ES2481408T3 - Derivados sustituidos de indolilalquilaminas como inhibidores de histona-desacetilasas - Google Patents

Abstract

Un compuesto de la fórmula (I),**Fórmula** las formas N-óxido, las sales de adición farmacéuticamente aceptables y las formas estereoquímicamente isoméricas de los mismos, en el que: n es 0 o 1 y cuando n es 0, quiere indicarse un enlace directo; m es 0, 1 o 2 y cuando m es 0, quiere indicarse un enlace directo; p es 0 o 1 y cuando p es 0, quiere indicarse un enlace directo; X es N; cada Y es independientemente O, NH, N-alquilo C1-6, CH o CH2 y cuando Y es CH, el sustituyente está unido al átomo Y de la estructura de anillo; R1 es hidroxi o un radical de la fórmula (a-1) **Fórmula**

Description

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DESCRIPCIÓN

Derivados sustituidos de indolilalquilaminas como inhibidores de histona-desacetilasas

5 Esta invención se refiere a compuestos que inhiben la actividad enzimática de las histona-desacetilasas (HDAC). Además se refiere a procedimientos para su preparación, a composiciones que los contienen, así como a su uso, tanto in vitro como in vivo, para la inhibición de las HDAC y como medicamento, por ejemplo, como medicamento para la inhibición de afecciones proliferativas como cáncer y psoriasis.

Las histonas nucleares son conocidas como componentes integrales y dinámicos de la maquinaria responsable de la regulación de la transcripción génica y otros procesos que usan un molde de ADN como la replicación, la reparación, la recombinación y la segregación cromosómica. Son objeto de modificaciones postraduccionales, incluidas acetilación, fosforilación, metilación, ubicuitinación y ADP-ribosilación.

15 Las histona-desacetilasas, denominadas en este documento “HDAC”, son enzimas que catalizan la eliminación de la modificación de acetilo en restos de lisina de las proteínas, incluidas las histonas del núcleo de los nucleosomas H2A, H2B, H3 y H4. Juntamente con las histona-acetiltransferasas, denominadas en este documento “HAT”, las HDAC regulan el nivel de acetilación de las histonas. El equilibrio de acetilación de las histonas nucleosómicas desempeña un papel importante en la transcripción de numerosos genes. La hipoacetilación de las histonas está asociada con una estructura condensada de la cromatina que resulta en la represión de la transcripción génica, mientras que las histonas acetiladas están asociadas con una estructura más abierta de la cromatina y la activación de la transcripción.

Se han descrito once HDAC relacionadas estructuralmente que se agrupan en dos clases. La clase I de HDAC

25 consta de las HDAC 1, 2, 3, 8 y 11, mientras que la clase II de HDAC consta de las HDAC 4, 5, 6, 7, 9 y 10. Los miembros de una tercera clase de HDAC no están relacionados estructuralmente con las HDAC de las clases I y II. Las HDAC de las clases I y II operan por mecanismos dependientes de cinc, mientras que las HDAC de la clase III dependen de NAD.

Además de las histonas, también otras proteínas son sustratos de acetilación, en particular factores de transcripción como p53, GATA-1 y E2F, receptores nucleares como el receptor de glucocorticoides, los receptores tiroideos y los receptores de estrógenos y proteínas reguladoras del ciclo celular como pRb. La acetilación de las proteínas se ha relacionado con su estabilización, como la estabilización de p53, la atracción de cofactores y el aumento de la unión a ADN. La proteína p53 es un supresor tumoral que puede inducir la parada del ciclo celular o la apoptosis en

35 respuesta a diversas señales de estrés, como daños en el ADN. La diana principal para la parada del ciclo celular inducida por p53 parece ser el gen p21. Además de por su activación por p53, p21 se ha identificado por su asociación con ciclina o complejos de cinasa dependientes de ciclina que resulta en la parada del ciclo celular en las dos fases G1 y G2, su regulación por aumento durante la senescencia y su interacción con el antígeno nuclear de proliferación celular.

El estudio de los inhibidores de las HDAC indica que estas desempeñan un papel importante en la parada del ciclo celular, la diferenciación celular, la apoptosis y la reversión de fenotipos transformados.

Por ejemplo, el inhibidor tricostatina A (TSA) causa la parada del ciclo celular en las dos fases G1 y G2, revierte el

45 fenotipo transformado de diferentes líneas celulares e induce la diferenciación de las células con leucemia de Friend y se ha descrito que otras TSA (y el ácido suberoilanilidohidroxámico, SAHA) inhiben el crecimiento celular, inducen la diferenciación terminal e impiden la formación de tumores en ratones (Finnin y col., Nature, 401: 188-193, 1999).

También se ha descrito que la tricostatina A es útil en el tratamiento de fibrosis, por ejemplo, fibrosis hepática y cirrosis hepática (Geerts y col., solicitud de patente europea EP 0827742, publicada el 11 de marzo de 1998).

El farmocóforo para los inhibidores de las HDAC consta de un dominio de unión a metales que interacciona con el sitio activo que contiene cinc de las HDAC, un dominio enlazante y un dominio de reconocimiento superficial o región de bloqueo que interacciona con restos en el borde del sitio activo.

55 También se ha descrito que los inhibidores de las HDAC inducen la expresión del gen p21. La activación transcripcional del gen p21 por estos inhibidores es estimulada por la remodelación de la cromatina que sigue a la acetilación de las histonas H3 y H4 en la región promotora de p21. Esta activación de p21 tiene lugar de manera independiente de p53 y, por lo tanto, los inhibidores de las HDAC son operativos en células con genes p53 mutados, una característica distintiva de numerosos tumores.

Además, los inhibidores de las HDAC pueden tener actividades indirectas como el aumento de las respuestas inmunitarias del huésped y la inhibición de la angiogénesis tumoral y, de este modo, pueden suprimir el crecimiento de tumores primarios e impedir la metástasis (Mai y col., Medicinal Research Reviews, 25: 261-309, 2005).

65 A la vista de lo anterior, los inhibidores de las HDAC pueden tener un gran potencial en el tratamiento de

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enfermedades o afecciones proliferativas, incluidos tumores con genes p53 mutados.

La solicitud de patente EP 1472216, publicada el 14 de agosto de 2003, desvela hidroxamatos bicíclicos como inhibidores de histona-desacetilasas.

5 Las solicitudes de patente EP 1485099, EP 1485348, EP 1485353, EP 1485354, EP 1485364, EP 1485365, EP 1485370 y EP 1485378, publicadas el 18 de septiembre de 2003, entre otras, desvelan ácidos piperazinilpirimidinilhidroxámicos sustituidos como inhibidores de histona-desacetilasas y, además, el documento EP 1485365 desvela R306465.

La solicitud de patente EP 1492534, publicada el 9 de octubre de 2003, desvela compuestos de ácido carbámico que comprenden un enlace de piperazina como inhibidores de las HDAC.

La solicitud de patente EP 1495002, publicada el 23 de octubre de 2003, desvela compuestos de 15 piperazinilfenilbenzamida sustituidos como inhibidores de histona-desacetilasas.

La solicitud de patente EP 1501508, publicada el 13 de noviembre de 2003, desvela benzamidas como inhibidores de histona-desacetilasas.

La solicitud de patente WO 04/009536, publicada el 29 de enero de 2004, desvela derivados que contienen un enlazante alquilo entre el grupo arilo y el hidroxamato como inhibidores de histona-desacetilasas.

La solicitud de patente EP 1525199, publicada el 12 de febrero de 2004, desvela hidroxamatos bicíclicos sustituidos con (hetero)arilalquenilo como inhibidores de histona-desacetilasas.

