ES2453377T3 - Gen de la flavonoide 3', 5' hidroxilasa de la Flor de Santa Lucía - Google Patents
Gen de la flavonoide 3', 5' hidroxilasa de la Flor de Santa Lucía Download PDFInfo
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Abstract
Un gen que codifica una flavonoide 3',5'- hidroxilasa de Commelina communis, que comprende una secuencia aminoacídica representada en la SEC ID Nº 2 o una secuencia aminoacídica que tenga al menos un 90% de homología con la secuencia aminoacídica representada en la SEC ID Nº 2.
Description
Gen de la flavonoide 3’, 5’ hidroxilasa de la Flor de Santa Lucía
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir una planta de la familia de las Orquídeas que tiene un color de flor azul empleando una tecnología de recombinación genética. Particularmente, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir Orquídeas que tienen color de flor azul utilizando un gen que
10 codifica una flavonoide 3’,5’ hidroxilasa (F3’5’H) que es una de las enzimas de Commelina communis para la síntesis de pigmentos.
15 El color de la flor es una característica particularmente importante en las plantas ornamentales, y hasta ahora se producían flores de varios colores por cruzamiento. Sin embargo, en el caso del cruzamiento, las fuentes de genes se limitan a las especies que son capaces de cruzarse, y los colores que se pueden cambiar están limitados. Además, en un caso en el que se introduce solo una característica específica tal como el color de las flores en una variedad específica, es necesario hacer repetidos retrocruzamientos a lo largo de generaciones, y se necesita
20 emplear gran cantidad de esfuerzo y tiempo. Además, el periodo de cruzamiento varía dependiendo de las especies vegetales, y algunas plantas tardan desde unos cuantos años a unas cuantas décadas en florecer. Particularmente, las Orquídeas tales como la Orquídea mariposa y Cymbidium necesitan un periodo de tiempo largo para florecer, y se tarda mucho tiempo en desarrollar tales plantas. Por lo tanto, aunque existe una demanda en los mercados, no se ha producido una nueva variedad superior de Orquídea mariposa o Cymbidium que tenga un nuevo color de flor,
25 particularmente una flor azul.
En los últimos años, es posible llevar a cabo cruzamientos entre especies y géneros por tecnologías de recombinación de ADN, y se espera producir una nueva variedad que tenga un color que no se pueda obtener por cruzamientos convencionales.
30 El color de las flores deriva principalmente de tres tipos de pigmentos: antocianina, carotenoides y betalaína. Entre ellos, la antocianina (del color naranja al azul) que tiene la absorción máxima del espectro de longitudes de onda tiene la función del control del color azul. La antocianina es uno de los flavonoides y se sintetiza biológicamente por medio de una ruta metabólica que se muestra en la Fig. 1. El color de la antocianina depende sustancialmente de su
35 estructura química, y cuanto mayor es el número de grupos hidroxilo en un anillo bencénico, más azul es el color. La hidroxilación del anillo bencénico se cataliza por una flavonoide 3’-hidroxilasa (F3’H) y una flavonoide 3’,5’ hidroxilasa (F3’5’H). En el caso en que no haya actividad de la F3’H ni de la F3’5’H en las células de los pétalos, se sintetiza pelargonidina (del color naranja al color rojo), y en el caso en el que haya actividad F3’H, se sintetiza cianidina (del color rojo al carmesí). Y, en el caso en el que haya actividad F3’5’H, se sintetiza delfinidina (color azul).
40 Por lo tanto, con el fin de producir el color azul de las flores, el papel de la F3’5’H se considera importante.
Desde tal punto de vista, se ha desarrollado un estudio para producir una planta que tenga flores azules por recombinación genética, utilizando la F3’5’H.
45 Entre los genes conocidos convencionalmente que codifican la F3’5’H, se conocen los genes derivados de plantas tales como Campanula medium, Catharanthus roseus, Petunia, Eustoma grandiflorum, Nierembergia spp., Verbena, Gentiana, Gossypium hirsutum, Lycianthes rantonnei, Solanum tuberosum y Torenia, pero no se ha informado de que se haya aislado un gen que codifique la F3’5’H a partir de Commelina communis.
50 Como ejemplos en los que el color de la flor se ha cambiado utilizando un gen conocido convencionalmente, se han descrito, un procedimiento para producir un clavel azul transfectando una variedad de clavel deficiente en DFR (dihidroflavonoide 4 reductasa) con un gen F3’5’H y un gen DFR que derivaba de Petunia (Documento Patente 1) y un procedimiento para producir una rosa azul transfectando una rosa en la que se había eliminado la ruta metabólica interna, con un gen F3’5’H derivado de Viola x Wittrockiana (Documento Patente 2).
55 Por otra parte, se ha descrito el cambio del color de la flor de la orquídea mariposa sobre-expresando un gen endógeno, sin embargo, no se ha producido una orquídea mariposa azul (Documento no Patente 1). Además, no se ha informado de la producción de una variedad de cymbidium azul.
60 Documento Patente 1: WO1996/036716 Documento Patente 2: WO2005/017147 Documento no Patente 1: Su y Hsu, Biotechnology Letters (2003) 25: 1933-1939.
Divulgación de la Invención
5 Con el fin de producir una flor azul, se sabe que la F3’5’H tiene un papel importante, y se desea un gen F3’5’H que se pueda expresar con más fuerza.
Es un objetivo de la presente invención encontrar un tipo de gen F3’5’H que tenga una expresión alta, de forma que se pueda producir una orquídea mariposa azul, y producir Orquídeas que tengan flores azules utilizando tal tipo de gen F3’5’H de expresión alta.
Los presentes inventores han llevado a cabo un extenso estudio con el fin de conseguir el objetivo anterior, y como
15 resultado han encontrado que un gen F3’5’H que se deriva de Commelina communis tiene un mayor efecto que el de los genes convencionales, y que transfectando orquídeas mariposa con el gen anterior, el color de sus flores pueda cambiarse en azul. Así, se ha conseguido la presente invención.
Es decir, la presente invención se refiere a un gen que codifica una flavonoide 3’,5’ hidroxilasa de Commelina communis, que comprende una secuencia aminoacídica representada por la SEC ID Nº 2 o una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 90% de homología con la secuencia aminoacídica representada por la SEC ID Nº 2.
Además, la presente invención se refiere a un vector, que contiene el gen anterior.
25 Además, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir una planta en la que se ha cambiado el color de las flores, que comprende la transfección de una orquídea mariposa roja con el gen anterior y la expresión del gen.
Además, se describe un procedimiento para producir una planta en la que se ha cambiado el color de las flores, que comprende la transfección de una Orquídea con el gen anterior y un gen que codifica una dihidroflavonol 4 reductasa de Torenia o Gerbera y la expresión de los genes.
Además, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir una Orquídea que tenga flores azules,
35 que comprende la transfección de una Orquídea que tiene flores blancas con el gen anterior; un gen que codifica una dihidroflavonol 4 reductasa de Torenia o Gerbera; un gen que codifica una flavanona 3 hidroxilasa; y un gen que codifica una antocianidin sintasa y la expresión de los genes.
Además, la presente invención se refiere a una planta en la que se ha cambiado el color de las flores, como se define en las reivindicaciones 6 a 9.
Además, en la presente invención, “flavonoide 3’,5’ hidroxilasa” (F3’5’H) es una enzima que cataliza una reacción para producir dihidromiricetina a partir de dihidrokaempferol. Además, “flavanona 3 hidroxilasa” (F3H) es una enzima que cataliza una reacción para producir dihidrokaempferol a partir de naringenina. “Antocianidin Sintasa” (ANS) es
45 una enzima que cataliza una reacción para producir delfinidina a partir de leucodelfinidina.
Utilizando el gen F3’5’H derivado de Commelina communis, se pueden producir plantas que tienen flores de varios tonos de color azul. Particularmente, por medio de la presente invención, es posible producir
Orquídeas que tienen flores de tonos de color azul que no se pueden conseguir por los procedimientos de cruzamiento convencionales.
La Fig. 1 es una ruta sintética de antocianina.
La Fig. 2 es un vector plásmido utilizado para transfectar un pétalo con un gen. El P-CaMV35S es un promotor
35S del virus del mosaico de la coliflor. ! es una secuencia omega del virus del mosaico del tabaco. T es una
secuencia de terminación de la transcripción que se deriva de un virus del mosaico de la coliflor.
La Fig. 3 es la transfección de un pétalo de Phal. amabilis con un gen ANS diferente derivado de una planta.
La Fig. 4 es la transfección de un pétalo de Phal. amabilis con un gen DFR diferente derivado de una planta.
La Fig. 5 es la transfección de un pétalo de Phal. amabilis con un gen F3’5’H diferente derivado de una planta.
La Fig. 6 es la identificación de un gen necesario para el cambio de color de las flores de una orquídea mariposa
65 blanca. La Fig. 7 es una vista esquemática (1) que muestra un procedimiento para la construcción de ADN por
transformación de la orquídea mariposa.
La Fig. 8 es una vista esquemática (2) de un procedimiento para la construcción de ADN para la transformación
de la orquídea mariposa.
La Fig. 9 es la transfección de un pétalo de un cymbidium blanco con los genes.
A partir de aquí, la presente invención se describirá en detalle, y por medio de estas descripciones, serán aparentes para los expertos en la técnica, otros objetivos, características y superioridades de la presente invención. Además, las descripciones de la presente especificación incluyendo las siguientes explicaciones, ejemplos específicos, etc. muestran realizaciones preferidas, y los expertos en la técnica pueden hacer cambios y modificaciones (o alteraciones) de la invención dentro del concepto y el ámbito de la presente invención desvelada en la presente especificación. Además todos los Documentos Patentes y referencias citadas en la presente especificación se citan con fines de explicación.
15 Poniendo atención al gen F3’5’H que se relaciona con un pigmento azul (delfinidina), los presentes inventores han transfectado orquídeas mariposa con un gen F3’5’H conocido que se deriva de petunia y que muestra resultados prácticos en el clavel, con el fin de producir orquídeas azules. Sin embargo, no se ha podido obtener el resultado deseado. Por tanto, los presentes inventores han llevado a cabo la clonación de genes F3’5’H de varias plantas con el fin de encontrar un gen superior. Como resultado, han descubierto que un gen (secuencia número 1) derivado de Commelina communis tenía un rendimiento de producción de pigmento marcadamente alto. En un caso en el que se transfecta una célula del pétalo de la orquídea mariposa con el gen anterior, se producía cinco veces más de delfinidina, cuando se comparaba con el gen derivado de petunia que era la técnica anterior. Además, en un caso en el que la célula del pétalo de una orquídea mariposa blanca se transfecta con el gen de la presente invención, se
25 cambia el color de las flores a un azul con tonalidad púrpura.
Además, se ha descubierto que el color de la flor cambia de blanco a azul transfectando una célula del pétalo de una orquídea mariposa blanca con el gen F3H que cataliza una reacción corriente arriba del F3’5’H y con un gen DFR y un gen ANS que catalizan una reacción corriente abajo del F3’5’H en la ruta de síntesis de la antocianina, además del gen F3’5’H anterior. Particularmente, en el caso en el que se utiliza el gen DFR derivado de Gerbera o Torenia, la flor tiene un color azul más profundo.
El gen derivado de Commelina communis que se encuentra en la presente invención es superior a los genes convencionales, y empleando el gen de la presente invención, es posible producir un tipo de orquídea mariposa azul.
35 Además, la superioridad del gen de la presente invención se ha probado en cymbidium así como en orquídea mariposa, y se ha descubierto que el gen de la presente invención se puede aplicar para cambiar los colores de las flores de varias plantas con flores.
El gen F3’5’H se aísla del ADN genómico de la flor de Santa Lucía Asiática (nomenclatura: Commelina communis) o del ADN transcrito inversamente a partir de un ARNm transcrito del ADN genómico anterior. El gen F3’5’H de la presente invención es el gen representado en la SEC ID Nº 1 que codifica una proteína representada en la SEC ID Nº 2. El gen de la presente invención incluye genes que tienen una alta homología con el gen anterior, en tanto que tales genes tengan actividad de la enzima F3’5’H. La homología alta es al menos de un 90% de homología con la secuencia aminoacídica representada en la SEC ID Nº 2, preferentemente al menos de un 95%, y más
45 preferentemente al menos del 98%.
Se pueden utilizar genes nuevos o convencionales, como el gen flavanona 3 hidroxilasa (F3H), el gen dihidroflavonol 4 reductasa (DFR) y el gen de la enzima que sintetiza la antocianidina (ANS). Específicamente, el gen F3H puede ser, por ejemplo, un gen registrado en GenBank (número de registro: DQ394303, AY221246, AJ493133, AY641730, AF184270, AB078956, AB201760, AY669324, AF036093, AB211958, AB187027 o AB234905). El gen DFR puede ser, por ejemplo, un gen registrado en GenBank (número de registro: AAB62873, AAC17843, AAD49343, AAQ83576, AAU93766, AAY32600, AAY32601, AAY32602, BAB40789 o BAE79202). El gen ANS puede ser, por ejemplo, un gen registrado en GenBank (número de registro: AY585677, AY228485, AF015885, AY581048, U82432, AY695817, AB208689, AY997840, AY382828, AY256380, AF026058, Y07955, AF384050, AB097216, AB087206,
55 AB198869, AB044091, AY123768 o AB234906). Particularmente, el gen DFR es preferentemente el gen derivado de Gerbera mostrado por el número de registro: Z17221 o el gen derivado de Torenia que se muestra por el número de registro: AB012924. Además, se puede utilizar un gen tal como el gen F3H (SEC ID Nº 50) que se deriva de la orquídea mariposa, el gen DFR (SEC ID Nº 64) o el gen ANS (SEC ID Nº 74).
Además, se describe un vector recombinante que contiene tal gen, particularmente un vector de expresión.
Dependiendo de las especies huésped en las que se introduce el gen, el vector de expresión tiene una región reguladora de la expresión tal como una promotora, una de terminación, un origen de replicación de ADN, etc. El promotor puede ser, por ejemplo, uno que induzca una expresión del gen en células del pétalo, y un promotor
65 derivado de un gen CHS (chalcona sintasa) de la orquídea mariposa o se puede mencionar un promotor derivado del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S. Además, la secuencia de terminación puede ser, por ejemplo, un terminador derivado de un gen CHS de la orquídea mariposa o un terminador derivado del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S.
Específicamente, se prefiere que el gen F3’5’H de Commelina communis se conecte al 3’ corriente abajo de una 5 secuencia promotora, y se añade una secuencia de terminación de la transcripción al 3’ corriente abajo del gen F3’5’H.
El gen F3H, el gen DFR y/o el gen ANS pueden conectarse también al 3’ corriente abajo de una secuencia promotora e introducirse en las plantas, de forma similar que el gen F3’5’H.
El vector de expresión se puede producir de acuerdo con un procedimiento convencional utilizando una endonucleasa de restricción, una ligasa, etc. Además, la transformación de huéspedes con el vector de expresión se puede llevar a cabo también con un procedimiento convencional.
