ES2461520T3 - Modulador de receptores de andrógenos y sus usos - Google Patents

Abstract

Un compuesto que es el éster isopropílico del ácido [(S)-7-ciano-4-((2R,3S)-3-hidroxitetrahidrofuran-2-ilmetil)-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-il]carbámico.

Description

Modulador de receptores de androgenos y sus usos.

La presente invencion pertenece al campo de los moduladores de receptores de androgenos para uso terapeutico.

Los androgenos esteroides endogenos (esto es, testosterona y 5a-dihidrotestosterona (DHT)) son las hormonas de sexo circulantes principales y desempefan un papel en la regulacion de diversos procesos fisiologicos. Entre los efectos anabolicos (por ejemplo, construccion de tejidos) de los androgenos figuran el aumento y fortalecimiento de la masa muscular y el aumento de la masa y densidad osea, mientras que entre los efectos androgenos (por ejemplo, masculinizacion) figuran el desarrollo de tejidos reproductores internos (por ejemplo, prostata y vesiculas seminales), los genitales externos, las configuraciones del crecimiento del peso en hombres y la libido. Clinicamente se ha usado la terapia de sustitucion de androgenos en el tratamiento de diversas afecciones y trastornos, incluidos hipogonadismo masculino, osteoporosis, enfermedades de agotamiento muscular y disfuncion sexual o erectil.

Sin embargo, la terapia con androgenos esteroides tiene limitaciones. Por ejemplo, se ha encontrado que las preparaciones de androgenos esteroides adolecen de una degradacion rapida en el higado que conduce a una mala biodisponibilidad oral y poca duracion de la actividad tras administracion parenteral, variaciones en niveles de plasma, hepatotoxicidad o reactividad cruzada con otros receptores de hormonas esteroides (por ejemplo, receptor de glucocorticoide (GR), el receptor de mineralocorticoide (MR) o el receptor de progesterona (PR)). Ademas, con la terapia de androgenos esteroides estan asociados efectos secundarios no deseados, incluida la estimulacion de la prostata y vesiculas seminales, la estimulacion de tumores de prostata y subidas del antigeno prostatico especifico (PSA), y el riesgo de hirsutismo y virilizacion en mujeres.

Asi, sigue habiendo una necesidad en la tecnica de alternativas a la terapia con androgenos esteroides. En particular, sigue habiendo necesidad de ligandos de receptores de androgenos no esteroides (AR) que posean actividad agonista de androgenos. Mas en particular, sigue habiendo necesidad de agonistas de AR no esteroides que se unan a AR con una afinidad mayor en comparacion con los otros receptores de hormonas esteroides. Mas en particular, sigue habiendo necesidad de moduladores de receptores de androgenos selectivos de tejido (SARM) que presenten actividad agonista de androgenos en tejidos anabolicos tales como musculo o hueso, pero solo actividad agonista parcial, actividad antagonista parcial o actividad antagonista en tejidos androgenos tales como prostata o vesicula seminal.

La solicitud de patente internacional publicada WO 2008/063867 y la solicitud de patente internacional en tramitacion con la presente PCT/US2009/043875 desvelan, cada una de ellas, una serie de compuestos de ciclopenta[b]indol utiles como moduladores de receptores de androgenos. Todavia sigue habiendo necesidad de mas compuestos de ciclopenta[b]indol con una potencia mejorada y/o caracteristicas farmacocineticas mejores tales como exposicion o biodisponibilidad.

La presente invencion esta dirigida a un compuesto ciclopenta[b]indol, definido por la siguiente formula (I) que tiene perfiles de actividad particular en un ensayo in vitro y in vivo, que sugiere que es util en el tratamiento de trastornos que responden a una terapia de androgenos esteroides. Asi, la presente invencion proporciona un compuesto de formula (I):

Formula (I)

ester isopropilico del acido ([(S)-7-ciano-4-((2R, 3S)-3-hidroxitetrahidrofuran-2-ilmetil)-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-il]-carbamico).

La presente invencion se refiere a un procedimiento para tratar o prevenir el hipogonadismo, la osteoporosis, osteopenia, sarcopenia, caquexia, atrofia muscular, disfuncion sexual o la disfuncion erectil que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz del compuesto de formula (I). En un aspecto particular, la presente invencion proporciona un procedimiento para tratar o prevenir la osteoporosis, la osteopenia, la atrofia muscular, o la disfuncion erectil, que comprende la administracion a un paciente que lo necesita de una cantidad eficaz del compuesto de formula (I). En otro aspecto particular, la presente invencion proporciona un procedimiento para tratar o prevenir la atrofia muscular asociada con la falta de uso, trauma, inmovilizacion, la lesion de la medula espinal o accidente cerebral vascular que comprende la administracion a un paciente que lo necesita de una cantidad eficaz del compuesto de formula (I). Aun mas en particular, la presente invencion proporciona un procedimiento para tratar o prevenir la atrofia muscular asociada con sustitucion de cadera o rodilla, fractura de cadera, lesion de la medula espinal o accidente cerebral vascular que comprende la administracion a un paciente que lo necesita de una cantidad eficaz del compuesto de formula (I).

Ademas, la presente invencion proporciona el compuesto de formula (I) para uso en el tratamiento o la prevencion de hipogonadismo, osteoporosis, osteopenia, sarcopenia, caquexia, atrofia muscular, disfuncion sexual o disfuncion erectil. Mas en particular, la invencion proporciona el compuesto de formula (I) para uso en el tratamiento o la prevencion de osteoporosis, osteopenia, atrofia muscular o disfuncion erectil. En otro aspecto particular, la presente invencion proporciona el compuesto de formula (I) para uso en el tratamiento o la prevencion de atrofia muscular asociada con falta de uso, trauma, inmovilizacion, lesion de la medula espinal o accidente cerebral vascular. Aun mas en particular, la presente invencion proporciona el compuesto de formula (I) para tratar o prevenir la atrofia muscular asociada con sustitucion de cadera o rodilla, fractura de cadera, lesion de la medula espinal o accidente cerebral vascular. Ademas, la presente invencion proporciona el compuesto de formula (I) para uso en terapia.

En otra realizacion, la presente invencion proporciona el compuesto de formula (I) para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion de hipogonadismo, osteoporosis, osteopenia, sarcopenia, caquexia, atrofia muscular, disfuncion sexual o disfuncion erectil. Mas en particular, la presente invencion proporciona el compuesto de formula (I) para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion de osteoporosis, osteopenia, atrofia muscular o disfuncion erectil. En otro aspecto particular, la presente invencion proporciona el compuesto de formula (I) para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion de atrofia muscular asociada con falta de uso, trauma, inmovilizacion, lesion de la medula espinal o accidente cerebral vascular. Aun mas en particular, la presente invencion proporciona el compuesto de formula (I) para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion de la atrofia muscular asociada con sustitucion de cadera o rodilla, fractura de cadera, lesion de la medula espinal o accidente cerebral vascular.

La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de formula

(I)

en combinacion con uno o varios vehiculos, diluyentes o excipientes farmaceuticamente aceptables para el tratamiento o la prevencion de hipogonadismo, osteoporosis, osteopenia, sarcopenia, caquexia, atrofia muscular, disfuncion sexual o disfuncion erectil, que comprende el compuesto de formula (I) en combinacion con uno o varios vehiculos, diluyentes a excipientes farmaceuticamente aceptables. Mas en particular, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para el tratamiento o la prevencion de osteoporosis, osteopenia, sarcopenia, caquexia, atrofia muscular, disfuncion sexual o disfuncion erectil, que comprende el compuesto de formula (I) en combinacion con uno o varios vehiculos, diluyentes a excipientes farmaceuticamente aceptables. Mas en particular, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para el tratamiento o la prevencion de atrofia muscular asociada con falta de uso, trauma, inmovilizacion, lesion de la medula espinal o accidente cerebral vascular que comprende el compuesto de formula (I) en combinacion con uno o varios vehiculos, diluyentes a excipientes farmaceuticamente aceptables. Aun mas en particular, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para el tratamiento o la prevencion de la atrofia muscular asociada con sustitucion de cadera o rodilla, fractura de cadera, lesion de la medula espinal o accidente cerebrovascular, que comprende el compuesto de formula (I) en combinacion con uno o varios vehiculos, diluyentes a excipientes farmaceuticamente aceptables. En otra realizacion mas, la composicion farmaceutica de la presente invencion comprende ademas uno

o varios agentes terapeuticos adicionales.

La presente invencion tambien abarca intermedios y procedimientos utiles para la sintesis del compuesto de formula (I).

