ES2445152T3 - Presentación en fagos de pVII - Google Patents
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Abstract
Un genoma de fago o un fagémido que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión quecomprende la proteína de la cubierta menor de fago filamentoso pVII, en el que la proteína de fusión no comprendeuna secuencia señal N terminal.
Description
Presentación en fagos de pVII
El uso de enfoques combinatorios para la identificación, caracterización y modificación de proteínas, ha sido altamente exitoso tanto en la investigación como en el desarrollo académico y comercial. A este respecto, la tecnología de presentación en bacteriófagos filamentosos, o fagos, ha preparado el terreno siendo la primera plataforma de colecciones y todavía rige como la tecnología dominante. Por tanto, la presentación en fagos se aplica ampliamente tanto en el descubrimiento de proteínas básico como aplicado, así como en el desarrollo tanto de diagnósticos basados en proteínas novedosos como de tratamientos, ya que son la clase de compuestos que crecen más rápidamente en todo el mundo.
15 El principio de la tecnología de presentación en fagos se basa en la unión de genotipo - fenotipo ofrecida por la propiedad de que cada virión sólo presentará sobre su superficie las mismas proteínas que se codifican por el genoma encapsulado por su cubierta proteica. La propia partícula de fago es altamente resistente a una variedad de condiciones fisioquímicas; por tanto la presentación en fagos ofrece una versatilidad superior en muchos regímenes de selección en comparación con las tecnologías combinatorias competitivas.
Se ha logrado la presentación en fagos de polipéptidos heterólogos usando las cinco proteínas estructurales de la cubierta de fagos filamentosos, pero sólo la presentación en pIII y en cierta medida en pVIII han alcanzado un uso generalizado (Figura 1).
25 Cuando la fusión heteróloga es sólo un péptido corto, se prefieren los sistemas de presentación multivalentes que usan vectores basados en genoma de fago, mientras que para fusiones más grandes que requieren dominios plegados la mayoría de las aplicaciones se beneficiarán de los sistemas fagémidos. En el último caso, la presentación en fagos de pIII-anticuerpo está dominando, con mucho, el campo, pero están emergiendo estructuras alternativas en la actualidad, continuando con la necesidad de expansión de las herramientas de ingeniería de proteínas del futuro. Para muchas aplicaciones, será altamente ventajoso poder fabricar, específicamente y de manera controlada, partículas de fagos biespecíficas en las que más de una de las proteínas de la cubierta presente un péptido de fusión en el contexto de la misma partícula de virus. Además, un sistema de este tipo no debe interferir con los enfoques de presentaciones ya establecidos y en particular con la presentación en pIII y pVIII.
35 Endemann y Model, 1995 (PMID: 7616570), informaron de que la proteína de la cubierta menor pVII no estaba accesible en el fago intacto y que pVII no era funcional con otra proteína fusionada a su extremo N-terminal. Por tanto, este informe concluyó que pVII no se puede usar para la presentación en fagos.
Gao et al, 1999 (PMID: 10339535) y la solicitud de patente WO0071694, describen la presentación en fagos de péptidos heterólogos en pVII usando la marca de octapéptido FLAG, así como presentación en fagos simultánea en pVII y pIX para generar polipéptidos heterodiméricos funcionales que albergan topologías de plegado complejo (anticuerpo Fv). Estos autores quisieron desarrollar un medio alternativo para la presentación de anticuerpos. Las proteínas de fusión pVII y pIX se expresaron a partir de un fagémido empleando una constelación bicistrónica, por lo que las partículas de fagos funcionales resultantes contuvieron inevitablemente varias cantidades de proteínas de
45 fusión pVII y pIX debido a la complementación por la proteína pVII y pIX natural donada desde el genoma del fago colaborador. Como se menciona anteriormente, se había sugerido previamente que pVII y pIX no eran funcionales con otra proteína fusionada a sus extremos N-terminales, y Gao et. al. dieron dos posibles motivos para su éxito, solas o por la combinación de ambas.
Un posible motivo era que una secuencia líder procariota (secuencia señal) se unió de forma N-terminal a las proteínas de fusión, garantizando así la dirección de la proteína recombinante al espacio periplásmico y de este modo evitó la acumulación en el citoplasma. Otro posible motivo era que las proteínas recombinantes se expresaron a partir de un fagémido, no de un genoma de fago como por Endemann y Model, por tanto las pVII y pIX naturales del fago colaborador que necesitaban inevitablemente un rescate de fagémido complementaron las proteínas de
55 fusión pVII y pIX recombinantes, preservando así la funcionalidad natural que de otro modo se podía haber perdido debido a la modificación recombinante. Es decir, los fagos comprenderían una mezcla de proteínas de fusión y naturales. Los autores mencionan que el formato de presentación de pVII-pIX sería particularmente útil para la presentación combinatoria de las matrices heterodímeras, que, por motivos desconocidos, parece proporcionar un enriquecimiento de gran alcance particular durante los protocolos de fijación. Los autores no prevén el uso de pVII como única proteína de presentación (como genoma de fago o fagémido) o el uso de la presentación de pVII en combinación con la presentación de otra proteína de la cubierta (diferente de pIX) para lograr una presentación biespecífica.
Kwasnikowski et al. (PMID: 16277988) describió una fusión genéticamente estable de fragmentos de scFv al gen VII
65 directamente en el genoma del fago. Es decir, los fagos resultantes no comprendían proteína pVII nativa, y la presentación de pVII era multivalente. Los autores especularon que uno de los motivos para una presentación de pVII exitosa en el formato de genoma de fago es que soportaban el gen de fusión con una secuencia señal procariota que dirige la proteína de fusión al espacio periplásmico. Los autores argumentaron que la única característica de su sistema es que los fagos que presentan pVII llevan la proteína de la cubierta menor pIII natural, no modificada. Puesto que se ha informado de que se requieren múltiples copias de pIII funcional para una infección
5 de células huésped, la presencia de pIII natural de la superficie del fago puede facilitar la recuperación de los anticuerpos seleccionados con mayor diversidad. Por tanto, los autores no prevén la presentación biespecífica, ni prevén la presentación de pVII sin una secuencia señal procariota dirigida al espacio periplásmico.
Khalil et al (PMID: 17360403) describe una aplicación que se aprovecha de la característica de un virión de fago filamentoso biespecífico en el que se presenta un péptido exógeno en cada punta distal del mismo virión. Lograron esto usando la combinación de un vector de genoma de fago pIII común que complementa un fagémido de presentación de pIX. En este ajuste, el vector de genoma de fago sirvió como fago colaborador en el rescate del fagémido, recordando de este modo el enfoque descrito en el presente documento de crear un virión de fagémido biespecífico rescatando un fagémido de presentación de pIII por el uso de un genoma de fago colaborador
15 modificado pVII. Además, los viriones biespecíficos de Khalil et al presentan una fusión de péptido-pIII que permite una biotinilación controlada de su virión. Sin embargo, existen varias características que diferencian entre estas dos vías de obtención de un virión biespecífico, así como de obtención de una biotinilación de virión definida, lo que las hace únicas entre sí.
El documento WO 2004/050871 divulga una mezcla de proteínas de fusión que contienen dominios de interacción mutua, usados para identificar los agentes de unión específicos donde cada proteína incluye una secuencia de localización para translocación a través de la membrana citoplásmica. La cápside del fago de la mezcla se elige de las cápsides de M13 pIII, pVI, VII y pVIII.
25 En primer lugar, el enfoque de Khalil et al no se puede usar en combinación con la presentación de fagémido de pIII, ya que el su vector de genoma de fago el que porta su fusión de pIII, por tanto no se puede obtener biespecíficamente en el rescate de fagémido y también sería muy probablemente perjudicial para la funcionalidad de ambas fusiones de pIII.
En segundo lugar, y como también señalaron los propios autores, las modificaciones de pIX genómicas no se consideran como una estrategia viable debido a la superposición de genes en el genoma del fago, por tanto no prevén ni especulan sobre realizar ningún genoma de fago colaborador modificado que se pueda usar para el rescate de fagémido pIII (o pVIII) y de este modo donar una característica fenotípica definida a ambas puntas distales del mismo virión. Khalil et al no mencionan nunca el uso de pVII modificada en presentación del genoma de
35 fago o bien de fagémido.
En tercer lugar, Khalil et al no especulan en la modificación de un único genoma de fago para lograr un virión biespecífico, aprovechando la modificación simultánea de más de un gen de cápside dentro del mismo genoma. Simplemente usan una presentación de péptidos pIII estándar a través de un vector de genoma de fago comercialmente disponible.
En cuarto lugar, Khalil et al sólo preparan viriones biespecíficos que presentan péptidos cortos, no dominios plegados, y nunca especulan sobre aprovechar dicha presentación en, o ambas proteínas de cápside modificadas.
45 En quinto lugar, Khalil et al logran una biotinilación específica de sitio de su péptido presentado pIII a través de una conjugación química in vitro, no por una reacción enzimática in vitro o bien in vivo. Los autores nunca previeron una biotinilación mediada por enzimas de un resto presentado presentando un sustrato enzimático tal como AviTag.
Finalmente, Khalil et al. no muestra ningún tipo de presentación sin el uso de una secuencia señal N-terminal.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar una estructura alternativa para péptidos presentados en fagos filamentosos.
55 Un primer aspecto de la invención es un genoma de fago o un fagémido que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende la proteína de la cubierta menor del fago filamentoso pVII, dicha proteína de fusión no comprende una secuencia señal N terminal y por tanto es una fusión directa a un péptido exógeno.
Otro aspecto de la invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión de la invención.
Un aspecto de la invención se refiere a fagos filamentosos que comprenden las proteínas de fusión de la invención.
65 Otro aspecto de la invención se refiere a una colección de fagos filamentosos.
Un aspecto de la invención se refiere a un sistema de presentación en fagos que comprende un fagémido y un fago colaborador, en el que el fago colaborador comprende un ácido nucleico que codifica las proteínas de fusión pVII de la invención.
5 Otro aspecto de la invención se refiere a un sistema de presentación en fagos que comprende un fagémido y un fago colaborador, en el que el fagémido comprende un ácido nucleico que codifica las proteínas de fusión pVII de la invención.
Un aspecto se refiere a un kit que comprende un sistema de presentación en fagos que comprende un fagémido y un fago colaborador, en el que el fago colaborador comprende un ácido nucleico que codifica las proteínas de fusión pVII de la invención.
15 Figura 1
Dibujo esquemático de la estructura del fago filamentoso. El virión se construye por cinco proteínas estructurales que cubren una molécula de ADN monocatenaria. En el fago natural (wt) existen aproximadamente 2700 copias de pVIII y aproximadamente 3-5 copias de cualquiera de las cuatro proteínas pIII, pVI, pVII y pIX, que se encuentran en cada punta del virión. El tamaño del virión es dependiente del tamaño del genoma en aprox. 2,3 nucleótidos por proteína de la cubierta pVIII y por tanto la longitud de la partícula se acomoda por un incremento o una disminución en las copias insertadas de pVIII. De forma notable, las estructuras de pIII y pVIII se han caracterizado por difracción de rayos X de fibras, cristalografía y RMN. La proteína de la cubierta menor pIII contiene tres dominios distintos separados por regiones ricas en glicina: N1 (se une a ToIA), N2 (se une al pilus F) y CT (integrado en el virión y es
25 importante para un ensamblaje de virión normal).
Figura 2
Optimización de codón K12 de E. coli de AviTag™, marca HIS6 y marca FLAG. (A) Comparación de la secuencia de ADN AviTag™ comercialmente disponible con el uso del codón K12 de E. coli. Las columnas en rojo son la secuencia presentada y las columnas en negro son los ajustes de referencia. (B) La línea superior muestra la AviTag™ original, mientras que la línea inferior muestra la secuencia modificada ajustada de acuerdo con el resultado en A. (C) péptido FLAG de codón optimizado. (D) péptido HIS6 de codón optimizado.
35 Figura 3
Valoración de fagos colaboradores modificados comparados con fago colaborador wt.
Figura 4
Análisis ELISA M13K07 AviTag-pVII
Las preparaciones de fago normalizado se mezclaron con perlas de estreptavidina (SA) para absorber viriones biotinilados y se realizó un ELISA como se describe en el ejemplo 1.
45 Figura 5
Análisis ELISA que muestra la accesibilidad de la marca FLAG como fusión de pVII en M13K07. Las preparaciones de fago normalizadas se usaron en el ensayo ELISA. Hay una detección de marca FLAG específica sólo de M13K07-FLAG tanto para M2 como para M5 MAb. Hay una detección más fuerte de la marca FLAG por el M5 MAb.
Figura 6
Análisis que muestra la accesibilidad de la marca HIS como fusión de pVII tanto para M13K07 (SEQ ID NO: 31)
55 como para VCSM13 (SEQ ID NO: 32). Las preparaciones de fago normalizadas se mezclaron con Talon Dynabeads para absorber los viriones marcados con HIS6 y se realizó un ELISA como se describe en el ejemplo 1.
Figura 7
(A) valoraciones de fagémido de fagémidos que presentan scTcR y scFv-pIII mostradas como cfuampR/ml. (B): proporciones de fagémido con respecto a fago colaborador como la proporción de la valoración de fagémido (cfuampR/ml) dividida entre la valoración del fago colaborador (cfukanR/ml).
Figura 8
65 Análisis de ELISA de AviTag de fagémido scTCR que muestra la accesibilidad específica de AviTag después del rescate de fago por Dynabeads recubiertas con estreptavidina. El recuadro muestra el valor de la señal del fago colaborador M13K07-AviTag. Se usaron preparaciones de fago normalizadas.
Figura 9
5 Análisis ELISA que muestra la accesibilidad de la marca FLAG como fusión de pVII en dos fagémidos diferentes, pFKPDNscTCR Vaβ4B2A1 (A) y pSEX-scFv anti-phOx (B) por captura de viriones de fagémido por dos anticuerpos anti FLAG, M2 y M5. Se usaron preparaciones de fago normalizadas.
Figura 10
Análisis ELISA que muestra la funcionalidad de scTCRpIII (A) y scFvpIII (B) presentada en viriones derivados de fagémido con pVIIAviTag. Se usaron preparaciones de fago normalizadas.
15 Figura 11
Análisis que muestra la funcionalidad de scTCR (A) y scFv (B) presentada en viriones derivados de fagémido con marca FLAG y marca HIS6. Se usaron preparaciones de fago normalizadas.
Figura 12
Valoración de fago genómico fUSE5-scTCRpIII con y sin pVIIAviTag.