25 La solicitud de patente EP 1572626, publicada el 24 de junio de 2004, desvela derivados (2-aminofenil)amídicos de ácidos arilenocarboxílicos como agentes farmacológicos.

La solicitud de patente EP 1581484, publicada el 29 de julio de 2004, desvela derivados de N-hidroxibenzamida con actividad antiinflamatoria y antitumoral.

La solicitud de patente EP 1585735, publicada el 29 de julio de 2004, desvela derivados sustituidos de hidroxamato de arilo como inhibidores de histona-desacetilasas.

35 La solicitud de patente EP 1592667, publicada el 19 de agosto de 2004, desvela derivados de O-fenilendiaminas monoaciladas como agentes farmacológicos.

La solicitud de patente EP 1590340, publicada el 19 de agosto de 2004, desvela derivados de diaminofenileno como inhibidores de histona-desacetilasas.

La solicitud de patente EP 1592665, publicada el 26 de agosto de 2004, desvela derivados de benzamida como inhibidores de histona-desacetilasas.

La solicitud de patente WO 04/072047, publicada el 26 de agosto de 2004, desvela indoles, bencimidazoles y 45 naftimidazoles como inhibidores de histona-desacetilasas.

La solicitud de patente EP 1608628, publicada el 30 de septiembre de 2004, desvela hidroxamatos enlazados a sistemas de anillos heterocíclicos no aromáticos como inhibidores de histona-desacetilasas.

La solicitud de patente EP 1613622, publicada el 14 de octubre de 2004, desvela derivados de oximas como inhibidores de histona-desacetilasas.

La solicitud de patente EP 1611088, publicada el 28 de octubre de 2004, desvela derivados de hidroxamatos como inhibidores de histona-desacetilasas.

55 La solicitud de patente WO 05/028447, publicada el 31 de marzo de 2005, desvela bencimidazoles como inhibidores de histona-desacetilasas.

Las solicitudes de patente WO 05/030704 y WO 05/030705, publicadas el 7 de abril de 2005, desvelan benzamidas como inhibidores de histona-desacetilasas.

La solicitud de patente WO 05/040101, publicada el 6 de mayo de 2005, desvela hidroxamatos conectados a acilurea y a sulfonilurea como inhibidores de histona-desacetilasas.

65 La solicitud de patente WO 05/040161, también publicada el 6 de mayo de 2005, desvela hidroxamatos enlazados a biarilo como inhibidores de histona-desacetilasas.

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La solicitud de patente WO 05/075469, publicada el 18 de agosto de 2005, desvela ácidos tiazolilhidroxámicos y tiadiazolilhidroxámicos como inhibidores de histona-desacetilasas.

5 La solicitud de patente WO 05/086898, publicada el 22 de septiembre de 2005, desvela ácidos hidroxámicos heteropentacíclicos como inhibidores de histona-desacetilasas.

La solicitud de patente WO 05/092899, publicada el 6 de octubre de 2005, desvela alquenilbenzamidas como histona-desacetilasas.

10 Los compuestos de la presente invención se diferencian de los de la técnica anterior en estructura, en su actividad farmacológica y/o potencia farmacológica.

El objetivo que ha de conseguirse es proporcionar inhibidores de histona-desacetilasas con alta actividad enzimática 15 y celular que tengan mayor biodisponibilidad y/o potencia in vivo.

Los nuevos compuestos de la presente invención permiten conseguir el objetivo descrito anteriormente. Los compuestos de la presente invención muestran una excelente actividad enzimática y celular de inhibición de las histona-desacetilasas. Presentan gran capacidad de activación del gen p21. Pueden tener un perfil farmacocinético

20 deseable y baja afinidad por las enzimas P450, lo que reduce el riesgo de interacciones adversas entre fármacos y permite también un margen de seguridad más amplio.

Algunas características ventajosas de los presentes compuestos pueden ser estabilidad metabólica, solubilidad y/o capacidad de inducción de p21. 25 Esta invención se refiere a compuestos de la fórmula (I)

imagen1

30 las formas N-óxido, las sales de adición farmacéuticamente aceptables y las formas estereoquímicamente isoméricas de los mismos, en los que:

n es 0 o 1 y cuando n es 0, quiere indicarse un enlace directo;

35 m es 0, 1 o 2 y cuando m es 0, quiere indicarse un enlace directo;

p es 0 o 1 y cuando p es 0, quiere indicarse un enlace directo;

X es N; 40

cada Y es independientemente O, NH, N-alquilo C1-6, CH o CH2 y cuando Y es CH, el sustituyente está unido al

átomo Y de la estructura de anillo;

R1 es hidroxi o un radical de la fórmula (a-1) 45

imagen2

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en la que

R9 es hidroxi o -NH2;

5 R10 es hidrógeno, tienilo, furanilo o fenilo y cada tienilo, furanilo o fenilo puede estar sustituido opcionalmente con halo, amino, nitro, ciano, hidroxi, fenilo, alquilo C1-6, dialquilamino C1-6, alquiloxi C1-6, fenilalquiloxi C1-6, hidroxialquilo C1-6, alquiloxicarbonilo C1-6, hidroxicarbonilo, alquilcarbonilo C1-6, polihaloalquiloxi C1-6, polihaloalquilo C1-6, alquilsulfonilo C1-6, hidroxicarbonilalquilo C1-6, alquilcarbonilamino C1-6, aminosulfonilo, aminosulfonilalquilo C1-6, isoxazolilo, aminocarbonilo, fenilalquenilo C2-6, fenilalquinilo C3-6 o piridinilalquinilo C3-6;

R6, R7 y R8 son independientemente hidrógeno, -NH2, nitro, furanilo, halo, alquilo C1-6, alquiloxi C1-6, trifluorometilo, tienilo, fenilo, alquilcarbonilamino C1-6, aminocarbonilalquilo C1-6 o -C≡C-CH2-R11; en donde R11 es hidrógeno, alquilo C1-6, hidroxi, amino o alquiloxi C1-6;

15 R2 es alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7, alquilaminocarbonilo C1-6 o alquiloxicarbonilo C1-6;

R3 es hidrógeno, alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7, hidroxialquilo C1-6, alquiloxi C1-6 alquilo C1-6, alquiloxicarbonilo C1-6 o alquilaminocarbonilo C1-6; o

R2 y R3 pueden unirse (es decir, formar un sistema de anillo cíclico) mediante un puente de metileno, etileno o propileno;

R12 R13

R4 es hidrógeno, alquilo C1-6, -C(=O)-CHR12R13 o -S(=O)2-N(CH3)2; en que cada uno de y es 25 independientemente hidrógeno, amino, alquilo C1-6, o aminoalquilo C1-6; y

R5

es hidrógeno, hidroxi, amino, halo, alquilo C1-6, polihaloalquilo C1-6, alquiloxicarbonilo C1-6, hidroxicarbonilo, alquilcarbonilamino C1-6, alquiloxi C1-6 o mono o dialquilamino C1-6.

Las líneas que entran en los sistemas de anillos bicíclicos a partir de los sustituyentes indican que los enlaces pueden estar unidos a cualquiera de los átomos del anillo adecuados del sistema de anillos bicíclico.