El compuesto de formula (I) y los intermedios relacionados con ellos tienen centros quirales y se consideran aqui las configuraciones estereoisomeras. Los terminos "R" y "S" se usan aqui como se usan comunmente en quimica organica para denotar configuraciones especificas de un centro quiral. Los terminos "(:)" o "RS" se refieren a una configuracion de un centro quiral que comprende un racemato. La obra Nomenclature of Organic Compounds: Priciples and Practice J.H. Fletcher y otros, eds., 1974) contiene una lista parcial de prioridades y una discusion de estereoquimica. Los estereoisomeros y enantiomeros especificos pueden prepararlos expertos en la tecnica de cualificacion normal usando tecnicas y procedimientos bien conocidos. Por ejemplo, se pueden preparar estereoisomeros y enantiomeros especificos por sintesis estereoespecificas usando materiales de partida enantiomericamente y geometricamente puros, o enantimerica y geometricamente enriquecidos. Ademas, se pueden resolver y recuperar estereoisomeros y enantiomeros especificos por tecnicas tales como cromatografia sobre fases quirales estacionarias, resolucion enzimatica, recristalizacion fraccionada de sales de adicion. Asi como las tecnicas proporcionadas en los Esquemas, Preparaciones y Ejemplos de esta memoria. Ademas, el compuesto de la presente invencion puede existir como solvato. Asi, el compuesto de formula (I) incluye en su significado cualquier solvato del compuesto.

La designacion

se refiere a un enlace que sobresale hacia adelante del plano de la pagina. La designacion

se refiere a un enlace que sobresale hacia atras del plano de la pagina. La designacion

se refiere a un enlace que existe como mezcla de enlaces que sobresalen hacia adelante y hacia atras del plano de la pagina.

Se han usado clinicamente o preclinicamente agonistas de receptores de androgenos y androgenos no esteroides en una variedad de aplicaciones terapeuticas, por lo que los procedimientos para el tratamiento o la prevencion de sintomas, afecciones o trastornos que responden al agonismo de receptores de androgenos estan relacionados con la presente invencion. El compuesto de la presente invencion puede administrarse o usarse en un medicamento solo o en combinacion con otros agentes terapeuticos convencionales usados para tratar un sintoma particular, una afeccion o un trastorno. Cuando los compuestos de la presente invencion se usan como parte de una combinacion, los compuestos de formula (I) se pueden administrar separadamente o como parte de una formulacion que comprende el agente terapeutico con el que debe combinarse.

Un procedimiento particular en el que se cree que el compuesto de la presente invencion es util, es en el tratamiento o la prevencion de las afecciones de debilitacion muscular o atrofia muscular. La debilitacion muscular puede producirse como resultado natural del envejecimiento (por ejemplo, despues de sustitucion de la cadera o rodilla o fractura de cadera), trauma, inmovilizacion (por ejemplo, entablillado o escayolado del brazo), asi como lesion de la medula espinal o accidente cerebral vascular. (Vease Hafer-Macko y otros, J. Rehab. Res. Develop. 45(2): 261-272 (2008)). Asi, tal como se usa aqui, el termino "atrofia muscular asociada con falta de uso, trauma, inmovilizacion, lesion de la medula espinal o accidente cerebral vascular" se refiere a atrofia muscular que se presenta como consecuencia secundaria de la incidencia de la falta de uso o inactividad (por ejemplo, despues de sustitucion de la cadera o rodilla o fractura de cadera), trauma, inmovilizacion (por ejemplo, entablillado o escayolado del brazo), lesion de la medula espinal o accidente cerebral vascular. Ademas, en el contexto de lesion de la medula espinal o accidente cerebral vascular, el compuesto de la presente invencion se puede usar como coadyuvante a la terapia estandar de rehabilitacion (por ejemplo, terapia fisica u ocupacional), ejercicio, paseos asistidos y/o entrenamiento para resistencia).

Otro procedimiento particular en el que se cree que el compuesto de la presente invencion es util es en el tratamiento o la prevencion de la disfuncion erectil. Entre los agentes convencionales para el tratamiento de la disfuncion erectil figuran los inhibidores de fosfodiesterasa de tipo 5 (PDE5) tadalafil (Cialis® o Cialis® para uso diario), citrato de sildenafil (Viagra®) e hidrocloruro de vardenafil (Levitra®). Asi, la presente invencion proporciona tambien un procedimiento de tratamiento o prevencion de la disfuncion erectil que comprende la administracion a un paciente que lo necesita de una cantidad eficaz del compuesto de formula (I) en combinacion con un agente seleccionado entre el grupo constituido por tadalafil, citrato de sildenafil e hidrocloruro de vardenafil. Mas en particular, la presente invencion prporciona un procedimiento para tratar o prevenir la disfuncion erectil que comprende administrar a un paciente que lo necesita el compuesto de formula (I) en combinacion con un agente seleccionado entre el grupo constituido por Cialis®, Cialis® para uso diario, Viagra® y Levitra®. Ademas, la presente invencion tambien proporciona el compuesto de formula (I) para uso en combinacion con un agente seleccionado entre el grupo constituido por tadalafil, citrato de sildenafil e hidrocloruro de vardenafil en el tratamiento de la disfuncion erectil. Mas en particular, la presente invencion proporciona el compuesto de formula (I) para uso con un agente seleccionado entre el grupo constituido por Cialis®, Cialis® para uso diario, Viagra® y Levitra® en el tratamiento de la disfuncion erectil.

El compuesto de la presente invencion se puede formular como parte de una composicion farmaceutica. Como tal, una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de formula (I) en combinacion con uno o varios vehiculos, diluyentes o excipientes farmaceuticamente aceptables es un aspecto importante de la presente invencion. Como otro aspecto, la presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de formula (I), composicion farmaceutica que comprende uno o varios agentes terapeuticos adicionales. En particular, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende: (a) el compuesto de formula (I); (b) un agente terapeutico seleccionado entre el grupo constituido por tadalafil, citrato de sildenafil e hidrocloruro de vardenafil, y (c) un vehiculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable. Mas en particular, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende: (a) el compuesto de formula (I) con un agente seleccionado entre el grupo constituido por Cialis®, Cialis® para uso diario, Viagra® y Levitra® en el tratamiento de la disfuncion erectil. Los ejemplos de composiciones farmaceuticas y los procedimientos para su preparacion son bien conocidos en la tecnica.

Tal como se usa aqui, el termino "paciente" se refiere a un mamifero humano o no humano, y preferiblemente se refiere a un ser humano. El termino "tratar" (o "tratar" o "tratamiento") tal como se usa aqui se refiere a prohibir, restringir, ralentizar, parar o revertir la progresion o gravedad de un sintoma, una afeccion o un trastorno existente. El termino "prevenir" (o "prevenir" o "prevencion") tal como se usa aqui se refiere a prohibir, restringir o inhibir la incidencia o presencia de un sintoma, una afeccion o trastorno. Los sintomas, afecciones o trastornos pueden estar presentes como acontecimientos "agudos" o "cronicos". En un acontecimiento agudo, el compuesto se administra a la aparicion del sintoma, la afeccion o el trastorno, y se interrumpe la administracion cuando desaparece el acontecimiento, mientras que un sintoma, una afeccion o un trastorno critico se trata en el transcurso del acontecimiento. La presente invencion contempla el tratamiento agudo y el cronico.

Tal como se usa aqui, "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad o la dosis del compuesto de formula (I) que, despues de la administracion de una o multiples dosis al paciente, proporciona el efecto deseado en el paciente diagnosticado o en tratamiento. Se puede determinar una cantidad eficaz facilmente atendiendo a quien ha diagnosticado, un experto en la tecnica, considerando varios factores tales como la especie de mamifero, su tamafo, edad y estado general de salud la enfermedad especifica implicada, el grado de gravedad de la enfermedad, la respuesta del paciente individual; el compuesto particular a administrar, el modo de administracion, las caracteristicas de biodisponibilidad de la preparacion a administrar, el regimen de dosificacion y el uso de cualesquiera medicaciones concomitantes. El compuesto de formula (I), o una composicion que comprende el compuesto de formula (I) se puede administrar por cualquier via que haga biodisponible el compuesto, incluidas las vias oral y parenteral (por ejemplo, subcutanea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o transdermica).

Determinacion de la actividad biologica

Como lo evidencian los ensayos in vitro y in vivo, el compuesto de formula (I) tiene un perfil de actividad que sugiere que tiene utilidad en el tratamiento de sintomas, afecciones o trastornos que responden a la terapia de androgenos esteroides. En particular, el compuesto de formula (I) es un potente agonista de AR que se une a AR en comparacion con cada uno de MR, GR y PR.

