ES2468190T3 - Método para aumentar la resistencia a pat�genos en plantas - Google Patents

Abstract

Método para mejorar la resistencia a patógenos en las plantas con respecto al nivel que se alcanza por el nivel endógeno del compuesto de señalización en dichas plantas por la sobreexpresión de un receptor RKS proporcionando estas plantas con un constructo génico que comprende una secuencia de ADN que codifica para dicho receptor RKS seleccionado de los genes Arabidopsis de RKS0, RKS1, RKS2, RKS3. RKS4, RKS5, RKS6, RKS7, RKS8, RKS10, RKS11, RKS12, RKS13 y RKS14 como se describió en WO 2004/007712, o receptores ortólogos de otras plantas

Description

M�todo para aumentar la resistencia a pat�genos en plantas

Esta invención se relaciona con el campo de las enfermedades de las plantas, más específicamente para mejorar la resistencia de las plantas a los pat�genos, más específicamente para aumentar el mecanismo de resistencia inducida.

INTRODUCCI�N

Cuando las plantas se encuentran con los pat�genos, se activan los mecanismos de resistencia que pueden prevenir la infección, ayudan a la recuperación de la enfermedad y previenen incluso futuras infecciones. Una característica común de la resistencia es que se induce en respuesta a un primer encuentro inicial o ataque por pat�genos.

Recientemente se hizo evidente que las proteínas de resistencia vegetal cuando se activan mediante la interacción con las moléculas inductoras derivadas de pat�genos son capaces de inducir una vía de transducci�n de señal. Se ha establecido que algunas interacciones usan al menos en parte, una vía común (Science, 1997, 278, 1963-1965). En esta publicación se demostr� que se requiere el locus NDR1 para la resistencia al pat�geno bacterianoPseudomonas syringae pv. tomato y que se induce por el hongo pat�geno Peronospora parasitica. Del mismo modo Parker, J.E. y otros (The Plant Cell, 1996, 8, 2033-2046) demostraron que el producto codificado por el locus EDS1 en Arabidopsis thaliana tiene una función clave además en la vía de transducci�n de señal después de la infección con Peronospora parasitica, pero no después de la infección con Pseudomorcass syringae pv glycinae.

Muchos grupos de investigación diferentes introdujeron genes que codifican para tales moléculas sensoras o receptoras de inducción en plantas para hacer que estas plantas transformadas resistan a la infección por pat�genos. Generalmente, estos receptores de inducción sólo son capaces de reconocer un pat�geno, o incluso una cepa virulenta de una especie de pat�genos. Además, el pat�geno puede adaptarse rápida y fácilmente a esa forma de presión por selección y pequeñas modificaciones de la molécula de inducción que prueban ser suficientes para hacer a la planta incapaz de reconocer el pat�geno. Aunque hay es un gran número de posibles moléculas sensores, el número de genes implicados en la transmisión de la señal es muy pequeña, y consiste de proteínas evolutivamente conservadas.

Niveles más amplios de percepción y de las respuestas de resistencia a enfermedades de amplio espectro est�n mediadas por la percepción de las moléculas de pat�genos, que se conservan en una gran variedad de pat�genos. Estos patrones moleculares asociados a pat�genos (PAMP) se reconocen por los receptores de la planta, como el receptor del p�ptido flagelina FLS2 (Mol Cell., 2000, 5, 1003-1011), o el receptor para el factor de elongaci�n Tu (The Plant Cell, 2004, 16, 3496-3507).

Las señales intracelulares de advertencia transmitidas por los receptores de inducción proporcionan un objetivo adecuado para la manipulación de la resistencia basal (Trends in Genetics, 2000, 16, 449-450). Las cascadas de se�alizaci�n intracelular en el sitio de invasión primaria son similares y conservadas en la mayoría de las especies de planta. La modulación de la se�alizaci�n basal en las plantas transg�nicas a un nivel superior (ver WO99/45129) result� en un nivel de resistencia basal inducida.

La activación continua de la señal de defensa primaria parece por lo tanto la estrategia de elección para aumentar la resistencia en la primera barrera de defensa. Sin embargo, la sobreestimulaci�n constante de ese nivel de resistencia no es deseable debido a los costos de eficacia biológica implicados (Trends in Plant Science, 2002, 7, 61-67).

La segunda barrera de resistencia se proporciona por un proceso de respuestas de resistencia inducida (IR) a lo largo de toda la planta. Esta barrera de defensa es esencial en la lucha contra los pat�genos. Puede dividirse en apenas dos procesos diferentes:

(a)

la liberación de las señales de alarma desde el sitio primario de la infección y la propagación sist�mica de las señales a lo largo de toda la planta;

(b)

la percepción de estas señales en los diferentes órganos y la activación de la resistencia inducida (IR).

La percepción de las señales de alarma y el procesamiento corriente abajo que produce la resistencia activada son procesos que pueden ser diferentes entre las diversas señales de alarma.

Desde hace mucho tiempo el ácido salicílico (SA) ha sido reconocido como una de las principales señales de alarma. También actúa como una hormona implicada en los procesos de desarrollo de la planta como la senescencia y termog�nesis (Plant Physiol., 1992, 99, 799-803; Science, 1987, 237, 1601-1602; PNAS, 1989, 86, 2214-2218). En el campo de la medicina animal desde hace mucho tiempo se ha usado el ácido salicílico (y sus derivados) contra la fiebre inducida por la inflamación. Las temperaturas en aumento del cuerpo humano pueden reducirse aplicando el ácido salicílico que media su efecto a través de COX2, una ciclo-oxigenasa. El vínculo entre la resistencia en la inflamación y

la enfermedad, tanto en los sistemas de animales (Journal of Endocrinology, 2003, 178, 1-4) como en los sistemas de plantas es mediado por la actividad de COX2. COX2 tiene homólogos claros en el reino vegetal, como Piox en el tabaco (The Plant Cell, 1998, 10, 1523-1537), o pCa- COX1 de la pimienta, cuyo patrón de expresión se induce fuerte y rápidamente después de la invasión de pat�genos (J. Exp. Botany, 2002, 53, 383-385). Definimos en la presente los homólogos vegetales de los homólogos de la ciclooxigenasa como moléculas de percepción (receptores) del salicílico ácido. La unión de SA a la ciclooxigenasa resulta en la modificación de su actividad enzim�tica, lo que resulta en cambios en los procesos (lípidos) intracelulares que finalmente resultan en la inducción de la resistencia mediada por SA dentro de la planta.

Otra molécula implicada en la mediación de la respuesta SA hacia la resistencia en las plantas es SABP2. SABP2 une al ácido salicílico con alta afinidad (PNAS, 2003, 100, 16101-16106). La actividad enzim�tica hidrolasa de SABP2 se modifica de ese modo, resultando en cambios en los procesos de lípidos intracelulares que resultan finalmente en la inducción de de la resistencia de la planta mediada por SA . Se conoció recientemente que SABP2 es una esterasa de metilo que modifica MeSA en SA activando SAR y que SA inhibe esta reacción en un circuito de realimentación (PNAS, 2005, 102, 1773-1778). Por lo tanto, esta molécula es probablemente mal definida como receptor.

El receptor de brasinoesteroide BRI1 (BRasinoesteroide Insensible 1) es un receptor quinasa transmembrana LRR (que contiene repeticiones ricas en leucina) (Cell, 1997, 90, 929-938). Pertenece a una familia pequeña en Arabidopsis que comprende: BRI1 (At4g39400); BRL1 (At1g55610), BRL2 (At2g01950) y BRL3 (At3g13380) (Development, 2004, 131, 5341-5351). BRI1 y homólogos no sólo est�n directamente implicados en la percepción de esteroides (Nature 2005, 433, 167-171), sino también que se unen con alta afinidad a la sistemina (homol�ga a la pro-sistemina de Arabidopsis: At2g22940), una hormona pept�dica implicada en la se�alizaci�n sist�mica de las respuestas de resistencia (PNAS, 2002, 99, 9090-9092). Las vías intracelulares corriente abajo para la se�alizaci�n de esteroide de plantase describieron (Bioassays, 2001, 23, 1028-1036; Trends in Plant Science, 2004, 9, 91-95).

Otra familia de receptores implicada en la percepción de brasinoesteroides se define por los productos g�nicos de RKS (receptor SERK tipo quinasa; Development, 1997, 124, 2049-2062) (documento WO 04/007712). Estos productos g�nicos RKS est�n implicados también en la se�alizaci�n mediada por brasinoesteroides en las plantas y parecen formar complejos con los receptores tipo BRI1(The Plant Cell, 2004, 16, 3216-3229; Cell, 2002, 110, 213-222;Cell, 2002, 110, 203-212). Est�n implicados también en la unión de los ligandos pept�dicos extracelulares, representados por los ligandos pept�dicos candidatos como los productos g�nicos de 14Arabidopsis GASA (Arabidopsis estimulada con ácido giber�lico; Plant Mol Biol., 1995, 27, 743-752) que se postularon para unirse directamente a los productos g�nicos 14Arabidopsis RKS (WO 04/007712). Las proteínas GASA contienen un bolsillo en su estructura que se postula que est� implicado en la unión de los brasinoesteroides con alta afinidad. Los ligandos pept�dicos GASA pueden actuar por lo tanto como intermedios entre los d�meros RKS/BRI y la molécula de brasinoesteroide. El complejo de dimerizaci�n entre RKS y otros receptores como BRI1 es un complejo de la membrana plasm�tica dinámico, en el que diferentes miembros de la familia son capaces de participar como socios de la dimerizaci�n (ver Figura 1).

La modulación de la actividad de esta clase de receptores quinasas est� regulada tanto por ligandos pept�dicos como hormonas esteroides. Los brasinoesteroides de plantas est�n disponibles en diferentes formas (descritos en J. Exp. Botany, 1999, 50, 275-282; The Plant Cell, 2002, S97-S110; Plant Physiol., 2003, 131. 287-297). Aparte de estos, un número de agonistas sintéticos o antagonistas (Trends in Plant Science, 1999, 4, 348-353) se puede usar para regular estas actividades de receptor.

En el complejo receptor de la proteína descrito anteriormente las proteínas ELS (WO 04/007712) est�n implicadas también en la percepción de brasinoesteroides y transmisión de la señal y por lo tanto en la mediación de las respuestas de resistencia en toda la planta. LRP, el homólogo de tomate de los productos g�nicos de ELS de Arabidopsis se induce específicamente y, sorprendentemente, se procesa proteol�ticamente además durante la patog�nesis (Mol. Gen. Genet., 1994, 243, 47- 53; Plant J., 1996, 10, 315-330). Los productos de la proteína ELS son por lo tanto, claramente implicados en las respuestas de resistencia, y pueden desempeñar un papel en la modulación de la regulaci�n de la resistencia de brasinoesteroides. La se�alizaci�n del jasmonato, mediada por el ácido jasm�nico (JA) y un número de moléculas de derivadas, se conoce además que juega un papel importante en la resistencia de la planta, as� como en los procesos de desarrollo como la maduración del fruto, senescencia, y el desarrollo del embrión y polen (The Plant Cell, 2002, 14, S153-S164). JA est� implicado en la mediación de las vías de la ubiquinaci�n, a través de la acción de las proteínas con caja F como COI1. La percepción de JA puede mediarse por los productos g�nicos como los codificados por el locus J24I-1 (PNAS, 2002, 99, 6416-6422) o mediante los receptores aún por identificarse.

