ES2476919T3

ES2476919T3 - Identificación, optimización y utilización de ep�topos crípticos HLA-B7 para inmunoterapia

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Publication number: ES2476919T3
Application number: ES07825358.0T
Authority: ES
Inventors: Kostantinos Kosmatopoulos (Kostas); St�Phanie Graff-Dubois; Jeanne Menez-Jamet
Original assignee: Vaxon Biotech SA
Current assignee: Vaxon Biotech SA
Priority date: 2006-07-12
Filing date: 2007-07-12
Publication date: 2014-07-15
Anticipated expiration: 2027-07-12
Also published as: CN101495501A; US20110256163A1; US8465747B2; KR101454935B1; JP2009542251A; EP2041160B1; CN101495501B; US20170202936A1; PT2041160E; CA2656883A1; WO2008010010A1; PL2041160T3; JP5717338B2; KR20090029833A; WO2008010098A3; DK2041160T3; WO2008010098A2; EP2041160A2; US20130266598A1

Abstract

Epítopo críptico restringido por HLA-B*0702, que es un péptido seleccionado del grupo que comprende APRSPLAPS (ID. SEC. No. 2), SPKANKEIL (ID. SEC. No. 3), GPKHSDCLA (ID. SEC. No. 4).

Description

Identificaci�n, optimización y utilización de ep�topos crípticos HLA-B7 para inmunoterapia

La presente invención se refiere al sector de la inmunoterapia de p�ptidos. En particular, la presente invención da a conocer nuevos procedimientos y materiales para tratar eficazmente pacientes que tienen un fenotipo HLA-B*0702.

La inmunoterapia es un enfoque terapéutico que actualmente es objeto de un gran interés en el contexto del tratamiento del cáncer. El principio de la misma se basa en la inmunizaci�n con p�ptidos que reproducen ep�topos de células T de ant�genos tumorales reconocidos por los linfocitos T citot�xicos (CTL) que juegan un papel importante en la eliminación de las células tumorales.

Cabe recordar que los CTL no reconocen ant�genos proteicos enteros, sino fragmentos pept�dicos de los mismos, que comprenden en general de 8 a 11 amino�cidos, que presentan las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC I) expresadas en la superficie de las células. La presentación de estos p�ptidos es el resultado del procesamiento de ant�genos que consta de tres etapas:

-: degradaci�n citos�lica del ant�geno por un complejo multienzim�tico denominado proteosoma -translocaci�n de los p�ptidos derivados de esta degradación en el retículo endoplasm�tico (ER) por los transportadores TAP -asociación de estos p�ptidos con las moléculas del MHC I y la exportación de los complejos p�ptido/MHC I a la superficie celular

Los complejos p�ptido/MHC I interact�an con el receptor específico de células T (TCR) en los CTL induciendo la estimulaci�n y la amplificación de estos CTL que se vuelven capaces de atacar a las células diana que expresan el ant�geno del que se deriva el p�ptido.

Durante el procesamiento de los ant�genos, se lleva a cabo una selección de p�ptidos, lo que da como resultado una jerarquía de presentación de p�ptidos. Los p�ptidos que las moléculas del MHC I presentan preferentemente son denominados inmunodominantes mientras que los p�ptidos que presentan débilmente se denominan crípticos. Los p�ptidos inmunodominantes exhiben una elevada afinidad por el MHC I y son inmunog�nicos, mientras que los p�ptidos crípticos muestran una baja afinidad por el MHC I y son no inmunog�nicos.

Los p�ptidos inmunodominantes han sido determinados ampliamente como el objetivo de vacunas contra el cáncer en estudios precl�nicos y cl�nicos con resultados decepcionantes (Bowne y otros, 1999; Colella y otros, 2000; Gross y otros, 2004; Hawkins y otros, 2000; Naftzger y otros, 1996; Overwijk y otros, 1998; Vierboom y otros, 1997; Weber y otros, 1998).

Los ant�genos tumorales frecuentemente son proteínas propias sobreexpresadas por los tumores y expresadas a niveles más bajos por las células y tejidos normales. El sistema inmunol�gico es incapaz de reaccionar contra estos ant�genos propios debido al proceso de la autotolerancia. La autotolerancia concierne principalmente a los p�ptidos inmunodominantes (Cibotti y otros, 1992; Gross y otros, 2004; Hernández y otros, 2000; Theobald y otros, 1997) explicando de este modo la incapacidad de estos p�ptidos para inducir una inmunidad tumoral.

Los p�ptidos crípticos est�n mucho menos involucrados en el proceso de la autotolerancia (Anderton y otros, 2002; Boisg�rault y otros, 2000; Cibotti y otros, 1992; Friedman y otros, 2004; Gross y otros, 2004; Moudgil y otros, 1999; Overwijk y otros, 2003; Sinha y otros, 2004) y, por lo tanto, pueden inducir una inmunidad tumoral eficiente siempre que se mejore su inmunogenicidad (Disis y otros, 2002; Dyall y otros, 1998; Engelhorn y otros, 2006; Gross y otros, 2004; Grossmann y otros, 2001; Lally y otros, 2001; Moudgil y Sercarz, 1994a; Moudgil y Sercarz, 1994b; Palomba y otros, 2005).

La estrategia habitual para potenciar la inmunogenicidad de p�ptidos crípticos, que debido a su baja afinidad por MHC I son no inmunog�nicos, comprende el aumento de su afinidad por las moléculas del MHC I a través de sustituciones de amino�cidos. La afinidad de los p�ptidos por las moléculas del MHC I depende principalmente de la presencia en posiciones bien definidas (posiciones de anclaje primario) de residuos llamados “residuos de anclaje primario”. Estos residuos son específicos de alelo de MHC I. Aunque a menudo necesaria, la presencia de residuos de anclaje primarios no es suficiente para asegurar una elevada afinidad por el MHC I. Se ha demostrado que los residuos situados fuera de las posiciones de anclaje primarias (residuos de anclaje secundario) pueden ejercer un efecto favorable o desfavorable sobre la afinidad del p�ptido por el MHC I. La presencia de estos residuos de anclaje secundarios hace que sea posible explicar la existencia de una gran variabilidad en la afinidad de unión, dentro de los p�ptidos que tienen los motivos de anclaje primarios.

Las sustituciones de amino�cidos dirigidas a la mejora de la afinidad por las moléculas del MHC I deberían conservar la antigenicidad de estos p�ptidos optimizados. Los CTL generados por p�ptidos optimizados deben reaccionar de forma cruzada con los correspondientes p�ptidos nativos.

Muchos equipos de investigación han tenido éxito en mejorar adicionalmente la inmunogenicidad de p�ptidos ya inmunog�nicos mediante el aumento de su afinidad por HLA-A*0201 (Bakker y otros, 1997; Parkhurst y otros, 1996; Sarobe y otros, 1998; Valmori y otros, 1998). Los presentes inventores han descrito anteriormente una estrategia general para mejorar la afinidad y la inmunogenicidad de p�ptidos crípticos restringidos por HLA-A*0201 (Scardino y otros, 2002; Tourdot y otros, 2000).

HLA-B*0702 es una molécula expresada frecuentemente (25% de la población). Por lo tanto, la identificación y optimización de p�ptidos crípticos tumorales restringidos por HLA-B*0702, deben ser necesarias a efectos de desarrollar vacunas eficientes contra el cáncer para pacientes que expresan HLA-B*0702.

Hasta la fecha, se han descrito pocos p�ptidos tumorales presentados por HLA-B*0702. Dos p�ptidos derivados de los ant�genos CEA (CEA632) (Lu y otros 2000) y TERT (TERT1123) (Cortez-Gonzales y otros, 2006) han sido identificados; estos p�ptidos mostraron una fuerte afinidad de unión por HLA-B*0702 y fueron inmunog�nicos tanto en HLA-B*0702 de ratones transg�nicos como en pruebas in vitro con células humanas. Estos resultados experimentales muestran que estos p�ptidos son p�ptidos inmunodominantes.

