ES2448816T3

ES2448816T3 - Biocatalizadores de transaminasa

Info

Publication number: ES2448816T3
Application number: ES10746948.8T
Authority: ES
Inventors: Christopher Savile; Emily Mundorff; Jeffrey C. Moore; Paul N. Devine; Jacob M. Janey
Original assignee: Codexis Inc
Current assignee: Codexis Inc
Priority date: 2009-02-26
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2014-03-17
Anticipated expiration: 2030-02-26
Also published as: US8889380B2; US20190071702A1; EP2401366B1; CN102405281B; JP5707344B2; JP6034346B2; US20160264948A1; US20120329108A1; EP2401366A2; US10160985B2; US20150037869A1; US20100285541A1; US12344874B2; JP2012519004A; WO2010099501A3; CN102405281A; US20200199636A1; US20180201963A1; US20210332399A1; JP6250747B2

Abstract

Un polipéptido de transaminasa capaz de convertir el sustrato de cetoamida 4 - oxo - 4 - [3 - (trifluorometil) - 5,6 - dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 - α] pirazin - 7 (8H) - il] - 1 - (2, 4, 5 - trifluorofenil) butan - 2 - ona en elproducto (2R) - 4 - oxo - 5 4 - [3 - (trifluorometil) - 5, 6 - dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 - α] pirazin - 7 (8H) - il] - 1- (2, 4, 5 - trifluorofenil) butan - 2 - amina, en la que el polipéptido de transaminasa comprende una secuenciaaminoácida que es idéntica en, al menos, el 80 % a la SEC ID Nº 4 y en la que la secuencia aminoácida incluye,al menos, las siguientes características: (1) el residuo correspondiente a X223 de la SEC ID Nº es P; (2) elresiduo correspondiente a X69 de la SEC ID Nº 2 es G, C, T, A o S y / o el residuo correspondiente a X284 de laSEC ID Nº 2 es G; y (3) el residuo correspondiente a X122 de la SEC ID Nº 2 es M, I, V o H.

Description

Biocatalizadores de transaminasa

CAMPO TÉCNICO

5 [0001] La presente divulgación se refiere a biocatalizadores de transaminasa y a procedimientos de utilización de biocatalizadores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Tras la ingestión de un alimento, se liberan un grupo de hormonas denominadas incretinas, que incluyen glucagón como péptido – 1 (GLP – 1) y péptido insulinotrópico – dependiente de glucosa (GIP). Las incretinas estimulan la liberación de insulina y reprimen la liberación de glucagón de manera dependiente, retrasa el vaciado gástrico y aumenta la saciedad. Las incretinas se degradan rápidamente por la Dipeptidil peptidasa IV (DPP – 4).

15 [0003] La Sitagliptina forma parte de una clase de medicamentos anti hiperglicémicos que inhiben la DPP – 4. La actividad inhibitoria de la DPP – 4 y, por tanto, el retraso de la inactivación de creatinas parece mejorar la función insular incrementando la reactividad de las células alfa y beta a la glucosa, dando como resultado una secreción de glucosa – dependiente de insulina mejorada y una secreción reducida de glucagón inapropiado. Debido a sus efectos anti hiperglicémicos, la Sitagliptina ha sido aprobada para su uso en el tratamiento de diabetes Tipo 2 en numerosos países.

[0004] El proceso actual de fabricación de la Sitagliptina presenta hidrogenación asimétrica de una amida enamina desprotegida (patente US Nº 7.468.459, emitida el 23 de diciembre del 2008; Shultz et al., 2007, Acc. Chem. Res. 40 1320 – 1326). El uso de un catalizador de rodio con ligando de tipo JOSIPHOS en metanol a 50 ºC y 250 psi

25 presenta Sitaglipina como base libre en un 97 % e.e. La mejora de la cristalización de la base libre produce Sitagliptina con gt; 99,5 % e.e. Y un 84 % de rendimiento, y la subsecuente reacción con ácido fosfórico da lugar a monohidrato fosfato de Sitaglipina, el principio farmacéutico activo (“API”) en JANUVIA®, en un 97 % del rendimiento completo a partir del sustrato de amida enamina.

[0005] Para más referencias sobre el enfoque de resolución química para sintetizar Sitagliptina véanse Dooseop et al., 2005 (Journal of medicinal chemistry, 48: 141 – 151), Edmonson et al., 2004 (Bioorganic & medicinal chemistry,

14: 5155 – 5155) y la patente WO 2004 / 085378.

[0006] En Oue, 1999, J. Biol. Chem, 274: 2344 – 2349, se trata el resideño de la especifidad del sustrato de una 35 enzima mediante efectos acumulativos de las mutaciones de residuos en sitio no activo.

[0007] Se aconsejan otras mejoras en el proceso de fabricación de Sitagliptina.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0008] La presente invención presenta un polipéptido de transaminasa capaz de convertir el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) –il] –1 –(2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina, en la que el polipéptido de transaminasa

45 comprende una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80 % a la SEC ID Nº 4 y en la que la secuencia aminoácida incluye, al menos, las siguientes características: (1) el residuo correspondiente a X223 de la SEC ID Nº es P; (2) el residuo correspondiente a X69 de la SEC ID Nº 2 es G, C, T, A o S y / o el residuo correspondiente a X284 de la SEC ID Nº 2 es G; y (3) el residuo correspondiente a X122 de la SEC ID Nº 2 es M, I, V o H.

[0009] La invención también presenta un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención.

[0010] La invención también presenta una célula huésped que comprende un vector de expresión que incluye un polinucleótido de la invención.

55 [0011] La invención también presenta un proceso de preparación de un compuesto cuya fórmula estructural (I) es:

que tiene la configuración estereoquímica indicada en el centro estereogénico marcado con un *; con un exceso 65 enantiomérico de, al menos, el 70 % respecto al enantiómero opuesto, en el que

Z es OR2 o NR2R3;

R1 es C1–8 alquilo, arilo, heteroarilo, arilo – C1–2 alquilo o heteroarilo – C1–2 alquilo; R2 y R3 son hidrógenos independientes, C1–8 alquilo, arilo o arilo – C1–2 alquilo; o R2 y R3 junto al átomo de nitrógeno al que se unen forman un anillo heterocíclico membrado de 4– a 7– que contiene un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S, NH y NC1–4 alquilo, sustituyendo, o no, el anillo heterocíclico por

5 uno de los tres sustituyentes seleccionados independientemente entre oxo, hidroxi, halógeno, C1–4 alcoxi y C1–4 alquilo, en el que alquilo y alcoxi son sustituidos, o no, por uno a cinco átomos de flúor; y fusionando el sistema del anillo heterocíclico a un sistema de anillos carbocíclicos aromáticos o saturados de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros que contiene de uno o dos heteroátomos seleccionados entre O, S y

10 NC0–4 alquilo, sustituyendo, o no, el sistema de anillos fusionados por uno o dos sustituyentes seleccionados entre hidroxi, amino, flúor, C1–4 alquilo, C1–4 alcoxi y trifluorometil; el proceso incluye la etapa de poner en contacto una cetona proquiral de fórmula estructural (II):

20 con un polipéptido de transaminasa de la invención en presencia de un dador del grupo amino en un disolvente orgánico apropiado en las condiciones de reacción adecuadas, en las que, opcionalmente:

i) R1 es un bencilo en el que el grupo fenil de bencil es sustituido, o no, por uno a 3 sustituyentes seleccionado del grupo formado por flúor, trifluorometil y trifluorometoxi; o 25 ii) Z es NR2R3, por ejemplo un heterociclo de fórmula estructural (III):

en la que R4 es hidrógeno o C1–4 alquilo, sustituido, o no, por uno a cinco átomos de flúor.

35 [0012] La invención también presenta una composición que comprende el polipéptido de transaminasa según la invención y:

(a) Un compuesto de fórmula estructural (I): 40

que tiene la configuración estereoquímica indicada en el centro estereogénico marcado con un *; en el que:

50 Z es OR2 o NR2R3; R1 es C1–8 alquilo, arilo, heteroarilo, arilo – C1–2 alquilo o heteroarilo – C1–2 alquilo; R2 y R3 son hidrógenos independientes, C1–8 alquilo, arilo o arilo – C1–2 alquilo; o R2 y R3 junto al átomo de nitrógeno al que se unen forman un anillo heterocíclico membrado de 4– a 7– que contiene un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S, NH y NC1–4 alquilo, sustituyendo, o no, el anillo

55 heterocíclico por uno de los tres sustituyentes seleccionados independientemente entre oxo, hidroxi, halógeno, C1–4 alcoxi y C1–4 alquilo, en el que alquilo y alcoxi son sustituidos, o no, por uno a cinco átomos de flúor; y fusionando el sistema del anillo heterocíclico a un sistema de anillos carbocíclicos aromáticos o saturados de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros que contiene

60 de uno o dos heteroátomos seleccionados entre O, S y NC0–4 alquilo, sustituyendo, o no, el sistema de anillos fusionados por uno o dos sustituyentes seleccionados entre hidroxi, amino, flúor, C1–4 alquilo, C1–4 alcoxi y trifluorometil;

(b) Un compuesto de fórmula estructural (1): 65

que tiene la configuración – (R) en el centro estereogénico marcado con ***, en el que:

Ar es un fenilo sustituido, o no, por uno a cinco sustituyentes independientemente seleccionados del grupo formado por flúor, trifluorometil y trifluorometoxi; y R4 es hidrógeno o C1–4 alquilo sustituido, o no por uno a cinco átomos de flúor;

(d) Un compuesto de fórmula estructural (II)

que tiene la configuración estereoquímica indicada en el centro estereogénico marcado con un *, en el que:

35 Z es OR2 o NR2R3; R1 es C1–8 alquilo, arilo, heteroarilo, arilo – C1–2 alquilo o heteroarilo – C1–2 alquilo; R2 y R3 son hidrógenos independientes, C1–8 alquilo, arilo o arilo – C1–2 alquilo; o R2 y R3 junto al átomo de nitrógeno al que se unen forman un anillo heterocíclico membrado de 4– a 7– que contiene un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S, NH y NC1–4 alquilo, sustituyendo, o no, el anillo heterocíclico por uno de los tres sustituyentes seleccionados independientemente entre oxo, hidroxi, halógeno, C1–4 alcoxi y C1–4 alquilo, en el que alquilo y alcoxi son sustituidos, o no, por uno a cinco átomos de flúor; y fusionando el sistema del anillo heterocíclico a un sistema de anillos carbocíclicos aromáticos o saturados de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros que contiene de uno o dos

45 heteroátomos seleccionados entre O, S y NC0–4 alquilo, sustituyendo, o no, el sistema de anillos fusionados por uno o dos sustituyentes seleccionados entre hidroxi, amino, flúor, C1–4 alquilo, C1–4 alcoxi y trifluorometil;

55 (e) Un compuesto de fórmula estructural (2):

en el que:

Ar es un fenilo sustituido, o no, por uno a cinco sustituyentes independientemente seleccionados del grupo formado por flúor, trifluorometil y trifluorometoxi; y R4 es hidrógeno o C1–4 alquilo sustituido, o no, por uno a cinco átomos de flúor; o

(f) El compuesto de fórmula estructural (2a) 65

RESUMEN DE LA DIVULGACIÓN

[0013] La presente divulgación se refiere a polipéptidos, polinucleótidos que codifican los polipéptidos y métodos

15 de utilización de los polipéptidos para la conversión biocatalítica de 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona (el “sustrato de cetoamida”) en (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) –il] – 1–(2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina (el “producto”) en presencia de un dador del grupo amino. El producto, que tiene el nombre USAN de Sitagliptina, es el principio activo de JANUVIA®, que ha recibido la aprobación comercial en numerosos países para el tratamiento de la diabetes Tipo 2.

[0014] Ya que las transaminasas naturales medidas por los inventores no actuaban notablemente en el sustrato de cetoamida, las transaminasas modificadas de la presente divulgación son capaces de llevar a cabo fácilmente la conversión del sustrato de cetoamida en el producto. Por tanto, por un lado, la presente divulgación se refiere a

25 transaminasas mejoradas capaces de convertir 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona (“el sustrato de cetoamida”) en (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina (“el producto”) en presencia de un dador del grupo amino a niveles medibles mediante un análisis técnico, como la absorción UV – HPLC.

[0015] En algunas realizaciones, las transaminasas mejoradas de la divulgación son capaces de llevar a cabo la conversión del sustrato de cetoamida en el producto con una actividad superior o igual a la actividad del polipéptido de la SEC ID Nº 4. En las presentes realizaciones, las transaminasas mejoradas son capaces de formar el producto con un exceso enantiomérico de, al menos, el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más.

35 [0016] En algunas realizaciones, las transaminasas mejoradas son capaces de llevar a cabo la conversión del sustrato de cetoamida en el producto con, al menos, 1, 5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000 o más de 2000 veces la actividad del polipéptido de la SEC ID Nº 4 en condiciones de reacción definidas. En algunas realizaciones, las condiciones de reacción comprenden una temperatura de 45 ºC y un pH de 8,5.

[0017] En algunas realizaciones, los polipéptidos de transaminasa mejorada son capaces de convertir el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4]

45 triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina en presencia de un dador del grupo amino con una actividad mejorada respecto a la actividad de la transaminasa de la SEC ID Nº 2 y comprende una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más a la secuencia de referencia de las SEC ID Nº 4, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100 o 102.

[0018] En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa mejorada puede comprender una secuencia aminoácida que contiene una o más diferencias residuales en comparación a la secuencia de la SEC ID Nº 2 en las siguientes posiciones residuales correspondientes a: X4, X5, X8, X18, X25, X26, X27, X28, X30, X41, X42, X48, X49, X50, X54, X55, X56, X61, X62, X65, X69, X81, X94, X96, X102, X117, X120, X122, X124, X126, X136, X137,

55 X138, X146, X148, X150, X152, X155, X156, X160, X163, X164, X169, X174, X178, X195, X199, X204, X208, X209, X211, X215, X217, X223, X225, X230, X252, X269, X273, X282, X284, X292, X297, X302, X306, X321 y X329. Las directrices para elegir los diversos residuos aminoácidos que pueden presentarse en las posiciones residuales especificadas se presentan en la siguiente descripción detallada.

[0019] En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada mejorada comprende una secuencia aminoácida correspondiente a la secuencia de la SEC ID Nº ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

65 [0020] Por otro lado, la presente divulgación se refiere a polinucleótidos que codifican los polipéptidos de

transaminasa modificada mejorada. En algunas realizaciones, los polinucleótidos pueden formar parte de un vector de expresión que tiene una o más secuencias de control para la expresión del polipéptido de transaminasa. En algunas realizaciones, el polinucleótido puede comprender una secuencia correspondiente a la secuencia de la SEC ID Nº: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61,

5 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, o 167.

[0021] Por otro lado, la presente divulgación se refiere a células huésped que comprenden polinucleótidos que

10 codifican las transaminasas modificadas o vectores de expresión capaces de expresar las transaminasas modificadas. En algunas realizaciones, la célula huésped pueden ser células huésped bacterianas, como E. coli. Las células huésped pueden utilizarse para la expresión y el aislamiento de las enzimas transaminasa modificada descritas en la presente, o, de manera alternativa, para convertir directamente el sustrato de cetoamida en el producto.

15 [0022] En algunas realizaciones, las transaminasas modificadas, en forma de células completas, extractos crudos, polipéptidos aislados o polipéptidos purificados, pueden utilizarse individualmente o como una combinación de diferentes transaminasas modificadas.

20 [0023] Por otro lado, los polipéptidos de transaminasa modificada mejorada descritos en la presente pueden utilizarse en un proceso de transaminación de ciertos aceptores de grupos amino (por ejemplo, una cetona aceptora) en presencia de un dador del grupo amino. En algunas realizaciones, las transaminasas pueden utilizarse en un proceso de preparación de un compuesto de fórmula estructural (I):

que tiene la configuración estereoquímica indicada en el centro estereogénico marcado con un *; con un exceso enantiomérico de, al menos, el 70 % respecto al enantiómero opuesto, en el que

Z es OR2 o NR2R3;

35 R1 es C1–8 alquilo, arilo, heteroarilo, arilo – C1–2 alquilo o heteroarilo – C1–2 alquilo; R2 y R3 son hidrógenos independientes, C1–8 alquilo, arilo o arilo – C1–2 alquilo; o R2 y R3 junto al átomo de nitrógeno al que se unen forman un anillo heterocíclico membrado de 4– a 7– que contiene un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S, NH y NC1–4 alquilo, sustituyendo, o no, el anillo heterocíclico por uno de los tres sustituyentes seleccionados independientemente entre oxo, hidroxi, halógeno, C1–4 alcoxi y C1–4

40 alquilo, en el que alquilo y alcoxi son sustituidos, o no, por uno a cinco átomos de flúor; y fusionando el sistema del anillo heterocíclico a un sistema de anillos carbocíclicos aromáticos o saturados de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros que contiene de uno o dos heteroátomos seleccionados entre O, S y NC0–4 alquilo, sustituyendo, o no, el sistema de anillos fusionados por uno o dos sustituyentes seleccionados entre

45 hidroxi, amino, flúor, C1–4 alquilo, C1–4 alcoxi y trifluorometil; el proceso incluye la etapa de poner en contacto una cetona proquiral de fórmula estructural (II):

con un polipéptido transaminasa de la invención en presencia de un dador del grupo amino en un disolvente

55: orgánico apropiado en las condiciones de reacción adecuadas para la conversión del compuesto de fórmula (II) en el

compuesto de fórmula (I).

[0024]: En algunas realizaciones, los polipéptidos de transaminasa modificada mejorada descritos en la presente

60

65

6 5

que tiene la configuración – (R) en el centro estereogénico marcado con ***, con un exceso enantiomérico de, al menos, el 70 % respecto al enantiómero que tiene la configuración – (S) opuesta, en la que: Ar es un fenilo sustituido, o no, por uno a cinco sustituyentes independientemente seleccionados del grupo formado por flúor, trifluorometil y trifluorometoxi; y R4 es hidrógeno o C1–4 alquilo sustituido, o no, por uno a cinco átomos de flúor, en el que el proceso comprende la etapa de poner en contacto una cetona proquiral de fórmula estructural (2):

con un polipéptido de transaminasa modificada mejorada descrita en presencia de un dador del grupo amino en un disolvente orgánico apropiado en las condiciones de reacción adecuadas para la conversión del compuesto de fórmula (2) en el compuesto de fórmula (1). En algunas realizaciones del proceso, la Ar de la fórmula (2) es 2, 5 – difluorofenilo o 2, 4, 5 – trifluorofenilo, y R4 es trifluorometilo. En algunas realizaciones del proceso, la Ar de la fórmula (2) es 2, 4, 5 – trifluorofenilo.

[0025] En algunas realizaciones, los polipéptidos de transaminasa modificada mejorada pueden utilizarse en un proceso de preparación de un compuesto de fórmula (1a), (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina con un exceso enantiomérico:

[0026] En estas realizaciones, el proceso comprende la etapa de poner en contacto una cetona proquiral de fórmula estructural (2a), 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il]

– 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona:

con un polipéptido de transaminasa modificada mejorada descrita en presencia de un dador del grupo amino en un disolvente orgánico apropiado en las condiciones de reacción adecuadas para la conversión del compuesto de fórmula (2a) en el compuesto de fórmula (1a).

[0027] En algunas realizaciones de los procesos anteriores, el compuesto de fórmula (I), el compuesto de fórmula

(1) o el compuesto de fórmula (1a) se producen con, al menos, el 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de exceso enantiomérico. En algunas realizaciones de los procesos, el compuesto de fórmula (I), el compuesto de fórmula (1) o el compuesto de fórmula (1a) se producen con, al menos, el 99 % de exceso enantiomérico.

[0028] En algunas realizaciones de los procesos anteriores en los que la elección del dador del grupo amino es resultado de un subproducto carbonilo que tiene una presión de vapor mayor que el agua (por ejemplo, un co– producto de bajo punto de ebullición como un compuesto carbonilo orgánico volátil), el proceso puede llevarse a cabo de manera que el subproducto se elimine inyectando a la solución de la reacción un gas no reactivo (por ejemplo, nitrógeno) o aplicando un vacío para bajar la presión de la reacción y eliminando así el subproducto carbonilo presente en la fase gaseosa.

[0029] Los polipéptidos de transaminasa modificada mejorada útiles para los procesos anteriores pueden

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comprender una secuencia aminoácida seleccionada de la SEC ID Nº 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

[0030] Por otro lado, la presente divulgación se refiere a procesos de preparación de (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina utilizando las transaminasas modificadas reveladas en la presente. En algunas realizaciones, el proceso comprende poner en contacto el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona en presencia de un dador del grupo amino con un polipéptido de transaminasa modificada descrito en la presente en condiciones de reacción apropiadas para convertir el sustrato de cetoamida en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina.

[0031] En algunas realizaciones, el proceso es capaz de formar el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil)

–: 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina con, al menos, un 90 % de exceso enantiomérico.

[0032] En algunas realizaciones, el proceso es capaz de formar el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil)

–: 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina con, al menos, un 99 % de exceso enantiomérico.

[0033] En algunas realizaciones, el proceso para convertir el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina comprende poner en contacto el sustrato cetoamida a unos 50 g / L con unos 5 g / L de una transaminasa descrita en la presente en condiciones de reacción de pH 8,5 y 45 ºC en presencia de isopropilamina 1 M, en la que, al menos, el 90 % del sustrato de cetoamida se convierte en el producto en 24 horas. En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa capaz de llevar a cabo la reacción precedente comprende una secuencia aminoácida correspondiente a la SEC ID Nº 80, 86, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0034] La presente divulgación se refiere a biocatalizadores altamente esteroselectivos y eficientes capaces de mediar transformaciones que conllevan la transaminación de ciertos aceptores de grupos amino, por ejemplo, la síntesis de Sitagliptina. Los biocatalizadores son polipéptidos de transaminasa modificada que pueden convertir el sustrato de fórmula (2a) 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona (el “sustrato de cetoamida”) en el producto de fórmula (1a) (2R) –4– oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina (el “producto”) en presencia de un dador del grupo amino con la siguiente fórmula (3):

[0035] En algunas realizaciones, las transaminasas modificadas derivan de la transaminasa natural de Arthrobacter sp KNK168, que es una enzima dependiente selectiva del R – 5' – fosfato de piridoxal que puede catalizar la transferencia reversible de un grupo amino entre un dador del grupo amino y un aceptor del grupo amino, normalmente una cetona proquiral (véanse, por ejemplo, Iwasaki et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 69 : 499 –

505; y la patente US 7.169.592). La actividad de transaminación estereoselectiva de R – de la transaminasa natural de Arthrobacter sp KNK168 se ha demostrado en 3, 4 – dimetoxifenilacetona, pero la enzima natural y la transaminasa de la SEC ID Nº 2 no muestran actividad notable para el sustrato de cetoamida (2a) 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 –

5 ona. La transaminasa de la SEC ID Nº 2 difiere de la enzima natural de Arthrobacter sp KNK168 en que tiene una sustitución de isoleuquina (I) en la posición residual X306 con valina (V). Para superar estos defectos, la transaminasa de la SEC ID Nº 2 se ha modificado para mediar la conversión eficiente del sustrato de cetoamida de fórmula (2a) en el producto de fórmula (1a) en presencia de un dador del grupo amino, como la isopropilamina. La conversión puede llevarse a cabo en condiciones bajas con un porcentaje alto de conversión y estereoselectivdad, haciendo el proceso aplicable a la producción en gran volumen de Sitagliptina.

6.1 Abreviaturas y definiciones

[0036] Para los objetivos de las siguientes descripciones, las abreviaturas empleadas para los aminoácidos 15 genéticamente codificados son los convencionales y son los siguientes:

Aminoácido: Abreviatura de tres letras Abreviatura de una letra

Alanina: Ala A

Arginina: Arg R

Asparagina: Asn N

Aspartato: Asp D

Cisteína: Cys C

Glutamato: Glu E

Glatumina: Gln Q

Glicina: Gly G

Histidina: His H

Isoleuquina: Ile I

Leuquina: Leu L

Lisina: Lys K

Metionina: Met M

Fenilalanina: Phe F

Prolina: Pro P

Serina: Ser S

Treonina: Thr T

Triptófano: Trp W

Tirosina: Tyr Y

Valina: Val V

[0037] Cuando se utilizan las abreviaturas de tres letras, salvo cuando está específicamente precedida de una “L” 65 o una “D” o el contexto en el que se utiliza es claro, el aminoácido puede estar en configuración – L o – D en el α – carbono (Cα). Por ejemplo, cuando “Ala” designa alanina sin especificar la configuración en el α – carbono, “D – Ala”

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y “L – Ala” designan D – alanina y L – alanina, respectivamente. Cuando se utilizan las abreviaturas de una letra, las letras mayúsculas designan aminoácidos en configuración – L en el α – carbono y las letras minúsculas designan aminoácidos en configuración – D en el α – carbono. Por ejemplo, “A” designa L – alanina y “a” designa D – alanina. Cuando las secuencias peptídicas se presentan como una sucesión de abreviaturas de una o tres letras (o una combinación de ambas), las secuencias se presentan en dirección N → C según la convención.

[0038] Los términos técnicos y científicos utilizados en las presentes descripciones significarán lo que los expertos en la materia normalmente entienden, salvo que se defina específicamente de otro modo. En consecuencia, los siguientes términos pretenden tener los siguientes significados.

[0039] “Aminotransferasa” y “transaminasa” se utilizan en la presente de manera intercambiable para referirse a polipéptidos que tienen una capacidad enzimática de transferir un grupo aminoácido (NH2) y un átomo de hidrógeno de una amina primaria (3) a un compuesto aceptor de carbonilo (2), convirtiendo la amina dadora en su

[0040] En las presentes realizaciones, los polipéptidos de transaminasa son capaces de convertir enantioselectivamente el compuesto de fórmula (2a) en el compuesto de fórmula (1a) en presencia de un dador del grupo amino de fórmula (3).

[0041] “Proteína”, “polipéptido” y “péptido” se utilizan en la presente de manera intercambiable para denotar un polímero de, al menos, dos aminoácidos convalentemente unidos por un enlace amida, con independencia de la longitud o la modificación post–translacional (por ejemplo, glucosilación, fosforilación, lipidación, miristilación, ubiquitinación, etc.). Se incluyen en esta definición los aminoácidos D – y L – y combinaciones de los mismos.

[0042] “Sustrato” se utiliza en la presente para referirse a un aceptor del grupo amino, como una cetona, que acepta al grupo amino de un dador del grupo amino en una reacción mediada por una transaminasa. En el contexto de la presente divulgación, el sustrato para la transaminasa incluye, entre otros, el compuesto de fórmula (II), el compuesto de fórmula (2) y el compuesto de fórmula (2a), como se describe a continuación. Un “sustrato de cetoamida” se refiere específicamente al compuesto de fórmula (2a), 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona.

[0043] “dador del grupo amino” se refiere a un compuesto amino capaz de dar un grupo amino a un compuesto carbonilo aceptor (es decir, un aceptor del grupo amino), convirtiéndose así en un subproducto carbonilo. Los dadores de grupos amino son moléculas de fórmula general (3),

en el que R1 y R2, cuando se toman independientemente, son un un alquilo, un grupo alquilarilo o un grupo arilo que se sustituye, o no, por uno o más grupos enzimáticamente no inhibidores. R1 puede ser igual o diferente a R2 en estructura o quiralidad. Los grupos R1 y R2, cuando se toman juntos, pueden formar un anillo que es sustituido, o no,

o fusionado a otros anillos. Los dadores de grupos amino típicos que pueden utilizarse en la invención incluyen aminoácidos quirales y aquirales, y aminas quirales y aquirales.

[0044] “Amina quiral” se refiere a aminas de fórmula general R1 – CH (NH2) – R2 en la que R1 y R2 son diferentes y se emplea en la presente en su sentido más amplio, incluyendo una extensa variedad de compuestos alifáticos y alicíclicos de diferentes, y combinados, tipos funcionales, caracterizados por la presencia de un primer grupo amino unido a un segundo átomo de carbono que, además de un átomo de hidrógeno, lleva (i) un grupo divalente que forma una estructura cíclica quiral o (ii) dos sustituyentes (diferentes del hidrógeno) diferentes entre sí en estructura y quiralidad. Los grupos divalentes que forman estructuras cíclicas quirales incluyen, por ejemplo, 2 – metilbutano – 1, 4 – diil, pentano – 1, 4 – diil, hexano – 1, 4 – diil, hexano – 1, 5 – diil, 2 – metilpentano – 1, 5 – diil. Los dos sustituyentes diferentes en el segundo átomo de carbono (los anteriores R1 y R2) también pueden variar enormemente e incluir alquilo, aralquilo, arilo, halo, hidroxi, alquilo bajo, alcoxi bajo, alquiltio bajo, cicloalquilo, carboxi, carboalcoxi, carbamoil, mono y di (bajo alquilo) carbamoil sustituido, trifluorometilo, fenilo, nitro, amino, mono y di (bajo alquilo) amino sustituido, alquilsulfonil, arilsulfonil, alquilcarboxamido, arilcarboxamido, etc., así como alquilo, aralquilo o arilo sustituidos por los precedentes.

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[0045] “Subproducto carbonilo” se refiere al compuesto carbonilo formado por el dador del grupo amino cuando el grupo amino del dador del grupo amino se transfiere al aceptor del grupo amino en una reacción de transaminación. El subproducto carbonilo tiene la siguiente estructura general de fórmula (4):

en la que R1 y R2 se definen anteriormente por el dador del grupo amino.

[0046] “Fosfato de piridoxal”, “PLP”, “5' – fosfato de piridoxal”, “PYP” y “P5P” se utilizan en la presente de manera intercambiable para referirse al compuesto que actúa como coenzima en reacciones de transaminasa. En algunas realizaciones, el piridoxal fosfato se define por la estructura ácido 1 – (4' – formil – 3' – hidroxi – 2' – metil – 5' – piridil) metoxifosfónico, número CAS [54 – 47 – 7]. El 5' – fosfato de piridoxal se produce in vivo por fosforilación y oxidación de piridoxol (también conocido como piridoxina o Vitamina B6). En reacciones de transaminación en las que se emplean enzimas transaminasa, el grupo amino del dador del grupo amino se transfiere a la coenzima para producir un subproducto ceto, mientras el 5' – fosfato de piridoxal se convierte en fosfato de piridoxamina. El 5' – fosfato de piridoxal se regenera por la reacción con un compuesto ceto diferente (el aceptor del grupo amino). La transferencia del grupo amino del fosfato de piridoxamina al amino aceptor produce una amina quiral y regenera la coenzima. El 5' – fosfato de piridoxal de la actual invención puede reemplazarse por otro miembro de la familia de la vitamina B6, incluyendo, entre otros, piridoxal (PL), piridoxamina (PM) y sus equivalentes fosforilados: fosfato de piridoxina (PNP) y fosfato de piridoxamina (PMP).