Tal como se usa aqui, "Kd" se refiere a la constante de disociacion en equilibrio para un complejo de ligandoreceptor; "Ki" se refiere a la constante de disociacion en equilibrio para un complejo de farmaco-receptor, y es una indicacion de la concentracion de farmaco que se unira a la mitad de los sitios de union en el equilibrio; "Kb" se refiere a la constante de disociacion en equilibrio para un complejo de antagonista-receptor; "CI50" se refiere a la concentracion de un agente que produce el 50% de la respuesta inhibidora maxima posible para ese agente o, alternativamente, la concentracion de un agente que produce el 50% de desplazamiento de la union de ligando al receptor; "CE50" se refiere a la concentracion de un agente que produce 50% de la respuesta maxima posible para ese agente; "DE50" se refiere a la dosis de un agente terapeutico que produce 50% de la respuesta maxima posible para ese agente; "DS" se refiere a la desviacion estandar; "p.o." representa por boca y se refiere a administracion oral; "s.c". se refiere a administracion subcutanea y "HEC" se refiere a hidroxietilcelulosa.

Ensayo de union del receptor nuclear de hormona esteroide

Se usan lisados de celulas de celulas HEK293 de higado embrionico humano que sobreexpresan MR (receptor de corticoide mineral), GR (receptor de glucocorticoide) AR (receptor de androgeno) o PR (receptor de progesterona) para ensayos de union de competicion de receptor-ligando para determinar los valores de Ki. Los procedimientos tipicos se indican seguidamente.

En resumen, los ensayos de union de competicion de receptor esteroide se realizan en un tampon que contienen tampon HEPES 20 mM (pH = 7,6), EDTA 0,2 mM, NaCl 75 mM, MgCl2 1,5 mM, 20% de glicerol, molibdato sodico 20 mM, DTT 0,2 mM (ditiotreitol), 20 !g de aprotinina y 20 !g/ml de leupeptina (tampon de ensayo). Tipicamente, los ensayos de union de receptor esteroide incluyen ligandos radiomarcados tales como [3H]-aldosterona 0,25 nM para union de MR, [3H]-dexametasona 0,3nM para union de GR, [3H]-metiltrienolona 0,36 nM para union de AR y [3H]metiltrienolona 0,29 nM para union de PR, y 20 !g de lisado de 293-GR, 22 !g de lisado de 293-AR o 40 !g de 293-PR por pocillo. Tipicamente los ensayos se realizan en formato de 96 pocillos. Los compuestos del ensayo de competicion se afaden a diferentes concentraciones que varian de aproximadamente 0,01 nM a 10 !M. La union no especifica se determina en presencia de aldosterona 500 nM para union de MR, dexametasona 500 nM para union de GR, o metiltrienolona 500 nM para union de AR y PR. Las reacciones de union (140 !l) se incuban durante la noche a 4°C, luego se afaden a cada reaccion 70 !l de tampon de carbon vegetal-tampon de dextrano frio (que contiene por 50 ml de tampon de ensayo, 0,75 g de carbon vegetal y 0,25 g de dextrano). Se mezclan las placas durante 8 minutos en un agitador orbital a 4°C. Las placas se centrifugan luego a 3.000 rpm a 4°C durante 10 minutos. Luego se pasa a otra placa de 96 pocillos una parte alicuota de 120 !l y se afaden a casa pocillo 175 !l de fluido de centelleo Wallac Optiphase Hisafe 3MC. Se cierran las placas y se agitan vigorosamente en un agitador orbital. Despues de incubacion durante 2 horas, se leen las placas en un contador Wallac Microbeta.

Se usan los datos para calcular una CI50 estimada e inhibicion porcentual a 10 !M. Se determina por union con saturacion la Kd para [3H]-aldosterona para union de MR, [3H]-dexametasona para union de GR, [3H]-metiltrienolona para unir AR, o [3H] metiltrienolona para unir PR. Los valores de CI50 para los compuestos se convierten en Ki usando la ecuacion de Chang-Prushoff.

Siguiendo un protocolo esencialmente como de ha descrito antes, el compuesto de formula (I) presento en el ensayo de union de AR una Ki de aproximadamente 10 nM. Ademas, el compuesto presento una Ki en los ensayos de union de MR, GR y PR mayor que aproximadamente 4000 nM, mayor que aproximadamente 2000 nM y mayor que aproximadamente 4000 nM respectivamente. Asi, el compuesto de formula (I) es un ligando selectivo de alta afinidad para el receptor de androgenos.

Ensayos funcionales de modulacion del receptor de hormona nuclear esteroide

Los androgenos ejercen sus efectos fisiologicos por interaccion con el receptor de androgeno. Despues de la union citoplasmatica de un androgeno a AR, el complejo de receptor de ligando se transpone al nucleo de la celula donde se une a elementos de respuesta a hormona en el ADN, iniciando la expresion de genes diana. Los efectos de los androgenos se pueden caracterizar como anabolicos o androgenicos por naturaleza. Los efectos anabolicos (esto es, construccion de tejido) de los androgenos incluyen el crecimiento de la masa muscular y la resistencia de la masa osea, mientras que los efectos androgenicos (esto es, masculinizacion) incluyen el desarrollo de caracteristicas sexuales masculinas secundarias tales como los tejidos reproductores internos (esto es, prostata y vesiculas seminales), genitales externos (pene y escroto), libido y las configuraciones de crecimiento de pelo.

Para demostrar la capacidad de los compuestos de la presente invencion para modular la actividad de receptores de hormona esteroide (esto es, agonizar, agonizar parcialmente, antagonizar parcialmente o antagonizar) se realizan bioensayos que detectan la modulacion funcional de la expresion de genes diana en celulas transfectadas transitoriamente con una proteina de receptor nuclear y una construccion de genes informadores de elemento que responde a hormonas. Los disolventes, reactivos y ligandos empleados en el ensayo funcional son facilmente adquiribles de fuentes comerciales, o se pueden preparar por un experto normal en la tecnica. Seguidamente se proporcionan procedimientos tipicos para ensayos funcionales de receptor de hormona nuclear.

A. Exploracion de panel de receptor de hormona nuclear

Se transfectan celulas HEK293 de rifon embrionario humano con receptor de hormona esteroide y plasmidos de gen informador usando un reactivo de transfeccion adecuado tal como FugeneMC. En resumen, el plasmido informador que contiene dos copias de probasina ARE y promotor de TK (timidinaquinasa) corriente arriba del ADNc del informador de luciferasa se transfecta en celulas HEK293 con un plasmido que constitutivamente expresa receptor de androgeno humano (AR) usando promotor de CMV(citomegalovirus) viral. El plasmido de promotor que contiene dos copias del promotor de GRE y TK corriente arriba del ADNc de promotor de luciferasa se transfecta con un plasmido que constitutivamente expresa receptor de glucocorticoide (GR) humano, receptor de mineralcorticoide (MR) humano o receptor de progesterona (PR) humana usando promotor CMV viral. Las celulas se transfectan en matraces T de 150 cm en medio DMEM con suero fetal bovino (FBS) apurado con 5% de carbon vegetal. Despues de incubacion durante la noche, se tripsinizan las celulas transfectadas, se cultivan en placas de 96 pocillos en medio DMEM que contiene FBS apurado con carbon vegetal, se incuban durante 4 horas y luego se exponen a varias concentraciones de los compuestos de ensayo, que varian de aproximadamente de 0,01 nM a 10 !M. Al modo antagonista de ensayo, las concentraciones bajas de agonista para cada respectivo receptor se afaden al medio (aldosterona 0,08 nM para MR, dexametasona 0,25 nM para GR, metiltrienolona 0,66 nM para AR y 0,06 nM de progestona para PR). Despues de 24 horas de incubacion con los compuestos de ensayo, se lisan las celulas y se determina la actividad de liciferasa usando tecnicas estandar.

Los datos se ajustan a una curva logistica de ajuste de cuatro parametros para determinar los valores de CE50. La eficacia porcentual (compuestos con respuestas maximas saturadas) o la estimulacion maxima porcentual (compuestos con respuestas maximas que no saturan) se determinan en relacion a la estimulacion maxima obtenida con los siguientes agonistas de referencia: aldosterona 30 nM para el ensayo de MR, metiltrienolona 100 nM para el ensayo de AR, promegestona 30 nM para el ensayo de PR y con dexametasona 100 nM para el ensayo de GR. Se determinan analogamente los valores de CI50 usando los datos del ensayo al modo antagonista. Al modo antagonista, el porcentaje de inhibidores se determina por comparacion de la actividad del compuesto de ensayo en presencia de una concentracion baja de agonista (aldosterona 0,08 nM para MR, dexametasona 0,25 nM para GR, metiltrienolona 0,66 nM para AR, y promegestona 0,08 nM para PR) a la respuesta producida por la misma concentracion baja de agonista en ausencia del compuesto de ensayo.

