ES2451018T3 - Reguladores implicados en la formación de setas - Google Patents
Reguladores implicados en la formación de setasInfo
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Abstract
Hongo o seta con un nivel de expresión aumentado de un polipéptido implicado en la formación de seta, donde elpolipéptido tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 56 y/o tiene al menos un 50 % de identidadde aminoácido con SEC ID n.º: 202, y donde el nivel de expresión aumentado del polipéptido es una producción aumentadadel polipéptido y/o una actividad más alta de dicho polipéptido que el hongo/seta progenitor del que deriva este hongo/setacuando ambos son evaluados y/o son cultivados bajo las mismas condiciones
Description
Reguladores implicados en la formación de setas
Campo de la invención
[0001] La invención se refiere a una seta y a un método para producir dicha seta donde la seta tiene un nivel de expresión aumentado de un polipéptido y/o un nivel de expresión disminuido de un polipéptido, donde el polipéptido se codifica por una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene al menos un 40 % de identidad con SEC ID n.º: 56 y/o que tiene al menos un 50 % identidad con SEC ID n.º : 202.
Antecedentes de la invención
[0002] La formación de setas es un proceso de desarrollo altamente complejo. Como un ejemplo, describimos un esquema generalizado para la formación de cuerpos frutales agáricos tales como los de Agaricus bisporus (véase Kües, 2000; Umar and van Griensven, 1997). Después de que una "masa crítica" de micelio sumergido se haya formado, las hifas escapan del sustrato para crecer en el aire. Estas hifas forman agregados, que son llamados nudos hifales o nódulos. En los nudos las hifas se agregan formando un cuerpo frutal inicial. En el núcleo del inicial la diferenciación de células ocurre. La parte inferior se desarrollará en el estipe, mientras que la cobertura será formada a partir de la parte superior. En la cobertura se desarrollan diferentes tejidos. En la parte interna de la cobertura se pueden distinguir la trama de píleo y branquias con un himenio. En el himenio diferentes tipos de célula son formados, entre los cuales la basidia. En el basidio tienen lugar la cariogamia y la meiosis, en última instancia dando como resultado basidioesporas. Este desarrollo de cuerpos frutales es complejo está también ejemplificado en el hecho de que la formación de los tejidos diferentes se superpone en el tiempo. Por otra parte, las células en la seta en desarrollo difieren en diámetro, longitud, número de tabiques, núcleos y vacuolas al igual que en la composición molecular (p. ej. el contenido de reserva de carbohidrato).
[0003] Las esporas formadas por A. bisporus contienen dos núcleos con un tipo de acoplamiento diferente. La germinación de estas esporas así produce un micelio heterocariótico autofértil, con un número variable de ambos tipos nucleares. En cambio, la fase fértil de una mayoría de hongos que forman setas resultan de un acoplamiento de dos cepas compatibles con diferentes loci de tipo acoplamiento. Durante el acoplamiento, los socios intercambian núcleos. Estos núcleos no se fusionan sino que se mantienen en el compartimento hifal. Tales micelios son por lo tanto llamados heterocarióticos (en el caso de que cada compartimento contenga un núcleo de cada tipo se llama un dicarión). Estos pueden formar cuerpos frutales bajo las condiciones nutricionales y medioambientales apropiadas. Los loci tipo acoplamiento son los reguladores maestros del desarrollo del cuerpo frutal. Se conoce poco acerca del sistema tipo acoplamiento de A. bisporus. Se supone que este hongo contiene un único locus tipo acoplamiento. Los loci tipo acoplamiento de Schizofillum commune y Coprinus cinereus y su papel en el desarrollo han sido estudiados bien (para una revisión véase Kües, 2000). Tanto S. commune como C. cinereus contienen dos loci tipo acoplamiento. El locus A codifica proteínas homeodominio. Estas proteínas funcionan por formación de heterodímeros con proteínas de homeodominio codificadas en un locus A compatible. Algunas de estas proteínas de homeodominio también parecen formar homodímeros funcionales. El locus B codifica feromonas y receptores. Estos receptores pueden enlazar feromonas codificadas por otros alelos del locus B. Tanto el locus A como el B regulan procesos celulares diferentes implicados en el establecimiento del micelio dicariótico. No obstante, ellos regulan de manera coordinada la iniciación del cuerpo frutal. Claramente, la presencia de loci de tipo de acoplamiento A y B compatibles no es suficiente para originar fruta. Por ejemplo, en C. Cinereus en los agregados formados por un dicarión pueden desarrollar en una fruta inicial o en esclerocio. Condiciones medioambientales tales como luz y disponibilidad de nutriente determinarán qué programa de desarrollo será accionado.
[0004] Se conoce poco acerca de proteínas reguladoras diferentes de aquellas codificadas por los loci tipo acoplamiento que están implicadas en la formación de setas en general y en la iniciación de fruta en particular. A diferencia de A. bisporus, al menos algunos mutantes y genes han sido identificados en S. commune y C. cinereus. La mutación fbf es una mutación recesiva frecuentemente observada en S. commune que suprime procesos específicos de dicarión en hifas vegetativas al igual que la formación de cuerpos de fruta (Springer and Wessels, 1989). El gen FBF así parece ser un activador. Por otro lado, el gen FRT de S.commune suprime la expresión de genes específicos de dicarión en monocariones (Horton et al., 1999). Otras cepas mutantes afectadas en el desarrollo del cuerpo de fruta en S. commune han sido descritas pero los genes implicados no han sido identificados. Estos mutantes están afectados en la morfología del cuerpo frutal o su esporulación (Raper and Krongelb, 1958; Bromberg and Schwalb, 1977). Recientemente, diferentes genes implicados en la formación del cuerpo de fruta han sido identificados en C.cinereus. El gen pcc1 funciona en el desarrollo regulado de A y codifica una proteína de enlace de ADN putativa (Murata et al., 1998). Una mutación en el gen resultó en un programa completo de diferenciación sexual independiente de los genes tipo acoplamiento. La función de pcc1 es, no obstante, desconocida. Los genes ich1 y eln2 están implicados en la diferenciación del primordio (Muraguchi et al., 1998, 2000). Mutaciones en estos genes afectan la formación del píleo y del estipe, respectivamente. Claramente, estos datos no presentan una imagen de cómo se regula la formación del cuerpo frutal a nivel molecular.
[0005] Hasta el momento, genes implicados en la regulación/iniciación de la producción de setas no han sido descritos. Estos genes controlan la formación de setas y son por lo tanto objetivos para mejorar la producción de setas, para mejorar la calidad de las setas, para aumentar previsibilidad de la producción de setas y para permitir la producción de setas en sustratos sobre los que ellas todavía no pueden ser producidas eficazmente.
Descripción de la invención
[0006] Hemos estudiado la expresión de factores de transcripción putativos en el sistema modelo de formación de hongos Schizophyllum commune. S. commune se puede encontrar en todo el mundo. Es un basidiomiceto de madera que se está pudriendo que forma cuerpos frutales en madera dura talada pero puede encontrarse también en la madera de coníferas y ensilaje de césped. Los basidios que se forman en las branquias están dispersos y pueden dar lugar a un micelio monocariótico. La fusión de monocariones con alelos diferentes en los loci de tipo acomplamiento MATA y MATB produce un dicarión fértil que puede formar cuerpos frutales bajo las condiciones medioambientales apropiadas. S. commune puede formar cuerpos frutales esporulantes en medios sintéticos simples en plazo de unos días. Esto y el hecho de que monocariones están disponibles fue la razón de que S. commune se volviera un sistema modelo para basidiomicetos frutales. Tanto la genética molecular como la tradicional han sido establecidas en S. commune. Nosotros estamos seguros de que programas reguladores en S. commune, A. bisporus y otros basidiomicetos están bastante conservados. Hemos mostrado que los promotores de los genes sc3 y gpd de S. commune están activos en el basidiomiceto no relacionado Pycnoporus cinnabarinus (Alves et al., 2004).
[0007] Genes implicados en la sincronización de la formación de setas y en la morfología y rendimiento son objetivos para mejorar (es decir, para setas que actualmente son producidas comercialmente, incluyendo pero no limitado a la seta de botón blanco común [el "champiñón"], la seta de ostra y shiitake) o para permitir (es decir, para setas que no son actualmente producidas en una disposición comercial) la formación de setas comerciales. Hemos identificado 200 genes en el genoma de S. commune que codifican reguladores putativos cuya expresión cambia durante la formación de seta. Estos genes podrían estar implicados en la formación de setas. Hemos encontrado que la inactivación de ocho de estos genes afectó a la producción de setas. La producción fue bien promovida o bien disminuida, si estaba en absoluto presente. Homólogos de estos genes reguladores putativos se pueden encontrar en otros hongos que forman setas. En la presente invención como se describe además aquí, haremos uso de los genes que codifican reguladores transcripcionales putativos y cuyo cambio de expresión durante la formación de setas para 1) permitir la producción comercial de setas que todavía no pueden ser producidas en una preparación comercial, 2) mejorar el rendimiento de las setas, 3) mejorar la calidad (p. ej. forma y homogeneidad de morfología), 4) mejorar la previsibilidad del proceso de formación de setas y/o 5) permitir la producción de setas en sustratos que todavía no pueden ser usados para la producción de setas comerciales.