Figura 13
25 Análisis ELISA que muestra la funcionalidad de preparaciones de fago fUSES-AviTag genómicas por captura de fagos por perlas de estreptavidina seguido de detección de fagos unidos por anticuerpos anti M13. Se usaron preparaciones de fago normalizadas.
Figura 14
Análisis ELISA que muestra la funcionalidad de pIII que presenta scTCR en fago genómico fUSE5 con Avitag-pVII. Se usaron preparaciones de fago normalizadas.
35 Figura 15
Dibujo esquemático de los fagémidos de presentación de pVII novedosos pGALD7 (A) y pGALD7ΔL (B). El esqueleto del vector de ambos fagémidos se basó en pSEX81 (SEQ ID NO:29), secuencia a la que se puede acceder a partir del GenBank con n.º de acceso: Y14584, y los detalles sobre la construcción se describen en Material y procedimientos. Ambos fagémidos pueden acomodar casetes de secuencias exógenas en marco (denominadas E1 y E2) por medio de un intercambio de casetes sencillo de las porciones NcoI/HindIII y MluI/NotI respectivamente. Los casetes se conectan por una secuencia enlazadora sintética que varía entre las diferentes construcciones descritas en el presente documento. Abreviaturas: lacPO, promotor lac; sd, secuencia Shine-Dalgarno; peIB, secuencia señal de pectato liasa bacteriana; TP, sitio de proteasa tripsina; t, T7 terminador
45 transcripcional.
Figura 16
Valoraciones de fagémidos de scFv anti-phOx (SEQ ID NO:26) presentadas de pGALD7ΔL (pVIIΔL), pGALD7 (pVII), pSEX81 (pIII) y pSEX81ΔL (pIIIΔL).
Todos los fagémidos albergan un marcador de resistencia a ampicilina, por tanto las valoraciones se muestran como unidades formadoras de colonias resistentes a ampicilina por milímetro de solución (cfuampR/ml).
55 Figura 17
ELISA específica de antígeno (phOx-BSA) que compara la presentación funcional de scFv anti-phOx (SEQ ID NO:26) entre pVII y pIII, y con y sin secuencia señal (ΔL). Se llevó a cabo el ELISA como se describe en materiales y procedimientos y la entrada de la valoración fue de 2x 1010 cfuampR/ml para todas las muestras, excepto para pGALD7 (pVII), para la que se usó no diluido (correspondiente a 1,1x 107 cfuampR/ml). El anti-M13HRP es un control negativo en adsorción inespecífica de la detección del virión MAb para el antígeno y bloque.
Figura 18
65 (A) valoraciones de fagémidos de scFv anti-phOx presentadas de pGALD7ΔL (pVIIΔL), pGALD7 (pVII), pSEX81 (pIII) y pSEX81ΔL (pIIIΔL) mostradas como cfuampR/ml. (B). proporciones de fagémido con respecto a fago colaborador como la proporción de la valoración de fagémido (cfuampR/ml) dividida entre la valoración del fago colaborador (cfukanR/ml). En empaquetado del virión se realizó como un rescate de fagémido estándar como se describe en materiales y procedimientos (-), o con una concentración final de IPTG 0,1 mM presente después de superinfección
5 en ambos A y B.
Figura 19
ELISA específico de antígeno (phOx-BSA) que compara la presentación funcional de scFv anti-phOx pVII con y sin
10 secuencia señal (ΔL) y con y sin inducción de IPTG (0,1 mM) de la expresión de la fusión de pVII. Se llevó a cabo el ELISA como se describe en materiales y procedimientos y la entrada de la valoración fue de 2x 1010 cfuampR/ml para pGALD7ΔL (pVIIΔL), mientras que se usó el pGALD7 (pVII) no diluido (correspondiente a 2,0x 109 y 1,1x 107 cfuampR/ml sin y con IPTG, respectivamente). El anti-M13HRP es un control negativo en adsorción inespecífica de la detección del virión MAb para el antígeno y bloque.
15 Figura 20
ELISA específico de antígeno que compara la presentación funcional de scTCR (A) y scFv-anti-NIP (B) pVII con y sin secuencia señal (ΔL). Se llevó a cabo el ELISA como se describe en materiales y procedimientos usando
20 volúmenes iguales en sobrenadante aclarado no diluido. El anti-M13HRP es un control negativo en adsorción inespecífica de la detección del virión MAb para el antígeno y bloque. En (A), se usó el anticuerpo GB113 específico de clon para el receptor de linfocitos T 4B2A1 (Bogen et al, PMID: 1700755) como antígeno sustituto que sustituye el ligando afín I-Ed/A2315 al scTCR Vαβ4B2A1 (Løset et al, PMID: 17925331).
25 Figura 21
(A) valoraciones de fagémidos del scTCR Vαβ4B2A1 y el scFv anti-NIP (SEQ ID NO: 27) presentadas de pGALD7ΔL y pGALD7 usando un rescate de fagémido estándar como se describe en materiales y procedimientos. (B) proporciones de fagémido-a-fago colaborador de las mismas muestras que en (A).
30 Figura 22
(A) Densidad celular de los respectivos cultivos de E. coli al final de la medida de protocolo de empaquetado del virión como densidad óptica (DO) a A600nm. De forma notable, todos los cultivos se iniciaron a una densidad idéntica
35 de A600nm 0,025 y se superinfectaron con M13K07 a MOI5 cuando se alcanzó A600nm 0,1. A continuación, se dejó que prosiguiera el empaquetado ON a 30 ºC antes de medir la DO del cultivo final.
40 Cabe destacar que los modos de realización y las características descritas en el contexto de uno de los aspectos de la presente invención también se aplica a los otros aspectos de la invención.
Aquí se presenta un concepto novedoso, en el que la proteína de la cubierta estructural pVII del virión del fago filamentoso fago se altera genéticamente de modo que la versión modificada codifique una marca de secuencia N 45 terminal. Dependiendo de qué tipo de marca esté fusionada a pVII, a los viriones se les da la propiedad de detección de marca específica, así como de vías de purificación e inmovilización flexibles como propiedad inherente del sistema. El enfoque es directamente compatible con todos los sistemas de presentación de plll y pVIII existentes donde se aplican vectores de fagémidos basados en genoma de fagos, incluyendo una nueva generación de colección en pVII. Por lo tanto, el concepto ofrece una expansión sin precedentes de la ya alta versatilidad de la
50 tecnología de presentación en fagos.
El informe actual muestra por primera vez que el genoma del fago filamentoso tolera una modificación de péptido N terminal, que no alberga una secuencia señal, de pVII sin interferir con la viabilidad y funcionalidad del fago. Esto era cierto para ambos genomas M13K07 (SEQ ID NO: 31), VCSM13 (SEQ ID NO: 32) y fUSES (SEQ ID NO: 30) así
55 como los fagémidos y puesto que la secuencia y la conservación fenotípica entre las diversas cepas de fago son muy altas, esto se aplica de la forma más probable a todos los fagos filamentosos.
Una de las fusiones pVII elegidas fue una versión optimizada de codón procariota de la AviTag, un péptido que es el sustrato BirA más eficaz informado hasta la fecha. Combinando esta presentación peptídica de pVII con la
60 presentación de pIII, se muestra que se producen viriones biespecíficos. Esto es cierto para el vector basado en el genoma de fago fUSE5 (SEQ ID NO: 30) y de la presentación basada en fagémidos cuando se rescata con un fago colaborador modificado M13K07. Es fácilmente concebible que esta naturaleza biespecífica se pueda usar en combinación con la presentación de pVIII. En particular en el caso de viriones derivados de fagémidos, el nivel de biotinilación endógena era muy bajo.
65 Sin embargo, si son deseables niveles altos de biotinilación, esto se puede lograr fácilmente por biotinilación in vitro de este virión, así como por el uso de biotinilación in vivo por medio del uso de la cepa AVB100FmkII de E. coli Fpositiva novedosa.
5 Por tanto, el concepto actual permite la combinación de tecnología de avidina-biotina (y otros sistemas de captura) tanto con plataformas de presentación en fagos dominantes (fago y fagémido) como con sistemas de presentación (pIII y pVIII). Permite una unión específica de sitio, controlada, del resto de biotina a la partícula de fago sin interferir con la fusión de pIII y/o pVIII, garantizando por tanto la preservación de la funcionalidad. El sistema es directamente compatible con las plataformas existentes sin modificaciones adicionales, dando solo la opción de uso o no.
En conclusión, los viriones tanto derivados de genoma como derivados de fagémido pueden tolerar la modificación de pVII, proporcionando viriones con funcionalidad y viabilidad aparentemente normales.
Proteína de fusión pVII
15 En un aspecto, la presente invención proporciona un genoma de fago o un fagémido que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende la proteína de la cubierta menor de fago filamentoso pVII, comprendiendo dicha proteína de fusión una fusión de un péptido exógeno al extremo N terminal de pVII. Una proteína de fusión de este tipo es útil, por ejemplo, en el contexto de presentación en fagos.
Cuando se hace referencia a un péptido exógeno, lo que quiere decir es un péptido que no es parte originalmente de la proteína pIII, pVII o pVIII con o sin cualquier aminoácido enlazador al extremo N terminal de la parte de aminoácido de pIII, pVII o pVIII de la proteína de fusión. En un modo de realización preferente, la proteína de fusión no comprende una secuencia señal N terminal. Como se usa en el presente documento, el término péptido engloba
25 tanto péptidos cortos, polipéptidos, proteínas como fragmentos de los mismos.
El término proteína pIII se refiere a la secuencia de aminoácidos divulgada en SEQ ID NO 2.
En un modo de realización, la proteína pIII comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos un 80% con la de SEQ ID NO 2, al como una identidad de un 80 %, una identidad de un 81 %, una identidad de un 82 %, una identidad de un 83 %, una identidad de un 84 %, una identidad de un 85 %, una identidad de un 86 %, una identidad de un 87 %, una identidad de un 88 %, una identidad de un 89 %, una identidad de un 90 %, una identidad de un 91 %, una identidad de un 92 %, una identidad de un 93 %, una identidad de un 94 %, una identidad de un 95 %, una identidad de un 96 %, una identidad de un 97 %, una identidad de un 98 %, o una
35 identidad de un 99 %.
El término pVIII proteína de fusión se refiere a una proteína pVIII, o fragmentos de la misma, fusionada a un péptido exógeno.
El término proteína pVIII se refiere a la secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO 3.
En un modo de realización, la proteína pVIII comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos un 80% con la de SEQ ID NO 3, al como una identidad de un 80 %, una identidad de un 81 %, una identidad de un 82 %, una identidad de un 83 %, una identidad de un 84 %, una identidad de un 85 %, una
45 identidad de un 86 %, una identidad de un 87 %, una identidad de un 88 %, una identidad de un 89 %, tal como una identidad de un 90 %, una identidad de un 91 %, una identidad de un 92 %, una identidad de un 93 %, una identidad de un 94 %, una identidad de un 95 %, una identidad de un 96 %, una identidad de un 97 %, una identidad de un 98 %, o una identidad de un 99 %.
El término proteína pVII se refiere a la secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO 1.
En un modo de realización, la proteína pVII comprende el aminoácido con una identidad de secuencia de al menos un 80% con la de SEQ ID NO 1, al como una identidad de un 80 %, una identidad de un 81 %, una identidad de un 82 %, una identidad de un 83 %, una identidad de un 84 %, una identidad de un 85 %, una identidad de un 86 %,
55 una identidad de un 87 %, una identidad de un 88 %, una identidad de un 89 %, una identidad de un 90 %, una identidad de un 91 %, una identidad de un 92 %, una identidad de un 93 %, una identidad de un 94 %, una identidad de un 95 %, una identidad de un 96 %, una identidad de un 97 %, una identidad de un 98 %, o una identidad de un 99 %.
Identidad de secuencia
Como se define comúnmente "identidad" se define aquí como identidad de secuencia entre genes o proteínas al nivel de nucleótido o aminoácido, respectivamente.
65 Por tanto, en el presente contexto "identidad de secuencia" es una medida de identidad entre proteínas al nivel de aminoácido y una medida de identidad entre ácidos nucleicos a nivel de nucleótido. La identidad de secuencia de proteínas se puede determinar comparando la secuencia de aminoácidos en una posición dada en cada secuencia cuando se alinean las secuencias. De forma similar, la identidad de secuencia de ácidos nucleicos se puede determinar comparando la secuencia de nucleótidos en una posición dada en cada secuencia cuando se alinean las secuencias.
5 Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, se alinean las secuencias con fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácido o de ácido nucleico para una alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácido o de ácido nucleico). A continuación, se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = n.º de posiciones idénticas/n.º total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100). En un
15 modo de realización, las dos secuencias son de la misma longitud.
Se pueden alinear manualmente las secuencias y contar el número de aminoácidos idénticos. De forma alternativa, la alineación de dos secuencias para la determinación del porcentaje de identidad se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático. Un algoritmo de este tipo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de (Altschul et al. 1990). Las búsquedas de nucleótidos con BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de la palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteínas con BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína de la invención. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, se puede utilizar el
25 programa Gapped BLAST. De forma alternativa, se puede usar PSI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecte las relaciones distantes entre moléculas. Cuando se utilicen los programas NBLAST, XBLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos. Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. De forma alternativa, la identidad de secuencia se puede calcular después de que las secuencias se hayan alineado, por ejemplo, por el programa BLAST en la base de datos EMBL (www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST). En general, para la alineación se pueden usar los ajustes por defecto con respecto a, por ejemplo "matriz de puntuación" y "penalización por hueco". En el contexto de la presente invención, los ajustes por defecto BLASTN y PSI BLAST pueden ser ventajosos.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando técnicas similares a las descritas
35 anteriormente, dejando o sin dejar huecos. Al calcular el porcentaje de identidad, sólo se cuentan las coincidencias exactas.
Proteínas plegadas
En un modo de realización preferente, el término péptido se refiere exclusivamente a proteínas plegadas tales como los dominios derivados de anticuerpos. El destinatario experto reconocerá que las proteínas plegadas pueden ser anticuerpos o fragmentos de los mismos, que cubren Fv, scFv, Fab, dominios individuales, dominio Z de proteína A (Affibody), anquirina o fragmentos de la misma, receptor de linfocitos T o fragmento del mismo, MHC clase I y II, fibronectina o fragmento de la misma, avímeros, anticalinas, dominios PDZ, IgNAR o fragmento del mismo, CTLA4 o
45 fragmento del mismo, ImmE7, Knotinas , GFP y otros fluoróforos biológicos codificados por genes.
