ES2465473T3

ES2465473T3 - Transcripción de arnt supresor en células de vertebrado

Info

Publication number: ES2465473T3
Application number: ES07837972.4T
Authority: ES
Inventors: Feng Tian; Thea Norman; Stephanie Chu
Original assignee: Ambrx Inc
Current assignee: Ambrx Inc
Priority date: 2006-09-08
Filing date: 2007-09-07
Publication date: 2014-06-05
Anticipated expiration: 2027-09-07
Also published as: NZ574960A; JP5451390B2; JP2015198667A; US20140045259A1; WO2008030614A3; AU2007292893A1; EP2064333A4; CA2662755C; CN101511856A; US8420792B2; EP2064333B1; HK1132530A1; JP5932117B2; DK2064333T3; MX2009002526A; WO2008030614A2; PT2064333E; JP2014110791A; CA2662755A1; JP5764647B2

Abstract

Casete de transcripción de ARNt que comprende secuencias flanqueantes en 5' de un ARNt humano, secuencias flanqueantes en 3' de un ARNt humano, un ARNt humano y uno o más ARNt de no mamífero, en el que el ARNt humano se encuentra cadena arriba del ARNt de no mamífero y en el que dicho casete comprende, en un orden de 5' a 3', (a) secuencia flanqueante en 5' de un ARNt humano, ARNt humano, secuencia flanqueante en 3' de un ARNt humano, y (b) uno o más de una unidad de transcripción de ARNt de no mamífero que comprende una secuencia flanqueante de ARNt humano en 5', un ARNt de no mamífero y una secuencia flanqueante de ARNt humano en 3'.

Description

Transcripción de ARNt supresor en células de vertebrado

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención pertenece al campo de la bioquímica de traducción en células de vertebrado. La invención se refiere a métodos de producción y a composiciones de ARNt ortogonales, sintetasas ortogonales y pares de los mismos, en células de vertebrado. La invención también se refiere a composiciones de aminoácidos no naturales, proteínas y métodos de producción de proteínas en células de vertebrado que incluyen aminoácidos no naturales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El código genético de cada organismo conocido, desde las bacterias hasta los seres humanos, codifica los mismos veinte aminoácidos comunes. Las diferentes combinaciones de los mismos veinte aminoácidos naturales forman las proteínas que llevan a cabo prácticamente todos los complejos procesos de la vida, desde la fotosíntesis hasta la transducción de señales y la respuesta inmunitaria. Con el fin de estudiar y modificar la estructura y función de las proteínas, los científicos han tratado de manipular tanto el código genético como la secuencia de aminoácidos de las proteínas. Sin embargo, ha sido difícil eliminar las limitaciones impuestas por el código genético que limitan las proteínas a veinte bloques básicos estándar codificados genéticamente (con la rara excepción de la selenocisteína (véase, por ejemplo, A. Bock et al., (1991), Molecular Microbiology 5:515-20) y la pirrolisina (véase, por ejemplo, G. Srinivasan, et al., (2002), Science 296:1459-1462).

Se han hecho algunos avances para eliminar estas limitaciones, aunque estos avances se han visto limitados, y la capacidad de controlar racionalmente la estructura y la función de las proteínas está todavía en ciernes. Por ejemplo, los químicos han desarrollado métodos y estrategias para sintetizar y manipular las estructuras de moléculas pequeñas (véase, por ejemplo, E.J. Corey y X.-M. Cheng, The Logic of Chemical Synthesis (Wiley-Interscience, Nueva York, 1995)). La síntesis total (véase, por ejemplo, B. Merrifield, (1986), Science 232:341-7 (1986)) y las metodologías semisintéticas (véase, por ejemplo, D.Y. Jackson et al., (1994) Science 266:243-7, y P.E. Dawson y S.B. Kent, (2000), Annual Review of Biochemistry 69:923-60), han hecho posible sintetizar péptidos y proteínas pequeñas, pero estas metodologías tienen una utilidad limitada con las proteínas de más de 10 kiloDaltons (kDa). Los métodos de mutagénesis, aunque potentes, están restringidos a un número limitado de cambios estructurales. En varios casos, ha sido posible incorporar competitivamente en las proteínas análogos estructurales cercanos de los aminoácidos comunes. Véase, por ejemplo, R. Furter, (1998), Protein Science 7:419-26; K. Kirshenbaum, et al., (2002), ChemBioChem 3:235-7, y V. Doring et al., (2001), Science 292:501-4.

En un intento de ampliar la capacidad de manipular la estructura y función de las proteínas, se desarrollaron métodos in vitro utilizando ARNt ortogonales químicamente acilados que permitían que se incorporasen selectivamente aminoácidos no naturales en respuesta a un codón sin sentido, in vitro (véase, por ejemplo, J.A. Ellman, et al., (1992), Science 255:197-200). Se incorporaron selectivamente a las proteínas aminoácidos con nuevas estructuras y propiedades físicas para estudiar el plegamiento y la estabilidad y el reconocimiento biomolecular y la catálisis de las proteínas. Véase, por ejemplo, D. Mendel, et al., (1995), Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 24:435-462, y V.W. Cornish et al. (31 de marzo de 1995), Angewandte Chemie-International Edition en inglés 34:621-633. Sin embargo, la naturaleza estequiométrica de este proceso limitaba seriamente la cantidad de proteína que podía generarse.

Se han microinyectado aminoácidos no naturales en células. Por ejemplo, se introdujeron aminoácidos no naturales en el receptor nicotínico de acetilcolina en ovocitos de Xenopus (por ejemplo, M.W. Nowak, et al. (1998), In vivo incorporation of unnatural amino acids into ion channels in Xenopus oocyte expression system, Método Enzymol 293:504-529) mediante microinyección de un ARNt disaminoacilado químicamente de Tetrahymena thermophila (por ejemplo, M.E. Saks et al. (1996), An engineered Tetrahymena tRNAGln for in vivo incorporation of unnatural amino acids into proteins by nonsense suppression, J. Biol. Chem., 271:23169-23175) y el ARNm correspondiente. Esto ha permitido estudios biofísicos detallados del receptor en ovocitos por la introducción de aminoácidos que contienen cadenas laterales con propiedades físicas o químicas únicas. Véase, por ejemplo, D.A. Dougherty (2000), Unnatural amino acids as probes of protein structure and function, Curr. Opin. Chem. Biol. 4:645-652. Lamentablemente, esta metodología está limitada a las proteínas en células que pueden ser microinyectadas y dado que el ARNt pertinente se acila químicamente in vitro y no puede volver a acilarse, los rendimientos de proteína son muy bajos.

En el documento WO 2006/001832 se describe la expresión de ARNtTrp de B. subtilis en células T 293 humanas. Para potenciar la expresión de una secuencia de ARNtTrp de B. subtilis en las células, se insertó el gen entre las secuencias flanqueantes en 5’ y 3’ del gen de ARNtTrp de Arabidopsis.

Para superar estas limitaciones, se añadieron nuevos componentes a la maquinaria de biosíntesis de proteínas del procariota Escherichia coli (E. coli) (por ejemplo, L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500), lo que permitió la codificación genética de aminoácidos no naturales in vivo. Se han incorporado, de manera eficaz y con elevada fidelidad, varios nuevos aminoácidos con nuevas propiedades químicas, físicas o biológicas, incluidos marcadores de fotoafinidad y aminoácidos fotoisomerizables, aminoácidos ceto y aminoácidos glicosilados, en proteínas en E. coli en respuesta al codón ámbar, TAG, utilizando esta metodología. Véase, por ejemplo, J.W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J.W. Chin y P.G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J.W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024; y L. Wang y P.G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1-10. Sin embargo, la maquinaria de traducción de procariotas y eucariotas, no está altamente conservada; por lo tanto, los componentes de la maquinaria biosintética añadidos a E. coli no pueden utilizarse con frecuencia para incorporar de manera específica de sitio aminoácidos no naturales en las proteínas en células de vertebrado. Por ejemplo, el par tirosil-ARNt sintetasa/ARNt de Methanococcus jannaschii que se utilizó en E. coli no es ortogonal en células de vertebrado. Además, la transcripción de ARNt en eucariotas, pero no en procariotas, es llevada a cabo por la ARN polimerasa III y esto impone restricciones a la secuencia primaria de los genes estructurales de ARNt que pueden transcribirse en células de vertebrado. Por otra parte, a diferencia de las células procariotas, los ARNt en células de vertebrado necesitan ser exportadas del núcleo, donde se transcriben, al citoplasma, para que funcionen en la traducción. Por último, el ribosoma 80S de vertebrados es distinto del ribosoma 70S procariota. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar componentes mejorados de la maquinaria biosintética para ampliar el código genético de vertebrados. La presente invención satisface estas y otras necesidades, como resultará evidente tras la revisión de la siguiente descripción.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un casete de transcripción de ARNt que comprende secuencias flanqueantes en 5’ de un ARNt humano, secuencias flanqueantes en 3’ de un ARNt humano, un ARNt humano y uno o más ARNt de no mamífero, en el que el ARNt humano se encuentra cadena arriba del ARNt de no mamífero y en el que el casete comprende, en un orden de 5’ a 3', (a) secuencia flanqueante en 5’ de un ARNt humano, ARNt humano, secuencia flanqueante en 3’ de un ARNt humano y (b) uno o más de una unidad de transcripción de ARNt de no mamífero que comprende una secuencia flanqueante en 5’ de ARNt humano, un ARNt de no mamífero y una secuencia flanqueante en 3’ de ARNt humano.

En algunas formas de realización de la invención, el ARNt de no mamífero reconoce un codón selector presente en un ARNm, preferentemente del grupo que consiste en un codón ámbar, ocre, ópalo o de cuatro bases, lo más preferentemente un ARNt supresor de ámbar. En una forma de realización preferente de la invención, el ARNt de no mamífero es de Escherichia coli.

En algunas formas de realización de la invención, el ARNt humano es Tyr ARNt humano.

La invención también proporciona una célula o línea celular de vertebrado que comprende un casete de transcripción de ARNt de la invención.

La descripción también proporciona proteínas (o polipéptidos de interés) con al menos un aminoácido no natural. En determinadas formas de realización de la descripción, una proteína con al menos un aminoácido no natural incluye al menos una modificación postraduccional. En una forma de realización, la al menos una modificación postraduccional comprende la fijación de una molécula (por ejemplo, un colorante, un polímero, por ejemplo, un derivado de polietilenglicol, un fotoentrecruzador, un compuesto citotóxico, un marcador de afinidad, un derivado de biotina, una resina, una segunda proteína o polipéptido, un quelante de metales, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido (por ejemplo, ADN, ARN, etc.), etc.) que comprende un segundo grupo reactivo mediante una cicloadición [3+2] al por lo menos un aminoácido no natural que comprende un primer grupo reactivo. Por ejemplo, el primer grupo reactivo es un resto alquinilo (por ejemplo, en el aminoácido no natural p-propargiloxifenilalanina) (este grupo también se conoce a veces como resto acetileno) y el segundo grupo reactivo es un resto azido. En otro ejemplo, el primer grupo reactivo es el resto azido (por ejemplo, en el aminoácido no natural p-azido-L-fenilalanina) y el segundo grupo reactivo es el resto alquinilo. En determinadas formas de realización, una proteína de la descripción incluye al menos un aminoácido no natural (por ejemplo, un aminoácido no natural ceto) que comprende al menos una modificación postraduccional, en la que la al menos una modificación postraduccional comprende un resto sacárido. En determinadas formas de realización, la modificación postraduccional se realiza in vivo en una célula de vertebrado.

En determinadas formas de realización, la proteína incluye al menos una modificación postraduccional que es realizada in vivo por una célula de vertebrado, en la que la modificación postraduccional no es realizada por una célula procariota. En determinadas formas de realización, una proteína o polipéptido de la invención puede comprender una secuencia de localización o secreción, un epítopo de identificación, un marcador FLAG, un marcador de polihistidina, una fusión de GST, y/o similares.

Una célula de vertebrado de la invención proporciona la capacidad de sintetizar proteínas que comprenden aminoácidos no naturales en grandes cantidades útiles. Por ejemplo, pueden producirse proteínas que comprenden un aminoácido no natural a una concentración de proteína de, por ejemplo, al menos 10 μg/litro, al menos 50 μg/litro, al menos 75 μg/litro, al menos 100 μg/litro, al menos 200 μg/litro, al menos 250 μg/litro o al menos 500 μg/litro o más en un extracto celular, un tampón, un excipiente farmacéuticamente aceptable, y/o similares. En determinadas formas de realización, una composición de la invención incluye, por ejemplo, al menos 10 μg, al menos 50 μg, al menos 75 μg, al menos 100 μg, al menos 200 μg, al menos 250 μg o al menos 500 μg o más de proteína que comprende un aminoácido no natural.