Dos p�ptidos adicionales derivados de MAGE-A1 (MAGE-A1289) (Luiten y otros, 2000) y RU2 (un nuevo ant�geno expresado por el carcinoma de células renales) (Van den Eynde y otros, 1999) se han identificado como objetivos de CTL de HLA-B*0702 que habían sido aislados a partir de pacientes con cáncer. Aunque no existe información acerca de la afinidad por HLA-B*0702 de estos dos p�ptidos, podemos considerarlos inmunodominantes porque los CTL desarrollados en pacientes con cáncer est�n siempre dirigidos contra p�ptidos inmunodominantes.

Tal como se describe a continuación en la parte experimental, los presentes inventores han encontrado ahora una estrategia general para aumentar la afinidad y la inmunogenicidad de un ep�topo críptico restringido por HLAB*0702.

La presente memoria descriptiva describe un procedimiento para aumentar la inmunogenicidad de un ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702, que comprende una etapa de sustitución de un residuo del extremo N terminal de dicho ep�topo con una alanina (A), o de sustitución del residuo del extremo C terminal con una leucina (L).

A continuación, la frase "ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702" se utilizar� para designar un p�ptido que tiene de 8 a 11 amino�cidos, más preferentemente 9 � 10 amino�cidos, que muestra una baja afinidad por HLA-B*0702, es no inmunog�nico y tiene la secuencia de X1PX3X4X5X6X7XSXPX10X11 (ID. SEC. No. 58), en la que P es prolina, X3 es R (arginina) o K (lisina) o H (histidina) o M (metionina), X1 y X4 a X7 son independientemente cualquier amino�cido, X8 a X10 son independientemente cualquier amino�cido o ninguno, y el amino�cido X11 del extremo C terminal es cualquier amino�cido con la condición de que si el amino�cido del extremo N terminal X1 es A (alanina) entonces, X11 no es ni L (leucina) ni A, ni I (isoleucina), ni V (valina), y no es M, y si X1 es un amino�cido distinto de A, entonces X11 es L o A o I o V o M.

En la presente memoria descriptiva, el término "p�ptido" designa no sólo a moléculas en las que residuos de amino�cidos est�n unidos por enlaces pept�dicos (-CO-NH-), sino también a pseudop�ptidos sintéticos o peptidomim�ticos en los que se modifica el enlace pept�dico, especialmente para hacerlos más resistentes a la prote�lisis, y siempre que su inmunogenicidad no se vea afectada por esta modificación.

En la presente memoria descriptiva, los residuos de amino�cidos se designan por sus códigos de letras.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la palabra "sustitución" se debe entender como la obtención de un p�ptido cuya secuencia se deriva de la secuencia de dicho ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702 mediante la sustitución mencionada, cuando la secuencia de amino�cidos de dicho ep�topo críptico restringido no contiene el amino�cido apropiado, cualquiera que sea el procedimiento técnico utilizado para obtener dicho p�ptido. Por ejemplo, el p�ptido se puede producir mediante síntesis artificial de p�ptidos o mediante expresión recombinante.

La afinidad de un p�ptido por el HLA-B*0702 se puede determinar por procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante el ensayo descrito por Rohrlich y otros, 2003. Los resultados se expresan como la afinidad relativa (AR) cuando se compara con un p�ptido de referencia. Según este procedimiento, se dice que un p�ptido tiene una baja afinidad por HLA-B*30702 cuando AR es mayor que 10. Por lo tanto, se considera que p�ptidos con AR mayor que 10 son p�ptidos crípticos (o ep�topos):

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término "no inmunog�nico" se refiere a un p�ptido incapaz de iniciar una respuesta inmune de CTL restringidos por HLA-B*0702 cuando se administra a un sujeto que expresa HLA-B*0702 (incluyendo un animal transg�nico HLA-B*0702).

En otra realización, la inmunogenicidad de un ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702 en el que el segundo y tercer residuo de amino�cido es PR o PK o PH o PM y el último residuo es L o A o I o V o M, se puede aumentar

mediante la sustitución de su primer amino�cido por una A (alanina). De hecho, cuando la secuencia del ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702 seleccionado es X1PX3X4X5X6X7X8X9X10X11 (ID. SEC. No. 59), en la que el amino�cido X1 del extremo N terminal es cualquier amino�cido excepto A, X3 es R o K o H o M, el amino�cido X11 del extremo C terminal es L o A o I o V o M, X4 a X7 son, independientemente, cualquier amino�cido, y X8 a X10 son independientemente cualquier amino�cido o ninguno, la sustitución de X1 por A es suficiente para aumentar su inmunogenicidad.

En otra realización adicional, la inmunogenicidad de ep�topos crípticos restringidos por HLA-B*0702 en los que los tres primeros residuos de amino�cidos son APX3 (en el que X3 es R o K o H o M) se puede incrementar mediante la sustitución de su último amino�cido por una L (o mediante la adición de una leucina en su extremo C terminal, siempre que la secuencia de amino�cidos de dicho ep�topo después de haber añadido la leucina no sea más larga que 11 amino�cidos). De hecho, cuando la secuencia del ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702 seleccionado es APX3X4X5X6X7X8X9X10X11 (ID. SEC. No. 60), en la que X3 es R o K o H o M, X4 a X7 son independientemente, cualquier amino�cido, X8 a X10 son independientemente cualquier amino�cido o ninguno, y el amino�cido X11 del extremo C terminal es un amino�cido distinto a L o A o I o V o M, la sustitución de X11 por L es suficiente para aumentar su inmunogenicidad.

A continuación, la expresión "p�ptido optimizado" designa un p�ptido inmunog�nico derivado de un ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702, mediante los procedimientos anteriores, y que tiene la secuencia general APX3X4X5X6X7X8X9X10X11 (ID. SEC. No. 61), en la que X3 es R o K o H o M, X4 a X7 son independientemente cualquier amino�cido, X8 a X10 son independientemente cualquier amino�cido o ninguno, y el amino�cido X11 del extremo C terminal es L o A o I o V o M.

Los presentes inventores han identificado una serie de ep�topos crípticos restringidos por HLA-B*0702, algunos de ellos se dan a conocer en la Tabla 1 siguiente. En consecuencia, un aspecto de la presente invención es un ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702, seleccionado de entre los p�ptidos de ID. SEC. No. 2 a 4, que se describen en la Tabla 1.

Tabla 1. p�ptidos crípticos restringidos por HLA-B*0702 seleccionados

Ant�geno: P�ptido ID. SEC. No.

TEXT444: DPRRLVQLL 1

HER-2/neu: APRSPLAPS 2

SPKANKEIL: 3

GPKHSCDLA: 4

Entre los ejemplos de ep�topos inmunog�nicos restringidos por HLA-B*0702 obtenidos según la presente invención est�n los derivados de un ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702 de la ID. SEC. No. 3 o 4, mediante la sustitución de su amino�cido del extremo N terminal con una A (alanina) y los derivados del ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702 de ID. SEC. No. 2 mediante la sustitución de su amino�cido del extremo C terminal con una L (leucina).

Por lo tanto, la presente invención se refiere además a p�ptidos optimizados derivados de los p�ptidos crípticos de ID. SEC. No. 2 a 4, mediante un procedimiento tal como el que se ha descrito anteriormente. Los ejemplos preferentes de p�ptidos optimizados son APRSPLAPL (ID. SEC. No. 6), APKANKEIL (ID. SEC. No. 7) y APKHSCDLA (ID. SEC. No. 8).