El término “inhibidor de histona-desacetilasas” o “inhibidor de histona-desacetilasa” se usa para identificar un compuesto que es capaz de interaccionar con una histona desacetilasa e inhibir su actividad, más en particular, su

35 actividad enzimática. La inhibición de la actividad enzimática de una histona-desacetilasa significa reducir la capacidad de la histona-desacetilasa para eliminar un grupo acetilo de una histona. Preferentemente, una inhibición tal es específica, es decir, el inhibidor de una histona-desacetilasa reduce la capacidad de la histona-desacetilasa para eliminar un grupo acetilo de una histona a una concentración inferior a la concentración del inhibidor que se requiere para producir cualquier otro efecto biológico no relacionado.

Según se usa en las definiciones anteriores y a partir de ahora, halo es genérico para flúor, cloro, bromo y yodo; alquilo C1-6 define radicales de hidrocarburos saturados de cadena lineal y ramificada con uno a seis átomos de carbono como, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, 1-metiletilo, 2-metilpropilo, pentilo, 2-metilbutilo, hexilo, 2metilpentilo y similares; alquenilo C2-6 define radicales de hidrocarburo de cadena lineal y ramificada que contienen

45 un enlace doble y con dos a seis átomos de carbono como, por ejemplo, etenilo, 2-propenilo, 3-butenilo, 2-pentenilo, 3-pentenilo, 3-metil-2-butenilo y similares; alquinilo C3-6 define radicales de hidrocarburo de cadena lineal y ramificada que contienen un enlace triple y con tres a seis átomos de carbono como, por ejemplo, 2-propinilo, 3butinilo, 2-butinilo, 2-pentinilo, 3-pentinilo, 3-hexinilo y similares; polihaloalquilo C1-6 define un alquilo C1-6 que contiene tres sustituyentes halo idénticos o diferentes, por ejemplo, trifluorometilo; y cicloalquilo C3-7 incluye grupos de hidrocarburo cíclicos con tres a seis átomos de carbono, como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, cicloheptilo y similares.

Las sales de adición farmacéuticamente aceptables abarcan sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables y sales de adición de base farmacéuticamente aceptables. Se entiende que las sales de adición de ácido 55 farmacéuticamente aceptables según se mencionan anteriormente comprenden las formas de sales de adición de ácido no toxicas y terapéuticamente activas que pueden formar los compuestos de la fórmula (I). Los compuestos de la fórmula (I) que tienen propiedades básicas pueden convertirse en sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables mediante el tratamiento de dichas formas básicas con un ácido apropiado. Los ácidos apropiados comprenden, por ejemplo, ácidos inorgánicos como los ácidos halogenhídricos, por ejemplo, ácido clorhídrico o bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y ácidos similares o ácidos orgánicos como, por ejemplo, acético, trifluoroacético, propanoico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico, malónico, succínico (es decir, ácido butanodioico), maleico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, etanosulfónico, bencenosulfónico, p-toluenosulfónico, ciclámico, salicílico, p-aminosalicílico, pamoico y ácidos similares. Los compuestos de la fórmula (I) que tienen propiedades ácidas pueden convertirse en sus sales de adición de base 65 farmacéuticamente aceptables mediante el tratamiento de dichas formas ácidas con una base orgánica o inorgánica apropiada. Las formas de sales básicas apropiadas comprenden, por ejemplo, las sales de amonio, las sales de los

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metales alcalinos y alcalinotérreos, por ejemplo, las sales de litio, sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, sales con bases orgánicas, por ejemplo, las sales de benzatina, N-metil-D-glucamina, hidrabamina y sales con aminoácidos como, por ejemplo, arginina, lisina y similares. El término “sales de adición de ácido o base” comprende también los hidratos y las formas de adición de disolvente que pueden formar los compuestos de la fórmula (I).

5 Algunos ejemplos de tales formas son, por ejemplo, hidratos, alcoholatos y similares. El término “formas estereoquímicamente isoméricas de compuestos de la fórmula (I)”, según se usa en este documento, define todos los posibles compuestos formados por los mismos átomos enlazados por la misma secuencia de enlaces pero con estructuras tridimensionales diferentes no intercambiables que pueden presentar los compuestos de la fórmula (I). A menos que se mencione o indique lo contrario, la designación química de un compuesto abarca la mezcla de todas las posibles formas estereoquímicamente isoméricas que puede tener dicho compuesto. Dicha mezcla puede contener diastereoisómeros y/o enantiómeros de la estructura molecular básica de dicho compuesto. Se entiende que todas las formas estereoquímicamente isoméricas de los compuestos de la fórmula (I), tanto en forma pura como mezcladas entre sí, están comprendidas dentro del alcance de la presente invención.

15 Se entiende que las formas N-óxido de los compuestos de la fórmula (I) comprenden aquellos compuestos de la fórmula (I) en los que uno o varios átomos de nitrógeno se oxidan para dar los denominados N-óxidos, en particular, aquellos N-óxidos en los que se oxidan uno o más de los nitrógenos de la piperidina, piperazina o piridazinilo. Algunos de los compuestos de la fórmula (I) pueden existir también en sus formas tautoméricas. Aunque no se indica explícitamente en la fórmula anterior, se entiende que tales formas se incluyen dentro del alcance de la invención. Se entiende que el término “compuestos de la fórmula (I)”, siempre que se use de ahora en adelante, incluye también las sales de adición farmacéuticamente aceptables y todas las formas estereoisoméricas. Se entiende que los términos “histona-desacetilasa” y “HDAC”, según se usan en este documento, se refieren a una cualquiera o a una familia de enzimas que eliminan grupos acetilo de los grupos ε-amino de los restos de lisina en el extremo N-terminal de una histona. A menos que se indique lo contrario por el contexto, se entiende que el término

25 “histona” se refiere a cualquier proteína histona, incluidas H1, H2A, H2B, H3, H4 y H5, de cualquier especie. Las proteínas o productos génicos HDAC humanos incluyen, pero no se limitan a HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9, HDAC-10 y HDAC-11. La histona-desacetilasa puede derivarse también de una fuente protozoaria o fúngica.

Un primer grupo de compuestos interesantes consta de aquellos compuestos de la fórmula (I) en los que se aplican una o más de las siguientes restricciones:

a) n es 1;

35 b)pes0;

c) cada Xes N;

d) cada Y es CH;

e) R1 es hidroxi;

f) R2 es alquilo C1-6;

45 g) R2 y R3 pueden unirse mediante un puente de metileno, etileno o propileno;

h) R3 es hidrógeno;

i) R4 es alquilo C1-6; y

j) R5 es hidrógeno.

Un segundo grupo de compuestos interesantes consta de aquellos compuestos de la fórmula (I) en los que se aplican una o más de las siguientes restricciones:

55 a) n es 1;

b) p es 0;

c) cada Y es CH;

d) R10 es hidrógeno;

e) cada uno de R6, R7 y R8 es independientemente hidrógeno;

65 f) R2 es alquilo C1-6;

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g) R2 y R3 pueden unirse mediante un puente de metileno, etileno o propileno;

h) R3 es hidrógeno; 5 i) R4 es alquilo C1-6; y

j) R5 es hidrógeno.

10 Un tercer grupo de compuestos interesantes consta de aquellos compuestos de la fórmula (I) o de aquellos compuestos del primero y segundo grupo en los que se aplican una o más de las siguientes restricciones:

a) n es 0;

15 b) cada Y es independientemente O, CH o CH2;

c) R1 es hidroxi; y

d) R3 es cicloalquilo C3-7, alquiloxicarbonilo C1-6 o alquilaminocarbonilo C1-6.

20 Un cuarto grupo de compuestos interesantes consta de aquellos compuestos de la fórmula (I) en los que se aplican una o más de las siguientes restricciones:

a) n es 1; 25 b) m es 1o 2;

c) p es 0;

30 d)cadaXesN;

e) cada Y es CH;

f) R2 y R3 están unidos mediante un puente de metileno, etileno o propileno; 35 g) R4 es alquilo C1-6;

h) R5 es hidrógeno.