En determinadas formas de realización, la proteína o el polipéptido de interés (o porción del mismo) es codificada por un ácido nucleico. Por lo general, el ácido nucleico comprende al menos un codón selector, al menos dos codones selectores, al menos tres codones selectores, al menos cuatro codones selectores, al menos cinco codones selectores, al menos seis codones selectores, al menos siete codones selectores, al menos ocho codones selectores, al menos nueve codones selectores o incluso diez o más codones selectores.

La descripción también proporciona métodos para producir, en una célula de vertebrado, al menos una proteína que comprende al menos un aminoácido no natural (así como proteínas producidas mediante tales métodos). Los métodos incluyen, por ejemplo, el crecimiento, en un medio apropiado, de una célula de vertebrado que comprende un ácido nucleico que comprende al menos un codón selector y codifica la proteína. La célula de vertebrado también comprende un ARNt ortogonal (O-ARNt) que funciona en la célula y reconoce el codón selector y una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) que aminoacila preferentemente el O-ARNt con el aminoácido no natural, y el medio comprende un aminoácido no natural. En una forma de realización, la O-RS aminoacila el O-ARNt con el aminoácido no natural, por ejemplo, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o incluso un 99%, o más, tan eficazmente como lo hace una O-RS que tiene una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, como la expuesta en la SEQ ID NO: 86 ó 45. En otra forma de realización, el O-ARNt comprende, es procesado a partir de, o es codificado por la SEQ ID NO: 64 ó 65, o una secuencia polinucleotídica complementaria de la misma. En otra forma de realización, la O-RS comprende una secuencia de aminoácidos como la expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 36-63, y/u 86.

En una forma de realización de la descripción, el método incluye adicionalmente incorporar en la proteína el aminoácido no natural, en la que el aminoácido no natural comprende un primer grupo reactivo, y poner en contacto la proteína con una molécula (por ejemplo, un colorante, un polímero, por ejemplo, un derivado de polietilenglicol, un fotoentrecruzador, un compuesto citotóxico, un marcador de afinidad, un derivado de biotina, una resina, una segunda proteína o polipéptido, un quelante de metales, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido (por ejemplo, ADN, ARN, etc.), etc.) que comprende un segundo grupo reactivo. El primer grupo reactivo reacciona con el segundo grupo reactivo para fijar la molécula al aminoácido no natural a través de una cicloadición [3+2]. En una forma de realización, el primer grupo reactivo es un resto azido o alquinilo y el segundo grupo reactivo es un resto alquinilo o azido. Por ejemplo, el primer grupo reactivo es el resto alquinilo (por ejemplo, en el aminoácido no natural p-propargiloxifenilalanina) y el segundo grupo reactivo es el resto azido. En otro ejemplo, el primer grupo reactivo es el resto azido (por ejemplo, en el aminoácido no natural p-azido-L-fenilalanina) y el segundo grupo reactivo es el resto alquinilo.

En determinadas formas de realización de la descripción, la proteína codificada comprende una proteína terapéutica, una proteína de diagnóstico, una enzima industrial, o una porción de las mismas. En una forma de realización, la proteína que se produce mediante el método se modifica adicionalmente mediante el aminoácido no natural. Por ejemplo, el aminoácido no natural se modifica mediante, por ejemplo, una reacción nucleófila-electrófila, mediante una cicloadición [3+2], etc. En otra forma de realización, la proteína producida mediante el método se modifica mediante al menos una modificación postraduccional (por ejemplo, N-glicosilación, O-glicosilación, acetilación, acilación, modificación lipídica, palmitoilación, adición de palmitato, fosforilación, modificación por enlace glucolipídico, y similares) in vivo.

En determinadas formas de realización, las composiciones y los métodos descritos en el presente documento incluyen células de vertebrado. Una célula de vertebrado de la invención incluye cualquiera de entre, por ejemplo, una célula de mamífero, una célula de levadura, una célula de hongo, una célula vegetal, una célula de insecto, etc. Los componentes de traducción de la invención pueden derivarse de diversos organismos, por ejemplo, organismos no vertebrados, tales como un organismo procariota (por ejemplo, E. coli, Bacillus stearothermophilus, o similares) o una arqueobacteria, o, por ejemplo, un organismo vertebrado.

Un codón selector de la invención amplía la estructura del codón genético de la maquinaria de biosíntesis de proteínas de vertebrados. Puede utilizarse en la invención cualquiera de diversos codones selectores, incluidos los codones de terminación (por ejemplo, un codón ámbar, un codón ocre o un codón de terminación ópalo), codones sin sentido, codones raros, codones de cuatro (o más) bases, y/o similares.

Los ejemplos de aminoácidos no naturales que pueden utilizarse en las composiciones y métodos descritos en el presente documento incluyen (pero no se limitan a): una p-acetil-L-fenilalanina, una p-yodo-L-fenilalanina, una O-metil-L-tirosina, una p-propargiloxifenilalanina, una p-propargil-fenilalanina, una L-3-(2-naftil)alanina, una 3-metil-fenilalanina, una O-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-aretil-GlcNAc�-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, un fosfonotirosina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, una isopropil-L-fenilalanina, un análogo no natural de un aminoácido tirosina; un análogo no natural de un aminoácido glutamina; un análogo no natural de un aminoácido fenilalanina; un análogo no natural de un aminoácido serina; un análogo no natural de un aminoácido treonina; un grupo alquilo, arilo, acilo, azido, ciano, halo, hidrazina, hidrazida, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, sulfonilo, seleno, éster, tioácido, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterociclo, enona, imina, aldehído, hidroxilamina, ceto o aminoácido aminosustituido o cualquier combinación de los mismos; un aminoácido con un entrecruzador fotoactivable; un aminoácido con marcador de espín; un aminoácido fluorescente; un aminoácido que se une a un metal; un aminoácido que contiene un metal; un aminoácido radiactivo; un aminoácido fotoenjaulado (photocaged) y/o fotoisomerizable; un aminoácido que contiene biotina o un análogo de biotina; un aminoácido que contiene un grupo ceto; un aminoácido que comprende polietilenglicol o poliéter; un aminoácido sustituido con un átomo pesado; un aminoácido fotoescindible o escindible químicamente; un aminoácido con una cadena lateral alargada; un aminoácido que contiene un grupo tóxico; un aminoácido sustituido con un azúcar; un aminoácido que contiene un azúcar unido a un carbono; un aminoácido con actividad redox; un aminoácido que contiene un grupo a-hidroxi; un aminotioácido; un aminoácido a,a-disustituido; un �-aminoácido; un aminoácido cíclico distinto de prolina o histidina, un aminoácido aromático distinto de fenilalanina, tirosina o triptófano, y/o similares.

En el presente documento también se describen polipéptidos (O-RS) y polinucleótidos, por ejemplo, O-ARNt, polinucleótidos que codifican O-RS o porciones de los mismos (por ejemplo, el sitio activo de la sintetasa), oligonucleótidos utilizados para construir mutantes de aminoacil-ARNt sintetasa, polinucleótidos que codifican una proteína o polipéptido de interés que comprenden uno o más codones selectores, etc. Por ejemplo, un polipéptido de la invención incluye un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 36-63, y/u 86, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia polinucleotídica como la expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3-35 y un polipéptido que es específicamente inmunorreactivo con un anticuerpo específico para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 36-63, y/u 86, o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia polinucleotídica como la mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 3-35.

En una forma de realización de la descripción, una composición incluye un polipéptido y un excipiente (por ejemplo, tampón, agua, excipiente farmacéuticamente aceptable, etc.). La descripción también proporciona un anticuerpo o antisueros específicamente inmunorreactivos con un polipéptido de la invención.

Los polinucleótidos de la descripción incluyen aquellos que codifican las proteínas o los polipéptidos de interés de la descripción con uno o más codones selectores. Además, los polinucleótidos de la descripción incluyen, por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica como la expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3-35, 64-85; un polinucleótido que es complementario de o que codifica una secuencia polinucleotídica de la misma; y/o un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 36-63, y/u 86, o una variación conservadora de la misma. Un polinucleótido de la descripción también incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido de la descripción. Del mismo modo, un ácido nucleico que hibrida con un polinucleótido que se ha indicado anteriormente en condiciones muy rigurosas en sustancialmente toda la longitud del ácido nucleico, es un polinucleótido de la descripción.

Un polinucleótido que es idéntico en al menos un 70%, (o al menos un 75%, al menos un 80%, al menos 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos 98% o menos un 99% o más) a un polinucleótido que se ha indicado anteriormente y/o a un polinucleótido que comprende una variación conservadora de cualquiera de los polinucleótidos indicados anteriormente, también queda incluido entre los polinucleótidos de la descripción.

En determinadas formas de realización, un vector (por ejemplo, un plásmido, un cósmido, un fago, un virus, etc.) comprende un polinucleótido de la descripción. En una forma de realización, el vector es un vector de expresión. En otra forma de realización, el vector de expresión incluye un promotor unido operativamente a uno o más de los polinucleótidos de la descripción. En otra forma de realización, una célula comprende un vector que incluye un polinucleótido de la descripción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra el esquema 1 para la transcripción de ARNt.

La Figura 2 muestra el esquema 2 para la transcripción de ARNt.

La Figura 3 muestra la supresión de ámbar y la expresión de hGH.

La figura 4 muestra el aumento de la supresión de ámbar y la expresión de hGH.

La Figura 5 muestra los efectos del promotor H1 sobre la expresión de hGH.

La figura 6 muestra el esquema 3 de la transcripción de ARNt.

La Figura 7 muestra los efectos del promotor U6 sobre la expresión de hGH.

La Figura 8 muestra la supresión de un codón selector para incorporar leucina en un polipéptido utilizando un ARNt de Bacillus stearothermophilus.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Antes de describir detalladamente la presente invención, debe entenderse que la presente invención no se limita a los sistemas biológicos o dispositivos concretos, que pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene solamente el fin de describir formas de realización concretas y no pretende ser limitativa. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", “el” y "la" incluyen los referentes plurales a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una combinación de dos o más células; la referencia a "bacteria" incluye mezclas de bacterias, y similares.

A menos que se defina lo contrario en el presente documento o más adelante en el resto de la memoria descriptiva, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado entendido comúnmente por los expertos en la técnica a la que pertenece la invención.

Homólogo: Las proteínas y/o secuencias de proteínas son "homólogas" cuando se derivan, natural o artificialmente, de una proteína ancestral común o secuencia de la proteína. Del mismo modo, los ácidos nucleicos y/o secuencias de ácido nucleico son homólogos cuando se derivan, natural o artificialmente, de un ácido nucleico ancestral común o secuencia del ácido nucleico. Por ejemplo, puede modificarse cualquier ácido nucleico natural mediante cualquier método de mutagénesis disponible para que incluya uno o más codones selectores. Cuando se expresa, este ácido nucleico mutagenizado codifica un polipéptido que comprende uno o más aminoácidos no naturales. El proceso de mutación puede, por supuesto, modificar adicionalmente uno o más codones normales, cambiando también de este modo uno o más aminoácidos normales en la proteína mutante resultante. La homología se deduce generalmente a partir de la similitud de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o proteínas (o secuencias de los mismos). El porcentaje preciso de similitud entre secuencias que es útil para establecer la homología varía en función del ácido nucleico y la proteína en cuestión, pero para establecer la homología se utiliza de manera rutinaria sólo un 25% de similitud de secuencia. Para establecer la homología también pueden utilizarse niveles mayores de similitud de secuencia, por ejemplo, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% o más. Los métodos para determinar los porcentajes de similitud de secuencia (por ejemplo, BLASTP y BLASTN utilizando los parámetros por defecto) se describen en el presente documento y están generalmente disponibles.

Ortogonal: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "ortogonal" se refiere a una molécula (por ejemplo, un ARNt ortogonal (O-ARNt) y/o una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS)) que funciona con componentes endógenos de una célula con una eficacia reducida en comparación con una molécula correspondiente que es endógena de la célula o del sistema de traducción, o que no funciona con componentes endógenos de la célula. En el contexto del ARNt y las aminoacil-ARNt sintetasas, ortogonal se refiere a la incapacidad o menor eficacia, por ejemplo, una eficacia inferior al 20%, una eficacia inferior al 10%, una eficacia inferior al 5% o una eficacia inferior al 1%, de un ARNt ortogonal para funcionar con una ARNt sintetasa endógena en comparación con un ARNt endógeno para funcionar con la ARNt sintetasa endógena, o de una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal para funcionar con un ARNt endógeno en comparación con una ARNt sintetasa endógena para funcionar con el ARNt endógeno. La molécula ortogonal carece de una molécula complementaria endógena funcional en la célula. Por ejemplo, un ARNt ortogonal en una célula es aminoacilado por cualquier RS endógena de la célula con una eficacia reducida o incluso nula, en comparación con la aminoacilación de un ARNt endógeno por la RS endógena. En otro ejemplo, una RS ortogonal aminoacila cualquier ARNt endógeno en una célula de interés con una eficacia reducida o incluso nula, en comparación con la aminoacilación del ARNt endógeno por una RS endógena. Puede introducirse en la célula una segunda molécula ortogonal que funcione con la primera molécula ortogonal. Por ejemplo, un par ARNt/RS ortogonal incluye componentes complementarios introducidos que funcionan juntos en la célula con una eficacia (por ejemplo, una eficacia del 50%, una eficacia del 60%, una eficacia del 70%, una eficacia del 75%, una eficacia del 80%, una eficacia del 90%, una eficacia del 95% o una eficacia del 99% o más) con respecto a la de un par endógeno ARNt/RS correspondiente.