[0008] Las setas se pueden definir como un cuerpo frutal carnoso que soporta esporas de un hongo, típicamente producido sobre el suelo en la suciedad o en su fuente alimenticia. El estándar para el nombre "seta" es la seta de botón de blanco cultivada, Agaricus bisporus, por lo tanto la palabra seta es muy a menudo aplicada a esos hongos (Basidiomycota; Agaricomicetes) que tienen un vástago (estipe), una cobertura (píleo), y branquias (láminas, sing. lámina) en la parte inferior de la cobertura, tal como las setas blancas compradas en tiendas. Las setas también pueden tener poros en lugar de láminas. La palabra "seta" también puede usarse para una amplia variedad de cuerpos de frutales fúngicos que producen esporas sexuales y que bien tienen tallos o bien no, y el término se usa incluso más generalmente, para describir los cuerpos de fruta carnosa de algún Ascomycota y los cuerpos de fruta correosa o boscosa de algún Basidiomycota. Las formas que se desvían de la morfología estándar normalmente tienen nombres más específicos, tales como, "pedo de lobo" "stinkhorn", y "colmenilla", y setas de branquias en sí mismas son frecuentemente llamados "agáricas" en referencia a su similitud con Agaricus o su posición Agaricales. Por extensión, el término "seta" puede también designar el hongo entero cuando en el cultivo o el tallo (llamado un micelio) de especies que forman los cuerpos frutales llamados setas, o las especies mismas.
Polipéptido
[0009] En un primer aspecto, hay descritos 200 polipéptidos que se sospecha que están implicados en la regulación de la producción de un hongo. Estos polipéptidos se identifican en la tabla 1 y están disponibles en una base de datos pública (http: //jgi.doe.gov/Scommune). Esta solicitud específicamente concierne un polipéptido que tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º:56 (tabla 1) y/o que tiene al menos un 50 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º:202 (tabla 4). Tabla 5 enlaza el nombre de cada polipéptido a una SEC ID n.º dada correspondiente a una secuencia de aminoácidos. Estos polipéptidos también pueden ser denominados regulador o factor de transcripción (TF) ya que ellos han sido identificados por la presencia de un motivo o dominio conocido por estar presente en un TF tal como un dominio de unión de ADN conocido, tal como un dominio de dedo de zinc (para más detalles véase ejemplo 1). Los genes TF son preferiblemente identificados en base a:
1) anotación automática utilizando GO (Ontología Génica) (Ashburner et al., 2000),
2) KOG (Grupos de Ortólogos Eucariotas) (Koonin et al., 2004) y
3) algoritmos PFAM (Finn et al., 2008).
[0010] Los TF putativos identificados son preferiblemente posteriormente procesados con BLAST (Blast N y Blast P) frente al genoma para identificar genes TF putativos que faltaron en la anotación automática.
[0011] En un segundo paso, su expresión se analiza durante la producción de un seta. Un TF de la invención se expresa durante al menos parte del ciclo de vida de una seta. Por ejemplo, la expresión de un TF de la invención puede cambiar durante desarrollo de una seta.
[0012] "Polipéptido" como se utiliza en este caso se refiere a cualquier péptido, oligopéptido, polipéptido, producto génico, producto de expresión, o proteína. Un polipéptido está compuesto de aminoácidos consecutivos. El término "polipéptido" abarca moléculas de origen natural o sintético.
[0013] Cada secuencia de aminoácidos descrita aquí en virtud de su identidad o porcentaje de similitud (como mínimo un 40 % de identidad o similitud con SEC ID n.º 1-200; al menos un 50 % de identidad o similitud con SEC ID n.º 201-208) con una secuencia de aminoácidos respectivamente tiene en otra forma de realización preferida una identidad de al menos un 42 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 82 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad o similitud con el polipéptido dado. En una forma de realización preferida, la identidad de secuencia o similitud se determina por comparación de la longitud total de las secuencias según se identifica aquí.
[0014] Cada secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido como se describe en este caso puede codificar un polipéptido fúngico, es decir un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que es idéntica a aquella de un polipéptido que existe naturalmente en un organismo fúngico o de seta. La funcionalidad de tal polipéptido depende de la relación (identidad o porcentaje de similitud) de la secuencia de aminoácidos en comparación con la de la correspondiente SEC ID n.º identificada.
[0015] Se dice preferiblemente que un TF es funcional cuando dicho TF tiene una actividad transcripcional detectable durante al menos parte del ciclo de vida de una seta. Preferiblemente una seta es un Schizophyllum. Más preferiblemente cepa 4-8 (FGSC#9210) de Schizophyllum commune (Fungal Genetic Stock Center, Missouri, EE. UU.). La presencia de una actividad, preferiblemente una actividad transcripcional, es preferiblemente evaluada inactivando una secuencia de nucleótidos que codifica dicho TF en dicho hongo o seta y analizando si una seta será producida en comparación con la producción de setas de una seta de control donde dicha secuencia de nucleótidos no ha sido inactivada. Si una seta no se produce o si menos o más setas se producen, dicho TF se dice que muestra una actividad, preferiblemente una actividad transcripcional, y por lo tanto es funcional. Menos o más setas son definidas posteriormente aquí.
[0016] Alternativamente o en combinación con una forma de realización precedente, un polipéptido de la invención puede ser un polipéptido natural o éste puede ser un polipéptido que no existe naturalmente. Un polipéptido que no existe naturalmente puede ser un polipéptido codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que se muta por ejemplo usando mutagénesis sitio dirigida o un PCR propenso a mutación.
Constructo de ácidos nucleicos
[0017] En otro aspecto, se proporciona un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se codifica por una secuencia de nucleótidos seleccionada de:
- (a)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º:56; y,
- (b)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º:202
donde la secuencia de nucleótidos está opcionalmente operativamente enlazada a un promotor que es capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos en un hongo y/o en una seta.
[0018] Un constructo de ácidos nucleicos se define como una molécula de ácido nucleico, que es aislada de un gen de origen natural o que ha sido modificada para contener segmentos de ácido nucleico que están combinados o superpuestos de manera que de otra forma no existen en la naturaleza. Una molécula de ácido nucleico se representa por una secuencia de nucleótidos. Opcionalmente, una secuencia de nucleótidos presente en un constructo de ácidos nucleicos está operativamente enlazada a una o más secuencias de control, que dirigen la producción de dicho polipéptido en un hongo.
[0019] Operativamente enlazado se define aquí como una configuración en la que una secuencia de control está apropiadamente colocada en una posición en relación a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la invención de manera que la secuencia de control dirige la producción del polipéptido de la invención en una célula fúngica y/o en una seta.
[0020] Expresión será entendido que incluye cualquier paso implicado en la producción del polipéptido incluyendo, pero no limitado a transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.
[0021] La secuencia de control es definida aquí para incluir todos los componentes, que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polipéptido. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional.
[0022] Como se utiliza en este caso, el término "promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más genes o ácidos nucleicos, localizados secuencia arriba con respecto a la dirección de transcripción del sitio de iniciación de transcripción del gen, y se refiere al sitio de unión identificado por la presencia de un sitio de unión para ARN-polimerasa dependiente del ADN, sitios de iniciación de transcripción y cualquiera de las otras secuencias de ADN, incluyendo, pero no limitado a sitios de unión de factor de transcripción, represor y sitios de unión a proteínas activadoras, y cualquiera de las otras secuencias de nucleótidos conocidas por un experto en la técnica que actúan directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción del promotor. En el contexto de la invención, un promotor preferiblemente termina en el nucleótido -1 del sitio de inicio de transcripción (TSS).
[0023] Un promotor es preferiblemente capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos en un hongo y/o en una seta. Promotores preferidos incluyen: promotores que son constitutivamente expresados tales como el de gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa (GPD) de Schizophyllum commune (Harmsen et al., 1992) (SEC ID n.º: 209).
[0024] La invención también se refiere a un vector de expresión que comprende un constructo de ácidos nucleicos de la invención. Preferiblemente, un vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos de la invención, que está operativamente enlazada a una o más secuencias de control, que dirige la producción del polipéptido codificado en una célula fúngica y/o en una seta. Un vector de expresión se puede ver como un vector de expresión recombinante. Un vector de expresión puede ser cualquier vector que pueda ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y pueda provocar la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención en un hongo y/o en una seta. Dependiendo de la identidad del hongo/seta donde este vector de expresión será introducido y en el origen de la secuencia de nucleótidos de la invención, el experto en la materia sabrá elegir el vector de expresión más adecuado y secuencias de control.
[0025] Copias únicas o múltiples de un constructo de ácidos nucleicos se pueden introducir en una célula fúngica y/o una seta. Un constructo de ácidos nucleicos se puede mantener de forma episomal y así comprende una secuencia para la replicación autónoma, tal como una secuencia ARS. Constructos de ácidos nucleicos episómicos adecuados pueden por ejemplo estar basados en los plásmidos 2µ o pKD1 de la levadura (Fleer et al., 1991). Alternativamente, un constructo de ácidos nucleicos se integra en una o más copias en el genoma de una célula fúngica y/o una seta. La integración en una célula fúngica y/o un genoma de seta puede ocurrir al azar por recombinación ilegítima o a través de recombinación homóloga en un sitio de integración previsto. Preferiblemente, un constructo de ácidos nucleicos se integra en el genoma de un hongo y/o una seta. Este tipo de constructo de ácidos nucleicos puede comprender un vehículo de clonación bacteriano, una secuencia de nucleótidos que codifica un TF y un marcador de selección. Un marcador de selección puede conferir resistencia antibiótica o ser un marcador auxotrófico. Tales marcadores se conocen por el experto en la materia. Constructos de ácidos nucleicos que comprenden un vehículo de clonación bacteriano y una etiqueta de selección están por ejemplo descritos en Schuren et al (1994) y Munoz-Rivas et al (1986). Alternativamente, este tipo de constructo de ácidos nucleicos se puede sintetizar utilizando técnicas tal como por ejemplo PCR.