15 El procedimiento para expresar un gen en las células del pétalo pueden ser por ejemplo, un procedimiento de bombardeo con microproyectiles, un procedimiento de transformación mediado por Agrobacterium, un procedimiento de electroporación, un procedimiento PEG o un procedimiento de transformación mediado por virus.
En la Fig. 7, (pBIH-35S-CcF3’5’H) muestra un ejemplo de un vector para llevar a cabo la transformación con el gen F3’5’H por un procedimiento de transformación mediado por Agrobacterium. Además, los genes F3H, DFR y ANS también se pueden construir en el mismo vector como el que contiene el gen F3’5’H de Commelina communis independientemente o juntos (Figs. 7 y 8).
En la presente invención, las plantas que se transforman son Orquídeas. Las Orquídeas pueden ser, por ejemplo,
25 orquídeas mariposa, cymbidium, dendrobyobium, oncidium, odontoglossum, mitonia o cattleya. Entre ellas, se prefieren las orquídeas mariposa y cymbidium. El cymbidium es una planta que pertenece al género Cymbidium, y la orquídea mariposa se incluye en el género Phalaenopsis y el género Doritaenopsis.
A partir de ahora, la presente invención se describirá con más detalle en referencia a los Ejemplos. Sin embargo estos Ejemplos se dan simplemente para describir la presente invención y como referencia de las realizaciones. Estos ejemplos describen realizaciones específicas de la presente invención.
35 Además, los procedimientos generales que se necesitan para la recombinación genética, tales como de corte y empalme de ADN, transformación de E. coli, determinación de la secuencia de bases de un gen y PCR se llevaron a cabo según los manuales de los reactivos disponibles comercialmente o los aparatos utilizados para cada operación
o según manuales experimentales (tales como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Tercera Edición, Sambrook y Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press"). Para la PCR se utilizó un sistema PCR GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystems). A menos de que se especifique otra cosa, un aparato se manejó de acuerdo con el procedimiento de manipulación de referencia que se describe en el manual adjunto al aparato. A menos de que se especifique otra cosa, todos los ejemplos se llevaron a cabo o pueden llevarse a cabo utilizando técnicas de referencia, y tales técnicas se conocen bien y son comunes para los expertos en la técnica.
45 Como programa de búsqueda de homologías para examinar una secuencia aminoacídica codificada por el nuevo gen de la presente invención y secuencias aminoacídicas conocidas se utilizó BLASTP 2.2.15 (http://www. ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html, Documento: Altschul y col., Nucleic Acids Res. (1997) 25: 3389-3402). Aquí, la homología es el grado de similitud de aminoácidos a lo largo de la secuencia entera, y su valor se obtiene alineando una secuencia aminoacídica codificada por el gen nuevo con secuencias aminoacídicas conocidas en el orden de alta similitud, y dividiendo el número de aminoácidos homólogos entre ellas por el número de aminoácidos de la región comparada. En el presente documento alta similitud es el resultado de un alineamiento que se produce bajo un estado (con hueco, valor 10 esperado, con filtro) que es un parámetro que el programa BLASTP mencionado anteriormente tiene por defecto. La homología descrita en los presentes Ejemplos es la que se describe con respecto a una secuencia aminoacídica conocida que mostró la alta homología en el análisis de homología anterior.
55 EJEMPLO 1: Transfección de un pétalo de orquídea mariposa con un gen
A menos de que se especifique otra cosa en los Ejemplos de la presente especificación, un pétalo de orquídea mariposa se transfectó con cada gen por el siguiente procedimiento de transfección, y se evaluó su propiedad. Todos los genes tenían una estructura ADN que tenía un promotor en el lado 5’ y un terminador en el lado 3’ y se introdujeron en una célula del pétalo de tal forma que fuera expresado en la célula.
Se esterilizó un capullo de orquídea mariposa con una solución acuosa de hipoclorito sódico al 1% pp durante cinco minutos y se lavó con agua esterilizada 3 veces. Luego, el capullo se separó en sépalo lateral, sépalo dorsal y 65 pétalos, y el sépalo lateral, sépalo dorsal y pétalo se dejaron en un medio agar que contenía sal de Nuevo Medio Dogashima (Tokuhara y Mii, Plant Cell Reports (1993) 13: 7-11, de aquí en adelante designada como sal NDM) y un
0,6% pp de agarosa. Aquí, en el caso de Phal. amabilis, se utilizó un capullo que tenía una longitud de aproximadamente 15 mm, y en el caso de Dtps. Queen Beer ‘Mantenkou’, se utilizó un capullo que tenía una longitud de aproximadamente 8 mm.
5 El ADN que se iba a introducir se purificó utilizando el Kit Hi Speed Plasmid Midi (QUIAGEN), y el gen se introdujo por el procedimiento de bombardeo de microproyectiles. Además, en el caso en el que una pluralidad de genes se introdujo simultáneamente, estas soluciones de ADN se mezclaron equitativamente entre ellas, y tal mezcla se utilizó como una solución de ADN para la transfección.
En ese momento, se llevó a cabo la adsorción de ADN en partículas de oro con la relación siguiente. El ADN disuelto en 20 ∀l de tampón Tris/EDTA (Tris-HCL 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) (Cada 2 pg de ADN del plásmido que contenía un gen se mezcló y disolvió en el tampón Tris/EDTA) se mezcló con 50 ∀l de una suspensión de partículas de oro (el tamaño de las partículas era: 1,0 ∀m, en glicerol al 50% con una concentración de 60 mg/ml), y se añadieron 50 ∀l de cloruro cálcico 2,5 M y 10 ∀l de espermidina 0,2 M a 70 ∀l de la mezcla y se suspendió, de forma
15 que el ADN se adsorbió a las partículas de oro. Luego, se eliminó el sobrenadante por separación en centrífuga, y las partículas se lavaron con etanol al 70% y 100% respectivamente. Luego, se añadieron 60 ∀l de etanol al 100% al precipitado obtenido para preparar una suspensión. La suspensión se utilizó como una solución muestra, y se utilizaron 10 ∀l de la solución muestra para la transfección genética en una vez. Como pistola génica, se utilizó IDERA GIE-III (TANAKA Co., Ltd.). La transfección genética se llevó a cabo bajo unas condiciones de distancia de la boquilla a la muestra de 12 cm, bajo presión reducida de -80 kPa, una presión de gas helio de 0,3 MPa y un tiempo de rociado de 0,025 segundos.
Se dejó el pétalo después de la transfección génica en un medio agar sal NDM y se cultivó bajo un ciclo de luzoscuridad (intensidad de luz: 23 ∀mol/m2/s, periodo de luz: 16 horas, periodo de oscuridad: 8 horas) a 25 ºC.
25 EJEMPLO 2: Búsqueda y clonación del gen F3’5’H de Commelina communis (CcF3’5’H)
A partir de un pétalo de un capullo de flor de Santa Lucía de color azul (Commelina communis), se extrajo todo el ARN utilizando el Mini Kit RNeasy Plant (QIAGEN), y utilizando el ARN como matriz, se preparó un ADNc utilizando el kit GeneRacer (Invitrogen).
Luego, se llevó a cabo una RT-PCR utilizando este ADNc como matriz. Los cebadores que se utilizaron para la reacción PCR fueron 35FH-1 (5’-ATGGTIGTIGARYTIATGAC-3’; SEC ID Nº 3) y 35FH-4 (5’-CCRAAIGGIA TIARYTCRAA-3’; SEC ID Nº 4) que se diseñaron a partir de una secuencia de un gen F3’5’H conocido
35 convencionalmente (Nos de registro GenBank: D14590, AJ011862, AB262585, D14589, AB078514, AY566988, D85184, AY275430, AF313490, AY675558, AB012925). En la reacción, se repitió una etapa de 10 segundos a 98 ºC, 30 segundos a 56 ºC y 1 minuto a 72 ºC 40 ciclos. Además se llevó a cabo una PCR anidada utilizando como matriz la solución obtenida en la reacción y un cebador 35FH-2 (5’-TGGATGGAYYTICARGGIAT-3’; SEC ID Nº 5) y un cebador 35FH-3(5’-CCDATIGCCCADATRTTIAC-3’; SEC ID Nº 6). En la reacción, se repitió una etapa de 10 segundos a 98 ºC, 30 segundos a 56 ºC y 1 minuto a 72 ºC 40 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a un tratamiento de formación de extremos romos y luego se clonó en el sitio HincII del pUC18 (Takara Bio Inc.) para obtener el p35FH23, y se determinó una secuencia parcial de ADN en el p35FH23 (secuencia parcial de CcF3’5’H).
45 A partir de la secuencia parcial de CcF3’5’H, se analizaron las secuencias del lado 3’ corriente abajo y el lado 5’ corriente arriba por el procedimiento RACE.
El procedimiento RACE 3’ se llevó a cabo utilizando un cebador que se puede diseñar a partir de la secuencia parcial de CcF3’5’H, el ARN de Commelina communis anterior y el kit GeneRacer (Invitrogen). Los cebadores que se utilizaron en la reacción PCR fueron C35FH-3 (5’-ATCTCCCTCGTATCGCAACC-3’; SEC ID Nº 7) y el cebador GeneRacer 3’. En la reacción, se repitió una etapa de 10 segundos a 98 ºC, 30 segundos a 58 ºC y un minuto a 72 ºC 40 ciclos. Se llevó a cabo la PCR anidada utilizando como matriz la solución obtenida en la reacción, un cebador C35FH-4 (5’-GAAGCTTGTGAAGCCAATGG-3’; SEC ID Nº 8) y un cebador anidado GeneRacer 3’. En la reacción se repitió una etapa de 10 segundos a 98 ºC, 30 segundos a 58 ºC y 1 minuto a 72 ºC 40 ciclos. El producto que se
55 obtuvo en la reacción se sometió a un tratamiento de formación de extremos romos y luego se clonó en el sitio HincII del pUC18 (Takara Bio, Inc.) para obtener el p35FHC43’, y se determinó una secuencia de ADN del lado 3’ corriente abajo contenida en p35FHC43’ (secuencia CcF3’5’H 3’RACE).
Se llevó a cabo el procedimiento RACE 5’ utilizando un cebador que se puede diseñar a partir de la secuencia parcial de CcF3’5’H, el ARN de Commelina communis anterior y el kit GeneRacer (Invitrogen). Los cebadores utilizados en la reacción PCR fueron el C35FH-6 (5’-CGTCGCCTCGTGCTCTCGCAGTATC-3’; SEC ID Nº 9) y el cebador GeneRacer 5’. En la reacción, se repitió una etapa de 10 segundos a 98 ºC, 30 segundos a 68 ºC y 1 minuto a 72 ºC 30 ciclos. Se llevó a cabo una PCR anidada utilizando la solución obtenida en la reacción como matriz, un cebador C35FH-5 (5’-TCTTCGAGAGCACCTTATCGAACCTC-3’; SEC ID Nº 10) y un cebador anidado 65 GeneRacer 5’. En la reacción, se repitió una etapa de 10 segundos a 98 ºC, 30 segundos a 68 ºC y 1 minuto a 72 ºC
30 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en el pCR4/TOP010 (Invitrogen) para obtener el p35FH5’5, y se determinó una secuencia de del lado 5’ corriente arriba contenida en p35FH5’5 (secuencia CcF3’5’H 5’RACE).
5 El gen F3’5’H de Commelina communis completo (CcF3’5’H) se sometió a clonación basándose en la secuencia CcF3’5’H 3’RACE y la secuencia CCF3’5’H 5’RACE. Se llevó a cabo la RT-PCR utilizando el ARN de Commelina communis anterior como matriz, un cebador C35FH-7(5’-GAAAACCAATACAAAAACATACC-3’; SEC ID Nº 11), un cebador C35FH-10 (5’-ATTGCTTCAAGTTCCCTAGC-3’; SEC ID Nº 12) y Perlas Ready-To-Go RT-PCR (Amersham Biosciences). En la reacción se repitió una etapa de 30 segundos a 98 ºC, 30 segundos a 54 ºC y 2 minutos a 72 ºC
10 30 ciclos. Además se llevó a cabo una PCR semi anidada utilizando como matriz la solución obtenida en la reacción, un cebador C35FH-7 (SEC ID Nº 11) y C35FH-9 (5’-GTTCCCTAGCCCCGTACCAC-3’; SEC ID Nº 13). En la reacción se repitió una etapa de 10 segundos a 98 ºC, 30 segundos a 54 ºC y 1 minuto a 72 ºC 30 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en el pCR4/TOPO10 (Invitrogen) para obtener el p35FH79. Luego, se determinó una secuencia de ADN del gen F3’5’H completo de la flor de Santa Lucía Asiática contenida en
15 p35FH79 (CcF3’5’H; SEC ID Nº 1). Además, la secuencia del gen de la presente invención encontrado en Commelina communis es un gen nuevo. La secuencia aminoacídica codificada por la secuencia de base tiene una homología del 61% con la secuencia aminoacídica (Nº de registro GenBank: AY856345) codificada por el gen F3’5’H de delphinium según el análisis de homología.
20 EJEMPLO 3: Preparación de un vector de expresión (pBS-P35T35) para la transfección genética
El pBS-P35T35 es un plásmido que tiene un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Hohn y col., Curent Topics in Microbiology and Immunology (1982) 96: 194-236), una secuencia omega del virus del mosaico del tabaco (Gallie y col., Nucleic Acids Research (1987) 15: 3257-3273), un sitio Swal para una endonucleasa de restricción y
25 un terminador 35S del virus del mosaico del tabaco en este orden en el pBluescriptIISK (Stratagene) (Fig. 2). Un plásmido que tiene sustancialmente la misma función que este pBS-P35T35 se puede construir de la siguiente manera.
Se desnaturalizaron un oligonucleótido SAS-S (5’-CTAGCTAGCGGCGCGCCTGCAGGATATCATTTAAATCC
30 CGGG-3’; SEC ID Nº 14) y un oligonucleótido SAS-AS (5’-CCCGGGATTTAAATGATATCCTGCAGGCGCGCCGCTA GCTA G-3’; SEC ID Nº 15) y luego se enfriaron gradualmente hasta temperatura ambiente. El producto que se obtuvo se sometió a tratamiento con NheI y se conectó al sitio Xbal-EcoRV del pBluescriptIISK (Stratagene) para preparar el pBS-SAS que es un plásmido ADN al que se le ha modificado un sitio de restricción enzimática. Se trató con las endonucleasas de restricción Sse8387I y AscI una región amplificada por PCR utilizando como matriz un
35 ADN del genoma del virus del mosaico de la coliflor (registro GenBank V00140), un cebador T-CaMV35S-Ssel-F (5’-AACCTGCAGGAAATCACCAGTCTCTCTCTA-3’; SEC ID Nº 16) y un cebador T-CaMV35S-Ascl-R (5’-GGCGCGC CATCGATAAGGGGTTATTAG-3’; SEC ID Nº 17). Este fragmento se conectó al sitio Sse8387I – AscI del pBS-SAS para preparar el pBS-T35S. Basándose en el pJD301 (Leon y col., Plant Physiology (1991) 95: 968-972), se conectaron una secuencia promotora del virus 35S del mosaico de la coliflor que se cortó con HindlII e HincII y una
40 secuencia omega del virus del mosaico del tabaco al sitio HidnlII-SmaI del pBS-T35S para preparar un vector de expresión (pBS-P35T35).