Complementario: El término "complementario" se refiere a componentes de un par ortogonal, O-ARNt y O-RS que pueden funcionar juntos y, por ejemplo, en el que la O-RS aminoacila el O-ARNt.

Aminoacila preferentemente: La expresión "aminoacila preferentemente" se refiere a una eficacia, por ejemplo, una eficacia del 70%, una eficacia del 75%, una eficacia del 85%, una eficacia del 90%, una eficacia del 95% o una eficacia del 99% o más, con la que una O-RS aminoacila un O-ARNt con un aminoácido no natural en comparación con la O-RS que aminoacila un ARNt natural o un material de partida utilizado para generar el O-ARNt. El aminoácido no natural se incorpora en una cadena polipeptídica en crecimiento con elevada fidelidad, por ejemplo, con una eficacia superior al 75% para un codón selector determinado, con una eficacia superior a aproximadamente el 80% para un codón selector determinado, con una eficacia superior a aproximadamente el 90% para un codón selector determinado, con una eficacia superior a aproximadamente el 95% para un codón selector determinado, o con una eficacia superior a aproximadamente el 99% o más para un codón selector determinado.

Codón selector: La expresión "codón selector" se refiere a codones reconocidos por el O-ARNt en el proceso de traducción y no reconocidos por un ARNt endógeno. El bucle anticodón del O-ARNt reconoce el codón selector en el ARNm e incorpora su aminoácido, por ejemplo, un aminoácido no natural, en este sitio en el polipéptido. Los codones selectores pueden incluir, por ejemplo, codones sin sentido, tales como codones de terminación, por ejemplo, los codones ámbar, ocre y ópalo; codones de cuatro bases o más; codones raros; codones derivados de pares de bases naturales o no naturales y/o similares.

ARNt supresor: Un ARNt supresor es un ARNt que modifica la lectura de un ARN mensajero (ARNm) en un sistema de traducción determinado, por ejemplo, proporcionando un mecanismo para incorporar un aminoácido en una cadena polipeptídica en respuesta a un codón selector. Por ejemplo, un ARNt supresor puede ultraleer, por ejemplo, un codón de terminación, un codón de cuatro bases, un codón raro, y/o similares.

ARNt reciclable: La expresión "ARNt reciclable" se refiere a un ARNt que se aminoacila y puede reaminoacilarse repetidamente con un aminoácido (por ejemplo, un aminoácido no natural) para la incorporación del aminoácido (por ejemplo, el aminoácido no natural) en una o más cadenas polipeptídicas durante la traducción.

Sistema de traducción: La expresión "sistema de traducción" se refiere al conjunto de componentes que incorporan un aminoácido natural en una cadena polipeptídica en crecimiento (proteína). Los componentes de un sistema de traducción pueden incluir, por ejemplo, ribosomas, ARNt, sintetasas, ARNm, aminoácidos, y similares. Los componentes de la invención (por ejemplo, O-RS, O-ARNt, aminoácidos no naturales, etc.) pueden añadirse a un sistema de traducción in vitro o in vivo, por ejemplo, una célula de vertebrado, por ejemplo, una célula de levadura, una célula de mamífero, una célula vegetal, una célula de alga, una célula de hongo, una célula de insecto, y/o similares.

Aminoácido no natural: Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "aminoácido no natural" se refiere a cualquier aminoácido, aminoácido modificado, y/o análogo de aminoácido que no sea uno de los 20 aminoácidos naturales comunes, selenocisteína o pirrolisina.

Derivado de: Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "derivado de" se refiere a un componente que se aísla a partir de o se genera utilizando información de un organismo o una molécula especificada.

RS inactiva: Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "RS inactiva" se refiere a un sintetasa que ha sido mutada de manera que ya no puede aminoacilar su ARNt afín natural con un aminoácido.

Marcador de cribado o selección positiva: Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "marcador de cribado o selección positiva" se refiere a un marcador que cuando está presente, por ejemplo, expresado, activado o similares, da como resultado la identificación de una célula con el marcador de selección positiva frente a aquellas que no tienen el marcador de selección positiva.

Marcador de cribado o selección negativa: Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "marcador de cribado o selección negativa" se refiere a un marcador que cuando está presente, por ejemplo, expresado, activado o similares, permite la identificación de una célula que no posee la propiedad deseada (por ejemplo, en comparación con una célula que sí posee la propiedad deseada).

Indicador: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "indicador" se refiere a un componente que puede utilizarse para seleccionar componentes diana de un sistema de interés. Por ejemplo, un indicador puede incluir un marcador de cribado fluorescente (por ejemplo, proteína verde fluorescente), un marcador luminiscente (por ejemplo, una proteína luciferasa de luciérnaga), un marcador de cribado basado en la afinidad, o genes marcadores seleccionables tales como his3, ura3, leu2, lys2, lacZ, �-gal/lacZ (�-galactosidasa), Adh (alcohol deshidrogenasa), o similares.

Vertebrado: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "vertebrado" se refiere a organismos que pertenecen al dominio filogenético Eucarya, tal como los animales, por ejemplo, mamíferos, reptiles, aves, etc.

No eucariota: Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "no eucariota" se refiere a organismos no vertebrados. Por ejemplo, un organismo no vertebrado puede pertenecer al dominio filogenético Eubacteria (por ejemplo, Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, etc.) o al dominio filogenético Archaea (por ejemplo, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tal como Haloferax volcanii y las especies de Halobacterium NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, etc.).

Anticuerpo: El término "anticuerpo", tal como se utiliza en el presente documento, incluye, pero no se limita a un polipéptido sustancialmente codificado por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos, que reconocen y se unen específicamente a un analito (antígeno). Los ejemplos incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, híbridos, y monocatenario, y similares. Los fragmentos de inmunoglobulinas, incluidos los fragmentos Fab y los fragmentos producidos por una genoteca de expresión, incluida la presentación en fagos, también están incluidos en el término "anticuerpo" tal como se utiliza en el presente documento. Véase, por ejemplo, Paul, Fundamental Immunology, 4ª ed., 1999, Raven Press, Nueva York, para la terminología y la estructura de los anticuerpos.

Variante conservadora: La expresión "variante conservadora" se refiere a un componente de traducción, por ejemplo, un O-ARNt variante conservadora o una O-RS variante conservadora, que se comporta funcionalmente como el componente en el que se basa la variante conservadora, por ejemplo, un O-ARNt o una O-RS, pero que presenta variaciones en la secuencia. Por ejemplo, una O-RS aminoacilará un O-ARNt complementario o una O-ARNt variante conservadora con un aminoácido no natural, aunque el O-ARNt y el O-ARNt variante conservadora no tengan la misma secuencia. La variante conservadora puede tener, por ejemplo, una variación, dos variaciones, tres variaciones, cuatro variaciones o cinco o más variaciones en la secuencia, siempre y cuando la variante conservadora sea complementaria del O-ARNt o la O-RS correspondientes.

Agente de cribado o selección: Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "agente de cribado o selección" se refiere a un agente que, cuando está presente, permite la selección/cribado de determinados componentes a partir de una población. Por ejemplo, un agente de selección o cribado incluye, pero no se limita a, por ejemplo, un nutriente, un antibiótico, una longitud de onda de luz, un anticuerpo, un polinucleótido expresado (por ejemplo, una proteína moduladora de la transcripción), o similares. El agente de selección puede modificarse, por ejemplo, en concentración, intensidad, etc.

Sustancia detectable: La expresión "sustancia detectable", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un agente que, cuando está activado, modificado, expresado o similares, permite la selección/cribado de determinados componentes a partir de una población. Por ejemplo, la sustancia detectable puede ser un agente químico, por ejemplo, ácido 5-fluroorótico (5-FOA), que en determinadas condiciones, por ejemplo, la expresión de un indicador URA3, se vuelve detectable, por ejemplo, un producto tóxico que mata las células que expresan el indicador URA3.

La capacidad de modificar genéticamente las estructuras de las proteínas directamente en las células de vertebrado, más allá de las limitaciones químicas impuestas por el código genético, proporciona una potente herramienta molecular para investigar y manipular procesos celulares. La invención proporciona componentes de traducción que amplían el número de aminoácidos codificados genéticamente en las células de vertebrado. Estos incluyen ARNt (por ejemplo, ARNt ortogonales (O-ARNt)), aminoacil-ARNt sintetasas (por ejemplo, sintetasa ortogonal (O-RS)), pares de O-ARNt/O-RS, y aminoácidos no naturales.

Por lo general, los O-ARNt de la invención se expresan y procesan de manera eficaz, y funcionan en la traducción en una célula de vertebrado, pero no son aminoacilados significativamente por las aminoacil-ARNt sintetasas del hospedador. En respuesta a un codón selector, un O-ARNt de la invención proporciona un aminoácido no natural, que no codifica ninguno de los veinte aminoácidos comunes, a una cadena polipeptídica en crecimiento durante la traducción del ARNm.

La descripción proporciona adicionalmente métodos para producir una proteína en una célula de vertebrado, en los que la proteína comprende un aminoácido no natural. La proteína se produce utilizando los componentes de traducción de la invención. La descripción también proporciona proteínas (y proteínas producidas mediante los métodos de la descripción), que incluyen aminoácidos no naturales. La proteína o el polipéptido de interés también pueden incluir una modificación postraduccional, por ejemplo, que se añade a través de una cicloadición [3+2], o una reacción nucleófila-electrófila, que no es realizada por una célula procariota, etc. En determinadas formas de realización, también se incluyen en la invención métodos para producir una proteína moduladora de la transcripción con un aminoácido no natural (y proteínas producidas mediante tales métodos). También es una característica de la descripción las composiciones que incluyen proteínas que incluyen un aminoácido no natural.

En un aspecto de la descripción, el O-ARNt actúa de mediador en la incorporación del aminoácido no natural en una proteína con, por ejemplo, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o un 99% o más, de la eficacia de un ARNt que comprende o es procesado a partir de una secuencia polinucleotídica como la expuesta en la SEQ ID NO: 65. En otro aspecto, el O-ARNt comprende la SEQ ID NO: 65 y la O-RS comprende una secuencia polipeptídica expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 36-63, y/u 86, y/o una variación conservadora de la misma. Véanse también, por ejemplo, la Tabla 5 y el Ejemplo 6, en el presente documento, para las secuencias de moléculas de O-ARNt y O-RS ejemplares.

ARNt ortogonales

En el presente documento se describen células eucariotas que incluyen un ARNt ortogonal (O-ARNt). El ARNt ortogonal actúa de mediador en la incorporación de un aminoácido no natural en una proteína que es codificada por un polinucleótido que comprende un codón selector que es reconocido por el O-ARNt, in vivo. En determinadas formas de realización, un O-ARNt actúa de mediador en la incorporación de un aminoácido no natural en una proteína con, por ejemplo, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 75%, al menos un 80% o incluso un 90% o más, tan eficazmente como el ARNt que comprende o es procesado en una célula a partir de una secuencia polinucleotídica como la expuesta en la SEQ ID NO: 65. Véase la Tabla 5, en el presente documento.

Un ejemplo de un O-ARNt es la SEQ ID NO: 65. (Véanse el Ejemplo 6 y la Tabla 5, en el presente documento). La SEQ ID NO: 65 es un transcrito previo al ayuste/procesamiento que es opcionalmente procesado en la célula, por ejemplo, utilizando la maquinaria endógena normal de ayuste y procesamiento celular, y modificado para formar un O-ARNt activo. Por lo general, una población de tales transcritos previos al ayuste forma una población de ARNt activos en la célula. La descripción también incluye variaciones conservadoras del O-ARNt y sus productos celulares procesados. Por ejemplo, las variaciones conservadoras del O-ARNt incluyen aquellas moléculas que funcionan como el O-ARNt de la SEQ ID NO: 65 y mantienen la estructura en forma de L del ARNt en forma procesada, pero no tienen la misma secuencia (y son diferentes de moléculas de ARNt naturales). Por lo general, un O-ARNt es un O-ARNt reciclable, debido a que el O-ARNt puede reaminoacilarse in vivo para actuar de mediador nuevamente en la incorporación del aminoácido no natural en una proteína que es codificada por un polinucleótido en respuesta a un codón selector.