La presente invención se refiere además a un polip�ptido quimérico, que comprende dos, tres o más ep�topos crípticos restringidos por HLA-B*0702 seleccionados del grupo que comprende las ID. SEC. No. 1 a 4, o dos, tres o más ep�topos inmunog�nicos restringidos por HLA-B*0702 seleccionados del grupo que comprende APRRLVQLL (ID. SEC. No. 5) y las ID. SEC. No. 6 a 8, tal como se ha descrito anteriormente. En un polip�ptido quimérico según la presente invención, los ep�topos pueden ser diferentes unos de otros, o el mismo ep�topo se puede repetir varias veces (dos, tres o más veces). El técnico en la materia puede elegir cualquier técnica conocida para producir estos polip�ptidos. Por ejemplo, el polip�ptido puede obtenerse por síntesis química, o mediante la utilización de la tecnología de la ingeniería genética.

Otro objetivo de la presente invención es una molécula de ácido nucleico aislada diseñada para causar la expresión de un ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702 seleccionado del grupo que comprende las ID. SEC. No. 2 a 4 o un ep�topo inmunog�nico seleccionado del grupo que comprende las ID. SEC. No. 6 a 8, o un polip�ptido quimérico tal como el que se ha descrito anteriormente. En la presente memoria descriptiva, por "diseñado para causar la expresión de un p�ptido” se entiende que dicho p�ptido se expresa como tal, aislado de todo el ant�geno del que se ha seleccionado su secuencia (y en los casos apropiados, optimizado tal como se ha descrito anteriormente), cuando el ácido nucleico se introduce en una célula apropiada. La región que codifica el ep�topo o polip�ptido quimérico se encuentra normalmente en el polinucle�tido bajo el control de un promotor adecuado. Son preferentes los promotores bacterianos para la expresión en bacterias, que pueden producir el polip�ptido ya sea in vitro o, en circunstancias particulares, in vivo. Un ejemplo de bacteria que se puede utilizar para producir un p�ptido o

polip�ptido según la presente invención, directamente in vivo, es Listeria monocytogenes, que es una bacteria intracelular facultativa que entra en las células presentadoras de ant�geno profesionales mediante fagocitosis activa (Paterson y Maciag, 2005). Alternativamente, un ácido nucleico según la presente invención se puede administrar directamente, utilizando un vector apropiado. En este caso, se puede utilizar un promotor específico de tejido, uno constitutivo fuerte o uno end�geno para controlar la expresión del p�ptido. Entre los sistemas de vectores adecuados se incluyen pl�smidos de ADN desnudo, composiciones de liposomas para mejorar la liberación, y vectores virales que provocan la expresión transitoria. Son ejemplos los adenovirus o vectores de virus vacuna y vectores de la familia de los herpes, especialmente en una forma no replicativa.

Otra realización de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende, como mínimo, como un principio activo, un ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702 seleccionado del grupo que comprende las ID. SEC. No. 2 a 4, o un polip�ptido ep�topo inmunog�nico derivado de las mismas tal como se ha mencionado anteriormente,

o un polip�ptido quimérico según la presente invención, o un ácido nucleico que codifica cualquiera de estos y/o un vector que porta dicho ácido nucleico. La formulación de las composiciones farmacéuticas ser� conforme a las normas y técnicas actuales. Medicamentos destinados para la administración humana se pueden preparar adecuadamente en condiciones estériles, en los que el ingrediente o ingredientes activos se combinan con una solución isot�nica u otro vehículo farmacéutico apropiado para la utilización terapéutica recomendada. De forma general, se describen formulaciones y técnicas adecuadas en la última edición de “Ciencias farmacéuticas de Remington” (“Remington’s Pharmaceutical Sciences”) (Maack Publishing Co, Easton PA).

En particular, un ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702, o un polip�ptido ep�topo inmunog�nico derivado del mismo, o un polip�ptido quimérico que porta varios de estos ep�topos inmunog�nicos o crípticos, o un ácido nucleico que codifica cualquiera de estos, incluido o no en un vector, se puede utilizar para la preparación de una composición para inmunoterapia preventiva o curativa, especialmente, para inmunoterapia antiviral o contra el cáncer.

En una realización particular, una composición farmacéutica según la presente invención es una vacuna. En este último caso, las composiciones de la presente invención se pueden combinar con un adyuvante para potenciar la respuesta inmune. Entre los adyuvantes clásicos se incluyen emulsiones de aceite, tal como Adyuvante Incompleto de Freund, y las superficies adherentes tales como el alumbre. Son especialmente útiles los adyuvantes que seleccionan y activan las células dendr�ticas, en particular, a través de TLR (tales como ADN bacteriano o proteínas derivadas de membrana bacteriana) o ayudan a obtener células T citot�xicas. Se pueden incluir además en la composición otros factores que refuerzan la respuesta inmune de otro modo o promueven la apoptosis o la eliminación de las células cancerosas.

Se pueden empaquetar para su distribución por separado o juntas dosis múltiples y/o diferentes combinaciones de las composiciones inmunog�nicas de la presente invención. Cada composición o conjunto de composiciones, tales como los kits de partes que se describen a continuación, se pueden acompañar con las instrucciones escritas (en forma de material promocional o prospecto) con respecto a la utilización de la composición o combinación en la provocación de una respuesta inmune y/o el tratamiento del cáncer.

En una solicitud de patente anterior (documento PCT/EP2006/005325), el presente solicitante ha descrito un protocolo de vacunación que permite el inicio y mantenimiento de una respuesta de células T dirigida hacia ep�topos crípticos. Los resultados dados a conocer en el documento PCT/EP2006/005325 demuestran que la inyección de un p�ptido nativo correspondiente a un ep�topo críptico, seguida de la vacunación con su p�ptido cognado optimizado, puede mantener la respuesta inmune iniciada por dicho p�ptido optimizado.

Por lo tanto, según la presente invención, un ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702 se puede utilizar para la preparación de una composición medicinal para mantener la respuesta inmune de CTL iniciada por su p�ptido cognado optimizado. Un p�ptido inmunog�nico que tiene una secuencia de ep�topo restringido por HLA-B*0702 optimizada derivado de un gen de ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702 se puede utilizar además, para la preparación de una composición medicinal para iniciar una respuesta inmune de CTL contra dicho ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702. La presente invención abarca además un procedimiento para vacunar a un paciente contra un ant�geno tumoral o viral, en el que dicho procedimiento comprende una primera etapa de vacunación con un p�ptido cognado optimizado a un ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702 nativo de dicho ant�geno, seguido de una segunda etapa de vacunación con dicho p�ptido nativo. En este procedimiento, la primera etapa y/o la segunda etapa se pueden realizar mediante la utilización de un polip�ptido quimérico que comprende dos, tres o más p�ptidos optimizados o crípticos tal como los que se han descrito anteriormente, en lugar de p�ptidos de un solo ep�topo.

La presente invención también se refiere a un kit de partes que comprende, en formulaciones separadas, un primer p�ptido que tiene la secuencia de un gen de un ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702 seleccionado del grupo que comprende las ID. SEC. No. 2 a 4, y un segundo p�ptido derivado de dicho primer p�ptido mediante un procedimiento para aumentar su inmunogenicidad, tal como se ha descrito anteriormente.