EJEMPLO 4: Subclonación del gen F3’5’H de Commelina communis en un vector de expresión
45 Una parte de la fase de lectura abierta del gen F3’5’H de Commelina communis se amplificó por PCR utilizando como matriz un plásmido ADN (p35FH79) que contenía la anterior secuencia CcF3’5’H completa y se sometió a subclonación en un vector de expresión pBS-P35T35. La PCR se llevó a cabo utilizando un cebador CcF35H-F (5’-ATGGTACCCCTTACGTACCTT-3’; SEC ID Nº 18), un cebador CcF35H-R (5’-TTATGTTGTTTTTATATTCTTATAA ACG-3’; SEC ID Nº 19) y el p35FH79 como matriz. En la reacción se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30
50 segundos a 52 ºC y 1 minuto y 20 segundos a 72 ºC 25 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en el sitio SwaI del pBS-P35T35 para obtener el p35CcF3’5’H. El p35CcF3’5’H es un ADN que expresa el gen F3’5’H de Commelina communis en células vegetales.
EJEMPLO 5: Confirmación de la expresión del gen F3’5’H de Commelina communis
55 Un pétalo de una orquídea mariposa roja (Dtps. Queen Beer ‘Mantenkou’) se transfectó con 1,2 pg del p35CcF3’5’H por el procedimiento del Ejemplo 1 y se cultivó durante 5 días, por el que muchas células púrpura oscuro emergieron en el pétalo. Por otra parte, en el caso en el que las células se transfectaron con partículas de oro que no contenían tal gen, el fenómeno anterior no se observó.
60 Por lo tanto, se considera que el gen F3’5’H de Commelina communis aislado tiene una actividad flavonoide 3’, 5’ hidroxilasa en la célula del pétalo de la orquídea mariposa, y como resultado, produce delfinidina que es un pigmento azul.
EJEMPLO 6: Evaluación de la actividad enzimática del gen F3’5’H de Commelina communis
La actividad enzimática del gen F3’5’H de Commelina communis se evaluó por la cantidad de delfinidina que es un pigmento azul y comparándola con la de un gen que ya se conocía (gen de Petunia) que se consideraba útil para 5 producir el clavel azul.
(1) Aislamiento del gen F3’5’H de Petunia (PetF3’5’H)
Se aisló todo el ARN de un pétalo de un capullo de Petunia disponible comercialmente (híbrida) antes de la floración
10 utilizando el Mini Kit RNeasy Plant (QIAGEN). Se preparó el ADNc utilizando este ARN como matriz y el Sistema de Síntesis SuperscriptII First-Strand (Invitrogen). Luego se llevó a cabo una RT-PCR utilizando este ADNc como matriz. Se utilizaron como cebadores para la reacción PCR, el PetF3’5’H1-F (5’-ATGATGCTACTTACTGAGCT TGGTG-3’; SEC ID Nº 20) y el PetF3’5’H1-R (5’-CAACATGCGCAATTATAGCA-3’; SEC ID Nº 22) que se habían diseñado a partir de dos secuencias (Nos de registro GenBank: A29011, A29013) de un gen F3’5’H de petunia
15 conocido, o con PetF3’5’H2-F(5’-ATGGTGCTACTTAGTGAGCTTGC-3’; SEC ID Nº 22) y PetF3’5’H2-R (5’-AACC AACGTAAAGG CATGTT-3’; SEC ID Nº 23). En ambos casos, la reacción se llevó a cabo repitiendo una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 55 ºC y 2,5 minutos a 72 ºC 45 ciclos. El producto obtenido en cada reacción se sometió a clonación en el sitio SwaI del pBS-P35T35 para obtener el p35PetF3’5’H1 y el p35PetF3’5’H2.
20 (2) Transfección con el gen F3’5’H de Commelina communis y el gen F3’5’H de Petunia
Un pétalo de una orquídea mariposa roja (Dtps. Queen Beer ‘Mantenkou’) se transfectó con 1,3 ∀g de o bien el gen p35CcF3’5’H derivado de Commelina communis o bien un gen (p35 PetF3’5’H1 o p35 PetF3’5’H2) derivado de Petunia por el procedimiento del Ejemplo 1. Además, en el momento de la transfección genética, con el fin de medir
25 la eficacia de la transfección genética, el pétalo se cotransfectó con 0,17 pg de p35luc (gen de la luciferasa de luciérnaga) como referencia interna. Este p35luc se preparó subclonando el fragmento del extremo truncado del gen de la luciferasa, que se obtuvo cortando el pSP-luc+ (Promega) con BgIII-XbaI, en el extremo truncado de pBI221 (CLONTECH) que se corta con BamHI y SacI.
30 El pétalo transfectado genéticamente se cultivó estático durante 5 días, y a continuación se molió en nitrógeno líquido y se suspendió en 200 ∀l de Tampón de Lisis Pasivo 0,1 x (Dual-Luciferasa Reporter Assay System, Promega) para preparar una muestra. Se midió la actividad de luciferasa de la muestra, y se llevó a cabo el análisis cuantitativo de antocianidina.
Se añadieron 5 ∀l de Tampón de Lisis Pasivo 5x (Promega) y 100 ∀l de Sustrato de Ensayo de Luciferasa (Promega) a 20 ∀l de la muestra anterior, y luego se midió la actividad de Luciferasa utilizando un luminómetro Flash’n glow LB955 (BERTHOLD TECHNOLOGIES) bajo una condición de tiempo de medición de 10 segundos.
Se añadieron 400 ∀l de ácido clorhídrico a 150 ∀l de la muestra anterior, y se llevó a cabo entonces el tratamiento de hidrólisis a 98 ºC durante 2 horas, y la extracción con 200 ∀l de isoamilalcohol. La cantidad de delfinidina en la capa
45 orgánica se midió por un procedimiento de cromatografía líquida bajo las siguientes condiciones.
Aparato: Waters2690 (Waters),
Columna: Nucleosil 100-5C18 4,6x250 mm (GL. Sciences),
Temperatura de la columna: 40 ºC,
50 Condiciones de elución: Se aplicó un gradiente (líquido B al 20% # 85% durante 40 minutos, Líquido B al 85% durante 5 minutos) utilizando una solución de ácido fosfórico al 1,5% (líquido A) y una solución acuosa de ácido fosfórico al 1,5%·ácido acético al 20%·acetonitrilo al 25% (líquido B), y se llevó a cabo la elución a una tasa de flujo de 1 ml/minuto. Longitud de onda de detección: 531 nm.
55 La cantidad de delfinidina se midió por un procedimiento analítico de curva absoluta utilizando la referencia (hidrocloruro de delfinidina). Además, la cantidad que se obtuvo de delfinidina se corrigió utilizando la actividad Luciferasa. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Se evidencia en la Tabla 1 que la cantidad acumulada de delfinidina por el gen F3’5’H de Commelina communis era aproximadamente cinco veces mayor que la del gen
60 F3’5’H2 de Petunia. Además, la delfinidina no se detectó a partir de la muestra utilizando el gen F3’5’H1 de Petunia.
TABLA 1
- CcF3’5’H
- Pet F3’5’H2
- Cantidad de delfinidina (pg/muestra)
- Ensayo Luc (RLU/muestra) pg/RLU Cantidad de delfinidina (pg/muestra) Ensayo Luc (RLU/muestra) pg/RLU
- 1
- 12400 265681 0,0467 4400 491562 0,0090
- 2
- 26200 743973 0,0352 13000 1063867 0,0122
- 3
- 50600 880990 0,0574 7400 757137 0,0098
- 4
- 37000 741444 0,0499 3200 530822 0,0060
- Media
- 0,0473 0,0092
- DS
- 0,0092 0,0026
EJEMPLO 7: Transfección de un pétalo de la orquídea mariposa blanca con un gen F3’5’H
5 Con el fin de producir una orquídea mariposa azul, se transfectó un pétalo de orquídea mariposa blanca (Phal. amabilis) con 1,6 ∀g de o bien un gen (p35CcF3’5’H) derivado de Commelina communis o un gen (p35Pet F3’5’H1, p35Pet F3’5’H2) derivado de Petunia como en el Ejemplo 6 (2), según el procedimiento del Ejemplo 1. Sin embargo, no se observó un cambio de color claro en el pétalo transfectado con tales genes.
10 Por lo tanto, se aisló para la transfección un gen que codifica el grupo de enzimas corriente arriba de la F3’5’H en la ruta sintética de la antocianidina (Fig.1) ((1) Chalcona sintasa: CHS, (2) chalcona Isomerasa: CHI y (3) flavanona 3 hidroxilasa: F3H).
EJEMPLO 8: Aislamiento del gen CHS de la orquídea mariposa (PhCHS3)
15 Se aisló todo el ARN de un pétalo de una orquídea mariposa (Dpts. Sogo Vivien x Dtps. Sogo Yenlin) justo antes de la floración utilizando el Mini Kit RNeasy Plant (QIAGEN). Se preparó el ADNc utilizando este ARN como matriz y el Sistema de Síntesis SuperscriptII First-Strand (Invitrogen). Luego se llevó a cabo la RT-PCR utilizando este ADNc como matriz. Se utilizaron como cebadores de la reacción PCR PhCHS3 F1 (5’-AAGCTTGTGAG AGACGACG GA
20 3’; SEC ID Nº 24) y PhCHS3 R1 (5’-TGGCCCTAATCCTTCAAATT-3’; SEC ID Nº 25) que se diseñaron a partir de la secuencia conocida del gen CHS de la orquídea mariposa (PhCHS3) (Nº de registro GenBank: DQ089652). La reacción se llevó a cabo repitiendo una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 55 ºC y 1 minuto a 72 ºC 25 ciclos. El producto de la reacción se amplificó utilizando como matriz esta solución de la reacción de nuevo bajo las mismas condiciones. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en el sitio SwaI de pBS
25 P35T35 para obtener el p35PhCHS3. Luego se determinó una secuencia completa del gen CHS de la orquídea mariposa contenido en p35PhCHS3 (PhCHS3; SEC ID Nº 26). El p35PhCHS3 es un ADN que expresa el gen CHS de orquídea mariposa en las células vegetales.
EJEMPLO 9: Aislamiento del gen CHI de la orquídea mariposa (PhCHI1)
30 Se aisló todo el ARN de un pétalo de una orquídea mariposa (Dpts. Sogo Vivien x Dtps. Sogo Yenlin) justo antes de la floración utilizando el Mini Kit RNeasy Plant (QIAGEN). Se preparó el ADNc utilizando este ARN como matriz y el Sistema de Síntesis SuperscriptII First-Strand (Invitrogen).
35 Luego, se llevó a cabo la RT-PCR utilizando este ADNc como matriz. Se ha informado de varios genes CHI vegetales (Nos de registro GenBank: AY700850, AY086088, DQ160231, AJ004902, AF474923, XM_470129, 03433, AB187026). Se utilizaron como cebadores para la reacción PCR CHI-dgF1 (5’-TTYCTCGSYGGBGCMGGYGWVMG VGG-3’; SEC ID Nº 28) y CHI-dgR1 (5’-CMGGIGAIACVSCRTKYTYICCRATVAT-3’; SEC ID Nº 29) que se diseñaron a partir de genes CHI conocidos convencionalmente. En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y
40 1 minuto a 72 ºC 5 ciclos, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1 minuto a 70 ºC 5 ciclos, y luego se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 68 ºC y 1 minuto a 72 ºC 25 ciclos.
Además, se llevó a cabo una PCR anidada utilizando como matriz la solución obtenida en la reacción, un cebador CHI-dgF3 (5’-TMIKYWCMGGISMITTYGARAARYT-3’; SEC ID Nº 30) y un cebador CHI-dgR3 (5’-TYICCRA
45 TVATIGWHTCCARIAYBGC-3’; SEC ID Nº 31). En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 60 ºC y 1 minuto a 72 ºC 25 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en pCR4-TOPO (Invitrogen) para obtener el PhCHIfrag 16, y se determinó una secuencia parcial de ADN contenida en PhCHIfrag 16 (secuencia parcial PhCHI).
50 A partir de la secuencia parcial PhCHI, se analizaron las secuencias del lado 3’ corriente abajo y del lado 5’ corriente arriba por el procedimiento RACE.
El procedimiento RACE 3’ se llevó a cabo utilizando un cebador que se puede diseñar a partir de la secuencia
5 parcial PhCHI, el ARN anterior y el kit GeneRacer (Invitrogen). Los cebadores utilizados en la reacción PCR fueron PhCHI-GSP F1 (5’-ATGCTGCTGCCATTAACGGGTCA-3’; SEC ID Nº 32) y el cebador GeneRacer 3’. En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1 minuto a 72 ºC 5 ciclos, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1 minuto a 70 ºC 5 ciclos, y luego se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 60 ºC y 1 minuto a 72 ºC 25 ciclos. Además, se llevó a cabo una PCR anidada utilizando como matriz la solución obtenida en la reacción, un cebador PhCHI-GSP F2 (5’-TCCGAGAAGGTCTCCGGGAACT-3’; SEC ID Nº 33) y un cebador GeneRacer 3’ anidado. En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 60 ºC y 1 minuto a 72 ºC 25 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en el pCR4-TOPO (Invitrogen) para obtener el PhCHI3’RACE23. Se determinó una secuencia de ADN en el lado 3’ corriente abajo contenida en PhCHI3’RACE23 (secuencia PhCHI 3’RACE)
15 El procedimiento RACE 5’ se llevó a cabo utilizando un cebador que se puede diseñar a partir de la secuencia parcial PhCHI, el ARN anterior y el kit GeneRacer (Invitrogen). Los cebadores utilizados en la reacción PCR fueron PHCHI-GSP R1 (5’-GCATTCGTCAGCTTCTTGCTCTCT-3’; SEC ID Nº 34) y el cebador GeneRacer 5’. En la reacción se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1 minuto a 72 ºC 5 ciclos, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1 minuto a 70 ºC 5 ciclos, y luego se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 60 ºC y 1 minuto a 72 ºC 25 ciclos. Además se llevó a cabo una PCR anidada utilizando como matriz la solución obtenida en la reacción, un cebador PhCHI-GSP R2 (5’-ATCACATCAGTCTCAGCCACA-3’; SEC ID Nº 35) y un cebador GeneRacer 5’ anidado. En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 60 ºC y 1 minuto a 72 ºC 25 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en pCR4-TOPO
25 (Invitrogen) para obtener el PhCHI5’RACE54. Se determinó la secuencia de ADN del lado 5’ corriente arriba contenida en PhCHI5’RACE54 (secuencia PhCHI 5’RACE).