40 Un grupo de compuestos preferidos consta de aquellos compuestos de la fórmula (I) en los que n es 1; p es 0; cada X es N; cada Y es CH; R1 es hidroxi; R2 es alquilo C1-6 y R3 es hidrógeno o R2 y R3 pueden unirse mediante un puente de metileno, etileno o propileno; R4 es alquilo C1-6; y R5 es hidrógeno.

Otro grupo de compuestos preferidos consta de aquellos compuestos de la fórmula (I) en los que n es 1; p es 0;

45 cada Y es CH; R10 es hidrógeno; cada uno de R6, R7 y R8 es independientemente hidrógeno; R2 es alquilo C1-6 y R3 es hidrógeno o R2 y R3 pueden unirse mediante un puente de metileno, etileno o propileno; R4 es alquilo C1-6; y R5 es hidrógeno.

Un grupo más preferido de compuestos consta de aquellos compuestos de la fórmula (I) en los que n es 1; m es 1 o 50 2; p es 0, cada X es N; cada Y es CH; R2 y R3 están unidos mediante un puente de metileno, etileno o propileno; R4 es alquilo C1-6; y R5 es hidrógeno.

Los compuestos más preferidos son el compuesto n°2 y el compuesto n°3.

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Los compuestos de la fórmula (I) y sus sales farmacéuticamente aceptables y N-óxidos, así como las formas

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estereoquímicamente isoméricas de los mismos pueden prepararse de manera convencional. Los materiales de partida y algunos de los compuestos intermedios son compuestos conocidos a están disponibles comercialmente o pueden prepararse de acuerdo con procedimientos de reacción convencionales conocidos generalmente en la técnica o según se describen en las solicitudes de patente EP 1485099, EP 1485348, EP 1485353, EP 1485354, EP

5 1485364, EP 1485365, EP 1485370 y EP 1485378.

Algunos procedimientos de preparación se describirán más adelante en más detalle. Otros procedimientos para la obtención de los compuestos finales de la fórmula (I) se describen en los ejemplos.

10 Los ácidos hidroxámicos de la fórmula (I), en los que R1 es hidroxi, denominados en este documento como compuestos de la fórmula (I-a), pueden prepararse por reacción de un compuesto intermedio de la fórmula (II) con un ácido apropiado como, por ejemplo, ácido trifluoroacético. Dicha reacción se lleva a cabo en un disolvente apropiado como, por ejemplo, metanol o diclorometano.

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Los compuestos de la fórmula (I), en los que R1 es un radical de la fórmula (a-1) y R9 es -NH2, denominados en este documento como compuestos de la fórmula (I-b), pueden prepararse por reacción de un compuesto intermedio de la fórmula (III), en la que M representa hidrógeno, sodio, litio o un catión de metal alcalino, por ejemplo sodio, 20 denominado en este documento como compuesto de la fórmula (III-a), con un compuesto intermedio de la fórmula

(IV) en presencia de los reactivos apropiados como, por ejemplo, hexafluorofosfato de benzotriazol-1iloxitris(pirrolidino)fosfonio (PyBOP). La reacción puede llevarse a cabo en presencia de una base como trietilamina, en un disolvente adecuado como una mezcla de diclorometano y tetrahidrofurano.

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Los compuestos de la fórmula (I-b) pueden prepararse también por reacción de un compuesto intermedio de la fórmula (V) con un ácido apropiado como, por ejemplo, ácido trifluoroacético. Dicha reacción se lleva a cabo en un disolvente apropiado como, por ejemplo, metanol o diclorometano.

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Los compuestos de la fórmula (I), en los que R1 es un radical de la fórmula (a-1) y R9 es hidroxi, denominados en este documento como compuestos de la fórmula (I-c), pueden prepararse por reacción de un compuesto intermedio de la fórmula (VI) con fluoruro de tetrabutilamonio en un disolvente adecuado como, por ejemplo, tetrahidrofurano.

10 En el compuesto intermedio de la fórmula (VI), TBDMS indica terc-butil(dimetil)silanilo.

imagen7

Los compuestos intermedios de la fórmula (II) pueden prepararse por reacción de un compuesto intermedio de la

15 fórmula (III) con un compuesto intermedio de la fórmula (VII) en presencia de los reactivos apropiados como monoclorhidrato de N’-(etilcarbonimidoil)-N,N-dimetil-1,3-propanodiamina (EDC) y 1-hidroxi-1H-benzotriazol (HOBT). La reacción puede llevarse a cabo en presencia de una base como trietilamina, en un disolvente adecuado como una mezcla de diclorometano y tetrahidrofurano.

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Los compuestos intermedios de la fórmula (V) pueden prepararse por reacción de un compuesto intermedio de la fórmula (III) con una fenilamina protegida por terc-butiloxicarbonilo (Boc) apropiada de la fórmula (VII), en presencia de hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfonio (BOP) e hidruro de sodio. Dicha reacción puede llevarse a cabo en un disolvente adecuado como, por ejemplo, piridina.

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10 Los compuestos intermedios de la fórmula (VI) pueden prepararse por reacción de un compuesto intermedio de la fórmula (III) con una fenilamina protegida por terc-butil(dimetil)silanilo (TBDMS) apropiada de la fórmula (IX), en presencia de hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfonio (BOP) y trietilamina. Dicha reacción se lleva a cabo en un disolvente adecuado como, por ejemplo, N,N-dimetilformamida.

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Los compuestos intermedios de la fórmula (III) pueden prepararse por reacción de un compuesto intermedio de la fórmula (X) con una disolución ácida apropiada, por ejemplo, ácido clorhídrico, o una disolución básica apropiada, por ejemplo hidróxido de litio o hidróxido de sodio, en un disolvente adecuado, por ejemplo, un alcohol como etanol o propanol o dioxano.

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10 Los compuestos intermedios de la fórmula (X), en los que R3 es según se define anteriormente distinto de hidrógeno, pueden prepararse por reacción de un compuesto correspondiente de la fórmula (X) en el que R3 es hidrógeno con un reactivo funcional apropiado que sirve para introducir el grupo R3 apropiado. Por ejemplo, cuando R3 es alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7, hidroxialquilo C1-6 o alcoxi C1-6 alquileno C1-6, el reactivo es un agente alquilante apropiado, por ejemplo, un haluro de alquilo apropiado, por ejemplo, cloruro, y la reacción se efectúa en condiciones básicas, por

R3

15 ejemplo, con el uso de trietilamina, en un disolvente adecuado como dimetilformamida. Cuando es alquiloxicarbonilo C1-6 o alquilaminocarbonilo C1-6, el reactivo es un agente acilante apropiado, por ejemplo, un haluro de acilo apropiado, por ejemplo, cloruro, y la reacción se efectúa en condiciones básicas, por ejemplo, con el uso de trietilamina, en un disolvente adecuado como diclorometano.

20 Los compuestos intermedios de la fórmula (X), en los que R3 es hidrógeno, denominados en este documento como compuestos intermedios de la fórmula (X-a), pueden prepararse por reacción de un compuesto intermedio de la fórmula (XI) con un compuesto intermedio de la fórmula (XII) en presencia de los reactivos apropiados como NaBH(OAC)3 y Ti(OEt)4, en un disolvente adecuado como dicloroetano o metanol. Alternativamente, la reacción puede efectuarse con el uso de BH3CN en condiciones ácidas, por ejemplo, con el uso de ácido acético en un

25 disolvente adecuado como metanol, o en condiciones de hidrogenación con un catalizador de paladio y carbono en un disolvente adecuado como metanol.