Otros kits de partes según la presente invención comprenden, como mínimo, un polip�ptido quimérico. Se contemplan varias variantes de estos kits: en una primera realización, el kit comprende, en formulaciones separadas, un primer polip�ptido quimérico que comprende dos, tres o más ep�topos crípticos restringidos por HLA-B*0702 y un segundo polip�ptido quimérico que corresponde a su polip�ptido quimérico cognado inmunog�nico restringido por HLA-B*0702 (lo que significa que comprende ep�topos inmunog�nicos restringidos por HLAB*0702 cognados optimizados a los ep�topos crípticos comprendidos en el primer polip�ptido quimérico). En una segunda realización, el kit comprende un primer polip�ptido quimérico que comprende dos, tres o más ep�topos crípticos restringidos por HLA-B*0702 y en una o varias otras formulaciones separadas, p�ptidos cognados correspondientes a los ep�topos inmunog�nicos restringidos por HLA-B*0702 optimizados para los ep�topos crípticos comprendidos en el primer polip�ptido quimérico. En una tercera realización, el kit comprende dos, tres o más p�ptidos que corresponden ep�topos crípticos restringidos por HLA-B*0702 diferentes, en el que dichos p�ptidos se mezclan bien en una sola formulación, o bien se separan en varias formulaciones y, en formulaciones separadas, un polip�ptido quimérico que comprende el gen de ep�topos cognados inmunog�nicos restringidos por HLA-B*0702 optimizados para dichos p�ptidos crípticos.

En la siguiente descripción de los kits según la presente invención, se har� mención sólo de los p�ptidos (nativos u optimizados), entendiéndose que los polip�ptidos quiméricos (que comprenden ep�topos crípticos nativos o ep�topos optimizados) quedan incluidos dentro de los kits en lugar de los p�ptidos de ep�topo único.

En una realización particular de la presente invención, el kit es un kit de vacunación, en el que dichos primer (nativo) y segundo (cognado optimizado) p�ptido est�n en dosis de vacunación separadas. En una realización preferente, el kit de vacunación comprende 2 � 3 dosis de p�ptido optimizado y 3, 4, 5 � 6 dosis de p�ptido nativo. Un kit de vacunación particular según la presente invención est� adaptado para una primera secuencia de vacunación de 6 inyecciones y comprende 2 � 3 dosis de p�ptido optimizado y 4 � 3 dosis de p�ptido nativo. En caso de enfermedades prolongadas, es preferente mantener el nivel de inmunidad obtenido después de esta primera vacunación, mediante dosis de recuerdo regulares. Esto se puede hacer, por ejemplo, mediante inyecciones realizadas cada 1,5 a 6 meses. Por lo tanto, los kits complementarios, que comprenden al menos 2 dosis, y hasta 40

o 50 dosis de p�ptido nativo, son también parte de la presente invención. Alternativamente, el kit de vacunación puede comprender de 2 a 3 dosis de p�ptido optimizado y 3 a 40 o hasta 50 dosis de p�ptido nativo. Por supuesto, dichos p�ptidos nativo y optimizado presentes en el kit son tal como los que se han descrito anteriormente.

Cada dosis comprende entre 0,5 y 10 mg de p�ptido, preferentemente de 1 a 5 mg, o entre 1 y 20 mg de polip�ptido. En una realización preferente, cada dosis se formula para inyección subcutánea. Por ejemplo, cada dosis se puede formular en 0,3 a 1,5 ml de una emulsión de solución acuosa emulsionada con Montanide, utilizado como un adyuvante. El técnico en la materia puede elegir cualquier otro adyuvante o adyuvantes en lugar del Montanide o además del mismo. En una realización particular, las dosis est�n en forma de una solución acuosa. Alternativamente, las dosis pueden estar en forma de un p�ptido liofilizado, para preparación al momento de la solución líquida para inyección. Otros componentes posibles de dichos kits son uno o varios adyuvantes, que se añaden a las composiciones de p�ptidos antes de la administración, y un prospecto que describe cómo utilizar dichos kits.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos.

Figura 1: Inmunogenicidad de p�ptidos restringidos por HLA-B*0702. Se ensayaron CTL contra objetivos de RMA-B7 cargados con p�ptido tal como se indica.

Figura 2: Inmunogenicidad de p�ptidos crípticos HLA-B*0702 optimizados. Se ensayaron CTL contra objetivos de RMA-B7 cargados con p�ptido tal como se indica.

Figura 3: Inmunogenicidad in vivo de p�ptidos optimizados HLA-B*0702 Her2/neu1069L9 (A) y Her2/neu1069 (B) en ratones transg�nicos HLA-B*0702. Se ensayaron CTL contra objetivos de RMA-B7 cargados con p�ptido tal como se indica. La población de CTL inducida se diluyó 3 (1), 10 (2), 30 (3) y 100 (4) veces.

Figura 4: TERT4 induce CTL específicos de TERT en ratones HLA-B7 y en donantes sanos. (A) Inmunogenicidad TERT4 en ratones transg�nicos HLA-B*0702. Se ensayaron CTL contra objetivos RMA-B7 cargados con dosis decrecientes de p�ptido TERT4. (B) Reconocimiento de TERT end�geno por CTL murinos específicos de TERT4. Se ensayaron CTL frente a células COS transfectadas con HLA-B*0702 y TERT tal como se indica. (C) Inducción de CTL humanos específicos de TERT4. Se ensayaron CTL contra objetivos T2-B7 cargados con TERT4 (_) o un p�ptido irrelevante (e) utilizando la relación efector/diana tal como se indica (gráfico de la izquierda), y contra líneas de células tumorales humanas HLA-B*0702 positivo TERT positivo SK-MES-1 (_), HBL100 (e) y HLA-B*0702 negativo TERT positivo SW-480 (0), HSS (0) (gráfico derecho).

Figura 5: Reconocimiento de TERT end�geno mediante CTL murinos específicos TERT444. (A) Se ensayaron CTL contra objetivos RMA-B7 cargados con dosis decrecientes de p�ptidos TERT444 o TERT444A1 tal como se indica.

(B) Se ensayaron CTL frente a células COS transfectadas con HLA-B*0702 y/o TERT tal como se indica.

Figura 6: Inducción de CTL humanos específicos de TERT444A1. Se ensayaron CTL contra objetivos T2-B7 cargados con p�ptidos tal como se indica. La activación máxima de CTL se obtiene mediante tratamiento con PMA/ionomicina.

EJEMPLOS

Los ejemplos se han realizado utilizando los siguientes materiales y procedimientos:

Ratones transg�nicos. Los ratones knockout HLA-B7 H-2 de clase I se han descrito anteriormente (Rohrlich y otros, Cells 2003). Las células murinas RMA-B7 y humanas T2-B7 transfectadas con HLA-B*0702 se han descrito anteriormente (Rohrlich y otros, 2003). Las células COS-7 y clon 13 de WEHI-164 fueron proporcionadas por F. Jotereau (INSERM 463, Nantes, Francia). Se utilizaron las líneas celulares SK-MES-1 (cáncer de pulmón), HBL-100 (cáncer de mama) HLA-B*0702 positivas y las SW-480 (cáncer de colon) y HSS (mieloma) HLA-B*0702 negativas líneas como objetivos de los CTL humanos. Todas las líneas celulares se cultivaron en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con FCS al 10%.

P�ptidos y pl�smidos. Los p�ptidos fueron sintetizados por Epytop (Nimes, Francia). El pl�smido HLA-B*0702 fue proporcionado por el Dr. Lemonnier (Institut Pasteur, París, Francia) (Rohrlich y otros, 2003) y el pl�smido TERT fue proporcionado por el Dr. Weinberg (MIT, Boston, MA) (Meyerson y otros, 1997).

Medici�n de la afinidad relativa de p�ptidos frente a HLA-B*0702. El protocolo utilizado se ha descrito anteriormente (Rohrlich y otros, 2003). En resumen, las células T2-B7 se incubaron a 37�C durante 16 horas con las concentraciones de p�ptidos que van desde 100 μM a 0,1 μM, y a continuación se tiñeron con el anticuerpo monoclonal (mAb) ME-1 para cuantificar la expresión de HLA-B*0702 en superficie. Para cada concentración de p�ptido, la tinción específica de HLA-B*0702 se calcul� como el porcentaje de tinción obtenido con 100 μM del p�ptido de referencia CMV265-274 (R10V; RPHERNGFTV, ID. SEC. No. 9). La afinidad relativa (AR) se determin� tal como:

AR = (concentración de cada p�ptido que induce el 20% de expresión de HLA-B*0702/Concentración del p�ptido de referencia que induce el 20% de expresión de HLA-B*0702).