En principio, se puede realizar una colección de cualquier cosa siempre y cuando se pueda presentar, por tanto, al más alto nivel sólo se puede separar entre algo que sólo tiene una configuración no estructurada, en comparación con una estructura ordenada, esto es, un pliegue.
En otro modo de realización preferente, el término péptido se refiere exclusivamente a péptidos cortos entre de 2 a 50 aa. En cierta extensión, un péptido helicoidal aleatorio corto será lo suficientemente largo para adoptar un pliegue secundario o terciario definido y por tanto, entra en la definición de dominio plegado. Obviamente, esto dependerá de la composición química, por tanto, un péptido de 20 aa aún será una espiral aleatoria, mientras que otro péptido
55 de 20 aa puede estar plegado y por tanto entrar en la definición de dominio plegado.
En otro modo de realización preferente, la proteína de fusión pVII de la invención comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en pos. 1-33, 2-33, 3-33, 4-33 y 5-33 de SEQ ID NO:1.
SEQ ID NO:1 (MEQVADFDTIYQAMIQISVVLCFALGIIAGGQR) es la secuencia de aminoácidos de la proteína de cubierta estructural pVII del fago filamentoso (pVII natural). Lo más preferentemente, la proteína de fusión pVII comprende las posiciones 1-33 de SEQ ID NO:1.
Secuencia señal
65 Preferentemente, el péptido exógeno se fusiona directamente con o sin cualquier aminoácidos enlazador al extremo N terminal de la secuencia pVII de la proteína de fusión. Aún en otro modo de realización preferente, la proteína de fusión pVII no comprende una secuencia líder N terminal.
El término "secuencia líder" se usa de manera intercambiable con los términos "péptido señal" y "secuencia señal", y
5 se refiere a una secuencia de aminoácidos que dirige la proteína (de la que es parte la secuencia líder) al espacio de membrana periplásmica de bacterias gram negativas. Son ejemplos de secuencias líder usadas pelBss, OmpAss, TorAss, malEss, phoAss, lamBss, Blass, y DspAss, mglBss, sfmCss, tolBss y TorTss. Se sabe que dichas secuencias señal dirigen la proteína completa hacia la maquinaria secretora de E.coli que se sabe que incluye al menos la translocación dependiente de SRP, dependiente de SEC, dependiente de TatABC o dependiente de YidC desde el citosol al espacio periplásmico (Baneyx et al. PMID: 15529165). Por tanto, el término secuencia señal N terminal se refiere a una secuencia señal que está en la parte N terminal de la proteína.
Las secuencias señal que albergan la propiedad de dirigir una proteína (de la que es parte) a la maquinaria secretora de E. coli y por lo tanto translocarla del compartimento citosólido al periplásmico se pueden identificar 15 parcialmente por medio de firmas, o motivos, definidos por la propiedad química de su composición de aminoácidos.
Sin embargo, la variedad de la secuencia señal funcional existente es hasta el momento superior al conocimiento actual en su identificación, por tanto el estado de la técnica actual al definir un péptido como una secuencia señal afín se realiza típicamente por medio de extracción de datos usando datos basados en el conocimiento basados como moldes por, por ejemplo, metodología heurística o red neuronal. Existen varias de dichas herramientas disponibles para la comunidad por medio de canales de acceso abiertos como los actuales, tales como SignalP, PPSEARCH de PROSITE (EMBL-EBI), SecretomeP, TatP.
El reto es aún mayor con la clase de proteínas secretoras, en el sentido de que se exportan del compartimento
25 citosólico, que se desvía de las normas de modo que no se puede identificar ningún motivo de secuencia señal, pero a través de la extracción de datos también se pueden definir aquí características de secuencia señal u obtener la probabilidad de la capacidad secretora de la proteína eucariota en cuestión. Hasta el momento, no existe dicha herramienta para los taxones procariotas.
El único procedimiento actualmente disponible que identificó de forma irrevocable un péptido como secuencia señal es, por tanto, por medios experimentales para validar la propiedad de un péptido para establecer si es o no una secuencia señal real. También es evidente que se puede realizar ingeniería en dichos péptidos de modo que se puedan alterar las posiciones de aminoácidos dadas en la secuencia señal, mientras se retiene su función como péptido señal, por funcionalidad nativa, o bien por funcionalidad alterada, tal como un incremento en la capacidad de
35 transporte. También se puede emplear deleción o adición de aminoácidos. De hecho, dichos análisis e ingeniería se han realizado con la secuencia señal de Ff pVIII, g8pss dirigiendo la ruta Sec, y TorAss dirigiendo la ruta Tat. En especial, los resultados de Shen et al. pueden servir como directrices bien fundadas para la ingeniería de mutantes funcionales, pero alterados, de la secuencia señal de pIII y de la secuencia señal de la pectato liasa bacteriana.
La funcionalidad de una secuencia señal también se puede subdividir en las dos propiedades siguientes:
1. Dirigir una proteína (de la que es parte) a la maquinaria secretora de E. coli y de este modo translocarla del compartimento citosólico al periplásmico y en el transcurso de este proceso, separar proteolíticamente desde la proteína restante por proteasas específicas, tales como peptidasa señal de lipoproteína, o peptidasas líder.
2. Dirigir una proteína (de la que es parte) a la maquinaria secretora de E. coli y de este modo translocarla desde el compartimento citosólico al periplásmico y después de la translocación permanecer aún como parte de la proteína.
Aunque la gran mayoría de las secuencias señal se asignan a la situación 1) dada anteriormente, queda claro que estas proteínas se pueden modificar fácilmente a la situación 2). Por lo tanto, cualquier secuencia señal actualmente conocida, por ejemplo, una pelBss mutante y otra que pertenezca originalmente a la situación 1), pero que se alteran a la situación 2), aún se considera una secuencia señal afín.
Además, se puede concebir que se altere una secuencia señal de la situación 1) a la situación 2), o bien que se elija
55 directamente una secuencia señal que se asigne a la situación 2) y a continuación, después de la translocación retire la secuencia señal. Esto se puede realizar por proteasas endógenas del huésped y/o bien en el caso de, por ejemplo, presentación en fagos, cuando la proteína se fusiona con una proteína de la cápside. A continuación, se podría modificar en la región apropiada de la secuencia señal, o la proteína de la que es parte, un sitio de proteasa artificial, de modo que se puede realizar una escisión definida. Aquí se pueden prever dos tipos diferentes de sitios de proteasa elegidos:
A. El sitio de proteasa no escinde la proteína de interés, sólo el sitio predicho, tal como, por ejemplo, el sitio carboxipeptidasa A, o proteasa 3C de rinovirus en combinación con anticuerpos u otras estructuras de interés, tales como moléculas del complejo principal de histocompatibilidad o receptores de linfocitos T. Usando este enfoque, se
65 puede prever, por ejemplo, la presentación en fagos de la proteína de interés por el uso de una secuencia señal que se asigna a la situación 2) anterior y antes de usar en la selección, etc, retirar artificialmente el péptido señal para obtener la funcionalidad y homogeneidad para la fusión de cápside.
B. El sitio de proteasa escinde la proteína de interés además del sitio modificado, tal como, por ejemplo, tripsina.
5 Ambas situaciones aún se considerarán como presentación de fagos dependiente de secuencia señal.
Complementación natural
Hasta ahora, se que las fusiones de pVII sin secuencia señal no eran funcionales con respecto a la producción sostenida de partículas de fago (Endeman et al, 1995; Gao et al, 1999). Por lo tanto, las proteínas de fusión pVII con un péptido exógeno fusionado directamente a su extremo N terminal tenían que estar más complementados por la proteína wt pVII desde un segundo gen en el genoma del fago o bien por donación de un fago colaborador.
El término natural, a veces escrito "wildtype" o wt, es la forma típica de un organismo, cepa, gen, o característica
15 como se produce en la naturaleza. Natural (wildtype) se refiere al fenotipo más común en la población natural. Natural también se refiere al alelo en cada locus requerido para producir el fenotipo natural. Natural es el estándar de referencia para el genotipo y el fenotipo. En biología, se refiere específicamente a la diferencia ente un organismo que se produce de forma natural, y uno que se ha mutado deliberadamente. Mutagénesis dirigida a sitio es la técnica de búsqueda que permite la mutación de nucleótidos específicos en la secuencia génica de un gen natural. Las proteínas naturales se escriben como wt-(nombre de la proteína) por ejemplo una proteína pVII natural se escribe wt pVII, wt-pVII o pVII natural.
Los presentes inventores han descubierto que dichas proteínas de fusión pVII son, de hecho funcionales y no necesitan complementarse necesariamente por la proteína wt pVII.
25 Por tanto, un aspecto de la invención se refiere a proteínas de fusión pVII que son funcionales en una presentación en fagos sin complementación por la proteína wt pVII.
Kwasnikowski et al. informaron de proteínas de fusión pVII que no tenían que complementarse por la proteína pVII natural. Sin embargo, las proteínas de fusión pVII de Kwasnikowski et al., comprendían un péptido señal en el extremo N terminal del péptido exógeno. Se asumió que dicho péptido señal era necesario para dirigir la proteína de fusión pVII N terminal en el espacio periplásmico y evitar su acumulación en el citoplasma.
La ausencia de un péptido señal en el extremo N terminal de la proteína de fusión pVII tiene varias ventajas.
35 Normalmente, los péptidos señal se retiran proteolíticamente y a menudo este proceso no se completa, lo que genera extremos N terminales diferentes de la proteína procesada cuando se expresa una colección de proteínas, introduciendo así una heterogeneidad aleatoria en el sistema, que puede afectar a la funcionalidad de las proteínas que aún albergan el péptido líder lo que da lugar a errores no deseados en la proteína procesada. Esto se previene cuando no está presente ningún péptido señal.
Además, cuando se presenta una colección de péptidos, algunos de los péptidos pueden evitar o afectar la proteolisis, que a su vez afectará a la actividad de la proteína presentada y por tanto a la diversidad de la colección funcional. Otra ventaja sorprendente de no incluir un péptido señal es que la viabilidad y la funcionalidad del fago no se ven afectadas, al contrario que cuando se usa un péptido señal. Kwasnikowski et al., informaron de una
45 valoración reducida para fagos con la proteína de fusión pVII que comprende una secuencia líder (péptido señal) en los extremos N terminales.
Péptido exógeno
En un modo de realización, el péptido exógeno es una marca de afinidad que se une a un objetivo predeterminado. La marca de afinidad se puede unir, por ejemplo, a un anticuerpo predeterminado. Los pares de marcas de afinidad y objetivos predeterminados son bien conocidos para el experto en la técnica.
Las marcas de proteínas son secuencias peptídicas injertadas genéticamente sobre una proteína recombinante. A
55 menudo, estas marcas se pueden retirar por agentes químicos o por medios enzimáticos, tales como proteolisis o empalme de inteína. Las marcas se unen a proteínas para varios fines.
Las marcas de afinidad se añaden a las proteínas de modo que se pueden purificar a partir de su fuente biológica en bruto usando una técnica de afinidad.
Una característica del uso de una marca FLAG N terminal no procesada es que tiene su residuo formil-Met intacto y por tanto permite la interacción dependiente de Ca2+ con el anti-FLAG MAb M1. Por tanto, el virión se puede unir (es decir, inmovilizar) en M1 y liberar, simplemente quelando del catión, por ejemplo, por EDTA, ofreciendo de este modo una elución muy leve sin pH extremo que desnaturalice la(s) fusión/fusiones heteróloga(s). Al usar el M1
65 también significa que se puede usar el sistema con otras fusiones de FLAG presentes (C terminal o N terminal procesado, interno) sin interferencia ya que no se reconocen por M1, o manteniendo simplemente la [Ca2+] baja.
En un modo de realización preferente, el péptido exógeno de la proteína de fusión pVII se selecciona del grupo que consiste en Avitag (SEQ ID NO:A), marca FLAG (SEQ ID NO:9), marca HIS (SEQ ID NO:12), marca HAT, marca HA, marca c-Myc, marca Strep, marca V5ag, anticuerpo o fragmento del mismo, receptor de linfocitos T o fragmento
5 del mismo, MHC clase I y II, anquirina, IgNAR o fragmento del mismo, fibronectina o fragmento de la misma, dominio Z de proteína A, CTLA4 o fragmento del mismo, ImmE7, GFP y otros fluoróforos biológicos codificados por genes.
SEQ ID NO:2 (MSGLNDIFEAQKIEWHE) es una secuencia de sustrato de la secuencia del enzima BirA de E.coli que permite el acoplamiento específico de sitio mediado por enzima de un resto de biotina a la secuencia del sustrato. Por tanto, se combinan los recursos de la tecnología de presentación en fagos y la tecnología de avidinabiotina. Cualquier colección de fusión en la que la colección no se presente en pVII, por ejemplo, se puede fraccionar en primer lugar frente a un objetivo para la identificación miembros de la colección con alta afinidad y a continuación inmovilizarse usando unión de biotina a avidina, o una matriz de tipo avidina por medio de la inclusión adicional de la fusión de pVII en los viriones. De forma alternativa, cualquier colección de fusión en la que la colección no esté en
15 pVII, por ejemplo, en primer lugar se puede inmovilizar, de forma aleatoria o bien en una matriz predefinida en una matriz de avidina o de tipo avidina, de manera direccional, controlada seguido de rastreo del objetivo tal como, por ejemplo, en SEREX, por medio de la inclusión adicional de la fusión de pVII en los viriones. De forma similar, se puede detectar cualquier miembro de una colección de fusión pIII o pVIII de este tipo, en lote o bien como clones individuales, antes o después de la interacción del objetivo por el uso de cualquier complejo indicador de avidina o de tipo avidina, el término indicador en el presente documento describe, por ejemplo, especie de enzima, de ácido nucleico o fluoróforo sintético o biológico.