[0026] Si el nivel de expresión de un polipéptido de la invención debe ser aumentado, una secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido se introduce en un constructo de expresión. Si el nivel de expresión de un polipéptido de la invención debe ser disminuido, una secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido se puede introducir en un constructo de inactivación. Un constructo de inactivación se conoce por el experto en la materia. Tal constructo puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido mutado o con las secuencias flanqueantes de una secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido. Tal constructo se debería integrar al locus endógeno de dicho polipéptido para reemplazar el gen endógeno e inactivarlo. Alternativamente, el constructo de inactivación puede contener una secuencia que induce ARNi. Técnicas de ARNi se conocen por el experto en la materia (De Jong et al, 2006).
[0027] La inactivación del polipéptido se puede deber a la inactivación del gen correspondiente o secuencia de nucleótidos. En el caso de una inactivación tipo ARNi, los niveles de ARNm son reducidos. El constructo de inactivación también puede resultar en niveles de ARNm similares a los observados en el tipo salvaje. En este caso, el polipéptido mutado codificado tiene una actividad disminuida, donde dicha actividad disminuida se evalúa por comparación con la actividad del polipéptido del que deriva o se origina el polipéptido mutado. Una actividad de un polipéptido se puede evaluar utilizando un ensayo conocido por el experto en la materia. Tal ensayo puede incluir la introducción de dicho polipéptido mutado en un hongo y la comparación de una actividad de dicho polipéptido mutado expresado con la actividad correspondiente del polipéptido del que se origina el polipéptido mutado. Una actividad de un polipéptido mutado se puede comparar con la actividad de un polipéptido de control. Si un hongo es un Schizophyllum, una actividad de control de un polipéptido de control puede ser una actividad como la presente en la cepa de Schizophyllum commune cepa 4-8 (FGSC #9210). Preferiblemente un polipéptido mutado no tiene actividad detectable. Una actividad tiene el mismo significado como actividad transcripcional o siendo funcional como se ha definido en la presente anteriormente.
[0028] Procedimientos adecuados para la transformación del hongo son bien conocidos para el experto en la materia. Por ejemplo, el hongo que forma seta se puede transformar utilizando protoplastos utilizando por ejemplo procedimientos según van Peer et al (2009).
Célula fúngica/seta
[0029] En otro aspecto, se proporciona un hongo y/o una seta con un nivel de expresión aumentado de un polipéptido, donde el polipéptido se codifica por una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º:56, y/o al menos un 50 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 202.
[0030] En una forma de realización preferida, un hongo y/o una seta comprende un constructo de ácidos nucleicos o vector de expresión de la invención tal y como se define en el párrafo precedente. La elección del hongo y/o seta en gran parte dependerá de la fuente de la secuencia de ácidos nucleicos de la invención. Dependiendo de la identidad del hongo, el experto en la materia sabría transformar este con el constructo o vector de la invención.
[0031] En una forma de realización preferida, se proporciona un hongo y/o una seta con un nivel de expresión aumentado de un polipéptido y un nivel de expresión disminuido de otro polipéptido. En otra forma de realización preferida, se proporciona un hongo y/o una seta con un nivel de expresión aumentado de al menos un polipéptido de la invención y/o un nivel de expresión disminuido de al menos otro polipéptido de la invención.
[0032] Un polipéptido de la invención que se expresa en un hongo y/o una seta, como se describe anteriormente, puede ser un polipéptido heterólogo o un polipéptido endógeno, como se define posteriormente. Preferiblemente, un polipéptido de la invención que se expresa en un hongo y/o una seta es un polipéptido heterólogo, por ejemplo cuando un polipéptido de la invención se utiliza para mejorar la producción de una seta comestible. Donde aquí se dice que un hongo y/o una seta tiene un "nivel de expresión de un polipéptido aumentado", esto incluye la expresión de un polipéptido heterólogo, aunque por definición el polipéptido heterólogo no es naturalmente expresado por un hongo y/o una seta. No obstante, el nivel de expresión "aumentado" en esta situación se interpreta que significa que hay una expresión detectable del polipéptido heterólogo mientras que un hongo de control y/o seta no tiene expresión detectable del polipéptido heterólogo. Un polipéptido del cual el nivel de expresión es disminuido, como es anteriormente descrito, es un polipéptido endógeno.
[0033] La expresión aumentada y/o disminuida como se identifica anteriormente no necesita existir durante el ciclo de vida entero de la seta/hongo. Dependiendo de la identidad del polipéptido, su expresión se puede aumentar respectivamente disminuida durante parte del ciclo de vida de la seta/hongo. Un hongo puede ser cualquier hongo. Preferiblemente un hongo es un hongo donde un nucleótido que codifica un polipéptido como se identifica anteriormente aquí está implicado durante la producción de dicho hongo. Un hongo es preferiblemente un hongo que produce una seta. Más preferiblemente, una seta que es atractiva para ser producida o que se sospecha que es atractiva para producir una sustancia de interés. Se puede deber a cuestiones comerciales. En una forma de realización, un hongo es un Basidiomiceto o un Ascomiceto, preferiblemente un Basidiomiceto, preferiblemente un Agaricales, más preferiblemente un Schizofillaceae e incluso más preferiblemente un Schizofilum. Más preferido es un Schizophyllum commune. Incluso más preferiblemente cepa 4-8 de Schizophyllum commune (FGSC#9210). Agaricales preferidos son por ejemplo Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus and Lentius edodus.
[0034] Según una forma de realización preferida, un hongo y/o una seta tiene un nivel de expresión de un polipéptido que ha sido aumentado, es decir produce más que las cantidades normales o tiene un nivel de producción aumentada de dicho polipéptido de la invención y/o muestra una actividad más alta para dicho polipéptido que el hongo/seta progenitor del que deriva este hongo/seta cuando ambos se evalúan y/o cultivan bajo las mismas condiciones.
[0035] "Producir más de la cantidad normal o tener un nivel de producción elevado de dicho polipéptido" es aquí definido como producir más del polipéptido de la invención de lo que el hongo/seta progenitor del que deriva el hongo/seta transformado producirá cuando ambos tipos de células (progenitoras y células transformadas) sean cultivadas bajo las mismas condiciones. El aumento puede ocurrir durante parte del ciclo de vida de un hongo/seta y/o durante una fase particular del ciclo de vida de dicho hongo/seta. Preferiblemente, un hongo/seta de la invención produce al menos 3 %, 6 %, 10 % o 15 % más del polipéptido de la invención que el hongo/seta progenitor del que el hongo/seta transformado deriva producirá cuando ambos tipos de células (progenitoras y células transformadas) sean cultivadas bajo las mismas condiciones. También hongos que producen al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 500 %, 1000 %, 10 000 % o más de dicho polipéptido que el hongo/seta progenitor son preferidos. Según otra forma de realización preferida, el nivel de producción del polipéptido del hongo/seta de la invención se compara con el nivel de producción del mismo polipéptido en una cepa de control. Según una forma de realización aún más preferida, cuando el hongo/seta de la invención es una cepa de Schizophyllum, el nivel de producción del polipéptido del hongo/seta de la invención se compara con el nivel de producción de la cepa 4-8 de Schizophyllum commune (FGSC #9210), que se toma como control.
[0036] La evaluación del nivel de producción del polipéptido se puede realizar al nivel de ARNm realizando un Northern Blot
o un análisis de array y/o al nivel de polipéptido realizando un Western blot. Todos estos métodos son conocidos para el experto en la materia.
[0037] "Exhibir una actividad polipeptídica aumentada o más alta" se define aquí como exhibir una actividad de polipéptido más alta que la del hongo/seta progenitor del cual deriva el hongo/seta transformado usando un ensayo específico para una actividad de dicho polipéptido. Preferiblemente, el hongo/seta de la invención muestra al menos una actividad un 3 %, 6 %, 10 % o 15 % más alta de la que el hongo/seta progenitor del cual deriva el hongo/seta transformado mostrará como se evalúa utilizando un ensayo específico para una actividad de dicho polipéptido. También un hongo/seta que muestra al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 500 %, 1000 %, 10 000 % o más de dicha actividad que el hongo/seta progenitor es preferido. Según otra forma de realización preferida, el nivel de una actividad de dicho polipéptido del hongo/seta de la invención se compara con la actividad correspondiente de la cepa 4-8 de Schizophyllum commune (FGSC #9210), que se toma como control.
[0038] El experto en la materia conocerá qué actividad podría ser usada para cada polipéptido. En una forma de realización preferida, dicha actividad es una actividad transcripcional que se puede evaluar tal y como se define anteriormente aquí.
[0039] La sobreexpresión o aumento de expresión o sobrerregulación puede haber sido conseguida por métodos convencionales conocidos en la técnica, tal como por introducción de más copias de un nucleótido que codifica un polipéptido en un hongo/seta, bien sea en un portador o en el cromosoma, que las naturalmente presentes. Alternativamente, un nucleótido que codifica dicho polipéptido se puede sobreexpresar fusionándolo a un promotor fuerte o altamente expresado adecuado para la expresión de proteína de nivel alto en el hongo/seta seleccionado, o combinación de los dos métodos. El experto en la materia conocerá qué promotor fuerte es el más apropiado dependiendo de la identidad del hongo/seta. En este contexto, un promotor fuerte significa preferiblemente un promotor que es capaz de inducir una expresión más alta de la secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a este que la expresión de dicha secuencia de nucleótidos cuando está operativamente enlazada a su promotor endógeno. La sobreexpresión también se puede conseguir por otros métodos tales como por ejemplo mediante el aumento de estabilidad de ARNm o introduciendo intrones.
[0040] Según una forma de realización preferida, un hongo/seta tiene un nivel de expresión de un polipéptido que ha sido disminuido, es decir produce menos de las cantidades normales o tiene un nivel de producción disminuida de dicho polipéptido de la invención y/o muestra una actividad inferior para dicho polipéptido que el hongo/seta progenitor del cual deriva este hongo/seta cuando ambos se evalúan y/o cultivan bajo las mismas condiciones.