[0047] “Secuencia codificadora” se refiere a la parte de un ácido nucleico (por ejemplo, un gen) que codifica una secuencia aminoácida de una proteína.

[0048] “Natural” o “de tipo salvaje” se refiere a la forma encontrada en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o una secuencia polinucleótida natural o de tipo salvaje o una es una secuencia presente en un organismo que puede aislarse de una fuente natural y que no ha sido modificada de manera intencionada por manipulación humana.

[0049] “Recombinante”, cuando se emplea en referencia a, por ejemplo, una célula, un ácido nucleico o un polipéptido, se refiere a un material, o a un material que corresponde a la forma natural o nativa del material, que ha sido modificado de manera que no existiría en la naturaleza, o es idéntica a esta pero es producida o derivada a partir de materiales sintéticos y / o por manipulación utilizando técnicas recombinantes. Algunos ejemplos incluyen, entre otros, células recombinantes que expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que se expresan de otra manera en un nivel diferente.

[0050] “Porcentaje de identidad de secuencia”, “porcentaje de identidad” y “porcentaje idéntico” se utilizan en la presente para referirse a comparaciones entre secuencias polinucleótidas o secuencias polpeptídicas, y se determinan comparando dos secuencias alineadas correctamente en una ventana de comparación, en la que la parte de la secuencia polinucleótida o polipeptídica de la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) si se compara con la secuencia de referencia para el alineamiento correcto de dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones a las que la base de ácido nucleico o el residuo aminoácido idéntico tiene lugar en ambas secuencias o una base de ácido nucleico o un residuo aminoácido se alinean con un hueco para proporcionar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de secuencia de identidad. La determinación del alineamiento correcto y porcentaje de secuencia de identidad se lleva a cabo utilizando los algoritmos BLAST y BLAST 2.0 (véanse, por ejemplo, Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403 – 410 y Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 3389 – 3402). El software para llevar a cabo análisis con BLAST está disponible públicamente en la página web del National Center for Biotechnology Information.

[0051] En resumen, los análisis con BLAST suponen, primero, la identificación por pares de alta puntuación (HSPs) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia consultada, que coincide o cumple una puntuación umbral T de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en la secuencia de la base de datos. T se refiere a la puntuación umbral de la palabra vecina (Altschul et al., supra). Esta coincidencia inicial de palabras vecinas actúa como una semilla para iniciar las búsquedas para encontrar HSPs más largas que las contengan. Las coincidencias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde la puntuación de alineamiento acumulada pueda incrementarse. Las puntuaciones acumuladas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos que se corresponde; siempre gt;0) y N (puntuación de penalización para residuos que no se corresponden; siempre lt;0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de las coincidencias de palabra en cada dirección se paran cuando la puntuación acumulada de alineamiento disminuye en la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de

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puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un valor de corte de 100, M= 5, N= -4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (B) (véase, Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA; 89: 10915).

[0052] Otros muchos algoritmos se encuentran disponibles y funcionan de manera similar a BLAST, proporcionando el porcentaje de identidad para dos secuencias. El alineamiento correcto de secuencias para su comparación puede ser dirigido, por ejemplo mediante el algoritmo de alineamiento local de secuencias de Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2 : 482, mediante el algoritmo de alineamiento de homólogos de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol 48: 443, mediante el método de búsqueda por similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA del GCG Wisconsin Software Package), o mediante inspección visual (véanse, Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc y John Wiley & Sons, Inc., (suplemento de 1995) (Ausubel)). Además, la determinación del alineamiento de secuencias y el porcentaje de identidad de secuencia pueden utilizar los programas BESTFIT o GAP en el GCG Winsconsin Software Package (Accelrys, Madison WI), utilizando los parámetros establecidos por defecto.

[0053] “Secuencia de referencia” se refiere a una secuencia definida a la que se compara otra (por ejemplo, alterada) secuencia. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por ejemplo, un segmento de un gen completo o una secuencia polipeptídica. Generalmente, una secuencia de referencia es de, al menos, 20 residuos nucleótidos o aminoácidos de longitud, al menos 25 residuos de longitud, al menos 50 residuos de longitud o la longitud completa del ácido nucleico o el polipéptido. Ya que dos polinucleótidos o polipéptidos pueden (1) comprender una secuencia (es decir, una parte de la secuencia completa) similar entre las dos secuencias, y (2) comprender una secuencia divergente entre las dos secuencias, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos o polipéptidos se llevan a cabo, normalmente, comparando las secuencias de dos polinucleótidos en una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia.

[0054] El término “secuencia de referencia” no pretende limitarse a las secuencias de tipo salvaje, y puede incluir secuencias modificadas o alteradas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una “secuencia de referencia” puede ser una secuencia aminoácida modificada o alterada previamente. Por ejemplo, una “secuencia de referencia basada en la SEC ID Nº 2 con residuo glicina en la posición X284” se refiere a una secuencia de referencia correspondiente a la SEC ID Nº 2 con un residuo glicina en X284 (la versión no alterada de la SEC ID Nº tiene alanina en X284).

[0055] “Ventada de comparación” se refiere a un segmento conceptual de, al menos, 20 posiciones nucleótidas o residuos aminoácidos contiguos en los que una secuencia puede compararse a la secuencia de referencia de, al menos, 20 nucleótidos o aminoácidos contiguos y en la que la parte de la secuencia en la ventana de comparación puede incluir adiciones o supresiones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos respecto a la secuencia de referencia comparada (que no incluye adiciones o supresiones) para el alineamiento correcto de las dos secuencias. La ventana de comparación puede ser superior a 20 residuos contiguos, e incluye, opcionalmente, ventanas de 30, 40, 50, 100 o más.

[0056] “Identidad sustancial” se refiere a una secuencia polinucleótida o polipeptídica que tiene, al menos, el 80 por ciento de identidad de secuencia, al menos 85 por cierto de identidad de secuencia, al menos 89 por ciento de identidad de secuencia, al menos 95 por ciento de identidad de secuencia e incluso, al menos, 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con la secuencia de referencia en una ventana de comparación de, al menos, 20 posiciones residuales, con frecuencia, en una ventana de, al menos, 30 – 50 residuos, en los que el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia a la secuencia que incluye supresiones o adiciones del 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia en la ventana de comparación. En realizaciones específicas aplicadas a polipéptidos, el término “identidad sustancial” significa que dos secuencias polipeptídicas, cuando está alineadas correctamente, por ejemplo mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando los pesos de huecos por defecto, compartir al menos el 80 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 89 por ciento de identidad de secuencia, al menos 95 por ciento de identidad de secuencia

o más (por ejemplo, 99 por ciento de identidad de secuencia). Preferiblemente, las posiciones residuales que no son idénticas difieren en las sustituciones aminoácidas conservativas.

[0057] “Correspondiente a”, “en referencia a” o “respecto a”, cuando se utilizan en el contexto de la numeración de una secuencia aminoácida o polinucleótida dada, se refieren a la numeración de residuos de una secuencia de referencia especificada cuando la secuencia aminoácida o polinucleótida se compara a la secuencia de referencia. En otras palabras, el número de residuos o la posición de los residuos de un polímero dado se designa respecto a la secuencia de referencia más que por la posición numérica real del residuo en la secuencia aminoácida o polinucleótida dada. Por ejemplo, una secuencia aminoácida dada, como la de la transaminasa modificada, puede alinearse a una secuencia de referencia introduciendo huecos para optimizar el emparejamiento de residuos entre

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las dos secuencias. En estos casos, aunque los huecos están presentes, la numeración del residuo de la secuencia aminoácida o polinucleótida dada se hace respecto a la secuencia de referencia a la que ha sido alineada.

[0058] “Estereoselectivdad” se refiere a la formación preferente en una reacción química o enzimática de un estereoisómero respecto a otro. La estereoselectividad puede ser parcial, cuando la formación de un estereoisómero es preferida respecto al otro, o puede ser completa solo cuando se forma un estereoisómero. Cuando los estereoisómeros son enantiómeros, la estereoselectividad se denomina enantioselectividad, la fracción (normalmente dada como porcentaje) de un enantiómero en la suma de ambos. Es común en la disciplina informar (normalmente como porcentaje) de exceso enantiomérico (e.e.) calculado según la fórmula [enantiómero mayor – enantiómero menor] / [enantiómero mayor – enantiómero menor]. Cuando los estereoisómeros son diastereoisómeros, la estereoselectividad se denomina diastereoselectivdad, las fracción (normalmente dada como porcentaje) de un diastereómero en una mezcla de dos diastereómeros, comúnmente denominado exceso diastereomérico (d.e.). Exceso enantiomérico y exceso diastomérico son tipos de exceso estereomérico.

[0059] “Altamente estereoselectivo” se refiere a la reacción química o enzimática capaz de convertir un sustrato (por ejemplo, de fórmula (2a)) en su producto correspondiente (por ejemplo, de fórmula (1a)) con, al menos, un 85 % de exceso estereoisomérico.

[0060] “Propiedad enzimática mejorada” se refiere a una propiedad enzimática mejor realizada o más deseable para un propósito particular en comparación a la propiedad encontrada en una enzima de referencia. Para los polipéptidos de transaminasa modificada descritos en la presente, la comparación se hace, en general, a la enzima transaminasa de tipo salvaje, aunque, en algunas realizaciones, la transaminasa de referencia puede ser otra tranasaminasa modificada mejorada. Las propiedades enzimáticas para las que pueden hacerse mejoras incluyen, de manera no limitante, la actividad enzimática (que puede expresarse en términos de porcentaje de conversión del sustrato en un período de tiempo), estabilidad térmica, estabilidad del disolvente, perfil de actividad del pH, requisitos de la coenzima, resistencia a inhibidores (por ejemplo, inhibición de producción), estereoespecifidad y estereoselectivdad (incluyendo enantioselectividad).

[0061] “Actividad enzimática aumentada” o “actividad aumentada” se refiere a una propiedad mejorada de una enzima modificada, que puede representarse por un incremento en una actividad específica (por ejemplo, producto producido / tiempo / peso de la proteína) o un incremento en porcentaje de conversión del sustrato al producto (por ejemplo, porcentaje de conversión de cantidad inicial de sustrato a producto en un período de tiempo especificado utilizando una cantidad especificada de transaminasa) en comparación a la enzima de referencia. Algunos métodos de determinar la actividad de la enzima se presentan en los Ejemplos. Cualquier propiedad relativa a la actividad enzimática puede verse afectada, incluyendo las propiedades enzimáticas clásicas de Km, Vmáx o kcat, cambios que pueden permitir el incremento de la actividad enzimática. Las mejoras en la actividad enzimática pueden ser de 1,5 veces la actividad enzimática de la correspondiente enzima modificada o de tipo salvaje a 2, 5, 10, 20, 25, 50, 75, 100 o más veces la actividad enzimática que la que se da de manera natural en una enzima (por ejemplo, una transaminasa) u otra enzima modificada de la que derivan las enzimas que muestran una actividad aumentada. En realizaciones específicas, las enzimas de transaminasa modificadas de la presente divulgación mostraron actividad enzimática en un rango de 1,5 a 500 veces, 1,5 a 100 veces o más que la enzima transaminasa progenitora (es decir, la transaminasa modificada o de tipo salvaje de la que se derivan). Cabe señalar que los expertos comprenderán que la actividad de cualquier enzima es de difusión limitada, al igual que el flujo de volumen catalítico no puede exceder la velocidad de difusión del sustrato, incluyendo cualquier coenzima requerida. El límite de difusión máximo teórico es de 108 a 109 (M–1 s–1). Por consiguiente, cualquier mejora de la actividad enzimática de la transaminasa tendrá un límite máximo relacionado con la velocidad de difusión de los sustratos que actúan en la enzima transaminasa. La actividad de la transaminasa puede medirse mediante cualquiera de los ensayos estándares utilizados para medir transaminasas, como el cambio de concentración del sustrato o el producto o el cambio en la concentración del dador del grupo amino. Las comparaciones entre la actividad de las enzimas se realiza utilizando preparaciones definidas de enzima, un ensayo definido en ciertas condiciones y uno o más sustratos definidos, como se describe a continuación en la presente. Generalmente, cuando se comparan enzimas en lisados celulares, se determinan el número de células y la cantidad de proteína testada, además de los sistemas de expresión idénticos y las células huésped para minimizar las variaciones en la cantidad de enzima producida por las células huésped presentes en los lisados.

[0062] “Conversión” se refiere a la transformación enzimática de un sustrato en el producto correspondiente. “Porcentaje de conversión” se refiere al porcentaje del sustrato que se ha convertido en el producto en un período de tiempo en condiciones específicas. Por tanto, por ejemplo, la “actividad enzimática” o “actividad” de un polipéptido de transaminasa puede expresarse como “porcentaje de conversión” del sustrato al producto.

[0063] “Termoestable” o “estable térmicamente” se utilizan de manera intercambiable para referirse a un polipéptido resistente a la inactivación cuando se expone a unas condiciones de temperatura (por ejemplo, de 40 a 80 ºC) durante un período de tiempo (por ejemplo, de 0,5 a 24 horas) en comparación a la enzima no tratada, conservando por tanto cierto nivel de actividad residual (más del 60 al 80 %, por ejemplo) tras las exposición a temperaturas elevadas.

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[0064] “Estable al disolvente” se refiere a un polipéptido que mantiene una actividad similar (más de, por ejemplo, del 60 % al 80 %) tras la exposición a concentraciones variables (por ejemplo, del 5 % al 99 %) de disolvente (por ejemplo, alcohol isopropil, dimetilsulfóxido, tetrahidrofurano, 2 – metiltetrahidrofurano, acetona, tolueno, butilacetato, metil, tert – butiléter, acetonitril, etc) durante un período de tiempo (por ejemplo, de 0,5 a 24 horas) en comparación a la enzima no tratada.

[0065] “Estable al pH” se refiere a un polipéptido que mantiene una actividad similar (más de, por ejemplo, del 60 % al 80 %) tras la exposición a pH alto o bajo (por ejemplo, del 4,5 al 6 o del 8 al 12) durante un período de tiempo (por ejemplo, de 0,5 a 24 horas) en comparación a la enzima no tratada.

[0066] “Estable a la temperatura y al disolvente” se refiere a un polipéptido que es tanto termoestable como estable al disolvente.

[0067] “Deriva de” utilizado en la presente en el contexto de enzimas modificadas identifica la enzima originaria y /

o el gen que codifica dicha enzima a partir de la cual se basó la modificación. Por ejemplo, la enzima transaminasa modificada de la SEC ID Nº 4 se obtuvo mutando la transaminasa de la SEC ID Nº 2. Por lo tanto, esta enzima transaminasa modificada de la SEC ID Nº 4 “deriva del” polipéptido de la SEC ID Nº 2.

[0068] “Aminoácido” o “residuo” utilizados en el contexto de los polipéptidos descritos en la presente, se refieren al monómero específico en una posición de la secuencia (por ejemplo, P8 indica que el “aminoácido” o “residuo” en la posición 8 de la SEC ID Nº 2 es una prolina).

[0069] “Aminoácido o residuo hidrofílico” se refiere a un aminoácido o residuo que tiene una cadena lateral que muestra una hidrofobicidad inferior a cero según la escala de hidrofobicidad estándar de Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179: 125 – 142. Los aminoácidos hidrofílicos genéticamente codificados incluyen L – Thr (T), L – Ser (S), L

– His (H), L –Glu (E), L–Asn (N), L – Gln (Q), L –Asp (D), L – Lys (K) y L – Arg (R).

[0070] “Aminoácido o residuo ácido” se refiere a un aminoácido o residuo hidrofílico que tiene una cadena lateral que muestra un valor pK menor de 6 cuando el aminoácido se incluye en un péptido o polipéptido. Los aminoácidos ácidos tienen, normalmente, cadenas laterales cargadas negativamente a pH fisiológico debido a la pérdida de un ión hidrógeno. Los aminoácidos ácidos genéticamente codificados incluyen L – Glu (E) y L – Asp (D).

[0071] “Aminoácido o residuo básico” se refiere a un aminoácido o residuo hidrofílico que tiene una cadena lateral que muestra un valor pK mayor de 6 cuando el aminoácido se incluye en un péptido o polipéptido. Los aminoácidos básicos tienen, normalmente, cadenas laterales cargadas positivamente a pH fisiológico debido a la asociación con un ión hidronio. Los aminoácidos básicos genéticamente codificados incluyen L – Arg (R) y L – Lys (K).

[0072] “Aminoácido o residuo polar” se refiere a un aminoácido o residuo hidrofílico que tiene una cadena lateral sin carga a pH fisiológico, pero que tiene, al menos, un enlace en el que el par de electrones compartidos en común por dos átomos está sujeto más próximo por uno de los átomos. Los aminoácidos polares genéticamente codificados incluyen L – Asn (N), L –Gln (Q), L –Ser (S) y L –Thr (T).

[0073] “Aminoácido o residuo hidrofóbico” se refiere a un aminoácido o residuo que tiene una cadena lateral que muestra una hidrofobicidad superior a cero según la escala de hidrofobicidad estándar de Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179: 125 – 142. Los aminoácidos hidrofóbicos genéticamente codificados incluyen L – Pro (P), L – Ile (I), L

– Phe (F), L – Val (V), L – Leu (L), L – Trp(W), L –Met (M), L – Ala (A) y L – Tyr (Y).

[0074] “Aminoácido o residuo aromático” se refiere a un aminoácido o residuo hidrofílico o hidrofóbico que tiene una cadena lateral que incluye, al menos, un anillo aromático o heteroaromático. Las aminoácidos aromáticos genéticamente modificados incluyen L – Phe (F), L – Tyr (Y) y L – Trp (W). Aunque al tener el pKa de su átomo de nitrógeno heteroaromático L – His (H) se clasifica, a veces, como residuo básico, o como un residuo aromático que en su cadena lateral incluye un anillo heteroaromático, la presente histidina se clasifica como un residuo hidrofílico o como un “residuo forzado” (véase a continuación).

[0075] “Aminoácido o residuo forzado” se refiere a un aminoácido o residuo que tiene geometría forzada. En la presente, los residuos forzados incluyen L – Pro (P) y L – His (H). La histidina tiene geometría forzada porque tiene un anillo de imidazol relativamente pequeño. La prolina tiene geometría forzada porque tiene un anillo de cinco miembros.

[0076] “Aminoácido o residuo no polar” se refiere a un aminoácido o residuo hidrofóbico que tiene una cadena lateral sin carga a pH fisiológico y que tiene enlaces en los que la pareja de electrones compartidos en común por dos átomos está sujeta de manera equitativa por ambos átomos (es decir, la cadena lateral no es polar). Los aminoácidos no polares genéticamente codificados incluyen L – Gly (G), L – Leu (L), L – Val (V), L – Ile (I), L – Met

(M) y L –Ala (A).

[0077] “Aminoácido o residuo alifático” se refiere a un aminoácido o residuo hidrofóbico que tiene una cadena

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lateral de hidrocarbono alifático. Los aminoácidos alifáticos genéticamente codificados incluyen L – Ala (A), L – Val (V), L –Leu (L) y L –Ile (I).

[0078] “Cisteína” o L – Cys (C) es inusual ya que puede formar puentes disulfuro con otros aminoácidos L – Cys

(C): u otros aminoácidos con sulfanilo o sulfhidrilo. Los “residuos de tipo cisteína” incluyen cisteína y otros aminoácidos que contienen partes sulfhidrilo disponibles para la formación de puentes disulfuro. La habilidad de L – Cys (C) (y otros aminoácidos con – SH que contienen cadenas laterales) para existir en un péptido en la forma reducida sin – SH o en forma oxidada con puente disulfuro afecta si L – Cys (C) aporta carácter hidrofóbico o hidrofílico neto a un péptido. Mientras L – Cys (C) muestra una hidrofobicidad de 0,29 según la escala estándar de Eisenberg (Eisenberg et al., 1984, supra), cabe destacar que para los objetivos de la presente divulgación, L – Cys

(C): está categorizada en un grupo único propio.

[0079] “Aminoácido o residuo pequeño” se refiere a un aminoácido o residuo que tiene una cadena lateral compuesta total de tres carbonos y / o heteroátomos o menos (excluyendo el α – carbono y los hidrógenos). Los aminoácidos o residuos pequeños pueden categorizarse como alifáticos, no polares, polares o ácidos, según las definiciones anteriormente descritas. Los aminoácidos pequeños genéticamente codificados incluyen L – Ala (A), L – Val (V), L –Cys (C), L –Asn (N), L – Ser (S), L – Thr (T) y L – Asp (D).

[0080] “Aminoácido o residuo con hidroxil” se refiere a un aminoácido que contiene un resto de hidroxil (-OH). Los aminoácidos que contienen hidroxil genéticamente codificados incluyen L – Ser (S) L – Thr (T) y L – Tyr (Y).

[0081] “Diferencia aminoácida” o “diferencia residual” se refiere a un cambio en el residuo en una posición específica de una secuencia polipeptídica cuando se compara a la secuencia de referencia. Por ejemplo, una diferencia residual en la posición X8, en la que la secuencia de referencia tiene una serina, se refiere a un cambio del residuo en posición X8 a cualquier residuo diferente a la serina. Como se describe en la presente, una enzima puede incluir una o más diferencias residuales respecto a una secuencia de referencia, en la que se indican las múltiples diferencias residuales mediante una lista con las posiciones específicas en las que han tenido lugar los cambios respecto a la secuencia de referencia (por ejemplo, “una o más diferencias residuales en comparación a la SEC ID Nº 2 en las siguientes posiciones residuales: X4; X8; X26; X48; X60; X61; X62; X65; X81; X94; X96; X102; X124; X136; X137; X150; X152; X160; X163; X169; X174; X178; X195; X199; X208; X209; X211; X215; X217; X225; X230; X252; X269; X273; X282; X292; X297; X306; X321; y X329quot;).

[0082] Sustituciones o mutaciones aminoácidas “conservativas” se refiere a la intercambiabilidad de residuos que tiene cadenas laterales similares y, por lo tanto, que supone la sustitución del aminoácido en el polipéptido con aminoácidos de la misma clase definida de aminoácidos, o similar. Sin embargo, como se utiliza en la presente, en alguna realizaciones, las mutaciones conservativas no incluyen sustituciones de un residuo hidrofílico a hidrofílico, hidrofóbico a hidrofóbico, con hidroxil a con hidroxil, o pequeño a pequeño, si la mutación conservativa puede ser una sustitución de un alifático a un alifático, de no polar a no polar, de polar a polar, de ácido a ácido, de básico a báscio, de aromático a aromático o de restringido a restringido. Además, como se utiliza en la presente, A, V, L o I pueden mutarse conservativamente a otro residuo alifático o a otro residuo no polar. La siguiente tabla muestra ejemplos de sustituciones conservativas.

[0083]

Tabla 1

Residuo: Posibles mutaciones conservativas

A, L, V, I: Otro alifático (A, L, V, I) Otro no polar (A, L, V, I, G, M)

G, M: Otro no polar (A, L, V, I, G, M)

D, E: Otro ácido (D, E)

K, R: Otro básico (K, R)

P, H: Otro restringido (P, H)

N, Q, S, T: Otro polar

Y, W, F: Otro aromático (Y, W, F)

C: Ninguno

[0084] “Sustitución no conservativa” se refiere a la sustitución o mutación de un aminoácido en el polipéptido con un aminoácido cuya cadena lateral tiene propiedades significativamente diferentes. Las sustituciones no conservativas pueden utilizar aminoácidos entre, más que dentro de, los grupos definidos en la lista anterior. En una realización, una mutación no conservativa afecta (a) a la estructura del segmento principal del péptido en el área de la sustitución (por ejemplo, prolina por glicina) (b) a la carga o hidrofobicidad, o (c) a la mayoría de la cadena lateral.

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[0085] “Supresión” se refiere a la modificación del polipéptido mediante la eliminación de uno o más aminoácidos del polipéptido de referencia. Las supresiones pueden comprender la eliminación de 1 o más aminoácidos, 2 o más aminoácidos, 5 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos, 15 o más aminoácidos o 20 o más aminoácidos, hasta el 10 % del número total de aminoácidos, hasta el 20 % del número total de aminoácidos o hasta el 30 % del número total de aminoácidos que forman el polipéptido mientras conserve la actividad enzimática y / o las propiedades mejoradas de una enzima transaminasa modificada. En diversas realizaciones, la supresión puede comprender un segmento continuo o discontinuo.

[0086] “Inserción” se refiere a la modificación del polipéptido mediante la adición de uno o más aminoácidos al polipéptido de referencia. En algunas realizaciones, las enzimas transaminasa mejorada modificada comprenden inserciones de uno o más aminoácidos en el polipéptido de transaminasa natural, así como inserciones de uno o más aminoácidos a otros polipéptidos de transaminasa mejorada. Las inserciones pueden realizarse en partes internas del polipéptido, o en los extremos carboxi o amino. Las inserciones aquí utilizadas incluyen proteínas de fusión ya conocidas en la disciplina. La inserción puede ser un segmento contiguo de aminoácidos o estar separada por uno o más aminoácidos en el polipéptido natural.

[0087] “Fragmento” como se utiliza en la presente se refiere a un polipéptido que tiene una supresión en el extremo amino – terminal y / o carboxi – terminal, pero en el que la secuencia aminoácida restante es idéntica a la posiciones correspondientes en la secuencia. Los fragmentos pueden ser de, al menos, 14 aminoácidos de largo, de, al menos, 20 aminoácidos de largo, de, al menos, 50 aminoácidos de largo o superiores y hasta el 70%, 80%, 90%, 95%, 98% y 99% de la longitud total del polipéptido de transaminasa, por ejemplo el polipéptido de la SEC ID Nº 4.

[0088] “Polipéptido aislado” se refiere a un polipéptido que está sustancialmente separado de otros contaminantes que lo acompañan de manera natural, por ejemplo, proteínas, lípidos y polinucleótidos. El término abarca los polipéptidos que han sido eliminados o purificados de de su medio o sistema de expresión natural (por ejemplo, célula huésped o síntesis in vitro). Las enzimas transaminasa mejoradas pueden estar presentes en una célula, en el medio celular o preparadas de varias maneras, como lisados o preparaciones aisladas. Por tanto, en algunas realizaciones, la enzima transaminasa mejorada puede ser un polipéptido aislado.

[0089] “Polipéptido sustancialmente puro” se refiere a una composición en la que la especie de polipéptido es la especie predominante presente (es decir, en una base molar o de peso es más abundante que cualquier otra especie macromolecular individual en la composición), y es generalmente una composición sustancialmente purificada cuando la especie en cuestión comprende, al menos, un 50 % de la especie macromolecular presente en moles o en % en peso. Generalmente, una composición de transaminasa sustancialmente pura comprende un 60 %

o más, un 70 % o más, un 80 % o más, un 90 % o más, un 95 % o más y un 98 % o más de todas las especies moleculares en moles o en % en peso presente en la composición. En algunas realizaciones, la especie en cuestión se purifica a homogeneidad esencial (es decir, la especie contaminante no puede detectarse en la composición mediante métodos de detección convencionales) en la que la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular. Las especies disolventes, las moléculas pequeñas (lt; 500 Daltons) y las especies elementales de ión no se consideran especies moleculares. En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa mejorada aislada es una composición polipeptídica sustancialmente pura.

[0090] “Hibridación severa” como se utiliza en la presente se refiere a las condiciones bajo las cuales los híbridos de ácido nucleico son estables. Como ya conocen los expertos en la disciplina, la estabilidad de los híbridos se refleja en la temperatura de fusión (Tm) de los híbridos. En general, la estabilidad de un híbrido es una función de la fuerza de ión, la temperatura, el contenido GC y la presencia de agentes caotrópicos. Los valores de Tm para los polinucleótidos puede calcularse utilizando métodos para predecir temperaturas de fusión (véanse, por ejemplo, Baldino et al., Methods Enzymology 168: 761 – 777; Bolton et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 48: 1390; Bresslauer et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8893 – 8897; Freier et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9373 – 9377; Kierzek et al., Biochemistry 25: 7840 – 7846; Rychlik et al., 1990, Nucleic Acids Res 18: 6409 – 6412 (erratum, 1991, Nucleic Acids Res 19: 698); Sambrook et al., supra); Suggs et al., 1981, en Developmental Biology Using Purified Genes (Brown et al., eds.), págs 683 – 693, Academic Press; y Wetmur, 1991, Crit Rev Biochem Mol Biol

26: 227 – 259). En algunas realizaciones, el polinucleótido codifica el polipéptido descrito en la presente y se hibridiza bajo condiciones definidas, como condiciones moderada o altamente severas, para el complemento de una secuencia que codifica una enzima transaminasa modificada de la presente divulgación.