La transcripción del ARNt en eucariotas, pero no en procariotas, es llevada a cabo por la ARN polimerasa III, que impone restricciones a la secuencia primaria de los genes estructurales de ARNt que pueden transcribirse en las células de vertebrado. Además, en las células de vertebrado, los ARNt deben ser exportados del núcleo, donde se transcriben, al citoplasma, para actuar en la traducción. Los ácidos nucleicos que codifican un O-ARNt de la invención o un polinucleótido complementario del mismo son también una característica de la invención. En un aspecto, un ácido nucleico que codifica un O-ARNt incluye una secuencia de promotor interno, por ejemplo, una caja A (por ejemplo, TRGCNNAGY) y una caja B (por ejemplo, GGTTCGANTCC, la SEQ ID NO: 88). El O-ARNt también puede modificarse después de la transcripción. Por ejemplo, la modificación postranscripcional de los genes de ARNt en eucariotas incluye la eliminación de las secuencias flanqueantes en 5' y 3' por la ARNasa P y un 3'-endonucleasa, respectivamente. La adición de una secuencia 3'-CCA es también una modificación postranscripcional de un gen de ARNt en eucariotas.

En una forma de realización, se obtiene un O-ARNt sometiendo a selección negativa a una población de células de vertebrado de una primera especie, en la que las células de vertebrado comprenden un miembro de una biblioteca de ARNt. La selección negativa elimina las células que comprenden un miembro de la bibliotecas de ARNt que es aminoacilado por una aminoacil-ARNt sintetasa (RS) que es endógena de las células de vertebrado. Esto proporciona un grupo de ARNt que son ortogonales a la célula de vertebrado de la primera especie.

Como alternativa, o en combinación con otros métodos descritos anteriormente para incorporar un aminoácido no natural en un polipéptido, puede utilizarse un sistema de transtraducción. Este sistema implica una molécula llamada ARNtm presente en Escherichia coli. Esta molécula de ARN está relacionada estructuralmente con un alanil ARNt y es aminoacilado por la alanil-sintetasa. La diferencia entre el ARNtm y el ARNt es que el bucle anticodón se sustituye con una secuencia grande especial. Esta secuencia permite al ribosoma reanudar la traducción de secuencias que se han estancado utilizando un marco de lectura abierto codificado dentro del ARNtm como molde. Puede generarse un ARNtm ortogonal que se aminoacile preferentemente con una sintetasa ortogonal y se cargue con un aminoácido no natural. Al transcribir un gen mediante el sistema, el ribosoma se estanca en un sitio específico; el aminoácido no natural se introduce en ese sitio y la traducción se reanuda utilizando la secuencia codificada dentro del ARNtm ortogonal.

Pueden encontrarse métodos adicionales para producir ARNt ortogonales recombinantes, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 2002/086075, titulada "Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyltRNA synthetase pairs". Véase también Forster et al., (2003) "Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo". PNAS 100(11):6353-6357, y Feng et al., (2003), "Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change", PNAS 100(10): 5676-5681.

Pares ARNt ortogonal y aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal

Un par ortogonal se compone de un O-ARNt, por ejemplo, un ARNt supresor, un ARNt de desplazamiento del marco de lectura, o similar, y una O-RS. El O-ARNt no es acilado por sintetasas endógenas y es capaz de actuar de mediador en la incorporación de un aminoácido no natural en una proteína que es codificada por un polinucleótido que comprende un codón selector que es reconocido por el O-ARNt in vivo. La O-RS reconoce el O-ARNt y aminoacila preferentemente el O-ARNt con un aminoácido no natural en una célula de vertebrado. En la invención se incluyen métodos para producir pares ortogonales junto con pares ortogonales producidos mediante tales métodos y composiciones de pares ortogonales para su uso en células de vertebrado. El desarrollo de múltiples pares de ARNt/sintetasa ortogonales puede permitir la incorporación simultánea de múltiples aminoácidos no naturales utilizando diferentes codones en una célula de vertebrado.

Puede producirse un par O-ARNt/O-RS ortogonal en una célula de vertebrado importando un par, por ejemplo, un par supresor sin sentido, de un organismo diferente con aminoacilación entre especies ineficaz. El O-ARNt y la O-RS se expresan y procesan de manera eficaz en la célula de vertebrado y el O-ARNt se exporta de manera eficaz desde el núcleo hasta el citoplasma. Por ejemplo, uno de tales pares es el par tirosil-ARNt sintetasa/ARNtCUA de E. coli (véase, por ejemplo, H.M. Goodrnan, et al., (1968), Nature 217:1019-24; y, D.G. Barker, et al., (1982), FEBS Letters 150:419-23). La tirosil-ARNt sintetasa de E. coli aminoacila de manera eficaz su ARNtCUA de E. coli afín cuando ambos se expresan en el citoplasma de S. cerevisiae, pero no aminoacila los ARNt de S. cerevisiae. Véase, por ejemplo, H. Edwards y P. Schimmel, (1990), Molecular & Cellular Biology 10:1633-41; y H. Edwards, et al., (1991), PNAS, Estados Unidos de América 88:1153-6. Además, la tirosil-ARNtCUA de E. coli es un mal sustrato para las aminoacil-ARNt sintetasas de S. cerevisiae (véase, por ejemplo, V. Trezeguet, et al., (1991), Molecular & Cellular Biology 11:2744-51), pero funciona de manera eficaz en la traducción de proteínas en S. cerevisiae. Véase, por ejemplo, H. Edwards y P. Schimmel, (1990) Molecular & Cellular Biology 10:1633-41; H. Edwards, et al., (1991), PNAS, Estados Unidos de América 88:1153-6; y V. Trezeguet, et al., (1991), Molecular & Cellular Biology 11:2744-51. Además, la TyrRS de E. coli no tiene un mecanismo de edición para corregir un aminoácido no natural ligado al ARNt.

El O-ARNt y la O-RS pueden ser naturales o pueden derivarse por mutación de un ARNt y/o una RS naturales, lo que genera bibliotecas de ARNt y/o bibliotecas de RS, de diversos organismos. Véase la sección titulada "Fuentes y hospedadores" en el presente documento. En diversas formas de realización de la descripción, el O-ARNt y la O-RS se derivan de al menos un organismo. En otra forma de realización de la descripción, el O-ARNt se deriva de un ARNt natural o natural mutado de un primer organismo y la O-RS se deriva de una RS natural o natural mutada de un segundo organismo. En una forma de realización de la descripción, los organismos no vertebrados primero y segundo son iguales. Como alternativa, los organismos no vertebrados primero y segundo pueden ser diferentes.

Véanse las secciones del presente documento tituladas "Aminoacil-ARNt sintetasas ortogonales" y "O-ARNt" para los métodos de producción de O-RS y O-ARNt. Véase también la solicitud de patente internacional WO 2002/086075, titulada "Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyltRNA synthetase pairs".

Organismos hospedadores y de partida

Los componentes de traducción ortogonales de la invención se derivan por lo general de organismos no vertebrados para su uso en sistemas de traducción o células de vertebrado. Por ejemplo, el O-ARNt ortogonal puede derivarse de un organismo no vertebrado, por ejemplo, una eubacteria, tal como Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermphilus, o similares, o una arqueobacteria, tal como Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tal como Haloferax volcanii y las especies de Halobacterium NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, o similares, mientras que la O-RS ortogonal puede derivarse de un organismo no vertebrado, por ejemplo, una eubacteria, tal como Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermphilus, o similares, o una arqueobacteria, tal como Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tal como Haloferax volcanii y las especies de Halobacterium NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, o similares. Como alternativa, también pueden utilizarse fuentes de vertebrados, por ejemplo, plantas, algas, protistas, hongos, levaduras, animales (por ejemplo, mamíferos, insectos, artrópodos, etc.),

o similares, por ejemplo, cuando los componentes son ortogonales a una célula o un sistema de traducción de interés, o cuando se modifican (por ejemplo, se mutan) para que sean ortogonales a la célula o al sistema de traducción.

Los componentes individuales de un par O-ARNt/O-RS pueden derivarse del mismo organismo o de organismos diferentes. En una forma de realización, el par O-ARNt/O-RS es del mismo organismo. Por ejemplo, el par O-ARNt/O-RS puede derivarse de un par tirosil-ARNt sintetasa/ARNtCUA de E. coli. Como alternativa, el O-ARNt y la O-RS del par O-ARNt/O-RS son opcionalmente de organismos diferentes.

El O-ARNt, la O-RS o el par O-ARNt/O-RS ortogonales pueden seleccionarse o cribarse y/o utilizarse en una célula de vertebrado para producir un polipéptido con un aminoácido no natural. Una célula de vertebrado puede proceder de diversos fuentes, por ejemplo, cualquier animal vertebrado (por ejemplo, un mamífero, un anfibio, aves, reptiles, peces, etc.), o similares. Las composiciones de células de vertebrado con componentes de traducción son también una característica de la descripción.

Codones selectores

Los codones selectores de la invención amplían la estructura del codón genético de la maquinaria de biosíntesis de proteínas. Por ejemplo, un codón selector de incluye, por ejemplo, un único codón de tres bases, un codón sin sentido, tal como un codón de terminación, por ejemplo, un codón ámbar (UAG), un codón ópalo (UGA), un codón no natural, al menos un codón de cuatro bases, un codón raro, o similares. Puede introducirse varios codones selectores en un gen deseado, por ejemplo, uno o más, dos o más, más de tres, etc. Un gen puede incluir múltiples copias de un determinado codón selector o puede incluir múltiples codones selectores diferentes o cualquier combinación de los mismos.

En una forma de realización, los métodos implican el uso de un codón selector que es un codón de terminación para incorporar aminoácidos no naturales in vivo en una célula de vertebrado. Por ejemplo, se produce un O-ARNt que reconoce el codón de terminación, por ejemplo, UAG, y es aminoacilado por una O-RS con un aminoácido no natural deseado. Este O-ARNt no es reconocido por las aminoacil-ARNt sintetasas naturales del hospedador. Puede utilizarse la mutagénesis dirigida convencional para introducir el codón de terminación, por ejemplo, TAG, en el sitio de interés en un polipéptido de interés. Véase, por ejemplo, Sayers, J. R., et al. (1988), "5’,3’ Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed Mutagenesis". Nucleic Acids Res, 791-802. Cuando se combinan in vivo la O-RS, el O-ARNt y el ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés, el aminoácido no natural se incorpora en respuesta al codón UAG para dar un polipéptido que contiene el aminoácido no natural en la posición especificada.

La incorporación de aminoácidos no naturales in vivo puede realizarse sin perturbar significativamente a la célula hospedadora de vertebrado. Por ejemplo, debido a que la eficacia de supresión para el codón UAG depende de la competencia entre el O-ARNt, por ejemplo, el ARNt supresor de ámbar, y un factor de liberación de vertebrados (por ejemplo, eRF) (que se une a un codón de terminación e inicia la liberación del péptido en crecimiento del ribosoma), puede modularse la eficacia de supresión, por ejemplo, aumentando el nivel de expresión del O-ARNt, por ejemplo, el ARNt supresor.

Los codones selectores también comprenden codones prolongados, por ejemplo, codones de cuatro o más bases, tal como codones de cuatro, cinco, seis o más bases. Los ejemplos de codones de cuatro bases incluyen, por ejemplo, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU, y similares. Los ejemplos de codones de cinco bases incluyen, por ejemplo, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC, y similares. Una característica de la invención incluye el uso de codones prolongados basados en la supresión del desplazamiento del marco de lectura. Los codones de cuatro o más bases pueden insertar, por ejemplo, uno o múltiples aminoácidos no naturales en la misma proteína. Por ejemplo, en presencia de O-ARNt mutados, por ejemplo, un ARNt supresor del desplazamiento del marco de lectura especial, con bucles anticodón, por ejemplo, con al menos bucles anticodón de 8-10 nucleótidos, el codón de cuatro

o más bases se lee como un solo aminoácido. En otras formas de realización, los bucles anticodón pueden decodificar, por ejemplo, al menos un codón de cuatro bases, al menos un codón de cinco bases o al menos un codón de seis bases o más. Puesto que hay 256 posibles codones de cuatro bases, pueden codificarse múltiples aminoácidos no naturales en la misma célula utilizando un codón de cuatro o más bases. Véase Anderson et al., (2002) "Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size", Chemistry and Biology, 9:237-244; Magliery, (2001) "Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Fourbase Codons with a Library Approach in Escherichia coli", J. Mol. Biol. 307:755-769.