Inducci�n de CTL in vivo en ratones transg�nicos HLA-B*0702. Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con 100 μg de p�ptido emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (IFA) en presencia de 150 μg de ep�topo T auxiliar HBVcore128 I-Ab limitado (TPPAYRPPNAPIL, ID. SEC. No. 10). Después de 11 días, se estimularon 5x107 células de bazo in vitro con p�ptido (10 μM). El 6� día de cultivo, las poblaciones de respuesta masiva fueron ensayadas respecto a la citotoxicidad específica.

Ensayo de procesamiento de p�ptidos en células COS-7 transfectadas. Se sembraron 2,2x104 células COS-7 de simio en placas de 96 pocillos de fondo plano en DMEM + 10% de FCS, por triplicado para cada condición. Dieciocho horas después, las células se transfectaron con 100 ng de cada pl�smido de ADN con DEAE dextrano. Después de 4 horas, se a�adi� PBS + 10% de DMSO durante 2 minutos. Las células COS transfectadas se incubaron en DMEM+10% de FCS durante 40 horas y posteriormente se utilizaron para estimular CTL murinos en un ensayo de secreción de TNFα.

Ensayo de secreción TNF . En el 4� día, se suspendieron células COS-7 transfectadas en 50 μl de RPMI + 10% de FCS y se utilizaron como células estimulantes. A continuación se añadieron 5x104 de células T murinas en 50 μl de RPMI 10% de FCS y se incubaron durante 6 horas. Cada condición se ensay� por triplicado. Se recogieron 50 μl del sobrenadante para medir el TNFα. Se prepararon diluciones estándar en 50 ml con dosis finales de TNFα que van desde 104 hasta 0 μg/ml. Tanto a los sobrenadantes como a las diluciones estándar, se añadieron 3x104 células WEHI-164c13 sensibles a TNFα en 50 μl. Estas se incubaron durante 16 horas a 37�C. La i nhibici�n de la proliferaci�n celular se evalu� por el procedimiento colorim�trico MTT (Espevik y Nissen-Meyer, 1986).

Generaci�n de CTL a partir de PBMC humano. Se recogió PBMC mediante leucof�resis de voluntarios HLAB*0702 sanos. Las células dendr�ticas (CD) se produjeron a partir de células adherentes cultivadas durante siete días (2x106 células/ml) en presencia de 500 UI/ml de GM-CSF y 500 UI/ml de IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) en medio completo (RPMI-1640 suplementado con 10% de suero AB humano inactivado por calor, 2 μM de L-glutamina y antibióticos). En el 7� día, se pulsaron CD con 10 μM de p�ptidos durante 2 horas; se añadieron en el cultivo agentes de maduración Poly I:C (Sigma, Oakville, Canadá) a 100 ng/ml y anti-CD40 (clon G28-5, ATCC, Manassas, Virginia) a 2 μg/ml y los CD se incubaron a 37�C durante la noche o hasta 48 horas. A continuación, se irradiaron CD maduras (3.500 rads). Se purificaron células CD8+ mediante selección positiva con microperlas CD8 (Miltenyi Biotec, Auburn, California) según las instrucciones del fabricante. Se estimularon 2x105 células CD8+ + 6x104 células CD8-con 2x104 de CD pulsadas con p�ptido en medio de cultivo completo suplementado con 1000 UI/ml de IL-6 y 5 UI/ml de IL-12 (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) en placas de 96 pocillos de fondo redondo. A partir del 7� día, los cultivos se volvieron a estimular semanalmente con CD cargadas con p�ptido en presencia de 20 UI/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron Corp., Emeryville, California) y 10 ng/ml de IL-7 (R&D Systems, Minneapolis,

Minnesota). Después de la tercera reestimulaci�n in vitro, se evalu� la citotoxicidad de los cultivos celulares en masa (frente a TERT4) y la tinción intracelular de IFNγ (frente a TERT444A1).

Ensayo citot�xico. Los objetivos se marcaron con 100 μCi de Cr51 durante 60 min, se sembraron en placas de 96 pocillos con fondo en V (3x103 células/pocillo en 100 μl de medio RPMI 1640) y, cuando fue necesario, se pulsaron con p�ptidos (1 μM) a 37�C durante 2 horas. A continuación se a�adie ron efectores en los pocillos y se incubaron a 37�C durante 4 horas. Se determin� el porcentaje de lisis específica como: % de Lisis = (liberación experimental liberación espontánea)/(liberación máxima -liberación espontánea) x 100

Tinci�n intracelular de IFN . Las células T (105) se incubaron con 2x105 células T2 cargadas con p�ptido estimulante en presencia de 20 μg/ml de Brefeldina A (Sigma, Oakville, Canadá). Seis horas más tarde, se lavaron, se tiñeron con anticuerpo anti-CD8 conjugado con r-ficoeritrina (Caltag Laboratories, Burlingame, California, EE.UU.) en PBS durante 25 min a 4�C, se lavaron de nuevo, y se fijaron con PFA al 4%. Posteriormente las células se permeabilizaron con PBS, 0,5% de BSA, 0,2% de saponina (Sigma, Oakville, Canadá), y se marcaron con un mAb anti-IFNγ conjugado con aloficocianina (Pharmingen, Mississauga, Canadá) durante 25 min a 4�C antes del an�lisi s con un cit�metro de flujo FACSCalibur �.

Ejemplo 1: Afinidad de p�ptidos

Se ensayaron ocho p�ptidos con los motivos de anclaje específicos por HLA-B*0702, es decir, P2 y preferentemente L/V en la posición del extremo C terminal (Sidney y otros, 1996) que pertenecen a los ant�genos Hsp70 (Hsp70115, Hsp70137, Hsp70397), TERT (TERT4 y TERT444) y MAGE-A (MAGE-A121.1, MAGE-A121.2 y MAGE-A121.4) respecto a su unión a la molécula HLA-B*0702. Sólo TERT4 se unió a HLA-B*0702 con una elevada afinidad, los siete p�ptidos restantes fueron muy débiles o no enlazantes (Tabla II). Esto demuestra que la presencia de motivos de anclaje no es suficiente para asegurar una elevada afinidad de unión frente por HLA-B*0702. Dada su baja afinidad, los p�ptidos Hsp70115, Hsp70137, Hsp70397, TERT444, MAGE-A121.1, MAGE-A121.2, A121.4 MAGE-, se consideran p�ptidos crípticos.

Tabla II: Afinidad de p�ptidos por HLA-B*0702

P�ptido: Secuencia AR ID: SEC: No.

1: Hsp70 115 YPEEISSMVL >10 11

Hsp70 115A1: APEEISSMVL >10 12

2: Hsp70 137 (10) YPVTNAVITV >10 13

3: Hsp70 397 APLSLGLET >10 14

4: TERT4 APRCRAVRSL 0,74 15

5: TERT444 DPRRLVQLL >10 1

TERT 444A1: APRRLVQLL 1,4 5

6: MAGE-A121.1 EPVTKAEML >10 16

MAGE-121.1 A1: APVTKAEML >10 17

7: MAGE-A121.2 EPFTKAEML >10 18

8: MAGE-A121.4 EPITKAEIL >10 19

Ejemplo 2: Inmunogenicidad de p�ptidos seleccionados

Los p�ptidos de baja afinidad Hsp137, Hsp115, HSP397, TERT444 y de alta afinidad TERT4 se han ensayado respecto a su capacidad de inducir una respuesta inmune específica de CTL en ratones transg�nicos HLA-B*0702. Sólo la elevada afinidad TERT4 era inmunog�nica, lo que confirma que la inmunogenicidad de los p�ptidos est� fuertemente relacionada con su afinidad respecto por HLA (Figura 1).

