativa del peso corporal (p=0,0005) entre el grupo tratado con control de tampón y el grupo tratado con (ch)ARH460-16-2-IgG1.

En resumen, (ch)ARH460-16-2-IgG1 demuestra una eficacia igual o superior en comparación con el anticuerpo murino en el modelo de cáncer de mama de MDA-MB-231. En contraste, el anticuerpo quimérico (ch)ARH460-16-2-IgG2 no redujo el crecimiento tumoral en este modelo de cáncer de mama humano de MDA-MB-231.

EJEMPLO 11

Tinción con anexina-V de células MDA-MB231 tratadas con H460-16-2, (ch)ARH460-16-2-IgG1 y (ch)ARH460-16-2-IgG2

Se llevó a cabo tinción con anexina-V para determinar si las versiones quiméricas de H460-16-2 eran capaces de inducir apoptosis de la misma manera que la contrapartida murina en la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231. Las células MDA-MB-231 se trataron durante 24 horas con H460-16-2, (ch)ARH460-16-2-IgG1 ó (ch)ARH460-16-2-IgG2 a las concentraciones de 0,25, 2,5 y 20 microgramos/ml. Cada anticuerpo se sometió a ensayo por triplicado conjuntamente con el control de isotipo apropiado (1B7.11, anti-TNP, IgG1 murina, kappa, producida en el propio laboratorio; IgG1 de mieloma humano, k, Sigma, Oakville, ON; IgG2 de mieloma humano, k, Sigma, Oakville, ON) sometido a ensayo a concentraciones idénticas. Se incluyó una muestra no tratada a modo de control negativo y camptotecina (Biovision, Exton, PA) a modo de control positivo. El instrumento de FACS se compensó para la superposición de espectros ópticos de los conjugados fluorescentes utilizando perlas fluorométricas (BD Bioscience, Oakville, ON). A continuación, las células se tiñeron con anexina-V y 7AAD y se contaron en un FACSArray en 1 hora.

En dos experimentos independientes, se compararon los anticuerpos H460-16-2 murino y los dos quiméricos, entre sí y con los anticuerpos de isotipo de control apropiados (figura 52). La figura 52 también muestra la media de los 2 experimentos. Se encontró que los efectos apoptóticos espontáneos de las células tratadas con control de isotipo eran similares a los de las células tratadas con vehículo solo. Se encontró que los anticuerpos H460-16-2 quiméricos con IgG1 e IgG2 murinos y humanos inducían apoptosis en la línea celular de cáncer de mama de una manera dependiente de la dosis en cada experimento, observándose un mayor efecto apoptótico con los anticuerpos (ch)ARH460-16-2 IgG1 e IgG2. Los resultados indican que in vitro el anticuerpo (ch)ARH460-16-2-IgG2 presenta el mayor efecto apoptótico en comparación con el anticuerpo IgG1 quimérico.

Los 3 anticuerpos mostraron un incremento del porcentaje de poblaciones necróticas y necróticas/apoptóticas respecto a sus controles de isotipo prospectivos. El mayor porcentaje de incremento de las poblaciones necróticas y necróticas/apoptóticas se observó con (ch)ARH460-16-2-IgG2, seguido de (ch) ARH460-16-2-IgG1 y seguido de H460-16-2.

La mayor parte de la evidencia demuestra que H460-16-2, (ch)ARH460-16-2-IgG2, (ch)ARH460-16-2-IgG1 y AR37A335.8 median en efectos anticáncer mediante la ligación de epítopos presentes sobre CD44. Se ha demostrado, en el Ejemplo 5, que los anticuerpos H460-16-2 y AR37A335.8 pueden utilizarse para inmunoprecipitar el antígeno afín de células expresantes, tales como las células MDA-MB-231. Además se pudo demostrar que los anticuerpos H460-16-2, (ch)ARH460-16-2-IgG2, (ch) ARH460-16-2-IgG1 y AR37A335.8 podrían utilizarse en la detección de células y/o tejidos que expresan una fracción antigénica CD44 que se une específicamente a los mismos, utilizando técnicas ilustradas, aunque sin limitación, por FACS, ELISA celular o IHQ.

De esta manera, ha podido demostrarse mediante FACS, ELISA celular o ensayos IHQ que H460-16-2, (ch)ARH460-16-2-IgG2, (ch)ARH460-16-2-IgG1 y antígeno AR37A335.8 inmunoprecipitados pueden inhibir la unión de cualquiera de los anticuerpos a dichas células o tejidos. Además, al igual que con los anticuerpos H460-16-2, (ch)ARH460-16-2-IgG2, (ch)ARH460-16-2-IgG1 y AR37A335.8, podrían utilizarse otros anticuerpos anti-CD44 para inmunoprecipitar y aislar otras formas del antígeno CD44, y el antígeno también podría utilizarse para inhibir la unión de dichos anticuerpos a las células o tejidos que expresan el antígeno utilizando los mismos tipos de ensayo.