Por ejemplo, se han utilizado codones de cuatro bases para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas utilizando métodos de biosíntesis in vitro. Véase, por ejemplo, Ma et al., (1993) Biochemistry, 32:7939; y Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:34. Se utilizaron CGGG y AGGU para incorporar simultáneamente 2-naftilalanina y un derivado NBD de lisina en estreptavidina in vitro con dos ARNt supresores del desplazamiento del marco de lectura químicamente acilados. Véase, por ejemplo, Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:12194. En un estudio in vivo, Moore et al. examinaron la capacidad de los derivados ARNtLeu con anticodones NCUA para suprimir los codones UAGN (N puede ser U, A, G o C) y se descubrió que el cuadruplete UAGA puede ser decodificado por un ARNtLeu con un anticodón UCUA con una eficacia del 13% al 26% con poca decodificación en el marco de lectura 0 ó -1. Véase Moore et al., (2000) J. Mol. Biol., 298:195. En una forma de realización, pueden utilizarse en la invención codones prolongados basados en codones raros o codones sin sentido, que pueden reducir la ultralectura por cambio de aminoácido (missense readthrough) y la supresión del desplazamiento del marco de lectura en otros sitios no deseados.

Para un sistema determinado, un codón selector también puede incluir uno de los codones de tres bases naturales, en el que el sistema endógeno no utiliza (o rara vez utiliza) el codón de bases naturales. Por ejemplo, esto incluye un sistema que carece de un ARNt que reconoce el codón natural de tres bases, y/o un sistema en el que el codón de tres bases es un codón raro.

Los codones selectores incluyen opcionalmente pares de bases no naturales. Estos pares de bases no naturales amplían adicionalmente el alfabeto genético existente. Un par de bases adicional aumenta el número de codones triplete de 64 a 125. Las propiedades de los terceros pares de bases incluyen el apareamiento de bases estable y selectivo, la incorporación enzimática eficaz en el ADN con elevada fidelidad mediante una polimerasa y la prolongación del cebador continuada eficaz después de la síntesis del par de bases no natural naciente. Las descripciones de pares de bases no naturales que pueden adaptarse para los métodos y las composiciones incluyen, por ejemplo, Hirao, et al., (2002) "An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein", Nature Biotechnology, 20:177-182. Más adelante se enumeran otras publicaciones pertinentes.

Para el uso in vivo, el nucleósido no natural es permeable a la membrana y se fosforila para formar el trifosfato correspondiente. Además, el aumento de la información genética es estable y no es destruida por las enzimas celulares. Los intentos anteriores de Benner y otros aprovecharon los patrones de enlaces de hidrógeno que son diferentes de aquellos en los pares canónicos de Watson-Crick, cuyo ejemplo más notable es el par iso-C:iso-G. Véase, por ejemplo, Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc., 111:8322; y Piccirilli et al., (1990) Nature, 343:33; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602. Estas bases en general se aparean incorrectamente en cierta medida con las bases naturales y no pueden ser replicados enzimáticamente. Kool y colaboradores demostraron que las interacciones de empaquetamiento hidrófobas entre bases pueden reemplazar los enlaces de hidrógeno para conducir la formación de pares de bases. Véase Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602, y Guckian y Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825. En un intento de desarrollar un par de bases no naturales que cumplan con todos los requisitos anteriores, Schultz, Romesberg y colaboradores han estudiado y sintetizado de forma sistemática varias bases hidrófobas no naturales. Un auto-par PICS:PICS resulta ser más estable que los pares de bases naturales y puede ser incorporado de manera eficaz en el ADN por el fragmento Klenow (KF) de la ADN polimerasa I de Escherichia coli. Véase, por ejemplo, McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:11586; y Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:3274. Un auto-par 3MN:3MN puede ser sintetizado por KF con eficacia y selectividad suficiente para la función biológica. Véase, por ejemplo, Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:8803. Sin embargo, ambas bases actúan como terminador de cadena para la replicación adicional. Se ha desarrollado recientemente una ADN polimerasa mutante que puede utilizarse para replicar el auto-par PICS. Además, puede replicarse un auto-par 7AI. Véase, por ejemplo, Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc., 123:7439. También se ha desarrollado un par de metalobases (metallo-base pair) novedoso, Dipic:Py, que forma un par estable tras su unión a Cu(II). Véase Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:10714. Debido a que los codones prolongados y los codones no naturales son intrínsecamente ortogonales a los codones naturales, los métodos de la invención pueden aprovechar esta propiedad para generar ARNt ortogonales para ellos.

También puede utilizarse un sistema de puenteo de la traducción (translational bypassing) para incorporar un aminoácido no natural en un polipéptido deseado. En un sistema de puenteo de la traducción, se inserta una secuencia grande en un gen pero no se traduce a proteína. La secuencia contiene una estructura que hace de señal para inducir al ribosoma a saltar sobre la secuencia y reanudar la traducción cadena abajo de la inserción.

La presente invención incluye métodos para aumentar la supresión de ámbar y el reconocimiento de codones selectores, mediante el uso de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 40 o tantas como aproximadamente 80 copias de ARNt en un constructo plasmídico. En una forma de realización de la invención, estos son ARNt híbridos y pueden incluir múltiples secuencias terminadoras, como las mostradas en la Figura 2 y en la Figura 6. La presente invención también incluye vectores de transfección adicionales, incluidos bacteriófagos recombinantes, tales como fagos lambda y vectores de expresión de ADN de cósmidos, o similares, y por lo general incluyen secuencias promotoras, incluidas pero no limitadas a promotores de Pol III tales como U6 y H1. Además, los bacteriófagos permiten incluir más copias de ARNt, hasta aproximadamente 200, en el vector de transfección, lo que aumenta el número total de copias de ARNt en las células.

La presente descripción proporciona otro método altamente eficaz para la modificación selectiva de proteínas, que implica la incorporación genética de aminoácidos no naturales, por ejemplo, que contienen un resto azida o alquinilo, en las proteínas en respuesta a un codón selector. A continuación, pueden modificarse estas cadenas laterales de aminoácidos, por ejemplo, mediante una reacción de cicloadición [3+2] de Huisgen (véase, por ejemplo, Padwa, A., en "Comprehensive Organic Synthesis", vol. 4, (1991) Ed. Trost, B.M., Pergamon, Oxford, págs. 1069-1109; y Huisgen, R. en "1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry", (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, Nueva York, págs. 1-176) con, por ejemplo, derivados alquinilo o azida, respectivamente. Véase, por ejemplo, la Figura 16.

Una molécula que puede añadirse a una proteína de la descripción a través de un grupo funcional de un aminoácido codificado de forma no natural incluye prácticamente cualquier molécula con un grupo funcional complementario. Tales moléculas incluyen, pero no se limitan a, colorantes, fluoróforos, agentes de entrecruzamiento, derivados sacarídicos, polímeros (por ejemplo, derivados de polietilenglicol), fotoentrecruzadores, compuestos citotóxicos, marcadores de afinidad, derivados de biotina, resinas, perlas, una segunda proteína o polipéptido (o más), polinucleótido(s) (por ejemplo, ADN, ARN, etc.), quelantes de metales, cofactores, ácidos grasos, carbohidratos, y similares.

En otro aspecto, la descripción proporciona composiciones que incluyen tales moléculas y métodos de producción de estas moléculas, por ejemplo, derivados de polietilenglicol, en los que n es un número entero entre, por ejemplo, 50 y 10.000, 75 y 5.000, 100 y 2.000, 100 y 1.000, etc. En una forma de realización de la descripción, el polietilenglicol tiene un peso molecular de, por ejemplo, aproximadamente 5.000 Da a aproximadamente

100.000 Da, aproximadamente 20.000 Da a aproximadamente 30.000 Da, aproximadamente 40.000 Da, o aproximadamente 50.000 Da, aproximadamente 20.000 Da a aproximadamente 10.000 Da, etc.

También se proporcionan diversas composiciones que comprenden estos compuestos, por ejemplo, con proteínas y células. En un aspecto, una proteína que comprende un colorante azídico (por ejemplo, de estructura química 4 o estructura química 6), que incluye adicionalmente al menos un aminoácido no natural (por ejemplo, un aminoácido alquinílico), en el que el colorante azídico está fijado al aminoácido no natural mediante una cicloadición [3+2].

Una célula de vertebrado de la invención proporciona la capacidad de sintetizar proteínas que comprenden aminoácidos no naturales en grandes cantidades útiles. En un aspecto, la composición incluye opcionalmente, por ejemplo, al menos 10 microgramos, al menos 50 microgramos, al menos 75 microgramos, al menos 100 microgramos, al menos 200 microgramos, al menos 250 microgramos, al menos 500 microgramos, al menos 1 miligramo, al menos 10 miligramos o más de la proteína que comprende un aminoácido no natural, o una cantidad que puede conseguirse con los métodos de producción de proteínas in vivo (los detalles sobre la producción y purificación de proteínas recombinantes se proporcionan en el presente documento). En otro aspecto, la proteína está opcionalmente presente en la composición a una concentración de, por ejemplo, al menos 10 microgramos de proteína por litro, al menos 50 microgramos de proteína por litro, al menos 75 microgramos de proteína por litro, al menos 100 microgramos de proteína por litro, al menos 200 microgramos de proteína por litro, al menos 250 microgramos de proteína por litro, al menos 500 microgramos de proteína por litro, al menos 1 miligramo de proteína por litro o al menos 10 miligramos de proteína por litro o más, en, por ejemplo, un lisado celular, un tampón, un tampón farmacéutico, u otra suspensión líquida (por ejemplo, en un volumen comprendido, por ejemplo, entre aproximadamente 1 nl y aproximadamente 100 l). Es una característica de la invención la producción de grandes cantidades (por ejemplo, superiores a las posibles por lo general con otros métodos, por ejemplo, la traducción in vitro) de una proteína en una célula de vertebrado que incluya al menos un aminoácido no natural.

En determinadas formas de realización, la proteína o el polipéptido de interés (o porción del mismo) en los métodos y/o las composiciones de la descripción es codificada por un ácido nucleico. Por lo general, el ácido nucleico comprende al menos un codón selector, al menos dos codones selectores, al menos tres codones selectores, al menos cuatro codones selectores, al menos cinco codones selectores, al menos seis codones selectores, al menos siete codones selectores, al menos ocho codones selectores, al menos nueve codones selectores, diez o más codones selectores.

Los genes que codifican las proteínas o los polipéptidos de interés pueden mutagenizarse utilizando métodos conocidos para un experto en la materia y descritos en el presente documento en "Mutagénesis y otras técnicas de biología molecular" para que incluya, por ejemplo, uno o más codones selectores para la incorporación de un aminoácido no natural. Por ejemplo, se mutageniza un ácido nucleico para una proteína de interés para que incluya uno o más codones selectores, previendo la inserción en el uno o más aminoácidos no naturales. La descripción incluye tal variante, por ejemplo, mutante, versiones de cualquier proteína, por ejemplo, que incluye al menos un aminoácido no natural. Del mismo modo, la descripción también incluye los ácidos nucleicos correspondientes, es decir, cualquier ácido nucleico con uno o más codones selectores que codifican uno o más aminoácidos no naturales.

Una de las ventajas de producir una proteína o un polipéptido de interés con un aminoácido no natural en una célula de vertebrado es que por lo general las proteínas o los polipéptidos estarán plegados en sus conformaciones nativas. Sin embargo, en determinadas formas de realización de la invención, los expertos en la materia reconocerán que, después de la síntesis, la expresión y/o la purificación, las proteínas pueden tener una conformación diferente de las conformaciones deseadas de los polipéptidos pertinentes. En un aspecto de la invención, la proteína expresada está opcionalmente desnaturalizada y a continuación renaturalizada. Esto se logra, por ejemplo, añadiendo una chaperonina a la proteína o al polipéptido de interés, y/o solubilizando las proteínas en un agente caotrópico tal como guanidina-HCl, etc.

Secuencia de ácidos nucleicos y polipeptídica y variantes

Como se ha descrito anteriormente y se describe más adelante, la invención proporciona secuencias polinucleotídicas de ácidos nucleicos y secuencias polipeptídicas de aminoácidos, por ejemplo, O-ARNt y O-RS, y, por ejemplo, composiciones y métodos que comprenden dichas secuencias. En el presente documento se describen ejemplos de dichas secuencias, por ejemplo, O-ARNt y O-RS (véase la Tabla 5, por ejemplo, las SEQ ID NO: 3-65, 86, y distintas de las SEQ ID NO: 1 y 2). Sin embargo, un experto en la materia entenderá que la invención no se limita a las secuencias descritas en el presente documento, por ejemplo, los Ejemplos y la Tabla 5. Un experto entenderá que la invención también proporciona muchas secuencias relacionadas e incluso no relacionadas con las funciones descritas en el presente documento, por ejemplo, que codifican un O-ARNt o una O-RS.

La descripción también proporciona polipéptidos (O-RS) y polinucleótidos, por ejemplo, O-ARNt, polinucleótidos que codifican O-RS o porciones de las mismas (por ejemplo, el sitio activo de la sintetasa), oligonucleótidos utilizados para construir mutantes de aminoacil-ARNt sintetasa, etc. Por ejemplo, un polipéptido de la descripción incluye un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 36-63, y/u 86, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia polinucleotídica como la mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 3-35 y un polipéptido que es específicamente inmunorreactivo con un anticuerpo específico para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 36-63, y/u 86, o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia polinucleotídica como la mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 3-35.