El gen CHI completo de la orquídea mariposa (PhCHI) se sometió a clonación basándose en la secuencia PhCHI3’RACE y la secuencia PhCHI5’RACE. Se llevó a cabo la PCR utilizando el ADNc anterior, un cebador PhCHI init (5’-ATGGCAGAAACAGTGGCGACGCCCA-3’; SEC ID Nº 36) y un cebador PhCHI term (5’-TCAAACGAC TCCATCTTGCTC-3’; SEC ID Nº 37). En la reacción se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 65 ºC y 1,5 minutos a 72 ºC 45 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en el sitio SwaI del pBS-P35T35 para obtener el p35PhCHI1. Luego se determinó una secuencia básica del gen CHI completo de la orquídea mariposa contenido en el p35PhCHI1 (PhCHI1, SEC ID Nº 38). Además, la presente secuencia del gen
35 descubierto en la orquídea mariposa es un gen nuevo. La secuencia aminoacídica codificada por la secuencia de tiene un 54% de homología con la secuencia aminoacídica (Nº de registro GenBank: DQ120521) codificada por el gen CHI de la planta del té por el análisis de homología. El p35PhCHI1 es un ADN que expresa el gen CHI de orquídea mariposa en células vegetales.
EJEMPLO 10: Aislamiento del gen F3H de orquídea mariposa (PhF3H1)
Se aisló todo el ARN de un pétalo de orquídea mariposa (Dpts. Sogo Vivien x Dtps. Sogo Yenlin) justo antes de la floración utilizando el Mini Kit RNeasy Plant (QIAGEN). Se preparó el ADNc utilizando este ARN como matriz y el Sistema de Síntesis SuperscriptII First-Strand (Invitrogen).
45 Luego se llevó a cabo la RT-PCR utilizando el ADNc como matriz. Se ha informado de varios genes F3H vegetales (Nos de registro GenBank: DQ394303, AY221246, AJ493133, AY641730, AF184270, AB078956, AB078956, AB201760, AY669324, AF036093, AB211958, AB187027, AB234905). Se utilizaron como cebadores para la reacción PCR, un cebador P3H-dgF1 (5’-TIVGIGAYGARGABGARMGBCCIAA-3’; SEC ID Nº 40) y un cebador F3HdgR1 (5’-ACBGCYYGRTGRTCHGCRTTCTTRAA-3’; SEC ID Nº 41) que se habían diseñado a partir del gen F3H conocido convencionalmente. En la reacción se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1 minuto a 72 ºC 5 ciclos, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1 minuto a 70 ºC 5 ciclos, y luego se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 68 ºC y 1 minuto a 72 ºC 25 ciclos. Además se llevó a cabo una PCR anidada utilizando como matriz la solución obtenida en la reacción, un cebador F3H-dgF3 (5’-AARYTBRGKTTYGAY
55 ATGWCHGGIG-3’; SEC ID Nº 42) y un cebador F3H-dgR3 (5’-GGHWSRACVGTDATCCAIGWBTT-3’; SEC ID Nº 43). En la reacción se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 60 ºC y 1 minuto a 72 ºC 25 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en el pCR4-TOPO (Invitrogen) para obtener el PhF3Hfrag26, y se determinó una secuencia parcial de ADN contenida en PhF3Hfrag26 (secuencia parcial PhF3H).
Se analizaron las secuencias del lado 3’ corriente abajo y del lado 5’ corriente arriba de la secuencia parcial PhF3H por el procedimiento RACE.
El procedimiento RACE 3’ se llevó a cabo utilizando un cebador que se puede diseñar a partir de la secuencia parcial PhF3H, el ARN anterior y el kit GeneRacer (Invitrogen). Los cebadores utilizados en la reacción PCR fueron
65 PhF3H-GSP F1 (5’-TTCTCATACCCAATCGGGAG-3’; SEC ID Nº 44) y el cebador GeneRacer 3’. En la reacción se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1 minuto a 72 ºC 5 ciclos, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1 minuto a 70 ºC 5 ciclos, y luego se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 60 ºC y 1 minuto a 72 ºC 25 ciclos. Además, se llevó a cabo una PCR anidada utilizando como matriz la solución obtenida en la reacción, un cebador PhF3H-GSP F2 (5’-AATCGGGAGCCGCGATTACT-3’; SEC ID Nº 45) y un cebador GeneRacer 3’ anidado. En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 60 ºC y 1 minuto a 72 ºC 25
5 ciclos. El producto que se obtuvo de la reacción se sometió a clonación en el pCR4-TOPO (Invitrogen) para obtener el PhF3H3’RACE33. Se determinó una secuencia de ADN en el lado 3’ corriente abajo contenida en PhF3H 3’RACE33 (secuencia PhF3H 3’RACE)
El procedimiento RACE 5’ se llevó a cabo utilizando un oligonucleótido que se puede diseñar a partir de la secuencia parcial PhF3H, el ARN anterior y el kit GeneRacer (Invitrogen). Los cebadores utilizados en la reacción PCR fueron PhF3H-GSPR1 (5’-TCTGTGTGGCGCTTCAGGCC-3’; SEC ID Nº 46) y el cebador GeneRacer 5’. En la reacción se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1 minuto a 72 ºC 5 ciclos, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1 minuto a 70 ºC 5 ciclos, y luego se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 60 ºC y 1 minuto a 72 ºC 25 ciclos. Además se llevó a cabo una PCR anidada utilizando como matriz la solución obtenida en la reacción,
15 un cebador PhF3H-GSP R2 (5’-TGAGGTCCGGTTGCGGGCATTTT-3’; SEC ID Nº 47) y un cebador GeneRacer 5’ anidado. En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 60 ºC y 1 minuto a 72 ºC 25 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en pCR4-TOPO (Invitrogen) para obtener el PhF3H5’RACE86. Se determinó la secuencia de ADN en el lado 5’ corriente arriba contenido en el PhF3H 5’RACE86 (secuencia PhF3H 5’RACE).
El gen F3H completo de la orquídea mariposa (PhF3H) se sometió a clonación basándose en la secuencia PhF3H 3’RACE y la secuencia PhF3H 5’RACE. Se llevó a cabo la PCR utilizando el ADNc anterior, un cebador PhF3H init. (5’-ATGGCCCCAATACCATTCCTACCGA-3’; SEC ID Nº 48) y un cebador PhF3H term. (5’-CCTTAAGCTAAAATCT CATTTAATGCCTTTGCTCC-3’; SEC ID Nº 49).
25 En la reacción se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 65 ºC y 1,5 minutos a 72 ºC 40 ciclos. El producto que se obtuvo de la reacción se sometió a clonación en el sitio SwaI del pBS-P35T35 para obtener el p35PhF3H1. Luego se determinó una secuencia básica del gen F3H completo de la orquídea mariposa contenido en el p35PhF3H1 (PhF3H1, SEC ID Nº 50). Además, la secuencia del gen descubierto en la orquídea mariposa es un gen nuevo. La secuencia aminoacídica codificada por la secuencia de ADN tiene un 86% de homología con la secuencia aminoacídica (Nº de registro GenBank: X89199) codificada por el gen F3H de Bromheadia finlaysoniana. El p35PhF3H1 es un ADN que expresa el gen F3H de orquídea mariposa en células vegetales.
EJEMPLO 11: Transfección de un pétalo de orquídea mariposa blanca con el gen F3’5’H y genes relacionados con 35 la antocianina
Un pétalo de una orquídea mariposa blanca (Phal. amabilis) se cotransfectó de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 1 con el gen CHS (p35PhCHS3: Ejemplo 8), el gen CHI (p35PhCHI1: Ejemplo 9) y el gen F3H (p35PhF3H1: Ejemplo 10) que se derivaban de la orquídea mariposa y el gen F3’5’H (p35CcF3’5’H: Ejemplo 2) que se derivaba de Commelina communis. Sin embargo, no se observó el cambio de color en el pétalo.
Por tanto, se aislaron los genes que codifican las enzimas ((1) dihidroflavonol 4 – reductasa: DFR y (2) antocianidina sintasa: ANS) corriente abajo del gen F3’5’H en la ruta de síntesis de antocianina para su transfección.
45 EJEMPLO 12: Aislamiento del gen DFR de orquídea mariposa (PhDFR)
Se aisló todo el ARN de un pétalo del capullo de una orquídea mariposa (Dtps. Queen Beer ‘Mantenkou’) utilizando el Mini Kit RNeasy Plant (QIAGEN), y se preparó el ADNc utilizando este ARN como matriz y el kit GeneRacer (Invitrogen).
A continuación, se llevó a cabo la RT-PCR utilizando este ADNc como matriz. Se ha informado de varios genes DFR vegetales (Nos de registro GenBank: AAB62873, AAC17843, AAD49343, AAQ83576, AAU93766, AAY32600, AAY32601, AAY32602, BAB40789, BAE79202). Los cebadores utilizados para la reacción PCR fueron DFRD-F1 (5’-TTYCAYGTIGCIACNCCNATG-3’; SEC ID Nº 52) y DFRD-R1 (5’-DATNGCRTCRTCRAACATYTC-3’; SEC ID Nº 53) 55 que se habían diseñado a partir de la secuencia del gen DFR anterior. En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 48 ºC y 1 minuto a 72 ºC 40 ciclos. Se llevó a cabo una PCR anidada utilizando como matriz la solución obtenida en la reacción, un cebador DFRD-F2 (5’-ATGAAYTTYCARWSIRARGAYCC-3’; SEC ID Nº 54) y un cebador DFRD-R2 (5’-RCAIATRTAICKNCIRTTNGC-3’; SEC ID Nº 55). En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 48 ºC y 1 minuto a 72 ºC 40 ciclos. Además se llevó a cabo de nuevo una PCR anidada utilizando la solución obtenida de la reacción, un cebador DFRD-F3 (5’-GARAAY GARGTNATHAA RCC-3’; SEC ID Nº 56) y un cebador DFRD-R3 (5’-RTCRTCIARRTGNACRAAYTG-3’; SEC ID Nº 57). En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 48 ºC y 30 segundos a 72 ºC 40 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en pCR4/TOPO (Invitrogen) para obtener el PhDFR-D/pCR4, y se determinó una secuencia parcial de ADN contenida en PhDFR-D/pCR4 (secuencia parcial
65 PhDFR).
A partir de la secuencia parcial PhDFR se analizaron las secuencias del lado 3’ corriente abajo y del lado 5’ corriente arriba por el procedimiento RACE.
El procedimiento RACE 3’ se llevó a cabo utilizando un cebador que se puede diseñar a partir de la secuencia
5 parcial PhDFR, el ARN anterior y el kit GeneRacer (Invitrogen). Los cebadores utilizados para la reacción PCR fueron PhDFR-F1 (5’-GGTCATGCAAAAGGTCGGGCAGCGTAA-3’; SEC ID Nº 58) y el cebador GeneRacer 3’. En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1 minuto a 72 ºC 5 ciclos, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1 minuto a 70 ºC 5 ciclos, y luego se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 68 ºC y 1 minuto a 72 ºC 25 ciclos. Además se llevó a cabo una PCR anidada utilizando como matriz la solución obtenida en la reacción, un cebador PhDFR-F2 (5’-GTGATCTTCACATCTTCCGCAGGAACAGT-3’; SEC ID Nº 59) y un cebador GeneRacer 3’ anidado. En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 65 ºC y 1 minuto a 72 ºC 25 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en el pCR4/TOPO10 (Invitrogen) para obtener el PhDFR3’RACE/pCR4, y se determinó una secuencia de ADN del lado 3’ corriente abajo contenida en PhDFR3’RACE/pCR4 (secuencia PhDFR3’RACE).
15 El procedimiento RACE 5’ se llevó a cabo utilizando un cebador que se puede diseñar a partir de la secuencia parcial PhDFR, el ARN anterior y el kit GeneRacer (Invitrogen). Los cebadores utilizados para la reacción PCR fueron PhDFR-R4 (5’-ATGATTCATTAAAAATCCGAAAAAAAGACCACTACAA-3’; SEC ID Nº 60) y el cebador GeneRacer 5’. En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1 minuto a 72 ºC 5 ciclos, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1 minuto a 70 ºC 5 ciclos, y luego se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 68 ºC y 1 minuto a 72 ºC 25 ciclos. Además se llevó a cabo una PCR anidada utilizando como matriz la solución obtenida en la reacción, un cebador PhDFR-R3 (5’-AACCATGCATAATAAAGCAGATGTGTAAAT-3’; SEC ID Nº 61) y un cebador GeneRacer 5’ anidado. En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 65 ºC y 1 minuto a 72 ºC 25 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en
25 el pCR4/TOPO10 (Invitrogen) para obtener el PhDFR 5’RACE/pCR4, y se determinó una secuencia de ADN del lado corriente arriba contenida en PhDFR 5’RACE/pCR4 (secuencia PhDFR 5’RACE).
El gen DFR completo de la orquídea mariposa se sometió a clonación basándose en la secuencia PhDFR3’RACE y la secuencia PhDFR5’RACE. Se llevó a cabo la RT-PCR utilizando el ARN anterior, un cebador PhDFR-F8A5 (5’-AAAAAATGGAGGATGTGAGGAAGGGTCCTGTT-3’; SEC ID Nº 62), un cebador PhDFR-R5 (5’-ACATGATTCATTAAAAATCCGAAAAAAAGACCA-3’; SEC ID Nº 63) y las perlas Ready-To-Go You Prime First Strand (Amersham Biosciences). En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 98 ºC, 30 segundos a 68 ºC y 1,5 minutos a 72 ºC 35 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en el pBS-P35T35 para obtener el p35PhDFR. A continuación se determinó la secuencia de completa del gen DFR contenida en
35 p35PhDFR (PhDFR; SEC ID Nº 64). Además, la secuencia del gen descubierto en la orquídea mariposa es un gen nuevo. La secuencia aminoacídica codificada por la secuencia de ADN tiene un 86% de homología con la secuencia aminoacídica (Nº de registro GenBank: AF007096) codificada por el gen DFR de Bromheadia finlaysoniana por el análisis de homología. El p35PhDFR es un ADN para la expresión del gen DFR de orquídea mariposa en células vegetales.
EJEMPLO 13: Aislamiento del gen ANS de orquídea mariposa (PhANS1)
Se aisló todo el ARN de un pétalo del capullo de una orquídea mariposa (Dtps. Queen Beer ‘Mantenkou’) justo antes de la floración utilizando el Mini Kit RNeasy Plant (QIAGEN), y se preparó el ADNc utilizando este ARN como matriz
45 y el Sistema de Síntesis SuperscriptII Firs-Strand (Invitrogen).
A continuación, se llevó a cabo la RT-PCR utilizando este ADNc como matriz. Los cebadores utilizados para la reacción PCR fueron ANS-dgF2 (5’-TICARGGBTAYGGIAGYARRYTIGCIRMYA-3’; SEC ID Nº 66) and ANS-dgR2 (5’-GGYTCRCARAAIAYIRCCCAIGADA-3’; SEC ID Nº 67) que se habían diseñado a partir de la secuencia de un gen ANS conocido. En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 60 ºC y 1,5 minutos a 72 ºC 40 ciclos. Utilizando como matriz la solución obtenida en la reacción y los mismos cebadores de nuevo, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 56 ºC y 1 minuto a 72 ºC 30 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en pCR4/TOPO10 (Invitrogen) para obtener el PhANSfrag10, y se determinó una secuencia parcial de ADN contenida en PhANSfrag10 (secuencia parcial PhANS). A partir de la
55 secuencia parcial PhANS se analizaron las secuencias del lado 3’ corriente abajo y del lado 5’ corriente arriba por el procedimiento RACE.