Las plantas han desarrollado procesos sofisticados de activación de un mecanismo de inmunidad sist�mica a lo largo de toda la planta. En muchos aspectos, esta barrera de defensa secundaria es comparable a una respuesta de vacunación en los humanos, y elementos superpuestos dependen de los productos g�nicos similares y vías de se�alizaci�n que se mantienen conservadas durante la evolución entre plantas y animales (EMBO reports, 2005, 6, 504-507). La respuesta de la resistencia sist�mica en las plantas se puede dividir ampliamente en la resistencia sist�mica adquirida (SAR) y la

resistencia sist�mica inducida (ISR) (Curr Opin Plant Biol., 2004, 7, 456-464). Aunque estos diferentes modos de resistencia son eficaces cada uno contra un amplio intervalo de pat�genos, sus respuestas son en esta etapa más o menos específicas para diferentes clases de pat�genos (Mol Plant Microbe Interact., 2002, 15, 27-34). Una respuesta de resistencia de amplio espectro dirigida contra bacterias o virus no es necesariamente resultante de un nivel de resistencia inducida contra por ejemplo, nematodos o �fidos. Además cada cascada de se�alizaci�n se induce y transmite por las combinaciones de diferentes moléculas de se�alizaci�n (Trends in Genetics, 2000, 16, 449-455).

Normalmente, el transporte sist�mico de estas señales producidas en la planta da como resultado la inducción sist�mica de una amplia resistencia a largo plazo. Sin embargo, las combinaciones específicas de las señales de la planta dictan en conjunto la naturaleza específica de la respuesta sist�mica resultante duradera: Algunas respuestas ya se desencadenan por la presencia de una sustancia química de se�alizaci�n; otras tienen requisitos de solapamiento para diferentessustancia químicas en total. Los ejemplos de los compuestos de señal son el ácido salicílico, ácido jasm�nico, etileno, (Nature Biotechn., 2000, 18, 779-783), y brasinoesteroides (WO 04/007712). Los factores p�ptidicos tales como la sistemina y GASA se conocen por interferir con la percepción de la señal de brasinoesteroides, como se discutió anteriormente. La aplicación artificial del exterior de las plantas por ejemplo, rociando estas moléculas de se�alizaci�n específicas es capaz de activar las respuestas de resistencia inducida deseadas dentro de la planta. La modulación de la concentración y la composición de varias señales sist�micas de la planta en las soluciones de rociado permite la modulación de la adquisición de resistencia sist�mica.

Estas señales sist�micas se perciben por las células y órganos en las partes de las plantas, que no est�n directamente implicadas en el proceso de infección. Esta percepción se logra mediante receptores específicos para cada una de estas moléculas de señal sist�mica.

Controlar el nivel de resistencia a las enfermedades en los (mono)cultivos de las plantas cultivadas en condiciones de campo es una lucha constante entre el agricultor que produce en un lado y los diversos agentes pat�genos naturales en el otro lado. La planta en s� frecuentemente consta de una variedad clonal cultivada para niveles de alto rendimiento, y su estructura gen�mica no est� generalmente optimizada para la resistencia óptima a las enfermedades. La principal herramienta disponible para la protección de las plantas en cultivo o la posterior protección del cultivo recolectado consiste en la aplicación de biocidas, tales como fungicidas, bactericidas e insecticidas. La comprensión actual de los problemas ambientales asociados con estas sustancias químicas ha resultado en la prohibición de muchos de las sustancias químicas disponibles, dejando a los agricultores sin alternativas disponibles para el control de las enfermedades. Muchas de las estrategias de cultivo clásicas actualmente en curso se dirigen a la resistencia a enfermedades se tomar� muchos años en llegar a producir nuevos híbridos y cultivares valiosos para su aplicación comercial. Sin embargo, en las últimas décadas se han hecho numerosos intentos para aumentar la resistencia por ingeniería genética, por ejemplo, mediante la transformación de la planta con los componentes de la respuesta hipersensible e intermedios de las moléculas de señal (Transgenic Res., 2002, 11,599-613). La mayoría de estas alternativas transg�nicas, sin embargo aún, no han alcanzado el mercado.

Un método en el que el agricultor aprovecha el mecanismo de defensa natural de la planta es cebando la respuesta de defensa mediante la administración de compuestos de se�alizaci�n tales como ácido salicílico. Estos compuestos de se�alizaci�n se pueden aplicar en el medio ambiente (aditivo del suelo, rociado, espolvoreo, etc.). La desventaja de este enfoque, sin embargo, es que los compuestos de se�alizaci�n, mientras que necesitan ser administrados en dosis altas para compensar las pérdidas del rociado y las pérdidas durante la absorción por la planta, al menos en la concentración en que tienen que usarse para inducir ISR, son parcialmente tóxicos y/o enemigos del medio ambiente. Usar la propia maquinaria de la planta ofrece una alternativa a través de una producción end�gena aumentada de los compuestos de se�alizaci�n por la propia planta. De este modo los genes que regulan los niveles de compuestos de se�alizaci�n activa (como SA, brasinoesteroides, etc) se expresan dentro de la propia planta transg�nica bajo el control de un promotor específico tejido/inducible o específico de la etapa. La modulación del nivel de estado estacionario de estos productos g�nicos regula a su vez, el nivel de compuestos de se�alizaci�n activos. Ejemplos de tales productos g�nicos son las proteasas implicadas en la escisión del p�ptido pro-sistemina, o el producto g�nico de DWARF4 (Plant Journal 26 2001 573-582). Una desventaja específica de este último enfoque es que toda la planta se induce, lo cual frecuentemente no es necesario y reduce la eficacia biológica física general (y rendimiento) de la planta. As�, existe todavía la necesidad de estrategias alternativas para mejorar la resistencia a las enfermedades en las plantas que puedan interferir tan poco como sea posible con las características de la eficacia biológica y rendimiento de la planta.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona ahora un método para mejorar la resistencia a pat�genos en las plantas de acuerdo con las reivindicaciones.

La mejoría de la sensibilidad de las plantas para la resistencia inducida se logra aumentando el número de moléculas receptoras, correspondiente a uno o más de los receptores mencionados anteriormente, por célula/órgano.

El aumento de la percepción se puede realizar aumentando la cantidad de receptores de señales de alerta, pero también aumentando la concentración (local) de estas señales de alerta a s� mismos. Esto se puede realizar mediante la administración o mediante la producción end�gena (local) de estas señales como SA o brasinoesteroides.

Una modalidad específica est� formada por un método en donde la secuencia de ADN que codifica para el receptor est� bajo control de un promotor específico de tejido (como promotores específicamente expresados en frutas, semillas, o flores) o un promotor inducible, como los promotores inducibles por pat�genos, promotores inducibles por detergentes (TWEEN20; Hunzicker, G.M., y otros (2004) Proceedings for the 4th International Crop Science Congress, Brisbane, Australia, 26 septiembre-1 octubre 2004), promotores inducibles por choque térmico (Biochem Biophys Res Commun., 200, 321, 364-369), promotores inducibles por esteroides (ya sean esteroides animales (por ejemplo, Plant J., 2005, 41, 899-918) o esteroides vegetales (por ejemplo, promotor de At2g14560), sistemas promotores basados en el represor de la tetraciclina (Plant J., 2000, 21, 579-588) etc.

Parte de la invención son las plantas que se producen por un método de acuerdo con la invención. Resultados similares se pueden obtener mediante la combinación de diferentes constructos que implicados en la misma vía se sobreexpresan, como un constructo que codifica para un receptor en conjunto con un constructo de codificación para una molécula objetivo corriente abajo como un factor de transcripción.

Otra modalidad de la invención es un método para inducir resistencia en una planta de acuerdo con la invención, que comprende aplicar una molécula ligando a dicha planta, que es capaz de unirse a y estimular el receptor heter�logo con el que se provee la planta. Dicha aplicación comprende, preferentemente, el rociado de la molécula.

DESCRIPCI�N DE LAS FIGURAS

Fig. 1 Modelo propuesto de la se�alizaci�n mediada por BRI/RKS con respecto a la resistencia ca las enfermedades.

Las proteínas que interact�an con los receptores RKS se muestran en gris oscuro. BRL significa para el tipo BRI1 y otros RLKs (receptor tipo quinasas) que pueden heterodimerizarse con RKS. NHL (tipo NDR1/HIN1) y SPL (tipo proteína de unión a la escamosa) corresponde a los miembros de estas dos familias que interact�an con RKS. Componentes corriente arriba y corriente abajo se indican en gris claro.

Fig. 2 Brasinoesteroides aumentan la resistencia a Peronospora parasitica.

Pl�ntulas de Arabidopsis de nueve días de edad, ecotipo Columbia (Col-0) o Wassilewskija (WS-0), se rociaron con placebo-Silwet L-77 (0.01 %) (MQ = agua + Silwet) o 0.05 mM de brasinoesteroides (+ 0.01% Silwet L-77 = Bras).Después del secado, las plantas se incubaron en la cámara de crecimiento durante el día (MPMI 2005, 18, 583592). Después de dos días la mitad de las plantas se rociaron en sus hojas con Waco9 (50 esporas/ÉL; European journal of Plant Pathology, 2001, 107, 63-68). Las plantas (40 pl�ntulas por línea) se calificaron para la esporulaci�n, 7 días después de la inoculación. El placebo se us� como un control. Los análisis e infecciones experimentales se realizaron como se describió previamente (MPMI 2005,18, 583-592). Este mostr� que, dos días después de rociar el placebo y, la mezcla de brasinoesteroides, las plantas rociadas con brasinoesteroides se alargaron, pero después de seis días se vieron casi iguales que el placebo, sólo tratado con 0.01% Silwett-L77 en agua (apenas ligeramente más alargada. También algunos de los cotiledones se invirtieron. Las plantas Col-0 y Ws-0 rociadas con brasinoesteroides mostraron menos esporulaci�n que Waco9 comparada con el control placebo.

Fig. 3 El receptor RKS4 est� implicado en la percepción de brasinoesteroides.

A. Efecto de la concentración de 24-epibrasinolida (EBL) en el crecimiento de la raíz, como se midió en Ws-0 (WT), RKS4-OX1 y RKS10 (BAK1, Cell, 2002, 110, 213-222) sobreexpresi�n (RKS10-OX) pl�ntulas después de 9 días en las placas verticales. B. Longitud de la raíz en 0.1 nM EBL. Cada cuadro es 1 cm2. C. Efecto de alta concentración de EBL en el crecimiento de la raíz de líneas RKS4 KO (knock-out) (ver Fig. 4A para más detalles). D. Longitud de la raíz en 10 nM EBL. Cada cuadro es 1 cm2.

Fig. 4 Niveles de ARNm RKS4 en pl�ntulas knock-out y con sobreexpresi�n.

