ES2476896T3

ES2476896T3 - Sistema de cultivo celular para determinar el efecto sensibilizante, alerg�nico y/o irritante de una sustancia

Info

Publication number: ES2476896T3
Application number: ES09792367.6T
Authority: ES
Inventors: Manfred Schmolz
Original assignee: Rules Based Medicine Inc
Current assignee: Myriad RBM Inc
Priority date: 2008-09-10
Filing date: 2009-09-09
Publication date: 2014-07-15
Anticipated expiration: 2029-09-09
Also published as: EP2353001A1; WO2010030655A1; US9176116B2; CA2736485C; EP2353001B1; US20120129162A1; US20100068719A1; JP2012501660A; CA2736485A1; EP2735873A1; DK2353001T3

Abstract

Un método para estudiar el efecto sensibilizante, alergénico y/o irritante de un agente, que comprende: a) poner en contacto la superficie de un modelo de epidermis contenido en un primer compartimento, con el agente; y b) determinar la actividad de un cultivo celular de células inmunológicas contenido en un segundo compartimento, en el que el primer compartimento y el segundo compartimento están separados por una capa intermedia permeable, en el que la presencia de una célula inmunológica activada en el segundo compartimento indica que el agente es un alergeno o un agente irritante, y en el que la actividad de las células inmunológica se determina realizando una o más de las siguientes etapas: identificar la proliferación de las células inmunológicas; medir los marcadores de superficie de las células inmunológicas; medir los componentes de transducción de señales de las células inmunológicas; medir las citoquinas intracelulares de las células inmunológicas; y analizar los niveles de ARN mensajero dentro de las células inmunológicas.

Description

Sistema de cultivo celular para determinar el efecto sensibilizante, alerg�nico y/o irritante de una sustancia

Antecedentes

La alergia es un trastorno del sistema inmunol�gico que incluye la atop�a. Las reacciones alérgicas se producen en respuesta a sustancias ambientales conocidas como alergenos; estas reacciones son adquiridas, predecibles y rápidas. La alergia se caracteriza por una activación excesiva de ciertos leucocitos, conocidos como células cebadas, y bas�filos, por un tipo de anticuerpo, conocido como IgE, que provoca una respuesta inflamatoria extrema. Las reacciones alérgicas comunes incluyen eccema, urticaria, fiebre del heno, asma, alergias alimentarias, y reacciones al veneno de insectos que pican, tales como avispas y abejas.

Se conocen diferentes tipos de alergenos. Los alergenos inhalados incluyen polvo o aerosoles, por ejemplo, polen o polvo doméstico. Los alergenos alimentarios son sustancias contenidas en los alimentos a las que el cuerpo reacciona mediante hipersensibilizaci�n (reacciones alérgicas). Los alergenos de productos medicinales comprenden ciertas sustancias activas en productos medicinales, por ejemplo, antibióticos o analgésicos. Un grupo particularmente importante de sustancias alerg�nicas son los alergenos por contacto. Estos pueden provocar una reacción alérgica en los afectados a través del contacto con la piel. Ciertos metales y sustancias odor�feras pertenecen a los alergenos por contacto.

En décadas recientes, en especial en los países occidentales industrializados, se ha observado un aumento repentino en el número de alergenos. Muchas sustancias alerg�nicas son ingredientes en cosméticos u otras sustancias de aplicación típica (composiciones para la aplicación externa local). Los cosméticos o agentes t�picos se ensayan por sus propiedades alerg�nicas mediante experimentos en animales. Por tanto, los descubrimientos obtenidos solo tienen un valor limitado, porque los animales experimentales no siempre reaccionan a los mismos alergenos que los seres humanos y viceversa. Esta situación con frecuencia produce resultados falsos positivos y falsos negativos. Además, también existen problemas prácticos y �ticos asociados con el ensayo en animales.

El documento US 2001/0049115 describe un ensayo in vitro para ensayar el efecto inmunomodulador de un material de ensayo, que comprende colocar un soporte microporoso que tiene una monocapa de células epiteliales contenida en él, para que se ponga en contacto con un medio nutriente en un pocillo de cultivo.