[0091] “Severidad de hibridación” se refiere a las condiciones de hibridación, como las condiciones de lavado, en la hibridación de ácidos nucleicos. Generalmente, las reacciones de hibridación se llevan a cabo en condiciones de baja severidad, seguidas de lavados de severidad variable pero más elevada. El término “hibridación moderadamente severa” se refiere a las condiciones que permiten al ADN diana unirse a un ácido nucleico complementario que tiene un 60 % de identidad, preferiblemente un 75 % de identidad, un 85 % de identidad con el ADN diana; con más del 90 % de identidad con el polinucleótido diana. Las condiciones moderadamente severas ejemplares son condiciones equivalentes a la hibridación en 50 % de formamida, 5 x de solución Denhart, 5 x SSPE, 0,2 SDS a 42 ºC, seguida de un lavado en 0,2 x SSPE, 0,2 SDS a 42 ºC. “Hibridación altamente severa” se refiere,

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en general, a las condiciones que están a 10 ºC o menos de la temperatura de fusión Tm como se determina en condiciones de solución para una secuencia nucleótida definida. En algunas realizaciones, una condición de severidad alta se refiere a condiciones que permiten la hibridación de solo algunas secuencias de ácido nucleico que forman híbridos estable en NaCl 0,018 M a 65 ºC. (es decir, si un híbrido no es estable en NaCl 0,018 M a 65 ºC, no será estable en condiciones de severidad alta, como se contempla en la presente). Las condiciones de severidad alta puede presentarse, por ejemplo, por hibridación en condiciones equivalente a 50 % de formamida, 5 x solución Denhart, 5 x SSPE, 0,2 % SDS a 42 ºC, seguida de lavado en 0,1 X SSPE y 0,1 % SDS a 65 ºC. Otras condiciones de severidad alta son la hibridación en condiciones equivalentes a hibridación en 5 x SSC con 0,1 % (p:v) SDS a 65 ºC y lavado con 0,1 % SDS a 65 ºC. Otras condiciones de severidad de hibridación, así como condiciones moderadamente severas, se describen las referencias citadas anteriormente.

[0092] Polinucleótido “heterólogo” se refiere a cualquier polinucleótido que se introduce en una célula huésped mediante técnicas de laboratorio, e incluye polinucleótidos que se eliminan de una célula huésped, se someten a manipulación en laboratorio y se introducen en una célula huésped.

[0093] “Codón optimizado” se refiere a los cambios en los codones del polinucleótido que codifica una proteína por aquellos preferentemente empleados en un organismo particular de manera que la proteína codificada se expresa eficientemente en el organismo de interés. Aunque el código genético está degenerado en el sentido de que la mayoría de aminoácidos están representados por varios codones, llamados codones “equivalentes” o “sinónimos”, es de destacar que el uso de codones por organismos particulares no es aleatorio y tiene preferencia hacia tripletes de codones particulares. Esta preferencia de utilización de codón puede ser superior en referencia a un gen dado, genes de función común u origen ancestral, proteínas altamente expresadas contra proteínas de bajo número de copias y regiones que codifican proteínas agregadas del genoma de un organismo. En algunas realizaciones, los polinucleótidos que codifican las enzimas transaminasas pueden estar optimizadas por un codón para la correcta producción a partir de organismo huésped seleccionado para la expresión.

[0094] “Preferencia de utilización de codones altos, preferidos y apropiados” se refiere de manera intercambiable a codones que se utilizan a frecuencia más alta en las regiones que codifican proteínas que otros codones que codifican el mismo aminoácido. Los codones preferidos pueden determinarse en relación al uso de codones en un único gen, un conjunto de genes de función u origen común, genes altamente expresados, la frecuencia del codón en las regiones que codifican la proteína agregada del organismo completo, la frecuencia de codón en las regiones que codifican la proteína agregada de organismos relacionados o combinaciones de los mismos. Los codones cuya frecuencia incrementa con el nivel de expresión génica son, normalmente, codones apropiados para la expresión. Se conocen numerosos métodos para determinar la frecuencia de codón (por ejemplo, uso del codón, el uso de codones) y preferencia de codón en organismos específicos, incluyendo análisis multivariado, por ejemplo, utilizando análisis de conglomerados o análisis de correspondencia, y el número efectivo de codones utilizados en un gen (véanse GCG CodonPreference, Genetics Computer Group Wisconsin Package; CodonW, John Peden, Universidad de Nottingham; McInerney, J. O, 1998, Bioinformatics 14: 372 – 73; Stenico et al., 1994, Nucleic Acids Res. 222437

– 46; Wright, F., 1990, Gene 87: 23 – 29). Las tablas de uso de codones están disponibles para numerosos organismos (véanse, por ejemplo, Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20: 2111 – 2118; Nakamura et al., 2000, Nucl. Acids Res. 28: 292; Duret, et al., supra; Henaut and Danchin, quot;Escherichia coli and Salmonella,quot; 1996, Neidhardt, et al. Eds., ASM Press, Washington D.C., págs 2047 – 2066. La fuente de los datos para obtener el uso de codones puede depender de la secuencia nucleótida disponible capaz de codificar una proteína. Este conjunto de datos incluye secuencias de ácido nucleico ya conocidas para codificar proteínas expresadas (por ejemplo, secuencias codificadoras de proteínas completas – CDS), marcadores de secuencia expresada (EST) o regiones codificadoras predichas de secuencia genómicas (véanse, por ejemplo, Mount, D., Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Capítulo 8, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; Uberbacher, E. C., 1996, Methods Enzymol. 266: 259 – 281; Tiwari et al., 1997, Comput. Appl. Biosci. 13: 263 – 270).

[0095] “Secuencia de control” se define en la presente para incluir todos los componentes necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido y / o polipéptido de la presente divulgación. Cada secuencia de control puede ser nativa o foránea al polinucleótido de interés. Dichas secuencias de control incluyen, de manera no limitante, un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia propeptídica, un activador, una secuencia de señal peptídica y un terminador de transcripción.

[0096] “Unido operablemente” se define en la presente como una configuración en la que una secuencia de control se encuentra situada apropiadamente (es decir, en una relación funcional) en una posición cercana a un polinucleótido de interés de manera que la secuencia de control dirige o regula la expresión del polinucleótido y / o polipéptido de interés.

[0097] “Secuencia activadora” es una secuencia de ácido nucleico que se reconoce por una célula huésped para la expresión de un polinucleótido de interés, como una secuencia codificadora. La secuencia de control puede comprender una secuencia activadora apropiada. La secuencia activadora contiene secuencias de control transcripcionales, que median la expresión de un polinucleótido de interés. El activador puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestra actividad transcripcional en la célula huésped elegida, incluyendo mutados, truncados y activadores híbridos, y puede obtenerse de los genes que codifican polipéptidos extracelulares

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o intracelulares, ya sean homólogos o heterólogos a la célula huésped.

6.2 Descripción detallada de las realizaciones

[0098] En las presentes realizaciones, las transaminasas modificadas se mejoran en su capacidad de convertir estereoselectivamente el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina en comparación con la transaminasa de la SEC ID Nº 2. Las transaminasas, incluyendo las descritas anteriormente, contienen normalmente una coenzima, fosfato de piridoxal (PLP), que participa en la reacción de transaminación. El PLP puede obtenerse de la célula huésped en la que el polipéptido se ha sintetizado, o añadiendo PLP a una solución del polipéptido. Puesto que la transaminasa se describe respecto a la secuencia aminoácida, los expertos en la disciplina comprenderán que el polipéptido activo contiene PLP o un análogo apropiado como coenzima.

[0099] En algunas realizaciones, la mejora de la actividad enzimática es respecto a otra transaminasa modificada, como el polipéptido de la SEC ID Nº 4. La actividad mejorada del sustrato de cetoamida puede manifestarse por un incremento en la cantidad del sustrato convertido en el producto (por ejemplo, porcentaje de conversión) por la enzima modificada respecto a la enzima de referencia (por ejemplo, la de tipo salvaje) en condiciones definidas. La actividad mejorada puede incluir una velocidad superior de formación del producto resultante en un incremento en la conversión del sustrato de cetoamida en el producto en un período de tiempo definido en una condiciones definidas. El incremento en la actividad (por ejemplo, porcentaje de conversión incrementado y / o velocidad de conversión) también puede estar caracterizado por la conversión del sustrato en la misma cantidad de producto con una cantidad menor de enzima. La cantidad de producto puede ser calculada mediante diversas técnicas, por ejemplo, separación de la mezcla de reacción (por ejemplo, mediante cromatografía) y detección del producto separado por absorción UV

o espectrometría de masas en tándem (MS / MS) (véase, por ejemplo, el Ejemplo 4). Un método ejemplar de detección de producto por UV utiliza una longitud de onda incidente de 210 nm y una longitud de trayectoria de 1,0 cm, que tiene un límite de detección de Sitagliptina de 5 μg / ml. La detección de producto por UV, normalmente, sigue a la separación de la mezcla por cromatografía, particularmente HPLC en un medio de cromatografía de fase inversa, por ejemplo una columna Agilent Eclipse XDB – C8 (4,6 x 150 mm, 5 μm), utilizando un eluyente de 45: 55 10 mM NH4Ac / MeCN a una velocidad de flujo de 1,5 ml / mon y una temperatura de columna de 40 ºC. En algunas realizaciones, la detección por UV utiliza una longitud de onda incidente de 268 nm, que tiene un límite de detección similar al límite de detección a 210 nm.

[0100] En algunas realizaciones, la mejora en la actividad de la enzima es superior o igual a la actividad del polipéptido de la SEC ID Nº 4 en condiciones de reacción definidas, como se presentan en los Ejemplos 6 o 7. Una condición de reacción definida ejemplar para comparar la actividad de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4 es 2 g / l de sustrato de cetoamida, isopropilamina 0,5 M, 22 ºC, pH de 7,5, 5 % DMSO, 100 μM PLP y 20 mg / ml de polipéptido de transaminasa, como se da posteriormente en la descripción de las condiciones de reacción para las transaminsas enumeradas en la Tabla 2. Las condiciones de reacción definidas para la comparación de ciertas transaminasas modificas también se presentan en la descripción de las transaminasas enumeradas en la Tabla 2, y en las descripciones correspondientes en Ejemplos 7 a 11. En algunas realizaciones, las transaminasas modificadas tienen, al menos, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000 veces o más de 2000 veces la actividad del polipéptido de la SEC ID Nº 4 en las condiciones de reacción definidas. Dado que la enzima transaminasa de la SEC ID Nº 2 no actúa notablemente en el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona, una transaminasa modificada con actividad superior o igual a la SEC ID Nº 4 para cnvertir el sustrato de cetoamida en el producto correspondiente se mejora respecto a la enzima representada por la SEC ID Nº 2.

[0101] En algunas realizaciones, la actividad enzimática mejorada también se asocia a otras mejoras de las propiedades de la enzima. En algunas realizaciones, la mejora en la propiedad de la enzima se da respecto a la estabilidad térmica, como a 45 ºC o más.

[0102] En algunas realizaciones, la actividad enzimática mejorada también se asocia a mejoras en la estabilidad del disolvente, como del 25 al 40 % o del 25 al 50 % de dimetilsulfóxido (DMSO). En algunas realizaciones, la transaminasa mejorada es resistente a la inactivación mediante un componente de la reacción, como el dador del grupo amino. En algunas realizaciones, las transaminasas modificadas son estables a isopropilamina 1 M o hasta 2

M.

[0103] En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa mejorado también es capaz de convertir el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) –il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina con, al menos, el 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % o más de exceso enantiomérico (e.e.).

[0104] En algunas realizaciones, los polipéptidos de transaminasa modificada de la presente divulgación son

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capaces de convertir el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 –[3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina con una actividad superior o igual a la actividad del polipéptido de la SEC ID Nº 4 en presencia de un dador del grupo amino, particularmente isopropilamina, y comprende una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 4.

[0105] En algunas realizaciones, los polipéptidos de transaminasa modificada de la presente divulgación son capaces de convertir el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 –[3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina con una actividad superior o igual a la actividad del polipéptido de la SEC ID Nº 4 en presencia de un dador del grupo amino, particularmente isopropilamina, y comprende una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más a la secuencia de referencia enumerada en la Tabla 2, por ejemplo, la SEC ID Nº: 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100 o 102, como se describe a continuación.

[0106] En algunas realizaciones, los polipéptidos de transaminasa modificada comprende una secuencia aminoácida que tiene una o más diferencias residuales en comparación a la secuencia transaminasa de referencia. Las diferencias residuales pueden ser sustituciones no conservativas, sustituciones conservativas o una combinación de sustituciones conservativas y no conservativas. Respecto a la diferencias residuales y a las descripciones de las posiciones del residuo, las transaminasas reveladas en la presente pueden describirse en referencia a la secuencia aminoácida de la transaminasa natural de Arthrobacter sp KNK168 o la transaminasa de la SEC ID Nº 2, o una transaminasa modificada, como el polipéptido de la SEC ID Nº 4. Para las presentes descripciones, la posición del residuo aminoácido en la secuencia de referencia se determina en la transaminasa comenzando por el residuo inicial de metionina (M) (es decir, M representa un residuo en posición 1), aunque los expertos en la disciplina entenderán que este residuo inicial de metionina puede ser eliminado mediante procesos biológicos, como en una célula huésped o en un sistema de traducción in vitro, para generar una proteína madura que carece del residuo inicial de metionina.

[0107] La posición de la secuencia polipeptídica en la que hay un aminoácido particular o un cambio aminoácido (“diferencia residual”) se describe, a veces, en la presente como “Xn” o “posición n”, donde n se refiere a la posición del residuo respecto a la secuencia de referencia.

[0108] Una mutación de sustitución específica, que es un reemplazamiento del residuo específico en una secuencia de referencia con un residuo diferente específico puede denominarse según la nomenclatura convencional “X (número) Y”, donde X es la única letra para identificar el residuo en la secuencia de referencia, “número” es la posición del residuo en la secuencia de referencia, e Y es la única para identificar la sustitución del residuo en la secuencia modificada.

[0109] En algunas realizaciones, las diferencias residuales pueden tener lugar en una o más de las siguientes posiciones residuales: X4; X5; X8; X18; X25; X26; X27; X28; X30; X41; X42; X48; X49; X50; X54; X55; X60; X61; X62; X65; X69; X81; X94; X96; X102; X117; X120; X122; X124; X126; X136; X137; X138; X146; X148; X150; X152; X155; X156; X160; X163; X164; X169; X174; X178; X195; X199; X204; X208; X209; X211; X215; X217; X223; X225; X230; X252; X269; X273; X282; X284; X292; X297; X302; X306; X321; y X329. En algunas realizaciones, las diferencias residuales o combinaciones de las mismas están asociadas a propiedades mejoradas de la enzima. En algunas realizaciones, los polipéptidos de transaminasa pueden tener, de manera adicional, 1 – 2, 1 – 3, 1 – 4, 1 – 5, 1 – 6, 1 – 7, 1 –8, 1 – 9, 1 –10, 1 – 11, 1 – 12, 1 –14, 1 – 15, 1 – 16, 1 –18, 1 –20, 1 – 22, 1 –24, 1 –26, 1 – 30, 1

– 35, 1 – 40, 1 – 45, 1 – 50, 1 – 55, o 1 – 60 diferencias residuales en otras posiciones residuales aminoácidas. En algunas realizaciones, las diferencias residuales en otras posiciones residuales comprenden sustituciones con residuos aminoácidos conservativos.

[0110] En las presentes realizaciones, las diferencias residuales en comparación a la SEC ID Nº 2 en las posiciones residuales que afectan al sustrato que se une a la transaminasa permiten la colocación del sustrato de cetoamida de fórmula estructural (I), descrita a continuación, en particular el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona. Sin ser limitados por la teoría, al menos dos regiones, una primera región de unión al sustrato y una segunda región de unión al sustrato, interactúan con diferentes elementos estructurales del sustrato de cetoamida. La primera región de unión comprende posiciones residuales X62, X136, X137, X195, X199, X208, X209, X223, X225, y X282, mientras que la segunda región de unión comprende posiciones residuales X69, X122 y X284. En consecuencia, los polipéptidos de transaminasa de la presente tiene una o más diferencias residuales en las posiciones residuales que comprenden X62, X69, X122, X136, X137, X195, X199, X208, X209, X223, X225, X282, y X284. En algunas realizaciones, los polipéptidos de transaminasa de la presente tienen, al menos, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más o seis o más diferencias residuales en las posiciones residuales específicas asociadas al sustrato de unión.

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[0111] En algunas realizaciones, las diferencias residuales en comparación a la SEC ID Nº 2 están en una o más posiciones residuales que forman un primera región de unión al sustrato comprendida en la posiciones residuales X62, X136, X137, X195, X199, X208, X209, X223, X225, y X282. En consecuencia, en algunas realizaciones, la transaminasa modificada comprende una secuencia aminoácida que incluye, al menos, una diferencia residual en comparación a la SEC ID Nº 2 en las posiciones residuales X62, X136, X137, X195, X199, X208, X209, X223, X225, y X282.

[0112] En algunas realizaciones, las diferencias residuales en comparación a la SEC ID Nº 2 están en una o más posiciones residuales que forman una segunda región de unión al sustrato que incluye las posiciones residuales X69, X122 y X284. En consecuencia, en algunas realizaciones, la transaminasa modificada comprende una secuencia aminoácida que incluye, al menos, una diferencia residual en comparación a la SEC ID Nº 2 en las posiciones residuales X69, X122 y X284.

[0113] En algunas realizaciones, la transaminasa modificada comprende una secuencia aminoácida que incluye diferencias residuales en la primera región de unión en combinación con diferencias residuales en la segunda región de unión. En consecuencia, en algunas realizaciones, la transaminasa modificada comprende una secuencia aminoácida en que incluye uno o más diferencias residuales en comparación a la SEC ID Nº 2 en las posiciones residuales X62, X136, X137, X195, X199, X208, X209, X223, X225, y X282 en combinación con una o más diferencias residuales en comparación a la SEC ID Nº 2 en las posiciones residuales X69, X122 y X284.

[0114] En algunas realizaciones de las transaminasas modificadas de la divulgación, los residuos aminoácidos en una posición residual puede definirse en términos de “características” aminoácidas (por ejemplo, tipo o propiedad de aminoácidos) que pueden aparecer en esa posición. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los residuos aminoácidos en las posiciones especificadas anteriormente pueden seleccionarse de las siguientes características: X4 es un residuo aromático; X5 es un residuo básico, X8 es un residuo restringido, X18 es una cisteína (C) o un residuo alifático; X25 es un residuo polar, X26 es un residuo aromático o restringido; X27 es un residuo polar; X28 es un residuo registrado; X30 es un residuo polar o no polar; X41 es un residuo restringido o polar; X42 es un residuo no polar; X48 es un residuo polar, ácido, alifático o no polar; X49 es un residuo polar; X50 es un residuo alifático; X54 es un residuo restringido; X55 es un residuo alifático; X60 es un residuo aromático; X61 es un residuo aromático; X62 es un residuo aromático o polar; X65 es un residuo alifático; X69 es una cisteína (C) o un residuo no polar, polar o alifático; X81 es un residuo no polar; X94 es un residuo alifático; X96 es un residuo alifático; X102 es un residuo alifático o básico; X117 es un residuo no polar, X120 es un residuo aromático, X122 es un residuo restringido, no polar o alifático; X124 es un residuo polar o restringido; X126 es un residuo polar; X136 es un residuo aromático; X137 es un residuo polar o alifático; X138 es un residuo básico o restringido; X146 es un residuo básico; X148 es un residuo alifático o aromático; X150 es un residuo aromático, restringido o polar; X152 es una cisteína (C)

: o un residuo polar, no polar o alifático; X155 es un residuo polar o no polar; X156 es un residuo polar; X160 es un residuo alifático; X163 es un residuo alifático o restringido; X164 es un residuo alifático o restringido; X169 es un residuo alifático; X174 es un residuo alifático, X178 es residuo polar; X195 es un residuo aromático o polar; X199 es un residuo alifático o aromático; X204 es un residuo alifático; X208 es una cisteína (C) o un residuo restringido, polar, no polar, aromático o básico; X209 es un residuo alifático; X211 es un residuo alifático; X215 es una cisteína (C); X217 es un residuo polar; X223 es un residuo restringido; X225 es un residuo aromático; X230 es un residuo alifático; X252 es un residuo aromático o alifático; X269 es un residuo restringido; X273 es un residuo aromático; X282 es un residuo polar; X284 es un residuo no polar; X292 es un residuo polar; X297 es un residuo polar; X302 es un residuo alifático; X306 es un residuo alifático; X321 es un residuo restringido y X329 es un residuo restringido o aromático. En algunas realizaciones, en las que el residuo aminoácido en la correspondiente posición residual de la secuencia de referencia (por ejemplo, la SEC ID Nº 2) están incluidas en la categoría de aminoácidos descrita para la posición especificada, puede utilizarse un aminoácido diferente dentro de esa categoría aminoácida teniendo en cuenta las directrices descritas en la presente.

[0115] En algunas realizaciones, el residuo aminoácido en las posiciones residuales especificadas anteriormente puede seleccionarse de las siguientes características: X4 es Y, F, o W, particularmente Y; X5 es K o R, particularmente K; X8 es H o P, particularmente P; X18 es C, A, V, o I, particularmente C o 1; X25 es N, Q, S, o T, particularmente Q; X26 es F, W, H o P, particularmente H; X27 es N, Q, S, o T, particularmente T; X28 es P o H, particularmente P; X30 es N, Q, S, T, G, M, A, V, L o I, particularmente Q o M; X41 es P, H, N, Q, S, o T, particularmente H o S; X42 es G, M, A, V, L o I, particularmente G; X48 es N, Q, S, T, D, E, G, M, A, V, L, o I, particularmente Q, D, V, G, o A; X49 es N, Q, o T, particularmente T; X50 es A, V, L o I, particularmente L; X54 es P

: o H; X55 es A, V, o L, particularmente V; X60 es F o W, particularmente F; X61 es Y, F, o W, particularmente Y; X62 es S, T, N, Q, Y, F, o W, particularmente T, Y o F; X65 es A, L o I, particularmente A; X69 es C, G, M, A, L I, S, T, N

: o Q, particularmente G, C, T, A, o S; X81 es G, M, A, V, L, I, particularmente G; X94 es A, V, L o I, particularmente I

: o L; X96 es A, V o L, particularmente L; X102 es A, V, L, I, K o R, particularmente L o K; X117 es G, M, A, V, L o I, particularmente G; X120 es Y, W, o F, particularmente Y; X122 es G, M, A, V, I, L, P o H, particularmente M, I, L, V, o H; X124 es T, N, Q, P, o H, particularmente T, H o N; X 126 es N, Q, o T, particularmente T; X136 es Y, F o W, particularmente Y o F; X137 es S, T, N, Q, A, V, L o I, particularmente T o I; X138 es K, P o H, particularmente K o P; X146 es K o R, particularmente R; X148 es A, V, L I, W, o F, particularmente A o F; X150 es F, W, H, P, S, T, N, o Q, particularmente F, H, or S; X152 es C, G, M, A, L, I, S, T, N, o Q, particularmente G, I, L, S o C; X155 es N, S, T, G, M, A, V, L o I, particularmente M, V o T; X156 es N, Q, S, o T, particularmente Q; X160 es A, V, L o I, particularmente

20 5

L; X163 es P, H, A, V, o L, particularmente H o V; X164 es A, V, L, I, P o H, particularmente V o P; X169 es V, L o I, particularmente L; X174 es A, V, L o I, particularmente A; X178 es S, N, o Q, particularmente S; X195 es F, Y, W, S, T, N o Q, particularmente F o Q; X199 es A, L, I, Y, F, W, particularmente W o I; X204 es A, V, L, o I, particularmente A; X208 es H, C, G, K, N, Y, D o S; X209 es V, L o I, particularmente L; X211 es A, V, o I, particularmente I; X215 es C; X217 es S, T, N o Q, particularmente N; X223 es H o P, particularmente P; X225es W o Y, particularmente Y; X230 es A, V, o L, particularmente V; X252 es A, V, I, Y, F, o W, particularmente F; X269 es H o P, particularmente P; X273 es Y, F o W, particularmente Y; X282 es S, N o Q, particularmente S; X284 es G, M, V, L o I, particularmente G; X292 es T, N, o Q, particularmente T; X297 es S, T, N o Q, particularmente S; X302 es A, L, o I, particularmente A; X306 es A, L o I, particularmente L; X321 es H o P, particularmente P; y X329 es H, P, Y, F, o W, particularmente H.

[0116] En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada comprende una secuencia aminoácida que incluye, al menos, las siguientes características: X69 es C, G, M, A, L, I, S, T, N o Q, particularmente G, C, T, A,

o S; X122 es G, M, A, V, L, I, P o H, particularmente M, I, V, L, o H; y X223 es H o P, particularmente P.

[0117] En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada comprende una secuencia aminoácida que incluye, al menos, las siguientes características: X122 es G, M, A, V, L, I, P o H, particularmente M, I, V, L o H; X223 es H o P, particularmente P; y X284 es G, M, V, L o I, particularmente G.

[0118] En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada comprende una secuencia aminoácida que incluye, al menos, las siguientes características: X69 es C, G, M, A, L, I, S, T, N o Q, particularmente G, C, T, A,

o S; X122 es G, M, A, V, L, I, P o H, , particularmente M, I, V, L, o H; X223 es H o P, particularmente P; y X284 es G, M, A, V, L o I, particularmente G.

[0119] En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada comprende una secuencia aminoácida que incluye, al menos, las siguientes características: X69 es C o T; X122 es M o I; X223 es P; y X284 es G.

[0120] En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada con una o más de las características especificadas o combinaciones de características en las posiciones residuales X69, X122, X223, y X284, pueden tener, adicionalmente, una o más diferencias residuales en comparación a la SEC ID Nº 2 en las siguientes posiciones residuales: X4; X5; X8; X18; X25; X26; X27; X28; X30; X41; X42; X48; X49; X50; X54; X55; X60; X61; X62; X65; X81; X94; X96; X102; X117; X120; X124; X126; X136; X137; X138; X146; X148; X150; X152; X155; X156; X160; X163; X164; X169; X174; X178; X195; X199; X204; X208; X209; X211; X215; X217; X225; X230; X252; X269; X273; X282, X292; X297; X302; X306; X321; y X329. Además de las posiciones residuales X69, X122, X223, y X284, estas otras posiciones residuales se asocian con efectos en varias propiedades del polipéptido de transaminasa y, por tanto, puede haber diferencias residuales en comparación a la SEC ID Nº 2 para provocar cambios deseables en las propiedades de la proteína.

[0121] Como se ha visto anteriormente, las posiciones residuales X62, X136, X137, X19S, X199, X208, X209, X225, y X282 a lo largo de las posiciones residuales X69, X122, X223, y X284, están asociadas con la unión del sustrato a la enzima y, por tanto, el polipéptido de transaminasa puede tener diferencias residuales en estas posiciones en comparación a la SEC ID Nº 2 para provocar cambios deseables en las propiedades de la proteína.

[0122] Las posiciones residuales X4, X5, X8, X26, X48, X60, X65, X81, X96, X102, X124, X160, X163, X169, X174, X178, X211, X217, X225, X230, X252, X269, X273, X292, X297, X306, X321, X329 también se asocian a incrementos adicionales de la actividad de la enzima, y, por tanto, el polipéptido de transaminasa puede tener diferencias residuales en estas posiciones en comparación a la SEC ID Nº 2 para provocar cambios deseables en la actividad de la enzima, por ejemplo, un incremento en la eficiencia de conversión en condiciones de carga alta de sustrato.

[0123] Las posiciones residuales X18, X25, X27, X28, X30, X41, X42, X49, X50, X54, X55, X117, X120, X126, X138, X146, X 148, X150, M152, X155, X156, X164, X204, X302 también se asocian a incrementos adicionales en la termoestabilidad y / o la estabilidad de disolvente, como DMSO, y, por tanto, el polipéptido de transaminasa puede tener diferencias residuales en estas posiciones en comparación a la SEC ID Nº 2 para provocar cambios deseables en la termoestabilidad y / o estabilidad de disolvente.

[0124] Las posiciones residuales X61, X94, X215 también se asocian con la habilidad de soportar la reacción a altas concentraciones del dador del amino isopropilamina, y, por tanto, el polipéptido de transaminasa puede tener diferencias residuales en estas posiciones en comparación a la SEC ID Nº 2 para provocar el incremento en la eficiencia de la conversión a alta (por ejemplo, 1 – 2 M) concentraciones de isopropilamina.

[0125] Cabe señalar que las diferencias residuales de la SEC ID Nº 2 en las posiciones residuales asociadas a las diferentes propiedades de las enzimas pueden utilizarse en diversas combinaciones para formar polipéptidos de transaminasa con características enzimáticas deseables, por ejemplo, combinación del incremento de la actividad enzimática, estabilidad de disolvente y temperatura y utilización de un dador amino. Se describen en la presente combinaciones ejemplares.

21 5

[0126] En algunas realizaciones, la transaminasa modificada tiene las características en una o más posiciones residuales X69, X122, X223, y X284 como se ha descrito anteriormente, incluye, al menos, las siguientes características adicionales: X26 es P, H, F, o W, particularmente H, y/o X62 es S, T, N, Q, Y, F, o W, particularmente T o F; X65 es A, L o I, particularmente A; X136 es Y, F o W, particularmente Y o F; X199 es A, L, I, Y, F, o W, particularmente W o I; y X209 es V, L o I, particularmente L.

[0127] En algunas realizaciones, la transaminasa modificada tiene las características en una o más posiciones residuales X69, X122, X223, y X284 como se ha descrito anteriormente, incluye, al menos, las siguientes características adicionales: X61 es Y, F, o W, particularmente Y; X62 es S, T, N, Q, Y, F, o W, particularmente T o F; X65 es A, L o I, particularmente A; X94 es A, V, L o I, particularmente I o L; X136 es Y, F, o W, particularmente Y o F; X199 es A, L, I, Y, F, o W, particularmente W o I; X209 es V, L o I, particularmente L; X215 es C; y X282 es S, N o Q, particularmente S.

[0128] En algunas realizaciones, la transaminasa modificada tiene las características en una o más posiciones residuales X69, X122, X223, y X284 como se ha descrito anteriormente, incluye, al menos, las siguientes características adicionales: X8 es H o P, particularmente P; X61 es Y, F, o W, particularmente Y; X62 es S, T, N Q, Y, F, o W, particularmente T o F; X65 es A, L o I, particularmente A; X81 es G, M, A, V, L o I, particularmente G; X94 es A, V, L o I, particularmente I o L; X136 es Y, F, o W, particularmente Y o F; X199 es A, L, I, Y, F, o W, particularmente W o I; X209 es V, L o I, particularmente L; X215 es C; X217 es S, T, N, o Q, particularmente N; X269 es H o P, particularmente P; X282 es S, N o Q, particularmente S. X297 es S, T, N o Q, particularmente S; y X321 es H o P, particularmente P.