[0041] "Producir menos de la cantidad normal o tener un nivel de producción de dicho polipéptido disminuido" se define aquí como producir menos polipéptido de la invención de lo que el hongo/seta progenitor del cual deriva el hongo/seta transformado producirá cuando ambos tipos de células (progenitoras y células transformadas) son cultivadas bajo las mismas condiciones. Preferiblemente, un hongo/seta de la invención produce al menos un 3 %, 6 %, 10 % o 15 % menos del polipéptido de la invención del que el hongo/seta progenitor del cual deriva el hongo/seta transformado producirá cuando ambos tipos de células (progenitoras y células transformadas) son cultivadas bajo las mismas condiciones. También hongos/setas que producen al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o 150 % menos de dicho polipéptido que el hongo progenitor son preferidos. Está también abarcado por la presente invención que ninguna expresión de dicho polipéptido es detectable. Preferiblemente dicha expresión no es detectable durante al menos parte del ciclo de vida de dicho hongo/seta. Según otra forma de realización preferida, el nivel de producción del polipéptido del hongo/seta de la invención se compara con el nivel de producción del nivel de producción del mismo polipéptido en una cepa de control. Según una forma de realización aún más preferida, cuando el hongo/seta de la invención es una cepa de Schizophyllum, el nivel de producción del polipéptido del hongo/seta de la invención se compara con el nivel de producción de la cepa 4-8 de Schizophyllum commune (FGSC #9210), que se toma como control.
[0042] La evaluación del nivel de producción del polipéptido se puede realizar al nivel de ARNm por realización de un Northern Blot o un análisis de array y/o al nivel de polipéptido por realización de un Western blot. Todos estos métodos son conocidos por el experto en la materia.
[0043] "Exhibir una actividad polipeptídica menor o disminuida" se define aquí como exhibir una actividad de polipéptido inferior que la del hongo/seta progenitor del cual deriva el hongo/seta transformado usando un ensayo específico para una actividad de dicho polipéptido. Preferiblemente, el hongo/seta de la invención muestra como mínimo una actividad un 3 %, 6 %, 10 % o 15 % inferior de la que el hongo/seta progenitor del cual deriva el hongo/seta transformado mostrará como se evalúa utilizando un ensayo específico para una actividad de dicho polipéptido. También un hongo/seta que muestre al menos una actividad un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o 150 % menor de que el hongo/seta progenitor es preferido. Según otra forma de realización preferida, el nivel de una actividad de dicho polipéptido del hongo/seta de la invención se compara con la actividad correspondiente de la cepa 4-8 de Schizophyllum commune (FGSC #9210), que se toma como control. Aquí también una actividad de un polipéptido de la invención preferiblemente se refiere a una actividad transcripcional de dicho polipéptido como se ha definido en la presente anteriormente.
[0044] Según una forma de realización más preferida, un hongo/seta no produce ninguna cantidad detectable del polipéptido de la invención y/o no exhibe ninguna actividad detectable de dicho polipéptido. Preferiblemente, un hongo/seta no produce
- o no produce sustancialmente polipéptido de la invención.
[0045] La reducción del nivel de expresión del polipéptido de la invención y/o la reducción de su nivel de actividad puede haber sido conseguida por métodos convencionales conocidos en la técnica, tal como inactivación o regulación decreciente
- o disminución del nivel de expresión de un nucleótido endogéno que codifica dicho polipéptido de dicho hongo/seta.
[0046] El término "endógeno" cuando se usa respecto a un ácido nucleico o molécula polipeptídica se refiere a un ácido nucleico o polipéptido como está originalmente expresado en un hongo/seta, preferiblemente en un estado de tipo salvaje.
[0047] El término "heterólogo" se usa como opuesto de "endógeno". El término "heterólogo" cuando se usa respecto a un ácido nucleico o molécula de polipéptido se refiere a un ácido nucleico o polipéptido de un hongo/seta extraño que no existe naturalmente como parte de un hongo/seta dado (genoma o ADN o ARN de dicho hongo) o que se encuentra en un hongo/seta o ubicación o ubicaciones en el genoma o secuencia ADN o ARN que difiere de aquel en el que se haencontrado en la naturaleza. Ácidos nucleicos o proteínas heterólogos no son endógenos al hongo/seta en que ellos son introducidos, pero han sido obtenidos de otro hongo/seta o producidos sintéticamente o de recombinación. Generalmente, aunque no necesariamente, tales ácidos nucleicos codifican proteínas o polipéptidos que no son normalmente producidos por el hongo en el que el ADN es transcrito o expresado, de forma similar ARN exógeno codifica proteínas no expresadas normalmente en el hongo/seta en el que está presente el ARN exógeno. Además, es conocido que una proteína heteróloga
o polipéptido puede estar compuesta por elementos homólogos dispuestos en un orden y/o orientación no encontrado normalmente en un hongo/seta en el que son transferidas, es decir la secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína o polipéptido se origina de las mismas especies pero es sustancialmente modificada a partir de su forma nativa en la composición y/o locus genómico por intervención humana deliberada. Ácidos nucleicos heterólogos y proteínas también se puede denominar ácidos nucleicos o proteínas extraños. Cualquier ácido nucleico o proteína que un experto en la técnica reconocería como extraño o heterólogo a un hongo/seta en el que es expresado está aquí abarcado mediante el término ácido nucleico o proteína heterólogo. El término heterólogo también se aplica a combinaciones no naturales de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos, es decir combinaciones donde al menos dos de las secuencias combinadas son extrañas una con respecto a la otra.
[0048] Esta inactivación o regulación decreciente puede haber sido conseguida por eliminación de uno o más nucleótidos en el gen de codificación. Alternativamente, puede haber sido provocada por un mecanismo tipo ARNi. En otra forma de realización, la invención se refiere a un hongo/seta que tiene una mutación en su gen o nucleótido que codifica dicho polipéptido. Preferiblemente para construir un hongo/seta con un nucleótido inactivado que codifica dicho polipéptido, se prepara una sustitución o vector de inactivación y es posteriormente introducido en un hongo/seta por transformación. El experto en la materia sabe cómo construir tal vector. Por ejemplo, tal vector puede comprender regiones flanqueantes de un nucleótido codificante para un polipéptido con un gen marcador de selección presente en entre dichas regiones flanqueantes.
[0049] Alternativamente o en combinación con la inactivación del nucleótido endógeno que codifica dicho polipéptido, la expresión de dicho nucleótido que codifica dicho polipéptido se puede rebajar por fusión de este a un promotor débil adecuado para expresión de proteína de nivel bajo en el organismo fúngico seleccionado / seta seleccionada. Un promotor débil se define aquí como un promotor que es capaz de inducir una expresión inferior de la secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a este que la expresión de dicha secuencia de nucleótidos cuando está operativamente enlazada a su promotor endógeno.
[0050] Alternativamente o en combinación con cualquiera de las vías mencionadas de obtención de un hongo/seta de la invención, uno puede cruzar aislados naturales de hongo/seta con grados diferentes de expresión de los genes diana (es decir, nucleótido que codifica polipéptido como se identifica aquí) o uno puede modificar la expresión de estos genes por mutación, por modificación genética, o por otros métodos como la aplicación de una sustancia química o un estímulo físico. Una vía de modificación de la expresión de estos polipéptidos es someter un hongo a mutagénesis tradicional y selección para un hongo/seta con un nivel de expresión deseado de dichos polipéptidos como se identifica aquí.
[0051] Además, un hongo/seta está descrito donde el polipéptido cuyo nivel de expresión es aumentado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido o similitud con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID nº: 29, 177, 20, 56, 4; y/o que tiene al menos un 50 % de identidad de aminoácido o similitud con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n.º: 204, 207, 208, 202, 201, y donde el polipéptido cuyo nivel de expresión es disminuido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido o similitud con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n.º: 55, 21, 54; y/o que tiene al menos un 50 % de identidad de aminoácido o similitud con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n.º: 206, 205, 203.
[0052] Los 200 genes identificados están presentes en la tabla 1. Para conocer si la expresión de un gen/nucleótido dado de tabla 1 tiene que ser aumentada o disminuida, el experto en la materia puede reducir, preferiblemente inactivar este gen en un hongo o seta. Preferiblemente una seta es un Schizophyllum. Más preferiblemente cepa 4-8 (FGSC#9210) de Schizophyllum commune. Posteriormente, uno analiza si una seta será producida en comparación con la producción de seta de una seta de control donde dicha secuencia de nucleótidos no ha sido inactivada. Vías de inactivar un gen han sido descritas aquí.
[0053] Si una seta no se produce o si menos seta es producida, el nivel de expresión de dicha secuencia de gen/nucleótido
o nivel de expresión correspondiente de actividad del polipéptido codificado deberá preferiblemente ser aumentado en un hongo/seta incluido por la presente invención.
[0054] Por el contrario, si una seta se produce o si más seta es producida, dicha secuencia de gen/nucleótido o nivel de expresión correspondiente de actividad del polipéptido codificado deberá preferiblemente ser disminuido en un hongo/seta incluido por la presente invención. No obstante, si las agrupaciones de hongos se evitan, luego el nivel de expresión de actividad del polipéptido codificado deberá preferiblemente ser aumentado en un hongo/seta incluido por la presente invención. Por ejemplo, cuando se desea que una seta se desarrolle que no se obstaculice por otras, quizás más pequeñas, setas en su proximidad que no se desarrollan completamente. Por ejemplo, los inventores han encontrado que la inactivación de SEC ID n.º: 21, 54, 55 condujo a más producción de seta. Por lo tanto, para producir más hongos, se prefiere reducir la expresión de un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos con identidad o similitud a SEC ID n.º: 21, 54, o 55 como se define además en otra parte aquí. No obstante, si menos hongos pero más grandes son deseados, se prefiere sobreexpresar un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos con identidad o similitud a SEC ID n.º: 21, 54, o 55.