Entre los polipéptidos de la descripción también se incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la de una tirosil aminoacil-ARNt sintetasa (TyrRS) natural (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2) y comprende dos o más aminoácidos de los grupos A-E. Por ejemplo, el grupo A incluye valina, isoleucina, leucina, glicina, serina, alanina o treonina en una posición correspondiente a Tyr37 de TyrRS de

E. coli; el grupo B incluye aspartato en una posición correspondiente a Asn126 de TyrRS de E. coli; el grupo C incluye treonina, serina, arginina, asparagina o glicina en una posición correspondiente a Asp182 de TyrRS de

E. coli; el grupo D incluye metionina, alanina, valina o tirosina en una posición correspondiente a Phe1 83 de TyrRS de E. coli; y el grupo E incluye serina, metionina, valina, cisteína, treonina o alanina en una posición correspondiente a Leu1 86 de TyrRS de E. coli. Del mismo modo, los polipéptidos de la descripción también incluyen un polipéptido que comprende al menos 20 aminoácidos contiguos de las SEQ ID NO: 36-63, y/u 86, y dos o más sustituciones de aminoácidos como se ha indicado anteriormente. También se incluye como polipéptido de la invención una secuencia de aminoácidos que comprende una variación conservadora de cualquiera de los polipéptidos anteriormente indicados.

En una forma de realización, una composición incluye un polipéptido de la descripción y un excipiente (por ejemplo, tampón, agua, excipiente farmacéuticamente aceptable, etc.). La descripción también proporciona un anticuerpo o antisueros específicamente inmunorreactivos con un polipéptido de la descripción.

En la descripción también se proporcionan polinucleótidos. Los polinucleótidos de la invención incluyen aquellos que codifican las proteínas o los polipéptidos de interés de la descripción, o que incluyen uno o más codones selectores, o ambos. Por ejemplo, los polinucleótidos de la invención incluyen, por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica como la expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 3-35, 64-85; un polinucleótido que es complementario de o que codifica una secuencia polinucleotídica de la misma; y/o un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 36-63, y/u 86, o una variación conservadora de la misma. Un polinucleótido de la invención también incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención. Del mismo modo, un ácido nucleico que hibrida con un polinucleótido indicado anteriormente en condiciones muy rigurosas sobre sustancialmente toda la longitud del ácido nucleico, es un polinucleótido de la invención.

Un polinucleótido de la invención también incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 90% a la de una tirosil aminoacil-ARNt sintetasa (TyrRS) natural (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2) y comprende dos o más mutaciones como se ha indicado anteriormente en los grupos A-E en el párrafo 11. También se incluyen entre los polinucleótidos de la invención un polinucleótido que es que es idéntico en al menos un 70%, (o al menos un 75%, al menos un 80%, al menos 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 98% o al menos un 99% o más) a un polinucleótido indicado anteriormente y/o a un polinucleótido que comprende una variación conservadora de cualquiera de los polinucleótidos indicados anteriormente.

En determinadas formas de realización, un vector (por ejemplo, un plásmido, un cósmido, un fago, un virus, etc.) comprende un polinucleótido de la invención. En una forma de realización, el vector es un vector de expresión. En otra forma de realización, el vector de expresión incluye un promotor unido operativamente a uno o más de los polinucleótidos de la invención. En otra forma de realización, una célula comprende un vector que incluye un polinucleótido de la invención.

Un experto también entenderá que quedan incluidas en la invención muchas variantes de las secuencias descritas. Por ejemplo, quedan incluidas en la invención las variaciones conservadoras de las secuencias descritas que producen una secuencia funcionalmente idéntica. Las variantes de las secuencias polinucleotídicas de ácidos nucleicos, en las que las variantes hibridan con al menos una secuencia descrita, se consideran incluidas en la invención. También quedan incluidas en la invención las subsecuencias únicas de las secuencias descritas en el presente documento, según lo determinado por, por ejemplo, las técnicas de comparación de secuencias convencionales.

Variaciones conservadoras

Debido a la degeneración del código genético, las "sustituciones silenciosas" (es decir, sustituciones en una secuencia de ácidos nucleicos que no da como resultado una modificación en un polipéptido codificado) son una característica implícita de cada secuencia de ácidos nucleicos que codifica un aminoácido. Del mismo modo, las "sustituciones conservadoras de aminoácidos", en uno o algunos aminoácidos en una secuencia de aminoácidos están sustituidos con diferentes aminoácidos con propiedades muy similares, también se identifican fácilmente como muy similares a un constructo descrito. Tales variaciones conservadoras de cada secuencia descrita son una característica de la presente invención.

"Variaciones conservadoras" de una secuencia de ácidos nucleicos concreta se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o, cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales que modifican, añaden o eliminan un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos (por lo general menos del 5%, más generalmente menos del 4%, 2% ó 1%) en una secuencia codificada son "variaciones modificadas de manera conservadora" en las que las modificaciones dan como resultado la deleción de un aminoácido, la adición de un aminoácido o la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Por lo tanto, las "variaciones conservadoras" de una secuencia polipeptídica enumerada de la presente invención incluyen sustituciones de un pequeño porcentaje, por lo general menos del 5%, más generalmente menos del 2% ó 1%, de los aminoácidos de la secuencia polipeptídica, con un aminoácido seleccionado de manera conservadora del mismo grupo de sustitución conservadora. Finalmente, la adición de secuencias que no modifican la actividad codificada de una molécula de ácido nucleico, tal como la adición de una secuencia no funcional, es una variación conservadora del ácido nucleico básico.

Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son conocidas en la técnica. En la siguiente se exponen grupos de ejemplo que contienen aminoácidos naturales que incluyen "sustituciones conservadoras" recíprocas.

Grupos de Sustituciones Conservadoras

1: Alanina (A) Serina (S) Treonina (T)

2: Ácido aspártico (D) Ácido glutámico (E)

3: Asparagina (N) Glutamina (Q)

4: Arginina (R) Lisina (K)

5: Isoleucina (I) Leucina (L) Metionina (M) Valina (V)

6: Fenilalanina (F) Tirosina (Y) Triptófano (W)

Subsecuencias únicas

En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una subsecuencia única en un ácido nucleico seleccionado de entre las secuencias de O-ARNt y O-RS descritas en el presente documento. La subsecuencia única es única en comparación con un ácido nucleico correspondiente a cualquier secuencia de ácidos nucleicos de O-ARNt u O-RS conocida. Puede realizarse el alineamiento utilizando, por ejemplo, BLAST ajustado a los parámetros por defecto. Cualquier subsecuencia única es útil, por ejemplo, como sonda para identificar los ácidos nucleicos de la invención.

Del mismo modo, la invención incluye un polipéptido que comprende una subsecuencia única en un polipéptido seleccionado de entre las secuencias de O-RS descritas en el presente documento. En el presente documento, la subsecuencia única es única en comparación con un polipéptido correspondiente a cualquier secuencia polipeptídica conocida.

La invención también proporciona ácidos nucleicos diana que hibridan en condiciones rigurosas con un oligonucleótido codificante único que codifica una subsecuencia única en un polipéptido seleccionado de entre las secuencias de O-RS en las que la subsecuencia única es única en comparación con un polipéptido correspondiente a cualquiera de los polipéptidos de control (por ejemplo, secuencias parentales de las que se derivaron las sintetasas de la invención, por ejemplo, por mutación). Las secuencias únicas se determinan como se ha indicado anteriormente.

Comparación de secuencias, identidad y homología

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de restos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, cuando se miden mediante uno de los algoritmos de comparación de secuencias que se describen más adelante (u otros algoritmos disponibles para las personas con experiencia) o mediante inspección visual.

La expresión "sustancialmente idénticos", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos (por ejemplo, los ADN que codifican un O-ARNt o una O-RS, o la secuencia de aminoácidos de una O-RS) se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos aproximadamente un 60%, preferentemente un 80%, lo más preferentemente un 90%-95% de identidad en los restos de nucleótidos o aminoácidos, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, cuando se miden mediante un algoritmo de comparación de secuencias

o mediante inspección visual. Tales secuencias "sustancialmente idénticas" son por lo general consideradas "homólogas", sin hacer referencia a la ascendencia real. Preferentemente, la "identidad sustancial" existe en una región de las secuencias que es de al menos aproximadamente 50 restos de longitud, más preferentemente en una región de al menos aproximadamente 100 restos, y lo más preferentemente, las secuencias son sustancialmente idénticas en al menos aproximadamente 150 restos, o en la longitud completa de las dos secuencias que deben compararse.

Para la comparación de secuencias y la determinación de homología, por lo general una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se asignan las coordenadas de subsecuencia, en caso necesario, y se asignan los parámetros de programa de algoritmo de secuencia. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, en base a los parámetros de programa asignados.

El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda del similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Science. EE.UU. 85:2444 (1988), mediante aplicaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección visual (véase en general, Ausubel et al., infra).

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El software para realizar el análisis BLAST está a disposición del público a través del National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, que coinciden o satisfacen alguna puntuación T umbral de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de bases de datos. T se conoce como umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul et al., supra). Estas coincidencias de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. A continuación, las coincidencias de palabras se prolongan en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como pueda aumentarse la puntuación del alineamiento acumulada. Las puntuaciones acumuladas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para restos no coincidentes, siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La prolongación de las coincidencias de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación del alineamiento acumulada disminuye la cantidad X desde su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o por debajo de cero, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X, determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para las secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un corte de 100, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:10915).

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que indica la probabilidad de que una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se produzca por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,1, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01 y lo más preferentemente inferior a aproximadamente 0,001.

Mutagénesis y otras técnicas de biología molecular

Los textos generales que describen las técnicas de biología molecular incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2ª ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (complementado a lo largo de 1999) ("Ausubel")). Estos textos describen la mutagénesis, el uso de vectores, la preparación de ADN para plásmidos y fagos lambda, promotores y muchos otros temas pertinentes relacionados con, por ejemplo, la generación de genes que incluyen codones selectores para la producción e proteínas que incluyen aminoácidos no naturales, ARNt ortogonales, sintetasas ortogonales y pares de los mismos.

En la invención se utilizan diversos tipos de mutagénesis, por ejemplo, para producir bibliotecas de ARNt, para producir bibliotecas de sintetasas, para insertar codones selectores que codifican aminoácidos no naturales en una proteína o polipéptido de interés. Estas incluyen, pero no se limitan a mutagénesis puntual aleatoria, dirigida, recombinación homóloga, barajado de ADN u otros métodos de mutagénesis recursiva, construcción de híbridos, mutagénesis utilizando moldes que contienen uracilo, mutagénesis dirigida por oligonucleótido, mutagénesis de ADN modificado con fosforotioato, mutagénesis utilizando ADN bicatenario incompleto o similares, o cualquier combinación de los mismos. Los métodos adecuados adicionales incluyen la reparación de desapareamientos puntuales, la mutagénesis utilizando cepas hospedadoras deficientes para la reparación, selección por restricción y purificación por restricción, mutagénesis por deleción, mutagénesis mediante síntesis génica total, reparación de la rotura de la doble hebra, y similares. También se incluyen en la presente invención las mutagénesis, por ejemplo, que implican constructos híbridos. En una forma de realización, la mutagénesis puede ser guiada por la información conocida sobre la molécula natural o la molécula natural modificada o mutada, por ejemplo, la secuencia, las comparaciones de secuencias, las propiedades físicas, la estructura cristalina, o similares.

Los textos anteriores y los ejemplos que se encuentran en el presente documento describen estos procedimientos. Se encuentra información adicional en las siguientes publicaciones y referencias citadas en; Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462(1985); Botstein y Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201(1985); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlín)) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specfficities, Science 242:240-245 (1988); Methods in Enzymol.

100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller y Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982); Zoller y Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983); Zoller y Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987); Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotidedirected mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye y Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814; Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res.

12:: 9441-9456 (1984); Kramer y Fritz Oligonucleotidedirected construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Eghtedarzadeh y Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans.

R.: Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakamar y Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res.

14: 6361-6372 (1988); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Grundström et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ’shot-gun’ gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed doublestrand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 83:7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001). W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); y I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995). Pueden encontrarse detalles adicionales sobre muchos de los métodos anteriormente indicados en Methods in Enzymology, Volumen 154, que también describe controles útiles para las dificultades relacionadas con la resolución de problemas con diversos métodos de mutagénesis.

La invención también se refiere a organismos y células hospedadoras de vertebrados para la incorporación in vivo de un aminoácido no natural a través pares ARNt/RS ortogonales. Las células hospedadoras se diseñan genéticamente (por ejemplo, se transforman, transducen o transfectan) con los polinucleótidos de la invención o los constructos que incluyen un polinucleótido de la invención, por ejemplo, un vector de la invención, que puede ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de plásmido, bacteria, virus, polinucleótido desnudo o polinucleótido conjugado. Los vectores se introducen en células y/o microorganismos mediante métodos convencionales incluidas la electroporación (From et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82, 5824 (1985), infección mediante vectores virales, penetración balística de alta velocidad mediante partículas pequeñas con el ácido nucleico dentro de la matriz de pequeñas perlas o partículas, o sobre la superficie (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)).