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Los compuestos intermedios de la fórmula (X), en los que n es 1, R2 y R3 están unidos por un puente, en que la línea punteada representa un puente de metileno, etileno o propileno, y n es 1, denominados en este documento como

5 compuestos intermedios de la fórmula (X-b), pueden prepararse por reacción de un compuesto intermedio de la fórmula (XIII) con un compuesto intermedio de la fórmula (XIV) en presencia de NaBH(OAC)3 y Ti(OEt)4 en un disolvente adecuado como dicloroetano.

Alternativamente, la reacción puede efectuarse con el uso de BH3CN en condiciones ácidas, por ejemplo, con el uso

10 de ácido acético en un disolvente adecuado como metanol, o en condiciones de hidrogenación con un catalizador de paladio y carbono en un disolvente adecuado como metanol.

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15 La presente invención también se refiere a compuestos intermedios de las fórmulas (II), (III), (X), (X-a) y (X-b), denominados colectivamente como compuestos de la fórmula (A), en los que Q es alquiloxicarbonilo C1-2, hidroxicarbonilo o tetrahidropiraniloxiaminocarbonilo y n, m, p, X, Y, Z, R2, R3, R4 y R5 son según se definen para la fórmula (I), y las formas N-óxido, las sales farmacéuticamente aceptables y las formas estereoquímicamente isoméricas de los mismos.

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Los grupos de compuestos interesantes, preferidos, más preferidos y máximamente preferidos para los compuestos

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intermedios anteriores pueden definirse de acuerdo con los grupos definidos para los compuestos de la fórmula (I).

Los compuestos de la fórmula (I) y algunos de los compuestos intermedios pueden tener al menos un centro estereogénico en su estructura. Este centro estereogénico puede estar presente en configuración R o S.

5 Los compuestos de la fórmula (I) según se preparan en los procedimientos descritos anteriormente en este documento son generalmente mezclas racémicas de enantiómeros, que pueden separarse entre sí mediante procedimientos de resolución conocidos en la técnica. Los compuestos racémicos de la fórmula (I) pueden convertirse en las formas de sales diastereoméricas correspondientes por reacción con un ácido quiral adecuado. Dichas formas de sales diastereoméricas se separan subsiguientemente, por ejemplo, por cristalización selectiva o fraccionada y los enantiómeros se liberan posteriormente mediante un álcali. Una manera alternativa de separar las formas enantioméricas de los compuestos de la fórmula (I) implica el uso de cromatografía líquida con una fase estacionaria quiral. Dichas formas isoméricas estereoquímicamente puras pueden derivarse también de las correspondientes formas isoméricas esteroquímicamente puras de los materiales de partida apropiados, siempre

15 que la reacción tenga lugar de manera estereoespecífica. Preferentemente, si se desea un estereoisómero específico, dicho compuesto se sintetizará por procedimientos de preparación estereoespecíficos. Ventajosamente, estos procedimientos emplearán materiales de partida enantioméricamente puros.

Los compuestos de la fórmula (I), las sales de adición farmacéuticamente aceptables y las formas estereoisoméricas de los mismos tienen propiedades farmacológicas valiosas, en cuanto que tienen un efecto inhibidor de las histonadesacetilasas (HDAC).

Esta invención proporciona compuestos de la fórmula (I) para uso en la inhibición del crecimiento anormal de células, incluidas células transformadas, mediante la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de la

25 invención. El crecimiento anormal de células se refiere al crecimiento celular independiente de los mecanismos de regulación normales (por ejemplo, pérdida de la inhibición por contacto). Esto incluye la inhibición del crecimiento tumoral tanto directamente, al causar una parada del crecimiento, diferenciación terminal y/o apoptosis de las células cancerosas, como indirectamente, al inhibir la neovascularización de los tumores.

Esta invención proporciona también compuestos de la fórmula (I) para uso en la inhibición del crecimiento tumoral mediante la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención a un sujeto, por ejemplo, un mamífero (y más en particular, un humano) que necesite dicho tratamiento. En particular, esta invención proporciona un procedimiento para inhibir el crecimiento de tumores mediante la administración de una cantidad eficaz de los compuestos de la presente invención. Algunos ejemplos de tumores que pueden inhibirse son, pero no

35 se limitan a cáncer de pulmón (por ejemplo, adenocarcinoma, incluido el cáncer pulmonar no microcítico), cánceres de páncreas (por ejemplo, carcinoma pancreático como, por ejemplo, carcinoma pancreático exocrino), cánceres de colon (por ejemplo, carcinomas colorrectales como, por ejemplo, adenocarcinoma de colon o adenoma de colon), cáncer de próstata, incluida la enfermedad avanzada, tumores hematopoyéticos de líneas linfocíticas (por ejemplo, leucemia linfocítica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de Burkitt), leucemias mieloides (por ejemplo, leucemia mielógena aguda (LMA)), cáncer folicular tiroideo, síndrome mielodisplásico (SMD), tumores de origen mesenquimático (por ejemplo, fibrosarcomas y rabdomiosarcomas), melanomas, teratocarcinomas, neuroblastomas, gliomas, tumor benigno de la piel (por ejemplo queratoacantomas), carcinoma de mama (por ejemplo, cáncer de mama avanzado), carcinoma de riñón, carcinoma ovárico, carcinoma de vejiga y carcinoma epidérmico.

45 El compuesto de acuerdo con la invención puede usarse para otros fines terapéuticos, por ejemplo:

a) sensibilización de tumores a la radioterapia mediante la administración del compuesto de acuerdo con la invención antes, durante o después de la irradiación del tumor para tratar el cáncer;

b) tratamiento de artropatías y osteopatías como artritis reumatoide, osteoartritis, artritis juvenil, gota, poliartritis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante y lupus eritematoso sistémico;

c) inhibición de la proliferación celular del músculo liso, incluidos trastornos proliferativos vasculares, aterosclerosis y restenosis;

55 d) tratamiento de afecciones inflamatorias y afecciones dérmicas como colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, rinitis alérgica, enfermedad del injerto contra el huésped, conjuntivitis, asma, SDRA, enfermedad de Behcet, rechazo del trasplante, urticaria, dermatitis alérgica, alopecia areata, escleroderma, exantema, eccema, dermatomiositis, acné, diabetes, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Kawasaki, esclerosis múltiple, enfisema, fibrosis quística y bronquitis crónica;

e) tratamiento de la endometriosis, fibromas uterinos, metrorragia funcional e hiperplasia endometrial;

f) tratamiento de la vascularización ocular, incluida la vasculopatía que afecta a los vasos retinales y coroideos;

65 g) tratamiento de una insuficiencia cardiaca;

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h) inhibición de trastornos inmunosupresores como el tratamiento de las infecciones del VIH;

i) tratamiento de la insuficiencia renal; 5 j) supresión de trastornos endocrinos;

k) inhibición de la alteración de la gluconeogénesis;

l) tratamiento de una neuropatía, por ejemplo, la enfermedad de Parkinson, o una neuropatía que resulta en un trastorno cognitivo, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer o enfermedades neuronales relacionadas con poliglutamina;

m) tratamiento de trastornos psiquiátricos, por ejemplo, esquizofrenia, trastorno bipolar, depresión, ansiedad y 15 psicosis;

n) inhibición de una patología neuromuscular, por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica;

o) tratamiento de la atrofia muscular espinal;

p) tratamiento de otras patologías que pueden tratarse mediante la potenciación de la expresión de un gen;

q) refuerzo de la terapia génica;

25 r) inhibición de la adipogénesis;

s) tratamiento de parasitosis como la malaria.