[0055] El significado de menos seta es preferiblemente al menos un 3 %, 6 %, 10 % o 15 % menos de las setas que la seta progenitora de la cual deriva la seta transformada producirá cuando ambos tipos de células (progenitoras y células transformadas) son cultivadas bajo las mismas condiciones. También al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o 150 % menos de dicha seta que las setas progenitoras son preferidos. Está también incluido por la presente invención que ninguna seta es detectable.
[0056] El significado de más setas es preferiblemente al menos un 1 %, 3 %, 6 %, 10 % o 15 % más setas de lo que la seta progenitora de la cual deriva la seta transformada producirá cuando ambos tipos de células (progenitoras y células transformadas) son cultivadas bajo las mismas condiciones. También al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 500 %, 1000 %, 10 000 % o más de dicha seta que las setas progenitoras son preferidos.
[0057] La detección de seta es preferiblemente hecha visualmente, tal como por ejemplo determinando el número de setas en una placa petri, un contenedor con sustrato o en un lecho de seta.
[0058] En la parte experimental algunos genes identificados en la tabla 1 ha sido ya inactivados. Los resultados se presentan en la tabla 3. De estos resultados, concluimos que en una forma de realización preferida, un hongo/seta está provisto donde el polipéptido cuyo nivel de expresión es aumentado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 82 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de aminoácido o similitud con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n.º: 204, 207, 208, 202 y 201 y donde el polipéptido cuyo nivel de expresión es disminuido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 82 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de aminoácido o similitud con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n.º: 206, 205 y 203.
[0059] SEC ID n.º: 204, 207, 208, 202 y 201 codifica partes de fst4, hom2, wc2, c2h2, briI respectivamente. Las proteínas correspondientes se identifican por los siguiente ID en la Tabla 1: 66861, 257987, 13988, 114363, 255701 (SEC ID n.º: 29, 177, 20, 56, 4, respectivamente).
[0060] SEC ID n.º: 206, 205 y 203 codifican las partes de hom1, gat1, y fst3 respectivamente. Proteínas correspondientes se identifican por el siguiente ID en la tabla 1: 257652, 255004, 257422 (SEC ID n.º: 55, 21, 54, respectivamente).
[0061] Tal hongo/seta es atractivo para ser usado en muchas aplicaciones diferentes.
[0062] Estos procedimientos mejorarían/permitirían la producción de seta. Mejorar o permitir la producción de seta comercial puede resultar de
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- crecimiento en sustratos que todavía no pueden ser usados para criar setas comercialmente
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- formación controlada de setas en tiempo y espacio
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- niveles de producción aumentados
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- calidad aumentada (p. ej. más homogeneidad en tamaño y crecimiento)
[0063] En otra forma de realización, nuestra invención puede permitir mejorar el crecimiento de setas en una preparación comercial, o permitir la producción comercial de especies que todavía no pueden ser producidas, creando así oportunidades para producir hongos comestibles de forma más barata o producir (o mejorar producción de) fármacos o proteínas que son de interés para agricultura, alimentos, alimentación o aplicaciones sin alimentación o no alimentarias. Estas proteínas se pueden originar o no de los hongos que forman seta. Algunas aplicaciones posibles de un hongo de la invención están presentadas a continuación.
Método para la producción
[0064] En otro aspecto, se proporciona un método para la producción de un hongo/seta como se identifica en la sección precedente. El experto en la materia sabe cómo llevar a cabo tal método por ejemplo descrito en Stamets y Chilton (1983) y van Griensven (1988). Tal producción incluye la colonización de un sustrato (con o sin una capa de cobertura) seguida de una fase donde cuerpos frutales son producidos. La producción se puede realizar a una escala comercial con un nivel de producción y/o nivel de calidad óptimos (más homogeneidad en tamaño y crecimiento).
[0065] La invención también se refiere a un método para producir una sustancia de interés que utiliza un hongo/seta de la invención. En este método, un hongo/seta puede haber sido modificado con el objetivo de ser capaz de producir dicha sustancia. Una sustancia de interés puede ser cualquier sustancia que podría ser producida por un hongo/seta. Tal sustancia incluye una proteína, un polipéptido, un metabolito. Una proteína o polipéptido en este contexto puede una proteína farmacéutica o polipéptido y/o una proteína o polipéptido para interés para alimentos, alimentación, o, aplicaciones no alimentarias, sin alimentación. Tal sustancia puede ser endógena para un hongo/seta o no. Preferiblemente, el método comprende los pasos de: cultivo de un hongo/seta de la invención que es capaz de producir una sustancia de interés bajo circunstancias que son propicias para la generación de la sustancia de interés; y recuperación opcional de la sustancia de interés.
[0066] En una forma de realización, un hongo/seta comprende un constructo de ácidos nucleicos que comprende un nucleótido que codifica una proteína/polipéptido que debe ser producido. En este caso, una sustancia de interés puede ser tal proteína/polipéptido. Alternativamente, dicha proteína/polipéptido puede estar implicado en la producción o síntesis de tal sustancia de interés. Cada característica de dicho constructo de ácidos nucleicos ha sido anteriormente definida aquí. Está también incluido por la presente invención usar un hongo/seta que ha sido modificado aumentando/disminuyendo el nivel de expresión de una proteína/polipéptido que se conoce que interviene en el método de producción de dicha sustancia.
Método para identificación
[0067] El control de los niveles de expresión de tales genes o nucleótidos que codifican dicho polipéptido puede permitir la identificación de estímulos que están implicados en un método para la producción de una seta.
[0068] Por lo tanto en otro aspecto se proporciona un método para la identificación de un estímulo capaz de influir la producción de una seta, el método incluye las etapas de:
- (a)
- proporcionar un hongo/seta;
- (b)
- aplicar dicho estímulo a dicho hongo/seta;
- (c)
- determinar el nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos o la actividad o nivel estable de un polipéptido codificado correspondiente en el hongo/seta del paso b) donde dicho polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º:56 o que tiene al menos un 50 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 202;
- (d)
- comparar la expresión, actividad o nivel estable determinado en (c) con la expresión, actividad o nivel estable de la secuencia de nucleótidos o del polipéptido en un hongo/seta al que no se ha proporcionado dicho estímulo; y,
- (e)
- identificar un estímulo que produce una diferencia en el nivel de expresión, actividad o nivel estable de dicha secuencia de nucleótidos o polipéptido, entre el hongo/seta que ha sido provisto de dicho estímulo y el hongo/seta al que no se ha proporcionado dicho estímulo.
[0069] Un estímulo puede ser cualquier tipo de estímulo. Puede ser un estímulo físico como un aumento/reducción en la temperatura, un aumento/reducción en la intensidad de luz, un cambio en la longitud de onda de la luz, crear algún grado de daño por ejemplo por luz o medios mecánicos. Puede ser una sustancia o la presencia de un organismo muerto o vivo.
[0070] En un método preferido, los niveles de expresión, actividades o niveles estables de más de una secuencia de nucleótidos o más de un polipéptido son comparados. Polipéptidos preferidos y secuencia de nucleótidos codificante ya han sido identificados aquí.
[0071] En un aspecto la invención también pertenece a una sustancia, tratamiento u organismo vivo o muerto que se identifica en dicho método.
[0072] Cada característica de este método ha sido ya explicada aquí.
[0073] El significado de "produce una diferencia en el nivel de expresión, actividad o nivel estable de la secuencia de nucleótidos o el polipéptido" es el mismo que el de "nivel de expresión aumentado de un polipéptido y/o un nivel de expresión disminuido de un polipéptido".
[0074] En otro aspecto, usaremos un elemento promotor que es sensible a (los) genes reguladores (identificados) para:
- (i)
- identificar genes (secuencia abajo) que afectan a la formación de seta (p. ej., pero no limitado a, el número de setas, o el tamaño de una seta);
- (ii)
- generar modelos biológicos, basados en razas de setas comerciales presentes o futuras que permitirán:
- A.
- identificación, caracterización y aplicación de (conjuntos) específicos de genes reguladores, o genes que codifican proteínas estructurales pertinentes para unas especies específicas;
- B.
- caracterización y aplicación mejorada de moduladores del estado de la técnica usados para el cultivo de setas;
- C.
- generación o identificación de derivados de moduladores del estado de la técnica usados para el cultivo de hongos con características nuevas o mejoradas;
- D.
- generación o identificación de compuestos nuevos que permitirán el cultivo mejorado de setas, o pueden permitir el cultivo comercial de setas que actualmente no pueden ser producidos comercialmente.
Identidad de secuencia
[0075] "Identidad de secuencia" se define aquí como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptido o proteína) o dos o más secuencias de ácido nucleico (nucleótido; polinucleótido), como se determina por comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos, si necesario, como se determina por la correspondencia entre cadenas de tales secuencias. La "similaridad" entre dos secuencias de aminoácidos se determina por comparación de la secuencia de aminoácidos y su aminoácido conservado sustituye de un polipéptido a la secuencia de un segundo polipéptido. La "similaridad" e "identidad" pueden ser fácilmente calculadas por métodos conocidos, incluyendo pero no limitado a los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).
[0076] Métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para dar la correspondencia más amplia entre las secuencias evaluadas. Métodos para determinar identidad y similitud se codifican en programas informáticos públicamente disponibles. Métodos de programa de ordenador preferidos para determinar identidad y similitud entre dos secuencias incluyen por ejemplo el paquete de programa GCG (Devereux et al., 1984). BestFIT, BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul, et al., 1990). El programa BLAST X es públicamente disponible de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). El algoritmo de Smith Waterman bien conocido también se puede usar para determinar identidad.