En vista del estado de los ensayos para la actividad alerg�nica, son necesarias nuevas herramientas y métodos eficaces para determinar la actividad alerg�nica.

Sumario

La presente invención se refiere en general a un sistema de cultivo celular para determinar el efecto sensibilizante, alerg�nico y/o irritante de diversas sustancias.

En una realización, la presente invención se dirige a un sistema de cultivo celular para determinar el efecto sensibilizante, alerg�nico y/o irritante de sustancias, que comprende: a) un primer compartimento que comprende un modelo de epidermis; y b) un segundo compartimento que comprende un cultivo celular basado en células inmunol�gicas, en el que el primer y segundo compartimento est�n separados por una capa intermedia permeable, y en el que un alergeno o agente irritante introducido en el primer compartimento activa a las células inmunol�gicas del segundo compartimento. En una realización concreta, las células inmun�logicas son células presentadoras de ant�genos, por ejemplo, macr�fagos y/o células dendr�ticas. En una realización concreta, las células inmunol�gicas son linfocitos, en particular linfocitos B y/o linfocitos T. En una realización concreta, las células inmunol�gicas presentan ant�genos de compatibilidad tisular concordantes. En una realización concreta, el cultivo de células inmunol�gicas est� sustancialmente exento de células tisulares. En una realización concreta, las células inmun�logas se derivan de un ser humano. En una realización concreta, las células inmunol�gicas se aislan a partir de sangre. En una realización concreta, el modelo de epidermis tiene una estructura en capas. En una realización concreta, el modelo de epidermis tiene multiples capas, por ejemplo, el modelo de epidermis puede comprender al menos una capa de epidermis seleccionada del grupo que consiste en estrato c�rneo, estrato lúcido, estrato granuloso, estrato espinoso y estrato basal. En una realización concreta, el modelo de epidermis comprende células epid�rmicas vivas, por ejemplo, queratinocitos. En una realización concreta, el modelo de epidermis est� sustancialmente exento de células inmunol�gicas. En una realización concreta, el modelo de epidermis es un modelo de epidermis animal, por ejemplo, un modelo de epidermis humana. En una realización concreta, dicha una

o más sustancias comprenden al menos un agente cosmético. En una realización concreta, dicha una o más sustancias comprenden al menos un agente medicinal farmacol�gicamente activo. En una realización concreta, el segundo compartimento se rellena con un medio acuoso.

En una realización, la presente invención se dirige a un método para utilizar cualquiera de los sistemas de cultivo celular descritos en la presente para estudiar el efecto sensibilizante, alerg�nico o irritante de una o más sustancias, que comprende poner en contacto el primer compartimento con la sustancia, y detectar una respuesta alérgica en el segundo compartimento.

En una realización, la presente invención se dirige a un método para estudiar el efecto sensibilizante, alerg�nico y/o irritante de un agente, que comprende: a) poner en contacto la superficie de un modelo de epidermis contenido en un primer compartimento, con el agente; y b) determinar la actividad de un cultivo celular de células inmunol�gicas contenido en un segundo compartimento, en el que el primer compartimento y el segundo compartimento est�n separados por una capa intermedia permeable, en el que la presencia de una célula inmunol�gica activada en el segundo compartimento indica que el agente es un alergeno o un agente irritante. En una realización concreta, las células inmunol�gicas se aislan de la sangre. En una realización concreta, el cultivo celular comprende células presentadoras de ant�genos y linfocitos. En una realización concreta, las células presentadoras de ant�genos se derivan de monocitos bajo condiciones de diferenciación. En una realización concreta, se determina la actividad de las células inmunol�gicas estudiando el sobrenadante del cultivo celular. En una realización concreta, se determina la actividad de las células inmunol�gicas ensayando las sustancias producidas por las células inmunol�gicas activadas. En una realización concreta, las sustancias producidas por las células inmunol�gicas activadas se seleccionan del grupo que consiste en transductores de señales, receptores, enzimas y anticuerpos. En una realización concreta, se determina la actividad de las células inmunol�gicas ensayando las sustancias mensajeras procedentes de los queratinocitos del modelo de epidermis. En una realización concreta, se determina la actividad de las células inmunol�gicas identificando la proliferaci�n de las células inmunol�gicas. En una realización concreta, se determina la actividad de las células inmunol�gicas midiendo los marcadores de superficie de las células inmunol�gicas. En una realización concreta, se determina la actividad de las células inmunol�gicas midiendo los componentes de transducci�n de señales de las células inmunologicas. En una realización concreta, se determina la actividad de las células inmunol�gicas midiendo las citoquinas intracelulares de las células inmunol�gicas. En una realización concreta, se determina la actividad de las células inmunol�gicas analizando los niveles de ARN mensajero dentro de las células inmunol�gicas.