El procedimiento RACE 3’ se llevó a cabo utilizando un cebador que se puede diseñar a partir de la secuencia parcial PhANS, el ARN anterior y el kit GeneRacer (Invitrogen). Los cebadores utilizados para la reacción PCR fueron PhANS3RACEGSP1 (5’-GCCCACACCGACGTCAGCTCCCTCTCCT-3’; SEC ID Nº 68) y el cebador Gene Racer 3’. En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1,5 minutos a 72 ºC 5 ciclos, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1,5 minutos a 70 ºC 5 ciclos, y luego se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 70 ºC y 1,5 minutos a 72 ºC 25 ciclos. Además se llevó a cabo una PCR anidada utilizando como matriz la solución obtenida en la reacción, un cebador PhANS3RACEGSP2 (5’-CGTCGGGGATGCGCTCGAGA 65 TCCTCAGC-3’; SEC ID Nº 69) y un cebador GeneRacer 3’ anidado. En la reacción, se repitió una etapa de 10 segundos a 94 ºC, 10 segundos a 58 ºC y 1 minuto a 72 ºC 35 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se
sometió a clonación en el pCR4/TOPO (Invitrogen) para obtener el PhANS3’RACE37, y se determinó una secuencia de ADN del lado 3’ corriente abajo contenida en PhANS3’RACE37 (secuencia PhANS3’RACE).
El procedimiento RACE 5’ se llevó a cabo utilizando un cebador que se puede diseñar a partir de la secuencia
5 parcial PhANS, el ARN anterior y el kit GeneRacer (Invitrogen). Los cebadores utilizados para la reacción PCR fueron PhANS5RACEGSP1 (5’-AGTCCGCGGGTTCAGTCGGCCAGATGGT-3’; SEC ID Nº 70) y el cebador Gene Racer 5’. En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1,5 minutos a 72 ºC 5 ciclos, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC y 1,5 minutos a 70 ºC 5 ciclos, y luego se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 70 ºC y 1,5 minutos a 72 ºC 25 ciclos. Se llevó a cabo una PCR anidada utilizando como matriz la solución obtenida en la reacción, un cebador PhANS5RACEGSP2 (5’-CCGTCTTCTC CGGCGGGTAGACGAGGTG3’; SEC ID Nº 71) y un cebador GeneRacer 5’ anidado. En la reacción, se repitió una etapa de 10 segundos a 94 ºC, 10 segundos a 58 ºC y 1 minuto a 72 ºC 35 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en el pCR4/TOPO (Invitrogen) para obtener el PhANS5’RACE15, y se determinó una secuencia de ADN del lado corriente arriba contenida en PhANS5’RACE15 (secuencia PhANS 5’RACE).
15 El gen ANS completo de la orquídea mariposa se sometió a clonación basándose en la secuencia PhANS 3’RACE y la secuencia PhANS 5’RACE. Se llevó a cabo la PCR utilizando el ADNc anterior, un cebador PhANS init (5’-ATGGCCACCAAAGCAATCCCACC-3’; SEC ID Nº 72), un cebador PhANS term (5’-TCAATCCAC AGGCGCCTT CT-3’; SEC ID Nº 73). En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 69 ºC y 1,5 minutos a 72 ºC 35 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en el sitio SwaI de pBS-P35T35 para obtener el p35PhANS1. A continuación se determinó la secuencia de bases completa del gen ANS (PhANS1) contenida en el p35PhANS1 (PhANS1; SEC ID Nº 74).
Además, la secuencia del presente gen descubierto en la orquídea mariposa es un gen nuevo. La secuencia
25 aminoacídica codificada por la secuencia de ADN tiene un 58% de homología con la secuencia aminoacídica (Nº de registro GenBank: EF079869) codificada por el gen ANS de Anthurium por el análisis de homología. El p35PhANS1 es un ADN que expresa el gen ANS de orquídea mariposa en células vegetales.
EJEMPLO 14: Transfección de un pétalo de orquídea mariposa blanca con el gen F3’5’H y un gen relacionado con antocianidina
0093 Un pétalo de orquídea mariposa blanca (Phal. amabilis) se contransfectó con el gen F3’5’H que se derivaba de Commelina communis y los genes CHS (p35PhCHS3), CHI (35PhCHI), F3H (p35PhF3H1), DFR (PhDFR) y ANS (PhANS1) que se habían derivado de orquídea mariposa según el procedimiento del Ejemplo 1. Como resultado, se
35 observaron células azul pálido en el pétalo.
Por lo tanto, es evidente que con el fin de cambiar el color de las flores de la orquídea mariposa blanca a azules, el gen DFR y el gen ANS eran importantes. Por tanto, con el fin de cambiar el color de las flores en azul más oscuro, se estudiaron los genes DFR y ANS de otras plantas.
EJEMPLO 15: Aislamiento del gen DFR y el gen ANS de Gerbera y cotransfección con los mismos
(1) Aislamiento del gen DFR de Gerbera (GerDFR)
45 Se aisló todo el ARN de un pétalo de un capullo de Gerbera disponible comercialmente (híbrido) utilizando el Mini Kit RNeasy Plant (QIAGEN), y se preparó el ADNc utilizando este ARN como matriz y Sistema de Síntesis SuperscriptII First-Strand (Invitrogen). A continuación se llevó a cabo una RT-PCR utilizando este ADNc como matriz. Se utilizaron como cebadores para la reacción PCR el GerDFR-F (5’-ATGGAAGAGGATTCTCCGGC-3’; SEC ID Nº 76) y GerDFR-R (5’-CTATTGGCCTTCTTTTGAACAACAAA-3’; SEC ID Nº 77) que se habían diseñado a partir de una secuencia (Nº de registro GenBank: Z17221) de un gen DFR de Gerbera conocido (GerDFR). La reacción se llevó a cabo repitiendo una etapa de 10 segundos a 98 ºC, 10 segundos a 55 ºC y 1 minuto y 30 segundos a 72 ºC 45 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en el sitio SwaI del pBS-P35T35 para obtener un gen DFR de Gerbera (p35GerDFR). El p35GerDFR es un ADN que expresa el gen DFR de Gerbera en células vegetales.
(2) Aislamiento del gen ANS de Gerbera (GerANS)
Se llevó a cabo una RT-PCR utilizando el ADNc anterior como matriz. Los cebadores utilizados en la reacción PCR fueron GerANS-F (5’-ATGGTGATTCAAGCAACCACA-3’; SEC ID Nº 78) y GerANS-R (5’-CTAGTTTTGCATCA CTTCGTCTTTAT-3’; SEC ID Nº 79) que se habían diseñado a partir de una secuencia (Nº de registro GenBank: AY997842) de un gen ANS de Gerbera conocido (GerANS).
En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 56 ºC y 1 minuto y 10 segundos a 72 ºC 45 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en el sitio SwaI del pBS-P35T35 para
65 obtener el gen ANS de Gerbera (p35 GerANS). El p35 GerANS es un ADN que expresa el gen ANS de Gerbera en células vegetales.
(3) Cotransfección con el gen DFR de Gerbera y el gen GerANS
Un pétalo de orquídea mariposa (Phal. amabilis) se cotransfectó con los respectivos genes CHS (PhCHS33), CHI (PhCHI1) y F3H (PhF3H1) que se habían derivado a partir de la orquídea mariposa, el gen F3’5’H (CcF3’5’H) que se 5 derivaba de Commelina communis y el gen DFR (GerDFR) y gen ANS (GerANS) que se derivaban de Gerbera. Como resultado, emergía nuevamente un azul más oscuro en el pétalo, al compararlo con el del Ejemplo 14.
EJEMPLO 16: Aislamiento del gen DFR y el gen ANS de Torenia y cotransfección con los mismos
(1) Aislamiento del gen DFR de Torenia (TorDFR)
Se aisló todo el ARN de un pétalo de un capullo de Torenia disponible comercialmente (Torenia foumieri) utilizando el Mini Kit RNeasy Plant (QIAGEN), y se preparó el ADNc utilizando el Sistema de Síntesis SuperscriptII First-Strand (Invitrogen). Se llevó a cabo la RT-PCR utilizando este ADNc como matriz. Los cebadores utilizados para la reacción
15 PCR fueron un oligonucleótido TorDFR-F (5’-ATGAGCATGGAAGTAGTAGTACCA-3’; SEC ID Nº 80) y TorDFR-R (5’-CTATTCTATCTTATGTTCTCCATGG-3’; SEC ID Nº 81) que se habían diseñado a partir de la secuencia (Nº de registro GenBank: AB012924) de un gen DFR de Torenia que ya se conocía (TorDFR). En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 56 ºC y 1 minuto y 10 segundos a 72 ºC 45 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en el sitio SwaI del pBS-P35T35 para obtener un gen DFR de Torenia (p35TorDFR). El p35TorDFR es un ADN que expresa el gen DFR de Torenia en células vegetales.
(2) Aislamiento del gen ANS de Torenia (TorANS)
Se llevó a cabo una RT-PCR utilizando el ADNc anterior como matriz. Los cebadores utilizados para la reacción
25 PCR fueron TorANS-F (5’-ATGGTTTCTCCAGCATCTCCGA-3’; SEC ID Nº 82) y TorANS-R (5’-TCACTCAA CACTCTTATCATCATGCTC-3’; SEC ID Nº 83) que se habían diseñado a partir de una secuencia (Nº de registro GenBank: AB044091) de un gen ANS de Torenia conocido (TorANS). En la reacción, se repitió una etapa de 30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 56 ºC y 1 minuto y 10 segundos a 72 ºC 45 ciclos. El producto que se obtuvo en la reacción se sometió a clonación en el sitio SwaI de pBS-P35T35 para obtener el gen ANS de Torenia (p35TorANS) El p35TorANS es un ADN que expresa el gen AND en células vegetales.
(3) Cotransfección del gen DFR de Torenia y el gen ANS de Torenia
Un pétalo de orquídea mariposa blanca (Phal. amabilis) se cotransfectó con los genes respectivos CHS (PhCHS33),
35 CHI (PhCHI1) and F3H (PhF3H1) que se derivaban de orquídea mariposa, el gen F3’5’H (CcF3’5’H) que se derivaba de Commelina communis y el gen DFR (TorDFR) y gen ANS (TorANS) que se derivaban de Torenia según el procedimiento del Ejemplo 1, y como resultado, emergieron nuevamente células en el pétalo que tenían un color púrpura más profundo que las del Ejemplo 14.
EXAMEN DEL MEJOR GEN DFR Y GEN ANS
Con respecto al cambio de la orquídea mariposa blanca a color azul, se introdujeron los diferentes genes derivados de plantas con el fin de encontrar el mejor gen DFR y el mejor gen ANS, y tales genes se compararon y examinaron.
45 EJEMPLO 17: Observación de la coloración de las células del pétalo
La coloración de las células del pétalo se observaron con el estéreomicroscopio SZX12 (OLYMPUS Corporation) y se observaron macroscópicamente. La referencia del grado de coloración del pétalo se estableció en que si se podía observar macroscópicamente se juzgó como “III”, si se podía observar con un estéreomicroscopio con una magnificación de al menos 32 veces se juzgó como “II”, y si no podía observarse con un estéreomicroscopio con una magnificación de al menos 32 veces se juzgó como “I”, y cuando la coloración no se observaba se juzgó como “-“.
EJEMPLO 18: Comparación de los genes ANS en el pétalo de la orquídea mariposa blanca
55 Un pétalo de orquídea mariposa blanca (Phal. amabilis) se transfectó con uno de los siguientes tres grupos de genes en los que solamente un gen ANS variaba, y se observó el grado de coloración.
- (1)
- gen ANS de orquídea mariposa (PhANS)+ gen CHS de orquídea mariposa (PhCHS3) + gen CHI de orquídea mariposa (PhCHI1) + gen F3H de orquídea mariposa (PhF3H1) + gen F3’5’H de Commelina communis (CcF3’5’H) + gen DFR de Gerbera (GerDFR)
- (2)
- gen ANS de Gerbera (GerDFR) + gen CHS de orquídea mariposa (PhCHS3) + gen CHI de orquídea mariposa (PhCHI1) + gen F3H de orquídea mariposa (PhF3H1) + gen F3’5’H de Commelina communis (CcF3’5’H) + gen DFR de Gerbera (GerDFR)
- (3)
- gen ANS de Torenia (TorANS) + gen CHS de orquídea mariposa (PhCHS3) + gen CHI de orquídea mariposa
65 (PhCHI1) + gen F3H de orquídea mariposa (PhF3H1) + gen F3’5’H de Commelina communis (CcF3’5’H) + gen DFR de Gerbera (GerDFR)
Como resultado, emergieron células azul púrpura en las respectivas muestras. Se compararon los grados de coloración de células azul púrpura que emergieron en veintidós fragmentos de pétalo. Los resultados se muestran en la Fig. 3.
5 EJEMPLO 19: Comparación de los genes DFR en el pétalo de orquídea mariposa
Un pétalo de orquídea mariposa blanca (Phal. amabilis) se transfectó con uno de los siguientes tres grupos de genes en los que solamente variaba un gen DFR, y se observó el grado de coloración.
- (1)
- gen DFR de orquídea mariposa (Ph DFR) + gen CHS de orquídea mariposa (PhCHS3) + gen CHI de orquídea mariposa (PhCHI1) + gen F3H de orquídea mariposa (PhF3H1) + gen F3’5’H de Commelina communis (CcF3’5’H)+ gen ANS de Torenia (TorANS)
- (2)
- gen DFR de Gerbera (Ger DFR) + gen CHS de orquídea mariposa (PhCHS3)+gen CHI de orquídea mariposa
(PhCHI1) + gen F3H de orquídea mariposa (PhF3H1) + gen F3’5’H de Commelina communis (CcF3’5’H) + gen 15 ANS de Torenia (TorANS)
(3) gen DFR de Torenia (TorDFR) + gen CHS de orquídea mariposa (PhCHS3) + gen CHI de orquídea mariposa (PhCHI1) + gen F3H de orquídea mariposa (PhF3H1) + gen F3’5’H de Commelina communis (CcF3’5’H)+ gen ANS de Torenia (TorANS)
Como resultado, emergieron células azul púrpura en las respectivas muestras. Se comparó el grado de coloración azul púrpura de las células que emergieron en veintitrés fragmentos del pétalo. Los resultados se muestran en la Fig. 4. Cuando se utilizó el gen PhDFR, el grado de coloración azul-púrpura fue bajo al compararse con el caso en el que se utilizó el gen GerDFR o el TorDFR. Se consideró que con el fin de producir un color de flores azul púrpura oscuro, el gen Gerbera DFR (GerDFR) y el gen DFR de Torenia (TorDFR) eran superiores al gen DFR endógeno de
25 la orquídea mariposa (PhDFR).