[0077] Parámetros preferidos para la comparación de secuencias polipeptídicas incluyen los siguiente: Algoritmo: Needleman y Wunsch (1970); matriz de comparación: BLOSSUM62 de Hentikoff y Hentikoff (1992); penalización del espacio: 12; y penalización de longitud del espacio: 4. Un programa útil con estos parámetros es públicamente disponible como el programa "Ogap" de Genetics Computer Group, localizado en Madison, WI. Los parámetros ya mencionados son los parámetros por defecto para comparaciones de aminoácido (junto con ninguna penalización para espacios finales).
[0078] Parámetros preferidos para comparación de ácido nucleico incluyen lo siguiente: algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); matriz de comparación: combinaciones=+10; discordancia=0; penalización del espacio: 50; penalización de longitud del espacio: 3. Disponible como programa Gap de Genetics Computer Group, localizado en Madison, Wis. Anteriormente están dados los parámetros por defecto para comparaciones de ácidos nucleicos.
[0079] Opcionalmente, determinando el grado de similitud de aminoácidos, el experto en la materia también puede tener en cuenta las denominadas sustituciones de aminoácidos "conservativas", como estará claro para el experto en la materia. Sustituciones de aminoácidos conservadoras se refieren a la intercambiabilidad de residuos con cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos con cadenas alifáticas laterales es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales alifáticas de hidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos con cadenas aromáticas laterales es fenilalanina, tirosina, y triptófano; un grupo de aminoácidos con cadenas laterales básicas es lisina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoácidos con azufre que contiene cadenas laterales es cisteína y metionina. Grupos de sustitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina- isoleucina de leucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina. Variantes de sustitución de la secuencia de aminoácidos descritas aquí son aquellas en las que al menos un residuo en las secuencias descritas ha sido eliminado y un residuo diferente insertado en su posición. Preferiblemente, el cambio de aminoácido es conservador. Sustituciones conservadoras preferidas para cada uno de los aminoácidos de origen natural son de la siguiente manera: Ala a ser; Arg a lys; Asn a gln o His; Asp a glu; Cys a ser o ala; Gln a asn; Glu a asp; Gly a pro; His a asn o gln; Ile a leu o val; Leu a ile o val; Lys a arg; gln o glu; Met a leu o ile; Phe a met, leu o tyr; Ser a thr; Thr a ser; Trp a tyr; Tyr a trp o phe; y, Val a ile o leu.
[0080] En este documento y en sus reivindicaciones, el palabra "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para significar que los artículos después de la palabra están incluidos, pero artículos no específicamente mencionados no son excluidos. Además el palabra "consistir" se puede sustituir por "consistir esencialmente en" que significa que un producto o una composición tal y como se define aquí puede comprender componente(s) adicional(es) que aquellos específicamente identificados, dicho(s) componente(s) adicional(es) no alteran la característica única de la invención. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "uno" no excluye la posibilidad de que más de uno del elemento esté presente, a menos que el contexto requiera claramente que allí haya uno y sólo uno de los elementos. El artículo indefinido "un" o "uno" así normalmente significa "al menos uno".
[0081] Los siguientes ejemplos se ofrecen para uso ilustrativo sólo, y no se destinan a limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.
Descripción de las figuras
[0082]
Figura 1: La formación del cuerpo frutal en un dicarión tipo salvaje (A; D) y en dicariones en que los genes fst3 (B, E) y fst4 (C; F) han sido inactivados. D-F muestran una ampliación de parte de las colonias mostradas en A-C. La barra representa 5 mm (D-F).
Figura 2: Alineamiento de secuencias proteínicas de WC2 de S. commune (ID de proteína 13988), L. bicolor (ID de proteína
306097) y C.cinereus (ID de proteína CC1G_01095).
Identidad de secuencia se indica con un asterisco (*) y similitud con un punto y coma (:) sobre el alineamiento. El
alineamiento se realizó utilizando CLUSTAL 2.0.12.
Figura 3 : El alineamiento de secuencias proteínicas de C2H2 de S. commune (ID de proteína 114363), L. bicolor (ID de
proteína 310874) y C. cinereus (ID de proteína CC1G_08877).
Identidad de secuencia se indica con un asterisco (*) y similitud con un punto y coma (:) sobre el alineamiento. El
alineamiento se realizó utilizando CLUSTAL 2.0.12.
Figura 4: El Alineamiento de secuencias proteínicas de Fst3 de S. commune (ID de proteína 257422), L. bicolor (ID de
proteína 307309) y C. cinereus (ID de proteína CC1G_02690).
Identidad de secuencia se indica con un asterisco (*) y similitud con un punto y coma (:) sobre el alineamiento. El
alineamiento se realizó utilizando CLUSTAL 2.0.12.
Figura 5: El Alineamiento de secuencias proteínicas de Fst4 de S. commune (ID de proteína 66861), L. bicolor (ID de
proteína 308722) y C. cinereus (ID de proteína CC1G_05035).
Identidad de secuencia se indica con un asterisco (*) y similitud con un punto y coma (:) sobre el alineamiento. El
alineamiento se realizó utilizando CLUSTAL 2.0.12.
Figura 6: El Alineamiento de secuencias proteínicas de Gat1 de S. commune (ID de proteína 255004), L. bicolor (ID de
proteína 292733) y C. cinereus (ID de proteína CC1G_01461).
Identidad de secuencia se indica con un asterisco (*) y similitud con un punto y coma (:) sobre el alineamiento. El
alineamiento se realizó utilizando CLUSTAL 2.0.12.
Figura 7: El Alineamiento de secuencias proteínicas de Hom1 de S. commune (ID de proteína 257652), L. bicolor (ID de
proteína 324166) y C. cinereus (ID de proteína CC1G _01991).
Identidad de secuencia se indica con un asterisco (*) y similitud con un punto y coma (:) sobre el alineamiento. El
alineamiento se realizó utilizando CLUSTAL 2.0.12.
Figura 8: El Alineamiento de secuencias proteínicas de Hom2 de S. commune (ID de proteína 257987), L. bicolor (ID de
proteína 293988) y C. cinereus (ID de proteína CC1G_01962).
Identidad de secuencia se indica con un asterisco (*) y similitud con un punto y coma (:) sobre el alineamiento. El
alineamiento se realizó utilizando CLUSTAL 2.0.12.
Figura 9: El Alineamiento de secuencias proteínicas de Bril de S. commune (ID de proteína 255701), L. bicolor (ID de proteína 300797) y C. cinereus (ID de proteína CC1G_03649).
Identidad de secuencia se indica con un asterisco (*) y similitud con un punto y coma (:) sobre el alineamiento. El alineamiento se realizó utilizando CLUSTAL 2.0.12.
Ejemplos
Ejemplo 1: identificación de factores de transcripción putativos en el genoma de Schizophyllum commune
[0083] El análisis automático de genes del genoma de la cepa de Schizophyllum commune 4-8 (FGSC #9210) (8,29X cobertura) por el Joint Genome Institute resultó en 13181 genes predichos (ver http://jgi.doe.gov/Scommune). Estos genes fueron automáticamente anotados utilizando GO (ontología de gen) (Ashburner et al., 2000), KOG (Grupos de ortólogos eucariotas) (Koonin et al., 2004) y algoritmos PFAM (Finn et al., 2008). Esta anotación automática fue usada como un punto de partida para identificar factores de transcripción (TFs):
- •
- Basado en dominios de unión de ADN conocidos, 190 genes fueron colocados en el término de accesión de GO "Actividad de Factor de Transcripción" (GO:0003700).
- •
- El algoritmo de anotación KOG predijo 569 genes para ser generalmente implicados en la transcripción (función ID: "K"). De estos, 205 factores de transcripción fueron manualmente identificados.
- •
- Un total de 151 POLIPÉPTIDOS fueron identificados basados en la presencia de dominio PFAM PF00096/IPR007087 (Dedo de zinc, tipo C2H2).
Todos los TF putativos fueron manualmente inspeccionados y el modelo de gen o anotación fueron ajustados cuando fue necesario. Entradas duplicadas en la lista fueron eliminadas. Para identificar TF que faltaron durante la anotación automática, los TF identificados fueron usados en un análisis BLASTp (a la base de datos de proteínas predichas) y BLASTn (a la base de datos genómica). Los resultados resultantes fueron manualmente inspeccionados y los nuevos TF identificados fueron adicionados a la lista. Estos procedimientos condujeron a la identificación de 472 TF putativo en el genoma de S. commune.
Perfil de expresión de los factores de transcripción putativos
[0084] Para determinar el perfil de expresión de los TF putativos durante el desarrollo del cuerpo frutal, usamos la técnica MPSS (secuenciación masivamente paralela). El ARN total fue aislado de la cepa monocariótica 4-40 (CBS 340.81) y del dicarión resultando a partir de un cruce entre 4-40 y 4-39 (CBS 341.81). Una colonia de 7 días de edad crecida en MM sólido a 30 ºC en la oscuridad fue homogeneizada en 200 ml MM utilizando una Waring blender durante 1 min a velocidad baja. 2 ml del micelio homogeneizado fue difundido sobre una membrana de policarbonato que fue colocado encima del MM solidificado. Micelio monocariótico vegetativo fue crecido durante 4 días en la luz. El dicarión fue crecido durante 2 y 4 días en la luz para aislar micelio con agregados en fase I y fase II primordia, respectivamente. Setas maduras de 3 días de edad fueron escogidas de cultivos dicarióticos que han crecido durante 8 días en la luz. ARN fue aislado como se describe (van Peer et al., 2009). MPSS fue realizado esencialmente como se describe (Brenner et al., 2000) excepto que después de la digestión DpnII MmeI fue usado para generar 20 indentificativos de pares de bases. Los identificativos fueron ordenados utilizando la técnica Clonal Single Molecule Array (Illumina, Hayward, CA, US). Programas fueron desarrollados en el lenguaje de programación Python para analizar los datos. Las cuentas de identificativos fueron normalizadas a transcritos por millón (TPM). Los indentificativos con un máximo de < 4 TPM fueron eliminados del conjunto de datos. Valores TPM de indentificativos originados del mismo transcrito fueron sumados para valorar sus niveles de expresión. Si el gen de un TF putativo no contenía un UTR 5' o 3' conocido, entonces 200 pares de bases de ADN genómico se añadieron al final respectivo de la secuencia codificante del gen. El análisis de expresión MPSS estaba de acuerdo con estudios de expresión que han sido realizados en el pasado (para una revisión véase Wösten, H.A.B. & Wessels, 2006).