En esencia, la misma base que se indica para la AviTag, pero mientras que esta última da como resultado una inmovilización casi irreversible, la HIS6 permite una elución leve usando imidazol. La marca HIS es compatible con
25 todas las matrices IMAC disponibles,
En otro modo de realización preferente, el péptido exógeno de la proteína de fusión pVII es un miembro de la colección. Una colección, como se usa en el presente contexto, se refiere a una colección de diferentes péptidos. Los péptidos pueden ser dominios plegados o péptidos cortos de, por ejemplo, 2-50 aminoácidos. Dichas colecciones son de interés porque se pueden usar para identificar nuevos ligandos que se unen a un objetivo dado. Hay varias ventajas del uso de pVII para presentar una colección en comparación con colecciones presentadas usando pIII o pVIII. La presentación de pVII contiene los mismos recursos que la presentación con pIII con respecto a la direccionalidad y valencia, pero no afectará a la infectividad, un fenómeno que se sabe que se produce con la presentación de pIII, lo que introduce heterogeneidad no controlada y no deseada en el sistema, por ejemplo, en el
35 rescate después de la selección de afinidad. Además, se puede lograr la presentación de pVII sin la necesidad de un péptido líder N terminal, lo que es un prerrequisito para la presentación tanto de pIII como de pVIII. Finalmente, cualquier especie inmovilizada con el objetivo en la presentación de pIII requiere normalmente la alteración (normalmente por elución competitiva, o de pH alto o bajo) de este enlace objetivo-fago. Por ejemplo, se sabe que esto dificulta gravemente la recuperación de fijadores estables o de alta afinidad en la presentación de pIII. Como la pIII requerida para infección está inalterada y fácilmente disponible para interacciones alternativas en la presentación de pVII incluso después de la interacción fago-objetivo, esto elimina completamente la necesidad de alterar el enlace, por ejemplo por elución ácida, ya que los fagos inmovilizados retienen toda la infectividad y por tanto se pueden recuperar simplemente por infección mientras está unido al objetivo.
45 Ácido nucleico
Un segundo aspecto de la invención es un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la invención. El ácido nucleico puede estar comprendido dentro de un genoma de fago o dentro de un fagémido.
El término ácido nucleico se refiere a una macromolécula compuesta de cadenas de nucleótidos monoméricos. En bioquímica, estas moléculas portan información genética o forman estructuras dentro de las células. Los ácidos nucleicos más comunes son ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN). Además, el término ácidos nucleicos incluye ácidos nucleicos artificiales tales como ácido péptidonucleico (APN), morfolino y ácido nucleico bloqueado (ANB), así como ácido nucleico glucólico (ANG) y ácido nucleico treósico (ANT). Cada uno de estos se
55 distingue de ADN o ARN natural por cambios en el esqueleto de la molécula.
Un fagémido o fásmido es un tipo de vector de clonación desarrollado como un híbrido del fago filamentoso Ff y plásmidos para producir un vector que se puede propagar como un plásmido, y también se empaqueta como ADN monocatenario en partículas víricas. De forma similar a un plásmido, se puede usar un fagémido para clonar fragmentos de ADN e introducirse en un huésped bacteriano por una variedad de técnicas (transformación, electroporación). Sin embargo, la infección de un huésped bacteriano que contiene un fagémido con un fago 'colaborador', por ejemplo VCSM13 o M13K07, proporciona los componentes víricos necesarios para permitir la replicación del ADN monocatenario y el empaquetado del ADN de fagémido en las partículas de fago.
65 Fago filamentoso Un tercer aspecto de la invención es un fago filamentoso que comprende la proteína de fusión de la invención. El fago filamentoso puede comprender un genoma de fago genoma o un fagémido.
Fago, a menudo denominado bacteriófago, quiere decir aquí un virus que infecta, que se replica y que se secreta a
5 partir de una bacteria. Un bacteriófago filamentoso, o fago filamentoso, es un fago con un genoma de ADN monocatenario (genoma de ADNmc) que se empaqueta con proteínas de la cubierta del fago. La partícula de fago filamentoso secretada tiene fenotípicamente una estructura filamentosa.
El término fago filamentoso, como se usa en el presente documento, engloba tanto viriones derivados de genoma del fago como viriones derivados de fagémido.
En un modo de realización, el fago filamentoso no comprende un gen que codifique la proteína de fusión, ya que la proteína de fusión puede haber sido donada por un fago colaborador.
15 El término fago colaborador se refiere a un virus que ayuda a un virus defectuoso separado y no relacionado como, por ejemplo, un fagémido que en sí mismo no es un genoma de fago ni un virus funcional, sino simplemente un plásmido que contiene uno o varios elementos derivados de un genoma de fago, para reproducirse infectando la misma célula huésped que ya está ocupada por el virus defectuoso y proporcionar las proteínas que al virus defectuoso le faltan y que necesita para formar sus viriones de ciclo de vida completo que contienen el fagémido.
En otro modo de realización, el fago filamentoso comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la invención. El fago filamentoso puede comprender un genoma de fago genoma o un fagémido. Particularmente preferente es un fago que comprende un genoma de fago que comprende el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la invención.
25 Aún en otro modo de realización, el fago filamentoso de la invención comprende además un gen que codifica la proteína wt pVII y/o wt pVII. Es decir, el número de proteínas de fusión presentadas por el fago filamentoso se puede ajustar modulando la proporción de proteína wt pVII con relación a proteína de fusión pVII. Un sistema de este tipo también se puede denominar sistema 77 o sistema 7+7 dependiendo de si la proteína wt pVII se dona desde el fago colaborador (7+7) o desde un segundo gen en el genoma del fago (77).
Aún en otro modo de realización, el fago filamentoso no comprende el gen de wt pVII y/o la proteína wt pVII. Es decir, el fago filamentoso sólo comprende proteína de fusión pVII y no comprende proteína wt. pVII.
35 En un modo de realización preferente, el fago filamentoso comprende además una proteína de fusión pIII o una proteína de fusión pVIII. Por ejemplo, se puede presentar una colección en pIII o pVIII y la proteína de fusión pVII se puede usar para purificación por afinidad, inmovilización o detección usando, por ejemplo, avidina o una matriz de tipo avidina. Preferentemente, el fago filamentoso comprende solamente proteína pIX en forma natural.
Un cuarto aspecto de la invención es una colección de fagos filamentosos de la invención, presentando dichos fagos filamentosos péptidos o proteínas exógenas como fusiones para pIII, pVII o pVIII.
Una colección es una colección de fagos filamentosos que presentan péptidos o proteínas como parte de una o más proteínas de cubierta de fago filamentoso. Dichas colecciones pueden comprender dos o más fagos que presentan
45 diferentes péptidos o proteínas.
En un modo de realización preferente, los péptidos se presentan simultáneamente en pVII y pIII o bien pVIII.
En otro modo de realización preferente, el péptido exógeno presentado en pVII se selecciona del grupo que consiste en Avitag (SEQ ID NO:4), marca FLAG (SEQ ID NO:9), marca HIS (SEQ ID NO:12), marca HAT, marca HA, marca c-Myc, marca Strep, marca V5, anticuerpo o fragmento del mismo, receptor de linfocitos T o fragmento del mismo, anquirina, IgNAR o fragmento del mismo, fibronectina o fragmento de la misma, MHC clase I y II, dominio Z de proteína A, CTLA4 o fragmento del mismo, ImmE7, GFP y otros fluoróforos codificados por genes biológicos. En este modo de realización, los péptidos presentados en pIII o pVIII son preferentemente miembros de colección. En
55 un modo de realización alternativo, los miembros de la colección se presentan en pVII, mientras que pIII o pVIII presenta un péptido exógeno seleccionado del grupo que consiste en Avitag (SEQ ID NO:4), marca FLAG (SEQ ID NO:9), marca HIS (SEQ ID NO:12), marca HAT, marca HA, marca c-Myc, marca Strep, marca V5, anticuerpo o fragmento del mismo, receptor de linfocitos T o fragmento del mismo, MHC clase I y II, anquirina, IgNAR o fragmento del mismo, fibronectina o fragmento de la misma, dominio Z de proteína A, CTLA4 o fragmento del mismo, ImmE7, GFP y otros fluoróforos codificados por genes biológicos.
Sistema de presentación en fagos
Un quinto aspecto de la invención es un sistema de presentación en fagos que comprende un fagémido y un fago
65 colaborador, en el que el fago colaborador comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión pVII de la invención.
Sistema de presentación en fagos, técnica de presentación en fagos, tecnología de presentación en fagos o simplemente presentación en fagos se refiere a un procedimiento para el descubrimiento y estudio de las interacciones proteína-proteína, proteína-péptido y proteína-ADN que utiliza bacteriófago para conectar proteínas
5 con la información genética que las codifica.
Presentación de proteína o proteína presentada se refiere a una proteína fusionada con una proteína de cubierta de fago que es accesible para la detección o inmovilización por un ligando.
Un sexto aspecto de la invención es un sistema de presentación en fagos que comprende un fagémido y un fago colaborador, en el que el fagémido comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión pVII de la invención.
Kits
15 Un séptimo aspecto de la invención es un kit que comprende un sistema de presentación en fagos compuesto de un fagémido y un fago colaborador, en el que el fagémido comprende el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión pVII de la invención. El kit debe incluir un fagémido con un gen que codifica pVII con un sitio de clonación múltiple de forma N-terminal en la región codificante y un fago colaborador (por ejemplo M13K07, VCSM13 u otro). El kit se debe suplementar con protocolos para infección, expresión, inmovilización, selección y detección de clones de fago. Los kits también se deben acompañar con las recetas necesarias para los tampones y los medios para realizar los ensayos específicos.
Un kit se refiere aquí a una colección de reactivos para generar partículas de fago con proteínas de fusión
25 individuales o biespecíficas como una colección de presentación en fagos o bien como una partícula de fago individual. Un kit puede incluir fagémidos, fagos colaboradores, cepas bacterianas y un protocolo con recetas para los reactivos y la descripción de ensayo. Se puede usar un kit para el desarrollo de reactivos de búsqueda, diagnóstico y terapéuticos.
Un octavo aspecto de la invención es un kit que comprende un sistema de presentación en fagos basado en genoma de fago, en el que el genoma de fago comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión pVII de la invención.
El kit debe incluir un vector de genoma de fago (M13K07, VCSM13, fUSE5 (SEQ ID NO: 30)) con un gen que
35 codifica pVII con un sitio de clonación múltiple de forma N-terminal en la región codificante. El kit se debe suplementar con protocolos para infección, expresión, inmovilización, selección y detección de clones de fago. Los kits también se deben acompañar con las recetas necesarias para los tampones y los medios para realizar los ensayos específicos.
Un noveno aspecto de la invención es un kit que comprende un fago colaborador para la producción de colecciones de fagémidos de fusión de pIII o clones de fagémidos de fusión de pIII individuales con una marca como fusión de pVII. El kit debe incluir un fago colaborador (M13K07, VCSM13) con un gen que codifica pVII con secuencia insertada que codifica a péptido corto adecuado para fines de captura y /o detección. El kit se debe suplementar con protocolos para infección, expresión, inmovilización, selección y detección de clones de fago. Los kits también se
45 deben acompañar con las recetas necesarias para los tampones y los medios para realizar los ensayos específicos.
Un décimo aspecto de la invención es un kit que comprende un vector de genoma de fago para generar una colección de genoma de fago para presentación de proteínas de fusión tanto en pIII como en pVII. Un kit de este tipo debe incluir un vector de genoma de fago (Ff) con genes que codifican tanto PIII como PVII con múltiples sitios de clonación de forma N terminal en cada una de las regiones codificantes. De forma alternativa, el kit debe contener un vector de genoma de fago con secuencia insertada de forma N terminal en pVII que codifica un péptido corto adecuado para captura y /o detección y un sitio de clonación múltiple de forma N terminal en pIII. El kit se debe suplementar con protocolos para infección, expresión, inmovilización, selección y detección de clones de fago. Los kits también se deben acompañar con las recetas necesarias para los tampones y los medios para realizar los
55 ensayos específicos.
Un aspecto de la divulgación es un procedimiento que comprende las etapas de
- a.
- Proporcionar una colección de presentación en fagos biespecíficos, en la que los fagos comprenden un péptido presentado en una primera posición y una marca de afinidad en una segunda posición
- b.
- Seleccionar la colección de presentación en fagos frente a un objetivo
- c.
- Inmovilizar la colección de presentación en fagos frente a un grupo de captura de la marca de afinidad
65 La invención se describirá ahora con mayor detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLO 1. FAGOS COLABORADORES MODIFICADOS CON PÉPTIDOS FUSIONADOS A PVII.
5 Los fagos colaboradores modificados M13K07 (SEQ ID NO: 31) y VCSM13 (SEQ ID NO: 32), con FLAG-pVII, HIS6pVII, y AviTag-pVII pueden mostrar un potencial muy amplio para expandir el uso de tecnología de presentación en fagos, pero es de crucial importancia que los péptidos de fusión no comprometan la funcionalidad del fago colaborador, por lo tanto la valoración de los fagos es un parámetro de verificación importante. Además, los péptidos fusionados a pVII deben ser accesibles para la posterior detección y / o inmovilización. Este ejemplo soporta el hecho de que ambos fagos colaboradores modificados con pVII puedan albergar una variedad de péptidos con fines de detección y / o inmovilización y que estos péptidos de fusión no afectan a la infectividad de los fagos.
Aunque los resultados preliminares de Endemann y Model (PMID: 7616570) indicaron que la proteína pVII de la
15 cápside del fago filamentoso (Ff) no tolera las fusiones exógenas, posteriormente se demostró que tanto el péptido basado en fagémido (Gao et al (PMID: 10339535) como el basado en genoma de fago (Kwasnikowski et al (PMID: 16277988) y la presentación del dominio plegado se pueden permitir como fusiones N terminales para pVII. En ambos casos, se enfatiza que la clave para el éxito requirió la dirección periplásmica de la proteína de fusión añadiendo una secuencia señal procariota, o péptido líder, al extremo N terminal de la fusión, dirigiendo así la fusión a la ruta SEC del huésped de E. coli.
La presentación productiva de pVII sólo se ha mostrado previamente en el contexto de las fusiones N terminales codificadas en un fagémido que alberga un péptido líder N terminal garantizando el transporte de la pVII recombinante al compartimento periplásmico (Endeman et al, 1995; Gao et al, 1999).
25 Sin embargo, se sabe que antes de incorporarse en el virión, wt pVII se encuentra como proteína de membrana integral en la membrana interna del huésped de E. coli gram negativa, con su extremo N terminal orientado hacia el espacio periplásmico. Además, como está unida a esta membrana, la wt pVII madura retiene su grupo formilo amino terminal (Simons et al, PMID; 6945579), no parece procesarse de forma N terminal por, por ejemplo, las peptidasas líder periplásmicas, como es el caso con la gran mayoría de las proteínas dirigidas por secuencia señal que se encuentran fuera del compartimento citosólico (Baneyx y Mujacic, PMID: 15529165). Como no se puede identificar un motivo de tipo secuencia señal evidente en el pVII ORF, su modo de translocación desde el citosol al periplasma sigue siendo difícil de alcanzar, pero lo más probablemente no implica las cuatro maquinarias secretoras principales identificadas en E. coli, a saber, las rutas SEC, SRP y Tat y YidC (Baneyx y Mujacic, PMID: 15529165; Samuelson
35 et al, PMID: 10949305). Las estructura del virión de fago filamentoso se muestra en la figura 1.