Descripci�n detallada

La presente invención se dirige a proporcionar un modelo de investigación extracorporal que es específico para alergenos. Tal como se emplea en la presente, un “alergeno” es un ant�geno no parasitario capaz de estimular una reacción de hipersensibilidad en individuos. En la presente se describen materiales y métodos que imitan, de forma satisfactoria, la compleja situación fisiológica en un sujeto, por ejemplo, un ser humano, que puede conducir a una alergia, mientras que se evita la desventaja conocida del estado actual de la técnica, pero al mismo tiempo se toman en cuenta los actuales desarrollos en el campo de los ensayos aprobados para cosméticos y agentes t�picos.

En la presente se describe un sistema de cultivo celular útil para investigar el efecto sensibilizante, alerg�nico y/o irritante de sustancias, que comprende un primer y un segundo compartimento, de modo que se permite la comunicación entre el primer y el segundo compartimento. El primer compartimento contiene un modelo de epidermis, y el segundo compartimento contiene células inmunol�gicas. La comunicación entre los dos compartimentos es posible separando los compartimentos con una capa intermedia permeable. Tal como se emplea en la presente, la “comunicación” se refiere a la comunicación molecular entre células de los dos compartimentos, por ejemplo, a través del paso de mensajeros o moléculas de se�alizaci�n, por ejemplo, quimioquinas, citoquinas o sustantcias sensibilizantes, alerg�nicas y/o irritantes, entre los dos compartimentos. En una realización, el primer compartimento contiene solo el modelo de epidermis, y el segundo compartimento contiene solo el cultivo celular a base de las células inmunol�gicas.

La invención proporciona un sistema de cultivo celular que es principalmente adecuado para investigar los irritantes y alergenos por contacto. Para este fin, el modelo de epidermis del primer compartimento es particularmente ventajoso como estructura de modelo para la piel natural. En esta situación, el modelo de epidermis con la capa intermedia permeable proporciona un modelo para evaluar la actividad de los alergenos por contacto. Si se introduce una sustancia en el primer compartimento que comprende el modelo de epidermis, y la sustancia es un alergeno, entonces la sustancia, o señales activadas por esa sustancia, ser�n enviadas hacia el segundo compartimento para activar a las células inmunol�gicas. Tal como se emplea en la presente, “activar” significa cualquiera de una serie de alteraciones en el estado de la célula de modo que imita a una célula inmunol�gica activada in vivo (por ejemplo, la expansión de la población de células inmunol�gicas, la producción y/o la liberación de señales moleculares específicas, el cambio en el contenido de receptores de la superficie celular, el cambio en los patrones de expresión g�nica, y otros cambios mensurables conocidos por los expertos en la técnica).

La activación de las células inmunol�gicas puede determinarse evaluando, por ejemplo, la proliferaci�n de células inmunol�gicas y la producción y excreci�n de sustancias mensajeras e inmunoglobulinas, en especial la inmunoglobulina E (IgE). Cuando las células inmunol�gicas del sistema de cultivo celular se han puesto en contacto con las sustancias que se van a estudiar, su presencia en el segundo compartimento, suponiendo que tienen naturaleza alerg�nica, provoca que la reacción inmunol�gica descrita anteriormente se haga más intensa. Estos procesos pueden registrarse y evaluarse para identificar un alergeno o un grado de alergenicidad.