EJEMPLO 20: Rendimiento del gen F3’5’H de Commelina communis
Con el fin de medir el rendimiento del gen F3’5’H de Commelina communis en la orquídea mariposa blanca, se llevaron a cabo ensayos comparativos con el gen de petunia.
Un pétalo de orquídea mariposa blanca (Phal. amabilis) se cotransfectó con el gen F3’5’H de Commelina communis ((1) CcF3’5’H) o un gen F3’5’H de petunia ((2) PetF3’5’H1, o (3) PetF3’5’H2), junto con el gen CHS (PhCHS3), el gen CHI (PhCHI1) y el gen F3H (PhF3H1) que se derivaban de la orquídea mariposa y el gen DFR (GerDFR) y el gen
35 ANS (GerANS) que se derivaban de Gerbera.
Como resultado, en el caso en que se utilizó el gen F3’5’H de petunia (PetF3’5’H1) o el gen de petunia F3’5’H2 (Pet F3’5’H2), la coloración azul era poca. Por otro lado, en el caso en el que se utilizó el gen F3’5’H de Commelina communis (CcF3’5’H), se observó una coloración clara (Fig. 5).
EJEMPLO 21: Necesidad de transfección con los genes F3H, CHI, CHS
Se examinó la necesidad de los genes respectivos en el cambio de coloración a azul de las orquídeas mariposa blancas. Un pétalo de una orquídea mariposa blanca (Phal. amabilis) como material se transfectó con los siguientes
45 cuatro grupos de genes, y se observó el grado de coloración.
- (1)
- gen F3’5’H de Commelina communis (CcF3’5’H) + gen DFR de Torenia (TorDFR) + gen ANS de Torenia (TorANS)
- (2)
- gen F3H de Orquídea mariposa (PhF3H1) + gen F3’5’H de Commelina communis (CcF3’5’H) + gen DFR de Torenia (TorDFR) + gen ANS de Torenia (TorANS)
- (3)
- gen CHI de Orquídea mariposa (PhCHI1) + gen F3H de Orquídea mariposa (PhF3H1) + gen F3’5’H de Commelina communis (CcF3’5’H) + gen DFR de Torenia (TorDFR) + gen ANS de Torenia (TorANS)
- (4)
- gen CHS de Orquídea mariposa (PhCHS3) + gen CHI de Orquídea mariposa (PhCHI1) + gen F3H de
Orquídea mariposa (PhF3H1) + gen F3’5’H de Commelina communis (CcF3’5’H) + gen DFR de Torenia 55 (TorDFR) + gen ANS de Torenia (TorANS)
Un pétalo de Phal. amabilis se transfectó con estos genes, y se observó la coloración de las células. Como resultado, excepto en (1), emergieron células azul púrpura. Se compararon los grados de coloración de 18 fragmentos de las respectivas muestras, y los resultados se muestran en la Fig. 6. A partir de estos resultados, es evidente que el gen F3H (PhF3H1) es esencial para la coloración.
EJEMPLO 22: Análisis de los pigmentos emergentes por transfección de un pétalo de orquídeas mariposa blancas
En el experimento anterior, se examinó si los pigmentos contenidos en las células azul púrpura que emergían en el
65 pétalo de la orquídea mariposa blanca (Phal. amabilis) eran pigmentos relacionados con la delfinidina o no. Un pétalo de una orquídea mariposa blanca (Phal. amabilis) se cotransfectó con el gen CHI, el gen F3H y el gen ANS que se derivaban de orquídea mariposa, el gen DFR que se derivaba de Gerbera y el gen F3’5’H que se derivaba de Commelina communis, el pétalo se cultivó durante 5 días, y se extrajo la antocianidina del pétalo de la misma manera que en el Ejemplo 6 y se analizó. Como resultado, se detectó delfinidina como el componente principal del pigmento. La cantidad de delfinidina detectada era de 16 ng por muestra (media de cinco muestras). Por otro lado,
5 en el caso del grupo en el que el gen F3’5’H de Commelina communis se excluyó de los grupos de genes anteriores, no se detectó la delfinidina. A partir del resultado anterior, es evidente que las células azul púrpura observadas en la transfección genética de la orquídea mariposa blanca estaban coloreadas por un derivado de la delfinidina.
EJEMPLO 23: Aplicación a otras orquídeas mariposa blancas distintas de Phal. amabilis
Un pétalo de un capullo con una longitud de 1,7 cm de una gran orquídea mariposa blanca pura (Phal. White Stat) se contransfectó con el gen CHS, el gen CHI y el gen F3H que se derivaban de orquídea mariposa, el gen DFR y el gen ANS derivados de Gerbera y el gen F3’5’H derivado de Commelina communis según el procedimiento del Ejemplo 1, y emergieron nuevas células azul púrpura en el pétalo.
15 EJEMPLO 24: Preparación de ADN para la transformación de orquídeas mariposa por el procedimiento con Agrobacterium
La transformación de orquídeas mariposa se puede llevar a cabo por el procedimiento con Agrobacterium, así como por el procedimiento de bombardeo con microproyectiles (Belarmino y Mii, Plant Cell Reports (2000) 19:435-442., Mishiba y col., Plant Cell Reports (2005) 24: 297-303). Se construyó el ADN para la transformación para obtener plantas recombinadas genéticamente por estos procedimientos. Los mapas y los procedimientos de preparación de los plásmidos respectivos se muestran en las Fig. 7 y 8.
25 (1) Construcción del pBI-SAS1
Un fragmento corto obtenido cortando el pBI-SAS del Ejemplo 4 con NotI e HindlII se sometió a subclonación de una parte del pBI-RHL que se describe en el documento PCT/JP02/12268 que se cortó con NotI e HindlII para construir el pBI-SAS1. El pBI-SAS1 es un plásmido que confiere resistencia a la higromicina a las plantas transformadas con Agrobacterium.
(2) Construcción del pBS-35S-FT
Como se necesita al menos un periodo de un año para la floración de las orquídeas mariposa, se construyó un ADN 35 para expresar el gen de floración FT (Kobayashi y col., Science (1999) 286: 1960-1962).
El ADNc FT se preparó amplificando todo el ARN preparado a partir de la planta completa de Arabidopsis por RT-PCR. Para la PCR, se utilizaron como cebadores el AtFT 2nd-F (5’-GAAACCACCTGTTTGTTCAAGA-3’; SEC ID Nº 84) y AtFT 2nd-R (5’-TCAATTGGTTATAAAGGAAGAAGC-3’; SEC ID Nº 85), se insertó el ADNc FT purificado en una parte formada por el corte con SwaI del pBS-P35T35, el clon en el que se insertó el ADNc en la dirección sentido se seleccionó para construir el pBS-35S-FT. El pBS-35S-FT es un plásmido cuya transcripción está controlada por el promotor CaMV 35S y el terminador CaMV 35S.
(3) Construcción del pBIH-35S-CcF3’5’H
45 Se cortó el p35CcF3’5’H con BamHI, y un extremo cohesivo se truncó con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con AscI para recortar un fragmento de ADN del plásmido. Este fragmento de ADN se insertó en una parte formada por el corte de pBI-SAS1 con AscI y SwaI para construir el pBIH-35S-CcF3’5’H. El pBIH-35S-CcF3’5’H es un vector binario que tiene una región ADN-T en la que están conectados en este orden el HPT que es un marcador de selección y el CcF3’5’H, cuya transcripción está controlada por el promotor CaMV 35S y el terminador Ca MV 35S.
(4) Construcción del pBS-35S-mPhCHS3
55 Se introdujo una sustitución de nucleótidos sin sustitución de aminoácidos en una parte cortada con SphI en el ADNc PhCHS3 para preparar un ADNc que no se pudiera cortar con SphI. Se utilizaron como cebadores para la sustitución de nucleótidos el PhCHS3-1038F (5’-GTAACATGTCGAGCGCTTGCGTTCTTTTCATACTCG-3’; SEC ID Nº 86) y PhCHS3-1073R (5’-CGAGTATGAAAAGAACGCAAGCGCTCGACATGTTAC-3’; SEC ID Nº 87), y se sintetizó un ADNc utilizando el pBS-35S-PhCHS3 como matriz y Pyrobest (Takara Bio Inc.). A continuación el plásmido matriz se digirió por tratamiento con DpnI para construir el pBS-35S-mPhCHS3.
(5) Construcción del pBS-35S-UP1
Después de cortar el p35PhCHI1 con AscI, y de que se truncara un extremo cohesivo con el fragmento Klenow, se
65 continuó cortando con SphI para recortar un fragmento de ADN del plásmido. Este fragmento de ADN se insertó en una parte formada por el corte de p35PhF3H1 con XbaI, se truncó un extremo cohesivo, y a continuación se cortó con SphI para construir el BS-35S-UP1. El pBS-35S-UP1 es un plásmido en el que en los ADNc respectivos cuya transcripción está controlada por el promotor CaMV 35S y el terminador CaMV 35S están conectados en el orden de PhCHI1 y PhF3H1.
5 (6) Construcción del pBS-35S-Del1
Se cortó el p35TorANS con AscI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con KpnI para recortar un fragmento de ADN del plásmido. Este fragmento de ADN se insertó en una parte formada por el corte de p35TorDFR con XbaI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con KpnI para construir el pBS-35S-Del1. El pBS-35S-Del1 es un plásmido en el que los ADNc respectivos cuya transcripción está controlada por el promotor CaMV 35S y el terminador CaMV 35S están conectados en el orden de TorANS y TorDFR.
(7) Construcción de pBS-35S-Del2
15 Se cortó el p35CcF3’5’H con AscI, se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y se recortó un fragmento de ADN cortando el plásmido con SphI. Este fragmento de ADN se insertó en una parte formada por el corte de pBS-35S-Del1 con XbaI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con SphI para construir el pBS-35S-Del2. El pBS-35S-Del2 es un plásmido en el que los ADNc respectivos cuya transcripción está controlada por el promotor CaMV 35S y el terminador CaMV 35S están en orden de CcF3’5’H, TorANS y TorDFR.
(8) Construcción del pBS-35S-Del8
25 Se cortó el pBS-35S-UP1 con AscI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación, cortando con SphI se recortó un fragmento de ADN del plásmido. Este fragmento de ADN se insertó en una parte formada por el corte del pBS-35S-Del2 con XbaI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con SphI para construir el pBS-35S-Del8. El pBS-35S-Del8 es un plásmido en el que los ADNc respectivos cuya transcripción está controlada por el promotor CaMV 35S y el terminador CaMV 35S están conectados en el orden PhCHI1, PhF3H1, CcF3’5’H, TorANS y TorDFR.
(9) Construcción del pBS-35S-Del9
Se cortó el pBS-35S-mPhCHS3 con AscI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a
35 continuación cortando con SphI se recortó un fragmento de ADN del plásmido. Este fragmento de ADN se insertó en una parte formada por el corte de pBS-35S-Del8 con XbaI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con SphI para construir el pBS-35S-Del9. El pBS-35S-Del9 es un plásmido en el que los respectivos ADNc cuya transcripción está controlada por el promotor CaMV 35S y el terminador CaMV 35S están conectados en el orden mPhCHS3, PhCHI1, PhF3H1, CcF3’5’H, TorANS y TorDFR,
(10) Construcción de pBS-35S-Del15
Se cortó el p35 CcF3’5’H con AscI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con SphI para recortar un fragmento de ADN del plásmido. Este fragmento de ADN se insertó en una parte
45 formada por el corte del pBS-35S-FT con XbaI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con SphI para construir el pBS-35S-Del15. El pBS-35S-Del15 es un plásmido en el que los respectivos ADNc cuya transcripción se controla por el promotor CaMV 35S y el terminador CaMV 35S se conectan en el orden de CcF3’5’H y FT.
(11) Construcción del pBS-35S-Del16
El p35 TorDFR se cortó con AscI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con SphI para recortar un fragmento de ADN del plásmido. Este fragmento de ADN se insertó en una parte formada por el corte del p35-PhANS1 con XbaI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a
55 continuación se cortó con SphI para construir el pBS-35S-Del16. El pBS-35S-Del16 es un plásmido en el que los respectivos ADNc cuya transcripción se controla por el promotor CaMV 35S y el terminador CaMV 35S se conectan en el orden de TorDFR y PhANS1.
(12) Construcción de pBS-35S-UP4
El pBS-35S-Del16 se cortó con AscI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con SphI para recortar un fragmento de ADN del plásmido. Este fragmento de ADN se insertó en una parte formada por el corte del pBS-35S-UP1 con XbaI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con SphI para construir el pBS-35S-UP4. El pBS-35S-UP4 es un plásmido en el que los
65 respectivos ADNc cuya transcripción se controla por el promotor CaMV 35S y el terminador CaMV 35S se conectan en el orden de TorDFR, PhANS1, PhCHI1 y PhF3H1.
(13) Construcción del pBS-355-Del17
El pBS-35S-CcF3’5’H se cortó con AscI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con SphI para recortar un fragmento de ADN del plásmido. Este fragmento de ADN se insertó en una parte
5 formada por el corte del pBS-35S-UP4 con XbaI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con SphI para construir el pBS-355-Del17. El pBS-355-Del17 es un plásmido en el que los respectivos ADNc cuya transcripción se controla por el promotor CaMV 35S y el terminador CaMV 35S se conectan en el orden de CcF3’5’H, TorDFR, PhANS1, PhCHI1 y PhF3H1.
(14) Construcción del pBS-35S-Del18
El pBS-35S-Del15 se cortó con AscI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con SphI para recortar un fragmento de ADN del plásmido. Este fragmento de ADN se insertó en una parte formada por el corte del pBS-35S-UP4 con XbaI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a
15 continuación se cortó con SphI para construir el pBS-35S-Del18. El pBS-35S-Del18 es un plásmido en el que los respectivos ADNc cuya transcripción se controla por el promotor CaMV 35S y el terminador CaMV 35S se conectan en el orden de CcF3’5’H, FT, TorDFR, PhANS1, PhCHI1 y PhF3H1.
(15) Construcción del pBIH-35S-Del8
El pBS-35S-Del8 se cortó con SphI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con AscI para recortar un fragmento de ADN del plásmido. Este fragmento de ADN se insertó en una parte formada por el corte del pBI-SAS1con AscI y SwaI, para construir el BIH-35S-Del8. El pBIH-35S-Del8 es un vector binario que tiene una región ADN-T en la que HPT es un marcador de selección y en el que los respectivos ADNc
25 cuya transcripción se controla por el promotor CaMV 35S y el terminador CaMV 35S se conectan en el orden de PhCHI1, PhF3H1, CcF3’5’H, TorANS y TorDFR.
(16) Construcción del pBIH-35S-Del9
El pBS-35S-Del9 se cortó con SphI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con AscI para recortar un fragmento de ADN del plásmido. Este fragmento de ADN se insertó en una parte formada por el corte del pBI-SAS1con AscI y SwaI, para construir el pBIH-35S-Del9. El pBIH-35S-Del9 es un vector binario que tiene una región ADN-T en la que HPT es un marcador de selección y en el que los respectivos ADNc cuya transcripción se controla por el promotor CaMV 35S y el terminador CaMV 35S se conectan en el orden de
35 mPhCHS3, PhCHI1, PhF3H1, CcF3’5’H, TorANS y TorDFR.