[0129] En algunas realizaciones, la transaminasa modificada tiene las características en una o más posiciones residuales X69, X122, X223, y X284 como se ha descrito anteriormente, incluye, al menos, las siguientes características adicionales: X8 es H o P, particularmente P; X61 es Y, F, o W, particularmente Y; X62 es Y, F, W, S, T, N o Q, particularmente T o F; X65 es A, L o I, particularmente A; X81 es G, M, A, V, L o I, particularmente G; X94 es A, V, L o I, particularmente I o L; X96 es A, V o L, particularmente L; X124 es P, H, T, N, o Q, particularmente T, H

: o N; X136 es Y, F o W, particularmente Y o F; X199 es A, L, I, Y, F o W, particularmente W o I; X209 es V, L o I, particularmente L; X215 es C; X217 es S, T, N o Q, particularmente N; X269 es H o P, particularmente P; X282 es S, N o Q, particularmente S; X297 es S, T, N o Q, particularmente S; y X321 es H o P, particularmente P.

[0130] En algunas realizaciones, la transaminasa modificada tiene las características en una o más posiciones residuales X69, X122, X223, y X284 como se ha descrito anteriormente, incluye, al menos, las siguientes características adicionales: X8 es H o P, particularmente P; X60 es F o W, particularmente F; X61 es Y, F, o W, particularmente Y; X62 es Y, F, W, S, T, N o Q, particularmente T o F; X65 es A, L o I, particularmente A; X81 es G, M, A, V, L o I, particularmente G; X94 es A, V, L o I, particularmente I o L; X96 es A, V o L, particularmente L; X124 es P, H, T, N, o Q, particularmente T, H o N; X126 es N, Q, o T, particularmente T; X136 es Y, F o W, particularmente Y o F; X150 es F, W, H, P, S, T, N, o Q, particularmente F, H, o S; X152 es C, G, M, A, L, I, S, T, N,

: o Q, particularmente G, I, L, S o C; X169 es V, L, o I, particularmente L; X 199 es Y, F, W, A, L o I, particularmente W

: o 1; X209 es V, L o I, particularmente L; X215 es C; X217 es S, T, N o Q, particularmente N; X269 es H o P, particularmente P; X273 es Y, F, o W, particularmente Y; X282 es S, N o Q, particularmente S; X297 es S, T, N o Q, particularmente S; y X321 es H o P, particularmente P.

[0131] En algunas realizaciones, la transaminasa modificada que tiene las características en una o más posiciones residuales: X122 es un residuo restringido, no polar o alifático, particularmente M, I, L, V, o H; X223 es residuo restringido, particularmente P; X284 es residuo no polar, particularmente G. En algunas realizaciones, los polipéptidos de transaminasa puede tener adicionalmente 1 – 2, 1 – 3, 1 – 4, 1 – 5, 1 – 6, 1 – 7, 1 – 8, 1 – 9, 1 – 10, 1 – 11, 1 – 12, 1 – 14, 1 –15, 1 – 16, 1 –18, 1 – 20, 1 – 22, 1 – 24, 1 – 26, 1 – 30, 1 –35, 1 – 40, 1 –45, 1 – 50, 1 – 55, o 1 – 60 diferencias residuales en otras posiciones residuales. En algunas realizaciones, el número de diferencias puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 55, o 60 diferencias residuales en las otras posiciones residuales. En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada puede comprender una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a la secuencia aminoácida de referencia basada en la SEC ID Nº 2 que tiene las características descritas para las posiciones residuales especificadas anteriormente (es decir, X122; X223; y X284) (por ejemplo, la SEC ID Nº 8 o 10), con la condición de que el polipéptido de transaminasa modificada con polipéptidos comprenda una secuencia aminoácida que incluya, al menos, las características descritas para los residuos especificados.

[0132] En algunas realizaciones, la transaminasa modificada que tiene las características en una o más posiciones residuales: X69 es C o un residuo no polar, alifático o polar, particularmente G, C, T, A o S; X122 es un residuo restringido, no polar o alifático, particularmente M, I, L, V, o H; X223 es residuo restringido, particularmente P; X284 es residuo no polar, particularmente G. En algunas realizaciones, los polipéptidos de transaminasa puede tener adicionalmente 1 – 2, 1 – 3, 1 – 4, 1 – 5, 1 – 6, 1 – 7, 1 – 8, 1 – 9, 1 – 10, 1 – 11, 1 – 12, 1 – 14, 1 – 15, 1 – 16, 1 – 18, 1 –20, 1 –22, 1 –24, 1 –26, 1 –30, 1 –35, 1 –40, 1 –45, 1 –50, 1 –55, o 1 –60diferenciasresidualesen otras posiciones residuales. En algunas realizaciones, el número de diferencias puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,

22 5

11, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 55, o 60 diferencias residuales en las otras posiciones residuales. En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada puede comprender una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a la secuencia aminoácida de referencia basada en la SEC ID Nº 2 que tiene las características descritas para las posiciones residuales especificadas anteriormente (es decir, X69; X122; X223; y X284) (por ejemplo, la SEC ID Nº 4), con la condición de que el polipéptido de transaminasa modificada con polipéptidos comprenda una secuencia aminoácida que incluya, al menos, las características descritas para los residuos especificados.

[0133] En algunas realizaciones, la transaminasa modificada que tiene las características en una o más posiciones residuales: X65 es un residuo alifático, particularmente A; X69 es C o un residuo no polar, alifático o polar, particularmente G, C, T, A o S; X122 es un residuo restringido, no polar o alifático, particularmente M, I, L, V, o H; X223 es residuo restringido, particularmente P; X284 es residuo no polar, particularmente G. En algunas realizaciones, los polipéptidos de transaminasa puede tener adicionalmente 1 – 2, 1 – 3, 1 – 4, 1 – 5, 1 – 6, 1 – 7, 1 – 8, 1 – 9, 1 – 10, 1 – 11, 1 –12, 1 – 14, 1 – 15, 1 – 16, 1 – 18, 1 – 20, 1 – 22, 1 – 24, 1 –26, 1 – 30, 1 – 35, 1 – 40, 1

–: 45, 1 – 50, 1 – 55, o 1 – 60 diferencias residuales en otras posiciones residuales. En algunas realizaciones, el número de diferencias puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 55, o 60 diferencias residuales en las otras posiciones residuales. En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada puede comprender una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a la secuencia aminoácida de referencia basada en la SEC ID Nº 2 que tiene las características descritas para las posiciones residuales especificadas anteriormente (es decir, la SEC ID Nº 6), con la condición de que el polipéptido de transaminasa modificada con polipéptidos comprenda una secuencia aminoácida que incluya, al menos, las características descritas para los residuos especificados. En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada puede comprender una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 6.

[0134] En algunas realizaciones, la transaminasa modificada que tiene las características en una o más posiciones residuales: X122 es un residuo restringido, no polar o alifático, particularmente M, I, L, V, o H; X174 es un residuo alifático, particularmente A; X223 es residuo restringido, particularmente P; X284 es residuo no polar, particularmente G. En algunas realizaciones, los polipéptidos de transaminasa puede tener adicionalmente 1 – 2, 1 – 3, 1 – 4, 1 – 5, 1 –6, 1 –7, 1 –8, 1 – 9, 1 – 10, 1 –11, 1 –12, 1 – 14, 1 –15, 1 – 16, 1 – 18, 1 –20, 1 –22, 1 – 24, 1

–: 26, 1 – 30, 1 – 35, 1 – 40, 1 – 45, 1 – 50, 1 – 55, o 1 – 60 diferencias residuales en otras posiciones residuales. En algunas realizaciones, el número de diferencias puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 55, o 60 diferencias residuales en las otras posiciones residuales. En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada puede comprender una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a la secuencia aminoácida de referencia basada en la SEC ID Nº 2 que tiene las características descritas para las posiciones residuales especificadas anteriormente (es decir, la SEC ID Nº 12), con la condición de que el polipéptido de transaminasa modificada con polipéptidos comprenda una secuencia aminoácida que incluya, al menos, las características descritas para los residuos especificados. En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada puede comprender una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº

12.

[0135] La Tabla 2 que se presenta a continuación presenta un ejemplo de polipéptido de transaminasa modificada, con dos números de SEC ID en cada fila, el número impar se refiere a la secuencia nucleótida que codifica la secuencia aminoácida presentada por el número par. Las diferencias residuales están basadas en la comparación a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 2, una transaminasa derivada de Arthrobacter sp KNK168 y difiere de la enzima natural en que tiene una sustitución de isoleucina (I) en la posición residual X306 con valina (V). En la columna Actividad, los niveles de actividad incrementados (es decir, “+”, “++”, “+++”, etc) se definieron de la siguiente manera: “+” indica, al menos, igual pero no superior a 2 veces la actividad de la SEC ID Nº 4 (condiciones del ensayo: 2 g / l de sustrato de cetoamida, isopropilamina 0,5 M, 22 ºC, pH 7,5, 5 % DMSO, 100 μM PLP); “++” indica de 50 a 100 veces superior a la actividad de la SEC ID Nº 4 (condiciones del ensayo: 2 g / l de sustrato de cetoamida, isopropilamina 0,5 M, 22 ºC, pH 7,5, 5 % MeOH, 100 μM PLP); “+++” indica de 1,1 a 5 veces superior a la actividad de la SEC ID Nº 22 (condiciones del ensayo: 5 – 10 g / l de sustrato de cetoamida, isopropilamina 0,5 – 1 M, 22 – 30 ºC, pH 7,5, 5 % MeOH, 100 μM PLP); “++++” indica de 1,1 a 5 veces superior a la actividad de la SEC ID Nº 48 (condiciones del ensayo: 10 – 40 g / l de sustrato de cetoamida, isopropilamina 1 M, 30 – 45 ºC, pH 8,5, 10 % MeOH, 100 μM PLP); “+++++” indica de 1,1 a 5 veces superior a la actividad de la SEC ID Nº 58 (condiciones del ensayo: 40 – 100 g / l de sustrato de cetoamida, isopropilamina 1 M, 45 ºC, pH 8,5, 10 % MeOH – 25 % DMSO, 250 μM PLP); “++++++” indica de 1,1 a 5 veces superior a la actividad de la SEC ID Nº 104 (condiciones del ensayo: 40

– 100 g / l de sustrato de cetoamida, isopropilamina 1 M, 45 ºC, pH 8,5, 50 % DMSO, 1000 μM PLP). Se describen en los Ejemplos 6 a 11 condiciones de ensayo ejemplares para medir la actividad utilizando metanol y DMSO.

[0136]

Tabla 2

SEC ID Nº: Diferencias residuales respecto a la SEC ID Nº 2 Nº diferencias residuales Actividad

1 / 2: – – –

3 / 4: V69G; F122V; S223P; A284G 4 +

5 / 6: V65A; V69G; F122I; S223P 4 +

7 / 8: F122L; S223P; A284G 3 +

9 / 10: F122I; S223P; A284G 3 +

11 / 12: F122L; S174A; S223P; A284G 4 +

13 / 14: Y26H; V65A; V69G; F122I; S223P; A284G 6 +

15 / 16: Y26H; H62T; V65A; V69G; F122I; T178S; V199W; S223P; F225Y; T282S; A284G 11 ++

17 / 18: Y26H; H62F; V65A; V69G; F122V; G136Y; V199I; A209L; S223P; F225Y; T282S; A284G 12 ++

19 / 20: Y26H; H62T; V65A; V69G; F122V; G136Y; E137T; V199I; A209L; S223P; T282S; A284G 12 ++

21 / 22: Y26H; H62T; V65A; V69G; F122I; G136Y; E137I; V199I; A209L; S223P; T282S; A284G 12 ++

23 / 24: Y26H; H62T; V65A; V69G; F122I; G136Y; E137T; V199I; A209L; S223P; F225Y; T282S; A284G 13 ++

25 / 26: Y26H; V65A; V69G; F122V; G136Y; E137I; S174A; V199I; A209L; S223P; I230V; A284G 12 ++

27 / 28: Y26H; H62T; V65A; V69G; F122H; G136Y; E137I; V199I; A209L; S223P; T282S; A284G 12 +++

29 / 30: Y26H; H62T; V65A; V69T; F122I; G136Y; E137I; V199I; A209L; S223P; T282S; A284G 12 +++

31 / 32: Y26H; H62T; V65A; V69C; F122I; G136Y; E137I; V199I; A209L; S223P; T282S; A284G 12 +++

33 / 34: Y26H; H62T; V65A; V69A; F122I; G136Y; E137I; V199I; A209L; S223P; T282S; A284G 12 +++

35 / 36: Y26H; L61Y; H62T; V65A; V69G; F122I; G136Y; E137I; V199I; A209L; S223P; T282S; A284G 13 +++

37 / 38: Y26H; H62Y; V65A; V69G; F122I; G136Y; E137I; V199I; A209L; S223P; T282S; A284G 12 +++

39 / 40: Y26H; H62T; V65A; V69G; F122I; G136F; E137I; V199I; A209L; S223P; T282S; A284G 12 +++

24 15

41 / 42: S4Y; Y26H; H62T; V65A; V69G; M94I; F122I; G136Y; E137T; V199I; A209L; G215C; S223P; T282S; A284G 15 +++

43 / 44: H62T; V65A; V69G; M94I; F122I; G136Y; E137I; V199I; A209L; G215C; S223P; T282S; A284G 13 +++

45 / 46: H62T; V65A; V69G; M94I; F122I; G136Y; E137T; V199I; A209L; G215C; S223P; T282S; A284G 13 +++

47 / 48: H62T; V65A; V69C; M94I; F122I; G136Y; E137T; V199I; A209L; G215C; S223P; T282S; A284G 13 +++

49 / 50: S8P; H62T; V65A; V69C; M94I; F122I; G136Y; E137T; V199I; A209L; G215C; S223P; T282S; A284G 14 ++++

51 / 52: L61Y; H62T; V65A; V69S; M94I; F122I; G136F; E137T; V152I; V199I; A209L; G213C; S223P; T282S; A284G 15 ++++

53 / 54: L61Y; H62T; V65A; V69C; M94I; F122V; G136F; E137T; V199I; A209L; G215C; S223P; T282S; A284G 14 ++++

55 / 56: L61Y; H62T; V65A; V69T; M94I; F122V; G136F; E137T; V199I; A209L; G215C; S223P; T282S; A284G 14 ++++

57 / 58: L61Y; H62T; V65A; V69T; M94I; F122I; G136F; V199I; A209L; G215C; S223P; T282S; A284G 13 ++++

59 / 60: L61Y; H62T; V65A; V69T; M94I; F122H; G136F; V199I; A209L; G215C; S223P; T282S; A284G 13 ++++

61 / 62: L61Y; H62T; V65A; V69C; M94I; F122I; G136Y; E137T; F160L; A169L; V199I; A209L; G215C; S223P; L269P; T282S; A284G 17 ++++

63 / 64: L61Y; H62T; V65A; V69C; M94L; F122I; G136Y; E137T; A169L; V199I; A209L; G215C; S223P; T282S; A284G; V306L 16 ++++

65 / 66: L61Y; H62T; V65A; V69C; M94I; Q102L; F122I; G136F; Y150F; V152I; V199I; A209L; G215C; S223P; T282S; A284G 16 ++++

67 / 68: S8P; P48A; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; Q102K; F122I; G 136F; I163V; V199I; A209L; L211I; G215C; G217N; S223P; L252F; L273Y; T282S; A284G; S321P 24 +++++

69 / 70: S8P; P48A; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; F122I; G136F; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; T282S; A284G; P297S; S321P 21 +++++

71 / 72: S8P; L61Y; H62T; V65A; V69T; M94I; F122I; G136F; V199I; A209L; G215C; S223P; T282S; A284G 14 +++++

25 5

73 / 74: S8P; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94L; I96L; F122I; G136F; T178S; V199I; A209L; G215C; S223P; L269P; T282S; A284G; P297S; S321P 20 +++++

75 / 76: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122I; G136F; V152L; T178S; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L252F; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S;S321P 25 +++++

77 / 78: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94L; I96L; F122I; GI36F; AI69L; T178S; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; T282S; A284G; S292T; P297S; S321P 24 +++++

79 / 80: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122I; G136F; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 23 +++++

80 / 82: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94L; I96L; F122I; G136F; A169L; T178S; V199I; A209L; G215C; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 23 +++++

83 / 84: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122I; S124T; G136F; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 24 +++++

85 / 86: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122I; S124H; G136F; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 24 +++++

87 / 88: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122I; S124N; G136F; A169L; V199I; A209L; G215 C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 24 +++++

89 / 90: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G;M94I; I96L; F122I; G136F; Y150H; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 24 +++++

91 / 92: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124H; G136F; Y150H; V152S; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 26 +++++

26 15

93 / 94: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122I; S124T; G136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S;S321P 26 +++++

95 / 96: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124N; G 136F; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 24 +++++

97 / 98: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122I; S124H; G136F; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 24 +++++

99 / 100: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124N; G136F; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 24 +++++

101 / 102: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124N; G136F; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P; Q329H 25 +++++

103 / 104: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; 196L; F122M; S124T; G136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 +++++

105 / 106: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; S126T; G136F; R138K; Y150S; V152G; Q155M; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 +++++

107 / 108: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G136F; R138P; Q146R; Y150S; V152S; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 +++++

109 / 110: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; S126T; G136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

111 / 112: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G136F; Y150S; V152C; I163H; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

27 15

113 / 114: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G136F; Y148A; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

115 / 116: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G136F; Y150S; V152C; W156Q; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

117 / 118: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G136F; Y150S; V152C; R164V; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

119 / 120: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G136F; Y148F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

121 / 122: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; E120Y; F122M; S124T; G136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

123 / 124: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G136F; Y150S; V152C; Q155V; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

125 / 126: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G136F; Y150S; V152C; R164P; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

127 / 128: S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G136F; Y150S; V152C; Q155T; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

129 / 130: S8P; E50L; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G 136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

131 / 132: S8P; L18I; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G 136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

28 15

133 / 134: S8P; D25Q; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G136F; Y1505; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

135 / 136: S8P; E42G; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

137 / 138: S8P; P48D; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

139 / 140: S8P; P30Q; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N ;S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

141 / 142: S8P; L28P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G 136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

143 / 144: S8P; I41H; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G 136F; Y150S; V152C; A169L; VI 991; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

145 / 146: S8P; P30M; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G 136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

147 / 148: S8P; S54H; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

149 / 150: S8P; L18C; I55V; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G 136F; Y150S; V 152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 28 ++++++

151 / 152: S8P; P48G; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G 136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

55 [0137] Como se ha visto anteriormente, en algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa mejorada incluye una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144,146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168. En algunas realizaciones, los polipéptidos de transaminasa mejorada pueden tener 1 – 2, 1 – 3, 1 – 4, 1 – 5, 1 – 6, 1 – 7, 1 – 8, 1

153 / 154: S8P; P48V; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G 136F; Y150S; V152C; A169L; V 199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

155 / 156: S8P; I41S; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G 136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

157 / 158: S8P; E27T; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G 136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

159 / 160: S8P; S54P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G 136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

161 / 162: S8P; P48Q; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; G136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 27 ++++++

163 / 164: A5K; S8P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; S126T; G136F; Y150S; V152C; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 28 ++++++

165 / 166: S8P; S49T; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; E117G; F122M; S124T; S126T G136F; Y150S; V152S; A169L; V199I; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; V302A; S321P 30 ++++++

167 / 168: S8P; S54P; Y60F; L61Y; H62T; V65A; V69T; D81G; M94I; I96L; F122M; S124T; S126T; G136F; Y150S; V152S; A169L; V199I; D204A; A209L; G215C; G217N; S223P; L269P; L273Y; T282S; A284G; P297S; S321P 29 ++++++

– 9, 1 – 10, 1 – 11, 1 – 12, 1 –14, 1 –15, 1 – 16, 1 –18, 1 –20, 1 – 22, 1 –24, 1 –26, 1 – 30, 1 –35, 1 –40, 1 – 45, 1 – 50, 1 – 55, o 1 – 60 diferencias residuales en comparación a la transaminasa representada por la SEC ID Nº 2.

65 En algunas realizaciones, el número de diferencias residuales puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 55, o 60 en comparación con la SEC ID Nº 2.

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[0138] Como se ha visto anteriormente, en algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa mejorada incluye una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144,146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168, con la condición de que la secuencia aminoácida de transaminasa mejorada comprenda cualquiera de las diferencias residuales contenidas en cualquiera de las secuencias polipeptídicas enumeradas en la Tabla 2 en comparación con la SEC ID Nº 2. En algunas realizaciones, los polipéptidos de transaminasa mejorada pueden tener 1 – 2, 1 – 3, 1 – 4, 1 – 5, 1 – 6, 1 –7, 1 –8, 1 – 9, 1 – 10, 1 –11, 1 –12, 1 – 14, 1 –15, 1 – 16, 1 – 18, 1 –20, 1 – 22, 1 – 24, 1 –26, 1 – 30, 1 – 35, 1 – 40, 1 – 45, 1 – 50, 1 – 55, o 1 – 60 diferencias residuales en comparación a la transaminasa representada por la SEC ID Nº 2. En algunas realizaciones, el número de diferencias residuales puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 55, o 60 diferencias residuales en otras posiciones residuales. En algunas realizaciones, las diferencias residuales en otras posiciones residuales comprenden sustituciones con residuos aminoácidos conservativos.

[0139] En algunas realizaciones, los polipéptidos de transaminasa mejorada capaced de convertir el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) –il] – 1 –(2, 4, 5

– trifluorofenil) butan – 2 – ona en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 –α]pirazin –7(8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina en presencia de un dador del grupo amino con niveles de producto detectables mediante HPLC – UV a 210 nm comprende una secuencia aminoácida correspondiente a la SEC ID Nº 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 64, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

[0140] En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto con una actividad 50, 100 o más veces superior a la del polipéptido de la SEC ID Nº 4. En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto con una actividad 50, 100 o más veces superior a la del polipéptido de la SEC ID Nº 4 comprende una secuencia aminoácida correspondiente a la SEC ID Nº 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

[0141] En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto con una actividad 1,1, 5 o más veces superior a la del polipéptido de la SEC ID Nº 22. En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto con una actividad 1,1, 5 o más veces superior a la del polipéptido de la SEC ID Nº 22 comprende una secuencia aminoácida correspondiente a la SEC ID Nº 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

[0142] En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto con una actividad 1,1 a 5 o más veces superior a la del polipéptido de la SEC ID Nº 48. En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto con una actividad 1,1 a 5 o más veces superior a la del polipéptido de la SEC ID Nº 48 comprende una secuencia aminoácida correspondiente a la SEC ID Nº 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

[0143] En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto con una actividad 1,1 a 5 o más veces superior a la del polipéptido de la SEC ID Nº 58. En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa modificada es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto con una actividad 1,1 a 5 o más veces superior a la del polipéptido de la SEC ID Nº 58 comprende una secuencia aminoácida correspondiente a la SEC ID Nº 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

[0144] Como se ha descrito anteriormente, en algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa mejorado también es capaz de convertir el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2

–amina con, almenos, un 70 %,80 %, 85 %, 90 %, 91 %,92 %, 93 %,94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % o más de exceso enantiomérico. Algunos ejemplos de polipéptidos de transaminasa con los niveles especificados de

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enantioselectividad pueden comprender una secuencia aminoácida correspondiente a la SED ID Nº 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

[0145] En algunas realizaciones, los polipéptidos de transaminasa modificada mejorada pueden comprender supresiones de polipéptidos de transaminasa modificado descritos en la presenta. Por lo tanto, en cada una de las realizaciones de los polipéptidos de transaminasa de la divulgación, las supresiones pueden comprender la eliminación de 1 o más aminoácidos, 2 o más aminoácidos, 5 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos, 15 o más aminoácidos o 20 o más aminoácidos, hasta el 10 % del número total de aminoácidos, hasta el 20 % del número total de aminoácidos o hasta el 30 % del número total de aminoácidos que forman el polipéptido mientras conserve la actividad funcional de la actividad transaminasa. En algunas realizaciones, las supresiones pueden comprender 1

– 2, 1 – 3, 1 – 4, 1 – 5, 1 – 6, 1 – 7, 1 – 8, 1 –9, 1 – 10, 1 –11, 1 – 12, 1 – 14, 1 – 15, 1 – 16, 1 – 18, 1 – 20, 1 – 22, 1 –24, 1 –26, 1 –30,1 –35, 1 –40, 1 –45, 1 –50, 1 –55, o 1 –60aminoácidos residuales. En algunas realizaciones, el número de supresiones puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 55, o 60 aminoácidos. En algunas realizaciones, las supresiones pueden comprender supresiones de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 o 30 aminoácidos residuales.

[0146] Como se ha descrito anteriormente, los polipéptidos de transaminasa de la presente divulgación pueden estar en forma de polipéptidos de fusión en los que los polipéptidos de transaminasa se fusionan a otros polipéptidos, como, por citar algún ejemplo no limitante, marcadores de anticuerpos (por ejemplo, epítopo myc), secuencias de purificación (por ejemplo, marcadores de His para la unión a metales) y señales de localización de células (por ejemplo, señales de secreción). Por lo tanto, los polipéptidos de transaminasa pueden utilizarse con o sin fusiones a otros polipéptidos.

[0147] Los polipéptidos descritos en la presente no son restrictivos a los aminoácidos genéticamente codificados. Además de los aminoácidos genéticamente modificados, los polipéptidos descritos en la presente pueden comprender, ya sea total o parcialmente, aminoácidos naturales y / o sintéticos no codificados. Ciertos aminoácidos no codificados hallados normalmente pueden incluir los polipéptidos descritos en la presente, pero no de manera limitante: los estereoisómeros – D de los aminoácidos genéticamente modificados; ácido 2, 3 – diaminopropiónico (Dpr); ácido α – aminoisobutírico (Aib); ácido ε – aminohexanoico (Aha); ácido δ – aminovalérico (Ava); N – metilglicina o sarcosina (MeGly o Sar); ornitina (Orn); citrulina (Cit); t – butilalanina (Bua); t – butilglicina (Bug); N – metilisoleucina (MeIle); fenilglicina (Phg); ciclohexilalanina (Cha); norleucina (Nle); naftilalanina (Nal); 2 – clorofenilalanina (Ocf); 3 – clorofenilalanina (Mcf); 4 – clorofenilalanina (Pcf); 2 – fluorofenilalanina (Off); 3 – fluorofenilalanina (Mff); 4 – fluorofenilalanina (Pff); 2 – bromofenilalanina (Obf); 3 – bromofenilalanina (Mbf); 4 – bromofenilalanina (Pbf); 2 – metilfenilalanina (Omf); 3 – metilfenilalanina (Mmf); 4 – metilfenilalanina (Pmf); 2 – nitrofenilalanina (Onf); 3 – nitrofenilalanina (Mnf); 4 – nitrofenilalanina (Pnf); 2 – cianofenilalanina (Ocf); 3 – cianofenilalanina (Mcf); 4 – cianofenilalanina (Pcf); 2 – trifluorometilfenilalanina (Otf); 3 – trifluorometilfenilalanina (Mtf); 4 – trifluorometilfenilalanina (Ptf); 4 – aminofenilalanina (Paf); 4 – iodofenilalanina (Pif); 4 – aminometilfenilalanina (Pamf); 2 , 4 – diclorofenilalanina (Opef); 3, 4 – diclorofenilalanina (Mpcf); 2, 4 – difluorofenilalanina (Opff); 3, 4 – difluorofenilalanina (Mpff); pirid – 2 – ilalanina (2pAla); pirid – 3 – ilalanina (3pAla); pirid – 4 – ilalanina (4pAla); naft – 1 – ialanina (1nAla); naft – 2 – ialanina (2nAla); tiazolialanina (taAla); benzotienilalanina (bAla); tienialanina (tAla); furialanina (fAla); homofenilalanina (hPhe); homotirosine (hTyr); homotriptófano (hTrp); pentafluorofenilalanina (5ff); estirilcalanina (sAla); autrialanina (aAla); 3, 3 – difenilalanina (Dfa); ácido 3 – amino – 5 – fenipentanóico (Afp); penicillamina (Pen); ácido 1, 2, 3, 4 – tetrahidroisoquinolina – 3 – carboxílico (Tic); β – 2 – tienialanina (Thi); metionina sulfóxido (Mso); N(w) – nitroarginina (nArg); homolisine (hLys); fosfonometilfenialanina (pmPhe); fosfoserina (pSer); fosfotreonina (pThr); ácido homoaspártico (hAsp); ácido homoglutámico (hGlu); ácido 1 – aminociclopent – (2 o 3) – ano – 4 carboxílico; ácido pipecólico (PA), acetidina – 3 – ácido carboxílico (ACA); ácido 1 – ami – nociclopentano – 3 – carboxílico; allilglicina (aOly); propargilglicina (pgGly); homoalanina (hAla); norvalina (nVal); homoleucina (hLeu), homovalina (hVal); homoisoleucina (hIle); homoarginina (hArg); N – acetil lisina (AcLys); ácido 2, 4 – diaminobutírico (Dbu); ácido 2, 3 – diaminobutírico (Dab); N – metilvalina (MeVal); homocisteína (hCys); homoserina (hSer); hidroxiprolina (Hyp) y homoprolina (hPro). Resultarán evidentes para los expertos en la disciplina otros aminoácidos no codificados que pueden comprender los polipéptidos descritos en la presente (véanse, por ejemplo, los aminoácidos presentado en Fasman, 1989, CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Boca Raton, FL, págs 3 – 70 y las referencias citadas en la presente). Estos aminoácidos pueden tener configuración L – o D –.

[0148] Los expertos en la disciplina reconocerán que los aminoácidos o residuos portadores de grupos protectores de cadena lateral también pueden comprender los polipéptidos descritos en la presente. Entre los muchos ejemplos de aminoácidos protegidos, que en este caso pertenecen a la categoría aromática, incluyen (los grupos protectores se enumeran entre paréntesis), de manera no limitante: Arg (tos), Cys (metilbencilo), Cys (nitropiridinasulfenilo), Glu (δ – benciléster), Gln (xantil), Asn (N – δ – xantil), His (bom), His(bencilo), His (tos), Lys (fmoc), Lys (tos), Ser (O – bencilo), Thr (O – bencilo) y Tyr (O – bencilo).

[0149] Los aminoácidos no codificadores que son forzados conformacionalmente de los que pueden componerse los polipéptidos descritos en la presente incluyen, de manera no limitante, aminoácidos N – metil (en configuración

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L-), ácido 1 – aminociclopent – (2 o ) -ene – 4 – carboxílico, ácido pipecólico, ácido acetidina – 3 – carboxílico, homoprolina (hPro) y ácido 1 – aminociclopentano – 3 – carboxílico.