Ejemplo 3: Aumento de la afinidad de los p�ptidos de baja afinidad

Dado que todos estos p�ptidos crípticos tenían motivos favorables de anclaje primario, el aumento de su afinidad es un prerrequisito para que sean inmunog�nicos. Se requiere la identificación de los motivos de anclaje secundarios desfavorables y su sustitución con motivos favorables. Sin embargo, estas sustituciones deben preservar la conformación del segmento de p�ptido que interact�a con el TCR (posición 4 a la posición 8). El interés, por lo tanto, estuvo centrado en las posiciones de anclaje secundarias 1 y 3: los amino�cidos alif�ticos son motivos favorables en la posición 1 (Sidney, Southwood y otros, 1996). Sin embargo, los p�ptidos Hsp70115 y Hsp70137 que tienen una Y (tirosina) en la posición 1 son no enlazantes. Por otra parte, la sustitución del amino�cido en la posición 1 por una A (alanina), que también es favorable en esta posición (Parker y otros 1994) aumenta la afinidad de la TERT444 pero no de la Hsp70115 y los p�ptidos de MAGE-A121.1 (Tabla II). Esto indica que la presencia de amino�cidos favorables en la posición 1 y las posiciones de anclaje 2 y 9/10 no puede asegurar por s� misma una elevada afinidad de unión de todos los p�ptidos. Por otra parte, se han descrito que los p�ptidos cargados positivamente (R/H/K) son favorables en la posición 3 (Sidney y otros, 1996) y diez de 26 p�ptidos inmunog�nicos identificados derivados de tumores y del VIH tienen un R/K/H en la posición 3 (Tabla III).

Tabla III: Ep�topos restringidos por HLA-B*0702 derivados de tumores y del VIH

Ant�geno: Secuencia ID. SEC. No. Referencia

NY-ESO-1: APRGVRMAV 20 Slager y otros, 2004

ICE: SPRWWPTCL 21 Ronsin y otros, 1999

RAGE-1: SPSSNRIRNT 22 Gaugler y otros, 1996

RU2AS: LPRWPPPQL 23 Van Den Eynde y otros, 1999

RBAF500: RPHVPESAF 24 Lennerz y otros, 2005

Prote�na de fusión SSX2: QPRYGYDQIM 25 Worley y otros, 2001

HIVp17: RPGGKKRYKL 26 Bases de datos de Inmunolog�a Molecular de HIV (Gestionada por Los Alamos National Security, LLC, para el U.S. Department of Energy’s National Nuclear Security Administration) http://hivweb.lanl.gov/content/immunology/tables/ctl summary.html

HIVp24: SPRTLNAWV 27

HIVp24: HPVHAGPIA 28

HIVp24: PPIPVGEIY 29

HIVp24: GPGHKARVL 30

HIV-RT: GPKVKQWPLT 32

HIV-RT: SPAIFQSSM 33

HIV-RT: IPLTEEAEL 34

HIV-RT: QPDKSESELV 35

HIV-Vif: HPRISSEVHI 36

HIV-Vif: KPPLPSVKKL 37

HIV-Vif: FPRTWLHGL 38

HIVgp 160: KPCVKLTPLC 39

HIVgp160: KVVSTQLLL 40

HIVgp160: RPWNNTRKSI 41

HIVgp160: IPRRIRQGL 42

HIVnef: FPVTPQVPL 43

HIVnef: TPQVPLRPM 44

Seg�n todas estas observaciones, todos los p�ptidos con la secuencia de APX3X4X5X6X7X8X9X10X11 (Id. Sec. No. 61) deben tener una elevada afinidad por HLA-B*0702. Esto se confirma por los resultados mostrados en la Tabla 5 IV. Todos los dieciocho p�ptidos con la secuencia citada anteriormente tenían una elevada afinidad y/o fueron inmunog�nicas en ratones transg�nicos HLA-B*0702.

Tabla IV. Afinidad e inmunogenicidad de p�ptidos restringidos por HLA-B*0702 APX3X4X5X6X7X8X9X10X11.

-: = AR>10, + = 1< AR <10, ++ = AR<1. La inmunogenicidad se ensay� tal como se describe en el ejemplo 2.

10 + : significa que se gener� una inmunorespuesta en , como mínimo, un ratón transg�nico HLA-B*0702, ND : No determinado

Secuencia: ID: SEC: No. AR Inmunogenicidad

APRRLVQLL: 5 + +

APRSPLAPL: 6 ++ +

APKANKEIL: 7 ND +

APKHSDCLA: 8 ND +

APRCRAVRSL: 15 + +

APRMHCAVDL: 45 ++ +

APRVSIRLPL: 46 ++ ND

APREYVNAL: 47 + +

APRGVPQIEL: 48 ND +

APRALVETL: 49 + +

APRMPEAAL: 50 ND +

APRRRLGCEL: 51 + +

APRPWTPCL: 52 + +

APRASSPLL: 53 ND +

APRQLGREL: 54 ND +

APREISSMVL: 55 + +

APRSLGLEL: 56 ++ +

APRTKAEML: 57 + +

Ejemplo 4: Inmunogenicidad in vivo de p�ptidos con afinidad aumentada y reconocimiento de la contraparte nativa

Ratones transg�nicos HLA-B7 fueron vacunados con los p�ptidos seleccionados, y once días después, sus células de bazo se estimularon in vitro con el p�ptido.

En este contexto por lo tanto, Hsp70115, Hsp70397 y TERT444 fueron modificados en la posición 1 (sustitución del amino�cido por una A) y/o la posición 3 (sustitución del amino�cido por una R). Para el p�ptido Hsp70397 se ha introducido una modificación adicional en la posición del extremo C terminal (sustitución de T por una L). P�ptidos modificados, es decir, Hsp70115A1R3 (ID. SEC. No. 55), Hsp70397R3L9 (ID. SEC. No. 56), TERT444A1 (ID. SEC. No. 5) mostraron una fuerte afinidad por HLA-B*0702 (Tabla IV) y se indujo una respuesta inmune en la mayoría de los ratones vacunados (Figura 2). Sin embargo, para todos los p�ptidos excepto el TERT444A1, los CTL generados reconocieron el p�ptido optimizado, pero no el p�ptido nativo (Figura 2) correspondiente. Esto sugiere fuertemente que la sustitución del amino�cido en la posición 3 por una R puede cambiar la conformación del segmento de p�ptido que interact�a con el TCR y garantiza el reconocimiento cruzado con TCR.

Dado que a) todos los p�ptidos ensayados con APX3X4X5X6X7X8X9X10X11 tienen una elevada afinidad y son inmunog�nicos (Tabla IV y la Figura 1, 2) y b) la sustitución del amino�cido en la posición 3 por un R puede impedir el reconocimiento mutuo del p�ptido nativo, los presentes inventores seleccionaron p�ptidos nativos que tienen una P y una R en las posiciones 2 y 3, respectivamente, y sustituyeron el amino�cido en la posición 1 por una A si el último amino�cido era favorable (L, A, I, V o M). Dada la gran importancia de la posición 3, tanto en la afinidad como en el reconocimiento de CTL de p�ptidos restringidos por HLA-B*0702, los presentes inventores seleccionaron p�ptidos con la secuencia X1PX3 (en los que X1 es cualquier amino�cido y X3 es K, R, H o M; estos amino�cidos se han descrito como residuos favorables en la posición 3) y un amino�cido favorable (A/I/L/V) en la posición del extremo C terminal. Los p�ptidos con esta secuencia y baja afinidad por HLA-B*0702 se han modificado por sustitución del primer residuo por una A. Este es el caso de TERT444, Her-2/neu760 y Her-2/neu246. Los presentes inventores también seleccionaron p�ptidos con la secuencia de APX3 (en los que X3 es K, R, H o M) y un residuo no favorable en la posición del extremo C terminal (es decir, un amino�cido distinto de L, A, I, V o M). Los p�ptidos con esta secuencia y baja afinidad por HLA-B*0702 se han modificado mediante la sustitución del residuo en la posición del extremo C terminal con una L. Este es el caso de Her-2/neu1069. Todos estos p�ptidos modificados tenían una fuerte afinidad por HLA-B*0702.