Todas las patentes y publicaciones indicadas en la presente memoria son indicativas de los niveles de los expertos en la materia a la que se refiere la invención.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Arius Research, INC.

<120> Mediación en la citotoxicidad de células que muestran expresión en superficie de CD44

<130> 20561.000065

<150> US 10/810,165

<151> 2004-03-26

<150> US 09/415,278

<151> 1999-10-08

<150> US 09/727,361 25

<151> 2000-11-29

<150> US 10/603,000

<151> 2003-06-23

<150> US 10/647,818

<151> 2003-08-22

<160> 36

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 810

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> vector comercial con inserción ARH460-16-2 V kappa (M) 1-1

<400> 1

5 <210> 2

<211> 820

<212> ADN

<213> Artificial

10 <220><223> vector comercial con inserción ARH460-16-2 V kappa (M) 1-2

<400> 2 <210> 3

<211> 860

<212> ADN

<213> Artificial

<220><223> vector comercial con inserción ARH460-16-2 V kappa (M) 1-3

<400> 3

<210> 4

<213> Artificial

<220><223> vector comercial con inserción ARH460-16-2 V kappa (M) 2-1

20 <400> 4 <210> 5

<213> Artificial

<220><223> vector comercial con inserción ARH460-16-2 V kappa (M) 2-2

10 <400> 5 <210> 6

<211> 487

<212> ADN

<213> Artificial

<220><223> vector comercial con inserción H460-16-2 V pesada nº 1

<400> 6

<210> 7

<211> 477

<212> ADN 15 <213> Artificial

<220><223> vector comercial con inserción H460-16-2 V pesada nº 4

<400> 7

<210> 8

<213> Artificial

<220>

<223> vector comercial con inserción H460-16-2 V pesada nº 5

<400> 8 <210> 9

<213> Artificial

<220><223> vector comercial con inserción ARH460-16-2 V pesada nº 1

10 <400> 9

<210> 10 15 <211> 757

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

20 <223> vector comercial con inserción ARH460-16-2 V pesada nº 3

<400> 10 <210> 11

<213> Artificial

<220>

<223> vector comercial con inserción ARH460-16-2 V pesada nº 17

<400> 11 <210> 12

<211> 40

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cebador para PCR

<400> 12 cgtggaagct tcgtacggcc catcggtctt ccccctggca 40

<210> 13

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cebador para PCR

<400> 13 tagaaggcac agtcgagg 18

<210> 14

<211> 27

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cebador para PCR

<400> 14 gcgccaagat ctgatatcca gatgaca 27

<210> 15

<211> 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cebador para PCR

<400> 15 ggaggttgcg gccgcagtcc gttatatttc 30

<210> 16

<211> 40

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cebador para PCR

<400> 16 gcggaggcta gcggggatat ccaccatgga ttttgggctg 40

<210> 17

<211> 34

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cebador para PCR

<400> 17 gagtgccgta cgtggaggct gaggaaacgg tgac 34

5 <210> 18

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

10 <220>

<223> secuencia de cebador para PCR

<400> 18 gctggctagc acgcgttaaa catgaagttt ccttct 36

<210> 19

<211> 28

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cebador para PCR

<400> 19 25 cgcgaggcta gcacgcgtat ccaccatg 28

<210> 20

<211> 704

<212> ADN 30 <213> Artificial

<220>

<223> vector comercial con inserción ARH460-16-2 V kappa nº 1

35 <400> 20

<210> 21

<211> 704

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> vector comercial con inserción ARH460-16-2 V kappa nº 2

<400> 21

<210> 22

<213> Artificial

<220>

<223> vector comercial con inserción ARH460-16-2 V kappa nº 4

<400> 22 <210> 23

<211> 1055 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> vector comercial con inserción ARH460-16-2 V pesada nº 1

<400> 23 <212> ADN

<213> Artificial

<220> 10 <223> vector comercial con inserción ARH460-16-2 V pesada nº 2

<400> 24 <210> 25 <211> 988

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> vector comercial con inserción ARH460-16-2 V pesada nº 6

<400> 25

<210> 26

<211> 37

<212> ADN 15 <213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cebador para PCR

20 <400> 26 cgggggatcc gccgccacca tggtatcctc acctcag 37

<210> 27

<211> 41 25 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cebador para PCR

<400> 27 gacagatggt gcagccacag tccgttttat ttccaacttt g 41

<210> 28

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cebador para PCR

<400> 28 cgggggatcc ctaacactct cccctgttga agc 33

<210> 29

<211> 41

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cebador para PCR

<400> 29 caaagttgga aataaaacgg actgtggctg caccatctgt c 41

<210> 30

<211> 41

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cebador para PCR

<400> 30 gacagatggt gcagccacag ttgcggccgc agtccgtttt a 41

<210> 31

<211> 41

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cebador para PCR

<400> 31 taaaacggac tgcggccgca actgtggctg caccatctgt c 41

<210> 32

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cebador para PCR

<400> 32 catgggggcc cttggtggag ccgtacgtgg aggctga 37

<210> 33

<211> 47

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cebador para PCR

<400> 33 10 ctagggggcc catttaaatc gccgccacca tggattttgg gctgatt 47

<210> 34

<211> 37

<212> ADN 15 <213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cebador para PCR