Por consiguiente, la presente invención desvela los compuestos de la fórmula (I) para uso como medicamento, así como el uso de estos compuestos de la fórmula (I) para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una o más de las afecciones mencionadas anteriormente.

Los compuestos de la fórmula (I), las sales de adición farmacéuticamente aceptables y las formas estereoisoméricas de los mismos pueden tener propiedades valiosas en cuanto que pueden usarse para la detección o la identificación

35 de una HDAC en una muestra biológica, lo que comprende la detección o la medición de la formación de un complejo entre un compuesto marcado y una HDAC.

Los procedimientos de detección o identificación pueden usar compuestos que estén marcados con agentes marcadores como radioisótopos, enzimas, sustancias fluorescentes, sustancias luminosas, etc. Algunos ejemplos de radioisótopos incluyen 125I, 131I, 3H y 14C. Normalmente, las enzimas se hacen detectables por conjugación con un sustrato apropiado que, a su vez, cataliza una reacción detectable. Algunos ejemplos de estas enzimas incluyen, por ejemplo, β-galactosidasa, β-glucosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa y malato-deshidrogenasa, preferentemente peroxidasa de rábano. Las sustancias luminosas incluyen, por ejemplo, luminol, derivados de luminol, luciferina, ecuorina y luciferasa.

45 Las muestras biológicas pueden definirse como tejidos corporales o líquidos corporales. Algunos ejemplos de líquidos corporales son el líquido cefalorraquídeo, la sangre, el plasma, el suero, la orina, el esputo, la saliva y similares.

A la vista de sus útiles propiedades farmacológicas, los compuestos sujeto pueden formularse en diversas formas farmacéuticas para su administración.

Para preparar las composiciones farmacéuticas de esta invención, una cantidad eficaz de un compuesto concreto en forma de sal de adición de base o de ácido, como principio activo, se combina en mezcla íntima con un vehículo

55 farmacéuticamente aceptable, en que el vehículo puede tomar muy diversas formas, según la forma de la preparación que se desea para su administración. Es de desear que estas composiciones farmacéuticas estén en forma de dosificación unitaria adecuada, preferentemente, para administración por vía oral, rectal, percutánea o por inyección parenteral. Por ejemplo, al preparar las composiciones en forma de dosificación por vía oral, puede emplearse cualquiera de los medios farmacéuticos habituales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes y similares, en el caso de preparaciones líquidas para vía oral como suspensiones, jarabes, elixires y disoluciones; o vehículos sólidos como almidones, azúcares, caolín, lubricantes, aglutinantes, desintegrantes y similares, en el caso de polvos, pastillas, cápsulas y comprimidos.

Por su facilidad de administración, los comprimidos y las cápsulas representan la forma de dosificación unitaria más

65 ventajosa para la vía oral, en cuyo caso se emplean obviamente vehículos farmacéuticos sólidos. Para las composiciones para la vía parenteral, el vehículo comprenderá habitualmente agua estéril, al menos en gran parte,

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aunque pueden incluirse otros ingredientes, por ejemplo, para facilitar la solubilidad. Las disoluciones inyectables, por ejemplo, pueden prepararse de modo que el vehículo comprende una disolución salina, una disolución de glucosa o una mezcla de una disolución salina y de glucosa. También pueden prepararse suspensiones inyectables, en cuyo caso pueden emplearse vehículos líquidos apropiados, agentes de suspensión y similares. En las 5 composiciones adecuadas para la administración por vía percutánea, el vehículo comprende opcionalmente una agente potenciador de la penetración y/o un humectante adecuado, opcionalmente combinado con los aditivos adecuados de cualquier tipo en pequeñas proporciones, en que los aditivos no causan un efecto perjudicial significativo en la piel. Dichos aditivos pueden facilitar la administración a la piel y/o pueden ser útiles para la preparación de las composiciones deseadas. Estas composiciones pueden administrarse de diversas maneras, por

10 ejemplo, como parche transdérmico, como aplicación puntual o como pomada.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente en formas de dosificación unitaria por razones de facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria según se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones en este documento se refiere a 15 unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias, en que cada unidad contiene una cantidad predeterminada del principio activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Algunos ejemplos de tales formas de dosificación unitaria son comprimidos (incluidos comprimidos divididos o comprimidos recubiertos), cápsulas, pastillas, paquetes de polvos, obleas, disoluciones o suspensiones inyectables, cucharaditas, cucharadas y similares, así como múltiplos segregados de

20 los mismos.

Los expertos en la técnica podrían determinar fácilmente la cantidad eficaz a partir de los resultados de las pruebas presentadas más adelante. En general, se contempla que una cantidad terapéuticamente eficaz sería de 0,005 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal y, en particular, de 0,005 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal. Puede ser

25 apropiado administrar la dosis requerida como dos, tres, cuatro o más subdosis a intervalos apropiados a lo largo del día. Dichas subdosis pueden formularse como formas de dosificación unitaria, por ejemplo, con 0,5 a 500 mg y, en particular, 10 mg a 500 mg del principio activo por forma de dosificación unitaria.

Como otro aspecto de la presente invención, se prevé una combinación de un inhibidor de HDAC con otro agente 30 anticancerígeno, especialmente para uso como medicamento, más específicamente, en el tratamiento del cáncer o enfermedades relacionadas.

Para el tratamiento de las afecciones anteriores, los compuestos de la invención pueden emplearse ventajosamente en combinación con uno o más fármacos adicionales, más en particular, con otros agentes anticancerígenos. 35 Algunos ejemplos de agentes anticancerígenos son:

-compuestos de coordinación de platino, por ejemplo, cisplatino, carboplatino u oxaliplatino;

-compuestos de taxano, por ejemplo, paclitaxel o docetaxel; 40 -inhibidores de la topoisomerasa I como los compuestos de camptotecina, por ejemplo, irinotecán o topotecán;

-inhibidores de la topoisomerasa II como los derivados antitumorales de podofilotoxina, por ejemplo, etopósido o tenipósido; 45 -alcaloides antitumorales de vinca, por ejemplo, vimblastina, vincristina o vinorelbina;

-derivados antitumorales de nucleósidos, por ejemplo, 5-fluorouracilo, gemcitabina o capecitabina;

50 -agentes alquilantes como mostaza nitrogenada o nitrosourea y, por ejemplo, ciclofosfamida, clorambucilo, carmustina o lomustina;

-derivados antitumorales de antraciclina, por ejemplo, daunorrubicina, doxorrubicina, idarrubicina o mitoxantrona;

55 -anticuerpos dirigidos contra HER2, por ejemplo, trastuzumab;

-antagonistas de los receptores de estrógenos o moduladores selectivos de los receptores de estrógenos, por ejemplo, tamoxifeno, toremifeno, droloxifeno, faslodex o raloxifeno;

60 -inhibidores de la aromatasa como exemestano, anastrozol, letrozol y vorozol;

-agentes de diferenciación como retinoides, vitamina D y bloqueantes del metabolismo de los ácidos retinoicos (RAMBA), por ejemplo, acutano;

65 -inhibidores de metiltransferasas de ADN, por ejemplo azacitidina;

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-inhibidores de cinasas, por ejemplo flavoperidol, mesilato de imatinib o gefitinib;

-inhibidores de la farnesiltransferasa;

5 -otros inhibidores de HDAC;

-inhibidores de la ruta ubicuitina-proteasoma, por ejemplo, Velcade; o

-Yondelis.