A. Sitios de inserción de T-ADN en el gen RKS4. B. Análisis de RT-PCR del mensajero completo de RKS4 en pl�ntulas de 10 días de edad a partir del tipo silvestre (Ws-0 y Col-0), una línea de sobreexpresi�n (RKS4 -OX) y dos líneas de inserción de T-ADN (rks4-1 y rks4-2). Un control sin molde se incluyó y las mismas cantidades del molde de ADNc se evaluaron en el gen de la ubiquitina constitutiva (Ubi). La posición de los diferentes oligonucle�tidos usados en la reacción de RT-PCR se indica con respecto a los diferentes sitios de integración de T-ADN.

Fig. 5 RKS4 modula la resistencia frente a Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 y Peronospora parasitica.

A. Sobreexpresi�n de RKS4 (RKS4-OX1) muestra los niveles inducidos de la resistencia contra el pat�geno Pseudomonas syringae. Este se representa por el índice de la enfermedad en el eje Y. La extrapolación de los datos disponibles sugieren que las líneas knock out de RKS4 est�n implicadas además en la mediación de las respuestas de resistencia. Ensayos de resistencia se llevaron a cabo como se describió previamente (Plant Cell 1996, 8, 1225-1237;

Plant cell 1998, 10, 1571-1580). B. KO de RKS4 (rks4-1; expresión aumentada del N-terminal, ver Fig.4) aumenta también la resistencia a Peronospora parasitica, aunque menos que el control positivo inducido con ácido � aminobut�rico (BABA). Las plantas se calificaron usando una escala arbitraria I-IV, en la que I significa normal a síntomas muy leves y IV significa síntomas graves hasta la muerte. C. La deposición de callosidad se verificó en las mismas plantas, que revelaron que, después del tratamiento con BABA, la deposición de la callosidad se aumenta en las plantas rks4-1, lo que sugiere que la resistencia aumentada mediada por niveles alterados de RKS4 incluye la deposición de callosidad mejorada. Ambas pruebas se realizaron como se describió en (Plant Cell., 2005, 17, 987-999).

Fig. 6 Análisis de la expresión de los genes marcadores de resistencia a la enfermedad con la sobreexpresi�n de RKS4 de fondo.

Esto se realizó por RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) usando la Biblioteca de cebadores para genes inducibles por el pat�geno Arabidopsis (SIGMA) sobre el ARN aislado a partir de pl�ntulas de 10d de edad de Ws-0, 35S::RKS4 y 35S::RKS10. El número de veces de inducción corresponde al promedio de tres réplicas en los cambios de expresión (valores 2-MM Ct) después de la normalización con la actina (cebadores de control de la biblioteca) y usando el tipo silvestre como referencia. Las barras de error corresponden a la desviación estándar entre las réplicas. A. RLK1 = At5g60900, WAK1= At1g21250, HEL (proteína tipo heve�na) =PR4 = At3g04720 y WRKY70 = At3g56400. B. ZAT7 (C2H2 proteína dedo de cinc) = At3g46090 y el p�ptido se codifica por At2g32200. Muestra que la sobreexpresi�n de RKS4 induce la expresión de genes específicos relacionados con la defensa, lo que confirma su participación en la resistencia a las enfermedades.

Fig. 7 Fenotipos morfológicos inducidos por la expresión alterada de RKS4.

Los histogramas que se muestran en los paneles (b), (e), (f) y (g) se basan en mediciones realizadas en plantas con la expresión de RKS4 alterada y representan los cambios en porcentajes relativos al tipo silvestre correspondiente (Col-0 para rks4 -1 y -2;. Ws-0 para RKS4-OX1 y 2). La significación estadística de las diferencias observadas se analizó mediante la prueba t y el * indica que las diferencias medidas no son estadísticamente significativas (es decir, el valor de p > 0.05).

(a)

Tamaño de la flor aumentado debido a la sobreexpresi�n de RKS4 (RKS4-OX1) en función del tipo silvestre Ws-0 (WT) (barra de escala = 1 mm).

(b)

Influencia de la sobreexpresi�n de RKS4 en el pétalo y tamaño celular de la epidermis del pétalo. El número de células/pétalo se obtuvo dividiendo el área de superficie media del pétalo por el área de superficie celular media.

(c)

Forma de la hoja alterada en rosetas de plantas RKS4-OX1 (barra de escala en cm).

(d)

Descripción general de la forma de la roseta y el tamaño en las plantas RKS4-OX1 y WT (barra de escala en cm).

(e)

Influencia de la expresión alterada de RKS4 en el tamaño del cotiled�n basado en las mediciones del área de superficie de los cotiledones y de sus células del mes�filo en empalizada. El número de células por cotiled�n se obtuvo dividiendo el área de superficie media de los cotiledones por la de una de las células del mes�filo.

(f)

Influencia de la expresión alterada de RKS4 en el rendimiento de la semilla determinado por la medición de la longitud y peso de la semilla.

(g)

Influencia de la expresión alterada de RKS4 en la longitud de la raíz, como se midió en las pl�ntulas de 9 días de edad cultivadas en placas verticales. (h-i) Cambios en la actividad mit�tica de la punta de la raíz causada por la sobreexpresi�n de RKS4. (h) ) De izquierda a derecha: células en división/positiva a GUS en la punta de la raíz de una pl�ntula de 7-d de edad que contiene el constructo pCDG (Col�n-Carmona, A., You, R., Haimovitch-Gal, T. y Peter Doerner, O. (1999) Spatiotemporal analysis of mitotic activity with a labile cyclin-GUS fusion protein. Plant J. 20, 503-508) solo; número reducido de células que se dividen en la punta de la raíz de una pl�ntula F1 de 7-d de edad a partir de un cruzamiento entre RKS4-OX1 y pCDG; punta de raíz de una pl�ntula F1 de 7-d de edad a partir de un cruce entre RKS4-OX2 y pCDG (barra de escala = 50 um). (i) Histograma del número promedio de células positivas a GUS por punta de la raíz en la raíz principal (desviación estándar indicada por las barras de error).

Fig. 8 Expresión alterada de RKS4 aumenta el peso fresco.

Ws-0, Col-0, pGREEN 4K (control del vector vacío) y 35S::RKS10 se usaron como controles. El gráfico muestra que el peso fresco se aumenta, de nuevo en la sobreexpresi�n y en las líneas KO, que est� en acuerdo con los datos en la Figura 7. As�, la modulación de los niveles de RKS4 mejora, junto a la resistencia a las enfermedades también, las características de la eficacia biológica de la planta (crecimiento).

Fig. 9 Influencia de los niveles de expresión alterados de RKS4 sobre la expresión de los genes marcadores At2g14560 y PR1.

A. Análisis de qRT-PCR del gen reportero At2g14560 (un marcador tanto para la inducción de brasinoesteroides como para la activación de la resistencia mediada por NPR-1). RKS4-OX1 (RKS4S 6) y rks4-1 (ko566568) ambos muestran un aumento de los niveles de ARNm de este reportero, lo que indica una función de los fragmentos N-terminales de RKS4 (como se visualiza en la Figura 4) en la regulaci�n de la expresión g�nica mediada por la se�alizaci�n de RKS4. RKS4-OX2 (RKS4S 22), knock down de RKS4 (RKS4a 12) y knock out de RKS4 (rks4-2 = ko571166) todos resultan en los niveles disminuidos de este marcador g�nico. B. El análisis por qRT-PCR del gen reportero PR-1=At2g14610 (un

marcador de la inducción de SAR y la activación de la resistencia mediada por NPR-1). At2g14560 y PR-1 se ubican próximo uno del otro en el genoma de Arabidopsis y estos y otros genes dentro de este locus, como At2g14620, una xiloglucano:xiloglucosil transferasa, est�n bajo el control directo de la activación transcripcional modulada por la resistencia. rks4-1 (ko566568) muestra un fuerte aumento en los niveles de ARNm del reportero PR-1, lo que indica una función de los fragmentos N-terminales de RKS4, como se visualiza en la Figura 4, en la regulaci�n de RKS4 de la expresión g�nica mediada por la se�alizaci�n. RKS4-OX2 (RKS4S 22) y el knock down de RKS4 (RKS4a 12) resultan en los niveles disminuidos de este producto del gen reportero marcador. Estos datos muestran que los niveles de ARNm del receptor determina los productos g�nicos objetivos corriente abajo.

Fig. 10 Influencia del tratamiento con los brasinoesteroides en conjunto con la sobreexpresi�n de RKS4 en la expresión del gen marcador At2g14560.

Niveles de ARNm de At2g14560 se detectaron mediante qRT-PCR después del rociado de Brassinomix (materia prima diluida de brasinoesteroides, 0.05 o 0.01 mM (resp. 1:1000 o 1:5000 diluida), mezclado con Silwett L-77 (concentración final 0.01%)) o una solución de placebo de 0.01%Silwett L-77. Esto muestra un fuerte aumento en la amplitud de las respuestas de brasinoesteroides en la línea RKS4-OX1 (RKS4S 6) en comparación con el control WS de tipo silvestre. Este aumento ya se detecta a las 3 horas después de rociar con brasinoesteroides. Este tiempo es demasiado corto para las respuestas de activación indirecta. La se�alizaci�n mediada por RKS por lo tanto tiene un efecto directo sobre la activación transcripcional con este brasinoesteroide y genes reporteros activados por NPR-1. Los niveles de ARNm de At2g14560 dentro del tipo silvestre y las plantas transformadas en el intervalo de tiempo t=0, justo antes del rociado se usan como valores iniciales en esta figura. Para cada experimento 3 plantas se trataron y cosecharon. El material se mezcl� para el aislamiento del ARNm. Los experimentos Q-PCR se realizaron en triplicado, los errores estándar se indican. Curiosamente, la concentración óptima de brasinoesteroides en las plantas RKS4-OX1 fue la más diluida (0.01 mM), lo que confirma que el exceso de brasinoesteroides no presenta más efectos estimulantes. Por lo tanto, tanto los niveles del receptor como los niveles de brasinoesteroides determinan en conjunto las respuestas finales de la planta.

MODALIDAD DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La base de la invención es aumentar la sensibilidad de una planta para la resistencia inducida. Como se discutió en la introducción la resistencia inducida es causada por una reacción inicial de una planta a un ataque por un pat�geno, cuyo ataque resulta posteriormente en la dispersi�n de compuestos de se�alizaci�n sist�micos tales como el ácido salicílico, ácido jasm�nico y brasinoesteroides. Estos compuestos se perciben por receptores específicos en la célula de la planta. Se ha encontrado recientemente por los presentes inventores que la cantidad de receptores RKS para estos compuestos de se�alizaci�n es un factor limitante en los mecanismos de resistencia. As�, que aumentar el número de receptores RKS por célula o tejido permitir� una respuesta más fuerte de la circulación sist�mica y/o compuestos de se�alizaci�n aplicados externamente. Este aumento se realizar� preferentemente por transformación de la célula vegetal con un constructo de nucleótidos, que comprende la secuencia de codificación de una molécula receptor de este tipo.

El complejo de la proteína transmembrana dimerizante BRI/RKS (ver Fig. 1) est� implicado en los procesos de desarrollo (The Plant Cell, 2004, 16, 3216-3229; Cell, 2002, 110, 213-222; Cell, 2002, 110, 203-212), as� como en la regulaci�n de la resistencia a través de la percepción de brasinoesteroides (Plant Journal, 2003, 33, 887-898; y los datos obtenidos por los presentes inventores, por ejemplo, la Fig. 2 y Fig. 5). La percepción del p�ptido de difusión sistemina y, posiblemente, los ligandos GASA est�n implicados también en la mediación de la respuesta de resistencia a través de este complejo de proteínas asociados a membrana. Las parejas de la proteína heterodimerizante en este complejo (Figura 1), median por tanto, un conjunto diverso de procesos como la resistencia, el crecimiento y desarrollo del órgano de la flor.