Ejemplo 5: Inmunogenicidad de p�ptidos optimizados y reconocimiento mutuo de la contraparte nativa

Los p�ptidos nativos Her2/neu246, Her2/neu760, Her2/neu1069 y TERT444 no fueron inmunog�nicos, mientras que los p�ptidos optimizados fueron inmunog�nicos en ratones transg�nicos HLA-B*0702. Por otra parte, los CTL inducidos por todos estos p�ptidos optimizados fueron capaces de producir reconocimiento mutuo con el correspondiente p�ptido nativo (Figura 3 y Tabla V).

P�ptido: Secuencia ID: SEC: No. Inmunogenicidad Reconocimiento mutuo del p�ptido nativo correspondiente

TERT444: DPRRLVQLL 1 -

TERT444A1: APRRLVQLL 5 + +

Her2/neu760: APKANKEIL 3 -

Her2/neu760A1: APKANKEIL 7 + +

Her2/neu246: GPKHSDCLA 4 -

Her2/neu246A1: APKHSDCLA 8 + +

Her2/neu1069: APRSPLAPS 2 -

Her2/neu1069L9: APRSPLAPL 6 + +

Tabla V: La inmunogenicidad de p�ptidos restringidos por HLA-B*0702 nativos y optimizados. + para la inmunogenicidad o reconocimiento mutuo del p�ptido nativo significa que el p�ptido indujo una respuesta específica en, como mínimo, un ratón transg�nico HLA-B*0702, capaz de reconocer el p�ptido nativo correspondiente.

En conclusión, los presentes inventores han descrito un procedimiento para optimizar la inmunogenicidad (y también la afinidad) de p�ptidos crípticos restringidos por HLAB*0702. Este comprende a) sustituir el residuo en la posición 1 con una A en todos los p�ptidos que comprenden la secuencia X1PX3 (en la que X1 es cualquier amino�cido excepto A y X3 es R o K o H o M), un amino�cido favorable en la posición del extremo C terminal (es decir, L o A o I o V o M), y una baja afinidad por HLA-B*0702, o b) sustituir el residuo en la posición C terminal con una L en p�ptidos que comprenden la secuencia de APX3 (X3 se define tal como anteriormente), un residuo no favorable en la posición C terminal (es decir, un amino�cido diferente que L o A o I o V o M), y una baja afinidad por HLA-B*0702.

Ejemplo 6: El p�ptido inmunodominante TERT4 induce CTL específicos de TERT

Ratones transg�nicos HLA-B7 se inmunizaron a continuación con TERT4 (ID. SEC. No. 15) y once días más tarde se estimularon sus células de bazo in vitro con el p�ptido. Los CTL generados mataron a los objetivos RMA-B7 cargados con concentraciones decrecientes de p�ptido TERT4 (Figura 4A). El 50% de lisis máxima de los objetivos cargados con TERT4 se obtuvo con 1,5 nM (Figura 4A). Se ensayaron a continuación CTL respecto a su capacidad para reconocer células COS-7 que expresan HLA-B*0702 y TERT end�geno. Los resultados presentados en la Figura 4B demuestran que los CTL reconocieron células COS-7 transfectadas tanto con HLA-B*0702 como con

TERT pero no células COS-7 transfectadas bien con HLA-B*0702 o bien con TERT, lo que demuestra que el p�ptido dominante TERT4 es un ep�topo restringido por HLA-B*0702 procesado de forma natural a partir de TERT end�geno.

Por otra parte, se estimularon in vitro células CD8 de donantes sanos con células dendr�ticas aut�logas cargadas con el p�ptido TERT4. Después de cuatro estimulaciones, se ensayaron CTL para determinar la citotoxicidad contra objetivos T2-B7 cargados con TERT4. Se ensayaron tres donantes y se indujeron CTL en dos de ellos. Los resultados de un donante que responde se presentan en la Figura 4C. Los CTL mataron a los objetivos T2-B7 que presentan TERT4 pero no a las células T2-B7 que presentan el p�ptido Nef irrelevante (gráfico de la izquierda). Curiosamente, los CTL mataron a las líneas de células tumorales humanas HLA-B*0702 TERT + SK-MES-1 y HBL100, pero no a las de HLA-B*0702-TERT + SW-480 y HSS, confirmando la presentación restringida de HLA-B*0702 y el procesamiento end�geno del ep�topo TERT4 (gráfico de la derecha).

Ejemplo 7: Los CTL inducidos por p�ptidos TERT444A1 reconocen el TERT end�geno

Se ensay� TERT444A1 (ID. SEC. No. 5) respecto a su capacidad para inducir CTL capaces de reconocer de TERT end�geno y para inducir CTL en donantes sanos (Ejemplo 6). Se inmunizaron ratones transg�nicos HLA-B*0702 con TERT444A1 y once días más tarde se estimularon sus células de bazo in vitro con el p�ptido TERT444 nativo (ID. SEC. No. 1). Los CTL generados mataron a los objetivos RMA-B7 cargados con concentraciones decrecientes de p�ptidos TERT444A1 y TERT444. El 50% lisis máxima de los objetivos cargados con TERT444 y cargados con TERT444A1 se obtuvo con 5,5 nM y 1 nM, respectivamente (Figura 5A). Los CTL se ensayaron a continuación respecto a su capacidad para reconocer células COS-7 que expresan HLA-B*0702 y TERT end�geno. Los resultados presentados en la Figura 5B muestran que los CTL reconocieron células COS-7 transfectadas tanto con HLA-B*0702 como con TERT pero no células COS-7 transfectadas bien con HLA-B*0702 o TERT lo que demuestra que TERT444 es una ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702 procesado de forma natural a partir de TERT end�geno.

Ejemplo 8: TERT444A1 Estimula CTL de donantes sanos

Se estimularon células CD8 de donantes sanos in vitro con células dendr�ticas aut�logas cargadas con el p�ptido TERT444A1. Después de cuatro estimulaciones, las células proliferantes fueron divididas en 4 grupos. A continuación, cada grupo se ensay� respecto a la producción de IFNg intracelular tras la estimulaci�n con células T2-B7 cargadas con TERT444A1 optimizado o TERT444 nativo. Los resultados del donante D5609 que responde se presentan en la Figura 6. Los CTL que producen IFNg se detectaron en los grupos 2 y 4 después de la estimulaci�n con células T2B7 cargadas bien con TERT444 o bien con TERT444A1 (Figura 6).