20 <400> 34 ggaacaaaag ctgggtaccg ggccccccct cgaggtc 37

<210> 35

<211> 37 25 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de cebador para PCR

<400> 35 ccgatgggcc cttggtggaa gctgaggaaa cggtgac 37

<210> 36 35 <211> 438

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 40 <223> vector comercial con inserción H460-16-2 V pesada corregida

<400> 36

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Anticuerpo monoclonal aislado codificado por un hibridoma depositado en IDAC con el número de acceso 280104-06.

2. 2.

   Anticuerpo anti-CD44 que es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el que la totalidad de las regiones CDR del anticuerpo anti-CD44 humanizado corresponden a las regiones CDR del anticuerpo según la reivindicación 1 y en el que el anticuerpo anti-CD44 humanizado inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 y en el que el anticuerpo anti-CD44 humanizado presenta propiedades citotóxicas in vitro contra células tumorales malignas pero no células normales y en el que dicho anticuerpo anti-CD44 quimerizado media en la inhibición del crecimiento tumoral y extensión de la supervivencia en modelos in vivo de cáncer humano.

3. 3.

   Anticuerpo anti-CD44 que es una forma quimerizada del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el que la totalidad de las regiones CDR del anticuerpo anti-CD44 quimerizado corresponden a las regiones CDR del anticuerpo según la reivindicación 1 y en el que el anticuerpo anti-CD44 humanizado inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 y en el que el anticuerpo anti-CD44 humanizado presenta propiedades citotóxicas in vitro contra células tumorales malignas pero no células normales y en el que dicho anticuerpo anti-CD44 quimerizado media en la inhibición del crecimiento tumoral y extensión de la supervivencia en modelos in vivo de cáncer humano.

4. 4.

   Hibridoma aislado depositado en IDAC con el número de acceso 280104-06.

5. 5.

   Método para iniciar citotoxicidad celular inducida por anticuerpos de células cancerosas en una muestra de tejido seleccionada de entre un tumor humano que comprende:

   proporcionar el anticuerpo monoclonal aislado codificado por un hibridoma depositado en IDAC con el número de acceso 280104-06, y

   poner en contacto dicho anticuerpo monoclonal aislado con dicha muestra de tejido,

   en el que la unión de dicho anticuerpo monoclonal con dicha muestra de tejido induce citotoxicida celular.

6. 6.

   Fragmento de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, que se une a CD44.

7. 7.

   Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 6 conjugado con un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de fracciones citotóxicas, enzimas, compuestos radioactivos y células hematógenas.

8. 8.

   Anticuerpo monoclonal aislado codificado por un hibridoma depositado en IDAC con el número de acceso 280104-06 para la utilización en el tratamiento de un tumor humano susceptible de citotoxicidad celular inducida por anticuerpos en un mamífero, en el que dicho tumor humano expresa un antígeno CD44 que se une específicamente a dicho anticuerpo monoclonal.

9. 9.

   Anticuerpo monoclonal para la utilización según la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo monoclonal se conjuga con una fracción citotóxica.

10. 10.

    Anticuerpo monoclonal para la utilización según la reivindicación 9, en el que dicha fracción citotóxica es un isótopo radioactivo.

11. 11.

    Anticuerpo monoclonal para la utilización según la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo monoclonal activa el complemento o en el que dicho anticuerpo monoclonal media en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.

12. 12.

    Anticuerpo monoclonal anti-CD44 para la utilización en el tratamiento de un tumor humano susceptible de citotoxicidad celular inducida por anticuerpos en un mamífero, en el que dicho tumor humano expresa un antígeno CD44 que se une específicamente a dicho anticuerpo monoclonal y en el que dicho anticuerpo monoclonal es una forma humanizada o quimérica del anticuerpo codificado por un hibridoma depositado en IDAC con el número de acceso 280104-06, en el que la totalidad de las regiones CDR del anticuerpo anti-CD44 humanizado o quimerizado corresponden a las regiones de CDR del anticuerpo según la reivindicación 1 y en el que dicho anticuerpo anti-CD44 inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 y en el que dicho anticuerpo anti-CD44 humanizado o quimerizado presenta propiedades citotóxicas in vitro contra células tumorales malignas pero no células normales y en el que dicho anticuerpo anti-CD44 humanizado o quimerizado media en la inhibición del crecimiento tumoral y extensión de la supervivencia en modelos in vivo de cáncer humano.