Sorprendentemente, se ha establecido por los presentes inventores que la sobreexpresi�n del receptor-BRI1 no mejora la resistencia al pat�geno de una planta, mientras que la sobreexpresi�n de un receptor-RKS tiene un marcado efecto (ver la sección experimental). Esto sugiere, que, hasta en lo que se refiere a la participación en la vía de la resistencia a pat�genos, los receptores RKS parecen ser un factor limitante.

Esto lo hace un importante grupo de receptores, que son muy adecuados para su uso en la presente invención. El mecanismo de percepción de estos receptores se asemeja al de las respuestas de inflamación en sistemas animales, que se controlan por los esteroides. Entonces, la aplicación de glucocorticoides reduce las respuestas primarias hacia la invasión de pat�genos. Este proceso se modula por una reducción de la estabilidad del ARNm de diversos reguladores claves de la respuesta inflamatoria, por ejemplo COX2. Además estos esteroides regulan la actividad de diversos complejos receptores de tipo-Toll, tales como IL-1 (J. Endocrinology, 2003, 178, 1-4). Homólogos de los receptores de tipo-Toll en las plantas se representan por un subgrupo de receptores quinasas LRR, que contiene entre otros los homólogos de BRI1 y RKS implicados a la vez en la transducci�n de señales de esteroides de la planta. Una de las vías moduladas por la se�alizaci�n de esteroides vegetales es la vía de la MAP quinasas intracelulares (FEBS Lett., 2001, 2, 346-50), que es en los sistemas animales un objetivo para la inhibición por los glucocorticoides (Curr Opin Pharmacol.,

2003, 3, 404-11). Estos datos condujeron a la hipótesis de que la se�alizaci�n de esteroides vegetales y la se�alizaci�n de SA muestra interferencia extensa entre s�, y que media esta interacción usando vías similares y productos g�nicos como en los sistemas animales. Cada uno de estos compuestos de se�alizaci�n por s� mismo es capaz de regular las respuestas de resistencia, para las cuales usan los procesos intracelulares que parcialmente se superponen.

Recientemente se estableció que la sobreexpresi�n de un receptor RKS de este tipo induce un mayor nivel de resistencia a pat�genos en una planta. Un nivel claramente más alto, debido a que parece que ya existe un nivel end�geno (bajo) del compuesto de se�alizaci�n, el cual es capaz de estimular el receptor, que establece la cascada, se discutió anteriormente, funcionando y que conduce después a un nivel (bajo) de resistencia inducida. Esto es ventajoso en particular, debido a que proporciona ya un nivel de resistencia sin la necesidad de aplicar adicionalmente el compuesto de se�alizaci�n. Más aun, trae también un aumento de la sensibilidad de la cascada corriente abajo, lo que hace posible el uso de ligandos, que pueden estimular los compuestos de la cascada corriente abajo para aumentar el nivel de resistencia. Estos ligandos pueden, entre otros, seleccionarse del grupo consistente de SPL, At4g14400, At4g23130, NPR1, At2914610, At2g14560 y otras proteínas que forman parte de la cascada corriente abajo. Desde que pareció que existe interferencia entre la cascada anti-patog�nica de brasinoesteroides y por ejemplo, la cascada de la resistencia a pat�genos SA, es posible que la aplicación de otros factores, tales como esteroides vegetales, inductores de pat�genos o fragmentos de los mismos, SA, JA y p�ptidos extracelulares con una función de se�alizaci�n como GASA o sistemina o fragmentos de estos p�ptidos, se pueden usar también para impulsar la cascada activada. Como consecuencia, es posible sustituir una molécula de señal, que puede ser indeseable de usar bajo ciertas condiciones (por ejemplo, debido a la toxicidad, cuestiones medioambientales, etc.) por un ligando que actúa sobre la cascada corriente abajo. Se encontr� además que la sobreexpresi�n del receptor RKS para mejorar la resistencia se une a una capacidad óptima. Aparentemente, el exceso de receptor puede resultar en la sobreestimulaci�n de la cascada corriente abajo, lo que sugiere que est�-regulado por mecanismos de inhibición (ver Fig. 4 y 7). Por lo tanto, cuando las plantas se proporcionan con un constructo genética que codifica para un receptor de un compuesto de se�alizaci�n, se debe tener cuidado para no elegir los más altos expresores, sino más bien probarlos para los parámetros de resistencia óptima . Tales pruebas, que son fácilmente realizables por una persona con experiencia en la técnica, se describen más abajo en la presente. Básicamente, hay diversos métodos para determinar la resistencia óptima, tales como: 1) realizar los ensayos de resistencia, tal como el ensayo ATTA (Cell, 1996, 87, 1307-1316); y 2) determinar la cantidad de genes marcadores, como PR -1 o At2g14560 (un gen bajo el control transcripcional directo de NPR1, fuertemente inducido por SA y la aplicación de brasinoesteroide (Plant Physiology 2005, 137, 1147-1159; Science 2005, 308, 1036-1040)) o At3946090 (ZAT7) o At2932200 (también ver Fig. 9 y 10). La posibilidad de usar genes, con la expresión modificada después de la sobre-expresión en plantas de RKS4 u otro receptor RKS, como marcadores (como se indica en el método 2) anterior) ofrece la posibilidad de diseñar ensayos para la optimización del cebado de plantas transg�nicas o no transg�nicas a través del rociado.

Los receptores RKS, de los cuales RKS1, RKS4, RKS7, RKS11 y RKS14 son los receptores más preferidos (ver por ejemplo documento WO 04/007712). La mayoría de estos receptores y sus respectivas secuencias de codificación se aislaron de Arabidopsis. Sin embargo, los receptores ort�logos de otras plantas y las secuencias de codificación para estos receptores, que aún no se han aislado, se pueden usar también. Se cree que estas secuencias de codificación ser�n homólogas a las secuencias descritas en las referencias anteriormente mencionadas. As�, en principio, cualquier secuencia de nucleótidos, que sea homóloga a dichas secuencias y que codifique para una proteína que, al menos, funcione como un receptor del compuesto señal sist�mica puede ser útil. Estas secuencias de nucleótidos se pueden aislar de plantas que expresan receptores ort�logos, sin embargo, estas secuencias de nucleótidos se pueden fabricar también modificando las secuencias de nucleótidos existentes, que pueden codificar después para mute�nas de los receptores ya conocidos.

Las mute�nas de los receptores de la invención son proteínas que se obtienen a partir de los receptores ya conocidos mediante la sustitución, adición y/o deleci�n de uno o más amino�cidos, mientras que mantengan todavía su función como receptor de los compuestos de se�alizaci�n sist�micos. Tales mute�nas se pueden fácilmente fabricar por ingeniería de proteínas, por ejemplo, cambiando el marco de lectura abierto capaz de codificar la proteína tal que se afecta de ese modo la secuencia de amino�cidos. Mientras que los cambios en las secuencias de amino�cidos no supriman por completo la actividad de la proteína, tales mute�nas se abarcan en la presente descripción. Más aun, debe entenderse que las mute�nas deben ser derivables de los receptores conocidos, mientras que retienen la actividad biológica, es decir, todos, o una gran parte de los compuestos intermedios entre la mute�na y la proteína que se describen en la lista de secuencias deben ser capaces de ser inducidos por los compuestos de se�alizaci�n sist�mica. Una gran parte puede significar 30% o más de los compuestos intermedios, preferentemente 40% de más, con mayor preferencia 50% o más, con mayor preferencia 60% o más, con mayor preferencia 70% o más, con mayor preferencia 80% o más, con mayor preferencia 90% o más, con mayor preferencia 95% o más, con mayor preferencia 99% o más.

As�, se describen además los receptores que son al menos 70% idénticos a las proteínas conocidas, pero con mayor preferencia más de 80% idénticos, con mayor preferencia más de 90% idénticos y con mayor preferencia más de 95% idénticos a los receptores conocidos que se discutieron anteriormente. Para el cálculo del porcentaje de identidad se

puede usar el algoritmo BLAST (Nucl. Acids Res., 1997, 25, 3389-3402) usando los parámetros por omisión o, alternativamente, el algoritmo GAP (J. Mol. Biol., 1970, 48, 443-453), usando los parámetros por omisión, ambos se incluyen en el paquete de programa de genética de Wisconsin, Grupo de Computación de Genética (GCG), 575 Science, Madison, Wisconsin, Estados Unidos. Las búsquedas BLAST asumen que las proteínas se pueden modelar como secuencias aleatorias. Sin embargo, muchas proteínas reales comprenden regiones de secuencias no aleatorias, que pueden ser extensiones homopolim�ricas, repeticiones cortas, o regiones enriquecidas en uno o más amino�cidos. Tales regiones de baja complejidad pueden estar alineadas entre proteínas no relacionadas a pesar de que otras regiones de la proteína sean completamente diferentes. Un número de programas de filtro de baja complejidad se pueden emplear para reducir tales alineaciones de baja complejidad. Por ejemplo, los filtros de baja complejidad SEG (Comput. Chem.; 1993, 17, 149-163) y XNU (Comput. Chem., 1993, 17, 191-201) pueden emplearse solos o en combinación.

Como se usa en la presente descripción, 'secuencia de identidad' o 'identidad' u 'homología' en el contexto de dos secuencias de proteínas (o secuencias de nucleótidos) incluye la referencia a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean por correspondencia máxima en una ventana de comparación especificada. Cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia como referencia para las proteínas se reconoce que las posiciones de residuos que no son idénticas difieren frecuentemente en las sustituciones conservadoras de amino�cidos, donde se sustituyen los amino�cidos de otros residuos de amino�cidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en las sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de las sustituciones. Las secuencias, que difieren en tales sustituciones conservadoras se dice que tienen 'similitud de secuencia' o 'similitud'. Los medios para realizar estos ajustes son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Típicamente esto implica calificar una sustitución conservativa como una parcial en lugar de un desajuste completo, de ese modo aumenta el porcentaje de identidad de secuencia. As�, por ejemplo, cuando se da una puntuación de 1 a un amino�cido idéntico y una sustitución no-conservadora se le da una puntuación de cero, una sustitución conservadora se le da una puntuación entre 0 y 1. La puntuación de las sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, de acuerdo con el algoritmo de Meyers y Miller (Computer Applic. Biol. Sci., 1998, 4, 11-17).

Como se usa en el presente documento, 'porcentaje de identidad de secuencia' significa el valor determinado por la comparación de dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de amino�cidos o secuencia de nucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) en comparación con la secuencia de referencia para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que el amino�cido idéntico o residuo de base de ácido nucleico ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

En general, no todos los amino�cidos de una proteína y no todos los nucleótidos de una secuencia de nucleótidos son igualmente intercambiables. En la mayoría de los casos las proteínas tienen una o más regiones que son importantes o cruciales para la función. Para los receptores RKS de la invención, es fácil determinar las regiones menos variables mediante la alineación de las secuencias (que se pueden encontrar en documento WO 04/007712) ) y la determinación de las llamadas secuencias de consenso, es decir, partes de la proteína que est�n bien conservadas entre las secuencias homólogas con la misma función. Al tratar de diseñar variantes (o mute�nas) de los receptores RKS, estas secuencias de consenso deben mantenerse preferentemente intactas, mientras que otras regiones se pueden variar más. En el grupo de receptores RKS los más preferidos son RKS1, RKS4, RKS7, RKS11 y RKS14. Este subgrupo comparte las secuencias consenso específicas.