En el sistema de cultivo celular, la proximidad del modelo de epidermis a las células inmunol�gicas es un reflejo de la configuración natural de la piel y el sistema inmunol�gico. En el sistema de cultivo celular, las células inmunol�gicas del segundo compartimento est�n separadas del modelo de epidermis en el primer compartimento por la capa intermedia. Esta disposición puede evitar reacciones inadvertidas entre el modelo de epidermis y las células inmunol�gicas que, de otra forma, podrían interferir con el estudio de las sustancias. Por tanto, el modelo de

epidermis celular y las células inmunol�gicas pueden tener orígenes diferentes y, en particular, pueden originarse a partir de diferentes donantes.

En una realización, las células inmunol�gicas son células presentadoras de ant�genos (APC), por ejemplo, macr�fagos y/o células dendr�ticas. Las APC son útiles porque est�n implicadas en la presentación de alergenos a otras células del sistema inmunol�gico. La presentación de alergenos provoca la activación de linfocitos específicos de alergeno. Una activación de este tipo se manifiesta, en particular, como una proliferaci�n de células y por la producción y excreci�n de sustancias mensajeras e inmunoglobulinas, en especial IgE. Los linfocitos T específicos de alergeno, junto con la IgE, contribuyen a la identificación inicial o, si resulta apropiado, a la reidentificaci�n, de sustancias alerg�nicas.

Las células inmunol�gicas del segundo compartimento pueden ser células precursoras de APC. Los monocitos, por ejemplo, pueden considerarse células precursoras adecuadas, si se deja que se diferencien bajo condiciones específicas en APC. Los expertos en la técnica que est�n familiarizados con el cultivo de monocitos sabrán que las células precursoras pueden hacerse madurar en células útiles en el sistema de cultivo celular. Para lograr la diferenciación, por ejemplo, las células precursoras pueden incubarse en presencia de diversas citoquinas conocidas por inducir específicamente la diferenciación. Las células precursoras pueden incubarse, por ejemplo, para producir macr�fagos en presencia de M-CSF o G-CSF. Con el fin de lograr la diferenciación en células dendr�ticas, las células precursoras pueden incubarse en presencia, entre otros, de GM-CSF e IL-4, u otros. La diferenciación puede llevarse a cabo, por ejemplo, a lo largo de un periodo de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 días, a lo largo de un periodo de aproximadamente 7 a 18 días, o a lo largo de un periodo de aproximadamente 10 a 14 días.

Las células inmunol�gicas del segundo compartimento pueden ser linfocitos, por ejemplo, linfocitos B y/o linfocitos T. Tanto los linfocitos B como los linfocitos T son importantes para la identificación inicial y para la reidentificaci�n de sustancias alerg�nicas. En una realización, el cultivo celular del segundo compartimento comprende APC, linfocitos B y linfocitos T.

Las células inmunol�gicas pueden mostrar, por ejemplo, ant�genos de compatabilidad de tejido concordantes (ant�genos del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC)). Esto permite evitar respuestas de rechazo entre las células inmunol�gicas. Las respuestas de rechazo de este tipo, por lo demás, dificultar�an la investigación de las respuestas sensibilizantes, alerg�nicas y/o irritantes que puedan estar produci�ndose. Además, una correcta presentación de ant�genos solo se produce si los ant�genos MHC de las APC y de los linfocitos B y T que se van sensabilizar son de hecho idénticos, por ejemplo, derivados del mismo donante.

El cultivo celular del segundo compartimento puede comprender células de tejidos. Las células de tejidos adecuadas son, por ejemplo, queratinocitos y/o fibroblastos. Las células de tejidos también pueden ser aislados primarios. Como alternativa, el cultivo celular del segundo compartimento puede estar sustancialmente exento de células de tejidos.

Las células inmunol�gicas pueden derivarse, por ejemplo, de un donante, en particular de uno y el mismo donante. En una realización concreta, las células inmunol�gicas se aislan de la sangre, principalmente de la sangre de un paciente. Las células inmunol�gicas pueden aislarse de la sangre de personas sanas o de personas que tienen disposición a las alergias.