Identificación de perfiles de expresión interesantes
[0085] Un TF se considera que está potencialmente implicado en la regulación de formación del cuerpo frutal cuando está regulado tanto creciente como decrecientemente en una de las fases desarrollables en comparación con el monocarión estéril. Hay 75 TFs que fueron regulados crecientemente al menos al doble, y 155 al menos regulado decrecientemente a la mitad. De manera más interesante, 29 de estos fueron al menos regulados crecientemente al cuádruple y 77 al menos reducidos cuatro veces. Incluso de manera más interesante, 9 fueron al menos regulados crecientemente en diez veces más y 27 al menos regulados decrecientemente en diez veces. Los ID de proteína y los valores MPSS de estos TF interesantes están indicados en la Tabla 1.
+
Conservación de POLIPÉPTIDOS en el reino fúngico
[0086] Para determinar el nivel de conservación de los TF en todo el reino fúngico, secuencias proteínicas fueron analizadas
con BLAST frente a las bases de datos de proteína de Laccaria bicolor, Coprinus cinereus, Phanerochaete chrysosporium,
Cryptococcus neoformans (H99), Cryptococcus neoformans (JEC21), Ustilago maydis, Aspergillus niger (secuencia DSM),
Aspergillus niger (Broad Institute), Magnaporthe grisea y Neurospora crassa.
El valor esperado y el nombre del máximo resultado con las bases de datos de proteína de los hongos que forman seta
Coprinus cinereus y Laccaria bicolor se indican en la Tabla 1.
Ejemplo 2: Prueba de principio: inactivación de fst3 (ID de proteína 257422) afecta al desarrollo de seta
[0087] Una inactivación fue hecha del gen de factor putativo de transcripción fst3 (ID de proteína 257422). Con este fin, el vector pDelcas fue usado como se describe en Ohm et al. (2010). Cebadores que fueron usados para crear el constructo de inactivación se indican en la tabla 2. Este constructo de inactivación llamado pRO097 consiste en las regiones flanqueantes de la secuencia codificante de fst3 entremedias de las cuales el casete de resistencia de nourseotricina es situado. El casete de resistencia a fleomicina está presente en otro lugar en el constructo (para detalles véase Ohm et al., 2010). La transformación de la cepa H4-8 de S. commune fue hecha como se describe (van Peer et al., 2009). El medio de regeneración no contiene ningún antibiótico, mientras que las placas de selección contienen 20 µg ml-1 de nourseotricina. La eliminación del gen objetivo fue confirmada por PCR (para procedimiento véase Ohm et al., 2010). Monocariones compatibles con una deleción génica fueron seleccionados de esporas originadas de un cruce de las cepas mutantes con la cepa tipo salvaje 4-8.3 (L.G. Lugones, inédito). Monocariones con un gen fst3 inactivado no mostraron ningún fenotipo cuando se compara con el tipo salvaje. Por otro lado, dicariones ∆fst3∆fst3 mostraron claras diferencias en el desarrollo de seta en comparación con el tipo salvaje. Cuando se crece a partir de un inóculo de punto, las setas crecieron en el misma ubicación que en el tipo salvaje, pero el número de setas fue aumentado y el tamaño disminuido (ver figura 1). Cuando se crece como una colonia sincronizada (por depósito del micelio homogeneizado), el número de setas aumenta (datos no mostrados). De estos datos nosotros concluimos que Fst3 inhibe formación de agrupaciones de setas. Esta regulación puede ser importante en un entorno natural para asegurar que energía suficiente es disponible para desarrollo del cuerpo frutal completo.
Ejemplo 3: Prueba de principio: una inactivación de fst4 (ID de proteína 66861) afecta al desarrollo de seta
[0088] Una inactivación fue hecha del gen de factor putativo de transcripción fst4 (ID de proteína 66861). Con este fin, el vector pDelcas fue usado como se describe en Ohm et al. (2010). Cebadores que fueron usados para crear el constructo de inactivación se indican en la tabla 2. El constructo de inactivación llamado pRO191 consiste en las regiones flanqueantes de la secuencia codificante de fst4 entremedias de las cuales el casete de resistencia de nourseotricina es situado. El casete de resistencia de fleomicina está presente en otro lugar en el constructo (para detalles véase Ohm et al., 2010). Transformación de cepa H4-8 de S. commune fue hecha como se describe (van Peer et al., 2009). El medio de regeneración no ha contenido ningún antibiótico, mientras que placas de selección han contenido 20 µg ml-1 de nourseotricina. La eliminación del gen objetivo fue confirmada por PCR (para procedimiento véase Ohm et al., 2010). Monocariones compatibles con una deleción génica fueron seleccionados de esporas originadas de un cruce de las cepas mutantes con una cepa tipo salvaje 4
8.3. El monocarión ∆fst4 no mostró diferencias fenotípicas cuando se compara con el tipo salvaje. En cambio, el dicarión ∆fst4∆fst4 no produjo fruto pero produjo más hifas de antena cuando se compara con el tipo salvaje (figura 1). Aparentemente, Fst4 está implicado en el cambio entre la fase vegetativa y la fase reproductiva.
Tabla 2: Cebadores usados para inactivar los factores putativos de transcripción (continuación)
- Gen (ID de proteína)
- Constructo de deleción (pROxxxx) con cebadores usados para amplificar las secuencias flanqueantes
- c2h2 (114363)
- pRO103
- dC2H2UpFw
- GGCCTAATAGGCCCGGATGCTTTCTCGGAGAGG
- dC2H2UpRev
- GGCCTCGCAGGCCGAGCAGATGCTTCGCTCCGG
- dC2H2DwFw
- GGCCTGCGAGGCCCCAGTCGACCTCAATTAGCC
- dC2H2DwRev
- GGCCTATTAGGCCGCCCCTCACCCGTGTACCCG
- gat1 (255004)
- pRO190
- dGATA1UpFw
- GGCCTAATAGGCCTGGTCAAGGCATCCCGCAG
- dGATA1DwFw
- GGCCTGCGAGGCCTACTCTCATGCGAGACCCAC
- dGATA1DwRev
- GGCCTATTAGGCCCGTGGGTTGTTGAACTTACC
- fst4 (66861)
- pRO191
- dFst4UpFw
- GGCCTAATAGGCCACAAGCAGCAGAGGCTTGG
- dFst4UpRev
- GGCCTCGCAGGCCGATTCGGACAGTCGAG
- dFst4DwFw
- GGCCTGCGAGGCCGACTATAGGATGGTGAGCG
- dFst4DwRev
- GGCCTATTAGGCCCAAACGGTGTCGGGAACGC
- fst3 (257422)
- pRO097
- dFst3UpFw
- GGCCTAATAGGCCCGTTTCCTAGTACACCTGTC
- dFst3UpRev
- GGCCTCGCAGGCCGGAGAACGGGGTCCAGCAGG
- dFst3DwFw
- GGCCTGCGAGGCCAGACCACCGAAGGATAGTTG
- dFst3DwRev
- GGCCTATTAGGCCTCGTTGCTATCAGGAGCGGC
- wc2 (13988)
- pRO192
- dWC2UpFw2
- GGCCTAATAGGCCACCGTCACGTCCATGTTCG
- dWC2UpRev2
- GGCCTCGCAGGCCCGAAACAACAATGATTG
- dWC2DwFw
- GGCCTGCGAGGCCCTAGATGTTCGGTAATTGCC
- dWC2DwRev
- GGCCTATTAGGCCCAGCCACCCATCTCGACTTG
- hom2 (257987)
- pRO189
- dHom2UpFw
- GGCCTAATAGGCCTTGAGATGTTGCCTTGTCG
- dHom2UpRev
- GGCCTCGCAGGCCCAAGAGCAAGCGTTGAG
- dHom2DwFw
- GGCCTGCGAGGCCCACGATCTACCCAAACAG
- dHom2DwRev
- GGCCTATTAGGCCAGATCCAACGTGAGAGCCAG
- hom1 (257652)
- pRO093
- dHom1UpFw2
- GGCCTAATAGGCCAGTGCTGGTGAGACTCACG
- dHom1UpRev2
- GGCCTCGCAGGCCCGATTGGTACGAGCTGGATG
- dHom1DwFw
- GGCCTGCGAGGCCCATTCTCATATGCCTCAAAC
- dHom1DwRev
- GGCCTATTAGGCCTCGTCTCTATTCACAACCGC
- bri1 (255701)
- pDelcas-BRIGHT
- dBrightUpFw
- GGCCGAATGGGCCGTATGAAGGAAG
- dBrighUpRev
- GGCCCCGCTGGCCCTGCAAACGAAC
- dBrightDwFw
- GGCCAGCGAGGCCAGGTCCGTGATCCTTTGTG
Ejemplo 4: Prueba de principio: inactivaciones de otros factores de transcripción putativos
[0089] Además de fst3 y fst4, otros 6 genes de factor de transcripción putativos han sido inactivados. La inactivación ha seguido los procedimientos anteriormente descritos utilizando cebadores indicados en la Tabla 2. Estas deleciones también afectaron a la formación de seta (ver Tabla 3)
Tabla 3 Factores de transcripción de S. commune que han sido inactivados.