REFERENCIAS

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> VAXON BIOTECH KOSMATOPOULOS, Kostantinos (Kostas) GRAFF-DUBOIS, St�phanie MENEZ-JAMET

<120> IDENTIFICACIÓN, OPTIMIZACIÓN Y UTILIZACIÓN DE EPITOPOS CRÍPTICOS HLA-B7 PARA INMUNOTERAPIA

<130> VMA/bv-F1788/3PCT

<150> PCT/IB2006/002937

<151> 2006-07-12

<160> 61

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<212> PRT

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<223> TERT

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<223> HER-2/neu

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<223> Ep�topo críptico HLA-B7 HER-2/neu

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<223> Ep�topo críptico HLA-B7 HER-2/neu

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<223> Ep�topo inmunog�nico derivado de Her-2/neu

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<223> Ep�topo inmunog�nico derivado de Her-2/neu

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<223> P�ptido

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<223> 115A1R3 50

<400> 55

55 <210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

60 <220>

<223> 397R3L9

<400> 56

<210> 57

<211> 9

<212> PRT 10 <213> Artificial

<220>

<223> 121.1 A1R3

15 <400> 57

<210> 58 20 <211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 25 <223> Ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

<222>: (1)..(1) 30 <223> Xaa es cualquier amino�cido de origen natural

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

<222>: (3)..(3) 35 <223> Xaa es Arg o Lys o His o Met

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

<222>: (4)..(7) 40 <223> Xaa es independientemente cualquier amino�cido de origen natural

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

<222>: (8)..(10) 45 <223> Xaa es independientemente cualquier amino�cido de origen natural o ninguno

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

<222> (11)..(11)

50 <223> Xaa es cualquier amino�cido de origen natural con la condición de que si Xaa (1)..(1) es Ala entonces Xaa (11)..(11) no es ni Leu ni Ala ni lle ni Val ni Met; y si Xaa (1)..(1) no es Ala entonces Xaa (11)..(11) es Leu o Ala o lle

o Val o Met

<400> 58 55

<210> 59

<211> 11 60 <212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702

<220> 5 <221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es cualquier amino�cido de origen natural excepto Ala

<220>

10 <221> CARACTERÍSTICAS VARIAS <222>(3)..(3)

<223> Xaa es Arg o Lyso His o Met

<220>: 15 <221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

<222> (4)..(7)

<223> Xaa es independientemente cualquier amino�cido de origen natural

<220>: 20 <221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

<222> (8)..(10)

<223> Xaa es independientemente cualquier amino�cido de origen natural o ninguno

<220>: 25 <221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

<222> (11)..(11)

<223> Xaa es Leu o Ala olle o Val o Met

<400> 59 30

<210> 60

<211> 11 35 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223>: Ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702 40

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

<222> (3)..(3)

<223>: Xaa es Arg o Lys o His o Met 45

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

<222> (4)..(7)

<223>: Xaa es independientemente cualquier amino�cido de origen natural 50

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

<222> (8)..(10)

<223>: Xaa es independientemente cualquier amino�cido de origen natural o ninguno 55

<220>

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

<222> (11)..(11)

<223>: Xaa es cualquier amino�cido de origen natural diferente de Leu o Ala o lle o Val o Met 60

<400> 61

Claims

REIVINDICACIONES

1. Ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702, que es un p�ptido seleccionado del grupo que comprende

APRSPLAPS (ID. SEC. No. 2), SPKANKEIL (ID. SEC. No. 3), GPKHSDCLA (ID. SEC. No. 4). 5
2. Ep�topo inmunog�nico restringido por HLA-B*0702, que es un p�ptido optimizado derivado de un p�ptido críptico, según la reivindicación 1, en el que dicho ep�topo inmunog�nico se selecciona del grupo que comprende APRSPLAPL (ID. SEC. No. 6), APKANKEIL (ID. SEC. No. 7), APKHSDCLA (ID. SEC. No. 8).

10 3. Polip�ptido quimérico, que comprende dos, tres o más ep�topos crípticos restringidos por HLA-B*0702 seleccionados del grupo que comprende APRSPLAPS (ID. SEC. No. 2), SPKANKEIL (ID. SEC. No. 3), GPKHSDCLA (ID. SEC. No. 4), DPRRLVQLL (ID. SEC. No. 1).
4. Polip�ptido quimérico, que comprende dos, tres o más ep�topos inmunog�nicos restringidos por HLA-B*0702

15 seleccionados del grupo que comprende APRSPLAPL (ID. SEC. No. 6), APKANKEIL (ID. SEC. No. 7), APKHSDCLA (ID. SEC. No. 8) y APRRLVQLL (ID. SEC. No. 5).
5. Molécula de ácido nucleico aislada diseñada para causar la expresión de un ep�topo críptico restringido por HLA

B*0702, según la reivindicación 1, un ep�topo inmunog�nico, según la reivindicación 2, o un polip�ptido quimérico, 20 según la reivindicación 3 o la reivindicación 4.
6. Composición farmacéutica que comprende, como mínimo, como un principio activo, un ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702 según la reivindicación 1, o un polip�ptido ep�topo inmunog�nico, según la reivindicación 2, o un polip�ptido quimérico, según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, o un ácido nucleico según la reivindicación 5.
7.

Composici�n farmacéutica, según la reivindicación 5, que es una vacuna.
8.

Kit de partes que comprende, en formulaciones separadas, un primer p�ptido que tiene la secuencia de un ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702, y un segundo p�ptido que corresponde a su ep�topo inmunog�nico

30 restringido por HLA-B*0702 cognado, en el que dicho primer p�ptido es un ep�topo críptico, según la reivindicación 1, y dicho segundo p�ptido es un p�ptido inmunog�nico, según la reivindicación 2.
9. Kit de partes que comprende, en formulaciones separadas, un primer polip�ptido quimérico que comprende dos, tres o más ep�topos crípticos restringidos por HLAB *0702, y un segundo polip�ptido quimérico que comprende los

35 ep�topos inmunog�nicos restringidos por HLA-B*0702 cognados a los ep�topos crípticos restringidos por HLAB*0702 comprendidos en el primer polip�ptido quimérico, en el que dicho primer polip�ptido quimérico es un polip�ptido quimérico, según la reivindicación 3, y dicho segundo polip�ptido quimérico es un polip�ptido quimérico, según la reivindicación 4.

40 10. Kit, según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, que es un kit de vacunación, en el que dichos primer y segundo p�ptidos o polip�ptidos quiméricos est�n en dosis de vacunación separadas.
11. Kit de vacunación, según la reivindicación 10, que comprende 2 � 3 dosis de segundo p�ptido o polip�ptido

quim�rico, y 3, 4, 5, 6 o hasta 50 dosis de primer p�ptido o polip�ptido quimérico. 45
12. Vacuna, según la reivindicación 7, o kit de vacunación, según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en la que cada dosis comprende de 1 a 5 mg de p�ptido o de 1 a 20 mg de polip�ptido quimérico.
13. Vacuna, según la reivindicación 7 o la reivindicación 12, o kit de vacunación según cualquiera de las 50 reivindicaciones 9 a 11 en la que las dosis de vacunación se formulan para inyección subcutánea.
14. Ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702, según la reivindicación 1, o un polip�ptido ep�topo inmunog�nico según la reivindicación 2, o un polip�ptido quimérico según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, o un ácido nucleico según la reivindicación 5, para su utilización en inmunoterapia preventiva o curativa contra el cáncer.
15.

P�ptido, según la reivindicación 1, para su utilización para el mantenimiento de la respuesta inmune de CTL iniciado por su p�ptido cognado optimizado, o por un polip�ptido que contiene el mismo.
16.

Polip�ptido quimérico, según la reivindicación 3, para su utilización para mantener la respuesta inmune iniciada

60 por CTL ya sea por su polip�ptido quimérico optimizado cognado, o por p�ptidos optimizados cognados a dicho ep�topos crípticos.
17. P�ptido inmunog�nico, según la reivindicación 2, para su utilización para iniciar una respuesta inmune de CTL

contra su ep�topo críptico restringido por HLA-B*0702 cognado. 65
18. Polip�ptido quimérico, según la reivindicación 4, para su utilización para iniciar una respuesta inmune de CTL contra los ep�topos crípticos restringidos por HLA-B*0702 cognados a los ep�topos presentes en dicho polip�ptido quimérico.