[0150] Como se ha descrito anteriormente, las diferentes modificaciones introducidas en el polipéptido natural para generar la enzima transaminasa modificada pueden dirigirse a una propiedad específica de la enzima.

[0151] Por otra parte, la presente divulgación se refiere a polinucleótidos que codifican los polipéptidos de transaminasa mejorada. Los polinucleótidos pueden estar unidos operativamente a una o más secuencias reguladoras heterólogas que controlan la expresión génica para crear un polinucleótido recombinante capaz de expresar el polipéptido de transaminasa. Los constructos de expresión que contienen un polinucleótido heterólogo que codifican la transaminasa modificada pueden introducirse en las células huésped apropiadas para expresar el polipéptido de transaminasa correspondiente.

[0152] Debido al conocimiento de los codones correspondiente a los diferentes aminoácidos, la disponibilidad de una secuencia proteica presenta una descripción de todos los polinucleótidos capaces de codificar al sujeto. La degradación del código genético, en la que los mismos aminoácidos se codifican por codones alternativos o sinónimos permite hacer un gran número de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de transaminasa mejorada presentados en este documento. Por lo tanto, habiendo identificado una secuencia aminoácida particular, los expertos en la disciplina podrían hacer cualquier número de ácidos nucleicos diferentes simplemente modificando la secuencia de uno o más codones de manera que no cambia la secuencia aminoácida de la proteína. En este aspecto, la presente divulgación contempla específicamente cada una de las posibles variaciones de polinucleótidos que podrían hacerse seleccionando combinaciones basadas en posibles elecciones de codones, y todas estas variaciones se consideran específicamente descritas para cualquier polipéptido descrito en la presente, incluyendo las secuencias aminoácidas de la Tabla 2.

[0153] En algunas realizaciones, los polinucleótidos se pueden seleccionar y / o modificar para comprender codones que se seleccionan preferiblemente para unirse a la célula huésped en la que la proteína está siendo producida. Por ejemplo, los codones preferidos utilizados en bacterias se utilizan para expresar el gen en bacterias; los conoces preferidos utilizados en levaduras se utilizan para la expresión en levaduras; y los codones preferidos utilizados en mamíferos se utilizan para la expresión en células de mamíferos. Ya que no todos los codones necesitan reemplazarse para optimizar el uso de codones de las transaminasas (por ejemplo, debido a que la secuencia natural puede haber preferido codones y debido a que el uso de codones preferidos puede no exigirse para todos los residuos aminoácidos), los polinucleótidos de codones optimizados que codifican los polipéptidos de transaminasa pueden contener codones preferibles de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o más del 90% de posiciones de codón de región codificadora de longitud completa.

[0154] En algunas realizaciones, el polinucleótido codifica un polipéptido de transaminasa que comprende una secuencia aminoácida que es, al menos, idéntica en un 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 4, en la que el polipéptido es capaz de convertir el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona en el producto (2R) –4 –oxo –4 –[3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina en presencia de un dador del grupo amino con una actividad mejorada en comparación a la actividad de la transaminasa de la SEC ID Nº 2 derivada de Arthrobacter sp KNK168.

[0155] En algunas realizaciones, el polinucleótido codifica un polipéptido de transaminasa que comprende una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, o 102, en la que el polipéptido tiene una o más propiedades mejoradas para convertir el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina en presencia de un dador del grupo amino. En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa codificado tiene un actividad superior o igual a la actividad del polipéptido de la SEC ID Nº 4.

[0156] En algunas realizaciones, el polipéptido que codifica un polipéptido de transaminasa comprende una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144,146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

[0157] En algunas realizaciones, el polipéptido que codifica un polipéptido de transaminasa comprende una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,

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20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144,146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168, con la condición de que la secuencia aminoácida transaminasa comprende cualquiera de las diferencias residuales comprendidas en cualquiera de las secuencias polipeptídicas enumeradas en la Tabla 2 en comparación a la SEC ID Nº 2.

[0158] En algunas realizaciones, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de transaminasa mejorada se seleccionan de la SEC ID Nº 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, o 167.

[0159] En algunas realizaciones, los polinucleótidos son capaces de hibridizarse en condiciones altamente severas a un polinucleótido que comprende la SEC ID Nº 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, o 167 o a un complemento de los mismos, en el que los polinucleótidos que se hibridizan severamente codifican un polipéptido de transaminasa capaz de convertir 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan

– 2 – ona en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina en presencia de un dador del grupo amino con una actividad superior o igual a la del polipéptido de la SEC ID Nº 4.

[0160] En algunas realizaciones, los polinucleótidos codifican los polipéptidos descritos en la presente, pero tienen una identidad de secuencia del 80 % o más, del 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% o más en el nivel nucleótido a un polinucleótido de referencia que codifica la transaminasa modificada descrita en la presente. En algunas realizaciones, el polinucleótido de referencia se selecciona de las SEC ID Nº 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, o 167.

[0161] Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de transaminasa mejorada puede manipularse de diversas maneras para proporcionar la expresión del polipéptido. En algunas realizaciones, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de transaminasa modificada pueden presentarse como vectores de expresión en los que una o más secuencias de control regulan la expresión de los polinucleótidos. La manipulación del polinucleótido aislado antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesario dependiendo del vector de expresión. Las técnicas de modificación de polinucleótidos y secuencias de ácido nucleico utilizando métodos de ADN recombinante ya se conocen en la disciplina. Se proporciona una guía en Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; y Current Protocols en Molecular Biology, Ausubel, F, Ed.., Greene Pub. Associates, 1998, actualizado en 2006.

[0162] En algunas realizaciones, las secuencias de control incluyen, entre otros, activadores, secuencia líder, secuencia de poliadenilación, secuencia propeptídica, secuencia de péptido señal y terminador de transcripción. Para células huésped bacterianas, los activadores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico para la presente divulgación, incluyen los activadores obtenidos del operón lac de E. coli, el operón trp de

E. coli, bacteriófago λ, gen agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA), gen levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), gen alfa – amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), gen amilasa maltogénico de Bacillus stearothermophilus (amyM), gen alfa – amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gen penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP), genes xylA y xylB y gen beta – lactamasa procariótico de Bacillus subtilis (Villa – Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727 – 3731), así como el activador tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21 – 25).

[0163] Para las células huésped fúngicas filamentosas, los activadores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico para la presente divulgación, incluyen los activadores obtenidos de genes de amilasa de Aspergillus oryzae TAKA, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa – amilasa de Aspergillus niger, ácido alfa – amilasa de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o de Aspergillus awamori (glaA), lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, isomerasa triosa fosfato de Aspergillus oryze, acetamidasa de Aspergillus nidulans y proteasa de Fusarium oxysporum de tipo tripsina (véase, por ejemplo, WO 96 / 00787), así como el activador NA2 – tpi (un híbrido de los activadores a partir de genes para alfa – amilasa neutral de Aspergillus niger e isomerasa triosa fosfato de Aspergillus oryzae), y activadores mutados, truncados e híbridos de los mismos.

[0164] En una levadura huésped, los activadores apropiados pueden ser de genes para enolasa (ENO – 1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), alcohol deshidrogenasa / gliceraldehído – 3 – fosfato deshidrogenasa (ADH2 / GAP) de Saccharomyces cerevisiae y quinasa 3 –

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fosfoglicerato de Saccharomyces cerevisiae. Otros activadores apropiados para células huésped de levadura se describen en Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423 – 488.

[0165] La secuencia de control también puede ser una secuencia de terminación de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia de terminación se une operablemente al extremo 3' terminal de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Cualquier terminador funcional en la célula huésped elegida puede utilizarse en la presente invención.

[0166] Por ejemplo, los terminadores de transcripción ejemplares para células huésped fúngicas filamentosas pueden obtenerse de genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, alfa–glucosidasa de Aspergillus niger y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[0167] Los terminadores preferidos para células huésped de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y gliceraldehído – 3 – deshidrogenasa fosfato de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores adecuados para células huésped de levadura se describen en Romanos et al., 1992, supra.

[0168] La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder está unida operativamente al extremo 5' terminal de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia líder funcional en la célula huésped elegida puede utilizarse en la presente invención. Los líderes preferidos para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans. Los líderes adecuados para células huésped de levadura se obtienen de los genes para enolasa (ENO – 1) de Saccharomyces cerevisiae, 3 – fosfoglicerato – quinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa / gliceraldehído – 3 – fosfato deshidrogenasa (ADH2 / GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[0169] La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia unida operativamente al extremo 3' terminal de la secuencia de nucleótidos y que, cuando está transcrita, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación funcional en la célula huésped elegida se puede utilizar en la presente invención. Las secuencias de poliadenilación preferidas para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum, y alfa – glucosidasa de Aspergillus niger. Se describen secuencias de poliadenilación adecuadas para células huésped de levadura en Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983 – 5990.

[0170] La secuencia de control también puede ser una región codificadora de un péptido señal que codifica una secuencia aminoácida enlazada al extremo amino terminal de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado a la vía secretora de la célula. El extremo 5' terminal de la secuencia codificadora de la secuencia de nucleótidos puede contener de manera inherente una región codificadora de un péptido señal unido de manera natural en el marco de lectura de traducción al segmento de la región codificadora que codifica el polipéptido secretado. Alternativamente, el extremo 5' terminar de la secuencia codificadora puede contener una región codificadora de un péptido señal que es extranjera a la secuencia codificadora. La región codificadora de un péptido señal extranjera puede requerirse donde la secuencia codificadora no contiene una región codificadora de un péptido señal de forma natural.

[0171] Las regiones codificadoras de péptidos señal eficaces para células huésped bacterianas son las regiones codificadoras de un péptido señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de Bacillus de NCIB 11837, alfa

– amilasa de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta – lactamasa de Bacillus licheniformis, proteasas neutrales (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, y Bacillus subtilis prsA. Se describen más péptidos señal en Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109 – 137.

[0172] Las regiones codificadoras de péptidos señal eficaces para células huésped fúngicas filamentosas son las regiones codificadoras de un péptido señal obtenidas de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, celulasa de Humicola insolens y lipasa de Humicola lanuginosa.

[0173] Los péptidos señal apropiados para células huésped de levadura se obtienen a partir de los genes para factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Se describen otras regiones codificadoras de péptidos señal adecuados en Romanos et al., 1992, supra.

[0174] La secuencia de control también puede ser una región codificadora de propéptido que codifica para una secuencia de aminoácidos situada en el amino terminal de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o un propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propéptido es generalmente inactivo y se puede convertir en un polipéptido maduro activo por escisión autocatalítica o catalítica del propéptido del

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propolipéptido. La región de codificación de propéptido se puede obtener a partir de los genes para proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT), factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, y lacasa de Myceliophthora thermophila (véase, por ejemplo, la patente WO 95/ 33836).

[0175] Cuando tanto el péptido señal como las regiones de propéptido están presentes en el amino terminal de un polipéptido, la región de propéptido está situada junto al amino terminal de un polipéptido y la región de péptido señal está situada junto al amino terminal de la región de propéptido.

[0176] También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras, que permitan la regulación de la expresión del polipéptido respecto al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son los que causan que la expresión del gen se active o desactive como respuesta a un estímulo físico o químico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. En las células huésped procarióticas, las secuencias reguladoras adecuadas incluyen los sistemas operadores lac, tac, y trp. En células huésped de levaduras, las secuencias reguladoras adecuadas incluyen, por ejemplo, el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, las secuencias reguladoras adecuadas incluyen el activador TAKA de alfa – amilasa, activador de glucoamilasa de Aspergillus niger, y activador de glucoamilasa de Aspergillus oryzae.

[0177] Otros ejemplos de secuencias reguladoras son los que permiten la amplificación del gen. En sistemas eucarióticos, estos incluyen el gen de dihidrofolato – reductasa, que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína, que se amplifican con metales pesados. En estos casos, la secuencia nucleótida que codifica el polipéptido de transaminasa de la invención se uniría operativamente a la secuencia reguladora.

[0178] Por lo tanto, en otra realización la presente divulgación también se dirige a un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de transaminasa modificada o una variante de este, y una o más regiones reguladoras de expresión como un activador y un terminador, un origen de replicación, etc. dependiendo del tipo de huésped en el que se van a introducir. Las secuencias de ácido nucleico y de control descritas anteriormente pueden unirse entre ellas para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido en dichos sitios. De manera alternativa, la secuencia de ácido nucleico de la presente divulgación puede expresarse insertando la secuencia de ácido nucleico o un constructo de ácido nucleico que comprenda la secuencia en un vector adecuado para la expresión. Creando el vector de expresión, la secuencia codificadora se localiza en el vector, de manera que la secuencia codificadora se une operablemente a las secuencia de control apropiada para su expresión.

[0179] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o un virus) que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y que pueda provocar la expresión de la secuencia de polinucleótidos. La elección del vector dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que se introducirá el vector. Los vectores pueden ser plásmidos circulares cerrados o lineales.

[0180] El vector de expresión puede ser un vector de replicación autónoma, es decir; un vector que existe como una entidad extracromosómica cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener medios para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser aquel que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto al (los) cromosoma(s) en que ha sido integrado. Además, puede utilizarse un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que contienen el ADN total que va a ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

[0181] El vector de expresión de la presente invención contiene preferiblemente uno o más marcadores seleccionables que permiten una fácil selección de las células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares. Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes del de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis o marcadores que confieren resistencia antibiótica como la amplicilina, canamicina, cloranfenicol o resistencia a la tetraciclina. Los marcadores adecuados para las células huésped de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3.

[0182] Los marcadores selccionables para el uso en un células huésped fúngica filamentosa incluyen, pero no se limitan a, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina 5 – fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de los mismos. Las realizaciones para la utilización en una célula de Aspergillus incluyen los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Sterptomyces hygroscopicus.

[0183] Los vectores de expresión para expresar transaminasas pueden contener un(os) elemento(s) que permite(n) la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma. Para la integración del genoma en la célula huésped, el vector puede depender de

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la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido o de cualquier elemento del vector para la integración del vector en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga.

[0184] Alternativamente, el vector de expresión puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de ácidos nucleicos adicionales permiten al vector integrarse en el genoma de la célula huésped en una(s) ubicación(es) precisa(s) en el(los) cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener, preferiblemente, un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como de 100 a

10.000 pares de bases, preferiblemente de 400 a 10.000 pares de bases, y más preferiblemente de 800 a 10.000 pares de bases con un alto grado de identidad con la secuencia sometida correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia diana en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias nucleótidas codificadoras o no codificadoras. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.

[0185] Para la replicación autónoma, el vector puede comprender, además, un origen de replicación que permite al vector replicar de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son P15A ori, o los orígenes de replicación de plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 (tiene el plásmido P15A ori), o pACYC184, que permite replicación en E. coli, y pUB110, pE194, pTA1060, o pAMß1, que permite replicación en Bacillus. Ejemplos de orígenes de replicación para su utilización en una célula huésped de levadura son los orígenes de replicación de 2 micrones, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6. El origen de replicación puede ser cualquiera que tenga una mutación que haga su funcionamiento sensible a la temperatura en la célula huésped (véase, por ejemplo, Ehrlich, 1978, Proc Natl Acad Sci. USA 75: 1433).

[0186] Puede insertarse más de una copia de una secuencia de ácido nucleico de la presente invención en una célula huésped para incrementar la producción del producto genético. Puede obtenerse un aumento en el número de copias de la secuencia de ácido nucleico integrando, al menos, una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con la secuencia de ácido nucleico donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, por tanto, pueden seleccionarse copias adicionales de la secuencia de ácido nucleico para cultivar las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

[0187] Muchos de los vectores de expresión para su utilización en la presente invención están disponibles comercialmente. Los vectores de expresión comerciales adecuados incluyen vectores de expresión p3xFLAGTMTM de Sigma – Aldrich Chemicals, St. Louis MO., un activador de CMV y el sitio de poliadenilación de hGH para la expresión en células huésped de mamíferos y un origen de replicación de pBR322 y marcadores de resistencia a la ampicilina para la amplificación en E. coli. Otros vectores de expresión adecuados son pBluescriptII SK (–) y pBK – CMV, disponibles comercialmente en Stratagene, La Jolla CA, y los plásmidos que se derivan de pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pREP4, pCEP4 (Invitrogen) o pPoly (Lathe et al ., 1987, Gene 57: 2193–201).

[0188] En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de transaminasa mejorada de la presente divulgación, el polinucleótido está unido operativamente a una o más secuencias de control para la expresión de la enzima transaminasa en la célula huésped. Las células huésped para su utilización en la expresión de los polipéptidos de transaminasa codificada por los vectores de expresión de la presente invención son ya conocidos en la disciplina e incluyen de manera no limitante, células bacterianas como E. coli, Lactobacillus, Streptomyces y células de Salmonella typhimurium, células fúngicas como células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris (N º de acceso ATCC 201178)); células de insecto tales que Drosophila S2 y células de Spodoptera Sf9; células animales tales que CHO, COS, BHK, 293, células del melanoma de Bowes y células de plantas. Son ya conocidos en la disciplina los medios de cultivo apropiados y las condiciones de crecimiento para las células huésped descritas anteriormente.

[0189] Los polinucleótidos para la expresión de la transaminasa pueden introducirse en las células mediante diversos procedimientos conocidos en la disciplina. Las técnicas incluyen, entre otras, electroporación, bombardeo de partículas biolísticas, transfección mediada por liposomas, transfección con cloruro de calcio y fusión de piroclastos. Serán evidentes para los expertos en la disciplina diversos procedimientos para la introducción de polinucleótidos en células.

[0190] Un ejemplo de célula huésped es Escherichia coli W3110. El vector de expresión se creó por la unión operativa de un polinucleótido que codifica una transaminasa mejorada al plásmido pCK110900 unido operativamente al activador lac en control del represor lacI. El vector de expresión contiene también el origen de replicación de P15a y el gen de resistencia al cloranfenicol. Las células que contienen el polinucleótido objeto en Escherichia coli W3110 se aislaron por someter las células a la selección de cloranfenicol.

[0191] Las transaminasas mejoradas y los polinucleótidos que codifican dichos polinucleótidos pueden prepararse utilizando métodos empleados comúnmente por los expertos en la disciplina. Como se ha señalado anteriormente, la

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secuencia de aminoácidos natural y su correspondiente polinucleótido que codifica a la enzima transaminasa de tipo salvaje de Arthrobacter sp KNK168 de la que se deriva la secuencia progenitora SEC ID Nº 2, se encuentra disponible en la patente US Nº 7.169.592. En algunas realizaciones, la secuencia de polinucleótidos progenitora es un codón optimizado para incrementar la expresión de la transaminasa en una célula huésped especificada. La secuencia de polinucleótidos designada como SEC ID Nº 1 fue la secuencia progenitora utilizada como punto de partida para la mayoría de los experimentos y la construcción de bibliotecas de transaminasa modificada.

[0192] Las transaminasas modificada pueden obtenerse sometiendo el polinucleótido que codifica la transaminasa de origen natural a mutagénesis y / o métodos de evolución dirigida. Un ejemplo de técnica de evolución dirigida es la mutagénesis y / o el barajado de ADN como se describe en Stemmer, 1994, Proc Natl Acad Sci y en las patentes USA 91: 10747 – 10751; WO 95/22625, WO 97/0078, WO 97/35966, WO 98/27230, WO 00/42651 y US Nº

6.537.746.

[0193] Otros procedimientos de evolución dirigida que pueden utilizarse incluyen, entre otros, el proceso de ampliación escalonada por recombinación in vitro (StEP) (Zhao et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16: 258 – 261), mutagénesis dirigida por PCR (Caldwell et al., 1994, PCR Methods Appl. 3: S136 – S140) y mutagénesis de cassette (Black et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93: 3525 – 3529). Las técnicas de mutagénesis y evolución dirigida útiles para los objetivos del presente documento se describen también en las siguientes referencias: Ling, et al., 1997, “Approaches to DNA mutagénesis: an overview”, Anal. Biochem. 254 (2): 157 – 78, Dale et al., 1996, “Oligonucleotide – directed random mutagénesis using the phosphorothioate method”, Methods Mol. Biol. 57: 369 – 74, Smith, 1985, “In vitro mutagenesis”, Ann. Rev. Gent. 19:423 – 462, Botstein et al., 1985, “Strategies and applications of in vitro mutagenesis”, Science 229: 1193 – 1201, Carter, 1986, “Site – directed mutagenesis”, Biochem. J. 237: 1 – 7, Kramer et al., 1984, “Point Mismatch Repair”, Cell 38: 879 – 887, Wells et al., 1985, “Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites”, Gene 34: 315 – 323, Minshull et al., 1999, “Protein evolution by molecular breeding”, Curr Opin Chem Biol 3:284 – 290, Christians et al., 1999, “Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling”, Nature Biotech 17: 259 – 264, Crameri et al., 1998, “DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution”, Nature 391: 288 – 291, Crameri et al., 1997 “Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling”, Nature Biotech 15: 436 – 438, Zhang et al., 1997, “Directed evolution of an effective fructosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening”, Proc Natl Acad Sci USA 94: 45 – 4 – 4509, Crameri et al., 1996, “Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuflling”, Nature Biotech

14: 315 – 319, y Stemmer, 1994, “Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling”, Nature 370: 389 – 391.

[0194] En algunas realizaciones, mediante el cribado por transaminasas con propiedad de la enzima mejorada deseada, se obtienen los clones tras el tratamiento mutagénico. La medición de la actividad de la enzima transaminasa de las bibliotecas de expresión puede realizarse utilizando técnicas estándar como la separación del producto (por ejemplo, por HPLC), la detección del producto mediante la medición de la absorción de la luz ultravioleta del sustrato y de los productos separados y / o la detección utilizando la espectrometría de masas en tándem (por ejemplo MS/MS). A continuación, se describen en el Ejemplo 4 ejemplos de ensayos. La velocidad de incremento en el producto deseado por unidad de tiempo indica la actividad relativa (enzimática) del polipéptido de transaminasa en una cantidad fija de lisado (o un polvo liofilizado realizado a partir de estos). Cuando la propiedad de la enzima mejorada deseada sea la estabilidad térmica, la actividad enzimática puede medirse tras someter las preparaciones enzimáticas a una temperatura definida y medir la cantidad de la actividad enzimática restante tras los tratamientos de calor. Los clones contienen un polinucleótido que codifica las transaminasas deseadas aisladas y secuenciadas posteriormente para identificar los cambios en la secuencia de los nucleótidos (si los hubiese) y utilizadas para expresar la enzima en una célula huésped.

[0195] Cuando se conoce la secuencia del polipéptido modificada, los polinucleótidos que codifican la enzima pueden prepararse por métodos en fase sólida según los procedimientos sintéticos conocidos. En algunas realizaciones, los fragmentos de aproximadamente 100 bases pueden sintetizarse individualmente para luego unirse (por ejemplo, por procedimientos de ligadura química o enzimática o procedimientos mediados por polimerasa) formando cualquier secuencia continua deseada. Por ejemplo, los polinucleótidos y los oligonucleótidos de la presente invención pueden prepararse por síntesis química utilizando, por ejemplo, el método de la fosforamidita descrito por Beaucage et al., 1981, Tet Lett 22: 1859 – 69, o el método descrito por Matthes et al., 1984, EMBO J. 3: 801 – 05, por ejemplo, tal como se practica en los métodos sintéticos automatizados. Según el método de la fosforamidita, se sintetizan los oligonucleótidos por ejemplo, en un sintetizador automático de ADN y se purifican, se hibridan, se ligan y se clonan en vectores adecuados. Además, cualquier ácido nucleico puede adquirirse de cualquier fabricante como The Great American Gene Company, Ramona, CA, ExpressGen Inc. Chicago, IL, Operon Technologies Inc., Alameda, CA, entre otros.

[0196] Las enzimas transaminasa modificadas expresadas en una célula huésped pueden ser recuperadas de las células o del medio de cultivo utilizando cualquiera de las técnicas ya conocidas para la purificación de proteínas, incluyendo, entre otros, el tratamiento con lisozima, la utilización de ultrasonidos, la filtración, precipitación por salado, ultracentrifugación y cromatografía. Las soluciones adecuadas para la lisis y la alta extracción de eficiencia de las proteínas a partir de bacterias como E. coli, están disponibles comercialmente con la marca comercial CelLytic BTM de Sigma – Aldrich de St Louis MO.

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[0197] Las técnicas cromatográficas para aislar el polipéptido de transaminasa incluyen, entre otras, la cromatografía de fase inversa, la cromatografía líquida de alta resolución, la cromatografía iónica, la electroforesis en gel y la cromatografía de afinidad. Las condiciones para purificar una enzima particular dependerán, en parte, de factores como la carga neta, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, el peso molecular, la forma molecular, etc, y serán evidentes para los expertos en la materia. En algunas realizaciones, las transaminasas modificadas pueden expresarse como proteínas de fusión con marcas de purificación como los marcadores en His que tienen afinidad por los metales o los marcadores de anticuerpos para unirse a los anticuerpos, por ejemplo, el marcador del epítopo de myc.

[0198] En algunas realizaciones, las técnicas de afinidad pueden utilizarse para aislar las enzimas transaminasas mejoradas. Para la purificación por cromatografía de afinidad puede utilizarse cualquier anticuerpo que se una al polipéptido de transaminasa. Para la producción de anticuerpos, diversos animales huésped que incluyen de manera no limitante a conejos, ratones, ratas, etc, pueden inmunizarse con una inyección de un polipéptido modificado. El polipéptido puede unirse a un vehículo adecuado como BSA por medio de un grupo funcional de cadena lateral o conectores unidos a un grupo funcional de cadena lateral. Pueden utilizarse varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica dependiendo de las especies huésped, incluyendo de manera no limitante el adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales como el hidróxido de aluminio, sustancias de superficie activa como la lisolecitina, los polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles como el BCG (bacilo de Calmette – Guérin) y

Corynebacterium parvum

[0199] Por otra parte, los polipéptidos de transaminasa mejorada descritos en el presente documento pueden utilizarse en un proceso de transaminación para algunos aceptores del grupo amino (por ejemplo, un aceptor de cetona) en presencia de un dador del grupo amino. Para la descripción de los compuestos del presente documento se aplicarán los siguientes significados.

[0200] “Alquilo” pretende incluir a los grupos alquilo de la longitud designada en una configuración lineal o ramificada. Algunos ejemplos de dichos grupos de alquilo son metil, etil, propil, isopropil, butil, sec – butil, terc – butil, pentil, isopentil, hexil, isohexil y similares. Los grupos alquilo están sustituidos o no sustituidos entre uno y tres grupos seleccionados independientemente de los grupos formados por halógeno, hidroxi, carboxi, aminocarbonil, amino, C1 –4 alcoxi y C 1 – 4 alquiltio.

[0201] “Cicloalquilo” se refiere a los anillos cíclicos de alcanos de entre cinco y doce átomos de carbono totales o cualquier número dentro de este intervalo (es decir; ciclopentil, ciclohexil, cicloheptil etc).

[0202] “Halógeno” pretende incluir los átomos de halógeno, flúor, cloro, bromo y yodo.

[0203] “Arilo” se refiere a un grupo aromático, incluyendo fenil y naftil. “Arilo” es sustituido o no sustituido entre uno y cinco sustituyentes seleccionados independientemente entre flúor, hidroxi, trifuorometil, amino, C 1 – 4 alquil y C 1 – 4 alcoxi.

[0204] “Heteroarilo” se refiere a un heterociclo aromático con 5 o 6 miembros que contiene al menos un heteroátomo de anillo selccionado de O, S y N. Los heteroarilos también incluyen heteroarilos fusionados con otras clases de anillos no aromáticos como los arilos, cicloalquilos y los heterociclos. Algunos ejemplos de grupos de heteroarilo incluyen de manera no limitante al pirrolil, isoxazolil, isotiazolil, pirazolil, piridinil, oxazolil, 1,2,4 – oxadiazolil, 1,3,4 – oxadiazolil, tiadiazolil, tiazolil, imidazolil, triazolil, tetrazolil, furilo, triazinil, tienil, pirimidinil, pirazinil, bencisoxazolilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, dihidrobenzofuranilo, idolinil, piridazinil, indazolil, isoindolil, dihidrobenzotienil, indolizinil, cinolinil, ftalazinil, quinazolinil, naftitidinil, carbazolil, benzodioxolil, quinoxalinil, purinil, furazanil, isobencilfuranil, bencimidazolil, benzofuranil, benzotienil, quinolil, indolil, isoquinolil y dibenzofuranil. “Heteroarilo” está sustituido o no sustituido entre uno y cinco sustituyentes seleccionados independientemente entre flúor, hidroxi, trifuorometil, amino, C 1 – 4 alquil y C 1 – 4 alcoxi.

[0205] En algunas realizaciones, las transaminasas pueden utilizarse en un proceso de preparación de un compuesto de fórmula estructural (I):

Z es OR2 o NR2R3; R1 es C1–8 alquilo, arilo, heteroarilo, arilo – C1–2 alquilo o heteroarilo – C1–2 alquilo;

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R2 y R3 son hidrógenos independientes, C1–8 alquilo, arilo o arilo – C1–2 alquilo; o R2 y R3 junto al átomo de nitrógeno al que se unen forman un anillo heterocíclico membrado de 4– a 7– que contiene un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S, NH y NC1–4 alquilo, sustituyendo, o no, el anillo heterocíclico por uno de los tres sustituyentes seleccionados independientemente entre oxo, hidroxi, halógeno, C1–4 alcoxi y C1–4 alquilo, en el que alquilo y alcoxi son sustituidos, o no, por uno a cinco átomos de flúor; y fusionando el sistema del anillo heterocíclico a un sistema de anillos carbocíclicos aromáticos o saturados de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros que contiene de uno o dos heteroátomos seleccionados entre O, S y NC0–4 alquilo, sustituyendo, o no, el sistema de anillos fusionados por uno o dos sustituyentes seleccionados entre hidroxi, amino, flúor, C1–4 alquilo, C1–4 alcoxi y trifluorometil; el proceso incluye la etapa de poner en contacto una cetona proquiral de fórmula estructural (II):

con un polipéptido transaminasa de la invención en presencia de un dador del grupo amino en un disolvente orgánico apropiado en las condiciones de reacción adecuadas para la conversión del compuesto de fórmula (II) en el compuesto de fórmula (I).