B.�Esaa�o�di�isformador�CAC2AARlARE

Como indicador de la actividad agonista de tejido muscular es realiza el ensayo de informador C2C12 AR/ARE. En resumen celulas C2C12 de mioblasto de raton se cotransfectan usando el reactivo FugeneMC. Un plasmido de informador que contiene GRE/ARE (elemento de respuesta de glucocorticoide/elemento de respuesta de androgeno) y promotor de TK corriente arriba del ADNc de informador de luciferasa, se transfecta con un plasmido que constitutivamente expresa receptor de androgeno (AR) humano usando un promotor CMV viral. Las celulas se transfectan en matraces T de 150 cm2 en medio DMEM con suero fetal bovino (FBS) purificado con 4% de carbon vegetal. Despues de incubacion durante 5 horas, se tripsinizan las celulas transfectadas en placas de 96 pocillos en medio DMEM que contiene FBS purificado con 4% de carbon vegetal, se incuban durante 2 horas y se exponen a varias concentraciones (que varian de aproximadamente de 0,01 nM a 10 !M) de compuestos de ensayo. Despues de incubaciones durante 24 horas con los compuestos, se lisan las celulas y se determina la actividad de liciferasa por tecnicas estandar. Los datos se ajustan a una logistica de ajuste de 4 parametros para determinar los valores de CE50. La eficacia porcentual se determina frente a la estimulacion maxima obtenida con metiltrienolona 10 nM.

Un experto en la tecnica puede disefar facilmente ensayos funcionales de modulacion del receptor de hormona nuclear de hormona esteroide similares a los descritos antes. Siguiendo un protocolo esencialmente como del descrito, el compuesto de formula (I) presento una CE50 en el ensayo de informador C2C12 AR/ARE de aproximadamente 0,2 nM (media geometrica de n = 7; SD de aproximadamente 0,8), lo que demuestra que el compuesto de la presente invencion es un agonista de AR humano.

Modelo in vivo de eficacia y selectividad

Se castran ratas Sprague Dawley de ocho semanas (gonadaectomizadas o "GDX") de acuerdo con procedimientos aprobados y se deja que vegeten durante 8 semanas. Tambien se preparan ratones simuladamente operados emparejados por la edad. Los animales se alojan en una habitacion con temperatura controlada (24°C) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas que se invierte, y tienen disponible al libitum agua y alimento.

Los animales se distribuyeron aleatoriamente atendiendo al peso corporal antes de adscribirlos a un lote de ensayo. Se administra diariamente compuesto de ensayo en un vehiculo o el vehiculo solo por inyeccion subcutanea a las ratas castradas de 16 semanas de edad (peso corporal de aproximadamente 380-400 g). usando un vehiculo convencional tal como 5% de DMSO/95% de aceite de soja, Se usan ratas operadas simuladamente tratadas con vehiculo solo como controles positivos de tratamiento, mientras que las ratas castradas tratadas con vehiculo solo se usan como control negativo de tratamiento. Para comparacion se trata con testosterona una cohorte separada de animales castrados.

Se administra diariamente a los animales de ensayo durante un periodo de dos a ocho semanas 0,1, 0,3 o 1,0 mg/kg por dia del compuesto de la presente invencion o semanalmente 10 mg/kg por semana de testosterona (vehiculo de aceite de sesamo). Despues del periodo de tratamiento se sacrifican los animales y se determinan el peso humedo del musculo levator ani (LA), la prostata y el musculo bulbocavernoso de cada animal (despues de pesar, el musculo bulbocavernoso se puede congelar en nitrogeno liquido para uso posterior en la medicion de ARNm de sintasa de oxido nitrico neuronal, como se describe mas adelante). Luego se normalizan los pesos humedos dividiendo cada peso humedo por el peso del correspondiente animal final del estudio. Luego se comparan los valores normalizados de los animales del tratamiento con los valores normalizados del grupo de control castrados con vehiculo solo, o el grupo operado simuladamente. Como indicador de la actividad selectiva de tejido, se puede comparar similarmente el peso de la prostata humeda de estos animales con el peso de la prostata humeda de los grupos de control o el grupo de comparacion tratado con testosterona.

Siguiendo un protocolo esencialmente como el descrito antes, usando un periodo de tratamiento de dos semanas, se estudio el compuesto de formula (I) obteniendose los resultados siguientes: El grupo operado simuladamente (vehiculo solo) presento un valor del peso en humedo de LA normalizado medio (n = 8) de aproximadamente 0,72, un valor normalizado medio de la prostata humeda de aproximadamente 1,5 y un valor normalizado medio del bulbocavernoso humedo de aproximadamente 2,15; los animales castrados/vehiculo solo presentaron un valor normalizado medio (n = 6) del peso en humedo de LA de aproximadamente 0,18, un valor normalizado medio de la prostata humeda de aproximadamente 0,04, y un valor normalizado medio del bulbocavernoso humedo de aproximadamente 0,77; el grupo de estudio de 0,3 mg/kg por dia presento un valor normalizado medio (n = 6) de peso humedo de LA de aproximadamente 0,57, un valor normalizado medio de peso humedo de prostata de aproximadamente 0,14 y un valor normalizado medio de peso humedo del bulbocavernoso de aproximadamente 1,29; y el grupo de estudio de 1,0 mg/kg por dia presento un valor normalizado medio (n = 6) de peso humedo de LA de aproximadamente 0,68, un valor normalizado medio de peso humedo de prostata de aproximadamente 0,52 y un valor normalizado medio de peso humedo del musculo bulbocavernoso de aproximadamente 1,41.

Asi, el tratamiento con el compuesto de formula (I) produjo un aumento dependiente de la dosis de los pesos del levatur ani y del musculo bulbocavernoso en comparacion con el grupo de control castrado, demostrando que el compuesto de la invencion es un potente agonista de androgeno in vivo. Ademas, el compuesto de formula (I) revelo eficacia en el musculo mientras que concomitantamente producia un efecto aminorado sobre el peso de la prostata cuando se comparo con el control de animales operados simuladamente y los animales tratados con testosterona, lo que demuestra que el compuesto de la presente invencion tiene selectividad tisular.

Ensayo in vitro de la actividad erectil

La via de paso de oxido nitrico sintasa/monofosfato de guanosina ciclico (NOS/GMPc) es critica para la actividad erectil. La expresion de NOS conduce a la generacion de oxido nitrico (NO) que, a su vez, promueve la generacion de GMPc por activacion de guanililciclasa. GMPc promueve la actividad de proteinquinasa G (PKG) que media la relajacion de musculo liso corporal facilitando la ereccion del pene. La evidencia soporta el papel de los androgenos en la regulacion de la expresion y actividad de los isoformos de NOS en el cuerpo cavernoso en modelos experimentales de animales. Traish y otros, European Urology, 52; 54-70 (2007). Asi, los moduladores de receptores de androgenos, que son capaces de aumentar la expresion de isomorfos de NOS, se cree que tienen un papel en la regulacion de la actividad erectil del pene.

Para determinar la capacidad de los compuestos de la presente invencion para regular por hiperproduccion la expresion de isoformos de NOS se pueden emplear los siguientes procedimientos in vitro.

Se aisla ARN de tejidos cavernosos de bulbo o cuerpo congelados, obtenidos por necropsia de ratas Sprague Dawley castradas, que son preparadas y dosificadas esencialmente como se ha descrito para el Modelo de Eficacia y Selectividad. Se sintetiza ADNc a partir de 2 !g de ARN usando un kit de ADNc de alta capacidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se realiza RCP cuantitativa en tiempo real de acuerdo con la metodologia TaqMan® fluorescente (Applied Biosystems), Se usan sondas Assays-on DemandMC (Applied Biosystems) para el transcripto de oxidonitricosintasa endotelial (NOSe) de rata, mientras que se disefan sondas para isomorfo especifico de pene de rata de oxidonitricosintasa neuronal NOSpn) usando software de disefo de sondas (Applied Biosystems). Las sondas se disefan para cubrir una region de 102 bp del gen de oxidonitricosintasa neuronal (NOSpn) que es especifico para NOSpn (posiciones 2865-2967). Las series de sonda de Assays-on-DemanCM para el transcripto de PIB se usan como control interno. Se realiza la RCP en un sistema de deteccion de secuencia 770 ABI Prism en las condiciones de termociclacion siguientes: 2 min a 50°C, 10 min a 96°C y 40 ciclos a 95°C durante 30 s y a 60°C durante 1 min. Todas las reacciones se realizan por triplicado.