(17) Construcción del pBIH-35S-Del17
El pBS-35S-Del17 se cortó con SphI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con AscI para recortar un fragmento de ADN del plásmido. Este fragmento de ADN se insertó en una parte formada por el corte del pBI-SAS1con AscI y SwaI, para construir el BIH-35S-Del17. El pBIH-35S-Del17 es un vector binario que tiene una región ADN-T en la que HPT es un marcador de selección y en el que los respectivos ADNc cuya transcripción se controla por el promotor CaMV 35S y el terminador CaMV 35S se conectan en el orden de CcF3’5’H, TorDFR, PhANS1, PhCHI1 y PhF3H1.
(18) Construcción del pBIH-35S-Del18
El pBS-35S-Del18 se cortó con SphI, y se truncó un extremo cohesivo con un fragmento Klenow, y a continuación se cortó con AscI para recortar un fragmento de ADN del plásmido. Este fragmento de ADN se insertó en una parte formada por el corte del pBI-SAS1con AscI y SwaI, para construir el BIH-35S-Del18. El pBIH-35S-Del18 es un vector binario que tiene una región ADN-T en la que HPT es un marcador de selección y en el que los respectivos ADNc cuya transcripción se controla por el promotor CaMV 35S y el terminador CaMV 35S se conectan en el orden de CcF3’5’H, FT, TorDFR, PhANS1, PhCHI1 y PhF3H1.
55 EJEMPLO 25: Producción de orquídeas mariposa transformadas
Se seleccionó con 50 mg/ml de higromicina una orquídea mariposa producida utilizando el ADN (pBIH-35SCcF3’5’H, pBIH-35S-De18, pBIH-35S-Del9, pBIH-355-Del17 y pBIH-355-Del18) que se había construido con el vector binario del Ejemplo 24 y la cepa Agrobacterium EHA101. Como resultado, se pudo obtener una orquídea mariposa en la que estaban integrados en el cromosoma los genes mostrados en el Ejemplo 24.
Se puede inducir PLB de la orquídea mariposa transformada que se ha obtenido, utilizando una parte de la planta tal como el tallo floral o una yema axilar, y se puede llevar a cabo la reproducción del clon. Llevando a cabo el cruzamiento utilizando la orquídea mariposa transformada que se obtiene, como parental del cruzamiento, es posible
65 obtener una descendencia con los genes integrados.
Por tanto, utilizando el gen F3’5’H de Commelina communis, se puede producir una variedad de tonos azules a partir de una orquídea mariposa con su color original, y se puede producir nuevamente una variedad azul a partir de una orquídea mariposa blanca.
5 EJEMPLO 26: Evaluación de la actuación del gen F3’5’H de Commelina communis en un pétalo de Cymbidium
Diez fragmentos de un pétalo obtenido de un capullo que tenía una longitud de 30 mm de un Cymbidium blanco (Cym. Lovely angel ‘The Two Virgins’) se cotransfectaron según el procedimiento del Ejemplo 1 con uno de los siguientes tres grupos de genes.
- (1)
- gen F3’5’H de Commelina communis (CcF3’5’H) + gen CHS de Orquídea mariposa (PhCHS3) + gen CHI de orquídea mariposa (PhCHI1) + gen F3H de Orquídea mariposa (PhF3H1) + gen DFR de Gerbera (GerDFR) + gen ANS de Gerbera (GerANS)
- (2)
- gen F3’5’H2 de Petunia (PetF3’5’H2) + gen CHS de orquídea mariposa (PhCHS3) + gen CHI de orquídea
15 mariposa (PhCHI1) + gen F3H de orquídea mariposa (PhF3H1) + gen DFR de Gerbera (GerDFR) + gen ANS de Gerbera (GerANS)
(3) gen CHS de orquídea mariposa (PhCHS3) + gen CHI de orquídea mariposa (PhCHl1) + gen F3H de orquídea mariposa (PhF3H1) + gen DFR de Gerbera (GerDFR) + gen ANS de Gerbera (GerANS)
Un pétalo transfectado se cultivó estáticamente durante 5 días, y luego se observó con un estéreomicroscopio. Emergieron células nuevas de un azul púrpura profundo en los pétalos que se habían transfectado con el grupo de genes (1) que incluían el gen F3’5’H de Commelina communis (CcF3’5’H). Por otro lado, en los pétalos que se habían transfectado con el grupo de genes (2) que incluía el gen F3’5’H2 de Petunia (PetF3’5’H2), se observaron células púrpura claro en solo una parte de los pétalos, y en los pétalos que se transfectaron con el grupo de genes
25 (3) que no contenía el gen F3’5’H, no se observó ningún cambio de color. Los resultados de la evaluación del grado de coloración de las células que emergieron en cada pétalo por el procedimiento descrito en el Ejemplo 17 se muestran en la Fig. 9.
Aplicabilidad Industrial
Utilizando el gen F3’5’H de Commelina communis, además de orquídeas que tienen flores azules que no se pueden conseguir por los procedimientos de cruzamiento convencionales, se pueden producir plantas que tengan varios tonos azules de la flor, y su aplicabilidad es extremadamente amplia.
35 Se hace referencia a la divulgación completa de la Solicitud de Patente Japonesa Nº 2007-066539 presentada el 15 de marzo de 2007 que incluye la especificación, reivindicaciones, dibujos y resumen.
LISTADO DE SECUENCIAS
SEC ID Nº: 1, secuencia de nucleótidos que codifica flavonoide 3',5'-hidroxilasa de Commelina communis SEC ID Nº: 2, secuencia de aminoácidos de flavonoide 3',5'-hidroxilasa de Commelina communis SEC ID Nº: 3, Cebador 35FH-1 SEC ID Nº 4, Cebador 35FH-4 SEC ID Nº: 5, Cebador 35FH-2
45 SEC ID Nº: 6, Cebador 35FH-3 SEC ID Nº: 7, Cebador C35FH-3 SEC ID Nº: 8, Cebador C35FH-4 SEC ID Nº: 9, Cebador C35FH-6 SEC ID Nº: 10, Cebador C35FH-5 SEC ID Nº: 11, Cebador C35FH-7 SEC ID Nº 12, Cebador C35FH-10 SEC ID Nº 13, Cebador C35FH-9 SEC ID Nº: 14, Oligonucleótido SAS-S SEC ID Nº: 15, Oligonucleótido SAS-AS
55 SEC ID Nº: 16, Cebador T-CaMV35S-Ssel-F SEC ID Nº: 17, Cebador TCaMV35S-Ascl-R SEC ID Nº: 18, Cebador CcF35H-F SEC ID Nº: 19, Cebador CcF35H-R SEC ID Nº: 20, Cebador PetF3’5’H1-F SEC ID Nº: 21, Cebador PetF3’5’H1-R SEC ID Nº: 22, Cebador PetF3’5’H2-F SEC ID Nº: 23, Cebador PetF3’5’H2-R SEC ID Nº: 24, Cebador PhCHS3 F1 SEC ID Nº 25, Cebador PhCHS3 R1
65 SEC ID Nº: 26, secuencia de nucleótidos que codifica la chalcona sintasa variedad de cultivo híbrida de
Doritaenopsis
SEC ID Nº: 27, secuencia de aminoácidos de la chalcona sintasa variedad de cultivo híbrida de Doritaenopsis SEC ID Nº: 28, Cebador CHI-dgF1 SEC ID Nº: 29, Cebador CHI-dgR1 SEC ID Nº 30, Cebador CHI-dgF3
5 SEC ID Nº: 31, Cebador CHI-dgR3 SEC ID Nº: 32, Cebador PhCHI-GSP F1 SEC ID Nº: 33, Cebador PhCHI-GSP F2 SEC ID Nº: 34, Cebador PhCHI-GSP R1 SEC ID Nº 35, Cebador PhCHI-GSP R2 SEC ID Nº: 36, Cebador PhCHI ini. SEC ID Nº 37, Cebador PhCHI term. SEC ID Nº: 38, secuencia de nucleótidos que codifica la chalcona isomerasa variedad de cultivo híbrida de
Doritaenopsis
SEC ID Nº: 39, secuencia de aminoácidos de la chalcona isomerasa variedad de cultivo híbrida de
15 Doritaenopsis SEC ID Nº: 40, Cebador F3H-dgF1 SEC ID Nº: 41, Cebador F3H-dgR1 SEC ID Nº: 42, Cebador F3H-dgF3 SEC ID Nº: 43, Cebador F3H-dgR3 SEC ID Nº: 44, Cebador PhF3H-GSPF1 SEC ID Nº: 45, Cebador PhF3H-GSPF2 SEC ID Nº: 46, Cebador PhF3H-GSPR1 SEC ID Nº: 47, Cebador PhF3H-GSPR2 SEC ID Nº: 48, Cebador PhF3H ini.
25 SEC ID Nº: 49, Cebador PhF3H term. SEC ID Nº: 50, secuencia de nucleótidos que codifica la flavanona 3-hidroxilasa variedad de cultivo híbrida de
Doritaenopsis
SEC ID Nº: 51, secuencia de aminoácidos de la flavanona 3-hidroxilasa variedad de cultivo híbrida de
Doritaenopsis
SEC ID Nº: 52, Cebador DFRD-F1
SEC ID Nº: 53, Cebador DFRD-R1
SEC ID Nº: 54, Cebador DFRD-F2
SEC ID Nº: 55, Cebador DFRD-R2
SEC ID Nº: 56, Cebador DFRD-F3
35 SEC ID Nº: 57, Cebador DFRD-R3 SEC ID Nº: 58, Cebador PhDFR-F1 SEC ID Nº: 59, Cebador PhDFR-F2 SEC ID Nº: 60, Cebador PhDFR-R4 SEC ID Nº: 61, Cebador PhDFR-R3 SEC ID Nº: 62, Cebador PhDFR-F8A5 SEC ID Nº: 63, Cebador PhDFR-R5 SEC ID Nº: 64, secuencia de nucleótidos que codifica la dihidroflavonol-4-reductasa variedad de cultivo híbrida de Doritaenopsis SEC ID Nº: 65, secuencia de aminoácidos de la dihidroflavonol-4-reductasa variedad de cultivo híbrida de
45 Doritaenopsis SEC ID Nº: 66, Cebador ANS-dgF2 SEC ID Nº: 67, Cebador ANS-dgR2 SEC ID Nº: 68, Cebador PhANS3RACEGSP1 SEC ID Nº: 69, Cebador PhANS3RACEGSP2 SEC ID Nº: 70, Cebador PhANS5RACEGSP1 SEC ID Nº: 71, Cebador PhANS5RACEGSP2 SEC ID Nº: 72, Cebador PhANS ini. SEC ID Nº: 73, Cebador PhANS term. SEC ID Nº: 74, secuencia de nucleótidos que codifica la antocianidina sintasa variedad de cultivo híbrida de
55 Doritaenopsis SEC ID Nº: 75, secuencia de aminoácidos de la antocianidina sintasa variedad de cultivo híbrida de
Doritaenopsis
SEC ID Nº: 76, Cebador GerDFR-F
SEC ID Nº: 77, Cebador GerDFR-R
SEC ID Nº: 78, Cebador GerANS-F
SEC ID Nº: 79, Cebador GerANS-R
SEC ID Nº: 80, Cebador TorDFR-F
SEC ID Nº: 81, Cebador TorDFR-R
SEC ID Nº: 82, Cebador TorANS-F
65 SEC ID Nº: 83, Cebador TorANS-R SEC ID Nº: 84, Cebador AtFT 2nd-F
SEC ID Nº: 85, Cebador AtFT 2nd-R
SEC ID Nº: 86, Cebador PhCHS3-1038F
SEC ID Nº: 87, Cebador PhCHS3-1073R
5 LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Ishihara Sangyo Kaisha LTD
<120> Gen de la flavonoide 3’, 5’ hidroxilasa de Commelina communis 10
<130> P2008003
<160> 87 15 <170> PatentIn versión 3.1
<210> 1
<211> 1524
<212> ADN 20 <213> Commelina communis
<220>
<221> CDS 25 <222> (1)..(1524)
<223> flavonoide 3’,5’-hidroxilasa de Commelina communis, (Cc F3’5’H)
<400> 1
<210> 2
<211> 507
<212> PRT
<213> Commelina communis
<400> 2
<210> 3
<211> 20
5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador 35FH-1 10
<220>
<221> base modificada
<222> (6) .. (15)
- <223> n (6, 9, 15) = i
- 5
- <400> 3 atggtngtng arytnatgac 20
- <210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador 35FH-4
- 15
- <220> <221> base modificada <222> (6)..(12) <223> n (6, 9, 12) = i
- <400> 4 ccraanggna tnarytcraa
- 20
- 25
- <210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador 35FH-2
- 35
- <220> <221> base modificada <222> (12) .. (18) <223> n (12, 18) i <400> 5 tggatggayy tncarggnat 20
- <210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
- 45
- <220> <223> Cebador 35FH-3
- <220> <221> base modificada <222> (3) .. (12) <223> n (3, 12) = d
- 55
- <220> <221> base modificada <222> (6) .. (18) <223> n (6, 18) = i
- <400> 6 ccnatngccc anatrttnac
- 20
- <210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
- 65
- <220> <223> Cebador C35FH-3
- <400> 7 atctccctcg tatcgcaacc
- 5
- <210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
- 10
- <220> <223> Cebador C35FH-4
- <400> 8 gaagcttgtg aagccaatgg
- 15
- <210> 9 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
- 20
- <220> <223> Cebador C35FH-6
- 25 30
- <400> 9 cgtcgcctcg tgctctcgca gtatc <210> 10 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador C35FH-5
- 35
- <400> 10 tcttcgagag caccttatcg aacctc
- 40
- <210> 11 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador C35FH-7
- 45
- <400> 11 gaaaaccaat acaaaaacat acc
- 50
- <210> 12 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
- 55
- <220> <223> Cebador C35FH-10 <400> 12 attgcttcaa gttccctagc
- 60
- <210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
- 65
- <220> <223> Cebador C35FH-9
- <400> 13 gttccctagc cccgtaccac
- 20
- 5
- <210> 14 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial
- 10
- <220> <223> Oligonucleótido SAS-S
- <400> 14 ctagctagcg gcgcgcctgc aggatatcat ttaaatcccg gg
- 42
- 15
- <210> 15 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial
- 20
- <220> <223> Oligonucleótido SAS-AS
- 25 30
- <400> 15 cccgggattt aaatgatatc ctgcaggcgc gccgctagct ag <210> 16 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador T-CaMV35S-Ssel-F 42
- 35
- <400> 16 aacctgcagg aaatcaccag tctctctcta 30
- 40
- <210> 17 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador T-CaMV35S-Ascl-R
- 45
- <400> 17 ggcgcgccat cgataagggg ttattag 27
- 50
- <210> 18 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial
- 55
- <220> <223> Cebador CcF35H-F <400> 18 atggtacccc ttacgtacct t 21
- 60
- <210> 19 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial
- 65
- <220> <223> Cebador CcF35H-R
- <400> 19 ttatgttgtt tttatattct tataaacg
- 28
- 5
- <210> 20 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
- 10
- <220> <223> Cebador PetF3’5’H1-F
- <400> 20 atgatgctac ttactgagct tggtg
- 25
- 15
- <210> 21 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
- 20
- <220> <223> Cebador PetF3’5’H1-R
- 25 30
- <400> 21 caacatgcgc aattatagca 20 <210> 22 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador PetF3’5’H2-F
- 35
- <400> 22 atggtgctac ttagtgagct tgc 23
- 40
- <210> 23 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador PetF3’ 5’ H2-R
- 45
- <400> 23 aaccaacgta aaggcatgtt 20
- 50
- <210> 24 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial
- 55
- <220> <223> Cebador PhCHS3 F1 <400> 24 aagcttgtga gagacgacgg a 21
- 60
- <210> 25 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
- 65
- <220> <223> Cebador PhCHS3 R1
<400> 25
tggccctaat ccttcaaatt 20
<210> 26
5 <211> 1185
<212> ADN
<213> Variedad de cultivo híbrida de Doritaenopsis (Doritaenopsis Sogo Vivien x Doritae nopsis Sogo Yenlin)
<220> 10 <221> CDS
<222> (1).. (1185)
<223> Chalcona sintasa variedad de cultivo híbrida de Doritaenopsis (PhCHS 3)
<400> 26 15
<210> 27
<211> 394
<212> PRT
<213> Variedad de cultivo híbrida de Doritaenopsis (Doritaenopsis Sogo Vivien x Doritae nopsis Sogo Yenlin)
<400> 27
- 5
- <210> 28 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial
- 10
- <220> <223> Cebador CHI-dgF1 <400> 28 ttyctcgsyg gbgcmggygw vmgvgg 26
- 15
- <210> 29 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial
- 20
- <220> <223> Cebador CHI-dgR1
- <220> <221> base modificada
- <222> (5) .. (20) <223> n (5, 8, 20) = i
- 5
- <400> 29 cmggnganac vscrtkytyn ccratvat 28
- <210> 30 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador CHI-dgF3
- 15
- <220> <221> base modificada <222> (3) .. (14) <223> n (3, 11, 14) = i
- <400> 30 tmnkywcmgg nsmnttygar aaryt
- 25
- 25
- <210> 31 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador CHI-dgR3
- 35
- <220> <221> base modificada <222> (3).. (21) <223> n (3, 12, 21)=i <400> 31 tynccratva tngwhtccar naybgc 26
- <210> 32 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial
- 45
- <220> <223> Cebador PhCHI-GSP F1
- <400> 32 atgctgctgc cattaacggg tca
- 23
- <210> 33 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial
- 55
- <220> <223> Cebador PhCHI-GSP F2
- <400> 33 tccgagaagg tctccgggaa ct
- 22
- 65
- <210> 34 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Cebador PhCHI-GSP R1
<400> 34
gcattcgtca gcttcttgct ctct 24
5
<210> 35
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial 10
<220>
<223> Cebador PhCHI-GSP R2
<400> 35 15 atcacatcag tctcagccac a 21
<210> 36
<211> 25
<212> ADN 20 <213> Artificial
<220>
<223> Cebador PhCHI ini.