Es muy importante mencionar que los receptores parciales, por ejemplo, sólo (partes) el dominio extracelular o sólo el dominio intracelular o fragmentos del mismo son capaces de actuar como compuestos activos constitutivos en el complejo heterod�mero proteína receptor . Nuestros resultados indican que la parte N -terminal de RKS4 (el dominio extracelular) puede actuar como un activador constitutivo de la respuesta a brasinoesteroides con respecto a la resistencia (Figura 5) y posiblemente también la eficacia biológica de la planta como se ilustra por el aumento en el tamaño del órgano y el peso fresco (Figuras 7 y 8).

Cuando, en la presente invención se menciona la parte N- terminal de un receptor RKS, se denota el dominio extracelular de dicho receptor RKS. Una persona con experiencia en la técnica comprender� que parte del receptor se denota por el dominio extracelular. Además en el documento WO 04/007712) se indican los dominios extracelulares de los receptores RKS.

Las secuencias de nucleótidos necesitarán que se expresen en la planta(s) en la que se transforman. Para esto se necesita un constructo genético (casete de expresión) que comprende una secuencia de nucleótidos expresable. La expresión de la secuencia de nucleótidos depende de los elementos operativos contenidos en un constructo de este tipo, tales como un promotor, un terminador, y elementos potenciadores.

El término "promotor" pretende significar una secuencia corta de ADN en la que se unen el ARN polimerasa y/o otros factores de iniciación de la transcripción antes de la transcripción del ADN a la que el promotor se conecta funcionalmente conectado, permitiendo que la transcripción tenga lugar. El promotor usualmente est� situado corriente arriba (5 ') de la secuencia de codificación. En su alcance más amplio, el término "promotor" incluye el sitio de unión de ARN polimerasa, as� como los elementos de la secuencia reguladora ubicada dentro de diversos cientos de pares de bases, incluso ocasionalmente más lejos, del sitio de inicio de la transcripción. Tales secuencias reguladoras son, por ejemplo, secuencias que est�n implicadas en la unión de factores de proteína que controlan la efectividad de la iniciación de la transcripción en respuesta a condiciones fisiológicas. La región promotora debe ser funcional en la célula huésped y corresponde preferentemente a la región del promotor natural de la proteína receptor. Sin embargo, cualquier región heter�loga del promotor se puede usar tanto como sea funcional en la célula huésped donde se desea la expresión. El promotor heter�logo puede ser ya sea constitutivo, específico de tejido o de desarrollo o regulable. Un promotor constitutivo tal como el promotor CaMV 35S o promotores de T-ADN, todos bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica, son promotores, que est�n sometidos a sustancialmente ninguna regulaci�n tales como la inducción o represión, pero que permite una transcripción constante y sustancialmente sin cambios de la secuencia de ADN a la que est� unido funcionalmente en todas o la mayoría de las células activas del organismo proporcionando que se cumplan otros requisitos para la transcripción tenga lugar. Un promotor tejido-específico es un promotor, que restringe la expresión de la secuencia codificante de una parte limitada de la planta, es decir, un tejido especial y/o un tipo de célula especial. Un promotor tejido-específico frecuentemente usado es el promotor de Rubisco (que es específico para partes verdes de las plantas). Un promotor regulable o inducible es un promotor cuya función est� regulada por uno o más factores, ya sea internamente presente o externamente añadido (Trends in biotechnology 2005, 23, 283-290). En la ausencia de un inductor, la secuencia de ADN no se transcribir� o se transcribir� a un nivel reducido con respecto a los niveles de transcripción en presencia de un inductor. En algunos casos, un factor puede unirse específicamente a un promotor inducible para activar la transcripción, dicho factor est� presente en una forma inactiva y convertible (ya sea directa o indirectamente) a una forma activa por el inductor El inductor puede ser un agente bioquímico/químico, tal como una proteína, metabolito (azúcar, alcohol, etc) un regulador de crecimiento, herbicida, o un compuesto fen�lico. Alternativamente, el inductor puede ser un estr�s fisiológico impuesto directamente (por ejemplo, calor, sal, herida, elementos tóxicos, etc) o un estr�s fisiológico impuesto indirectamente (por ejemplo, la acción de un pat�geno o agente de la enfermedad, tal como un virus). Una célula de planta que contiene un promotor inducible puede estar expuesta a un inductor mediante la aplicación externa del inductor a la célula, tales como por rociado, riego, calentamiento, o métodos similares. Ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor inducible de choque térmico de 70 kD de Drosophila melanogaster (Ann. Rev. Genet., 1985, 19, 297-323) y el promotor de alcohol deshidrogenasa que es inducido por etanol (Nagao, R.T. y otros, en: Miflin, B.J. (ed.) Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology, Vol. 3., p�gs. 384-438, Oxford Univ. Press, 1986). Los ejemplos de promotores que son inducibles por un sustancia química simple se describen en Gurr y Rushton (Trends in biotechnology 2005, 23, 283-290), WO 90/08826,WO 93/21334, WO 93/031294 y WO 96/37609.

Un terminador es un segmento corto de ADN que sirve para terminar la transcripción del ADN en ARN y se selecciona preferentemente del grupo que consiste de secuencias terminadoras de la transcripción de la planta, secuencias terminadoras de la transcripción de bacterias y secuencias terminadoras de virus de plantas conocidas por aquellos con experiencia en la técnica.

Elementos potenciadores (tal como el potenciador 35S) y otros elementos como regiones de unión al andamio (SARs) se pueden usar para aumentar la expresión de los genes de la invención. Es posible además reforzar la expresión por la introducción de un intr�n (por ejemplo, el Adh-intr�n) en el marco de lectura abierto o usar secuencias potenciadoras virales.

El término "gen" se usa para indicar una secuencia de ADN, que est� implicada al producir una cadena polipept�dica y que incluye regiones que preceden y siguen a la región de codificación (secuencias 5'-corriente arriba y 3'-corriente abajo), as� como secuencias que intervienen, los llamados intrones, que se colocan entre los segmentos codificantes individuales (los llamados exones) o en la región 5'-corriente arriba o 3'-corriente abajo. La región 5'-corriente arriba puede comprender una secuencia reguladora que controla la expresión del gen, típicamente un promotor. La región 3' corriente abajo puede comprender secuencias, que est�n implicadas en la terminación de la transcripción del gen y opcionalmente secuencias responsables de la poliadenilaci�n del transcrito y de la región 3' sin traducir.

En las células eucariotas, un casete de expresión por lo general comprende, además, una región de terminación transcripcional situada corriente abajo del marco de lectura abierto, lo que permite terminar la transcripción y ocurrir la poliadenilaci�n del transcrito primario. Adicionalmente, el uso de codones se puede adaptar para aceptar el uso de codones del huésped de elección. Los principios que regulan la expresión de un constructo de ADN en una célula huésped elegida se entiende comúnmente por las personas de habilidad ordinaria en la técnica y la construcción de constructos de ADN expresables es ahora de rutina para cualquier tipo de célula huésped, ya sea procariota o eucariota.

Para que el marco de lectura abierto sea mantenido en una célula huésped por lo general se proporcionar� en la forma de un replic�n que comprende dicho marco de lectura abierto de acuerdo con la invención unido al ADN, que se reconoce y replica por la célula huésped elegida. En consecuencia, la selección del replic�n se determina en gran medida por la célula huésped de elección. Tales principios como regulan la selección de los replicones adecuados para un huésped elegido en particular est�n bien dentro del ámbito de la persona ordinaria experta en la técnica.

Un tipo especial de replic�n es uno capaz de transferir en s�, o una parte de este, a otra célula huésped, tal como una célula de planta, de ese modo co-transfiriendo el marco de lectura abierto de acuerdo con la invención a dicha célula de la planta. Los replicones con tal capacidad se denominan en la presente descripción como vectores. Un ejemplo de tal vector es un vector Ti-pl�smido, que, cuando est� presente en un huésped adecuado, tal como Agrobacterium tumefaciens, es capaz de transferir parte de s� mismo, la llamada región T, a una célula de la planta. Ahora se est�n usando de de forma rutinaria diferentes tipos de vectores Ti-pl�smido (ver: EP 0 116 718 B 1) para transferir secuencias de ADN en células de plantas, o protoplastos, a partir de lo cual se pueden generar nuevas plantas que incorporan de forma estable dicho ADN en sus genomas. Una forma particularmente preferida de vectores Ti-pl�smido son los llamados vectores binarios (como se reivindica en EP 0 120 516 B1 y US 4,940,838). Otros vectores adecuados, que se pueden usar para introducir ADN de acuerdo con la invención en un huésped de planta, se puede seleccionar a partir de los vectores virales, por ejemplo, vectores virales no integrativos de la planta, tal como se deriva de los virus de doble cadena de planta (por ejemplo CaMV) y virus de cadena simple, virus Gemini y similares. El uso de tales vectores puede ser ventajoso, particularmente cuando es difícil transformar de manera estable el huésped de planta. Tal puede ser el caso de las especies leñosas, especialmente árboles y vides.

La expresión "células huésped que incorporan una secuencia de ADN de acuerdo con la invención en su genoma" significar� que comprende células, as� como organismos multicelulares que comprenden tales células, o consistente de esencialmente tales células, que incorporan dicho ADN en su genoma manteniendo de este modo el ADN, y preferentemente, transmitiendo una copia de tal ADN a células de la progenie, ya sea a través de la mitosis o la meiosis. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención se proporcionan plantas, que esencialmente consisten de células que incorporan una o más copias de dicho ADN en su genoma, y que son capaces de transmitir una copia o copias a su progenie, preferentemente en una forma Mendeliana En virtud de la transcripción y traducción del ADN de acuerdo con la invención en algunas o todas las células de la planta, aquellas células que son capaces de producir el (los) receptor (es) para los compuestos de señales sist�micas mostrarán una resistencia mejorada a las infecciones por pat�genos.

La transformación de especies de plantas es ahora una rutina para un número impresionante de especies de plantas, que incluyen tanto las Dicotiled�neas as� como la Monocotiled�neas. En principio, cualquier método de transformación se puede usar para introducir el ADN quimérico de acuerdo con la invención en una célula antecesora adecuada, siempre y cuando las células sean capaces de regenerarse en plantas completas. Los métodos se pueden seleccionar adecuadamente a partir del método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Nature, 1982, 296, 72-74; Plant Mol. Biol., 1987, 8, 363-373), electroporaci�n de protoplastos (Bio/Technol., 1985, 3, 1099-1102), microinyecci�n en material vegetal (Mol. Gen. Genet., 1986, 202, 179-185), (ADN o ARN-recubierto) bombardeo de partículas de varios materiales vegetales (Nature, 1987, 327, 70), infección con virus (no integradores) y similares. Un método preferido de acuerdo con la invención comprende transferencia de ADN mediada por Agrubacterium. Especialmente preferido es el uso de la llamada tecnología de vector binario como se describió en EP A 120 516 y patente de Estados Unidos 4,940,838.