Las reducciones de la masa muscular o los fortalecimientos se pueden presentar como resultado de falta de uso, trauma o inmovilizacion. Con el fin de confirmar la capacidad de los compuestos de la presente invencion para tratar

o prevenir la perdida de masa muscular o el fortalecimiento asociado con falta de uso, trauma o inmovolizacion se pueden emplear los siguientes modelos animales.

Modelo in vivo de perdida muscular inducida por trauma e inmovilizacion

Se anestesian con isofluorano (1-5%) ratones macho ICR a la edad de 8 semanas y se inyectan bilateralmente en el musculo gastrocnemico derecho de una pata trasera 100 !l de cardiotoxina 10 !M (naja naja atra; Sigma Aldrich) para inducir lesion muscular focal. Se deja que se recuperen los animales y antes de 24 h se inmoviliza la pata trasera en cuanto a la flexion plantar poniendo en la pata una pieza. Despues de 7 dias de inmovilizacion y despues de quitar la pieza puesta en la pata, los animales se tratan con diferentes dosis de un compuesto de la presente invencion durante diferentes periodos de tiempo. Los animales de control, con y sin las piezas inmoviizadoras, se trana similarmente con vehiculo durante varios periodos. Al final del protocolo de tratamiento, se sacrifican los ratones, se determinan los pesos humedos del musculo gastrocnemius inmovilizado y se comparan los grupos de tratamiento individuales con los controles con vehiculo. Vease en general Am. J. Endocrinol. Metab. 289:969-980 (2005).

Modelo in vivo de perdida muscular inducida por trauma

Se castran a la edad de 8 semanas ratones macho ICR y se deja que vegeten durante 8 semanas mas. Se enjaulan individualmente los ratones y se mantienen a 22°C en un ciclo de 12 h de oscuridad/luz con acceso ad libitum a alimento y agua. Se anestesian los ratones con isofluorano (1-5%) y luego se inyectan bilateralmente en el musculo gastrocnemius derecho 100 !l de cardiotoxina 10 !M (naja naja atra; Sigma Aldrich) para inducir lesion muscular. Los animales se recuperan de la anestesia y asumen en 5 min la actividad normal. Transcurridos 5 dias desde la inyeccion, los animales se tratan con varias dosis de un compuesto de la presente inyeccion. Despues del dia 14, se eutanizan los ratones tratados, se pesan y se cosecha el tejido del musculo gastrocnemius de ambas piernas la no inyectada (control contralateral) y la inyectada con cardiotoxina. Los pesos del musculo se emparejan con el no inyectado y el control no tratado para establecer la recuperacion porcentual del trauma.

Para demostrar que el compuesto de la presente invencion tiene la capacidad de tratar transtornos asociados con la perdida de hueso, como por ejemplo ostoporosis u ostopenia, se pueden emplear otros modelos de animales bien conocidos por los expertos en la tecnica. Ejemplos de dichos modelos son proporcionados por Y. L. Ma y otros, Japanese Journal of Bone y Mineral Metabolism 23 (Suppl.): 62-68 (2005); Y. L. Ma y otros, Endocrinology 144: 2008-2015 (2003); y K. Hanada y otros, Biol. Pharm. Bull. 26(11): 1563-1569 (2003). Se hace mencion particular a Female Rat Model of Estrogen Deficency Osteopenia Induced by Ovariectomy y Male Rat Model of Androgen Deficency Osteopenia Induced by Orchidectomy.

Modelo de osteopenia de deficiencia de estrogeno inducida por ovarioectomia

Ratas hembra Sprague Dawley virgenes de seis meses de edad, de un peso de aproximadamente 220 g se alojan con acceso ad libitum a alimento y agua. Se realizan ovarioectomias bilaterales (Ovx) en los animales (excepto de los controles simuladamente operados) y luego se distribuyen en grupos de tratamiento de 7-8 ratas por grupo. Cada ensayo contiene tipicamente como minimo seis conjuntos de controles, incluidas ovarioectomia simulada y controles ovariorectomizados (Ovx) tratados con vehiculo. Se permite una perdida osea en las ratas Ovx durante 1 mes para establecer osteopenia antes del tratamiento con compuesto de ensayo. Los compuestos de ensayo se administran oralmente a los animales Ovx con sonda gastrica durante 8 semanas. Como control positivo se puede dar a un subconjunto de animales Ovx PTH recombinante humano (1-38) (aproximadamente 10 !g/kg/d, subcutaneamente). Finalizado el protocolo de ensayo se usa tomografia cuantitativa computada (OCT) para analizar la densidad osea mineral volumetrica (BDM, cm3) de la vertebra lumbar L-5 y el femur. Se realizan analisis biomecanicos de flexion en tres puntos en la diafisis femoral y la carga a rotura en el femur proximal usando una maquina de ensayos mecanicos, analizando los resultados usando software TestWorks 4®.

Modelo de osteopenia de deficiencia de androgenos inducida por orquidectomia

Ratas macho Sprague Dawley de seis meses de edad, de un peso de aproximadamente 485 g se alojan con acceso ad libitum a alimento y agua. Se realiza orquidectomia bilateral (Orx) en los animales (excepto para los controles simuladamente operados) y luego se distribuyen en grupos de tratamiento de 7-8 ratas por grupo. Cada ensayo contiene tipicamente como minimo dos conjuntos de controles, incluidos animales orquidectomizados simuladamente y controles orquidectomizados (Orx) tratados con vehiculo. Se permite una perdida osea en las ratas Ovx durante 2 meses para establecer osteopenia antes de iniciar el tratamiento con compuesto de ensayo. Los compuestos de ensayo se administran oralmente a los animales Orx con sonda gastrica durante 8 semanas. Como control positivo se puede dar a un subconjunto de animales Orx PTH recombinante humano (1-38) (aproximadamente 10 !g/kg/d, subcutaneamente). Finalizado el protocolo de ensayo, la determinacion de la BMD de la vertebra y el femur asi como los ensayos biomecanicos del femur se puede realizar como se ha indicado antes para el modelo de rata hembra ovarioectomizada.

(Vease en general Ma y otros, JBMR 17:2256-2264 (2002), y Turner y otros, Bone [Review] 14:595-608 (1993)).

Determinacion de exposicion de plasma

Se administran las dosis a grupos de ratas macho Sprague Dawley (6 animales/grupo), oralmente (volumen de la dosis 1,25 ml/kg: vehiculo de 5% de DMSO/95% de HEC), o subcutaneamente (volumen de la dosis: 2,5 ml/kg: vehiculo de 5% de DMSO/95% de aceite de soja) 10 mg/kg p.o., 1 mg/kg s.c., 3 mg/kg s.c o 10 mg/kg s.c., del compuesto de formula (I), una vez al dia durante dos semanas. Empezando el segundo dia hasta el ultimo de administracion de las dosis, se recogen muestras de plasma a las 0,5 horas, 2 horas, 4 horas o 24 horas despues de la administracion [en cada momento se muestrean dos animales, usandose los mismos animales para el muestreo a las 0,5 y 24 horas]. Para cada muestra recogida se determina la concentracion en plasma del compuesto de formula (I) usando LC/MS/MS (sistema Sciex API-4000 LC/MS/MS). Las concentraciones resultantes se usan para construir un area bajo la curva tiempo -concentracion en plasma (AUC) para cada dosis administrada como indice de exposicion. Siguiendo un protocolo esencialmente como se ha descrito antes, las dosis administradas del compuesto de formula (I) produjeron los siguientes valores de AUC: 10 mg/kg p.o.: aprox. 295,511 ng.h/ml; 1 mg/kg s.c: aprox. 38,963 ng.h/ml; 3 mg/kg s.c.; aprox. 137,056 ng.h/ml; y 10 mg/kg s.c: aprox. 218,537 ng.h/ml. Asi, el compuesto de formula (I), cuando se administra oralmente o subcutaneamente, presenta una significativa exposicion del plasma.

Los Esquemas, Preparaciones y Ejemplos siguientes ilustran mas la invencion. Los materiales y materiales de partida son facilmente asequibles o los puede sintetizar facilmente un experto corriente en la tecnica. Debe entenderse que los esquemas, las preparaciones y los ejemplos se presentan a fines ilustrativos y no limitativos, y que se pueden hacer diversas modificaciones por parte de un experto en la tecnica de cualificacion normal. Las configuracion R o S de las preparaciones y ejemplos se pueden determinar por tecnicas estandar tales como analisis por rayos X y la correlacion con el tiempo de retencion de HPLC quiral. A no ser que se indique lo contrario, los nombres de las preparaciones y ejemplos son generalmente proporcionados por Autonom 2000 para SIS Draw add-in. Tal como se usan aqui, los siguientes terminos tienen los significados que se indican: "MeOH" se refiere a metanol; "EtOH" se refiere a etanol; "i-PrOH" o "IPA" se refiere a isopropanol; "EtOAc" se refiere a acetato de etilo; "DMAC" se refiere a dimetilacetamida; "THF" es refiere a tetrahidrofurano; "t-boc" o "boc" se refiere a tbutoxicarbonilo.