10 El término “compuesto de coordinación de platino” se usa en este documento para designar cualquier compuesto de coordinación de platino que inhibe el crecimiento de células tumorales que proporciona el platino en forma iónica.

El término “compuestos de taxano” indica una clase de compuestos que tienen el sistema de anillos de taxano y se 15 relacionan o derivan de extractos de ciertas especies de tejo (Taxus).

El término “inhibidores de topoisomerasa” se usa para indicar enzimas que son capaces de alterar la topología del ADN en las células eucariotas. Son críticos para funciones celulares importantes y para la proliferación celular. En las células eucariotas existen dos clases de topoisomerasas, el tipo I y el tipo II. La topoisomerasa I es una enzima

20 monomérica de un peso molecular aproximado de 100.000. La enzima se une al ADN e introduce una rotura transitoria en una de las hebras, desenrolla la hélice doble (o permite su desenrollamiento) y vuelve a cerrar la rotura antes de su disociación de la hebra de ADN. La topoisomerasa II tiene un mecanismo de acción similar que supone la inducción de roturas en las hebras de ADN o la formación de radicales libres.

25 El término “compuestos de camptotecina” se usa para indicar compuestos que están relacionados o que derivan del compuesto originario camptotecina, que es un alcaloide insoluble en agua derivado del árbol chino Camptothecin acuminata y del árbol indio Nothapodytes foetida.

El término “compuestos de podofilotoxina” se usa para indicar compuestos que están relacionados o que derivan del 30 compuesto originario podofilotoxina, que se extrae de la planta de mandrágora.

El término “alcaloides antitumorales de vinca” se usa para indicar compuestos que están relacionados o que derivan de extractos de la planta de vincapervinca (Vinca rosea).

35 El término “agentes alquilantes” abarca un grupo diverso de compuestos químicos que tienen como característica común la capacidad de proporcionar grupos alquilo a macromoléculas biológicamente vitales, como el ADN, en condiciones fisiológicas. Con la mayoría de los agentes más importantes como las mostazas nitrogenadas y las nitrosoureas, las fracciones alquilantes activas se generan in vivo tras complejas reacciones degradativas, algunas de las cuales son enzimáticas. Las acciones farmacológicas más importantes de los agentes alquilantes son

40 aquellas que alteran los mecanismos fundamentales que afectan a la proliferación celular, en particular, a la síntesis de ADN y la división celular. La capacidad de los agentes alquilantes de interferir con la funcionalidad e integridad del ADN en tejidos en rápida proliferación proporciona la base de sus aplicaciones terapéuticas y de muchas de sus propiedades tóxicas.

45 El término “derivados antitumorales de antraciclina” comprende antibióticos obtenidos del hongo Streptomyces peuticus var. caestus y sus derivados, caracterizados por tener una estructura de anillo de tetraciclina con un azúcar poco corriente, daunosamina, unido por un enlace glucosídico.

Se ha observado que la amplificación de la proteína receptora 2 del factor de crecimiento epidérmico (HER2) en

50 carcinomas de mama primarios se correlaciona con un mal pronóstico clínico para ciertas pacientes. Trastuzumab es un anticuerpo monoclonal IgG1κ humanizado altamente purificado por la tecnología del ADN recombinante que se une con gran afinidad y especificidad al dominio extracelular del receptor HER2.

Muchos cánceres de mama tienen receptores de estrógenos y el crecimiento de estos tumores puede estimularse

55 por estrógeno. Los términos “antagonistas de los receptores de estrógenos” y “moduladores selectivos de los receptores de estrógenos” se usan para indicar inhibidores competitivos de estradiol que se unen a los receptores de estrógenos (ER). Los moduladores selectivos de los receptores de estrógenos, al unirse a un ER, inducen un cambio en la estructura tridimensional del receptor, lo que modula su unión al elemento de respuesta a estrógenos (ERE) en el ADN.

60 En las mujeres postmenopáusicas, la fuente principal de estrógeno circulante es la conversión de los andrógenos adrenales y ováricos (androstenediona y testosterona) en estrógenos (estrona y estradiol) por la enzima aromatasa en los tejidos periféricos. La privación de estrógenos a través de la inhibición o la inactivación de la aromatasa es un tratamiento eficaz y selectivo para algunas pacientes postmenopáusicas con cáncer de mama dependiente de

65 hormonas.

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El término “agente antiestrogénico” se usa en este documento para incluir no solo los antagonistas de los receptores de estrógenos y los moduladores selectivos de los receptores de estrógenos, sino también los inhibidores de la aromatasa, según se ha descrito anteriormente.

5 El término “agentes de diferenciación” abarca compuestos que pueden inhibir de diversas maneras la proliferación celular e inducir diferenciación. Se sabe que la vitamina D y los retinoides desempeñan un papel importante en la regulación del crecimiento y la diferenciación de una amplia diversidad de tipos de células normales y malignas. Los agentes bloqueantes del metabolismo de los ácidos retinoicos (RAMBA) aumentan los niveles de ácidos retinoicos endógenos mediante la inhibición del catabolismo de los ácidos retinoicos mediado por el citocromo P450.

Los cambios en la metilación del ADN se encuentran entre las anormalidades más comunes en las neoplasias humanas. La hipermetilación de los promotores de genes seleccionados se asocia normalmente con la inactivación de los genes implicados. El término “inhibidores de metiltransferasas de ADN” se usa para indicar compuestos que actúan a través de la inhibición farmacológica de las metiltransferasas de ADN y la reactivación de la expresión

15 génica de los supresores tumorales.

El término “inhibidores de cinasas” comprende potentes inhibidores de cinasas que están implicados en la progresión del ciclo celular y la muerte celular programada (apoptosis).

El término “inhibidores de la farnesiltransferasa” se usa para indicar compuestos diseñados para impedir la farnesilación de Ras y otras proteínas intracelulares. Estos compuestos han demostrado tener efecto sobre la proliferación y supervivencia de las células malignas.

El término “otros inhibidores de HDAC” comprende, pero no se limita a:

25 -carboxilatos, por ejemplo, butirato, ácido cinámico, 4-fenilbutirato o ácido valproico;

-ácidos hidroxámicos, por ejemplo, ácido suberoilanilidohidroxámico (SAHA), análogos de SAHA que contienen piperazina, hidroxamato de biarilo A-161906 y sus análogos de carbazoliléter, tetrahidropiridina y tetralona, Nhidroxicarboxamidas de arilo bicíclicas, piroxamida, CG-1521, PXD-101, ácido sulfonamidahidroxámico, LAQ-824, LBH-589, tricostatina A (TSA), oxamflatina, Scriptaid, moléculas tricíclicas relacionadas con Scriptaid, bishidroxamida del ácido m-carboxicinámico (CBHA), ácidos hidroxámicos similares a CBHA, análogo de trapoxina de ácido hidroxámico, CRA-024781, R306465 y ácidos benzoil y heteroarilhidroxámicos relacionados, aminosuberatos y malonildiamidas;

35 -tetrapéptidos cíclicos, por ejemplo, trapoxina, apidicina, depsipéptido, compuestos relacionados con espirucostatina, RedFK-228, tetrapéptidos cíclicos que contienen sulfhidrilo (SCOP), tetrapéptidos cíclicos que contienen ácido hidroxámico (CHAP), TAN-174s y azumamidas;

-benzamidas, por ejemplo, MS-275 o CI-994, o

-depudecina.

El término “inhibidores de la ruta ubicuitina-proteosoma” se usa para identificar compuestos que inhiben la 45 destrucción dirigida de proteínas celulares en el proteosoma, incluidas proteínas reguladoras del ciclo celular.