Reactivos
Se prepararon todos los medios y tampones esencialmente como se describe en Sambrook et al (Molecular cloning: a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press)). El anticuerpo anti-M13-HRP y los anticuerpos M2 y M5 se adquirieron de GE Healthcare Bio-Sciences AB (Uppsala, Suecia) y Sigma-Aldrich (Oslo, Noruega), respectivamente. Las enzima de restricción (RE) se adquirieron de New England Biolabs (Ipswich, MA, EE.UU.) con la excepción de DpnI, que se obtuvo de Stratagene (LaJolla, CA, EE.UU.). Los oligos de ADN se adquirieron de MWG Biotech AG (Ebersberg, Alemania). Las perlas magnéticas de estreptavidina Dynabeads MyOne™ y las perlas
45 magnéticas de Ni-NTA Talon™ se adquirieron ambas de Invitrogen (Oslo, Noruega). BSA y Tween 20 se adquirieron de Sigma-Aldrich (Oslo, Noruega). Las ADN polimerasas Pfu Ultra y Phusion se adquirieron de Stratagene (LaJolla, CA, EE.UU.) y Sigma-Aldrich (Oslo, Noruega), respectivamente. La TMB soluble fue de Chalbiochem.
Cepas bacterianas, fago
Las cepas de E. coli XL1-Blue se adquirieron de Stratagene (LaJolla, CA, EE.UU.). El fago colaborador M13K07 se adquirió de GE Healthcare Bio-Sciences AB (Uppsala, Suecia) mientras que VCSM13 (SEQ ID NO: 32) se adquirió de Stratagene (LaJolla, CA, EE.UU.).
55 Diseño y mutagénesis in vitro de AviTag™-, HIS6-, y FLAG-pVII
Se comparó el marco de lectura abierto (ORF) de la AviTag™ (N-MSGLNDIFEAQKIEWHE-C) con el uso de codón en cepas K12 de E. coli usando el servidor GCUA (http://gcua.schoedl.de/seqoverall.html). Se unió una versión optimizada de codón procariota de la secuencia peptídica de AviTag™ (SEQ ID NO:4) de forma N terminal al pVII ORF por mutagénesis in vitro QuikChange™ de acuerdo con el protocolo de los fabricantes (Stratagen, LaJolla, CA, EE.UU.), usando el par de cebadores BirA-pVII_frwd/BirA-pVII_rev (5'-CCGGCTAAGTAACATGTCCGGCCTGAACGATATCTTTGAAGCGCAGAAAATTGAATGGCA TGAAATGGAGCAGGTC-'3/5'-GACCTGCTCCATTTCATGCCATTCAATTTTCTGCGCTTCAAAGATATCGTTCAGGCCGGAC
5 respectivamente) y HIS6-pVII-frwd/ HIS6-pVII-rev (5'-CCGGCTAAGTAACATGCATCACCATCACCATCACATGGAGCAGGTCG-3'/5'-CGACCTGCTCCATGTGATGGTGATGGTGATGCATGTTACTTAGCCGG-3') (SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11, respectivamente), respectivamente. Se verificaron las diversas construcciones por secuenciación de ADN (in-house ABI lab DNA sequencing core Facility, Dept. Molecular Biosciences, University of Oslo) en todos los casos. Para garantizar un fondo de vector limpio, se movió un fragmento BsrGI/SnaBI RE que contenía la pVII modificada en el genoma de M13K07wt o bien VCSM13wt en sitios de RE compatibles usando técnicas estándar. Se introdujeron las construcciones de ADN en los diversos huéspedes de E. coli por electroporación. El diseño de cebador se basó en una alineación de secuencia de las secuencias M13K07 (secuencia de New England Biolabs) (SEQ ID NO:31) y VCSM13 (n.º de acceso de GenBank: AY598820) (SEQ ID NO:32) usando ClustalW. La secuencia de las
15 secuencias mostradas AviTag™, HIS6, y FLAG se muestran en la figura 2.
Preparación de partículas de fago
Se amplificaron los fagos de E. coli XL1-Blue transformado con las construcciones M13K07 (SEQ ID NO: 31), VCSM13 (SEQ ID NO: 32) esencialmente como se ha descrito (Scott y Smith, PMID: 1696028).
Captura de perlas de SA de viriones biotinilados
Se transfirieron 10 μl/perlas de estreptavidina tube™ a tubos de 1,5 ml limpios y se añadieron 500 μl de BSA al 2 %
25 en PBS (p/v). Asimismo, se transfirieron 250 μl de sobrenadante aclarado o la cantidad apropiada de fagos a tubos de 1,5 ml y se complementaron con 250 μl de BSA al 2 %. A continuación, se incubaron los tubos durante 1 h a temperatura ambiente (TA) en una rueda giratoria. A continuación, se lavaron las perlas 3x inmovilizando las perlas en primer lugar por el uso de una rejilla magnética de tubos Dynal. Se desechó el sobrenadante y se añadieron 0,5 ml de PBS que contenía Tween 20 al 0,05 % (PBST) a cada tubo. Se sacaron los tubos fuera de la rejilla y se agitaron con vórtex brevemente antes de reintroducirlos en la rejilla. De nuevo se aclaró el sobrenadante y se repitió el lavado dos veces. Se retiraron los tubos de la rejilla y se añadieron 250 μl del fago bloqueado y se añadieron 250 μl de PBST a cada tubo. A continuación, se incubaron los tubos durante 1,5h/TA en una rueda giratoria. Se lavaron los tubos 3x en PBST como se describe anteriormente. A continuación, se añadieron 0,5 ml de PBST que contenía anti-M13 MAb-HRP (1:2000) a cada tubo y se incubaron los tubos durante 1h/TA en una rueda giratoria. Se lavaron
35 los tubos 3x en PBST como se describe anteriormente. A continuación, se añadieron 0,5 ml de ABTS a cada tubo y se dejaron los tubos en la mesa durante 30 min, antes de colocarlos en la rejilla magnética y se transfirieron 100 μl de sobrenadante a cintas de ELISA Maxisorp (Nunc, Roskilde, Dinamarca). A continuación, se midió la absorbancia a A405nm usando un aparato lector de ELISA TECAN.
Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas de captura de fago (ELISA).
Se absorbieron los anticuerpos M2 y M5 en pocillos de placa de microvaloración MaxiSorp™ (Nunc, Roskilde, Dinamarca) en concentraciones de 2,5 a 5 μg/ml en PBS, pH 7,4 durante la noche a 4 ºC. Se bloquearon los pocillos con leche desnatada al 2 % en PBS (p/v) durante 1 h a TA, a continuación se añadieron las preparaciones de
45 viriones y se dejó que reaccionara durante de 1 a 2 h a TA antes de que se detectaran los viriones capturados con anti-M13-HRP (1:5,000) durante 1 h a TA. Entre cada etapa, se lavaron los pocillos 3x con PBST. Se desarrollaron los pocillos con sustrato ABTS y se leyó la absorbancia a A405nm después de 30 min.
Resultados
A - Valoración de fagos colaboradores.
Se inocularon 16 ml de 2x YT con un cultivo recién preparado de XL1-Blue y se incubó a 37 ºC/250 rpm a una A600nm 0,4 -0,8. Se transfirieron 10 μl de cada preparación de fago diluido a una placa de microvaloración de 96 pocillos. Se
55 transfirieron 190 μl del cultivo XL1-Blue a cada pocillo con los diluyentes del fago. Se incubó la placa durante 50 min/37 ºC. Se cubrió con la membrana BA82/20 una placa de agar LB-kan, se manchó con un volumen de 3 μl/muestra la membrana y se incubó la placa a 37 ºC/ON. Se contaron las colonias (fig. 3).
B - Accesibilidad y funcionalidad de los péptidos insertados Avitag:
La enzima BirA es una acetil-CoA-carboxilasa y se encuentra de forma endógena en todas las E. coli. De hecho, se ha demostrado que la introducción de AviTag en el contexto de fago en dichas células da como resultado un pequeño nivel (~7 %) de biotinilación dirigida por BirA endógena (Sholle et al, PMID: 16628754). Para probar si en realidad la modificación de pVII N terminal era o no funcional en los viriones que se ensamblaron y funcionaron
65 como sustrato enzimático para BirA, se sometió a prueba si los viriones resultantes se podían capturar a partir de sobrenadante en bruto usando perlas magnéticas recubiertas con SA.
Captura de M13K07-AviTag pVII por perlas de estreptavidina Dynal.
5 Se emplearon dos fagos en este ensayo: M13K07-AviTag que se biotiniló in vivo por la BirA- endógena del huésped y M13K07wt. El resultado mostró claramente una captura de SA específica, mientras que el M13K07 (SEQ ID NO: 31) no se unió. Por tanto, la fusión AviTag-pVII, de hecho, debe ser funcional en el sentido de que ambos se acomodan al virión como wt pVII, mientras que la AviTag N terminal es accesible a la enzima BirA y se reconoce como sustrato para biotinilación (fig. 4).
Marca FLAG
Se realizaron ensayos ELISA para mostrar la accesibilidad de la marca FLAG como fusión de pVII en M13K07 (SEQ ID NO: 31) por la captura de fagos por dos anticuerpos anti-FLAG, M2 y M5. En el ensayo se incluyeron M13K07
15 natural, M13K07-His y M13K07-AviTag (fig.5).
Marca His
Se sometieron a prueba tanto M13k07-HIS6 como VCSM13-HIS6 para determinar la unión específica a perlas DynalTalon (matriz IMAC).
En resumen, se bloquearon las perlas Talon por incubación con BSA al 2 % durante 30 minutos con rotación. Se lavaron las perlas y se añadieron 250 μl de sobrenadante de fago bloqueado con BSA combinado para valoración (correspondiente a 2x 1010 cfukanR/ml) y se incubaron adicionalmente durante 30 min/TA en una rueda giratoria.
25 Después de lavar las perlas en PBST, se añadió anti-M13 MAb-HRP (diluido 1:2000) a cada tubo y se incubaron adicionalmente los tubos durante 45 min/TA en una rueda giratoria. Después del lavado, se añadió ABTS a cada tubo y se incubó 15 min a TA, antes de colocarlo en la rejilla magnética. Se transfirieron volúmenes de 100 μl de cada solución a cintas de ELISA Maxisorp. Se midió la absorbancia a A405 nm usando un aparato lector de ELISA TECAN. El resultado es un claro indicativo de que los viriones que contienen HIS6-pVII se unen preferentemente a perlas magnéticas de Ni-NTA. A pesar de las señales bajas, que se pueden superar por una optimización del ensayo, existe, de hecho una unión diferencial de los viriones afines con la matriz Ni-NTA. De las aplicaciones más atractivas de esta fusión pVII particular es la posibilidad de aprovecharse para la purificación de Ni-NTA en combinaciones con, por ejemplo, columnas de centrifugación, así como inmovilización específica de sitio, y por tanto direccional homogénea de las matrices Ni-NTA (fig. 6).
35 EJEMPLO 2. FUNCIONALIDAD DE FAGOS COLABORADORES MODIFICADOS EN EL EMPAQUETADO DE FAGÉMIDOS.
La promesa de la invención es el uso de fagos colaboradores modificados para el empaquetado funcional de fagémidos que presentan un dominio plegado en una proteína de la cubierta de fago distinta de pVII, preferentemente en pIII o pVIII. Los siguientes ejemplos respaldan que los fagos colaboradores modificados con diferentes péptidos fusionados a pVII pueden realizar el empaquetado de fagémido funcional y que estos fagémidos representan tanto la fusión del péptido pVII funcional así como los dominios empaquetados funcionales fusionados con sus proteínas de la cubierta pIII. De esta manera, los ejemplos también sirven para la presentación biespecífica
45 usando fagémidos.
Reactivos
Se prepararon todos los medios y tampones esencialmente como se describe en Sambrook et al (Molecular cloning: a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press)). El anticuerpo anti-M13-HRP y los anticuerpos M2 y M5 se adquirieron de GE Healthcare Bio-Sciences AB (Uppsala, Suecia) y Sigma-Aldrich (Oslo, Noruega), respectivamente, mientras que los anticuerpos F23.2 y GB113 fueron un amable obsequio del profesor B. Bogen (Institute of Immunology, University of Oslo, Noruega). Las perlas magnéticas de estreptavidina Dynabeads MyOne™ se adquirieron de Invitrogen (Oslo, Noruega). BSA y Tween 20 se adquirieron de Sigma-Aldrich (Oslo,
55 Noruega). El hapteno 2-feniloxazol-5-ona (phOx) conjugada con BSA se preparó esencialmente como se describe en otra parte (Makela et al, PMID; 722243).
Cepas bacterianas, fago y fagémidos
La cepa de E. coli XL1-Blue se adquirió de Stratagene (LaJolla, CA, EE.UU.). El fago colaborador M13K07 se adquirió de GE Healthcare Bio-Sciences AB (Uppsala, Suecia). El fagémido pSEX81 (SEQ ID NO:29), que alberga un scFv con especificidad frente a 2-feniloxazol-5-ona (phOx) acoplada a seroalbúmina bovina (BSA) se proporcionó amablemente por Affitech AS (Oslo, Noruega). El pFKPDN-scTCR Vαβ4B2A1 se describe en (Løset et al 2007, PMID: 17925331) (SEQ ID NO:28).
65 Preparación de partículas de fago Se monitorizó el rescate de fagémido de E. coli XL1-Blue usando fagos colaboradores M13K07 y ensamblaje de virión por valoración en detalle como se ha descrito (Welschof et al, PMID: 9050877 y Koch et al, PMID: 11126120).
5 Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas de captura de fago (ELISA)
Se absorbieron los Mab M2, M5, F23.2, GB113, phOx-BSA en pocillos de placa de microvaloración MaxiSorp™ (Nunc, Roskilde, Dinamarca) en concentraciones de 2,5 a 5 μg/ml en PBS, pH 7,4 durante la noche a 4 ºC. Se bloquearon los pocillos con leche desnatada al 2 % o BSA al 2 % en PBS (p/v) durante 1 h a TA, a continuación se añadieron las preparaciones de viriones y se dejó que reaccionara durante de 1 a 2 h a TA antes de que se detectaran los viriones capturados con anti-M13-HRP (1:5,000) durante 1 h a TA. Entre cada etapa, se lavaron los pocillos 3x con PBST. Se desarrollaron los pocillos con sustrato ABTS y se leyó la absorbancia a A405nm después de 30 min.