En una realización concreta, el sistema de cultivo celular implica solo a células de origen humano. Esto hace posible simular la situación in vivo del organismo humano de una manera particularmente eficaz. De esta forma, es posible aumentar aún más la validez de los resultados obtenidos con la ayuda del sistema de cultivo celular con respecto a un efecto sensibilizante, alerg�nico y/o irritante sobre los seres humanos. Las células del sistema de cultivo celular, en particular las células del modelo de epidermis y/o las células inmunol�gicas, pueden propagarse como líneas celulares.

En una realización, las células inmunol�gicas se aislan a partir de la sangre de un sujeto. En particular, las células inmunol�gicas pueden aislarse con la ayuda de herramientas y métodos conocidos en la técnica, en particular con la ayuda de técnicas de centrifugaci�n. Una técnica de centrifugaci�n que puede considerarse, por ejemplo, es la centrifugaci�n de densidad. Sin embargo, también pueden emplearse otras técnicas de centrifugaci�n. Como alternativa, las células inmunol�gicas pueden aislarse mediante métodos de clasificación adecuados, por ejemplo, esferas magnéticas y/o métodos de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS).

El modelo de epidermis celular puede comprender células epid�rmicas individuales, por ejemplo, queratinocitos. El modelo de epidermis presenta una estructura en capas, por ejemplo, de múltiples capas. En particular, el modelo de epidermis puede presentar una estructura de múltiples capas diferenciadas. En otra versión, el modelo de epidermis presenta al menos una capa de epidermis del grupo del estrato c�rneo, estrato lúcido, estrato granuloso, estrato espinoso y estrato basal. El modelo de epidermis incluye principalmente células epid�rmicas vivas, en particular queratinocitos vivos. El modelo de epidermis puede consistir en una superficie córnea, con las capas de queratinocitos epid�rmicos por debajo de esta. En una realización concreta, el modelo de epidermis est� sustancialmente exento de células inmunol�gicas. El modelo de epidermis puede ser de origen animal, preferiblemente de origen humano.

Adem�s de evaluar el efecto de sustancias sobre la activación de las células inmunol�gicas, ciertas sustancias con el potencial pertinente pueden activar otras reacciones, en particular en los queratinocitos del modelo de epidermis, que mejoren significativamente la detección de las reacciones de incompatibilidad.

Tal como se emplea en la presente, un efecto “sensibilizante” de una sustancia se refiere a la activación de un acontecimiento de sensibilizaci�n. La “sensibilizaci�n” en la presente se refiere a las reacciones inmunol�gicas que surgen en un organismo concreto tras el contacto inicial con la sustancia, en particular con un alergeno. Principalmente, esto supone inicialmente la activación de unos pocos linfocitos B y linfocitos T, que después se multiplican mucho (respuesta primaria oligoclonal). Al final de este proceso de activacion, la mayoría de los linfocitos son eliminados por el sistema inmunol�gico. Sin embargo, se forman células de memoria específicas de alergeno que continúan existiendo a lo largo de periodos largos de tiempo en un número significativamente mayor que las células específicas de alergeno originales.

Una alergia que surge como resultado de la sensibilizaci�n es una reacción de defensa excesiva del sistema inmunol�gico contra un alergeno específico, que puede producirse después de un contacto repetido con el alergeno pertinente. Por contraste con la sensibilizaci�n primaria, la reacción inmunol�gica secundaria excesiva est� provocada por muchas células de memoria de linfocitos B y linfocitos T con receptores del ant�geno concordantes (respuesta secundaria oligoclonal). Esto significa que esta reacción es reforzada con cada contacto renovado con el alergeno.