[0206] En algunas realizaciones del proceso, R1 de la fórmula (II) es bencilo, en el que el grupo fenilo está sustituido o no sustituido entre uno y tres sustituyentes seleccionados del grupo de flúor, trifluorometil y trifluorometoxi.

[0207] En algunas realizaciones del proceso, Z de la fórmula (II) es NR2R3.

[0208] En algunas realizaciones del proceso, el NR2R3 de fórmula (II) es heterociclo de fórmula estructural (III): en la que R4 es hidrógeno o C1–4 alquilo, sustituido, o no, por uno a cinco átomos de flúor.

[0209]

compuesto de fórmula estructural (1):

con un polipéptido de transaminasa modificada mejorada descrita en presencia de un dador del grupo amino en un disolvente orgánico apropiado en las condiciones de reacción adecuadas para la conversión del compuesto de fórmula (2) en el compuesto de fórmula (1).

[0210] En algunas realizaciones del proceso, la Ar de la fórmula (2) es 2, 5 – difluorofenilo o 2, 4, 5 – trifluorofenilo,

y R4 es trifluorometilo.

[0211] En algunas realizaciones del proceso, la Ar de la fórmula (2) es 2, 4, 5 – trifluorofenilo.

5 [0212] En algunas realizaciones, las transaminasas pueden utilizarse en un proceso de preparación de un compuesto de fórmula (1a), (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina con un exceso enantiomérico:

[0213] En estas realizaciones, el proceso comprende la etapa de contacto una cetona proquiral de fórmula estructural (2a), 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona:

35 con un polipéptido de transaminasa modificada mejorada descrita en presencia de un dador del grupo amino en un disolvente orgánico apropiado en las condiciones de reacción adecuadas para la conversión del compuesto de fórmula (2a) en el compuesto de fórmula (1a).

[0214] En algunas realizaciones de los procesos anteriores, el compuesto de fórmula (I), el compuesto de fórmula

(1) o el compuesto de fórmula (1a) se producen con, al menos, el 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de exceso enantiomérico.

[0215] En algunas realizaciones de los procesos, el compuesto de fórmula (I), el compuesto de fórmula (1) o el 45 compuesto de fórmula (1a) se producen con, al menos, el 99 % de exceso enantiomérico.

[0216] En algunas realizaciones del proceso, las transaminasas mejoradas son seleccionadas entre la SEC ID Nº: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o

168.

[0217] Se describen junto con sus síntesis, entre otras, las patentes US Nº 7.326.708 y 7.468.459, el compuesto de la fórmula (II), el compuesto de la fórmula (2) y el compuesto de la fórmula (2a).

55 [0218] Como ya se ha señalado anteriormente, el polipéptido de transaminasa del presente documento utiliza fosfato de piridoxal (PLP) como coenzima, que puede estar unido a la enzima cuando se prepara, por ejemplo, cuando se proporciona a la célula huésped en el que se expresa el polipéptido. En algunas realizaciones, el PLP, los análogos de PLP o los precursores de PLP pueden añadirse al medio de las células huésped durante la expresión del polipéptido de transaminasa. En algunas realizaciones de los procesos, el PLP o los análogos de PLP pueden añadirse a la reacción para proporcionar la coenzima necesaria para la actividad enzimática. La cantidad de PLP requerida para la actividad enzimática puede determinarse por un experto en la disciplina.

[0219] En algunas realizaciones, el proceso comprende poner en contacto o incubar el sustrato de cetoamida 4 –

65 oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –ona) con una transaminasa mejorada en presencia de un dador del grupo amino en condiciones de

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reacción adecuadas para convertir el sustrato de cetoamida en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –amina con un tasa y /

: o actividad de conversión entre 50 y 100 veces o mayor que la de la SEC ID Nº 4. Ejemplos de polipéptidos comprenden una secuencia de aminoácidos correspondientes a las SEC ID Nº: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

[0220] En algunas realizaciones, el proceso comprende poner en contacto o incubar el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –ona) con una transaminasa mejorada en presencia de un dador del grupo amino en condiciones de reacción adecuadas para convertir el sustrato de cetoamida en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –amina con un tasa y /

: o actividad de conversión entre 1,1 y 5 veces o mayor que la de la SEC ID Nº 22. Ejemplos de polipéptidos comprenden una secuencia de aminoácidos correspondientes a las SEC ID Nº: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

[0221] En algunas realizaciones, el proceso comprende poner en contacto o incubar el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –ona) con una transaminasa mejorada en presencia de un dador del grupo amino en condiciones de reacción adecuadas para convertir el sustrato de cetoamida en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –amina con un tasa y /

: o actividad de conversión entre 1,1 y 5 veces o mayor que la de la SEC ID Nº 48. Ejemplos de polipéptidos comprenden una secuencia de aminoácidos correspondientes a la SEC ID Nº: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

[0222] En algunas realizaciones, el proceso comprende poner en contacto o incubar el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –ona) con una transaminasa mejorada en presencia de un dador del grupo amino en condiciones de reacción adecuadas para convertir el sustrato de cetoamida en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –amina con un tasa y /

: o actividad de conversión entre 1,1 y 5 veces o mayor que la de la SEC ID Nº 58. Ejemplos de polipéptidos comprenden una secuencia de aminoácidos correspondientes a la SEC ID Nº: 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

[0223] En algunas realizaciones de los procesos anteriores, la condición de reacción para llevar a cabo el proceso puede comprender un pH entre 7,0 y 9,0. En algunas realizaciones, la condición de reacción para el proceso es un pH de 8,5.

[0224] En algunas realizaciones, la condición de reacción para llevar a cabo el proceso puede comprender una temperatura que oscila entre 25 ºC y 50 ºC. En algunas realizaciones, la condición de reacción es una temperatura de 45 ºC.

[0225] En algunas realizaciones, la condición de reacción es un pH de 8,5 y una temperatura de 45 ºC.

[0226] En algunas realizaciones del proceso, el disolvente orgánico comprende un disolvente polar como el metanol o el DMSO.

[0227] En algunas realizaciones, el disolvente orgánico es DMSO, que puede estar presente desde el 10 % al 40 % volumen / volumen (v / v); entre el 25 % y el 40 % (v / v), entre el 10 % y el 50 % (v / v) o entre el 25 % y el 50 % (v / v) de DMSO. En algunas realizaciones, el DMSO está presente en el 30 % (v / v), en el 35 % (v / v), en el 40 % (v / v) o en el 50 %(v / v).

[0228] Como ya se ha tratado anteriormente, el dador del grupo amino utilizado en el proceso puede ser una amina quiral o una amina aquiral. El dador del grupo amina aquiral posee una ventaja al no estar limitado en su reacción con un estereoisómero específico, por lo que requiere menos del dador del grupo amino. Pueden utilizarse diversos dadors del grupo amino adecuados, incluyendo, a modo de ejemplo y no de limitación, la isopropilamina (también denominada como 2 – aminopropano), L, D, DL alanina, fenilalanina, glutamato, glutamina, leucina (o cualquier otro α – aminoácido adecuado), 3 – ácido aminobutírico ( o cualquier otro β – aminoácido) y metilbencilamina. En algunas realizaciones, el dador del grupo amino es la isopropilamina. En algunas realizaciones, pueden utilizarse otros dadors del grupo amino, incluyendo, entre otros, α – feniletanamina y (R) – 1 – feniletanamina, 2 – amino – 4 – fenilbutano, glicina, ácido L – glutámico, L – glutamato, glutamato monosódico, ácido

42 5

L – aspártico, L – lisina, L – ornitina, β – alanina, taurina, n – pctilamina, ciclohexilamina, 1,4 – butanodiamina, 1,6 – hexanodiamina, 6 – ácido aminohexanoico, 4 – ácido aminobutírico, tiramina, bencialmina, 2 – aminobutano, 2 – amino – 1 – butanol, 1 – amno – 1 – feniletano, 1 – amino – 1 – (2 – metoxi – 5 – fluorofenil) etano, 1 – amino – 1 – fenilpropano, 1 – amino – 1 – (4 – hidroxifenil) propano, 1 – amino – 1 – (4 – bromofenil) propano, 1 – amino – 1 – (4 nitrofenil) propano, 1 – fenil – 2 – aminopropano, 1 – (3 – trfluorometilfenil) – 2 – aminopropano, 2 – aminopropanol, 1 – amino – 1 – fenilbutano, 1 – fenil – 2 – aminobutano, 1 – (2,5 – dimetoxi – 4 – metilfenil) – 2 – aminobutano, 1 fenil – 3 – aminobutano, 1 – (4 – hidroxifenil) – 3 – aminobutano, 1 – amino – 2 – metilciclopentano, 1 – amino – 3 – metilciclopentano, 1 – amino – 2 – metilciclohexano, 1 – amino – 1 – (2 – naftil) etano, 3 – metilciclopentilamina, 2 – metilciclopentilamina, 2 – etilciclopentilamina, 2 – metilciclohexilamina, 3 – metilciclohexilamina, 1 – aminotetralina, 2

– aminotetralina, 2 – amino – 5 – metoxitetralina y 1 – aminoindano, incluyendo cuando sea posible los dos isómeros únicos (R) y (S) y todas las sales posibles de las aminas.

[0229] En algunas realizaciones de los procesos descritos anteriormente, la etapa en el proceso puede comprender además la eliminación del carbonilo por un producto formado del dador del grupo amino cuando se transfiera el grupo amino al aceptor del grupo amino. Dicha eliminación in situ puede reducir la velocidad de la reacción inversa de manera que prevalece la reacción hacia adelante y a continuación, se convierte más sustrato en producto.

[0230] La eliminación del carbonilo por un producto puede realizarse de diferentes maneras. Cuando el dador del grupo amino es un aminoácido como la alanina, el subproducto carbonilo, un ácido ceto, puede eliminarse por reacción con un peróxido (véase, por ejemplo, la patente US 2008/0213845). Los peróxidos que pueden utilizarse incluyen, entre otros, peróxido de hidrógeno, peroxiácidos (perácidos) como el ácido peracético (CH3CO3H), ácido trifluoroperacético y ácido metacloroperoxibenzoico; peróxido orgánicos como el peróxido de t – butilo ((CH3)3COOH u otros oxidantes selectivos como perrutenato de tetrapropilamonio, MnO2, KMnO4, tetróxido de rutenio y compuestos relacionados. Alternativamente, la eliminación del piruvato puede lograrse a través de su reducción a lactato mediante el empleo de lactato deshidrogenasa para desplazar el equilibrio a la amina del producto (véase, por ejemplo, Koszelewski et al., 2008, Adv. Syn. Catal. 350: 2761 – 2766). La eliminación del piruvato puede también lograrse a través de su descarboxilación a dióxido de carbono y acetaldehído empleando piruvato descarboxilasa (véase, por ejemplo, Höhne et al., al, 2008, Chem BioChem 9: 363 – 365).

[0231] En algunas realizaciones, cuando se elige el dador del grupo amino da lugar a un subproducto carbonilo que tiene una presión de vapor mayor que el agua (por ejemplo, un coproducto de baja ebullición como un compuesto de carbonilo orgánico volátil), el subproducto carbonilo puede eliminarse por inyección de la solución de reacción con un gas no reactivo o aplicando un vacío para disminuir la presión de reacción y eliminar el subproducto carbonilo presente en la fase de gas. Un gas no reactivo es un gas que no reacciona con los componentes de la reacción. Diversos gases no reactivos incluyen nitrógeno y gases nobles (por ejemplo, gases inertes). En algunas realizaciones, el gas no reactivo es el gas nitrógeno.

[0232] En algunas realizaciones, el dador del aminoácido utilizado en el proceso es una isopropilamina que forma el carbonilo por acetona del producto hasta trasladar el grupo amino al aceptor del grupo amino. La acetona puede eliminarse por inyección con gas nitrógeno o aplicando un vacío a la solución de reacción y eliminando la acetona de la fase de gas por una trampa de acetona, como un condensador o cualquier otra trampa de frío. Alternativamente, la acetona puede eliminarse por reducción a isopropanol utilizando una cetorreductasa.

[0233] En algunas realizaciones de los procesos anteriormente descritos donde se elimina el subproducto carbonilo, el correspondiente dador del grupo amino puede añadirse durante la reacción de transaminación para completar el dador del grupo amino y / o mantener el pH de la reacción. La adición del dador del grupo amino también desplaza el equilibrio hacia la formación del producto, incrementado de este modo la conversión del sustrato en producto. Por consiguiente, en algunas realizaciones en el que el dador del grupo amino es una isopropilamina y el producto de acetona se elimina in situ, la isopropilamina puede añadirse a la solución para completar el dador del grupo amino perdido durante la eliminación de la acetona y mantener el pH de la reacción (por ejemplo, 8,5). Alternativamente, en realizaciones en las que se utilizan los aminoácidos como dador del grupo de amino, el subproducto cetoácido carbonilo puede volver a reciclarse en el aminoácido por reacción con amoniaco y NADH utilizando una enzima deshidrogenasa adecuada del aminoácido, añadiendo así el dador del grupo amino.

[0234] En algunas realizaciones, el proceso para convertir el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –ona) al producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –amina comprende poner en contacto el sustrato de cetoamida entre 10 y 50 g/L con 1 y 20 g/L de una transaminasa descrita anteriormente en condiciones de reacción del pH entre 7,5 y 9,0 y una temperatura que oscila entre 30 ºC y 50 ºC en presencia de una isopropilamina de entre 1 M y 2 M, en el que al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 92 %, el 94 %, el 96 % o el 98 % o más del sustrato de cetoamida se convierte en producto en 24 horas. En algunas realizaciones, el polipéptido de transaminasa capaz de realizar la reacción anterior comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a las SEC ID N: 80, 86, 96, 98, 100, 102, 110 o

166.

[0235] En algunas realizaciones, los procesos descritos anteriormente pueden además comprender la etapa de aislar el compuesto de la fórmula estructural (I), el compuesto de la fórmula estructural (1) o el compuesto de la fórmula estructural (1a) del disolvente de reacción.

[0236] En algunas realizaciones, los procesos descritos anteriormente pueden además comprender una etapa de convertir el compuesto de la fórmula estructural (1) o el compuesto de la fórmula estructural (1a) en una sal farmacéuticamente aceptable poniendo en contacto el componente con un ácido farmacéuticamente aceptable en un disolvente de reacción adecuado. En algunas realizaciones, el ácido farmacéuticamente aceptable es un ácido fosfórico y una sal farmacéuticamente aceptable es una sal de dihidrógeno – fosfato. En algunas realizaciones, la sal de (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 –

[0237] En algunas realizaciones, en un proceso para la preparación de (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –amina monohidrato

25 de fosfato (1:1), la mejora en el proceso comprende una etapa de conversión del compuesto de la fórmula (1a) al compuesto de la fórmula (2a) con un polipéptido de transaminasa de la divulgación en presencia de un dador del grupo amino en un disolvente orgánico adecuado en condiciones de reacción adecuadas en el que el compuesto de la fórmula (1a) es:

y el compuesto de la fórmula (2a) es:

[0238]

isopropilamina.

55 [0239] Los procedimientos para preparar diversas sales se describen en las patentes US Nº 7.326.708 y

7.468.459. Un proceso para preparar el monohidrato de fosfato de Sitagliptina se presenta en el Ejemplo 13.

[0240] En algunas realizaciones, los procesos pueden además comprender una etapa de cristalización de una sal farmacéuticamente aceptable del disolvente de reacción.

[0241] Se revela también en el presente documento que son composiciones de las transaminasas y sustratos / productos. En algunas realizaciones, las composiciones pueden comprender el compuesto de la fórmula (I), el compuesto de la fórmula (1) o el compuesto de la fórmula (1a) y una transaminasa mejorada de la divulgación.

65 Cualquiera de las transaminasas modificadas pueden formar parte de la composición.

44 5

[0242] En algunas realizaciones, la composición puede comprender el compuesto de la fórmula (II), el compuesto de la fórmula (2) o el compuesto de la fórmula (2a) y una transaminasa mejorada descrita en el presente documento.

[0243] En algunas realizaciones, las composiciones pueden además comprender un dador del grupo amino, por ejemplo, de la fórmula (3). En algunas realizaciones de las composiciones, el dador del grupo amino puede comprender isopropilamina, alanina, 3 – ácido aminobutírico o metilbencilamina. En algunas realizaciones de las composiciones, el dador del grupo amino es una isopropilamina.

EJEMPLOS

[0244] En los siguientes ejemplos representativos, se ilustran diferentes características y realizaciones de la divulgación con carácter ilustrativo y no limitantes.

Ejemplo 1:Adquisición de genes transaminasa de tipo salvaje y construcción de vectores de expresión.

[0245] La transaminasa (TA) que codifica a los genes diseñados para la expresión en E. coli basado en la secuencia de aminoácidos citada de la transaminasa y un algoritmo de optimización de codón se describe en el Ejemplo 1 de la Solicitud de la publicación de la patente de US 20080248539. Los genes se sintetizaron utilizando oligonucleótidos compuestos normalmente por 42 nucleótidos y el gen clonado en el vector de expresión pCK110700 (representado como Fig. 1 en la Solicitud de publicación de la patente de US 20050153417) o pCK110900 (representado como Fig. 3 en la Solicitud de publicación de la patente de US 20060195947) bajo control de un activador lac. Este vector de expresión contiene también el origen de replicación de P15a y un gen de resistencia al cloranfenicol. Los plásmidos resultantes se transformaron en E. coli W3110 utilizando procedimientos estándar. Los genes optimizados del codón y los polipéptidos codificados se enumeran en la Tabla 2 y sus secuencias se presentan como SEC ID Nº: 1 y 2.

[0246] Del mismo modo, los genes que codifican las transaminasas modificada de la presente divulgación enumeradas en la Tabla 2 (SEC ID Nº: 3 – 168) se clonaron en el vector pCK110700 o en el pCK110900 para la expresión en E. coli W3110.

Ejemplo 2: Producción de polvos de transaminasa – procedimiento del matraz oscilante.

[0247] Una única colonia microbiana de E. coli contiene un plásmido que codifica una transaminasa de interés inoculada en 50 mL de caldo de Luria Bertani que contiene 30 μg/ mL de cloranfenicol y un 1 % de glucosa. Las células se cultivaron durante la noche (al menos 16 horas) en un incubador a 30 ºC con agitación a 250 rpm. El cultivo se diluyó en 250 mL de M9YE (1,0 g/L de cloruro de amonio, 0,5 g/L de cloruro de sodio, 6,0 g/L de monohidrógeno fosfato disódico, 3,0 g/L dihidrógeno de fosfato de potasio, 2,0 g/L de extracto de levadura de Tastona – 154, 1 L/L de agua desionizada) que contiene 30 μg/ mL de cloranfenicol y 100 μM de piridoxina en un matraz de 1 L con una densidad óptica de 0,2 a 600 nm (DO600) y se dejó crecer a 30 ºC. La expresión del gen transaminasa se indujo por adición del isopropil – β – D – 1 tiogalactósido (IPTG) a una concentración final de 1mM cuando la DO600 del cultivo sea entre 0,6 y 0,8 y la incubación continuó durante la noche (al menos 16 horas). Las células se extrajeron por centrifugación (5.000 rpm, 15 min, 4 ºC) y se descartó el sobrenadante. El pellet celular se resuspendió con un mismo volumen de frío (4 ºC) en un tampón de 100 mM de trietanolamina (cloruro), un pH de 7,5 que contiene 100 o 500 μM 5 – fosfato de piridoxal (PLP) y se extrajo por centrifugación como se ha dicho anteriormente. Las células lavadas se resuspendieron en dos volúmenes de tampón de trietanolamina fría (cloruro) que contiene PLP y se pasaron a través de una prensa francesa dos veces a 12.000 psi mientras que se mantuvo a 4 ºC. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación (9.000 rpm, 45 min, 4 ºC). El sobrenadante del lisado claro se recogió y se conservó a 20 ºC. La liofilización del lisado claro congelado proporcionó un polvo seco de una enzima transaminasa cruda. Alternativamente, el pellet celular (antes o después del lavado) puede conservarse entre 4 ºC y 80 ºC.

Ejemplo 3: Producción de transaminasa – procedimiento de fermentación

[0248] Una única colonia microbiana de E. coli contiene un plásmido con un gen transaminasa de interés inoculado en 2 mL de caldo M9YE (1,0 g/L cloruro de amonio, 0,5 g/L de cloruro de sodio, 6,0 g/L de monohidrógeno fosfato disódico, 3,0 g/L dihidrógeno de fosfato de potasio, 2,0 g/L de extracto de levadura de Tastona – 154, 1 L/L de agua desionizada) que contiene 30 μg/ mL de cloranfenicol y un 1 % de glucosa. Las células se cultivaron durante la noche (al menos 12 horas) en un incubador a 37 ºC con agitación a 250 rpm. Tras el cultivo durante la noche, 0,5 mL de dicho cultivo se diluyó en 250 mL de caldo M9YE que contiene 30 μg/ mL de cloranfenicol y un 1 % de glucosa en un matraz de 1 L y se dejó crecer a 37 ºC con una agitación de 250 rpm. Cuando la DO600) del cultivo oscile entre 0,5 y 1,0, se eliminan las células del incubador y a continuación bien se utilizan inmediatamente, bien se conservan a 4 ºC.

[0249] Las fermentaciones de escala experimental se llevaron a cabo a 30 ºC en un fermentador de 15 L ventilado y agitado utilizando 6,0 L de medio de crecimiento (0,88 g / L sulfato de amonio, 0,98 g / L de citrato de sodio, 12,5 g / L de tihidrato de hidrógeno de fosfato de dipotasio, 6,25 g / L dihidrógeno de fosfato de potasio, 3,3 g / L de

45 5

extracto de levadura de Tastona – 154, 0,083 g / L de citato de amonio férrico, 8,3 ml / L de una solución de elementos traza que contiene 2 g / L de cloruro de calcio dihidratado, 2,2 g / L de sulfato de zinc heptahidratado, 0,5 g / L de sulfato de manganeso monohidratado, 1 g / L de sulfato de cobre heptahidratado, 0,1 g / L molibdato de amonio tetrahidratado y 0,02 g / L tetraborato de sodio. El recipiente se esterilizó a 121 ºC y 15 PSI durante 30 minutos, después de la esterilización se añadió 100 μM de piridoxina. El fermentador se inoculó en un cultivo exponencial tardío de E. coli W3110 que contiene un plásmido que codifica el gen transaminasa de interés (cultivado en un matraz oscilante descrito anteriormente para iniciar la OD600 entre 0,5 y 1,0. El fermentador se agitó entre 250

–: 1250 rpm y se suministró aire al recipiente de fermentación entre 0,6 – 25 L / min para mantener un nivel de saturación de oxígeno disuelto del 50 % o mayor. El pH del cultivo se mantuvo a 7,0 añadiendo el 20 % v / v de hidróxido de amonio. El crecimiento del cultivo se mantuvo añadiendo una solución de alimentación que contiene 500 g / L de cerelosa dextrosa, 12 g / L de cloruro de amonio y 5,1 g / L de sulfato de magnesio heptahidratado. Una vez que el cultivo alcanzó una OD600 de 70 + – 10, la expresión de la transaminasa se indujo por adición de isopropil

–: β – D – 1 tiogalactósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM y la fermentación continuó durante otras 18 horas. El cultivo se enfrió hasta los 4 ºC y se mantuvo a esa temperatura hasta la extracción. Las células se recogieron por centrifugación a 5.000 G durante 40 minutos en una centrifugadora Sorval RC12BP a 4 ºC. Las células extraídas se utilizaron directamente en el siguiente proceso de recuperación de aguas abajo o pueden conservarse a 4 ºC o incluso congelarse a – 80 ºC hasta dicha utilización.

[0250] El pellet celular se resuspendió en 2 volúmenes de tampón de 100 mM de trietanolamina (cloruro), un pH de 7,5 que contiene 100 o 500 μM de 5 – fosfato de piridoxal (PLP) a 4 ºC en cada volumen de pasta celular húmeda. La transaminasa intracelular se liberó de las células pasando por la suspensión a través de un homogeneizador dotado con un conjunto de válvulas de homogeneización de dos etapas utilizando una presión de

12.000 psig. El homogenado celular se enfrió a – 20 ºC inmediatamente después de la alteración. Una solución del 11 % p / v de polietileneimina con pH 7,2 se añadió al lisado a una concentración final del 0,5 % p / v. Una solución de Na2SO4 1 M se añadió al lisado a una concentración final de 100 mM. A continuación , el lisado se agitó durante 30 minutos. La suspensión resultante se aclaró por centrifugación a 5.000 G en una centrifugadora de Sorval RC12BP a 4 ºC durante 30 minutos. El sobrenadante claro se decantó y se concentró 10 veces utilizando una membrana de ultrafiltración de celulosa con un peso molecular cortado de 30 kD. El concentrado final se distribuyó en recipientes poco profundos, se congeló a – 20 ºC y se liofilizó a polvo. El polvo de transaminasa se conservó a – 80 ºC.

Ejemplo 4: Cribado de alto rendimiento para identificar variantes de la transaminasa Arthrobacter sp. KNK168 capaz de convertir estereoselectivamente un sustrato de cetoamida en Sitagliptina.

[0251] Método por HPLC aquiral para determinar la conversión del sustrato de cetoamida en Sitagliptina:

La conversión enzimática del sustrato de cetoamida (preparada como se describe en la patente de US Nº 7.326.708) en Sitagliptina se determinó utilizando una HPLC Agilent 1200 equipada con una columna de Agilent Eclipse XDB – C8 (4,6 x 150 mm, 5 μm), que utiliza 45:55 10 mM de NH4Ac/MeCN como eluyente con una velocidad de flujo de 1,5 ml / min y una temperatura de columna de 40 ºC. Tiempo de retención: para el sustrato de cetoamida, 1,7 min, para la Sitagliptina 1,4 min. El sustrato de cetoamida y el producto en el eluyente se determinaron como área pico a 210 nm o 286 nm con una longitud de trayectoria de 1 cm. Utilizando estas condiciones, el límite de detección de la Sitagliptina fue de 5 μg/mL. Normalmente, se utilizó una longitud de onda incidente de 210 nm para medir la actividad de las transaminasas con una actividad similar o igual a la de la SEC ID Nº 4.

[0252] Método por HPLC quiral para determinar la estereopureza de la Sitagliptina: La pureza estereoisomérica de la Sitagliptina se determinó utilizando una HPLC Agilent 1200 equipada con una columna de Daicel Chiralpak AD – H (4,6 x 150 mm, 5 μm) que utiliza 60:40:0,1:0,1 de EtOH / heptano / dietilamina / agua como eluyentes con una velocidad de flujo de 0,8 ml/min y una temperatura de columna de 35 ºC. Tiempo de retención: para el sustrato de cetoamida 6,3 min; para el enantiómero – (S) 8,4 min y para la Sitagliptina 10,8 min. El sustrato de cetoamida y el producto se determinaron como área pico a 210 nm o 286 nm con una longitud de trayectoria de 1 cm.

[0253] Cromatografía líquida – espectrometría de masas (LC/MS) método para detectar la conversión de bajo nivel del sustrato de cetoamida en Sitagliptina: La conversión enzimática de bajo nivel del sustrato de cetoamida en Sitagliptina se determinó utilizando un método de LC/MS/MS. Cinco microlitros de muestra se cargaron en una columna HPLC Eclipse XDB – C8 (4,6 x 150 mm) y se eluyeron isocráticamente con una fase móvil de 40: 60 con 0,2 % de formiato de amonio y metanol en 1,0 mL / min. El tiempo de retención de la Sitagliptina fue de 1,5 min a 35 ºC. La espectrometría de masas se utilizó para detectar en un triple cuadrupolo Quattro de Waters. Se estableció Q1 para pasar el ión M + H a 408,1 y Q3 se estableció para pasar el ión hija a 235,1. La celda de colisión (Q2) tuvo una energía de colisión de 17,0 y el flujo de gas argón fue de 0,3 mL / min. La ionización fue por APCI con una descarga de corona de 5 μA, la temperatura de la fuente fue de 130 ºC y la temperatura de la sonda de 600 ºC. El flujo de gas de la desolvatación fue de 100 L / min y el gas de cono se estableció en 50 L / min. Utilizando estas condiciones, el límite de detección de la Sitagliptina fue de 71 pg / mL.

Ejemplo 5: Cribado de alto rendimiento para identificar variantes de la transaminasa Arthrobacter sp. KNK168 capaz de convertir estereoselectivamente un sustrato de cetoamida en Sitagliptina.

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[0254] El gen que codifica la transaminasa, construido como se describe en el Ejemplo 1, se mutagenizó utilizando métodos descritos anteriormente y la población de moléculas de ADN alteradas se utilizaron para transformar una cepa huésped de E. coli adecuada. Se seleccionaron trasnformantes resistentes a los antibióticos y se procesaron para identificar aquellos que expresan una transaminasa con una capacidad mejorada para transaminar el sustrato de cetoamida estereoselectivamente en Sitagliptina en presencia de un dador del grupo amino adecuado (es decir; isopropilamina). La selección celular, el cultivo, la expresión inducida de las enzimas variantes transaminasa y la colección de los pellets celulares se describen a continuación.

[0255] Las colonias de E. coli recombiante que llevan un gen que codifica la transaminasa se recogieron utilizando un robot seleccionador de colonias Q – Bot® (Genetix USA, Inc., Boston, Ma) en placas de microtítulos de 96 pocillos poco profundos que contienen en cada pocillo 180 μL de caldo de LB, un 1 % de glucosa y 30 μg / mL de cloranfenicol (CAM). Las células se cultivaron toda la noche a 30 ºC con agitación a 200 rpm. Una alícuota de 10 μL de este cultivo se transfirió luego a placas de 96 pocillos profundos que contienen 390 μL de caldo de M9YE, 100 μM de piridoxina y 30 μg / mL de CAM. Tras la incubación de las placas de pocillo profundas a 30 ºC con agitación a 250 rpm durante 2 – 3 horas, la expresión del gen recombinante en las células cultivadas se indujeron por adición de IPTG a una concentración final de 1 nM. Las placas se incubaron a 30 ºC con agitación a 250 rpm durante 18 horas.