Las células hospedadoras modificadas por ingeniería genética pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados según resulte apropiado para actividades tales como, por ejemplo, las etapas de cribado, la activación de promotores o la selección de transformantes. Estas células pueden cultivarse opcionalmente en organismos transgénicos. Otras referencias útiles, por ejemplo, para el aislamiento y cultivo celular (por ejemplo, para el posterior aislamiento de ácidos nucleicos) incluyen Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, Nueva York y las referencias citadas en el mismo; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, NY; Gamborg y Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Origan Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg Nueva York) y Atlas y Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.

La invención también se refiere a líneas celulares de vertebrado con la capacidad de incorporar aminoácido(s) no natural(es) mediante pares ARNt/RS ortogonales. Estas líneas celulares pueden establecerse utilizando técnicas de cultivo celular conocidas en la técnica en células hospedadoras que se han transformado, transducido o transfectado con los polinucleótidos de la invención o constructos que incluyen un polinucleótido de la invención. Los métodos de introducción de ácidos nucleicos exógenos en las células hospedadoras son conocidos en la técnica y variarán en función de la célula hospedadora utilizada. Las técnicas incluyen, pero no se limitan a, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato cálcico, tratamiento con cloruro cálcico, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, infección viral o con fagos, encapsulación del polinucleótido o los polinucleótidos en liposomas y microinyección directa.

Las células pueden transformarse o transfectarse de manera que permitan la incorporación, transitoria o estable, de ADN. Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, resulta preferente la expresión estable. Por ejemplo, pueden modificarse por ingeniería genética líneas celulares que expresan de manera estable la molécula de anticuerpo. En lugar de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células hospedadoras pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador genético. Después de la introducción del ADN extraño, pueden dejarse crecer las células modificadas por ingeniería genética durante 1-2 días en un medio enriquecido y, a continuación, cambiarse a un medio selectivo. El marcador genético en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan hasta formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método puede utilizarse ventajosamente para modificar por ingeniería genética líneas celulares que expresan la molécula de anticuerpo. Tales líneas celulares modificadas por ingeniería genética pueden ser especialmente útiles en el cribado y la evaluación de compuestos que interaccionan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo. Como alternativa, otras técnicas, tal como algunas técnicas de transfección de vectores mediada por virus, conocidas por los expertos en la materia, pueden permitir la transfección transitoria de células.

Se dispone de varios métodos conocidos de introducción de ácidos nucleicos diana en las células, cualquiera de los cuales puede utilizarse en la invención. Estos incluyen: fusión de las células receptoras con protoplastos bacterianos que contienen el ADN, electroporación, bombardeo con proyectiles e infección con vectores virales (que se analiza adicionalmente, más adelante), etc. Pueden utilizarse células bacterianas para amplificar el número de plásmidos que contienen los constructos de ADN de la presente invención. Las bacterias se cultivan hasta la fase logarítmica y los plásmidos dentro de las bacterias pueden aislarse mediante diversos métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook). Además, se dispone en el mercado de una plétora de kits para la purificación de plásmidos a partir de bacterias, (véase, por ejemplo, EasyPrep™, Flexiprep™, ambos de Pharmacia Biotech; StrataClean™, de Stratagene; y QIAprep™ de Qiagen). A continuación, los plásmidos aislados y purificados se manipulan adicionalmente para producir otros plásmidos, se utilizan para transfectar células o se incorporan en vectores relacionados para infectar organismos. Los vectores típicos contienen terminadores de la transcripción y la traducción, secuencias de inicio de la traducción y la transcripción, y promotores útiles para la regulación de la expresión del ácido nucleico diana concreto. Los vectores comprenden opcionalmente casetes de expresión genéricos que contienen al menos una secuencia terminadora independiente, secuencias que permiten la replicación del casete en eucariotas, o procariotas, o ambos, (por ejemplo, vectores lanzadera) y marcadores de selección para sistemas de procariotas y de vertebrados. Los vectores son adecuados para la replicación y la integración en procariotas, eucariotas, o preferentemente ambos. Véase, Giliman y Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987); Schneider, B., et al., Protein Expr. Purif. 6435:10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (todos supra). La ATCC, por ejemplo, proporciona un catálogo de bacterias y bacteriófagos útiles para la clonación, por ejemplo, The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (Eds.) publicado por la ATCC. También se encuentran procedimientos básicos adicionales para la secuenciación, la clonación y otros aspectos de la biología molecular y las consideraciones teóricas subyacentes, en Watson et al. (1992) Recombinant DNA, Segunda edición, Scientific American Books, NY. Además, puede solicitarse o encargarse esencialmente cualquier ácido nucleico (y prácticamente cualquier ácido nucleico marcado, ya sea convencional o no convencional) de cualquiera de diversas fuentes comerciales, tales como la Midland Certified Reagent Company (Midland, TX mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA, disponible en la web en genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL, disponible en la web en expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) y muchos otros.

EJEMPLOS Y EJEMPLOS DE REFERENCIA

Se ofrecen los siguientes ejemplos para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada. Un experto reconocerá diversos parámetros no críticos que pueden modificarse sin alejarse del alcance de la invención reivindicada.

Ejemplo de Referencia 1: Métodos de producción y composiciones de aminoacil-ARNt sintetasas que incorporan aminoácidos no naturales en células de vertebrado.

La ampliación del código genético de los vertebrados para incluir aminoácidos no naturales con propiedades físicas, químicas o biológicas novedosas proporcionaría potentes herramientas para el análisis y el control de la función de las proteínas en estas células. Para lograr este objetivo, se describe un enfoque general para el aislamiento de aminoacil-ARNt sintetasas que incorporan aminoácidos no naturales con elevada fidelidad en las proteínas en respuesta a un codón ámbar en Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). El método se basa en la activación de los genes indicadores sensibles a GAL4: HIS3, URA3 o lacZ, mediante la supresión de los codones ámbar entre el dominio de unión a ADN y el dominio de activación de la transcripción de GAL4. Se describe la optimización de un indicador GAL4 para la selección positiva de las variantes activas de la tirosil-ARNt sintetasa de Escherichia coli (EcTyrRS). También se ha desarrollado una selección negativa de variantes de EcTyrRS inactivas con el indicador URA3 mediante el uso de una molécula pequeña (ácido 5-fluroorótico (5-FOA)) añadida al medio de crecimiento como “alelo tóxico”. Es importante destacar que pueden realizarse selecciones positivas y negativas en una sola célula y con un intervalo de rigurosidades. Esto puede facilitar el aislamiento de una variedad de actividades de la aminoacil-ARNt sintetasa (aaRS) a partir de grandes bibliotecas de sintetasas mutantes. La potencia del método para el aislamiento de fenotipos deseados de aaRS se demuestra mediante las selecciones de modelos.

Ejemplo 2

Transcripción de Tyr ARNt de E. coli en células de mamífero

Con el desarrollo de una selección genética en levaduras de una biblioteca de péptidos basada en Tyr-RS de E. coli, se hizo posible aislar sintetasas mutantes que son selectivas para su capacidad para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas en células eucariotas. Dada la homología entre las células de levadura y de mamífero, se contempla que las sintetasas mutantes ayudarían en la supresión de aminoácidos no naturales en células de mamíferos. Sin embargo, los intentos iniciales de Yokoyama et al., para conseguirlo se enfrentaron a problemas en cuanto a la capacidad de transcribir el Tyr ARNt de E. coli en células de mamífero. La transcripción de ARNt de eucariotas está dirigida por promotores, denominados cajas A y B: estos promotores están dentro de la propia secuencia de ARNt. Pueden encontrarse ejemplos adicionales de las secuencias de la caja A y la caja B en Geiduschek, (1988), Transcription By RNA Polymerase III, Ann. Rev. Biochem. 57:873-914. Yokoyama intentó obtener por ingeniería genética la secuencia de la caja A del ARNt para permitir su transcripción in vivo, pero no se detectó ningún producto de supresión de ámbar correspondiente.

En este ejemplo, se transcribió con éxito el ARNtTyr de E. coli supresor de ámbar utilizando dos esquemas de transcripción de pol III alternativos. En el primer esquema, el mutante de ARNtTry de E. coli supresor de ámbar se fusionó al extremo 3’ de un gen de ARNt de mamífero, el ARNtTyr humano, con una secuencia flanqueante en 5’ y 3’ adecuada. No se colocó entre estos dos ARNt ningún terminador de pol III. El ARNt de mamífero principal hace de "promotor líder de pol III de tipo II (TIILP)" para iniciar la transcripción de pol III que sigue por el gen ARNtTyr de

E. coli supresor de ámbar. El transcrito resultante produce un ARNtTyr de E. coli supresor de ámbar funcional generado en las células de mamífero como queda demostrado por la capacidad de este transcrito para ayudar en la incorporación de aminoácidos no naturales mediante la supresión del codón selector.

Después del inicio de la transcripción del ARNtTyr humano, con una secuencia flanqueante en 5’ y 3’ apropiada, también pueden transcribirse varios grupos de ARNt de E. coli supresor de ámbar. La agrupación del ARNt de E. coli supresor de ámbar conduce a una mejora de la supresión de aminoácidos no naturales (Figura 1).

En el segundo esquema, la transcripción del ARNtTyr de E. coli supresor de ámbar es iniciada por un promotor de la transcripción pol III de tipo III, tal como los promotores U6 o H1. Se utilizó este esquema para evaluar los efectos de la secuencia flanqueante en 5’ y 3’, así como diferentes casetes de ARNt de ARNtTyr de E. coli supresor de ámbar agrupados (Figura 2).

Parte experimental:

Construcción de un plásmido que contiene un casete de transcripción TIILP

Se generó, mediante PCR, la secuencia de ADN que codifica un mutante de ARNtTyr de E. coli supresor de ámbar de copia única. Este inserto incluye, en la dirección 5’ a 3’, sitios de restricción en 5’ (EcoR I y Bgl II), secuencia flanqueante en 5’ de Tyr ARNt humano (CTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTC (SEQ ID NO: 87)), ARNtTyr de E. coli supresor de ámbar, secuencia de ARNtTyr humano flanqueante en 3’ (GACAAGTGCGGTTTTTTTCTCCAGCTCCCGATGACTTATGGC (SEQ ID NO: 88)) y sitios de restricción en 3’ (BamH I y Hind III). Se utilizaron los siguientes cebadores de PCR para amplificar la secuencia de ADN a partir de una molde que ya contenía la secuencia de ARNtTyr humano flanqueante en 5’, el ARNtTyr de E. coli supresor de ámbar y la secuencia de ARNtTyr humano flanqueante en 3’:FTam97 corto GTACGAATTCCCGAGATCTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGC (SEQ ID NO: 89), FTam109

Se digirió el producto de PCR resultante (EcoR I y Hind III) y se ligó al ADN del plásmido pUC19 digerido con las mismas enzimas.

Se digirió el plásmido resultante (EcoR I y Bgl II) y se ligó a un inserto (cortado con EcoRI y Bam H1) que contenía el gen de ARNtTyr humano que contiene sitios de restricción en 5' (EcoR I y Bgl II), la secuencia de ARNtTyr flanqueante en 5’ humana

el ARNtTyr humano, la secuencia flanqueante en 3’ humana (GACAAGTGCGG (SEQ ID NO: 92)) y los sitios de restricción en 3’ (BamH I y Hind III).

Para construir un plásmido que codifica dos copias en tándem del casete de transcripción de ARNtTyr de

E. coli y el ARNtTyr humano, se digirió el plásmido resultante (enzimas de restricción EcoR I y Bgl II). Se amplificó mediante PCR el casete de transcripción utilizando los cebadores FT73-out nuevo (CTTTGTGTAATACTTGTAACGCTGAATTC (SEQ ID NO: 93)) y el cebador inverso FT76-out (ACCATGATTACGCCAAGCTTGAT (SEQ ID NO: 94)). Se digirió el producto de la PCR (EcoR I y BamH I) y se ligó al plásmido cortado.

Siguiendo esta estrategia, se construyeron varios plásmidos (Figura 1).