La transformación se puede facilitar por el uso de marcadores seleccionables o rastreables para discriminar entre las plantas transformadas o células de plantas y plantas no transformadas o células de plantas. Sin embargo, se pueden usar posiblemente los llamados protocolos de transformación de marcador libre tal como se describió por ejemplo en WO 01/29240.

Generalmente, después de la transformación se seleccionan células de la planta o agrupaciones de células para la presencia de uno o más marcadores que se codifican por genes expresables en las plantas co-transferidos con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención, donde después el material transformado se regenera en una planta completa. Los genes que se pueden usar como genes marcadores se pueden dividir más o menos en los genes marcadores de resistencia a antibióticos, tales como nptII (dando resistencia a kanamicina) y hpt (dando resistencia a la fosfonotricina), y genes marcadores de selección de desarrollo o metabólicos, tales como el gen de trehalasa, el gen de la manosa (ambos marcadores metabólicos) y el gen IPT o los genes del receptor quinasa RKS (marcadores de desarrollo). Para la transformación sin marcador es posible usar el sistema T/R descrito previamente basado en la actividad transitoria para la regeneración de productos g�nicos WO9743427, o integración estable para productos g�nicos regeneradores inducible.

Aunque se consideran algo más desafiante para conseguir la transformación genética, las plantas monocotiled�neas son susceptibles a la transformación y se pueden regenerar plantas transg�nicas fértiles a partir de células o embriones transformados, u otro material vegetal. En la actualidad, los métodos preferidos de transformación de monocotiled�neas son el bombardeo con microproyectiles de embriones, explantes o células en suspensión, y la absorción directa de ADN

o electroporaci�n (Shimamoto, y otros, 1989, Nature 338, 274-276). Plantas de maíz transg�nico se han obtenido introduciendo el gen bar de Streptomyces hygroscopicus bar-gene, que codifica la fosfinotricina acetiltransferasa (una enzima que inactiva el herbicida fosfinotricina), en células embriog�nicas de un cultivo en suspensión de maíz por bombardeo de microproyectiles (Plant Cell, 1990, 2, 603-618). Se ha informado la introducción de material genético en protoplastos de aleurona de otros cultivos de monocotiled�neas tales como trigo y cebada (Plant Mol. Biol., 1989, 13, 21-30). Las plantas de trigo se han regenerado a partir de cultivo embriog�nico en suspensión seleccionando solamente los tejidos de callo embriog�nicos compactos y nodulares envejecidos para el establecimiento de los cultivos embriog�nicos en suspensión (Bio/Technol., 1990, 8, 429-434). La combinación con sistemas de transformación para estos cultivos, permite la aplicación de la presente invención a monocotiled�neas.

Las plantas monocotiled�neas, que incluyen los cultivos de importancia comercial, tales como arroz y maíz son además susceptibles a la transferencia de ADN por cepas de Agrobacterium (ver WO 94/00977; EP 0 159 418 B1; Plant. Physiol., 1991, 95, 426-434; The Plant J., 1994, 6, 271-282).

A continuación de la transferencia de ADN y regeneración, las plantas transformadas putativamente se pueden evaluar, por ejemplo usando análisis Southern, para la presencia del ADN de acuerdo con la invención, número de copias y/o organización gen�mica. Después del análisis inicial, las plantas transformadas que muestran el número de copia deseado y el nivel de expresión del ADN recién introducido de acuerdo con la invención se pueden probar para niveles de resistencia contra un pat�geno.

Otras evaluaciones pueden incluir la prueba de resistencia a los pat�genos en condiciones de campo, chequeando la fertilidad, rendimiento, y otras características. Tal prueba se realiza ahora de forma rutinaria por las personas que tienen experiencia ordinaria en la técnica.

A continuación de tales evaluaciones, las plantas transformadas se pueden cultivar directamente, pero por lo general se pueden usar como líneas parentales en el cultivo de nuevas variedades (puras) o en la creación de híbridos y similares.

Estas plantas, que incluyen las variedades de plantas, con resistencia mejorada contra los pat�genos se pueden cultivar en el campo, en los invernaderos o en la casa o en otro lugar. Las plantas o partes comestibles de estas se pueden usar para la alimentación animal o consumo humano, o se pueden procesar para alimentos, piensos u otros propósitos, en cualquier forma de la agricultura o industria. La agricultura significar� que incluye la horticultura, arboricultura, cultivo de flores, y similares. Industrias que pueden beneficiarse a partir de material vegetal de acuerdo con la invención incluyen pero sin limitarse a la industria farmacéutica, la industria de fabricación de papel y pulpa, industria de la fabricación de azúcar, industria de la alimentos y piensos, fabricantes de enzimas y similares.

Las ventajas de las plantas, o partes de estas, de acuerdo con la invención son la disminución de la necesidad de tratamiento con pesticidas, reduciendo as� los costos de materiales, mano de obra, y contaminación del medio ambiente,

o prolongando la vida útil de los productos (por ejemplo, frutas, semillas, y similares) de tales plantas. Plantas para el propósito de esta invención significarán organismos multicelulares capaces de fotos�ntesis, y sujeto a algún tipo de enfermedad inducida por pat�genos. Ellos incluirán al menos las angiospermas, as� como las gimnospermas, monocotiled�neas as� como plantas como dicotiled�neas.

Uno de los objetivos de la invención es proporcionar una resistencia a pat�genos mejorada, manteniendo al mismo tiempo la eficacia biológica y rendimiento de las plantas Se ha demostrado (ver, por ejemplo. WO 04/007712) que la introducción de un receptor RKS indujo cambios fenot�picos en una planta. Sin embargo, los cambios que se inducen por la sobreexpresi�n de moléculas del receptor RKS no parecen reducir la eficacia biológica y rendimiento, pero parecen mejorar la eficacia biológica y rendimiento. As�, una ventaja adicional de inducir una resistencia a pat�genos mejorada proporcionando una planta con un constructo g�nico que codifica para un receptor RKS, es que la sobreexpresi�n de un receptor de este tipo aumenta además el rendimiento y/o la eficacia biológica general de las plantas.

Adem�s, si tales efectos se desean menos, puede ser preferible, para mantener la eficacia biológica óptima de las plantas, expresar tejido de moléculas de receptor específicamente, es decir, sólo en aquellos tejidos que son (más) susceptibles a la infección por pat�genos. Por supuesto, la elección de los tejidos depende además del pat�geno para el cual se solicita la protección: algunos de los agentes pat�genos sólo infectarán por ejemplo, las raíces de la planta, mientras que otros agentes pat�genos son específicos para las partes verdes o solamente la hoja o el tallo. Ser� comprensible que la expresión del receptor solamente en una parte limitada de la planta no da�ar� en gran medida la eficacia biológica de la planta, y mientras tanto ser� suficiente dar a la planta una resistencia mejorada contra las enfermedades.

Aunque las plantas transg�nicas, por s� mismas, mostrarán una susceptibilidad aumentada a los brasinoesteroides que se producirán por esas mismas plantas sist�micamente a nivel base o en cantidades más grandes después del ataque por pat�geno, es parte de la invención inducir una resistencia inducida mejorada por la aplicación de un compuesto

se�al sist�mico que se reconoce por el (los) receptor (es) para el cual la planta es transg�nica. Preferentemente los brasinoesteroides se aplican por rociado. Para la mayoría de las plantas de cultivo se sabe cuando son más vulnerables a la infección por pat�genos, o cuando los pat�genos, que usan tales plantas como huésped, son más patog�nicos. Para proteger de manera óptima estas plantas contra la enfermedad es aconsejable rociar estas plantas en un intervalo de tiempo, lo que permite construir la resistencia inducida, antes de que se espere el ataque del pat�geno.

Para proporcionar una prueba rápida y simple si una nueva especie de planta puede producir claramente una resistencia aumentada tras el rociado de un brasinoesteroide, una persona con experiencia en la técnica puede realizar una prueba de expresión transitoria rápida conocida bajo el nombre de ATTA (Agrobacterium tumefaciens Ensayo de Expresión Transitoria). En este ensayo (del cual se puede encontrar una descripción detallada en Van den Ackerveken, G., y otros. (Cell, 1996, 87, 1307-1316) la secuencia de nucleótidos que codifica para el receptor de elección se coloca bajo el control de un promotor constitutivo de planta y se introduce en una cepa de Agrobacterium que se usa además en los protocolos para la transformación estable. Después de la incubaci�n de la bacteria con acetosiringona o cualquier otro compuesto fen�lico que se conoce que mejora la transferencia de T-ADN de Agrobacterium, 1 ml del cultivo de Agrobacterium se infiltra in situ en una planta por inyección después que las plantas se colocan en un invernadero. Después de 2-5 días las hojas se pueden rociar con brasinoesteroides y al día siguiente se pueden probar para la resistencia a pat�genos, ya sea por aplicación de un pat�geno directamente en las hojas, o usando las hojas en el ensayo bien conocido de la hoja suelta. Es posible además no rociar activamente con el brasinoesteroide, sino usar el sistema de se�alizaci�n propio de la planta para la prueba de la resistencia aumentada de las partes de plantas no afectadas directamente.

Una prueba alternativa para detectar el nivel de resistencia es por el ensayo de marcadores de resistencia, es decir, moléculas que indican una resistencia aumentada a los pat�genos. Los marcadores, que se pueden usar en este sentido, son PR-1, que es un marcador para la inducción de ácido salicílico; At2g14560, que es un marcador para brasinoesteroide y la inducción de ácido salicílico, pero no para la inducción de auxina, y que est� bajo el control transcripcional directa de NPR1 (Plant Physiology 2005, 137, 1147-1159; Science 2005, 308, 1036-1040). La proteína dedo de zinc ZAT7 (At3g46090); y At2g32200, que codifican una molécula de se�alizaci�n pept�dica extracelular representan otros marcadores para respuestas de resistencia mediada por SAR (ver Figuras 6, 9 y 10). Otros genes con expresión modificada tras la sobreexpresi�n de RKS4 se pueden usar además como marcador. La abundancia de estos marcadores cuando se compara con los controles silvestres indica una resistencia a pat�genos mejorada en la planta.

Las cantidades intracelulares de estos marcadores son fáciles de determinar con ensayos estándar, que son bien conocidos por una persona con experiencia en la técnica (ver además la parte Experimental).

Las moléculas de ligando o los compuestos de señal, que se pueden aplicar para el rociado, son conocidos por la persona con experiencia en la técnica. Los brasinoesteroides son compuestos que se producen a granel y que est�n fácilmente disponibles. La concentración de los compuestos que se aplica depende de las características del compuesto en s�, la densidad de receptores end�genos y transg�nicos presentes en el tejido de la planta que se trata y la forma en que el compuesto se va a aplicar (por ejemplo, por rociado, a través de nutrientes o absorción en agua, etc.). Por ejemplo, los brasinoesteroides diseñados específicamente con función optimizada, y los antagonistas de la se�alizaci�n de brasinoesteroides, que interfieren con la unión normal de los brasinoesteroides activos, se pueden optimizar además basado en los sistemas reporteros moleculares basados en la detección cuantitativamente y cualitativamente de las respuestas intracelulares a los agonistas y antagonistas de brasinoesteroides. La detección optimizada de respuestas de resistencia mejoradas se puede determinar en diferentes fondos genéticos de plantas modelo, o en plantas mutadas para ciertas vías de se�alizaci�n.