Por contraste, surge un efecto irritante por el daño a las células del tejido activado por un irritante. En una primera fase de la irritación, las propias células del tejido liberan sustancias mensajeras, por ejemplo, el factor activador de linfocitos interleuquina-1 alfa (IL-1!) y el p�ptido activador de neutr�filos derivado de linfocitos, también conocido como la quimioquina interleuquina-8 (IL-8). Las sustancias mensajeras liberadas atraen a las células del sistema inmunol�gico y las activan. Si el efecto irritante del irritante continúa y se hace más potente, las células del tejido mueren. Esto, a su vez, provoca la liberación de constituyentes intracelulares (en el sentido de un proceso necr�tico). Esto potencia la activación secundaria de las células del sistema inmunol�gico. Los efectos que acompañan a la irritación son principalmente no específicos de ant�geno. Principalmente, est�n implicados macr�fagos y granulocitos.

La sustancia que se va a estudiar, es decir, el potencial agente alerg�nico o irritante, puede ser, por ejemplo, un extracto vegetal y/o aceite, cosméticos y/o sus constituyentes, o productos dermatol�gicos farmacol�gicamente activos (t�picos), en particular productos medicinales que se van a aplicar por vía típica a la piel y/u otros constituyentes.

En otra versión, el primer compartimento se diseña como el compartimento superior, y el segundo compartimento como compartimento inferior del sistema de cultivo celular. El sistema de cultivo celular, por ejemplo, puede diseñarse según los sistemas disponibles en el mercado Transwell�. Al menos el segundo compartimento puede contener un medio acuoso.

En una realización concreta, la invención se dirige a un proceso para estudiar el efecto sensibilizante, alerg�nico y/o irritante de sustancias, en especial cuando se emplea el sistema de cultivo celular descrito en la presente. Este método puede comprender las etapas de a) la adición de la sustancia que se va a estudiar a la superficie de un modelo de epidermis que est� en comunicación con un cultivo celular a base de células inmunol�gicas a través de una capa intermedia permeable, y b) el estudio del cultivo celular para detectar una respuesta sensibilizante, alerg�nica y/o irritante.

El sobrenadante del cultivo celular puede estudiarse, por ejemplo, para determinar el estado de actividad de las células inmunol�gicas. Las sustancias formadas por las células inmunol�gicas, por ejemplo, sustancias mensajeras, transductores de señales (moléculas de transducci�n de señales o componentes de transducci�n de señales), receptores, enzimas y/o anticuerpos, por ejemplo, pueden estudiarse en el sobrenadante del cultivo celular (medio de cultivo celular) o como componentes intracelulares. Las sustancias mensajeras (por ejemplo, mediadores) pueden ser, por ejemplo, citoquinas y/o quimioquinas. La concentración de las sustancias mensajeras se determina principalmente en el sobrenadante del cultivo y/o en las células. La densidad de los transductores de señales y/o receptores se determina, por ejemplo, sobre y/o en las células inmunol�gicas. Las sustancias mensajeras pueden ser, por ejemplo, interfer�n-∀ (IFN∀), IL-4 y/o eotaxina. Los receptores adecuados puede ser, por ejemplo, receptores de la superficie. Los receptores son receptores de la superficie de los linfocitos, por ejemplo, CD25, CD69, CD152 y CD154. Algunos ejemplos de transductores de señales son el factor nuclear kappa beta (NF#∃), la proteína asociada a zeta (ZAP-70), y el factor nuclear de células T activadas (NFAT). Las enzimas potencialmente adecuadas pueden ser, por ejemplo, fosfolipasas, ciclooxigenasas, proteína quinasas, poli (ADP ribosa) polimerasa (PARP), metaloproteinasas de matriz (MMP), triptasas, caspasas, dipeptidil peptidasas, quinasas y/o otras enzimas importantes para la generación de señales. Los anticuerpos son principalmente IgE o IgG4.

Pueden evaluarse las características que indican la activación celular por células epid�rmicas localizadas en el modelo de epidermis, en particular queratinocitos. Los métodos de investigación adecuados incluyen, por ejemplo, procesos electrofor�ticos, reacción en cadena de polimerasa (PCR), cromatograf�a líquida de alta presión (HPLC), tecnologías de matrices, métodos radiom�tricos, técnicas de tinción histológica, métodos de citometr�a de flujo y/o

diversos métodos de transferencias diferentes. Los métodos electrofor�ticos incluyen, por ejemplo, electroforesis en gel, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional (PAGE-2D). También puede utilizarse un análisis de la transferencia Western como método de detección. También es posible combinar métodos electrofor�ricos con métodos de transferencia. Las tecnologías de matrices incluyen, por ejemplo, el chip Immuno Solid-phase Allergen Chip (ISAC).