15 Resultados:
A - Empaquetado y valoración de fagémidos por M13K07 modificado.
Se emplearon dos fagémidos con diferentes dominios plegados, pFKPDNscTCR Vαβ4B2A1 pSEX-scFv anti-phOx , presentando scTcR y scFv como fusión de pIII, respectivamente. Se empaquetaron ambos con tres fagos colaboradores modificados y wt M13K07. En resumen, los cultivos durante la noche de los dos clones de fagémido se infectaron con fagos colaboradores modificados y wt. Después de la incubación, se centrifugó el cultivo y se resuspendió el sedimento bacteriano en medio YT con ampicilina y canamicina y se incubó adicionalmente ON a 30 ºC. Se usaron sobrenadantes aclarados por centrifugación corriente abajo. Se infectó el XL-1 Blue de E.coli con
25 diluciones de fagos y plaqueó sobre placas de ampicilina y canamicina para la valoración de fagémidos y fagos colaboradores, respectivamente. (Fig. 7)
Ambos fagémidos empaquetados muestran altas proporciones, lo que indica un empaquetado exitoso y funcional por los tres formatos de fagos colaboradores modificados de M13K07.
B - Funcionalidad de pVII donada por el fago colaborador en la presentación de pIII de fagémido:
Presentación de pVII-Avitag: Con respecto a la funcionalidad de AviTag-pVII, se llevó a cabo la captura en SA en perlas esencialmente como se describe en el ejemplo 1. Aunque las señales son bajas, existe, de hecho, una 35 captura diferencial específica de los viriones que contienen AviTag-pVII (Fig 8). En comparación con el control positivo (inserción), queda claro que el nivel de biotinilación menor en los viriones de fagémido que en los viriones de M13K07 cuando ambos albergan la fusión AviTag-pVII. Sin embargo, se sabe que la biotinilación de AviTag endógena en el contexto de fago sólo está en el intervalo de un 7 % a 37 ºC (Scolle et al PMID: 16628754). Mientras que, de hecho el M13K07-AviTag se empaqueta a 37 ºC, el rescate de fagémido se realiza sólo a 30 ºC, lo que sugiere fuertemente que la diferencia observada se debe a una menor actividad de BirA endógena per se a la menor temperatura. Por tanto, para un futuro uso, la eficacia de biotinilación del virión se debe incrementar para aprovechar esta característica. Esto se puede realizar convenientemente por biotinilación in vitro de los viriones, lo que debe dar una biotinilación próxima al 100 % usando técnicas estándar (Scolle et al PMID: 16628754). De forma alternativa, se puede realizar una biotinilación in vivo sobreexpresando la enzima BirA. Se sabe que mediante la
45 supertransformación de E. coli, de modo que más del vector del genoma de fagémido o fago estén en la misma célula, puede dar lugar al empaquetado del plásmido estándar en el virión y por tanto da lugar a la pérdida de la unión genotipo-fenotipo. Este sería el caso si se sobreexpresara la BirA a partir de un plásmido. Para una evaluación de clon individual esto puede ser aceptable, pero cuando se combina el enfoque con repertorios combinatorios esto es inaceptable ya que puede dar lugar a la pérdida de variantes fenotípicas reparados durante la fijación.
De forma alternativa, se puede sobreexpresar la BirA a partir de una integración cromosómica como se ofrece por la cepa AVB100 derivada de MC1061 E. coli (Avidity, CO, EE.UU.). Sin embargo, esta cepa carece del plásmido F que codifica la estructura F de las pilosidades indispensable para el sistema fagémido. Sin embargo, AVB100 es directamente compatible con vectores basados en genoma de fago, que no necesitan complementarse con el fago
55 colaborador. Para adoptar la cepa AVB100 para que también se ajuste a la presentación en fagos basada en fagémido en combinación con el fago colaborador M13K07 modificado, se hizo coincidir, por tanto, AVB100 con XL1-Blue por conjugación estándar (ejemplo 5).
Presentación de pVII-Flag:
Se realizaron ensayos ELISA para mostrar la accesibilidad de la marca FLAG como fusión de pVII en dos viriones derivados de fagémidos diferentes, pFKPDNscTCR Vαβ4B2A1 (Fig 9A) y pSEX-scFv anti-phOx (Fig 9B), capturando los viriones de fagémido por dos anticuerpos anti-FLAG, M2 y M5. En resumen, se recubrieron los anticuerpos en placas de ELISA ON a 4 ºC. Se lavaron las placas y se incubaron las preparaciones de fagémido en las placas 65 durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las placas y se incubaron adicionalmente con anticuerpo conjugado con HRP anti-M13. Se desarrollaron las señales después del lavado de las placas añadiendo ABTS
soluble y con incubación a TA/30 min (Fig 9).
Se obtiene la reactividad específica de FLAG para los viriones derivados de fagémido empaquetados con M13K07-FLAG, mientras que todas las demás muestras son negativas. Es decir, los viriones derivados de fagémido 5 empaquetados presentan la marca FLAG como una fusión de pVII funcional.
A. Funcionalidad de presentación de fagémido pIII.
Se sometieron a ensayo dos viriones derivados de fagémido diferentes, pFKPDNscTCR Vαβ4B2A1 y pSEX-scFv anti-phOx, presentando ambos AviTag (Fig 10), marca FLAG (Fig 11) y marca HIS6 (Fig.11) para determinar la presentación funcional de la fusión de scTcR y scFv pIII, respectivamente.
Se realizaron ensayos ELISA capturando los viriones de fagémido por sus objetivos específicos, MAB GB113 que se une a scTCR y phOx-BSA para el scFv anti-phOx (SEQ ID NO:26). Se usó BSA como bloque y se usó como control
15 los fagémidos rescatados por wt M13K07. En resumen, se recubrieron los objetivos en placas de ELISA ON a 4 ºC. Se lavaron las placas y se incubaron las preparaciones de fagémido en las placas durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las placas y se incubaron adicionalmente con anticuerpo conjugado con HRP anti-M13. Se desarrollaron las señales con ABTS y con incubación a TA/30 min, seguido de medida de la absorbancia a A405nm (fig. 10 y 11).
Los resultados muestran que se obtiene reactividad de Ag afín para todos los fagémidos empaquetados. Este análisis confirma, por tanto, que los fagos colaboradores modificados no afectan a la presentación de pIII, sino que simplemente donan un fenotipo definido a la proteína pVII en el mismo virión.
25 EJEMPLO 3. PRESENTACIÓN EN FAGOS GENÓMICA EN PIII Y PVII.
La invención permite la generación de un vector de fago genómico con la presentación de propiedades en las proteínas de cubierta pVII. Dicha presentación no afectará a la infectividad de viriones como presentación de pIII. Además, la invención fomenta la presentación biespecífica en pVII y pIII / pVIII, o incluso en las tres proteínas de la cubierta simultáneamente. El siguiente ejemplo respalda la presentación biespecífica en pIII y pVII en un sistema de presentación en fagos genómico que muestra que la construcción se comporta completamente como los fagos naturales con respecto a la propagación, ensamblaje de viriones, concentración de viriones, fenotipo de presentación de pIII y que, de hecho, se biotinila de forma selectiva in vivo en la fusión del péptido pVII.
35 Reactivos
Se prepararon todos los medios y tampones esencialmente como se describe en Sambrook et al (Molecular cloning: a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press)). El anticuerpo anti-M13-HRP se adquirió de GE Healthcare Bio-Sciences AB (Uppsala, Suecia) y los anticuerpos F23.2 y GB113 fueron un amable obsequio del profesor B. Bogen (Institute of Immunology, University of Oslo, Noruega). Las enzima de restricción (RE) se adquirieron de New England Biolabs (Ipswich, MA, EE.UU.) con la excepción de DpnI, que se obtuvo de Stratagene (LaJolla, CA, EE.UU.). Los oligos de ADN se adquirieron de MWG Biotech AG (Ebersberg, Alemania). Las perlas magnéticas de estreptavidina Dynabeads MyOne™ se adquirieron de Invitrogen (Oslo, Noruega). dm5CTP fue de Fermentas (Burlington, Canadá) BSA y Tween 20 se adquirieron de Sigma-Aldrich (Oslo, Noruega). Las ADN
45 polimerasas Pfu Turbo y Phusion se adquirieron de Stratagene (LaJolla, CA, EE.UU.) y Sigma-Aldrich (Oslo, Noruega), respectivamente. El kit de limpieza de PCR QIAquick fue de Qiagen (Qiagen, Hilden, Alemania).
Cepas bacterianas, fago y fagémidos
La cepa XL1-Blue de E. coli se adquirió de Stratagene (LaJolla, CA, EE.UU.), mientras que las cepas de E. coli MC1061 y K91K fueron amables obsequios del Dr G. P. Smith (Division de Biological Sciences, University de Missouri, EE.UU.) El fagémido pSEX81 (SEQ ID NO:29) que alberga un scFv con especificidad frente a 2feniloxazol-5-ona (phOx) acoplada a seroalbúmina bovina (BSA) se proporcionó por Affitech AS (Oslo, Noruega). El vector de presentación fUSE5-scTCR Vαβ4B2A1 pIII se describe en (Løset et al 2007, PMID: 17925331).
55 Diseño y mutagénesis in vitro de AviTag™ -pVII
Se comparó el marco de lectura abierto (ORF) de AviTag™ (N-MSGLNDIFEAQKIEWHE-C) con el uso de codón en cepas de K12 de E. coli usando el servidor GCUA (http://gcua.schoedl.de/seqoverall.html). Se unió una versión optimizada de codón procariota de la secuencia peptídica de AviTag™ de forma N terminal al pVII ORF por mutagénesis in vitro QuikChange™ de acuerdo con el protocolo de los fabricantes (Stratagen, LaJolla, CA, EE.UU.), usando el par de cebadores BirA-pVII_frwd/BirA-pVII_rev (5'-CCGGCTAAGTAACATGTCCGGCCTGAACGATATCTTTGAAGCGCAGAAAATTGAATGGCA TGAAATGGAGCAGGTC-'3/5'
65 GACCTGCTCCATTTCATGCCATTCAATTTTCTGCGCTTCAAAGATATCGTTCAGGCCGGAC ATGTTACTTAGCCGG-3') (SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6, respectivamente). Para garantizar un fondo de vector limpio, se clonó un fragmento BsrGI/SnaBI RE que contenía el pVII modificada en un genoma de fUSE5-scTCR Vαβ4B2A1 no modificado en sitios de RE compatibles usando técnicas estándar. Se introdujo la construcción de ADN en MC1061 de E. coli por electroporación. El diseño del cebador se basó en la secuencia fUSE5 publicada (n.º de acceso GenBank: AF218364) (SEQ ID NO: 30).
5
Construcción de los vectores de presentación de pVII genómicos novedosos pGVII y pGVIIΔL
El diseño del cebador y el ensamblaje del vector se realizó esencialmente como se describe en el protocolo SeamLess (Stratagene, LaJolla, CA, EE.UU.). Usando el ADN genómico de VCSM13 (SEQ ID NO: 32) como molde
10 y el par de cebadores VCSM13_F/VCSM13_R (5'-ATCTCTTCCATGGAGCAGGTCGCGGATTTCGACACAATTTATCAGG-3'/5'-ATCTCTTCCATGTTACTTAGCCGGAACGAGGCGCAGAC-3') (SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO: 20, respectivamente), se amplificó por PCR el genoma completo con Pfu Turbo polimerasa esencialmente como se describe en el protocolo SeamLess (Stratagene, LaJolla, CA, EE.UU.). Asimismo, pSEX81ΔL (el último descrito en el ejemplo 4),y
15 pSEX81 (SEQ ID NO:29) que albergan ambos una unidad scFv anti-phOx (SEQ ID NO:26), se usaron como molde en una PCR estándar usando ADN polimerasa Phusion (Sigma, Oslo, Noruega) con los pares de cebadores pGALDL_F/ pGAL_R (5'-TCTCTTCACATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAG-3'/5'-ATCTCTTCCCATTCTGATATCTTTGGATCCAGCGGCCGCAC-3') (SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23, respectivamente) y pGAL_F/ pGAL_R (5'-ATCTCTTCACATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGC-3'/5'
20 ATCTCTTCCCATTCTGATATCTTTGGATCCAGCGGCCGCAC-3')) (SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 23, respectivamente), respectivamente, para amplificar las unidades scFv. Después de la PCR, se purificaron los tres segmentos por un kit de limpieza de PCR (Qiagen, GmbH, Hilden, Alemania) y digerido con RE con EarI. A continuación se ligaron los segmentos purificados con gel digeridos con RE y se sometieron a electroporación en XL1-Blue usando técnicas estándar.
25 Se expandieron las colonias y se verificaron para determinar el tamaño de inserción correcto por rastreo con PCR en una PCR estándar usando el par de cebadores pVII_frwd/pVII_rev (5'-AGCAGCTTTGTTACGTTGATTTGG-3'/5'-GCAGCGAAAGACAGCATCG-3')) (SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25, respectivamente). Los vectores de presentación de pVII genómicos se indicaron como pGVII (con presentación scFv-pVII dependiente de secuencia
30 señal) y pGVIIΔL (con presentación scFv-pVII sin ninguna secuencia señal). Estos ahora contienen el scFv ORF como una fusión en-marco N terminal con pVII y preservan la posición correcta de su codón de inicio para el pV ORF corriente arriba importante para la transcripción y traducción normales. De forma notable, el ensamblaje de estos vectores de genoma de fago puede realizarse simplemente por un ensamblaje de PCR en tres etapas en el que el ORF exógeno se amplifica por PCR con la marca de cebador en 5' que sobresale complementaria al esqueleto del
35 vector, que se puede ayustar por SOEing (splicing by overlap extension) de PCR con segmentos complementarios amplificados desde la porción 5' y 3' del vector que cubre el sitio de inserción. Una porción ideal del genoma del fago debería cubrir un segmento que incluya los dos únicos sitios RE BsrGI/SnaBI que se encuentran flanqueando el pVII ORF en todos los genomas de Ff. El producto de SOEing digerido con RE se puede insertar convenientemente a continuación en un esqueleto de vector digerido con RE complementario, como se describe, por ejemplo, en el
40 ejemplo 1 y 3. Otra vía de ensamblaje conveniente sería realizar un ensamblaje génico artificial del ORF de fusión apropiado completamente por solapamiento corto de oligonucleótidos que se pueden aparear en un único recipiente, ligar y amplificar por PCR por cebadores flanqueantes. Esta estrategia puede dar un fragmento idéntico como en el enfoque de SOEing, o ser independiente de RE en el que la inserción en del genoma del fago se podía basar, por ejemplo, en la recombinación como se ha descrito (Tillett y Neilan, PMID: 10481038). También se puede prever
45 fácilmente una combinación de las técnicas.