Si se considera que mejora el efecto para proporcionar plantas con una mayor cantidad de moléculas de receptor para los compuestos de se�alizaci�n, un segundo constructo que codifica para uno o más de los compuestos intermedios corriente abajo de un procesador de este tipo puede ampliar los efectos potenciadores de resistencia. Los compuestos que pueden calificar para este enfoque se representan ya sea por productos g�nicos que transmiten la cascada de se�alizaci�n corriente abajo a partir del receptor, o productos g�nicos activados tras la activación del receptor. Un ejemplo de transmisión directa de la señal se proporciona por productos g�nicos del NHL y SPL, que han demostrado interactuar directamente como parejas de proteínas doble híbridos con proteínas de RKS. Un ejemplo de genes controlados en el nivel transcripcional por esta cascada de se�alizaci�n se representan por productos g�nicos implicados al inducir el cebado de resistencia, como el At2g14560 descrito previamente, o como alternativa At 4g14400 (una proteína con repeticiones de anquirina implicada que trae diferentes proteínas intracelulares juntas) y At4g23130 (un receptor quinasa transmembrana).

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Estrategias de clonaci�n.

La producción y expresión de los receptores se realiza por ejemplo a través del sistema de clonaci�n de puerta de enlace como se definió en (http://www.psb.rug.ac.be/gateway/).Los constructos de sobreexpresi�n se elaboran por la clonaci�n de clones de ADNc completos obtenidos de SALK RIKEN o en otro lugar, como se indicó por la herramienta de mapeo de gen de Arabidopsis (http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress), por ejemplo, por clonaci�n de recombinación usando secuencias del vector (iniciadores M13 directo y reverso o T7 y SP6/T3) y por ejemplo, fusion�ndolos a los sitios de recombinación B1 y B2 tal como se us� en la tecnología de clonaci�n de puerta de enlace. La recombinación en vectores de expresión binarios ect�picos se realiza, por ejemplo, por recombinación de puerta de enlace. La amplificación sola por PCR de los casetes de expresión y bombardeo de partículas posterior usando, por ejemplo la tecnología de transformación libre de marcador de T/R (WO 01/29240) se puede realizar posteriormente para la transformación de rutina de especies de plantas con el producto g�nico deseado. Un sistema inducible específico para la expresión se puede realizar en el mismo vector de clonaci�n de puerta de enlace donde se usan, los promotores inducibles como por ejemplo el promotor OPR1 de 1200 pb inducible por Tween 20 de Arabidopsis thaliana (Plant Mol Biol. 2001 Nov;47(5):595-605) o promotores inducibles de tejido o etapa como por ejemplo promotor de senescencia temprana CDPK1 (At1g18890) de 2000 pb (Mol Gen Genet., 1994, 244, 331-340). Receptores quiméricos se pueden construir usando la producción de RT-PCR de los diferentes dominios del receptor. La clonaci�n posterior (como se describió en Science, 2000, 288, 2360-2363) y la expresión de los receptores quiméricos resultantes se puede de nuevo realizar usando la clonaci�n de puerta de enlace y el sistema de expresión.

Ejemplo 2. La aplicación de los brasinoesteroides induce resistencia en las plantas

Dos líneas de Arabidopsis se usaron para el experimento; Ws-0, y Col-0. Pl�ntulas de nueve días de edad se rociaron con placebo-Silwet L-77 (0.01 %) o los brasinoesteroides (+ 0,01 % de Silwet L-77) Después de secar, las plantas se incubaron en la cámara de crecimiento de día largo (MPMI 2005, 18, 583-592). Después de dos días la mitad de las plantas se rociaron en sus hojas con Waco9 ( 50 espora/ÉL), una cepa de Peronospora parasitica (MPMI 2005, 18, 583592). Siete días post inoculación las plantas (40 pl�ntulas por línea) se calificaron para la esporulaci�n. El placebo se us� como un control. Las infecciones y análisis experimentales se realizaron como se describió previamente (MPMI 2005, 18, 583-592).

Los resultados (ver Fig. 2 y Tabla 1) mostraron que, dos días después del rociado el placebo y, la mezcla de brasinoesteroides, las plantas rociadas con brasinoesteroides se alargaron , pero después de seis días se veían casi igual que el placebo, sólo tratadas con 0.01 % Silwett-L77 en agua (sólo un poco más alargada . Además algunos de los cotiledones se habían vuelto al revés. Las plantas Col-0 y Ws-0 rociadas con brasinoesteroides mostraron menos esporulaci�n de Waco9 en comparación con el control de placebo, indicando as� la inducción de la resistencia por la aplicación de los brasinoesteroides.

Tabla I Resultados de la Esporulaci�n

Waco9 6 días pi

medio/pl�ntula Estándar

Col-0 MQ

34.49 21.48

Col-0 Bras

19.75 9.93

Ws-0 MQ

71.44 28.03

Ws-0 Bras

46.89 21.01

Ejemplo 3. Los receptores RKS median la percepción de brasinoesteroides.

La sobreexpresi�n de los genes de RKS resulta en las respuestas modificadas hacia diferentes concentraciones de brasinoesteroides en un bioensayo de respuesta de la raíz (Cell 2002, 110 203-112 & 213-222). La Figura 3 muestra que tanto líneas RKS10-OX como RKS4-OX muestran una sensibilidad aumentada a diferentes concentraciones de brasinoesteroides. Líneas knock out de RKS4, un gen que, en la raíz, se expresa específicamente en las iniciales de meristemas de la estela y en el tejido provascular, muestra por otra parte una fuerte disminución en la sensibilidad de brasinoesteroides como se ilustra por las raíces más largas en la concentración alta. Esto no sólo indica que RKS4 es una molécula reguladora importante durante el crecimiento de la raíz, sino que actúa además a través de la se�alizaci�n de los Brasinoesteroides. RKS4 controla tanto el alargamiento de las células como la velocidad de la división celular en varios órganos de la planta (ver la Figura 8 . Su expresión restringida en células meristem�ticas indica una función importante para el producto g�nico de RKS4 en el crecimiento, dependiendo de las concentraciones del receptor y de la hormona.

Para estudiar la función de RKS4 en detalle se siguieron tanto enfoques de ganancia como pérdida de función. El ADNc completo de RKS4 se expres� ect�picamente en plantas Arabidopsis Ws-0 bajo el control del promotor CaMV 35S y buscamos las líneas de inserción T-ADN en la colección SALK (Alonso y otros, 2003 disponible de NASC el Centro Europeo de reserva de semillas de Arabidopsis). Dos líneas de inserción, SALK_066568 y SALK_071166, renombradas

rks4-1 y rks4- 2, respectivamente, se estudiaron junto con las líneas de sobreexpresi�n (RKS4-OX) Los cambios en el nivel de ARNm del estado estacionario de RKS4 se verificaron por RT-PCR en 12d pl�ntulas (Figura 4), lo que demuestra que el gen de RKS4 se sobreexpresa, claramente en plantas RKS4-OX y que su mensajero completo ya no es detectable en cualquiera de las dos líneas de inserción T-ADN. Sin embargo, el extremo 5' del ARNm de RKS4 (corriente arriba de la inserción T-ADN) se transcribe todavía tanto en las líneas KO rks4-1 como rks4-2. En rks4-1 el nivel de mensajero truncado producido fue superior que en todas las otras muestras. Este fragmento corresponde al dominio extracelular del receptor RKS4. Los datos de la figura 4 muestran que la línea knock out rks4-1 muestra un nivel del 5'ARNm fuerte elevado en el estado estacionario en comparación con los niveles del silvestre del producto g�nico RKS4. Ambas líneas knock-out no expresan más ARNm completo de RKS4. Los resultados en la Figura 5 y los datos Q-PCR de los reporteros PR-1 y At2g14560 (Fig. 9 y 10) muestran que este fragmento tiene un efecto positivo en la resistencia a la enfermedad contra Pseudomonas y en los niveles de ARNm de los productos g�nicos reporteros de resistencia.

Un producto de la proteína N-terminal similar, la proteína LRP de tomate (homóloga de los productos g�nicos de ELS muy similar al dominio extracelular de RKS) ha sido descrito previamente por estar asociado con la infección viroide. Esta proteína LRP se procesa durante la patog�nesis por subtilisinas (Plant Journal 1996, 10, 315-330). Estas endoproteinasas específicas se implican al modular las respuestas de la planta hacia la invasión de pat�genos por la modificación específica de los productos g�nicos regulatorios dentro de la pared celular. Los cambios resultantes en la resistencia como se comprob� indican un papel para el dominio N-terminal de los productos g�nicos similares a RKS en la activación de la resistencia inducida dentro de la planta como se describe más abajo.

Un número de productos g�nicos de RKS se han demostrado que est�n involucrados en la resistencia viral, mediando la resistencia a un amplio espectro de Geminivirus (Genes and Development 2004, 18, 2545-2556). En la presente descripción la función end�gena de RKS 7, 14 y 1 se ha estudiado con respecto a su efecto sobre la infección viral. La infección de la planta con éxito result� depender de la supresión de estos receptores RKS por un factor NSP de virulencia v�rica. La proteína NSP de virulencia interact�a directamente con la proteína RKS, lo que resulta en la supresión de las respuestas antivirales (Virology 2004, 318, 24-31). Nuestros datos est�n de acuerdo con un papel de esta subclase de receptores RKS ya que las plantas cuya expresión de RKS4 se ha modulado muestran un mayor nivel de resistencia. La expresión ect�pica de RKS4 en Arabidopsis thaliana claramente, resulta en una reducción de aproximadamente el 50% de infección por Pseudomonas syringae (Figura 5). Es interesante señalar que este nivel de resistencia se aumenta además en la línea rks4-1 KO (Figura 5) en el que se aumenta el nivel de expresión del extremo 5' del mensajero (Figura 4). Esto sugiere una activación del receptor por una enzima proteol�tica. Estas plantas son resistentes además a Peronospora parasitica (Figura 5B), lo que sugiere un papel general para productos g�nicos de RKS de al menos este subgrupo al mediar la resistencia contra un variedad de pat�genos.

Ejemplo 4. Los genes de RKS regulan los diferentes genes marcadores de resistencia

En las plantas que sobreexpresan RKS4 el producto g�nico At2g14560, un marcador para la inducción de brasinoesteroides, pero no para la inducción de auxina, se regula positivamente (ver Figuras 9 y 10) El marcador At2g14560 est� bajo control transcripcional directo de NPR1, y est� fuertemente inducido por la aplicación SA (Plant Physiology 2005, 137, 1147-1159; Science 2005, 308, 1036-1040). Estos hallazgos est�n en completo acuerdo con la observación que PR-1, junto con otros marcadores de resistencia, se regula positivamente con fuerza en las plantas con niveles modificados de RKS4 en comparación con las plantas de control (ver Figuras 6, 9 y 10) . Concluimos a partir de estos resultados que la se�alizaci�n de brasinoesteroides mediada por RKS4 est� induciendo respuestas de se�alizaci�n SA dentro de la planta como se visualiza por la fuerte regulaci�n positiva de PR-1. Otros genes marcadores de resistencia altamente inducidos como el C2H2/ZAT7 (ver Figura 6), un producto g�nico regulador transcripcional (At3g46090) o el gen asociado a la resistencia At2g32200 se indujeron, respectivamente, 160 veces y 100 veces en plantas ect�picas que expresan RKS4.