Los anticuerpos formados por las células inmunol�gicas pueden detectarse mediante inmunoensayos apropiados. Los ejemplos de inmunoensayos incluyen, por ejemplo, el ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el ensayo radioalergoadsorbente (RAST).

Las sustancias segregadas por las células inmunol�gicas también pueden detectarse para determinar el estado de activación de las células inmunol�gicas. Las sustancias segregadas pueden ser, por ejemplo, proteínas y/o p�ptidos. Las proteínas pueden ser, por ejemplo, receptores y/o proteínas con actividad enzim�tica. Las sustancias segregadas pueden ser, por ejemplo, proteínas y/o p�ptidos glicosilados. Las sustancias segregadas pueden ser, por ejemplo, sustancias mensajeras. Las sustancias mensajeras pueden ser compuestos de bajo o alto peso molecular. Las sustancias mensajeras pueden ser, por ejemplo, compuestos de radicales de oxígeno, compuestos lipoides, aminas biog�nicas, citoquinas, factores del crecimiento y/o quimioquinas, receptores solubles, o incluso vesículas de membranas (por ejemplo, exosomas).

La detección de los compuestos segregados puede realizarse determinando la concentración de las sustancias segregadas en el sobrenadante del cultivo celular. Las técnicas para detectar las sustancias segregadas son conocidas por los expertos en la técnica. Las sustancias segregadas pueden detectarse a nivel transcripcional, a nivel traduccional y/o a nivel postraduccional. Las sustancias excretadas pueden estudiarse con ayuda de las tecnologías de matrices, en especial con la ayuda, por ejemplo, de matrices de esferas m�ltiplex o matrices planares.

La determinación del estado de activación de las células inmunol�gicas puede lograrse, por ejemplo, detectando la proliferaci�n de las células inmunol�gicas, en particular linfocitos. Un primer contacto o un contacto repetido con un alergeno estimula, particularmente, a los linfocitos B y los linfocitos T para que proliferen.

El sistema de cultivo celular descrito en la presente evalúa la gravedad de la alergenicidad mostrada por un alergeno potencial. Los métodos descritos en la presente para identificar alergenos pueden ser cuantitativos. Los datos recogidos de diversos ant�genos/alergenos pueden compilarse, por ejemplo, para determinar una escala de referencia de alergenicidad. La gravedad de una respuesta alerg�nica se determina mediante un modelo de respuesta alerg�nica, determinándose la gravedad midiendo los factores descritos en la presente, por ejemplo, expansión celular, detección de factores de liberación, etc. La comparación de la reacción alerg�nica producida por un alergeno potencial con la escala alerg�nica de referencia, por ejemplo, permite a los expertos en la técnica determinar el grado de alergenicidad provocado por el alergeno potencial.

En último término, la presente invención se refiere al uso del sistema de cultivo celular según la invención para estudiar el efecto sensibilizante, alerg�nico y/o irritante de sustancias. Existe un beneficio especial que hace que el sistema de cultivo celular sea adecuado para discriminar entre una alergia activada por las sustancias estudiadas y la irritación. De igual forma, el sistema de cultivo celular según la invención es adecuado para realizar estudios paralelos utilizando múltiples sistemas de cultivo celular.

Ejemplo

Para preparar queratinocitos recién aislados, un material de la piel obtenido por medios quirúrgicos se somete a un proceso de digestión enzim�tica. Los queratinocitos, por ejemplo, obtenidos de esta manera después se trasladan a placas con un fondo de membrana (por ejemplo, Millipore Millicells�) que actúan como compartimentos. Estos recipientes de cultivo contienen un medio de cultivo apropiado que contiene suero de ternera fetal, penicilina, estreptomicina, amino�cidos no esenciales y factores del crecimiento para cultivar queratinocitos. El medio de cultivo se refresca de modo regular durante el cultivo de las células hasta que se haya producido una diferenciación tridimensional suficiente en una epidermis equivalente. La epidermis diferenciada incluye múltiples capas de células, en particular capas de células en proliferaci�n, en no proliferaci�n y córneas.