Preparación de partículas de fago
Se amplificaron los fagos fUSE5 de E. coli MC1061 esencialmente como se ha descrito (Scott y Smith, PMID:
50 1696028). Se monitorizó el ensamblaje de viriones por valoración en detalle como se ha descrito (Scott y Smith, PMID: 1696028 y Koch et al, PMID: 11126120). En caso aplicable, se purificaron los viriones y se concentraron por precipitación con PEG/NaCl como se ha descrito (Sambrook et al (Molecular cloning: a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press)).
55 Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas de captura de fago (ELISA)
Se absorbieron los anticuerpos F23.2, GB113 en pocillos de placa de microvaloración MaxiSorp™ (Nunc, Roskilde, Dinamarca) en concentraciones de 2,5 a 5 μg/ml en PBS, pH 7,4 durante la noche a 4 ºC. Se bloquearon los pocillos con leche desnatada al 2 % en PBS (p/v) durante 1 h a TA, a continuación se añadieron las preparaciones de
60 viriones y se dejó que reaccionara durante de 1 a 2 h a TA antes de que se detectaran los viriones capturados con anti-M13-HRP (1:5,000) durante 1 h a TA. Entre cada etapa, se lavaron los pocillos 3x con PBST. Se desarrollaron los pocillos con sustrato ABTS y se leyó la absorbancia a A405nm después de 30 min.
A - Valoración de fagos genómicos fUSE5-scTCR- Avitag 65 Ni la versión wt, ni la fUSE5-scTCR Vαβ4B2A1 modificada con pVII presentan ninguna toxicidad a huésped. No existe diferencia fenotípica entre las versiones fUSE5-scTCR Vαβ4B2A1 modificadas pVII con relación a la producción de virión y la eficacia de precipitación con PEG. Ambas versiones fUSE5-scTCR Vαβ4B2A1 modificado por pVII proporcionan valoraciones teóricas casi máximas viables con el sistema fUSE5 (fig. 12).
5
B - Funcionalidad del péptido de fusión fUSE5-VII-AviTag
Este análisis ELISA es para probar la funcionalidad de preparaciones de fago genómicas por captura de viriones por perlas de estreptavidina seguido de detección de fagos unidos por anticuerpos anti M13. En resumen, se bloquearon
10 Dynabeads de estreptavidina MyOne con BSA, se lavaron y se incubaron con muestras normalizadas por valoración de fagos fUSE5 con (scTCR/pVII-AviTag) y sin péptidos de fusión pVII-Avitag (scTCR/pVII). Se lavaron las perlas y se detectaron los fagos unidos con anticuerpos conjugados anti-M13-HRP. Se desarrolló una señal por adición de ABTS y se midió a A405nm usando un aparato lector de ELISA TECAN. Los resultados muestran que el péptido pVII-BirA es accesible y se ha biotinilado, y por tanto sirve como una marca de inmovilización y detección para
15 viriones derivados del genoma de fago (fig. 13).
C -Funcionalidad de la fusión pIII fUSE5- scTCR
Este análisis de ELISA es para probar la funcionalidad de la fusión pIII de preparaciones de viriones derivados de
20 genoma de fago con y sin AviTag-pVII codificado por genoma. Se realizaron ensayos ELISA capturando viriones de fago por dos anticuerpos diferentes que reconoces el scTCR Vαβ4B2A1) (SEQ ID NO: 28); MAB GB113 y F23.2, respectivamente. Se usó leche desnatada como control negativo. En resumen, se recubrieron los anticuerpos en placas de ELISA ON a 4 ºC. Se lavaron las placas y se incubaron las preparaciones normalizadas de valoraciones de fagos en las placas durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las placas y se incubaron
25 adicionalmente con anticuerpo conjugado anti-M13 HRP seguido de la adición de 100 μl de ABTS e incubación a TA. Se midió la absorbancia después de 20 min a DO405nm usando un aparato lector de ELISA TECAN. El resultado muestra que el fenotipo de scTCR es indistinguible entre las dos versiones de fUSE5. Por tanto, la modificación pVII no parece que afecte al fenotipo del fago en ningún aspecto (fig. 14).
Reactivos
Se prepararon todos los medios y tampones esencialmente como se describe en Sambrook et al (Molecular cloning:
35 a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press)). El anticuerpo anti-M13-HRP se adquirió de GE Healthcare Bio-Sciences AB (Uppsala, Suecia) y el anticuerpo GB113 fueron un amable obsequio del profesor B. Bogen (Institute of Immunology, University of Oslo, Noruega). Las enzima de restricción (RE) se adquirieron de New England Biolabs (Ipswich, MA, EE.UU.) con la excepción de DpnI, que se obtuvo de Stratagene (LaJolla, CA, EE.UU.). Los oligos de ADN se adquirieron de MWG Biotech AG (Ebersberg, Alemania). BSA y Tween 20 se
40 adquirieron de Sigma-Aldrich (Oslo, Noruega). La ADN polimerasa Pfu Turbo se adquirió de Stratagene (LaJolla, CA, EE.UU.). Los haptenos 2-feniloxazol-5-ona phOx y 5-nitrofenacetilo (NIP) conjugado con BSA se prepararon esencialmente como se ha descrito en otra parte (Makela et al, PMID; 722243 y Michaelsen et al, PMID: 2125362). Isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) se adquirió de Fermentas (Burlington, Canadá).
45 Cepas bacterianas, fago y fagémidos
La cepa XL1-Blue de E. coli se adquirió de Stratagene (LaJolla, CA, EE.UU.). El fago colaborador M13K07 se adquirió de GE Healthcare Bio-Sciences AB (Uppsala, Suecia). El fagémido pSEX81 (SEQ ID NO:29), que alberga un scFv con especificidad frente a 2-feniloxazol-5-ona (phOx) acoplada a seroalbúmina bovina (BSA) se proporcionó
50 amablemente por Affitech AS (Oslo, Noruega). El fagémido de presentación de pIII pFKPDN-scTCR Vαβ4B2A1 se ha descrito en otra parte (Løset et al 2007, PMID: 17925331). El vector de expresión procariota pSG1 que alberga el scFv anti-NIP (SEQ ID NO: 27)(no publicado) se basa en pHOG21 (Kiprianov et al, PMID: 9005945) y se ha fabricado in-house a partir de los genes variables de anticuerpos derivados de pLNOH2 y pLNOK (Norderhaug et al, PMID: 9202712).
55 Construcción de los vectores de fagémido de presentación de pVII novedosos pGALD7 y pGALD7ΔL. Como molde de partida para el esqueleto del vector, se eligió el fagémido pSEX81 (SEQ ID NO:29) descrito anteriormente (n.º de acceso de GenBank: Y14584). En primer lugar, para retirar la secuencia señal de peIB procariota (N-MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA-C) (SEQ ID NO:33) que codifica un tramo en este vector, se introdujo un sitio NcoI
60 RE en el extremo N terminal por mutagénesis in vitro QuikChange™ usando el par de cebadores a41g-frwd/a41g-rev (5'-AGAGGAGAAATTAACCATGGAATACCTATTGCCTACGGC-3'/5-GCCGTAGGCAATAGGTATTCCATGGTTAATTTCTCCTCT-3') (SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO: 14, respectivamente), cambiando de este modo el primer nucleótido en el segundo codón del peIB ORF de A a G. Después de la mutagénesis, se digirió el vector por NcoI, se religó y se usó como molde en una segunda PCR recuperando la parte
65 relevante del vector usando el par de cebadores pHOG_EcoRI_frwd/scTCR_rev (5'
TAGCTCACTCATTAGGCACCC-3'/5'-TTTGGATCCAGCGGCCGC-3') (SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente). Este fragmento de PCR se movió a continuación en el pSEX81(SEQ ID NO:29) original en los sitios EcoRI/HindIII RE compatibles usando técnicas estándar y se confirmó por secuenciación de ADN. Esta etapa retiró completamente la porción que codifica la secuencia señal peIB, pero preservó el codón de partida y su 5 posición relativa hacia la secuencia lacPO y Shine-Dalgarno (SD) importante para la transcripción y traducción normales, así como añade sólo un residuo Ala antes de la secuencia exógena definida por los sitios NcoI/NotI RE hallados en el pSEX81 original (SEQ ID NO:29). La nueva construcción se indicó como pSEX81ΔL. En segundo lugar, se amplificó la secuencia que codifica pVII de M13K07 usando el par de cebadores marcados con RE en el extremo 5' pVII_EcoRV/ pVII_NheI (5'-ATATGATATCAGAATGGAGCAGGTCGCGGATTTCG-3'/5'-ATATGCTAGCTTATCATCTTTGACCCCCAGCGATTATACC-3') (SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO: 18, respectivamente). Este fragmento de PCR se movió a continuación en ambos fagémidos pSEX81 (SEQ ID NO:29), y pSEX81ΔL en los sitios de RE compatibles, intercambiando de este modo la región que codifica pIII en ambos y dando como resultado una fusión de pVII en-marco N terminal del casete definido con NcoI/NotI en el pSEX81original (SEQ ID NO:29). Se confirmaron las nuevas construcciones por secuenciación de ADN y se
15 indicaron como pGALD7 y pGALD7ΔL, respectivamente. Para intercambiar la unidad scFv anti-phOx (SEQ ID NO:26) en los diversos fagémidos descritos anteriormente, con las unidades scTCR Vαβ4B2A1 y scFv anti-NIP (SEQ ID NO: 27) de pFKPDN y pSG1, respectivamente, se realizó como un intercambio de casete definido con RE NcoI/NotI usando técnicas estándar. Todos los fagémidos describe en el presente documento se introdujeron en E. coli XL1-Blue por electroporación usando técnicas estándar.
Preparación de partículas de fago
Se monitorizó el rescate de fagémido de E. coli XL1-Blue usando fagos colaboradores M13K07 y ensamblaje de virión por valoración en detalle como se ha descrito (Welschof et al, PMID: 9050877 y Koch et al, PMID: 11126120).
25 Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas de captura de fago (ELISA)
Se absorbieron los MAb GB113, phOx-BSA o NIP-BSA en pocillos de placa de microvaloración MaxiSorp™ (Nunc, Roskilde, Dinamarca) en concentraciones de 2,5 a 5 μg/ml en PBS, pH 7,4 durante la noche a 4 ºC. Se bloquearon los pocillos con leche desnatada al 2 % o BSA al 2 % en PBS (p/v) durante 1 h a TA, a continuación se añadieron las preparaciones de viriones y se dejó que reaccionara durante de 1 a 2 h a TA antes de que se detectaran los viriones capturados con anti-M13-HRP (1:5,000) durante 1 h a TA. Entre cada etapa, se lavaron los pocillos 3x con PBST. Se desarrollaron los pocillos con sustrato ABTS y se leyó la absorbancia a A405nm después de 30 min.
35 Resultados
Debido a los resultados de los fagos colaboradores modificados descritos anteriormente, también se evaluó la presentación de pVII de dominios plegados. Como tanto Gao et al como Kwasnikowski et al han mostrado que se permite dicha presentación cuando se usa en combinación con la dirección periplásmica dirigida por secuencia señal, se construyeron dos fagémidos novedosos denominados pGALD7 y pGALD7ΔL, permitiendo una presentación de pVII N terminal con y sin una secuencia señal de este tipo , respectivamente (figura 15).
Las construcciones iniciales contenían una unidad de scFv basada en segmentos variables de anticuerpo humano y son específicas para el conjugado hapteno phOx-BSA. Como con los fagos colaboradores modificados con pVII
45 descritos previamente, la presentación de pVII del scFv no deben interferir con el ensamblaje de virión normal. Por lo tanto, se compararon el rendimiento de estos fagémidos con presentación de pVII scFv anti-phOx con y sin secuencia señal y también con presentación de pIII estándar con y sin secuencia señal, usando rescate de fagémido estándar y valoración como se describe en materiales y procedimientos. (Fig. 16)
De hecho, el resultado de la valoración mostró que se produjeron los viriones que contenían fagémido en todos los casos. Sin embargo, mientras que el fagémido pVIIΔL proporcionó valoraciones aproximadamente 30 veces menores que la presentación de pIII estándar, hubo una reducción enorme de 105 veces en la presentación de pVII dirigida con secuencia señal. Como la complementación wt de pVII está presente del fago colaborador en este sistema, este hallazgo fue tanto sorprendente como importante, debido a que muestra que la presentación de pVII
55 dirigida con secuencia señal (pVII) interfiere gravemente con el proceso de ensamblaje del virión, mientras que este efecto sólo es menor en el caso con presentación de pVII sin secuencia señal (pVIIΔL). En comparación, la diferencia de valoración entre la presentación de pIII con y sin secuencia señal, sólo fue menor.
Basándose en las valoraciones determinadas anteriormente, a continuación se evaluó la presentación de scFv funcional en estas muestras de virión en un ELISA específico de phOx-BSA usando entradas normalizadas de valoraciones, excepto para la muestra derivada de pGALD7 que se usó sin diluir ya que la valoración de fagémido era muy baja. (Fig.17).