Construcción de un plásmido que expresa un ARNt de E. coli dirigido por el promotor H1 como ejemplo de referencia

Se utilizó el mutante de supresión de ámbar de ARNtTyr de E. coli construido anteriormente como molde para sintetizar diferentes insertos de clonación de ADN que a continuación se flanquearon con diferentes secuencias en 5’ y 3’ como se muestra en el Esquema 2 (Figura 2). Los cebadores utilizados para la reacción de PCR fueron:

Versión 1: FTam111 (SEQ ID NO: 95) / FTam113 (SEQ ID NO: 98) Versión 1a: FTam111 (SEQ ID NO: 95) / FTam113 (SEQ ID NO: 98) Versión 2: FTam102a (SEQ ID NO: 97) / FTam113 (SEQ ID NO: 98) Versión 3: FTam111 (SEQ ID NO: 95) / FTam114 (SEQ ID NO: 99) Versión 4: FTam102a (SEQ ID NO: 97) / FTam114 (SEQ ID NO: 99) FTAM 111: GCATCGGATCCGGTGGGGTTCCCGAGCGGCC (SEQ ID NO: 95) FTAM 112: ACGCCAAGCTTTTCCAAAATGGTGGGGGAAGGATTCGAACCTTC (SEQ ID NO: 96) FTAM 102a: GCATCGGATCCGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCG (SEQ ID NO: 97) FTAM 113: ACGCCAAGCTTTTCCAAAAAATGGTGGGGGAAGGATTCGAACCTTC (SEQ ID NO: 98) FTAM 114: ACGCCAAGCTTTTCCAAAAAACCGCACTTGTCTGGTGGGGGAAGG (SEQ ID NO: 99)

Se digirieron los insertos (BamH I y Hind III), se purificaron (kit de purificación de PCR: Qiagen) y se ligaron al vector pSilenser (Ambion) digerido con las mismas enzimas (Figura 2). Las secuencias de los constructos terminados de la Figura 2 fueron las siguientes:

E. coli Versión 1 terminador Tx4 no secuencia flanqueante en 5’ y 3’:

E. coli Versión 1 a con terminador Tx6 no secuencia flanqueante en 5’ y 3’: E. coli Versión 2 con secuencia flanqueante en 5’:

E. coli Versión 3a con secuencia flanqueante en 3’:

E. coli Versión 4 con secuencia flanqueante en 3’ y 5’:

Además, se realizaron experimentos utilizando ARNtTyr de B. stearothermophilus en lugar de E. coli, en los que se transcribió el ARNtTyr de B. stearothermophilus supresor de ámbar, como se muestra en el tercer esquema en la Figura 6. El tercer esquema incluye. Se utilizaron las mismas técnicas analizadas anteriormente para crear plásmidos y este experimento demostró que el uso de un promotor, en este caso se utilizó U6, aumentaba adicionalmente la supresión de ámbar funcional por el ARNtTyr de B. stearothermophilus (la Figura 7 muestra los resultados experimentales).

Las secuencias de los constructos terminados de la Figura 6 fueron las siguientes:

B. stearothermophilus versión 1. Sin secuencia flanqueante en 5’ y 3’ y CCA en 3’:

B. stearothermophilus versión 1a. Sin secuencia flanqueante en 5’ y 3’ y CCA en 3’, 4 Ts para la terminación:

B. stearothermophilus versión 3a. Con secuencia flanqueante en 5’ más corta sin CCA en 3’ y secuencia flanqueante:

B. stearothermophilus versión 4. Con secuencia flanqueante en 3’, terminador y sin CCA en 3’, sin región flanqueante en 5’

B. stearothermophilus versión 5a. Con secuencia flanqueante en 5' más corta y secuencia flanqueante en 3’ normal sin CCA en 3’:

La secuencia del promotor H1 y la secuencia del promotor U6 son las siguientes: Promotor H1:

Promotor U6:

Resultados

Tyr ARNt de E. coli supresor de ámbar (Figura 3)

Se evaluaron varios constructos de ARNt, ARNtTry de E. coli supresor de ámbar de tres copias, de dos copias y de una copia flanqueado con el líder ARNtTyr humano en 5’ en un ensayo de supresión de ámbar. Se cotransfectaron en células CHO K1 los plásmidos que codificaban el mutante ámbar de hGH E88, el ARNt y la ARNtTyr sintetasa de E. coli. También se realizaron controles negativos en los que se omitió la sintetasa. Se ensayó la expresión de hGH 41 horas después de la transfección. En todos los experimentos de control negativo, se detectó escasa o nula expresión de hGH (ELISA específico de hGH). En presencia de Tyr RS de E. coli y ausencia de ARNt líder humano, también se detectó escasa o nula expresión de hGH. La expresión de hGH se detectó sólo en presencia de ARNtTyr sintetasa de E. coli que flanqueaba en su extremo 5’ con la secuencia de ARNtTyr humano. En el caso del ARNtTry de E. coli supresor de ámbar de dos copias, la expresión de hGH fue casi 3 veces superior a la de copia única. Estos resultados demuestran que el mutante de ARNtTyr de E. coli supresor de ámbar es funcional para la supresión sólo en presencia de un ARNt líder humano.

Supresión de ámbar con para-acetil-fenilalanina (pAF) utilizando Tyr ARNt de E. coli supresor de ámbar transcrito in vivo con TIILP (Figura 4)

Se cotransfectaron en células CHO K1 plásmidos que codifican el mutante ámbar de hGH E88, un formato de ARNt concreto y el mutante de la ARNtTyr sintetasa de E. coli que carga pAF. Se reemplazó el medio de transfección con medio de crecimiento que contenía 1 mM de pAF. Se ensayó la expresión de hGH 42 horas después de la transfección. Un formato de ARNt en el que un líder de ARNt humano se fusionó cadena abajo con copias en tándem de los ARNtTyr de E. coli supresor de ámbar (h-(CE)2), proporcionó una expresión de hGH muy limitada. Se detectó una expresión de hGH mucho mayor utilizando dos formatos de ARNt alternativos: el primero contiene un líder de ARNt humano en 5’ fusionado con un ARNtTyr de E. coli supresor de ámbar de copia única (hEC); el segundo contiene dos copias de todo el casete de transcripción que acaba de describirse (2x(hEC)). Para estos dos constructos, podría aumentarse adicionalmente el rendimiento de supresión de ámbar duplicando la cantidad del plásmido de ARNt transfectado (es decir, de 1 μg a 2 μg). Por el contrario, los rendimientos de supresión de ámbar disminuyeron cuando se duplicó la cantidad del plásmido que codifica pAFRS transfectado.

Supresión de ámbar con pAF utilizando Tyr ARNt de E. coli supresor de ámbar transcrito in vivo con promotor H1 (Figura 5) como ejemplo de referencia.

Se cotransfectaron en células CHO K1 plásmidos que codifican el mutante ámbar de hGH E88, uno de los ARNt supresor de ámbar Tyr de E. coli dirigido por el promotor H1 y el mutante de la ARNtTyr sintetasa de E. coli. Como control negativo se utilizaron el plásmido que carecía del promotor H1 y que consistía en ARNt supresor de ámbar Tyr de E. coli de copia única flanqueado en 5’ y 3’ por secuencias flanqueantes de Tyr ARNt humano. Se reemplazó el medio de transfección con medio de crecimiento que contenía 1 mM de pAF y se ensayó la expresión de hGH mediante ELISA 42 horas después de la transfección. El experimento de control negativo, en el que no se halla presente ningún promotor H1 en el extremo 5’ de los ARNtTyr de E. coli supresor de ámbar, proporcionó una supresión muy limitada de hGH. Del mismo modo, se detectaron títulos muy bajos de hGH con la Versión 2 de transcripción de ARNt (Figura 2), en la que el ARNt estaba flanqueado sólo en el extremo 5’ con la secuencia en 5' justo cadena arriba del Tyr ARNt humano. Se detectaron niveles mucho mayores de supresión de hGH utilizando los casetes de transcripción de las Versiones 1a, 3 y 4 (Figura 2). En conjunto, estos resultados sugieren que el Tyr ARNt de E. coli supresor de ámbar, que carece de una caja A interna, no es transcrito de manera eficaz por la pol III en las células CHO; la supresión de ámbar de este formato (es decir, la Versión 1) resulta pobre. Sin embargo, la inclusión de un promotor de pol III, tal como H1, en el extremo 5’ del ARNt, permite la transcripción y un ARNt supresor de ámbar funcional, como se observa en la versión 1a, versión 3 y versión 4 de los constructos de transcripción de ARNt. El hecho de que la versión 2 del constructo proporcionase un título de supresión limitado sugiere que la secuencia flanqueante en 5’ es importante para producir un ARNt supresor de ámbar funcional.

Ejemplo de Referencia 3

Supresión de ámbar en células CHO K1 con Leu RS de tipo silvestre y ARNt supresor de ámbar de E. coli

En este experimento el codón selector, en este caso ámbar, se suprimió en las células CHO K1 con Leu RS de tipo silvestre y ARNt supresor de ámbar de E. coli

Se utilizó el par Bacillus stearothermophilus como control positivo y el lado izquierdo de la figura muestra el control negativo. Se utilizaron dos conjuntos de promotores para dirigir la expresión del ARNt, H1 y U6. (x2) y en este caso, el ARNt no es un grupo de ARNt. Para mejorar la supresión, se utilizó el doble de ADN que codificaba ARNt durante la transfección.

Los resultados en la Figura 8 muestran que el par Leu RS/ARNt de E. coli es ortogonal en células de mamífero. El nuevo esquema de transcripción de ARNt (U6, expresión de ARNt dirigida por H1) también funciona con otro ARNt que también carece de una secuencia de la caja A.

Adición de moléculas a proteínas con un aminoácido no natural. En un aspecto, la invención proporciona métodos y composiciones de proteínas relacionadas que comprenden aminoácidos no naturales acoplados a moléculas sustituyentes adicionales.

Aunque la precedente invención se ha descrito con cierto detalle para fines de claridad y comprensión, resultará evidente para un experto en la materia a partir de una lectura de la presente descripción que pueden realizarse diversos cambios en la forma y el detalle sin alejarse del verdadero alcance de la invención. Por ejemplo, todas las técnicas y los aparatos descritos en el presente documento pueden utilizarse en diversas combinaciones.

LISTADO DE SECUENCIAS

<: 110> Feng Tian Norman, Thea Chu, Stephanie

<: 120> TRANSCRIPCIÓN DE ARNt SUPRESOR EN CÉLULAS DE VERTEBRADO

<: 130 > AMBX-0124.00PCT

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< 210 > 89 < 211 > 42 < 212 > ADN < 213 > Artificial

< 220 > < 223 > cebador

< 400> 89 gtacgaattc ccgagatctc tgtgctgaac ctcaggggac gc: 42

< 210 > 90 < 211 > 80 < 212 > ADN < 213 > Artificial

< 220 >

< 211 > 44 < 212 > ADN < 213 > Artificial

< 220 > < 223 > cebador

< 400> 96 acgccaagct tttccaaaat ggtgggggaa ggattcgaac cttc: 44

< 210 > 97 < 211 > 34 < 212 > ADN < 213 > Artificial

< 220 > < 223 > cebador

< 400 > 97 gcatcggatc cgtgctgaac ctcaggggac gccg: 34

< 210 > 98 < 211 > 46 < 212 > ADN < 213 > Artificial

< 220 > < 223 > cebador

< 400 > 98 acgccaagct tttccaaaaa atggtggggg aaggattcga accttc: 46

< 210 > 99 < 211 > 45 < 212 > ADN < 213 > Artificial

< 220 > < 223 > cebador

< 400 > 99 acgccaagct tttccaaaaa accgcacttg tctggtgggg gaagg: 45

< 210 > 100 < 211 > 112 < 212 > ADN < 213 > Artificial

< 220 > < 223 > cebador

< 400 > 100

<: 210 > 101

<: 211 > 114

<: 212 > ADN

<: 213 > Artificial

< 212 > ADN 5 < 213 > Artificial

<: 220 >

<: 223 > ARNt supresor de ámbar Leu de E. coli

10 < 400 > 112

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Casete de transcripción de ARNt que comprende secuencias flanqueantes en 5’ de un ARNt humano, secuencias flanqueantes en 3’ de un ARNt humano, un ARNt humano y uno o más ARNt de no mamífero, en el que el ARNt humano se encuentra cadena arriba del ARNt de no mamífero y en el que dicho casete comprende, en un orden de 5’ a 3', (a) secuencia flanqueante en 5’ de un ARNt humano, ARNt humano, secuencia flanqueante en 3’ de un ARNt humano, y (b) uno o más de una unidad de transcripción de ARNt de no mamífero que comprende una secuencia flanqueante de ARNt humano en 5’, un ARNt de no mamífero y una secuencia flanqueante de ARNt humano en 3'.
2.

Casete de transcripción de ARNt según la reivindicación 1, en el que dicho ARNt de no mamífero reconoce un codón selector presente en un ARNm.
3.

Casete de transcripción de ARNt según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho ARNt de no mamífero reconoce un codón selector seleccionado del grupo que consiste en un codón ámbar, ocre, ópalo o de cuatro bases.
4.

Casete de transcripción de ARNt según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ARNt de no mamífero es un ARNt supresor de ámbar.
5.

Casete de transcripción de ARNt según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ARNt de no mamífero es de Escherichia coli.
6.

Casete de transcripción de ARNt según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ARNt humano es Tyr ARNt humano.
7.

Célula o línea celular de vertebrado que comprende el casete de transcripción de ARNt según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.