[0256] Las células se paletizaron por centrifugación (4.000 rpm, 10 min, 4 ºC), se resuspendieron en un tampón de lisis de 200 μL y se lisaron por agitación a temperatura ambiente durante 2 horas. El tampón de lisis contenía un tampón de 100 mM de trietanolamina (cloruro), un pH 7,5 o 8,5, 1 mg/mL de lisozima, 500 μg / mL de sulfato de polimixina B (PMBS) y entre 100 y 400 μM de PLP. Tras sellar las placas con aluminio/ cinta de sellado térmico de laminado de propileno (Velocity 11, Menlo Park, CA, Cat# 06643 – 001), se agitó fuertemente durante 2 horas a temperatura ambiente. Los restos celulares se paletizaron por centrifugación (4.000 rpm, 10 min, 4 ºC) y el sobrenadante claro se analizó directamente o se conservó a 4 ºC hasta su utilización.

[0257] Para el cribado en metanol o DMSO en un pH de 7,5, con transaminasas modificadas en fase inicial (es decir, quot; envolventesquot; en fase inicial), una alícuota de 10 μL de una solución de sustrato de cetoamida (40 mg / mL) en metanol o DMSO se añadieron a cada pocillo de una placa de pocillos profundos de Costar®, seguido tras la adición de 90 μL de hidrocloruro de isopropilamina 1,1 M utilizando un instrumento robótico de Biomek NXp (Beckrnan Coulter, Fullerton, CA). A este le siguió la adición de 100 μL del sobrenadante de lisado recuperado, también se realizó utilizando el Biomek NXp para proporcionar una reacción que comprende 2 mg / ml de sustrato de cetoamida, 500 mM de clorhidrato de amina isopropil, 50 mM de trietanolamina, con un pH de 7,5, y 5 % de metanol

o DMSO (v / v). Las placas se termosellaron con aluminio / cinta de sellado térmico de laminado de polipropileno (Velocity 11, Menlo Park, CA, Cat # 06643–001) a 175 ºC durante 2,5 segundos y se agitó durante la noche (al menos 16 horas) a 30 ºC. Las reacciones se enfriaron mediante la adición de 1 ml de acetonitrilo utilizando un robot manipulador de líquidos Phoenix (Art Robbins Instruments, Sunnyvale, CA). Las placas se volvieron a sellar herméticamente, se agitaron durante 5 min, y después se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 min. Una alícuota de 200 μL de la mezcla de reacción aclarada se transfirió a una nueva placa de polipropileno de pocillo poco profundo (Costar # 3365), se selló y se analizó como se describe en el Ejemplo 4.

[0258] Para el cribado en el 25 % de DMSO con un pH de 8,5 con transaminasas la modificadas en última fase (es decir, quot; envolventesquot; de última etapa), se añadió una alícuota de 50 μL de una solución de sustrato de cetoamida (400 mg / mL) en dimetilsulfóxido (DMSO) a cada pocillo de una placa de pocillos profundos de Costar® tras la adición de 50 μL de hidrocloruro de isopropilamina 4 Mutilizando un instrumento robótico de Biomek NX ( Beckrnan Coulter, Fullerton, CA). A continuación se añadió 100 μL del sobrenadante de lisado recuperado, también se realizó utilizando el Biomek NX para proporcionar una reacción que comprende 100 mg / ml de sustrato de cetoamida, hidrocloruro de amina isopropilo 1 M, 50 mM de trietanolamina, un pH de 8,5 y 25 % de DMSO ( v / v ). Las placas se termosellaron con aluminio / cinta de sellado térmico de laminado de polipropileno (Velocity 11, Menlo Park, CA, Cat # 06643–001) a 175 ºC durante 2,5 segundos y luego se agitó durante la noche (al menos 16 horas) a 30 ºC. Las reacciones se enfriaron mediante la adición de 1 ml de acetonitrilo utilizando un robot manipulador de líquidos Phoenix (Art Robbins Instruments, Sunnyvale, CA). Las placas se volvieron a sellar herméticamente, se agitaron durante 5 min, y después se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 min. Una alícuota de 10 μL de la mezcla de reacción aclarada se transfirió a una nueva placa de polipropileno de pocillo poco profundo (Costar # 3365) que contiene 190 μL de acetonitrilo, se selló y se analizó como se describe en el Ejemplo 4.

[0259] Para el cribado en el 50 % de DMSO con un pH de 8,5 con transaminasas modificadas en última fase (es decir, quot; envolventesquot; de última etapa), se añadió una alícuota de 100 μL de una solución de sustrato de cetoamida (100 mg / mL) en dimetilsulfóxido (DMSO) a cada pocillo de una placa de pocillos profundos de Costar® tras la adición de 50 μL de hidrocloruro de isopropilamina 4 M utilizando un instrumento robótico de Biomek NX ( Beckrnan Coulter, Fullerton, CA). A continuación se añadió 50 μL del sobrenadante de lisado recuperado, también se realizó utilizando el Biomek NX para proporcionar una reacción que comprende 50 mg / ml de sustrato de cetoamida, hidrocloruro de amina isopropilo 1 M, 50 mM de trietanolamina, un pH de 8,5 y 50 % de DMSO ( v / v ). Las placas se termosellaron con aluminio / cinta de sellado térmico de laminado de polipropileno (Velocity 11, Menlo Park, CA, Cat # 06643–001) a 175 ºC durante 2,5 segundos y luego se agitó durante la noche (al menos 16 horas) a 30 ºC. Las reacciones se enfriaron mediante la adición de 1 ml de acetonitrilo utilizando un robot manipulador de líquidos

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Phoenix (Art Robbins Instruments, Sunnyvale, CA). Las placas se volvieron a sellar, se agitaron durante 5 min y se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 min. Una alícuota de 10 μL de la mezcla de reacción aclarada se transfirió a una nueva placa de polipropileno de pocillo poco profundo (Costar # 3365) que contiene 190 μL de acetonitrilo, se selló y se analizó como se describe en el Ejemplo 4.

[0260] La transaminasa de la SEC ID Nº 2 expresada en los Ejemplos 1 y 2 no exhibió actividad detectable sobre el sustrato de cetoamida utilizando los métodos de detección del Ejemplo 4. Las variantes de la transaminasa Arthrobacter sp. KNK168 capaz de convertir el sustrato de cetoamida en Sitagliptina se identificaron utilizando los procedimientos y los métodos revelados anteriormente. Numerosas repeticiones de estos procesos en los que se utilizaron uno o más aislados mejorados de una ronda se utilizaron como material de partida para las siguientes rondas de mutagénesis y cribado, se utilizaron para desarrollar o quot;evolucionarquot; las variantes de transaminasa Arthrobacter sp. KNK168 con una capacidad mejorada para reducir el sustrato de cetoamida estereoselectivamente en Sitagliptina.

Ejemplo 6:Transaminación estereoselectiva en metanol del sustrato de cetoamida por transaminasas modificadas designadas como “+” en la Tabla 2 derivada de la transaminasa Arthrobacter sp. KNK168.

[0261] Las transaminasas mejoradas designadas como “+” en la Tabla 2 derivadas de la transaminasa Arthrobacter sp. KNK168 se analizaron a continuación en una escala experimental en DMSO. Una solución de 500 μL de variante transaminasa (20 mg / mL) en un tampón de 100 mM de cloruro de trietanolamina con pH de 7,5 con 250 μM de 5 – fosfato de piridoxal se añadió a un vial de reacción de 5 mL equipado con una barra de agitación magnética. Posteriormente se añadió a la solución de transaminasa 450 μL de hidrocloruro de isopropilamina 1,1 M, seguido de 50 μL de solución de sustrato de cetoamida (40 mg / mL) en DMSO. La reacción se mezcló a 22 ºC y se controló mediante un análisis por HPLC de las muestras tomadas periódicamente de la mezcla de reacción (véase el Ejemplo 4 para condiciones analíticas). La Tabla 2 presenta la SEC ID Nº correspondiente a las variantes transaminasas designadas como “+”, el número de diferencias en los residuos de aminoácidos de las transaminasas de tipo salvaje y la actividad de cada uno de los sustratos de cetoamida respecto a la de la enzima que posee una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 4.

[0262] Para algunas de las transaminasas modificadas, la conversión del sustrato de cetoamida en Sitagliptina puede también lograrse utilizando dadors del grupo amino como la D – alanina, 3 – ácido aminobutírico o α – metilbencilamina en una concentración adecuada.

Ejemplo 7: Transaminación estereoselectiva en metanol del sustrato de cetoamida por transaminasas modificadas designadas como “++” en la Tabla 2 derivadas de Arthrobacter sp. KNK168.

[0263] Las transaminasas mejoradas designadas como “++” en la Tabla 2 derivadas de las variantes Arthrobacter sp. KNK168 se analizaron a continuación en una escala experimental. Una solución de 500 μL de variante transaminasa (20 mg / mL) en un tampón de 100 mM de cloruro de trietanolamina con pH de 7,5 con 250 μM de 5 – fosfato de piridoxal se añadió a un vial de reacción de 5 mL equipado con una barra de agitación magnética. Posteriormente se añadió a la solución de transaminasa 450 μL de idrocloruro de isopropilamina 1,1 M, seguido de 50 μL de solución de sustrato de cetoamida (40 mg / mL) en metanol. La reacción se mezcló a 22 ºC y se controló mediante un análisis por HPLC de las muestas tomadas periódicamente de la mezcla de reacción (véase el Ejemplo 4 para condiciones analíticas). La Tabla 2 presenta la SEC ID Nº correspondiente a las variantes transaminasas designadas como “++”, el número de diferencias en los residuos de aminoácidos de las transaminasas de tipo salvaje y la actividad de cada uno de los sustratos de cetoamida respecto a la de la enzima que posee una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 4.

Ejemplo 8: Transaminación estereoselectiva en metanol del sustrato de cetoamida por transaminasas modificadas designadas como “+++” en la Tabla 2 derivadas de Arthrobacter sp. KNK168.

[0264] Las transaminasas mejoradas designadas como “+++” en la Tabla 2 derivadas de las variantes Arthrobacter sp. KNK168 se analizaron a continuación en una escala experimental en metanol. Una solución de 500 μL de variante transaminasa (20 mg / mL) en un tampón de 100 mM de cloruro de trietanolamina con pH de 7,5 con 250 μM de 5 – fosfato de piridoxal se añadió a un vial de reacción de 5 mL equipado con una barra de agitación magnética. Posteriormente se añadió a la solución de transaminasa 450 μL de hidrocloruro de isopropilamina 2,2 M, seguido de 50 μL de solución de sustrato de cetoamida (100 o 200 mg / mL) en metanol. La reacción se mezcló a 30 ºC y se controló mediante un análisis por HPLC de las muestras tomadas periódicamente de la mezcla de reacción (véase el Ejemplo 4 para condiciones analíticas). La Tabla 2 presenta la SEC ID Nº correspondiente a las variantes transaminasas designadas como “+++”, el número de diferencias en los residuos de aminoácidos de las transaminasas de tipo salvaje y la actividad de cada uno de los sustratos de cetoamida respecto a la de la enzima que posee una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 22.

Ejemplo 9: Transaminación estereoselectiva en metanol del sustrato de cetoamida por transaminasas modificadas designadas como “++++” en la Tabla 2 derivadas de Arthrobacter sp. KNK168.

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[0265] Las transaminasas mejoradas designadas como “++++” en la Tabla 2 derivadas de las variantes Arthrobacter sp. KNK168 se analizaron a continuación en una escala experimental en metanol. Una solución de 500 μL de variante transaminasa (20 mg / mL) en un tampón de 100 mM de cloruro de trietanolamina con pH de 8,5 con 250 μM de 5 – fosfato de piridoxal se añadió a un vial de reacción de 5 mL equipado con una barra de agitación magnética. Posteriormente se añadió a la solución de transaminasa 400 μL de hidrocloruro de isopropilamina 2,5 M, seguido de 100 μL de solución de sustrato de cetoamida (200 mg / mL) en metanol. La reacción se mezcló a 45 ºC y se controló mediante un análisis por HPLC de las muestas tomadas periódicamente de la mezcla de reacción (véase el Ejemplo 4 para condiciones analíticas). La Tabla 2 presenta la SEC ID Nº correspondiente a las variantes transaminasas designadas como “++++”, el número de diferencias en los residuos de aminoácidos de las transaminasas de tipo salvaje y la actividad de cada uno de los sustratos de cetoamida respecto a la de la enzima que posee una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 48.

Ejemplo 10: Transaminación estereoselectiva en DMSO del sustrato de cetoamida por transaminasas modificadas designadas como “+++++” en la Tabla 2 derivadas de Arthrobacter sp. KNK168.

[0266] Las transaminasas mejoradas designadas como “+++++” en la Tabla 2 derivadas de las variantes Arthrobacter sp. KNK168 se analizaron a continuación en una escala experimental en DMSO. Una solución de 250 μL de variante transaminasa (20 mg / mL) en un tampón de 100 mM de cloruro de trietanolamina con pH de 8,5 con 250 μM de 5 – fosfato de piridoxal se añadió a un vial de reacción de 5 mL equipado con una barra de agitación magnética. Posteriormente se añadió a la solución de transaminasa 500 μL de hidrocloruro de isopropilamina 2 M, seguido de 250 μL de solución de sustrato de cetoamida (200 mg / mL) en DMSO. La reacción se mezcló a 45 ºC y se controló mediante un análisis por HPLC de las muestras tomadas periódicamente de la mezcla de reacción (véase el Ejemplo 4 para condiciones analíticas). La Tabla 2 presenta la SEC ID Nº correspondiente a las variantes transaminasas designadas como “+++++”, el número de diferencias en los residuos de aminoácidos de las transaminasas de tipo salvaje y la actividad de cada uno de los sustratos de cetoamida respecto a la de la enzima que posee una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 58.

Ejemplo 11: Transaminación estereoselectiva en DMSO del sustrato de cetoamida por transaminasas modificadas designadas como “++++++” en la Tabla 2 derivadas de Arthrobacter sp. KNK168.

[0267] Las transaminasas mejoradas designadas como “++++++” en la Tabla 2 derivadas de las variantes Arthrobacter sp. KNK168 se analizaron a continuación en una escala experimental en DMSO. Una solución de 250 μL de variante transaminasa (8 mg / mL) en un tampón de 100 mM de cloruro de trietanolamina con pH de 8,5 con 4000 μM de 5 – fosfato de piridoxal se añadió a un vial de reacción de 5 mL equipado con una barra de agitación magnética. Posteriormente se añadió a la solución de transaminasa 250 μL de hidrocloruro de isopropilamina 4 M, seguido de 500 μL de solución de sustrato de cetoamida (100 mg / mL) en DMSO. La reacción se mezcló a 45 ºC y se controló mediante un análisis por HPLC de las muestras tomadas periódicamente de la mezcla de reacción (véase el Ejemplo 4 para condiciones analíticas). La Tabla 2 presenta la SEC ID Nº correspondiente a las variantes transaminasas designadas como “++++++”, el número de diferencias en los residuos de aminoácidos de las transaminasas de tipo salvaje y la actividad de cada uno de los sustratos de cetoamida respecto a la de la enzima que posee una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 104.

Ejemplo 12: Proceso I para la conversión del sustrato de cetoamida en Sitagliptina

[0268] El siguiente ejemplo ilustra un proceso a gran escala utilizado para incrementar la conversión del sustrato 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –ona en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –amina. En este proceso se utiliza la inyección mediante nitrógeno para eliminar el coproducto de acetona e incrementa la conversión del sustrato en el producto. La adición de isopropilamina en agua ayuda a mantener constante el volumen y mantiene el pH de la reacción.

[0269] El proceso a gran escala contiene los siguientes componentes de reacción:

Sustrato de cetoamida:: 20 g (98 %) (48,2 nmol)

Isopropilamina – HCL:: 18,44 g (193 nmol)

Fosfato de piridoxal (PLP): 200 mg (98 %) (0,79 nmol)

Transaminasa (SEC ID Nº 86):: 2,2 g

Trietanolamina 0,1 M pH 8,5:: 140 mL

DMSO:: 20 mL + 40 mL

4 M iPr amina (base libre):: 38,5 mL

[0270] Proceso: A un matraz redondo de tres bocas (RB) de 500 mL con 4 deflectores y equipado con un mezclador, sonda de pH, sonda de temperatura, aguja para la inyección mediante nitrógeno y una aguja de vacío, se añadió 18,25 g de hidrocloruro de isopropilamina (4 equiv.) seguido de 200 mg de 5 – fosfato de piridoxal (vitamina B6). Esto se disolvió en 140 mL de pH 8,5, con agua tamponada de trietanolamina 0,1 M. Se añadió DMSO (20 ml) seguido por 2 g de polvo de enzima transaminasa (SEC ID Nº 86). Se aumentó la temperatura de la solución hasta

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alcanzar 45 ºC y el pH se ajustó de nuevo a 8,5 con isopropilamina 4 M acuosa. Una vez estabilizada (~ 5 min) se añadió una solución de 20 g de sustrato disuelto en 40 mL de DMSO durante 3 horas. Durante la adición, y a lo largo de la reacción, el pH se redujo de manera constante. El pH se controló por la adición continua de isopropilamina 4 M acuosa cuando el pH disminuye más de 0,1 unidades. Además, el nitrógeno se inyectó en la reacción entre 2 horas y 12 horas. Tras 21 horas, la conversión era del 93 %. Un total de 38,5 mL de isopropilamina 4 M (3,056 equiv) se añadió a la reacción durante el proceso. La unidad de control de pH tuvo un termopar, una sonda de pH e isopropilamina 4 M en agua para controlar el pH.

[0271] Una impureza de aducto de enamina del sustrato – producto presente en la mezcla del producto (tiempo de retención de 4,1 min en condiciones de separación descritas a continuación) se destruyó por la acidificación de la mezcla en un pH 2,0 con 10,5 mL de HCl 6 N seguido de agitación durante 1 hora a 45 ºC. Posteriormente, se añadieron 6 g de Celite, se agitó otra hora y a continuación se filtró con una almohadilla de Celite (filtro de 85 mm ID, una almohadilla con un grosor de 10 mm de Celite humedecida) con lavados agitados (4 x 30 mL) de agua/DMSO (90/10 con 1 gota de HCl 6 N). Los análisis muestran un rendimiento del 91 % de Sitagliptina y un 7 % de sustrato de cetoamida.

[0272] El producto además se procesó añadiendo 200 mL de acetato de isopropilo (IPAC) seguido de 32 mL de NaOH 5 N y se agitó hasta que el pH fuera ~ 11. Se separaron las capas (35 min sedimentando con emulsión en capa orgánica) y se extrajo la capa acuosa con otros 200 mL de acetato de isopropilo. Se llevó a cabo una extracción final con 100 mL adicionales de acetato de isopropilo. Se combinaron las tres capas de acetato de isopropilo, se dejaron sedimentar durante 30 min y se drenó el agua residual. A continuación se lavó el producto en la capa orgánica con 150 mL de salmuera (sedimenta en lt; 1h), se separó y se secó con Na2SO4 y luego se filtró. El disolvente se cambió a isopropanol (66,29 g de solución de isopropanol (IPA). El análisis del producto final muestra lo siguiente:

26,8 % de p/s de Sitagliptina (17,73 g). 1,89 % de p/s de sustrato de cetoamida (1,25 g). ~ 60,3 mL de IPA

[0273] Las condiciones de HPLC para separar la mezcla del producto fueron las siguientes:

Columna: Zorbax Eclipse Plus C18, 4,6 x 50 mm, 1,8 um

Gradiente: min H2O (0,1 % de H3PO4) / CH3CN

0 90/10

5 5/95

6 5/95

6,01 90/10

8 stop

Flujo: 1,5 mL / min Temperatura de columna: 25 ºC Volumen de la muestra: 5 μL Detector: UV @ 210 nm

[0274] Las muestras para los análisis por HPLC se prepararon en 0,2 mg / mL en 1/1 H2O (0,1 % de H3PO4) / CH3CN. El tiempo de retención en condiciones cromatográficas anteriores fueron las siguientes:

Sitagliptina: 2,2 min Sustrato de cetoamida: 3,2 min Sustrato de cetoamida (enol): 3,9 min Sustrato – producto de enamina: 4,1 min

[0275] La depuración con gas nitrógeno elimina la acetona, el producto de la reacción de transaminación desplaza de este modo el equilibrio de la reacción catalizada de la transaminasa hacia la formación del producto y por lo tanto, hay un mayor porcentaje de conversión del sustrato en el producto. Además, la adición continua de isopropilamina no sólo permite mantener el pH de la condición de reacción sino que rellena el dador del grupo amino perdido en la reacción de transaminación. Aunque el polipéptido de la transaminasa que tiene la SEC ID Nº 86 se utilizó en este proceso, se entiende que este proceso puede emplear cualquiera de las transaminasas modificadas posteriores descritas en el presente documento.

Ejemplo 13: Proceso II para incrementar la conversión del sustrato de cetoamida en Sitagliptina

[0276] El siguiente ejemplo ilustra un segundo proceso a gran escala utilizado para incrementar la conversión del sustrato 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –ona en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –amina. En este proceso se utiliza un vacío para

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eliminar el producto de acetona e incrementar la conversión del sustrato en el producto. Al igual que en el ejemplo anterior, la adición de isopropilamina en agua ayuda a mantener constante el volumen y mantiene el pH de la reacción.

[0277] Materiales

Componente de reacción: Cantidad Equivalencia en moles

Sustrato de cetoamida:: 1000 g (96 %) (2,36 mol) 1,0

Isopropilamina – HCl:: 903 g (9,45 mol) 4,0

Fosfato de piridoxal (PLP): 10 g (98 %) (0,04 mol) 0,017

Transaminasa (SEC ID Nº 102):: 50,0 g

Trietanolamina:: 104 g

DMSO:: 1.5 L + 2 L

isopropilamina 4 M acuosa (base libre): 157 mL

[0278] El equipo para el proceso posee las siguientes características: una unidad de control con un termopar, una sonda de pH y un depósito de isopropilamina 4 M en agua para controlar el pH. El recipiente de reacción está conectado a un sistema de vacío con su correspondiente controlador (ajustado a 375 torr) y una sonda reactor (Metter Toledo, Maryland, USA) para medir la acetona y la formación del producto.

[0279] Proceso: A un matraz redondo de tres bocas (RB) de 22 mL se agitó mecánicamente y se fijó a una sonda Reactor a una línea de alimentación de base conectada al depósito de isopropilamina 4 M acuosa, a una línea de alimentación de cetoamida conectada a un depósito de sustrato de cetoamida, a una sonda de pH y a un sistema de vacío para una unidad de control y una trampa. El matraz se cargó con 900 g de hidrocloruro de isopropilamina seguido por adición de 6,4 L de agua desionizada, 93 mL de trietanolamina (2 m / s de velocidad periférica) y se añadió 10 g de 5 – fosfato de piridoxal (pH 8,4). A continuación se cargó el matraz con 50 g de polipéptido de transaminasa disuelto que tiene la SEC ID Nº 102. Tras 10 min de mezcla a temperatura ambiente, se añadió 1,5 L de DMSO durante 30 min y el reactor se calentó a 40 ºC. Una vez estabilizada la temperatura, la sonda de pH se cambió por una sonda de temperatura y el pH se mantuvo con un pH de 8,5 con un controlador de pH y una solución de isopropilamina de 4 M. El sustrato de cetoamida (1 Kg) se disolvió en 2 L de DMSO y se colocó en un embudo de adición de 5 L. El vacío (~ 500 torr al inicio, después fueron 375 durante la noche tras la adición) se aplicó al recipiente de reacción y la solución de cetoamida se añadió al reactor durante 4 horas (667 mL / h). Un total de 1,45 equiv de isopropilamina se añadió tras 25 horas. Se produjo una conversión de sustrato al producto del 94 %.

[0280] Tras dejar la reacción actuar durante 1 día, se añadieron 580 mL de HCl 5 N a la solución de reacción hasta un pH de 2 y la solución se agitó durante 2 horas a 45 ºC. La solución se filtró en un embudo de Buchner de amplio diámetro utilizando dos capas de tejido de algodón dando como resultado 12,3 kg de filtrado. El residuo filtrado se agitó en un 5 5 de DMSO en HCl 0,01 N y a continuación se aclaró con 3 x 2 L adicionales de 5 % de DMSO en HCl 86,6 kg 0,01 N en total). El residuo se situó en una solución ácida acuosa, se lavó (~ 18 L en total) en un extractor y después se colocó en 9 L de acetato de isopropilo. El pH se ajustó a 10 con NaOH 5 N (1,4 L), la solución se agitó a 165 rpm en un recipiente de ChemGlass de 50 L, se dejó sedimentar las capas durante 10 minutos y se separó el acetato de isopropilo. La solución se volvió a extraer con 9 L de acetato de isopropilo y dichas capas de acetato de isopropilo extraídas se combinaron y se dejaron sedimentar durante 20 horas. Las capas de acetato de isopropilo se lavaron con 6 L de salmuera (5,9 kg). La solución de IPAc se analizó y contenía 861 g de Sitagliptina. El disolvente se cambió de IPAC (861 g en 19 L de IPAC, rendimiento de análisis del 90 %) a IPA en un evaporador rotatorio de vacío durante 1 hora a 30 ºC concentrando el 50 % del volumen En este momento la base libre de Sitagliptina se precipitó fuera de la solución. Se añadió 2 L de un 1% de agua en IPA para disolver el precipitado. Se añadió 8 L de un 1 % de agua en IPA durante 1 hora con una temperatura de baño entre 35 – 40 ºC. Una vez que se forman los precipitados adicionales, se añade 400 mL adicionales de agua para disolver el precipitado. La solución se deja sedimentar en un evaporador rotatorio de vacío durante la noche y después se traslada a otro matraz redondo con 2 L adicionales de un 1 % de agua en IPA. La concentración dio 2,5746 kg de una solución de IPA / agua de Sitagliptina.

Ejemplo 14: Preparación de fosfato de Sitagliptina monohidratado

(Fosfato de Sitagliptina monohidratado)

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65 [0282] Los materiales para la preparación de la sal de fosfato monohidratado de Sitagliptina son los siguientes:

Componente de reacción: Cantidad Equivalencia en moles

Crudo 3: 757 g (1,86 mol) 1,0

45 % p / p de H3PO4: 411 g (1,89 mol) 1,02

Agua: 347 + 491 + 100 mL 0,017

Isopropanol: 1,63 + 1,36 + 0,17 + 0,5 + 0,5 + 1,65 L

Semilla: 1,4 L 0,005

88/12 isopropanol / agua

[0283] Proceso. A una solución que contiene 757 g de crudo 3 en 1630 mL de isopropanol y 347 mL de agua se añadió 1,36 L de isopropanol seguido de 491 mL de agua desionizada. La solución se transfirió a un recipiente de agitación de 20 L y a continuación se cargó con 411 g con un 45 % p / p de H3PO4 (Fisher 85 %) y 172 mL de IPA. La solución se calentó entre 72 y 80 ºC para disolver la sal inicial de fosfato y se cargó con 100 mL adicionales de agua y 500 mL de isopropanol para disolver completamente la sal de fosfato. La solución se enfrió entre 62 y 66 ºC y se sembró con 5 g de fosfato de Sitagliptina puro. La reacción se dejó sedimentar 3 horas a 60 – 65 ºC, a continuación se enfrió a 20 – 25 ºC durante 5 horas y posteriormente durante la noche. La reacción se cargó con 2,65 L de isopropanol durante 2 horas (la solución es ~ 6:1 isopropanol / agua), se dejó reposar 1 hora a temperatura ambiente y 2 horas a 2 ºC. El material se filtró humedeciéndolo con 88/12 de isopropanol / agua. La torta resultante se lavó con un total de 1,4 L de 88/ 12 isopropanol / agua y se secó en atmósfera durante 3 horas, después se transfirió a una bandeja para secarla a ~ 40 ºC en un horno de vacío con barrido con nitrógeno (200 torr) durante 3 días produciendo 966 g de fosfato hidratado de Sitagliptina. El material satisfizo (o excedió) todas las especificaciones de pureza para fabricar fosfato hidratado de Sitagliptina y no muestra un disolvente residual, enzima (lt; 18 ppm), cofactor de PLP (lt; 0,1 ppm) o endotoxina (lt; 0,05 ng).

Ejemplo 15: Proceso III para incrementar la conversión del sustrato de cetoamida en Sitagliptina

[0284] El siguiente ejemplo ilustra un tercer proceso a gran escala utilizado para incrementar la conversión del sustrato 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –ona en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –amina. Normalmente, el proceso utiliza el mismo equipo y condiciones descritas en el Ejemplo 12 aunque con una mayor concentración de DMSO y sustrato.

[0285] Proceso: La reacción se realizó en un recipiente equipado con un agitador mecánico, una sonda de temperatura, una sonda de pH y un sistema de adición de base. El sistema de adición de base se utilizó para controlar el pH entre 8,6 y 8,4 utilizando una base libre de isopropilamina 4 M en agua. Al recipiente se le añadió 1,92 L de agua, seguido de 109 mL (0,82 ml, 0,33 equiv) de trietanolamina y 1,64 L (6,56 mol, 2,67 equiv) de solución de isopropilamina 4 M. El pH se ajustó a 8,5 utilizando Hcl 12 N (424 mL). El reactor se cargó después con 6,7 g (0,027 mol, 0,011 equiv) de PLP seguido por 40 g de polipéptido de transaminasa que tiene la SEC ID Nº 110 y la mezcla se disolvió cuidadosamente con una agitación suave. El recipiente se colocó en el bloque del reactor con la sonda de temperatura, el sistema de adición de base, la sonda de pH y se ajustó a 400 rpm (nota: el lazo de control de pH se encuentra apagado en este momento). A continuación, se añade 2,22 L de DMSO a la solución en agitación y el reactor se calienta a 45 ºC. Cuando se estabiliza la temperatura, el lazo de control de pH se enciende y se ajusta a un pH de 8,5 (pH controlado con isopropilamina 4 M en agua). En este momento, se incrementa la agitación a 600 rpm, aunque la velocidad periférica se mantiene por debajo de los 2 m / s para evitar la agitación excéntrica (vortex). A continuación, se disolvió 1,0 kg (el peso corregido de 1 kg como cetoamida recibida oscila normalmente entre un ps del 96 – 98 % como hemihidrato, 2,46 mol, 1,00 equiv) de cetoamida en un 1,11 L de DMSO. Esta solución de DMSO / cetoamida se añadió al reactor durante 2 – 3 horas. El reactor se agitó a 45 ºC con el pH mantenido entre 8,6 – 8,4 durante otras 13 horas siendo llevada a cabo la eliminación de acetona con 300 torr de vacío y 2 fps de barrido con nitrógeno. Tras ~ 15 horas de tiempo de reacción totales (1,3 – 2,0 equiv de absorción de isopropilamina), la reacción tuvo una conversión del 90 – 95 % según los análisis por HPLC de fase inversa.