El resultado claramente mostró la presentación de scFv funcional tanto de la versión pVII sin secuencia señal como 65 de pIII estándar, mientras que las otras muestras fueron negativas. Se esperaba que la presentación de pVII dirigida
con secuencia señal proporcionara resultados negativos debido a la entrada de virión menor de 2000 veces. Se sabe que pIII se exporta al periplasma por medio de la ruta SEC, por tanto la versión de pIII sin secuencia señal proporciona fusiones de pIII defectuosas en la dirección periplásmica, lo que es un prerrequisito para la incorporación de virión. Los viriones de esta muestra, por tanto, contienen sólo pIII derivado de fago colaborador 5 (pérdida de la unión física de fenotipo-genotipo), aunque la eficacia de empaquetado de fagémido es casi normal y da como resultado valoraciones normales (como se ve en la figura 16). Aunque tanto la versión pVII sin secuencia señal como la presentación de pIII estándar proporcionaron una presentación funcional, queda claro que la capacidad de unión a antígeno parece más fuerte con pIII. Esto no refleja necesariamente una mayor funcionalidad de la versión pIII, ya que está bien documentado que la presentación de pIII estándar hace que una mezcla de presentación mono- a oligovalente de unidades scFv provoque efectos de avidez (Bradbury y Marks, PMID: 15261570). Dichos efectos enmascaran la verdadera afinidad inherente de la interacción, y aunque a menudo se prefiere la unidad scFv debido al perfil de expresión superior, está extensamente documentado que, por ejemplo, el menor formato Fab expresado, con el significado de menor unidades por virión, da como resultado uniones mucho más fuertes en la selección de afinidad (de Haard, et al, PMID: 10373423 y Hoogenboom, PMID: 16151404). Por lo
15 tanto, puede ser que la señal menor de pGALD7ΔL refleje una presentación scFv casi monovalente, lo que podría ser ventajoso para muchas aplicaciones.
Los casetes de expresión scFv-pVII/pIII en todos los fagémidos empleados aquí se controlan por el promotor lac y el empaquetado de virión se realizó usando el protocolo estándar sin inducción IPTG (Welschof et al, PMID: 9050877), Por tanto, deber ser posible incrementar la presentación de scFv forzando una expresión más fuerte usando IPTG durante el empaquetado. Además, una característica importante de presentación en fagos de fagémido es el hecho de que la presentación funcional es dependiente del rescate mediado por fago colaborador del fagémido. Por lo tanto, en contraste con la presentación basada en genoma de fago, hay dos fuentes de ADNmc que se pueden empaquetar en el virión desde una célula dada (el fagémido o el genoma de fago colaborador). De forma importante,
25 ambos tipos de viriones tendrán acceso al mismo conjunto de proteínas de la cápside, ya que se producen y se encuentran dentro de la misma célula huésped. Para garantizar la preservación de la unión física de genotipofenotipo que forma la base para la tecnología combinatoria de presentación en fagos, por lo tanto, de de mayor importancia que la proporción de fagémido-a-fago colaborador esté a favor del fagémido. En un nuevo experimento, se prepararon las mismas muestras derivadas de fagémido como se describe anteriormente, pero ahora comparando el ensamblaje de virión con y sin IPTG incluido durante el empaquetado. Durante la valoración, esta vez también se mapearon las valoración de genoma de fago colaborador por medio de la resistencia a canamicina hallada en el genoma del fago colaborador.
El resultado de la valoración actual (Fig. 18A) presentó la misma tendencia que en el empaquetado inicial (Fig. 16),
35 con respecto a las valoraciones de fagémido en comparación con diferentes fagémidos en condiciones estándar, pero esta vez ambos pGALD7ΔL (pVIIΔL) y pGALD7 (pVII) tuvieron valoraciones algo mayores. En la inducción de IPTG de la expresión de pVII, o pIII todos los fagémidos presentan una reducción en la valoración, pero el efecto es el más grave para el fagémido pGALD7 de pVII dirigido con secuencia señal. Cuando se mapean las proporciones de fagémido-a-fago colaborador (Fig. 18B) y se comparan los diferentes fagémidos en condiciones estándar (sin IPTG presente), todas las muestras presentan proporciones en el intervalo normal y a favor del fagémido, excepto para el fagémido pGALD7 de pVII dirigido con secuencia señal, que presenta una pérdida completa de la unión de fenotipo-genotipo. En la inducción de IPTG, el desacoplamiento del fenotipo-genotipo fue aún más pronunciado para el fagémido pGALD7, y ahora también pIII sin secuencia señal (pIIIΔL) presentó esta característica en menor medida (proporción 0,5). Sin embargo, la última construcción es, sin embargo, no funcional con respecto a la presentación
45 pIII y sólo se incluyó como control.
Basándose en las valoraciones de fagémido mostradas en la Fig. 18A, se ensayó entonces la presentación de scFv funcional de los viriones pGALD7DL y pGALD7 en un ELISA específico phOx-BSA similar al mostrado en la Fig. 17. Usando entradas de valoraciones normalizadas.
El resultado, de hecho, mostró que la presentación de scFv-pVII funcional se logró de nuevo con pGALD7ΔL sin secuencia señal y la reactividad de phOx-BSA se incrementó significativamente en la expresión de la fusión de pVII forzada IPTG. Este incremento en la reactividad del antígeno refleja más probablemente un incremento en el número de fusión pVII por virión así como un incremento en el número de viriones que albergan una fusión pVII per se. Esto
55 último es probable ya que se sabe que en la presentación de pIII estándar sólo entre un 1 a un 10 % de los viriones que contienen fagémido contiene realmente una fusión (Bradbury y Marks, PMID: 15261570). Por otra parte, de nuevo la presentación de pVII dirigida con secuencia señal no mostró unión phOx-BSA funcional. Basándose en la Fig. 18B, la reactividad de antígeno débil observada en la muestra no inducida con IPTG, se debe asignar a viriones que contienen fago colaborador que albergan la fusión de pVII a nivel bajo.
Hasta este momento, se ha mostrado claramente la presentación basada en fagémido de pVII funcional de la unidad anti-phOx (SEQ ID NO:26) scFv , y que esta construcción es comparable con la presentación de pIII del mismo scFv, presentando sólo una reducción menor en las valoraciones de fagémido y en la capacidad de unión a antígeno.
65 El scFv anti-phOx (SEQ ID NO:26) se ha seleccionado para una colección de scFv de anticuerpo humano y se sabe que se expresa bastante bien en E. coli (Marks et al., PMID: 1748994). Para ver si la presentación de pVII presenta o no la capacidad para presentación funcional de compañeros de fusión más difíciles, se subclonó por tanto, un scFv anti-NIP (SEQ ID NO: 27) basado en los genes variables de anticuerpo de un hibridoma murino, así como un scTCR basado en los genes variables del clon de linfocito T murino 4B2A1 (Løset et al, PMID: 17925331) en ambos pGALD7ΔL y pGALD7. Es bien conocido que muchos genes variables de hibridoma no se expresan bien en E. coli y
5 también cuando los fagos presentados (Krebber et al, PMID: 9032408) y los receptores de linfocitos T son de la clase de proteínas plegadas que se ha probado que son especialmente difíciles de acomodar a la presentación en fagos (Li et al, PMID: 15723046, y Løset et al, PMID: 17925331).
Se prepararon viriones de estos nuevos fagémidos por rescate de fagémido estándar y se sometieron a prueba para determinar la capacidad de unión a antígeno en ELISA (figura 20).
El resultado, de hecho, mostró que se logró la presentación de pVII funcional con ambos scFv anti-NIP (SEQ ID NO: 27) y scTCR Vαβ4B2A1 y en contraste con lo que se observó previamente con el scFv anti-phOx (SEQ ID NO:26), este era el caso tanto con como sin presentación de pVII dirigida con secuencia señal. Las señales observadas en la
15 figura 20 no se compararon directamente porque valoraciones de virión no se normalizaron antes del ensayo. En vista la naturaleza no funcional completa de la presentación de pVII dirigida con secuencia señal del scFv anti-phOx (SEQ ID NO:26), se valoraron las muestras anteriores y se determinaron las proporciones de fagémido-a-fago colaborador (figura 21).
Las valoraciones de fagémido de nuevo mostraron que la presentación de pVII sin secuencia señal (pGALD7ΔL) presentaron un rendimiento superior en comparación con la presentación de pVII dirigida con secuencia señal (figura 21A). Esto, de hecho era cierto para ambos scTCR y scFv anti-NIP, pero la diferencia era menos obvia que con las valoraciones observadas para scFv anti-phOx (véanse las figuras 6 y 8). Cuando se comparan las proporciones de fagémido-a-fago colaborador, el pGALD7ΔL de nuevo mostró un rendimiento excelente con proporciones muy a
25 favor del fagémido tanto en el caso de scTCR como de scFv anti-NIP (SEQ ID NO: 27) (figura 21B). La grave pérdida de la unión de genotipo-fenotipo vista con scFv anti-phOx (SEQ ID NO:26) no se observó para scTCR ni scFv anti-NIP (SEQ ID NO:27), a partir de esas proporciones (figura 18 frente a figura 21B). Sin embargo, pGALD7ΔL fue claramente superior.
En vista de los resultados anteriores, cabe destacar el hecho de que hubo una diferencia bastante marcada entre scTCR y scFv anti-NIP con respecto a la proliferación en células huésped durante el empaquetado del virión (figura 22).
De la figura 22 es evidente que mientras que los cultivos que contenían pGALD7ΔL sólo tienen un efecto menor en
35 la proliferación en células huésped, se inhibió significativamente el crecimiento por los clones que contenían el fagémido pGALD7. Esto es un indicativo convincente de la toxicidad del huésped del fagémido de presentación de pVII dirigida con secuencia señal, mientras que no se observa o se observa muy poca toxicidad tan pronto como se retira la secuencia señal.
EJEMPLO 5. CONSTRUCCIÓN DE LA CEPA DE E. COLI AVB100FMKII
Reactivos y cepa bacteriana
Se prepararon todos los medios y tampones esencialmente como se describe en Sambrook et al (Molecular cloning:
45 a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press)). Las cepas de E. coli XL1-Blue y AVB100 (basadas en MC1061) se adquirieron de Stratagene (LaJolla, CA, EE.UU.) y Avidity (Denver, CO, EE.UU.), respectivamente.
Resultados
Para obtener AVB100 de E. coli positivo de plásmido F (StrR cromosómico) se hicieron coincidir las células con XL1-Blue (TetR plásmido F) como sigue. Se inocularon colonias individuales de cada cepa en 5 ml de medio LB complementado con el antibiótico apropiado y se incubó durante la noche a 37 ºC con agitación rigurosa. Al día siguiente, se iniciaron cultivos de 5 ml recién preparados a una A600nm de 0,1 y se hicieron crecer en fase semilogarítmica a 37 ºC con agitación rigurosa antes de que se mezclaran 1 ml de cada uno y se incubó de forma
55 estacionaria a 37 ºC durante 1 h. A continuación, se transfirieron 10 μl de esta mezcla a 5 ml de medio LB recién preparado que contenía 100 μg/ml de Str y 30 μg/ml de Tet y se incubó durante la noche a 37 ºC con agitación rigurosa. Al día siguiente, se pulverizaron diluciones de este cultivo en placas de agar que contenían 100 μg/ml de Str y 30 μg/ml de Tet y se usaron las colonias resultantes como fuente de la nueva cepa AVB100 positiva de plásmido F, denominada AVB100FmkII.
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<213> Artificial
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<223> péptido sintético
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<213> Artificial 20 <220>
<223> oligonucleótido
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5 <211> 76
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<213> Artificial
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<223> oligonucleótido 10 <400> 6 <210> 13
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- <213> Artificial
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- <223> oligonucleótido
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- 53
- 20
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- <211> 53
- <212> ADN
- <213> Artificial
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- <213> Artificial
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- <213> Artificial
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- 47
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5 <220>
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<223> oligonucleótido 15 <400> 14 gccgtaggca ataggtattc catggttaat ttctcctct 39
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<400> 15 tagctcactc attaggcacc c 21 25 <210> 16
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<213> Artificial
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<223> oligonucleótido
<400> 16
tttggatcca gcggccgc 18
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<213> Artificial
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<400> 17 atatgatatc agaatggagc aggtcgcgga tttcg 35
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<400> 18 atatgctagc ttatcatctt tgacccccag cgattatacc 40
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<400> 20 atctcttcca tgttacttag ccggaacgag gcgcagac 38 65 <210> 21
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- atctcttcac atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggc
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<223> Vector de presentación en fagos filamentosos fUSE5, secuencia completa
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<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial
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<223> secuencia señal
<400> 33
Claims (12)
- REIVINDICACIONES1. Un genoma de fago o un fagémido que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión quecomprende la proteína de la cubierta menor de fago filamentoso pVII, en el que la proteína de fusión no comprende 5 una secuencia señal N terminal.
- 2. El genoma de fago o fagémido de la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión pVII comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en pos. 1-33, 2-33, 3-33, 4-33 y 5-33 de SEQ ID NO:1 (MEQVADFDTIYQAMIQISVVLCFALGIIAGGQR).
-
- 3.
- El genoma de fago o fagémido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el péptido exógeno de la proteína de fusión pVII está fusionado directamente al extremo N terminal de la secuencia pVII.
-
- 4.
- El genoma de fago o fagémido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el péptido exógeno de la
15 proteína de fusión pVII se selecciona del grupo que consiste en Avitag (SEQ ID NO:4), marca FLAG (SEQ ID NO:9), marca HIS (SEQ ID NO:12), marca HAT, marca HA, marca c-Myc, marca Strep, marca V5, anticuerpo o fragmento del mismo, receptor de linfocitos T o fragmento del mismo, MHC clase I y II, anquirina, IgNAR o fragmento del mismo, fibronectina o fragmento de la misma, dominio Z de proteína A, CTLA4 o fragmento del mismo, ImmE7 y GFP y otros fluoróforos codificados por genes biológicos. - 5. El genoma de fago o fagémido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el péptido exógeno de la proteína de fusión pVII es un miembro de colección.
- 6. Un fago filamentoso que comprende el genoma de fago o fagémido de cualquiera de las reivindicaciones 25 anteriores.
- 7. El fago filamentoso de la reivindicación 6, que comprende además un gen que codifica wt pVII y/o la proteína wt pVII.
- 30 8. El fago filamentoso de la reivindicación 6, en el que el fago no comprende un gen que codifica wt pVII y/o la proteína wt pVII.
- 9. El fago filamentoso de cualquiera de las reivindicaciones 6-8, que comprende además una proteína de fusión pIII
- o a una proteína de fusión pVIII. 35
- 10. Una colección de fagos filamentosos como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 6-9 que presenta péptidos exógenos como fusiones para pIII, pVII o pVIII.
- 11. La colección de la reivindicación 10, en la que los péptidos se presentan de forma simultánea en pVII y pIII o 40 bien pVIII, o ambas.
- 12. Un sistema de presentación en fagos que comprende un fagémido y un fago colaborador, en el que el fago colaborador comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1.45 13. Un sistema de presentación en fagos que comprende un fagémido y un fago colaborador, en el que el fagémido comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1.
- 14. Un kit que comprende el sistema de presentación en fagos de la reivindicación 12 y/o 13.Fig. 16
Applications Claiming Priority (5)
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