- Nombre
- Proteína ID Inactivación de fenotipo
- hom2
- 257987 Sin setas, crecimiento de colonia radial
- wc2
- 13988 Sin setas, crecimiento de colonia radial
- fst4
- 66861 Sin setas, crecimiento de colonia radial
- c2h2
- 114363 Desarrollo se detiene en la fase I
- fst3
- 257422 Más setas pero más pequeñas
- gat1
- 255004 Más setas pero más pequeñas
- hom1
- 257652 Más setas pero más pequeñas
- bri1
- 255701 No se han formado setas
[0090] Estos resultados claramente muestran que con el método descrito anteriormente hemos identificado factores de 10 transcripción que están implicados en el desarrollo del cuerpo frutal en S. commune.
Ejemplo 5
[0091] Las bases de datos pública de proteína de Coprinopsis cinerea y Laccaria bicolor fueron examinadas en cuanto a
15 homólogos de los 8 factores de transcripción (Tabla 3) utilizando el algoritmo de BLASTP (versión 2.2.23+, utilizando ajustes por defecto). La secuencia de proteína del mejor resultado fue extraída de la base de datos. Los alineamientos se realizaron con ClustalX (versión 2.0.12, utilizando los ajustes por defecto) identificando dominios conservados en las secuencias proteínicas (Tabla 4, figuras 2 - 9).
20 Tabla 4: Dominios de factores de transcripción de S. commune que se conservan en C. cinerea y L. bicolor.
- Factor de transcripción
- Comienzo de dominio Final de dominio Secuencia de dominio
- Bri1
- 283 358
- C2h2
- 192 247
- Fst3
- 593 716
- Fst4
- 329 463
- Gat1
- 221 291
(continuación)
- Hom1
- 222 228
- Hom2
- 67 139
- Wc2
- 27 83
Tabla 5. Relación de ID de proteína (véase (http://jgi.doe.gov/Scommune) y dominio de proteína (ver tabla 4) y SEC ID n.º como se utiliza en este caso.
ID de proteína SEQ ID n.º: ID de proteína SEQ ID n.º: ID de proteína SEQ ID n.º: 84275 1 102836 33 237000 65 112067 2 102971 34 110445 66 75142 3 103145 35 269975 67 255701 4 105299 36 256910 68 17463 5 108072 37 84085 69 80413 6 269950 38 104304 70 269940 7 110010 39 111555 71 68168 8 110310 40 258217 72 80935 9 110595 41 257931 73 65208 10 269932 42 269938 74 269941 11 111234 43 110229 75 81364 12 269957 44 112017 76 236086 13 113625 45 110458 77 258244 14 114874 46 255386 78 233954 15 230844 47 14572 79 81115 16 233513 48 81262 80 50846 17 236631 49 269939 81 269944 18 255185 50 48318 82 11907 19 255490 51 257380 83 13988 20 255941 52 112634 84 255004 21 256135 53 255183 85 85539 22 257422 54 80526 86 83110 23 257652 55 107138 87 16376 24 114363 56 236743 88 53446 25 103949 57 105290 89 (continuación) ID de proteína SEQ ID n.º: ID de proteína SEQ ID n.º: ID de proteína SEQ ID n.º: 67562 26 250177 58 84273 90 54452 27 258543 59 254923 91 86194 28 85474 60 71685 92 66861 29 11542 61 237374 93 255327 30 110354 62 255836 94 84267 31 230646 63 255161 95 84657 32 110178 64 62967 96 79748 97 231700 131 111623 165 82694 98 256693 132 269956 166 112825 99 257455 133 231698 167 257915 100 258832 134 234557 168 103232 101 52392 135 234560 169 81412 102 257495 136 269958 170 269943 103 57298 137 255656 171 102719 104 57817 138 255852 172 255207 105 83015 139 256706 173 17379 106 269928 140 257056 174 73063 107 63410 141 257622 175 104375 108 66095 142 257926 176 85886 109 66586 143 257987 177 232127 110 73210 144 269960 178 257445 111 74309 145 257265 179 104344 112 74719 146 269961 180 81107 113 77191 147 248401 181 255863 114 78089 148 82883 182 232771 115 81726 149 84749 183 233370 116 81806 150 110478 184 256320 117 84684 151 254870 185 109936 118 269945 152 258883 186 114988 119 254988 153 108216 187 111683 120 255385 154 108605 188 230584 121 104000 155 102516 189 232060 122 269948 156 256746 190 66326 123 269949 157 258642 191 78316 124 256993 158 112405 192
(continuación) ID de proteína SEQ ID n.º: ID de proteína SEQ ID n.º: ID de proteína SEQ ID n.º:
86018 125 108591 159 83895 193 257247 126 109190 160 109596 194 232448 127 269952 161 269979 195 232514 128 110136 162 77161 196 63699 129 110416 163 233354 197 111405 130 250298 164 233946 198 ID de proteína SEQ ID NO: 12349 199 250247 200 Domino de proteína SEQ ID NO: Dominio Bri1 201 Dominio C2h2 202 Dominio Fst3 203 Dominio Fst4 204 Dominio de proteína SEQ ID NO: Dominio Gat1 205 Dominio Hom1 206 Dominio Hom2 207 Dominio Wc2 208
[0092]
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LISTADO DE SECUENCIAS
[0093]
<110> Stichting voor de Technische Wetenschappen Universiteit Holding B.V.
<120> Reguladores implicados en la formación de seta
<130> P6030560PCT
<150> US 61/212,953
<151> 2009-04-20
<160> 241
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 284
<212> PRT
<213> Schizophyllum commune
<400> 1
Claims (12)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Hongo o seta con un nivel de expresión aumentado de un polipéptido implicado en la formación de seta, donde el polipéptido tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 56 y/o tiene al menos un 50 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 202, y donde el nivel de expresión aumentado del polipéptido es una producción aumentada del polipéptido y/o una actividad más alta de dicho polipéptido que el hongo/seta progenitor del que deriva este hongo/seta cuando ambos son evaluados y/o son cultivados bajo las mismas condiciones.
-
- 2.
- Hongo o seta según la reivindicación 1, que comprende además un nivel aumentado o disminuido de expresión de un polipéptido, donde el polipéptido cuyo nivel de expresión es aumentado o disminuido tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con una secuencia seleccionada de SEC ID nº: 1-55, 57-200 y/o que tiene al menos un 50 % de identidad de aminoácido con una secuencia seleccionada de SEC ID nº: 201, 203-208.
-
- 3.
- Hongo o seta según la reivindicación 1, donde el polipéptido del cual el nivel de expresión es aumentado es un polipéptido heterólogo.
-
- 4.
- Hongo o seta según la reivindicación 1, donde el polipéptido del cual el nivel de expresión es aumentado es un polipéptido endógeno.
-
- 5.
- Hongo o seta según la reivindicación 2, donde el nivel de expresión disminuido se alcanza por una producción disminuida del polipéptido y/o una actividad inferior de dicho polipéptido que el hongo/seta progenitor del que deriva este hongo/seta cuando ambos son evaluados y/o cultivados bajo las mismas condiciones.
-
- 6.
- Hongo o seta según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 5, donde el polipéptido cuyo nivel de expresión es aumentado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 56 y donde el polipéptido cuyo nivel de expresión es disminuido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con una secuencia seleccionada de SEC ID n.º: 55, 21, 54.
-
- 7.
- Hongo o seta según la reivindicación 6, donde el polipéptido cuyo nivel de expresión es aumentado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 202 y donde el polipéptido cuyo nivel de expresión es disminuido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 % de identidad de aminoácido con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n.º: 206, 205 y 203.
-
- 8.
- Hongo o seta según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el hongo/seta es un Ascomiceto o un Basidiomiceto, preferiblemente un Basidiomiceto, preferiblemente un Agaricales.
-
- 9.
- Método para la producción de las setas tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
-
- 10.
- Método para producir una sustancia de interés que utiliza una seta tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
-
- 11.
- Constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos:
- (a)
- que tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 56; y/o,
- (b)
- que tiene al menos un 50 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 202;
donde la secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un promotor que es capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos en un hongo o una seta. - 12. Método para identificación de un estímulo capaz de influir en la producción de una seta, el método que incluye las etapas de:
- (a)
- proporcionar un hongo o una seta;
- (b)
- aplicar dicho estímulo a dicho hongo/seta;
- (c)
- determinar el nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos o la actividad o nivel estable de un polipéptido codificado correspondiente en el hongo/seta del paso b) donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 40 % de identidad de aminoácido con SEC ID n.º: 56 y/o que tiene al menos un 50 % de identidad de
aminoácido con SEC ID n.º: 202,- (d)
- comparar la expresión, actividad o nivel estable determinado en (c) con la expresión, actividad o nivel estable de la
secuencia de nucleótidos o del polipéptido en un hongo/seta al que no se ha proporcionado dicho estímulo; y, 5(e) identificar un estímulo que produce una diferencia en el nivel de expresión, actividad o nivel estable de dicha secuencia de nucleótidos o polipéptido, entre el hongo/seta que ha sido provisto de dicho estímulo y el hongo/seta al que no se ha proporcionado dicho estímulo10 13. Método según la reivindicación 12, por el cual los niveles de expresión, actividades o niveles estables superiores a una secuencia de nucleótidos o más de unos polipéptidos son comparados.
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-
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