[0286] Como se describe a continuación, puede utilizarse una filtración o un procedimiento de tratamiento final de extracción directa para preparar el producto para el proceso aguas abajo.

[0287] Tratamiento final de filtración: El lazo de control de pH se apagó y se añadieron 13 g de Solka – floc al recipiente seguido de HCl 12 M hasta un pH de 2 – 3. La reacción se dejó madurar aproximadamente durante 1 – 2 horas a 45 ºC y a 1000 rpm. La suspensión se filtró (por ejemplo, en un plástico filtrado de Buchner con papel de filtro en una escala de 1 kg o un filtro de chispa sin bucle reciclado en la escala de planta piloto). El recipiente y el filtro se enjuagó con 1 L de 0,01 N HCl. A este filtrado de ácido acuoso se le añadió 3 L de IPAC y el pH de la fase acuosa se ajustó a un pH de 11 con NaOH 19 N. Las capas se agitaron, más tarde se dejaron sedimentar y se separaron (con leve calor o un vacío que acelera la separación de la fase). Esto se repitió dos veces más con 3 L de IPAC y los orgánicos combinados se lavaron con 3 L de salmuera (pH 11). La solución resultante de IPAC de base libre de Sitagliptina se analizó para determinar (rendimiento del análisis entre el 88 – 92 %; 882 –922 g) y el disolvente se cambió a IPA por mediante aguas abajo para producir el fosfato monohidratado de Sitagliptina.

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[0288] Tratamiento final de extracción directa: El lazo de control de pH se apaga y se añadió HCl 12 M hasta conseguir un pH de 2 – 3. La reacción se dejó madurar durante 1 – 2 horas a 45 ºC y a 1000 rpm. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se añadió a continuación 3 L de IPA, seguido de 3 L de IPAC. El pH de la capa acuosa se ajustó a 11 con NaOH 19 N. La mezcla se agitó entre 20 – 45 ºC (el calor puede utilizarse para romper la emulsión), se dejó sedimentar y se separó. La capa IPAc/IPA se apartó y la capa acuosa se extrajo con 3 L de 80/20 (vol / vol) de IPAc / IPA. Los extractos combinados de IPAC/IPA se lavaron con 3 L de salmuera. La solución resultante de IPAc / IPA de la base libre de Sitagliptina se analizó para determinar (rendimiento del análisis entre el 87 – 90 %; 872 –902 g) y el disolvente se cambió a IPA mediante aguas abajo paroducir el fosfato monohidratado de Sitagliptina.

Ejemplo 16: Proceso IV para incrementar la conversión del sustrato de cetoamida en Sitagliptina

[0289] El siguiente ejemplo ilustra un cuarto proceso a gran escala utilizado para incrementar la conversión del sustrato de cetoamida en un producto de base libre de Sitagliptina y la posterior preparación del fosfato de Sitagliptina. Normalmente, el proceso utiliza el mismo equipo y condiciones descritas en los Ejemplos 12, 14 y 15 aunque con algunas modificaciones que se detallan a continuación.

[0290] Se preparó una solución tampón combinada 0,59 L solución de isopropilamina 4 M, 0,67 L de agua y 39 mL de trietanolamina entre 0 – 35 ºC. El pH del tampón se ajustó entre 8,4 – 9,2 a 20 – 25 ºC utilizando ácido clorhídrico 12 N. Esta mezcla se cargó con 1,22 g de PLP y 16,25 g de polipéptido de transaminasa de la SEC ID Nº 110 a 15 – 25 ºC. El PLP y la enzima se disolvieron agitándolos. A continuación, se cargó la mezcla con 0,72 L de DMSO a 15 – 46 ºC mínimo durante 30 minutos. La mezcla enzimática se calentó a 44 – 46 ºC y se ajustó a un pH entre 8,4 – 8,7 con solución isopropilamina 4 M. Hasta que no se enfrió la mezcla enzimática de la siguiente reacción, se controló el pH y se cargó en cuanto fuese necesario solución de isopropilamina 4 M para mantener el pH dentro del intervalo 8,4 – 8,7.

[0291] El sustrato de cetoamida, 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5,6 – dihidro [1,2,4] triazol [4,3 – a] pirazina – 7 (8H) – il] – 1 – (2,4,5 – trifluorofenil) butan – 2 –ona (406,28 g, 1,00 mol) se disolvió en 0,48 L de DMSO y la solución de DMSO / cetamida se añadió a la mezcla enzimática aproximadamente entre 2 – 8 horas. Esta mezcla enzimática se dejó reaccionar a 44 – 46 ºC y un pH de 8,4 – 8,7 durante otras 7 – 22 horas. Durante la adición de la solución de DMSO / cetamida y su posterior reacción, la presión del reactor se varió en cuanto fuese necesario para evaporar la acetona y, de ese modo, impulsar a la reacción a formar el producto de base libre de Sitagliptina. Además, durante el curso de la reacción, se cargó una solución de isopropilamina 4 M (mínimo 0,25 L o 1,0 mol equiv) en cuanto fuese necesario para mantener el pH entre 8,4 – 8,7.

[0292] La mezcla de reacción se enfrió llenando 65 g de Solka floc a 44 – 46 ºC. Tras llenarla con Solka floc, se cargó con ácido clorhídrico 12 N en la mezcla hasta alcanzar un pH de 2 – 3. La mezcla se agitó a 44 – 46 ºC con un pH de 2 – 3 durante al menos 3 horas. La mezcla se filtró a 44 – 46 ºC y la torta sobrante se lavó con ácido clorhídrico 0,01 N (1,02 L – 4,47 L). El filtrado combinado y lavado con ácido clorhídrico 0,01 N se enfrió a 15 – 25 ºC y a continuación se añadió 2,44 L de acetato de isopropil (IPAc). El pH se ajustó entre 10,5 – 11,5 con hidróxido de sodio 19 N. La mezcla se agitó entre 15 – 40 ºC, se sedimentó, y se separó. La capa orgánica superior se apartó y la capa acuosa inferior se extrajo con 1,22 L de IPAc a 15 – 25 ºC. Los dos extractos orgánicos se combinaron y lavaron con agua (0,20 L – 1,23 L) a 15 – 40 ºC. La capa orgánica final proporcionó 4,07 L de una corriente de crudo de base libre de Sitagliptina en 100g/L (407,31 g, 1,00 mol) utilizada en la preparación del fosfato monohidratado de Sitagliptina.

[0293] Los 4,07 L de la corriente de crudo de base libre de Sitagliptina se concentraron al vacío con 1,68 L a 20 – 35 ºC y el disolvente se cambió a isopropanol utilizando un mínimo de 2,52 L de isopropanol. Esta solución se cargó con 0,27 L de agua para disolver todos los sólidos. La adición de agua mejora la formación del monohidrato al inicio de la cristalización. El ácido fosfórico acuoso (1,02 mol) se añadió a esta solución y se calentó para que se disolviese.

[0294] La solución se enfrió a 62 – 68 ºC, se sembró con 2,62 g de fosfato monohidratado de Sitagliptina molida (por ejemplo, promedio de 10 – 20 micrones superior o igual al 95 % entre 25 – 45 micrones como determinó el análisis de Microtrac) y se dejó madurar durante 3 – 6 horas a 62 – 68 ºC. La suspensión se enfrió a 20 – 25 ºC durante al menos 2 horas. La suspensión se cargó con 0,48 L de isopropanol durante un mínimo de 2 horas mientras se mantiene una temperatura entre 20 – 25 ºC. La suspensión se enfrió entre 15 ºC y 20 ºC durante al menos 2 horas. La suspensión se filtró entre – 15 ºC y 20 ºC y la torta húmeda se lavó con isopropanol acuoso (contenido mínimo de agua 8 % en peso). La torta húmeda se secó a una temperatura máxima de 45 ºC in vacuo para producir fosfato monohidratado de Sitagliptina.

Ejemplo 17: Proceso V para incrementar la conversión del sustrato de cetoamida en Sitagliptina

[0295] El siguiente ejemplo ilustra un quinto proceso a gran escala utilizado para incrementar la conversión del sustrato de cetoamida en un producto de base libre de Sitagliptina y la posterior preparación del fosfato de

Sitagliptina. Normalmente, el proceso a gran escala utiliza el mismo equipo y condiciones descritas en el Ejemplo 16 aunque con algunas modificaciones que se detallan a continuación.

[0296] La solución tampón se preparó añadiendo 50,68 L de solución isopropilamina 4 M, 58, 1 L de agua y 3,36 L

5 de trietanolamina a 20 – 25 ºC. El pH del tampón se ajustó a 8,8 – 9,2 a 20 – 25 ºC utilizando ácido clorhídrico 12 N. La mezcla se cargó con 0,11 kg de PLP y 1,40 kg de enzima transaminasa de la SEC ID Nº 110 a 20 – 25 ºC. El PLP y la enzima se disolvieron mediante agitación (se confirma a los 30 min). A continuación, se cargó 61,76 L de DMSO en la mezcla a 20 – 46 ºC. La mezcla se calentó a 44 – 46 ºC, una vez alcanzada dicha temperatura, se cargó solución de isopropilamina 4 M para ajustar el pH a 8,4 – 8,7.

10 [0297] El sustrato de cetoamida (35.000 kg) se disolvió en 41,18 L de DMSO y esta solución de DMSO / cetoamida se añadió a la mezcla aproximadamente durante 2 – 3 horas. La mezcla se dejó actuar a 44 – 46 ºC con un pH de 8,4 – 8,7 durante otras 12 – 22 horas. Durante la adición de la solución de DMSO / cetoamida y su posterior maduración, la presión del reactor varió para eliminar la acetona (condiciones de presión normales para la

15 eliminación de acetona: ~ 325 – 350 mm vacío Hg y ~ 3 – 6 scfm barrido de espacio de cabeza con nitrógeno). Además, durante el curso de la reacción, se cargó con solución de isopropilamina 4 M cuanto fuese necesario para mantener el pH entre 8,4 – 8,7. Los resultados de la conversión de reacción fueron entre un 88 – 93 % tras 15 – 17 horas de tiempo de reacción total que incluye el tiempo de transferencia de DMSO / cetoamida.

20 [0298] La reacción se enfrió llenando 5,60 kg de lechada de Solka floc en 42 L de agua. Tras llenar el Solka floc, se cargó ácido clorhídrico 12 N en la mezcla hasta alcanzar un pH de 2 – 3. La reacción se agitó a 44 – 46 ºC con un pH de 2 – 3 durante 3 horas. La mezcla se filtró a 44 – 46 ºC y la torta sobrante se lavó con 154 L con solución de ácido clorhídrico 0,01 N.

25 [0299] El filtrado combinado y la solución de lavado se enfriaron a 15 – 25 ºC y se añadió 210 L de acetato de isopropil (IPAc). El pH de la mezcla se ajustó a 10,5 – 11,5 con hidróxido de sodio 19 N. La mezcla se agitó a 15 – 25 ºC, se sedimentó, y se separó (Extracción # 1). La capa orgánica superior se apartó y la capa acuosa inferior se extrajo con 105 L de IPAc a 15 – 25 ºC (Extracción # 2). Los extractos orgánicos se combinaron y se lavaron con 17,50 L de agua a 32 – 38 ºC (Extracción # 3). La capa orgánica resultante produjo 29,44 kg de análisis de corriente

30 de crudo de base libre de Sitagliptina (~ 85,9 % de rendimiento de análisis).

[0300] La corriente de crudo de base libre, 294,40 L en 100 g / L (29,44 kg, 72,28 mol), se concentró al vacío (30 – 60 mmHg) en 121,59 L a 20 – 35 ºC. La mezcla se disolvió cambiando de isopropanol utilizando 182,39 L a isopropanol. La mezcla se cargó con 19,72 L de agua para disolver todos los sólidos. A continuación, se añadió a la 35 mezcla 15,87 kg de ácido fosfórico acuoso al 45 % en peso, que se calentó a 72 – 80 ºC para que se disolviera. La solución de la mezcla se enfrió a 62 – 66 ºC y se sembró con 0,19 kg de fosfato monohidratado de Sitagliptina triturada. La mezcla se dejó madurar durante 3 horas a 62 – 66 ºC y se enfrió a 20 – 25 ºC durante 2 horas. La mezcla se cargó con 34,40 L de isopropanol durante 2 horas mientras se mantenga la temperatura de la mezcla a 20

– 25 ºC. La mezcla se enfrió entre – 15 ºC y 0 ºC durante 2 horas. La suspensión se filtró entre – 15 ºC y 0 ºC y la

40 torta húmeda se lavó con 70,05 L de isopropanol acuoso (8 % de agua en ps mínimo). La torta húmeda se secó a 40 ºC in vacuo para producir el fosfato monohidratado de Sitagliptina (37,34 kg físico, rendimiento ~ 98 %).

[0301] Si bien se han ilustrado y descrito numerosas realizaciones específicas, se apreciará aquellos cambios que puedan realizarse sin desviarse del alcance de las reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido de transaminasa capaz de convertir el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1

– (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina, en la que el polipéptido de transaminasa comprende una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80 % a la SEC ID Nº 4 y en la que la secuencia aminoácida incluye, al menos, las siguientes características: (1) el residuo correspondiente a X223 de la SEC ID Nº es P; (2) el residuo correspondiente a X69 de la SEC ID Nº 2 es G, C, T, A o S y / o el residuo correspondiente a X284 de la SEC ID Nº 2 es G; y (3) el residuo correspondiente a X122 de la SEC ID Nº 2 es M, I, V o H.
2. El polipéptido de transaminasa de la reivindicación 1 en la que el polipéptido de transaminasa es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto:

i) en condiciones de reacción definidas en presencia de una isopropilamina dadora del grupo amino a niveles de producto detectables por UV – HPLC a 210 nm en la que la condición de reacción comprende 2 g / L de sustrato de cetoamida, isopropilamina 0,5 M, 22 ºC, pH 7,5, 5 % de DMSO, 100 μM de fosfato de piridocal, 20 mg / mL de polipéptido de transaminasa y opcionalmente una actividad superior o igual a la actividad del polipéptido de la SEC ID Nº 4 en condiciones de reacción definidas;

ii) con al menos un 90 % de exceso enantiomárico; o iii) con al menos un 99 % de exceso enantiomárico.
3.

El polipéptido de transaminasa de la reivindicación 1 en la que la secuencia de aminoácidos incluye las siguientes características:

i) X69 esG, C,T, A o S; X122 es M, I, V o H y X223 es P; ii) X122 es M,I, V o H; X223 es P y X284 es G; iii) X69 esG, C, T, A o S; X122 es M, I, V o H; X223 es Py X284 esG o; iv) X69 es Co T; X122 es M o I; X223 es P y X284 es G.
4.

El polipéptido de transaminasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la que la secuencia de aminoácidos comprende adicionalmente una diferencia residual comparada a la SEC ID Nº 2 en una o más de las siguientes posiciones residuales: X4; X5; X8; X18; X25; X26; X27; X28; X30; X41; X42; X48; X49; X50; X54; X55; X60; X61; X62; X65; X69; X81; X94; X96; X102; X117; X120; X122; X124; X126; X136; X137; X138; X146; X148; X150; X152; X155; X156; X160; X163; X164; X169; X174; X178; X195; X199; X204; X208; X209; X211; X215; X217; X223; X225; X230; X252; X269; X273; X282; X284; X292; X297; X302; X306; X321; y X329, opcionalmente en las que las diferencias residuales aminoácidos en las posiciones residuales se seleccionan de los siguientes:

X4 es Y; X5 es K; X8 es P; X18 es C o I; X25 es Q; X26 es H; X27 es C; X28 es P; X30 es Q o M; X41 es H o S; X42 es G; X48 es Q, D, V,G o A, X49 es T; X50 es L; X54 es P o H; X55 es V; X60 es F; X61 es Y; X62 es T, Y o F; X65 es A; X81 es G; X94 es I o L; X96 es L; X102 es L o K; X117 es G; X120 es Y; X124 es T, H o N;X126 es T; X136 es Y o F; X137 es T o I; X138 es K oP; X146 es R; X148 es A o F; X150 es F, H o S; X152 es G, I, L S o C; X155 es M, V o T; X156 es Q; X160 es L; X163 es H o V; X164 es V o P; X169 es L; X174 es A; X178 es S; X195 es F o Q; X199 es W o I; X204 es A; X208 es H, C, G, K, N, Y, D o S; X209 es L; X211 es I; X215 es C; X217 es N; X225 es Y; X230 es V; X252 es F; X269 es P; X237 es Y; X282 es S; X292 es T; X297 es S; X302 es A; X306 es L; X321 es Py X329 es H.
5.

El polipéptido de transaminasa de la reivindicación 4 en el que la secuencia de transaminasa incluye adicionalmente al menos las siguientes características:

i) X26 es H, y/o X62 es T o F; X65 es A; X136 es Y o F; X199 esWo I; y X209 es L;

ii) X61 es Y; X62 es T o F; X65 es A; X94 es I o L; X136 es Y o F; X199 es W o I; X209 es L; X215 es C; y X282 es S;

iii) X8 es P; X61 es Y; X62 es T o F; X65 es A; X81 es G; X94 es I o L; X136 es Y o F; X199 es W o I; X209 es L; X215 es C; X217 es N; X269 es P; X282 es S; X297 es S; y X321 es P;

iv) X8 esP;X60 esF; X61 es Y; X62 es T o F; X65 es A; X81 es G; X94 es I o L; X96 es L; X124 es T, H o N; X136 es Y o F; X169 es L; X199 es W o I; X209 es L; X215 es C; X217 es N; X269 es P; X273 es Y; X282 es S; X297 es S; y X321 es P; o

v) X8 esP; X60 es F; X61 es Y; X62 es T o F; X65 es A; X81 es G; X94 es I o L; X96 es L; X124 es T, H o N; X 126 es T; X136 es Y o F; X150 es F, H, o S; X152 es G, I, L, S o C; X169 es L; X199 es W o I; X209 es L; X215 es C; X217 es N; X269 es P; X273 es Y; X282 es S; X297 es S; y X321 es P.
6. El polipéptido de transaminasa de la reivindicación 1 en el que:

i) La secuencia de aminoácidos corresponde a la secuencia SECs ID Nº: 110, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76,

78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144,146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168;

ii) La transaminasa es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto con una actividad, 50 a 100 o más veces superior a la del polipéptido de la SEC ID Nº 4, en la que opcionalmente la secuencia aminoácido corresponde a la secuencia de la SEC ID Nº: 110, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104,106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150,152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

iii) La transaminasa es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto con una actividad, 1,1 a 5

o más veces superior a la del polipéptido de la SEC ID Nº 22, en la que opcionalmente la secuencia aminoácida corresponde a la secuencia de la SEC ID Nº: 110, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104,106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150,152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

iv) La transaminasa es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto con una actividad, 1,1 a 5

o más veces superior a la del polipéptido de la SEC ID Nº 48, en la que opcionalmente la secuencia aminoácida corresponde a la secuencia de la SEC ID Nº: 110, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104,106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150,152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

v) La transaminasa es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto con una actividad, 1,1 a 5

o más veces superior a la del polipéptido de la SEC ID Nº 58, en la que opcionalmente la secuencia aminoácida corresponde a la secuencia de la SEC ID Nº: 110, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104,106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150,152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.
7.

Un polinucleótido que codifica a un polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 – 6 en el que opcionalmente el polinucleótido corresponde a la secuencia de SEC ID Nº 109: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, o 167.
8.

Una células huésped que incluye un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la reivindicación 7, que comprende además una secuencia de control, en la que por ejemplo:

i) la secuencia de control comprende un activador o; ii) la secuencia de control comprende una señal de secreción, en la que la célula huésped es opcionalmente

E. coli.
9.

que tiene la configuración estereoquímica indicada en el centro estereogénico marcado con un *; con un exceso enantiomérico de, al menos, el 70 % respecto al enantiómero opuesto, en el que

Z es OR2 o NR2R3; R1 es C1–8 alquilo, arilo, heteroarilo, arilo – C1–2 alquilo o heteroarilo – C1–2 alquilo; R2 y R3 son hidrógenos independientes, C1–8 alquilo, arilo o arilo – C1–2 alquilo; o R2 y R3 junto al átomo de nitrógeno al que se unen forman un anillo heterocíclico membrado de 4– a 7– que contiene un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S, NH y NC1–4 alquilo, sustituyendo, o no, el anillo heterocíclico por uno de los tres sustituyentes seleccionados independientemente entre oxo, hidroxi, halógeno, C1–4 alcoxi y C1–4 alquilo, en el que alquilo y alcoxi son sustituidos, o no, por uno a cinco átomos de flúor; y fusionando el sistema del anillo heterocíclico a un sistema de anillos carbocíclicos aromáticos o saturados de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros que contiene de uno o dos heteroátomos seleccionados entre O, S y NC0–4 alquilo, sustituyendo, o no, el sistema de anillos fusionados por uno o dos sustituyentes seleccionados entre hidroxi, amino, flúor, C1–4 alquilo, C1–4 alcoxi y trifluorometil; el proceso incluye la etapa de poner en contacto una cetona proquiral de fórmula estructural (II):

con un polipéptido de transaminasa de la invención en presencia de un dador del grupo amino en un disolvente orgánico apropiado en las condiciones de reacción adecuadas, en las que, opcionalmente:

i) R1 es un bencilo en el que el grupo fenil de bencil es sustituido, o no, por uno a 3 sustituyentes seleccionado del grupo formado por flúor, trifluorometil y trifluorometoxi; o ii) Z es NR2R3, por ejemplo un heterociclo de fórmula estructural (III):

en la que R4 es hidrógeno o C1–4 alquilo, sustituido, o no, por uno a cinco átomos de flúor.
10. Un proceso según la reivindicación 9 de preparación de un compuesto de fórmula estructural (1):

que tiene la configuración – (R) en el centro estereogénico marcado con ***, con un exceso enantiomérico de, al menos, el 70 % respecto al enantiómero que tiene la configuración – (S) opuesta, en la que: Ar es un fenilo sustituido, o no, por uno a cinco sustituyentes independientemente seleccionados del grupo formado por flúor, trifluorometil y trifluorometoxi; y R4 es hidrógeno o C1–4 alquilo sustituido, o no, por uno a cinco átomos de flúor, en el que el proceso comprende la etapa de poner en contacto una cetona proquiral de fórmula estructural (2):

con un polipéptido de transaminasa modificada mejorada descrita en presencia de un dador del grupo amino en un disolvente orgánico apropiado en las condiciones de reacción adecuadas para la conversión del compuesto de fórmula (2) en el compuesto de fórmula (1). En algunas realizaciones del proceso, la Ar de la fórmula (2) es 2, 5 – difluorofenilo o 2, 4, 5 – trifluorofenilo, y R4 es trifluorometilo. En algunas realizaciones del proceso, la Ar de la fórmula (2) es 2, 4, 5 – trifluorofenilo.
11. Un proceso según las reivindicaciones 9 o 10 de preparación de un compuesto de fórmula (1a):

comprende la etapa de poner en contacto un sustrato de la fórmula (2a):

con un polipéptido de transaminasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 – 6 en presencia de un dador del grupo amino en un disolvente orgánico apropiado en las condiciones de reacción adecuadas.
12. El proceso de las reivindicaciones 9, 10 o 11: i) el compuesto de fórmula (I), el compuesto de fórmula (1) o el compuesto de fórmula (1a) se producen con, al menos, el 90 % de exceso enantiomérico. ii) el compuesto de fórmula (I), el compuesto de fórmula (1) o el compuesto de fórmula (1a) se producen

con, al menos, el 99 % de exceso enantiomérico. iii) En la que el dador del grupo amino se selecciona entre isopropilamina, alanina, ácido 3 – aminobutírico

o metilbencilamina, por ejemplo en la que el dador del grupo amino es isopropilamina;

iv) Comprende además la etapa de eliminar el subproducto carbonilo de la reacción, en la que opcionalmente el dador del grupo amino es un aminoácido y el subproducto carbonilo es un ácido ceto, en el que el subproducto carbonilo tiene una presión de vapor mayor que el agua y se elimina el subproducto carbonilo inyectando un gas no reactivo o aplicando un vacío, en el que por ejemplo: a) el gas no reactivo es gas nitrógeno o; b) el dador del grupo amino es isopropilamina y el subproducto carbonilo es acetona;

v) en la que la condición de reacción tiene un pH que oscila entre 7,0 y 9,0, como en la que la condición de reacción tiene un pH de 8,5 o se mantiene el pH añadiendo isopropilamina; vi) en la que la condición de reacción tiene una temperatura que oscila entre 25 y 50 ºC, en la que opcionalmente la condición de reacción tiene una temperatura de 45 ºC. vii) en el que el disolvente comprende dimetilsulfóxido, en el que opcionalmente el dimetilsulfóxido oscila entre un 10 y un 50 % (v / v), por ejemplo en el que el DMSO tiene un 30 % v / v o; viii) además comprende la etapa de aislamiento del compuesto de la fórmula estructural (I), del compuesto de la fórmula estructural (1) o del compuesto de la fórmula estructural (1a) de la reacción.
13.

El proceso de la reivindicación de las reivindicaciones 10 u 11 que comprenden además la etapa de convertir el compuesto de fórmula estructural (1) o el compuesto de fórmula estructural (1a) en una sal farmacéuticamente aceptable poniendo en contacto dicho compuesto con un ácido farmacéuticamente aceptable en un disolvente de reacción apropiado, opcionalmente:

i) en el que el ácido farmacéuticamente aceptable es ácido fosfórico y la sal farmacéuticamente aceptable es la sal de fosfato dihidrógeno; ii) en el que el compuesto tiene la fórmula estructural (1a), el ácido aceptable farmacéuticamente es un ácido fosfórico y la sal aceptable farmacéuticamente es una sal de fosfato monohidratado o; iii) comprende la etapa de cristalización de la sal farmacéuticamente aceptable a partir del disolvente de reacción.
14.

Una composición que comprende el polipéptido de transaminasa según cualquiera de las reivindicaciones 1

– 6 y:

(a) Un compuesto de fórmula estructural (I): que tiene la configuración estereoquímica indicada en el centro estereogénico marcado con un *; con un exceso enantiomérico de, al menos, el 70 % respecto al enantiómero opuesto, en el que

Z es OR2 o NR2R3; R1 es C1–8 alquilo, arilo, heteroarilo, arilo – C1–2 alquilo o heteroarilo – C1–2 alquilo; R2 y R3 son hidrógenos independientes, C1–8 alquilo, arilo o arilo – C1–2 alquilo; o

R2 y R3 junto al átomo de nitrógeno al que se unen forman un anillo heterocíclico membrado de 4– a 7– que contiene un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S, NH y NC1–4 alquilo, sustituyendo, o no, el anillo heterocíclico por uno de los tres sustituyentes seleccionados independientemente entre oxo, hidroxi, halógeno, C1–4 alcoxi y C1–4 alquilo, en el que alquilo y alcoxi son sustituidos, o no, por uno a cinco átomos de flúor; y fusionando el sistema del anillo heterocíclico a un sistema de anillos carbocíclicos aromáticos o saturados de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros que contiene de uno o dos heteroátomos seleccionados entre O, S y NC0–4 alquilo, sustituyendo, o no, el sistema de anillos fusionados por uno o dos sustituyentes seleccionados entre hidroxi, amino, flúor, C1–4 alquilo, C1–4 alcoxi y trifluorometil;

(b) Un compuesto de fórmula estructural (1):

que tiene la configuración – (R) en el centro estereogénico marcado con ***, en el que:

Ar es un fenilo sustituido, o no, por uno a cinco sustituyentes independientemente seleccionados del grupo formado por flúor, trifluorometil y trifluorometoxi; y R4 es hidrógeno o C1–4 alquilo sustituido, o no por uno a cinco átomos de flúor;

(c)

(d)

Un compuesto de fórmula estructural (II)

que tiene la configuración estereoquímica indicada en el centro estereogénico marcado con un *, en el que:

Z es OR2 o NR2R3;

R1 es C1–8 alquilo, arilo, heteroarilo, arilo – C1–2 alquilo o heteroarilo – C1–2 alquilo;

R2 y R3 son hidrógenos independientes, C1–8 alquilo, arilo o arilo – C1–2 alquilo; o R2 y R3 junto al átomo de nitrógeno al que se unen forman un anillo heterocíclico membrado de 4– a 7– que contiene un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S, NH y NC1–4 alquilo, sustituyendo, o no, el anillo heterocíclico por uno de los tres sustituyentes seleccionados independientemente entre oxo, hidroxi, halógeno, C1–4 alcoxi y C1–4 alquilo, en el que alquilo y alcoxi son sustituidos, o no, por uno a cinco átomos de flúor; y fusionando el sistema del anillo heterocíclico a un sistema de anillos carbocíclicos aromáticos o saturados de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros que contiene de uno o dos heteroátomos seleccionados entre O, S y NC0–4 alquilo, sustituyendo, o no, el sistema de anillos fusionados por uno o dos sustituyentes seleccionados entre hidroxi, amino, flúor, C1–4 alquilo, C1–4 alcoxi y trifluorometil;

(e) Un compuesto de fórmula estructural (2):

en el que:

Ar es un fenilo sustituido, o no, por uno a cinco sustituyentes independientemente seleccionados del grupo formado por flúor, trifluorometil y trifluorometoxi; y

R4 es hidrógeno o C1–4 alquilo sustituido, o no, por uno a cinco átomos de flúor; o

(f)
15. La composición de la reivindicación 14, comprende además un dador del grupo amino y en la que opcionalmente el dador del grupo amino comprende isopropilamina, alanina, ácido 3 – aminobutírico o metilbencilamina.