Para la preparación de las células inmunol�gicas, se obtienen leucocitos, por ejemplo, a partir de la sangre periférica de un sujeto. Las células se enriquecen mediante un gradiente de Ficoll. Los leucocitos después se propagan en placas de múltiples pocillos, que actúan como compartimentos. Cada placa de múltiples pocillos contiene un medio de proliferaci�n adecuado que presenta los aditivos necesarios, tales como, por ejemplo, plasma o suero, vitaminas y/u otros componentes esenciales, tales como, por ejemplo, amino�cidos, nucleótidos y antibióticos (por ejemplo, penicilina, estreptomicina, etc.).

Los compartimentos con los cultivos de epidermis diferenciada se introducen en los compartimentos con los cultivos de leucocitos, formando un sistema de cultivo celular. El sistema de cultivo celular es un cocultivo con dos poblaciones de células diferentes (por ejemplo, células epid�rmicas y leucocitos), por lo cual el compartimento con el cultivo de epidermis representa el compartimento superior, y el compartimento con los leucocitos el compartimento inferior. Se aplica una sustancia (por ejemplo, un irritante o agente potencialmente alerg�nico) que se va a estudiar a

la superficie del cultivo de epidermis del compartimento superior. El cocultivo después se incuba durante un tiempo específico. Para determinar el potencial sensibilizante se mide la proliferaci�n de linfocitos, la síntesis de mediadores de los linfocitos y/o los parámetros de la activación de células de los leucocitos en el compartimento inferior. Además, el compartimento superior puede estudiarse para determinar parámetros para una irritación.

Otras realizaciones

Otras realizaciones ser�n evidentes para los expertos en la técnica. Debe entenderse que la anterior descripción detallada se proporciona solo como aclaración y simplemente es un ejemplo.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un método para estudiar el efecto sensibilizante, alerg�nico y/o irritante de un agente, que comprende:

a) poner en contacto la superficie de un modelo de epidermis contenido en un primer compartimento, con el agente; y

5 b) determinar la actividad de un cultivo celular de células inmunol�gicas contenido en un segundo compartimento, en el que el primer compartimento y el segundo compartimento est�n separados por una capa intermedia permeable,

en el que la presencia de una célula inmunol�gica activada en el segundo compartimento indica que el agente es un alergeno o un agente irritante, y

en el que la actividad de las células inmunol�gica se determina realizando una o más de las siguientes etapas:

10 identificar la proliferaci�n de las células inmunol�gicas; medir los marcadores de superficie de las células inmunol�gicas; medir los componentes de transducci�n de señales de las células inmunol�gicas; medir las citoquinas intracelulares de las células inmunol�gicas; y analizar los niveles de ARN mensajero dentro de las células inmunol�gicas.
2.- El método de la reivindicación 1, en el que las células inmunol�gicas se aislan a partir de sangre.

15 3.- El método de la reivindicación 1, en el que el cultivo celular comprende células presentadoras de ant�genos y linfocitos.
4.- El método de la reivindicación 3, en el que las células presentadoras de ant�genos proceden de monocitos bajo condiciones de diferenciación.
5.- El método de la reivindicación 1, en el que la actividad de las células inmunol�gicas se determina estudiando el 20 sobrenadante del cultivo celular.
6.- El método de la reivindicación 1, en el que la actividad de las células inmunol�gicas se determina ensayando para detectar sustancias producidas por las células inmunol�gicas activadas.
7.-El método de la reivindicación 6, en el que las sustancias producidas por las células inmunol�gicas activadas se seleccionan del grupo que consiste en transductores de señales, receptores, mensajeros, enzimas y anticuerpos.

25 8.- El método de la reivindicación 1, en el que la actividad de las células inmunol�gicas se determina ensayando para detectar sustancias mensajeras procedentes de los queratinocitos del modelo de epidermis.