25 <400> 36 atggcagaaa cagtggcgac gccca 25
<210> 37
<211> 21 30 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador PhCHI term. 35
<400> 37
tcaaacgact ccatcttgct c 21
<210> 38 40 <211> 723
<212> ADN
<213> Variedad de cultivo híbrida de Doritaenopsis (Doritaenopsis Sogo Vivien x Doritae nopsis Sogo Yenlin)
<220> 45 <221> CDS
<222> (1)..(723)
<223> Chalcona isomerasa variedad de cultivo híbrida de Doritaenopsis ( PhCHI 3 )
<400> 38
<210> 39
<211> 240
<212> PRT
<213> Variedad de cultivo híbrida de Doritaenopsis (Doritaenopsis Sogo Vivien x Doritae nopsi Sogo Yenlin)
<400> 39
- 5
- <210> 40 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
- 10 15
- <220> <223> Cebador F3H-dgF1 <220> <221> base modificada <222> (2).. (23) <223> n (2, 5. 23) = i <400> 40 tnvgngayga rgabgarmgb ccnaa 25
- 20
- <210> 41 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial
- 25
- <220> <223> Cebador F3H-dgR1
- <400> 41 acbgcyygrt grtchgcrtt cttraa
- 26
- 30
- <210> 42 <211> 25 <212> ADN
- <213> Artificial
- 5
- <220> <223> Cebador F3H-dgF3 <220> <221> base modificada <222> (24) .. (24) <223> n (24) = i
- <400> 42 aarytbrgkt tygayatgwc hggng
- 25
- 15
- <210> 43 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador F3H-dgR3
- 25
- <220> <221> base modificada <222> (12) .. (12) <223> n(12) = d
- <220> <221> base modificada <222> (18) .. (18) <223> n(18) = i
- <400> 43 gghwsracvg tnatccangw btt
- 23
- 35
- <210> 44 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador PhF3H-GSPF1
- 45
- <400> 44 ttctcatacc caatcgggag <210> 45 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial 20
- <220> <223> Cebador PhF3H-GSPF2
- 55
- <400> 45 aatcgggagc cgcgattact 20
- <210> 46 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador PhF3H-GSPR1
- 65
- <400> 46 tctgtgtggc gcttcaggcc 20
<210> 47
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
5
<220>
<223> Cebador PhF3H-GSPR2
<400> 47 10 tgaggtccgg ttgcgggcat ttt 23
<210> 48
<211> 25
<212> ADN 15 <213> Artificial
<220>
<223> Cebador PhF3H ini.
20 <400> 48 atggccccaa taccattcct accga 25
<210> 49
<211> 35 25 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador PhF3H term. 30
<400> 49
ccttaagcta aaatctcatt taatgccttt gctcc 35
<210> 50 35 <211> 1113
<212> ADN
<213> Variedad de cultivo híbrida de Doritaenopsis (Doritaenopsis Sogo Vivien x Doritae nopsis Sogo Yenlin)
<220> 40 <221> CDS
<222> (1).. (1113)
<223> Flavanona 3-hidroxilasa variedad de cultivo híbrida de Doritaenopsis ( PhF3H 1 )
<400> 50 45
<210> 51
<211> 370
<212> PRT
<213> Variedad de cultivo híbrida de Doritaenopsis (Doritaenopsis Sogo Vivien x Doritae napsis Sogo Yenlin)
- <400>
- 51
- <400>
- 52 ttycaygtng cnacnccnat g
- <210> 52
- <211> 21
- 5
- <212> ADN
- <213> Artificial
- <220>
- <223> Cebador DFRD-F1
- 10
- <220>
- <221> base modificada
- <222> (9) .. (12)
- <223> n (9, 12) =i
- 15
<210> 53
5 <211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador DFRD-R1
<220>
<221> base modificada
<222> (1) .. (1) 15 <223> n(1) = d
<400> 53 natngcrtcr tcraacatyt c
<210> 54
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
25 <220>
<223> Cebador DFRD-F2
<220>
<221> base modificada
<222> (15) .. (15)
<223> n(15) = i
<400> 54
atgaayttyc arwsnrarga ycc 35
<210> 55
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador DFRD-R2
<220> 45 <221> base modificada
<222> (4) .. (15)
<223> n (4, 10, 15) = i
<400> 55 rcanatrtan ckncnrttng c
<210> 56
<211> 20
<212> ADN 55 <213> Artificial
<220>
<223> Cebador DFRD-F3
<400> 56 garaaygarg tnathaarcc
<210> 57
<211> 21 65 <212> ADN
<213> Artificial
- <220> <223> Cebador DFRD-R3
- 5
- <220> <221> base modificada <222> (7).. (7) <223> n(7) = i
- <400> 57 rtcrtcnarr tgnacraayt g
- 21
- 15
- <210> 58 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador PhDFR-F1
- <400> 58 ggtcatgcaa aaggtcgggc agcgtaa
- 27
- 25
- <210> 59 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador PhDFR-F2
- <400> 59 gtgatcttca catcttccgc aggaacagt
- 29
- 35
- <210> 60 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador PhDFR-R4
- <400> 60 atgattcatt aaaaatccga aaaaaagacc actacaa
- 37
- 45
- <210> 61 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador PhDFR-R3
- 55
- <400> 61 aaccatgcat aataaagcag atgtgtaaat <210> 62 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial 30
- <220> <223> Cebador PhDFR-F8A5
- 65
- <400> 62 aaaaaatgga ggatgtgagg aagggtcctg tt 32
<210> 63
<211> 33
<212> ADN
<213> Artificial
5
<220>
<223> Cebador PhDFR-R5
<400> 63 10 acatgattca ttaaaaatcc gaaaaaaaga cca 33
<210> 64
<211> 1140
<212> ADN 15 <213> Variedad de cultivo híbrida de Doritaenopsis (Doritaenopsis Queen Beer)
<220>
<221> CDS
20 <222> (1)..(1140)
<223> Dihidroflavonol-4-reductasa variedad de cultivo híbrida de Doritaenopsis ( PhDFR )
<400> 64
<210> 65
<211> 379
<212> PRT
<213> Variedad de cultivo híbrida de Doritaenopsis (Doritaenopsis Queen Beer)
- <400>
- 65
- <400>
- 72 atggccacca aagcaatccc acc 23
- 5
- <210> 66 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial
- 10 15
- <220> <223> Cebador ANS-dgF2 <220> <221> base modificada <222> (2) .. (26) <223> n (2, 14, 23. 26) = i <400> 66 tncarggbta yggnagyarr ytngcnrmya 30
- <210> 67
- <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
- 5
- <220> <223> Cebador ANS-dgR2
- <220> <221> base modificada <222> (12) .. (21) <223> n (12, 15, 21) = i
- 15
- <400> 67 ggytcrcara anaynrccca ngada <210> 68 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial 25
- <220> <223> Cebador PhANS3RACEGSP1
- 25
- <400> 68 gcccacaccg acgtcagctc cctctcct 28
- <210> 69 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador PhANS3RACEGSP2
- 35
- <400> 69 cgtcggggat gcgctcgaga tcctcagc 28
- <210> 70 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial
- 45
- <220> <223> Cebador PhANS5RACEGSP1 <400> 70 agtccgcggg ttcagtcggc cagatggt 28
- <210> 71 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial
- 55
- <220> <223> Cebador PhANS5RACEGSP2
- <400> 71 ccgtcttctc cggcgggtag acgaggtg
- 28
- <210> 72 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial
- 65
- <220> <223> Cebador PhANS ini.
<210> 73
5 <211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 10 <223> Cebador PhANS term.
<400> 73
tcaatccaca ggcgccttct 20
15 <210> 74
<211> 1083
<212> ADN
<213> Variedad de cultivo híbrida de Doritaenopsis (Doritaenopsis Sogo Vivien x Doritae nopsis Sogo Yenlin)
<221> CDS
<222> (1) .. (1083)
<223> Antocianidina sintasa variedad de cultivo híbrida de Doritaenopsis ( PHANS 1 )
25 <400> 74
<210> 75
<211> 360
<212> PRT
<213> Variedad de cultivo híbrida de Doritaenopsis (Doritaenopsis Sogo Vivien x Doritae nopsis Sogo Yenlin)
<400> 75
- 5
- <210> 76 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
- 10
- <220> <223> Cebador GerDFR-F <400> 76 atggaagagg attctccggc 20
- 15
- <210> 77 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial
- 20
- <220> <223> Cebador GerDFR-R
- <400> 77 ctattggcct tcttttgaac aacaaa 26
- 25
- <210> 78 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial
- 30
- <220> <223> Cebador GerANS-F
- 35 40
- <400> 78 atggtgattc aagcaaccac a <210> 79 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador GerANS-R 21
- 45
- <400> 79 ctagttttgc atcacttcgt ctttat 26
- 5
- <210> 80 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador TorDFR-F
- <400> 80 atgagcatgg aagtagtagt acca
- 24
- 15
- <210> 81 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador TorDFR-R
- <400> 81 ctattctatc ttatgttctc catgg
- 25
- 25
- <210> 82 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador TorANS-F
- <400> 82 atggtttctc cagcatctcc ga
- 22
- 35
- <210> 83 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador TorANS-R
- <400> 83 tcactcaaca ctcttatcat catgctc 27
- 45
- <210> 84 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador AtFT 2nd-F
- 55
- <400> 84 gaaaccacct gtttgttcaa ga 22
- <210> 85 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial
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- 65
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- 5
- <210> 86 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> Cebador PhCHS3-1038F
- 10
- <400> 86 gtaacatgtc gagcgcttgc gttcttttca tactcg 36
- 15
- <210> 87 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial
- 20
- <220> <223> Cebador PhCHS3-1073R <400> 87 cgagtatgaa aagaacgcaa gcgctcgaca tgttac 36
Claims (9)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un gen que codifica una flavonoide 3’,5’-hidroxilasa de Commelina communis, que comprende una secuencia aminoacídica representada en la SEC ID Nº 2 o una secuencia aminoacídica que tenga al menos un 90% de homología con la secuencia aminoacídica representada en la SEC ID Nº 2.
-
- 2.
- Un vector que contiene el gen que se define en la Reivindicación 1.
-
- 3.
- Un procedimiento para producir una planta con el color de las flores cambiado, que comprende transfectar una orquídea mariposa roja con el gen que se define en la Reivindicación 1 y la expresión del gen.
-
- 4.
- Un procedimiento para producir una planta de la familia de las Orquídeas que tiene una flor azul, que comprende transfectar una planta de la familia de las Orquídeas que tiene una flor blanca con el gen que se define en la Reivindicación 1; un gen que codifica una dihidroflavonol 4-reductasa de Torenia o Gerbera; un gen que codifica una flavanona 3-hidroxilasa; y un gen que codifica una antocianidin sintasa y la expresión de los genes.
-
- 5.
- El procedimiento para producir una planta de la familia de las Orquídeas que tiene una flor azul de acuerdo con la Reivindicación 4, en la que la planta de la familia de las Orquídeas es una orquídea mariposa o un cymbidium.
-
- 6.
- Una planta de la familia de las Orquídeas con el color de las flores cambiado que tiene el gen que se define en la Reivindicación 1.
-
- 7.
- La planta de la familia de las Orquídeas de acuerdo con la Reivindicación 6, que es una orquídea mariposa o un cymbidium.
-
- 8.
- La planta de la familia de las Orquídeas con el color de las flores cambiado de acuerdo con la Reivindicación 7, que se ha transfectado con un gen que codifica una dihidroflavonol 4-reductasa de Torenia o Gerbera.
-
- 9.
- La planta de la familia de las Orquídeas de acuerdo con la Reivindicación 8, teniendo dicha planta una flor azul y que además se ha transfectado con un gen que codifica una flavanona 3-hidroxilasa derivado de una orquídea mariposa y un gen que codifica una antocianidin sintasa derivada de una orquídea mariposa, Torenia o Gerbera.
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