Eaquima2

La formacion de un intermedio de formula (7) se puede realizar de acuerdo con las reacciones indicadas en el Esquema 1.

En el Esquema 1, Etapa A, se hace reaccionar ciclopentenona con ftalimida en una adicion de Michael obteniendose (R,S)-2-(3-oxo-ciclopentil)-isoindol-1,3-diona (1). La reaccion se realiza en metanol/Na2CO3 2N en una relacion de aproximadamente 10/1 en volumen, preferiblemente a temperatura ambiente usando condiciones similares a las descritas por O. Nowitzki y otros en Tetrahedron 1996, 52, 11799-11810. El producto se aisla por adicion de agua y se obtiene (1) como un solido blanco.

En la Etapa B, se hace reaccionar (R,S)-2-(3-oxo-ciclopentil)-isoindol-1,3-diona (1) con hidrocloruro de 4bromofenilhidrazina en hidrato de hidrazina en una sintesis de Fischer tipica. En las condiciones preferidas se usa acido acetico glacial a aproximadamente 50-80°C durante 2 a 24 horas.

En el Esquema 1, Etapa C, el grupo ftalimida de tetrahidrociclopente[b]indol de formula (2) se escinde con hidrazina o hidrato de hidrazina obteniendose el aminotetrahidrociclopenta[b]indol de formula (3). Las condiciones preferidas usan tetrahidrofurano/etanol en una mezcla de aproximadamente 20/1 en volumen a una temperatura de aproximadamente 40 a 70°C durante 1 a 12 horas. La ftalhidrazida resultante se separa por filtracion y el producto se aisla por concentracion del filtrado.

En la Etapa D, se protege la amina de formula (3) con un grupo t-boc, obteniendose la amina protegida de formula (4). Las condiciones preferidas usan di-t-butildicarbonato en un disolvente inerte tal como THF o dioxano, en presencia de una base inorganica tal como NaHCO3. En la Etapa E, el material de t-boc racemico de formula (4) se resuelve usando HPLC quiral obteniendose el enantiomero (S) de formula (5).

En la Etapa F, el (S) bromocarbamato de formula (5) se convierte en el nitrilo de formula (6). La reaccion transcurre en un disolvente inerte tal como N,N'-dimetilacetamida en presencia de una mezcla de acetato de zinc o formiato de zinc, cianuro de zinc y polvo de zinc. Se usa un catalizador de paladio tal como [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio(II) o como complejo con diclorometano. Alternativamente, el catalizador se puede formar in situ usando paladio metal y el ligando apropiado. Se calienta la mezcla de reaccion a aproximadamente 80 a 120°C durante aproximadamente de 2 a 24 horas.

En la Etapa G, el grupo de boc se elimina usando condiciones acidas tipicas tales como HCl/dioxano o TFA, obteniendose la amina quiral, que luego se acila con cloroformiato de isopropilo, resultando un carbamato de formula (7) usando condiciones bien conocidas por los expertos en la tecnica. La amina se combina con un exceso de una base amina organica tal como trietilamina o diisopropiletilamina en un disolvente inerte tal como tetrahidrofurano, tolueno, dicloroetano o diclorometano, N-metilpirrolidinona o N,N'-dimetilformamida, o una mezcla de los mismos. En las condiciones preferidas se usa diisopropiletilamina en diclorometano en presencia de cloroformiato de isopropilo a una temperatura de aproximadamente 0 a 40°C durante aproximadamente 72 horas. El producto se aisla por adicion de agua y recogida del solido resultante.

EaquimaA

En el Esquema 2 se presenta una via alternativa para la sintesis de un intermedio de formula (7),

En el Esquema 2, Etapa A, el grupo ftalimida del tetrahidrociclopenta[b]indol de formula (2) se escinde con

5 metilamina, obteniendose un aminotetrahidrociclopenta[b]indol de formula (3). Las condiciones preferidas usan un disolvente tal como etanol a una temperatura de aproximadamente 0 a 35°C, durante 3 a 24 horas. El subproducto resultante se elimina alcalinizando el pH y filtrando el precipitado resultante. El producto se aisla del filtrado por precipitacion con agua y NaOH al 10%.

En la Etapa B, el aminotetrahidrociclopenta[b]indol racemico de formula (3) se resuelve usando acido (R)-2-hidroxi

10 3-fenilpropionico, obteniendose la sal de (S)-aminotetrahidrociclopenta[b]indol de formula (8). La formacion de la sal preferiblemente se realiza en isopropanol con calentamiento durante aproximadamente 1 a 6 horas, a lo que sigue el enfriamiento para obtener el enantiomero deseado.

En la Etapa C, la sal de formula (8) se neutraliza a base libre y luego se acila, obteniendose un carbamato de formula (9). La sal se neutraliza con aproximadamente 2 a 3 equivalentes de una base organica tal como

15 trietilamina o diisopropiletilamina en un disolvente inerte tal como tolueno, y seguidamente se acila con cloroformiato de isopropilo.

En el Esquema 2, Etapa D, el bromocarbamato de formula (9) se convierte en el nitrilo de formula (7) como se ha descrito anteriormente para el Esquema 1, Etapa F.

Priparacios2

20 (R,S)-2-(3-oxo-ciclopentil)-isoindol-1,3-diona

Mientras que se agita vigorosamente con un agitador mecanico, se afade Na2CO3 acuoso 2M (79 ml, 0,158 mol) a una suspension de ciclopentenona (100 g, 1,22 mol) y ftalimida (180 g, 1,22 mol) en MeOH (886 ml). Despues de aproximadamente 2 horas se formara un precipitado blanco. Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 24 25 horas. Se recoge por filtracion en vacio el solido blanco y se enjuaga con metanol (1 l). El solido se pone en suspension en agua (1 l) y se agita durante 3 horas. Se recoge el solido y se seca en horno de vacio a 40°C durante la noche, obteniendose198 g (71%) del compuesto del titulo como un solido blanco. RMN 1H (DMSO-d6) 8 7,857,77 (m, 4H), 4,90 (m, 1H), 2,67 (ddd, 1H, J = 18,5, 6,2, 1,3 Hz), 2,54 (dd, 1H, J = 18,5, 9,2 Hz) 2,45 (m, 1H), 2,322,21 (m, 3H); ES/EM m/z 230 (m:1, debil). NOTA. El producto experimentara facilmente la reaccion de retro-Michael

30 despues de tratamiento con una base acuosa.

PriparaciosA

(R,S)-2-(7-bromo-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-isoindol-1,3-diona

En un matraz de 5 l se mezclan (R,S)-2-(3-oxo-ciclopentil)-isoindol-1,3-diona (295,3 g, 1,29 mol), 4-bromofenilhidrazina-HCl (287,9 g, 1,29 mol) y acido acetico glacial (3 l) con agitacion mecanica. La mezcla de reaccion se somete a reflujo durante 5 horas y luego se enfria a temperatura ambiente. Se vierte la mezcla de reaccion en agua (4 l) agitando rapidamente. Se recoge el solido por filtracion en vacio, se lava con agua (4 l) y se seca al aire durante 30 min. Se dispersa el solido con MeOH (700 ml), se recoge por filtracion en vacio y se enjuaga con MeOH (100 ml). Se seca al aire el solido gris durante 2 horas y luego se seca durante la noche en horno de vacio a 50°C, obteniendose 416,67 g (84%) del compuesto del titulo como un solido oscuro. ES/EM m/z (79Br/81Br) 381/383 [M:H]:.

Priparacios�

(R,S-7-bromo-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-ilamina

A una solucion de (R,S)-2-(7-bromo-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]-isoindol-1,3-diona (150 g, 393 mmol) en THF (1000 ml) y EtOH (150 ml) se afade monohidrato de hidrazina (35,0 g, 34,0 ml, 699 mmol). La mezcla de reaccion se agita con agitador mecanico a temperatura ambiente durante 18 horas y luego durante 2 horas a 55°C, haciendose despues muy viscosa, y se afaden THF (425 ml) y EtOH (75 ml). Se continua calentando a 55°C durante otras 2 horas. Se enfria la mezcla de reaccion a temperatura ambiente, se filtra a traves de tierra de diatomeas y se concentra nuevamente a sequedad. El producto se somete a alto vacio durante 3 horas, resultando 94 g (95%) del compuesto del titulo como un solido. LC-ES/EM m/z C79Br/81Br) 251/253 [M:H]:. TR = 1,14 min.