Ejemplo 5. RKS indujo cambios fenot�picos

La observación de las plantas que sobreexpresan RKS4 revela una amplia variedad de cambios morfológicos, los efectos más dramáticos que se encuentran en las flores cuyo tamaño se aumenta drásticamente en RKS4-OX1 (Figura 7), pero permanece sin afectar en las plantas RKS4-OX2 y KO (datos no mostrados). Aunque no se realizó un análisis cuantitativo de todos los órganos florales este cambio de tamaño puede ser al menos correlacionado con un tamaño aumentado del pétalo. Como cuestión de hecho, pareció que el área de la superficie del pétalo en RKS4-OX1 se aument� en 60 % en comparación con el silvestre (Figura 7b). La medición del tamaño celular mostr� claramente que esto se caus� tanto por un aumento en el tamaño celular (37.6 %) como el número (16.3 %). Sin embargo no se observaron diferencias significativas en el RKS4-OX2 (Figura 7b, valor de p=0.09) o en las plantas rks4 knock-out (datos no mostrados). El último no es sorprendente ya que el gen RKS4 no se expresa en los pétalos. Sin embargo, la diferencia observada entre las dos líneas de sobreexpresi�n es más desconcertante y tiende a sugerir que la expresión de RKS4 por encima de un cierto nivel puede revertir la situación con la silvestre. La expresión alterada de RKS4 no

afect� la forma y tamaño de la silicua (datos no mostrados) frente al tamaño (como ya se mencion� anteriormente) y peso de la semilla (Figura 7f). El tamaño de la semilla, como se determin� por su longitud, es claramente reducido significativamente en las líneas KO, aunque sólo en un 5.2 % y 3.5 % para rks4-1 y -2, respectivamente. Lo contrario se observa en las líneas de sobreexpresi�n que, como en las flores, muestran un fuerte aumento en la longitud de RKS4-OX1 (27.6 %) y uno más débil , aunque significativo, en RKS4-OX2 (14.9 %). En términos de peso de la semilla las diferencias siguen la misma tendencia, pero son aún más extrema con 81.9 % y 33.7 % de semillas más pesadas para RKS4-OX1 y - OX2 , respectivamente. Las líneas KO por otra parte no muestran diferencia significativa. En particular los cambios de tamaño/peso de la semilla no afectaron la germinación de la semilla (datos no mostrados). Los cambios en el tamaño del embrión o contenido del endosperma no se investigaron, pero el tamaño del cotiled�n se midió postgerminaci�n (Figura 7e). Sorprendentemente, los cotiledones fueron claramente más grandes tanto en las líneas KO

(30.1 % para rks4-1 y 15.8 % para rks4-2), as� como en las líneas de sobreexpresi�n (61.7 % y 36.9 % para RKS4-OX1 y -OX2, respectivamente). Los cotiledones más grandes pueden justificar los embriones más grandes y por lo tanto un aumento en el peso y tamaño de la semilla como se observa en RKS4-OX1 y - OX2. Sin embargo, esto no est� de acuerdo con las semillas de rks4-1 y -2 que son más pequeñas que en las silvestres. Una observación más cercana puede explicar esta discrepancia. De hecho los cotiledones son más grandes en las líneas KO debido principalmente a un aumento en la división celular (15 % para rks4-1 y 10.7 % para rks4 -2). En las líneas de sobreexpresi�n por otra parte la división celular en realidad se disminuye en 15.5 % (RKS4-OX1) y 4.9 % (RKS4-OX2) y los cotiledones más grandes son por lo tanto sólo el resultado de un aumento extremo en la elongaci�n celular (más de 91.3 % y 43.9 %, respectivamente). Es interesante señalar que, la elongaci�n celular se aumenta as� como en rks4-1 (13.1 %) y contribuye as� como al cambio de tamaño de los cotiledones, pero no en rks4-2 (valor de p=0.38), que muestra, como en las semillas, una diferencia en la resistencia fenot�pica. El aumento de gran tamaño observado en los cotiledones de RKS4-OX1 fue visible además más tarde en el tamaño y la forma de sus hojas en roseta, especialmente en condiciones de día corto, dando rosetas extremadamente robustas con hojas más redondas y más anchas (Figura 7c-d). Sin embargo, al igual que en los pétalos, esto no fue el caso de RKS4-OX2 o las plantas KO que no mostraron diferencia significativa (datos no mostrados). Como se esperaba de su patrón de expresión, alterar los niveles de expresión de RKS4 afect� además el desarrollo de la raíz. La medición de las raíces de las pl�ntulas cultivadas en placas verticales, claramente revel� que, como en los cotiledones, el tamaño/longitud de la raíz aument� significativamente tanto en las líneas KO como de sobreexpresi�n (Figura 7g). La situación hasta el grado que el aumento sea preocupación es incluso idéntica (compare Figura 5e y g), con rks4-1, que muestra un aumento más fuerte que rks4-2 ( 74 % vs 65.9 %) y RKS4-OX1 que muestra el mayor aumento de todos (83.7 %), incluyendo RKS4-OX2 que es de nuevo menos extremo, con solamente 52.7 %. Para investigar la naturaleza de este aumento se hizo uso de un marcador de la actividad mit�tica descrito por Col�n-Carmona y otros (1999), el cual se cruzó en líneas RKS4-OX (Figura 7h) El análisis cuantitativo del número de células positivas a GUS en los ápices de las raíces mostr� que la velocidad de división celular se redujo dramáticamente en RKS4-OX1, pero no se cambi� significativamente en RKS4-OX2 (Figura 7i), lo cual est� más o menos de acuerdo con la reducción limitada (4.9 %) observada en el tamaño del cotiled�n (Figura 8e). A pesar de la reducción de 3 veces en la división celular observada en RKS4-OX1, la longitud de la raíz se aumenta todavía en 84 % indicando que como en los cotiledones el aumento de tamaño en las raíces se causa por un aumento dramático en la elongaci�n celular. En las líneas KO sin embargo todavía no hemos sido capaces de investigar si la situación corresponde además a la observada en los cotiledones, es decir, un aumento tanto en la elongaci�n como la división celular que justificaría raíces más largas.

La suma de estas observaciones est� de acuerdo con la actividad del promotor de RKS4 y sugiere que el receptor RKS4 se implica en el mantenimiento del tamaño de los órganos en los que se expresa. El hecho de que un aumento y una disminución de su expresión puede conducir tanto a órganos más grandes (excepto en las semillas), sugiere un requisito para un nivel específico del receptor RKS4 en un tamaño del órgano óptimo para el mantenimiento constante. Aunque la pérdida de la función del receptor no dio lugar a fenotipos tan dramáticos como su sobreexpresi�n est� claro que en la división celular de RKS4 knockouts se estimula al menos en los cotiledones y tal vez en las raíces, as� mientras lo contrario se observa en los mismos órganos de las plantas con sobreexpresi�n, confirmando que la división celular se puede reprimir/mantener bajo un cierto nivel por RKS4. Por otra parte, esto no se observ� en los pétalos donde la sobreexpresi�n de RKS4 estimul� la división celular as� como la elongaci�n. Sin embargo RKS4 normalmente no se expresa en los pétalos y podemos tener a la vista un efecto pleiotr�pico debido a una interacción ect�pica que puede no representar la función end�gena del receptor. Es interesante señalar en la línea RKS4-OX2 que muestra una expresión más fuerte de RKS4 los fenotipos observados son más leves que en la otra línea de sobreexpresi�n o aun ausente, al igual que en los pétalos. Esto probablemente indica que un nivel de saturación se ha alcanzado en el número de receptores producidos conduciendo a efectos más débiles.

La influencia de las condiciones de luz en los fenotipos observados durante el crecimiento vegetativo y la implicación conocida de los brasinoesteroides en la modulación de fotomorfog�nesis est�n de acuerdo con un papel de RKS4, en concordancia con la literatura sobre RKS 10 (BAK1/AtSERK3) en la se�alizaci�n de brasinoesteroide (BR) como se ilustr� además por el ensayo de crecimiento de las raíz descrito aquí anteriormente.

En conclusión, los productos g�nicos de RKS se implican en la percepción de brasinoesteroide. La modulación de estos receptores resulta en niveles elevados de resistencia contra diferentes pat�genos como bacterias Pseudomonas y virus.

Las plantas con niveles modificados de RKS no muestran solamente resistencia a la enfermedad de amplio espectro, sino muestran además las características de eficacia biológica inducida.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para mejorar la resistencia a pat�genos en las plantas con respecto al nivel que se alcanza por el nivel end�geno del compuesto de se�alizaci�n en dichas plantas por la sobreexpresi�n de un receptor RKS

   5 proporcionando estas plantas con un constructo g�nico que comprende una secuencia de ADN que codifica para dicho receptor RKS seleccionado de los genes Arabidopsis de RKS0, RKS1, RKS2, RKS3. RKS4, RKS5, RKS6, RKS7, RKS8, RKS10, RKS11, RKS12, RKS13 y RKS14 como se describió en WO 2004/007712, o receptores ort�logos de otras plantas.

   10 2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, que aumenta por célula el número de moléculas de receptor.

2. 3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en donde la secuencia de ADN que codifica para el receptor est� bajo el control de un receptor específico de tejido o desarrollo o un promotor regulable (inducible).

   15 4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el receptor se escoge del grupo que consiste de RKS1, RKS4, RKS7 y RKS14.

3. 5. M método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en donde las plantas se proporcionan con el receptor RKS y uno o más receptores seleccionados del grupo que consiste del receptor de ácido jasm�nico

   20 (posible codificado por el gen JAI-1) y el receptor de ácido salicílico (posiblemente codificado por genes homólogos COX2 de planta) .
4. 6. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichas secuencias de ADN codifican para la parte Nterminal (dominio extracelular) de un receptor RKS.

5. 7.

   M�todo de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la parte N-terminal se produce por un receptor truncado por la aplicación (end�genamente o por aplicación externa) de una proteasa extracelular.

6. 8.

   M�todo de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha proteasa extracelular es una subtilisina.

7. 9.

   Planta producida por un método de acuerdo con la reivindicación 6-7 y descendencia de esta en donde dicha descendencia contiene todavía la sensibilidad aumentada para la resistencia inducida.

8. 10.

   M�todo para inducir resistencia a pat�genos en una planta que se proporciona con un receptor RKS

   35 seleccionado de los genes de Arabidopsis de RKS0, RKS1, RKS2, RKS3. RKS4, RKS5, RKS6, RKS7, RKS8, RKS10, RKS11, RKS12, RKS13 y RKS14 como se describió en WO 2004/007712, o receptores ort�logos de otras plantas, mediante el rociado de una planta de este tipo con un brasinoesteroide.