Priparacios�

Ester de t-butilo del acido ((R,S)-7-bromo-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-il)carbamico

Una mezcla de (R,S)-7-bromo-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-ilamina (81,5 g, 325 mmol) en THF (800 ml) y solucion acuosa saturada de NaHCO3 (200 ml) se trata con dicarbonato de di-t-butilo (80,3 g, 357 mmol) en porciones y se agita a temperatura ambiente durante 1 hora. Se diluye la mezcla de reaccion con EtOAc (300 ml) y salmuera (100 ml). Se separan las capas y la capa organica se seca sobre MgSO4, se filtra y se concentra, obteniendose un solido oleoso oscuro. El solido se mezcla con CH2Cl2 (400 ml), se enfria en bafo de hielo y se filtra. Se enjuaga el solido con CH2Cl2 y hexanos, recuperandose 28,1 g (34%) del compuesto del titulo como un solido. Se obtienen 78,8 g (60%) mas del compuesto del titulo al concentrar el filtrado y purificacion posterior por cromatografia (1 l de gel de silice cargado como solucion concentrada en CH2Cl2, eluyendo con hexanos al 30%/CH2Cl2, 100% de CH2Cl2, luego EtOAc al 3%/CH2Cl2). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 8 7,98-7,91 (m, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,25 (s, 2H), 7,20-7,15 (m, 2H), 5,05-5,02 (m, 2H), 3,37-3,29 (m, 2H), 2,77-2,70 (m, 1H), 2,62-2,57 (m, 1H), 1,46 (s, 9H).

Priparacios�

Ester de t-butilo del acido ((S)-7-bromo-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-il)carbamico

Primeramente se tritura con Et2O el ester de t-butilo del acido ((R,S)-7-bromo-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2il)carbamico (635 g, 1810 mmol) y luego se purifica por HPLC quiral (columna; Chiralcel OJ8 x 32 cm; eluyente MeOH al 100%), obteniendose 310 g del compuesto del titulo (segundo isomero que se eluye) como un solido. HPLC quiral OJ-H, 100% de MeOH, deteccion por UV a 250 nm TR = 7,6 mm, 97,8% ee.

Priparacios�

Ester de t-butilo del acido ((S)-7-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-il)carbamico

Se agitan juntos los reactivos siguientes con DMF (250 ml) a 100°C durante 18 h: ester de t-butilo del acido ((S)-7bromo-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-il)carbamico (50,0 g, 142 mmol), cianuro de zinc (11,9 g, 99,7 mmol), acetato de zinc (5,22 g, 28,5 mmol), cloruro de 1,1'-bis(difenilfosdino)ferroceno)paladio (II) (Pd(dppf)2Cl2) (1,74g, 2,14 mmol) y zinc (3,72 g, 56,9 mmol). Se concentra a sequedad la mezcla de reaccion y se reparte entre agua y acetato de etilo. Se lavan con agua y salmuera los ingredientes organicos y luego se concentran a sequedad, obteniendose un solido. Se cromatografia el solido en dos porciones iguales sobre gel de silice (1600 ml) como sigue: se carga como solucion en CH2Cl2 y se eluye con EtOAc al 2% en CH2Cl2 (3 l), luego EtOAc al 5% en CH2Cl2. Se recupere el producto de las dos columnas, obteniendose 29 g (69%) del compuesto del titulo como un solido blanco. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 8 8,39 (s, 1H), 7,74 (s, 1h), 7,34 (d, J = 1,8 Hz, 2H), 5,05-4,96 (m, 2H), 3,37-3,25 (m, 2H), 2,80-2,63 (m, 2H), 1,46 (s, 9H).

Priparacios�

Ester isopropilico del acido ((S)-7-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-il)carbamico

Se disuelve en 1,4-dioxano (102 ml) el ester de t-butilo del acido ((S)-7-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2il)-carbamico (10 g, 33,63 mmol) y se trata con HCl 4M/dioxano (102 ml) a temperatura ambiente. Despues de 18 h se elimina por filtracion un solido y se lava con Et2O (50 ml) y luego se seca en vacio.

Se dispersa el solido en diclorometano (168 ml) y se trata con diisoprpiletilamina (12,3 ml, 70,1 mmol) y cloroformiato de isopropilo (1,0 M en tolueno, 34,0 ml, 34,0 mmol) a temperatura ambiente. Despues de 4 h se trata la mezcla de reaccion con agua (50 ml) y se concentra, resultando una suspension acuosa del producto. Se diluye mas con agua (500 ml) la mezcla de reaccion y se sonica durante 10 min en bafo ultrasonico, se filtra, se lava con Et2O (50 ml) y luego se seca en vacio, obteniendose 8,20 g (86%) del producto del titulo como un solido. LC-ES/EM m/z 284 [M:H]:, 282[M-H]-, TR = 2,20 min. RMN1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 11,44 (s, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,52 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,39 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,28 (dd, J = 1,8, 8,4 Hz, 1H), 4,77-4,63 (m, 2H), 3,18-3,04 (m, 2H), 2,70 (dd, J = 6,2, 15,6 Hz, 1H), 2,58 (dd, J = 6,2, 14,5 Hz, 1H), 1,13 (d, J = 6,2 Hz, 6H).

Sistiaia altirsativa di eatir iaopropilico dil acido ((S)-7-ciaso-2.A.3.4-titrahidro-ciclopista[b]isdol-A-il)carbamico

Priparacios�

(R,S)-7-bromo-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-ilamina

A un matraz de fondo redondo de 3 bocas se afade (R,S)-2-(7-bromo-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-il)isoindol-1,3-diona (170,00 g, 445,93 mmol) y metilamina en EtOH (510 ml, 510,00 mmol) a 25°C bajo nitrogeno. La mezcla se mantiene a 20-25°C mientras que se agita durante 14 h. Se disuelven los materiales de partida formandose una solucion marron, pudiendose ver algun precipitado marron. La mezcla de reaccion se controla por HPLC, que revela que queda menos del 2% del material de partida. La mezcla se agita durante 1 hora y se ajusta el pH a 11 con solucion de NaOH. Se filtra la mezcla y el solido (subproducto) se lava con EtOH (170 ml). Se afade al filtrado agua (3400 ml) y solucion de NaOH al 10% (600 ml) a lo largo de 30 min a temperatura ambiente. El pH llega a 12 y se forma un precipitado solido marron. Se separa el solido por filtracion y la torta se seca a 60°C en vacio, obteniendose 103 g (89%) de un solido de color marron claro.

Priparacios�

Sal de (S)-7-bromo-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-ilamina del acido (R)-2-hidroxi-3-fenilpropionico

A un matraz de fondo redondo de 3 bocas se afade (R,S)-2-(7-bromo-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-ilamina (94,00 g, 361,66 mmol) y acido (R)-2-hidroxi-3-fenilpropionico (36,00 g, 0,60 equiv, 216,64 mmol). Luego se afaden lentamente a la mezcla a 25°C IPA 180 ml) y EtOH. Se observa una suspension. Se mantiene la suspension a 80°C con agitacion durante 2 horas. De forma una solucion marron turbia. La mezcla se enfria a 60°C durante 1 h y luego se agita a 25°C durante 2 h. La mezcla se agita luego a -10°C durante 1 h. Se separa por filtracion el solido y la torta se lava con IPA (10 ml) y n-heptano (10 ml). El solido humedo se seca a 60°C en vacio durante 4 h, obteniendose 66,1 g (43,5%) de un solido amarillo claro. HPLC/EM: 93,3% de pureza. HPLC quiral; % de (Chiralcel OJ-RH, 100% de MeOH con 0,2% de dietilmetilamina, deteccion por UV a 230 nm, 99,62% de ee.

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Ester isopropilico del acido ((S)-7-bromo-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-il)carbamico

Se combinan en tolueno (165 ml) sal de (S)-7-bromo-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-ilamina del acido (R)-2hidroxi-3-fenilpropionico (60,00 g, 143,78 mmol) y diisopropiletilamina (50 ml, 296,12 mmol). El recipiente de reaccion se purga con nitrogeno tres veces. La mezcla se enfria a 0°C mientras que se agita y se mantiene a esta temperatura durante 30 min. Se afade a 0-5°C a lo largo de 5 min una solucion de cloroformiato de isopropilo (20,00 g, 163,20 mmol) en tolueno (165 ml). Se agita la mezcla a 5°C durante 10 min. La HPLC revela que la reaccion se ha realizado en un 98,6%. La reaccion se apaga con agua (1 l) y acetato de etilo (480 ml). Se filtra la mezcla y el solido se lava con acetato de etilo (2 x 240 ml). La capa organica combinada se lava dos veces con salmuera, se seca (MgSO4) y se filtra. Se reduce el disolvente organico a 50%. Se enfria a 25°C la mezcla y se afade t-butil metil eter (50 ml) y acetato de etilo (50 ml). Precipita un solido blancuzco. Se filtra el solido y se lava con heptanos (100 ml). Se seca el solido en vacio a 50°C durante 4 h, obteniendose 44,4 g (90,3%) de un solido

marron claro.

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Ester isopropilico del acido ((S)-7-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-il)carbamico

Se carga con dimetilacetamida (33 l, 10 volumenes) un matraz de 50 l de fondo redondo y se inicia una purga bajo la superficie con nitrogeno durante 30 min. Luego se carga el matraz con acetato de zinc (363 g, 1,98 mol) en una porcion. Se afade luego el complejo Pd(dppf)2Cl2 con diclorometano (1:1) (266 g, 0,327 mol, 3,3% en moles) y seguidamente cianuro de zinc (697 g, 5,93 mol, 0,6 equiv) en una porcion. Se afade ester isopropilico del acido ((S)-7-bromo-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-il)carbamico (3335 g, 9,89 mol) en una porcion y la mezcla se purga bajo la superficie durante 30 min con nitrogeno. Finalmente se afade en una porcion polvo de zinc (259 g, 3,96 mol) y la mezcla de reaccion se calienta a 100°C - 110°C durante 6 h. Se considera que la reaccion es completa cuando se ve por HPLC que hay menos de 1% de material de partida. Finalizada la reaccion, se interrumpe el calentamiento y la mezcla de reaccion se enfria a temperatura ambiente. Luego se filtra y se enjuaga con dimetilacetamida (3 x 3 l). Luego se vierte el filtrado sobre agua (60 l) y la suspension resultante se agita durante como minimo 2 h. La suspension se filtra luego y se enjuaga con agua (20 l). Se disuelve la torta humeda en t-butil metil eter/acetona (1:1, 60 l en total) y se agita durante como minimo 30 min. La mezcla se filtra luego para eliminar la sal inorganica. Se vuelve a cargar el filtrado en el tanque. La capa organica se lava con solucion acuosa al 10% de 2,4,6-trimercapto-s-triazina (TMT) (2 x 20 l). A la capa organica se afade luego carbon vegetal (300 g, 10% en peso), Florisil® (330 g, 10% en peso) y sulfato magnesico para secar la capa. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante como minimo 2 h. Luego se filtra la mezcla y se enjuaga con acetona. Se concentra luego el filtrado a presion y se coevapora con heptano. La suspension resultante se filtra y se enjuaga con heptano. Se recogen los solidos y se secan a peso constante (2520 g, 90%). LC-ES(EM m/z 284 [M:H]:, 282 [M-H]-.

Metodo alternativo de cianuracion

Se combinan ester isopropilico del acido ((S)-7-bromo-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-il)carbamico (50 g, 148,27 mmol), cianuro de zinc (10,45 g, 88,99 mmol) y paladio (6,31 g, 2,96 mmol) en dimetilacetamida (500 ml). La suspension resultante se purga bajo la superficie con nitrogeno durante 10 min. Luego se afade 1,1'bis(difenilfosfino)ferroceno (3,29 g, 5,93 mmol) y la mezcla de reaccion se purga durante otros 10 min. Finalmente se afade formiato de zinc (2,3 g, 14,80 mmol) y la mezcla se purga nuevamente durante 10 min. La mezcla de reaccion se pone bajo una capa de nitrogeno y se calienta durante la noche a 110°C. Se desconecta el calor. Se enfria la mezcla a 85°C y se afade gel de silice funcionalizada 3-mercaptopropilo (5 g, 10% en peso). La mezcla se agita durante 2 h mientras que se enfria a temperatura ambiente. Luego se filtra la mezcla de reaccion y el solido se enjuaga con DMAC (50 ml). Al filtrado de color naranja en agitacion se afade la sal tetrasodica del acido etilendiaminotetraacetico 0,3 M en agua (100 ml) a lo largo de 10 min. La suspension resultante se agita a temperatura ambiente y se filtra. El solido se enjuaga con la sal tetrasodica del acido etilendiaminotetraacetico 0,3 M (250 ml) y seguidamente con agua (250 ml). Se recoge un solido marron claro y se seca durante la noche en horno de vacio, obteniendose el producto (42,44 g) con rendimiento cuantitativo.

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4-metilbencenosulfonato de [(2R, 3S)-3-hidroxitetrahidrofuran-2-il]metilo

Se disuelve en piridina seca (15 ml) (2R,3S)-2-(hidroximetil)tetrahidrofuran-3-ol (1,59 g, 13,46 mmol) (preparado como se describe por Chenault, K.H., Mandes, R.F. Tetrahedron, 1997, 53(32), 11033-11038) y la solucion se enfria a -40°C en bafo de hielo seco/acetona durante 30 min. Se afade lentamente a lo largo de 5 min cloruro de ptoluenosulfonilo (2,58 g, 13,51 mmol) y la solucion se deja que se caliente a temperatura ambiente a lo largo de 4 h. Se concentra la solucion, obteniendose 3,59 g (86%) del compuesto del titulo, que se usa sin mas purificacion. LC-ES/EM m/z 295,0 [M:Na]:, TR = 1,76 min. (Symyx Draw 3,1 [Nombre de IUPAC) proporciona el nombre para el compuesto de la Preparacion 12).

Ejimplo2

Ester isopropilico del acido [(S)-7-ciano-4-((2R,3S)-3-hidroxitetrahidrofuran-2-ilmetil)-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-il]carbamico

Una mezcla de ester isopropilico del acido ((S)-7-ciano-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]-indol-2-il)carbamico (2,50 g,

10 8,82 mmol), 4-metilbencenosulfonato de [(2R, 3S)-3-hidroxitetrahidrofuran-2-il]metilo (3,10 g, 11,38 mmol) y carbonato de cesio (5,00 g, 15,35 mmol) en N-metilpirrolidina (25 ml) se calienta a 65°C en bafo de aceite durante la noche. Despues de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reaccion se diluye con acetato de etilo (120 ml) y se lava con agua (3 x 100 ml) y salmuera. La porcion organica se seca sobre sulfato sodico, se filtra y se concentra a sequedad. El residuo resultante se purifica por cromatografia liquida a media presion, eluyendo con

15 acetato de etilo. Se combinan las fracciones que contienen producto puro y se concentra la combinacion, obteniendose 2,46 g (72%) de compuesto del titulo. LC-ES/EM m/z 384,2 [M:H]:, TR = 1,90 min. (Symyx Draw 3,1 [Nombre de IUPAC) proporciona el nombre siguiente para el compuesto del Ejemplo 1: N-[(2,s)-7-ciano-4-[[(2R,3S)3-hidroxitetrahidrofuran-2-il]metil]-2,3-dihidro-1H-ciclopenta[b]indol-2-il]carbamato).

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto que es el ester isopropilico del acido [(S)-7-ciano-4-((2R,3S)-3-hidroxitetrahidrofuran-2-ilmetil)1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-il]carbamico.

   5 2. El compuesto de la reivindicacion 1 para su uso en terapia.

2. 3.

   El compuesto de la reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento o la prevencion de hipoganodismo, osteoporosis, osteopenia, sarcopenia, caquexia, atrofia muscular, disfuncion sexual o disfuncion erectil.

3. 4.

   El compuesto de la reivindicacion 3 para su uso en el tratamiento o la prevencion de la atrofia muscular asociada con la falta de uso, trauma, inmovilizacion, lesion de la medula espinal o accidente cerebral vascular.

   10 5. El compuesto de la reivindicacion 4 para su uso en el tratamiento o la prevencion de la atrofia muscular asociada con la sustitucion de cadera o rodilla, fractura de cadera, lesion de la medula espinal o accidente cerebral vascular.

4. 6. Una composicion farmaceutica que comprende el ester isopropilico del acido [(S)-7-ciano-4-((2R,3S)-3hidroxitetrahidrofuran-2-ilmetil)-1,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]indol-2-il]carbamico en combinacion con uno o mas vehiculos, excipientes o diluyentes farmaceuticamente aceptables.

   15 7. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 6 para el tratamiento o la prevencion de hipoganodismo, osteoporosis, osteopenia, sarcopenia, caquexia, atrofia muscular, disfuncion sexual o disfuncion erectil.

5. 8. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 6, que ademas comprende uno o varios agentes terapeuticos adicionales.