Para el tratamiento del cáncer, los compuestos de acuerdo con la presente invención pueden administrarse a un paciente según se describe anteriormente en combinación con irradiación. Irradiación significa radiación ionizante y, en particular, radiación γ, especialmente la emitida por aceleradores lineales o por radionúclidos de uso habitual en la actualidad. La irradiación del tumor por radionúclidos puede ser externa o interna.

La presente invención también se refiere a una combinación de acuerdo con la invención de un agente anticancerígeno y un inhibidor de HDAC de acuerdo con la invención.

55 La presente invención también se refiere a una combinación de acuerdo con la invención para uso en un tratamiento médico, por ejemplo, para la inhibición del crecimiento de células tumorales.

La presente invención también se refiere a combinaciones de acuerdo con la invención para la inhibición del crecimiento de células tumorales.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para la inhibición del crecimiento de células tumorales en un sujeto humano que comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz de una combinación de acuerdo con la invención.

65 Esta invención proporciona además compuestos de la fórmula (I) para uso en la inhibición del crecimiento anormal de células, incluidas células transformadas, mediante la administración de una cantidad eficaz de una combinación

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de acuerdo con la invención.

El otro fármaco y el inhibidor de HDAC pueden administrarse simultáneamente (por ejemplo, en composiciones separadas o unitarias) o sucesivamente en cualquier orden. En este último caso, los dos compuestos pueden

5 administrarse dentro de un periodo y en una cantidad y manera suficientes para asegurar que se alcanza un efecto ventajoso o sinérgico. Se apreciará que el procedimiento y el orden de administración preferidos y las cantidades y regímenes de dosificación respectivos para cada componente de la combinación dependerán del otro fármaco concreto y del inhibidor de HDAC que se administra, la vía de administración, el tumor concreto que se trata y el huésped concreto que se trata. El procedimiento y el orden de administración óptimos, así como las cantidades y el régimen de dosificación pueden ser determinados fácilmente por los expertos en la técnica mediante procedimientos convencionales y a la vista de la información expuesta en este documento.

El compuesto de coordinación de platino se administra ventajosamente en una dosis de 1 a 500 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, por ejemplo de 50 a 400 mg/m2, en particular, para cisplatino en

15 una dosis de aproximadamente 75 mg/m2 y para carboplatino de aproximadamente 300 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

El compuesto de taxano se administra ventajosamente en una dosis de 50 a 400 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, por ejemplo de 75 a 250 mg/m2, en particular, para paclitaxel en una dosis de aproximadamente 175 a 250 mg/m2 y para decetaxel de aproximadamente 75 a 150 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

El compuesto de camptotecina se administra ventajosamente en una dosis de 0,1 a 400 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, por ejemplo de 1 a 300 mg/m2, en particular, para irinotecán en una dosis de aproximadamente 100 a 350 mg/m2 y para topotecán de aproximadamente 1 a 2 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

25 El derivado antitumoral de podofilotoxina se administra ventajosamente en una dosis de 30 a 300 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, por ejemplo de 50 a 250 mg/m2, en particular, para etopósido en una dosis de aproximadamente 35 a 100 mg/m2 y para tenipósido de aproximadamente 50 a 250 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

El alcaloide antitumoral de vinca se administra ventajosamente en una dosis de 2 a 30 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, en particular, para vinblastina en una dosis de aproximadamente 3 a 12 mg/m2, para vincristina en una dosis de aproximadamente 1 a 2 mg/m2 y para vinorelbina en una dosis de aproximadamente 10 a 30 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

35 El derivado antitumoral de nucleósidos se administra ventajosamente en una dosis de 200 a 2.500 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, por ejemplo de 700 a 1.500 mg/m2, en particular, para 5-FU en una dosis de aproximadamente 200 a 500 mg/m2, para gemcitabina en una dosis de aproximadamente 800 a 1.200 mg/m2 y para capecitabina de aproximadamente 1.000 a 2.500 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

Los agentes alquilantes como mostaza nitrogenada o nitrosourea se administran ventajosamente en una dosis de 100 a 500 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, por ejemplo de 120 a 200 mg/m2, en particular, para ciclofosfamida en una dosis de aproximadamente 100 a 500 mg/m2, para clorambucilo en una dosis de aproximadamente 0,1 a 0,2 mg/kg, para carmustina en una dosis de aproximadamente 150 a 200 mg/m2 y para

45 lomustina en una dosis de aproximadamente 100 a 150 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

El derivado antitumoral de antraciclina se administra ventajosamente en una dosis de 10 a 75 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, por ejemplo de 15 a 60 mg/m2, en particular, para doxorrubicina en una dosis de aproximadamente 40 a 75 mg/m2, para daunorrubicina en una dosis de aproximadamente 25 a 45 mg/m2 y para idarrubicina en una dosis de aproximadamente 10 a 15 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

El trastuzumab se administra ventajosamente en una dosis de 1 a 5 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal, en particular, de 2 a 4 mg/m2 por ciclo de tratamiento.

55 El agente antiestrogénico se administra ventajosamente en una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg diarios, dependiendo del agente concreto y de la afección que se trate. El tamoxifeno se administra ventajosamente por vía oral en una dosis de 5 a 50 mg, preferentemente de 10 a 20 mg dos veces al día, continuando el tratamiento durante el tiempo suficiente para conseguir y mantener un efecto terapéutico. El toremifeno se administra ventajosamente por vía oral en una dosis de aproximadamente 60 mg una vez al día, continuando el tratamiento durante el tiempo suficiente para conseguir y mantener un efecto terapéutico. El anastrozol se administra ventajosamente por vía oral en una dosis de aproximadamente 1 mg una vez al día. El droloxifeno se administra ventajosamente por vía oral en una dosis de aproximadamente 20 a 100 mg una vez al día. El raloxifeno se administra ventajosamente por vía oral en una dosis de aproximadamente 60 mg una vez al día. El exemestano se administra ventajosamente por vía oral en una dosis de aproximadamente 25 mg una vez al día.

65 Estas dosis pueden administrarse, por ejemplo, una, dos o más veces por ciclo de tratamiento, que puede repetirse,

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por ejemplo, cada siete, 14, 21 o 28 días.

A la vista de sus útiles propiedades farmacológicas, los componentes de las combinaciones de acuerdo con la invención, es decir, el otro fármaco y el inhibidor de HDAC, pueden formularse en diversas formas farmacéuticas 5 para su administración. Los componentes pueden formularse separadamente en composiciones farmacéuticas individuales o en una composición farmacéutica unitaria que contiene los dos componentes.

Por consiguiente, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende el otro fármaco y el inhibidor de HDAC junto con uno o más vehículos farmacéuticos.

10 La presente invención se refiere además a una combinación de acuerdo con la invención en forma de una composición farmacéutica que comprende un agente anticancerígeno y un inhibidor de HDAC de acuerdo con la invención junto con uno o más vehículos farmacéuticos.

15 La presente invención se refiere además al uso de una combinación de acuerdo con la invención en la preparación de una composición farmacéutica para la inhibición del crecimiento de células tumorales.

La presente invención se refiere además a un producto que contiene como primer principio activo un inhibidor de HDAC de acuerdo con la invención y como segundo principio activo un agente anticancerígeno, como preparación 20 combinada para uso simultáneo, separado o sucesivo en el tratamiento de pacientes que padecen cáncer.

Parte experimental

Los ejemplos siguientes ilustran la presente invención.

25 En adelante, “EDC” se define como monoclorhidrato de N’-(etilcarbonimidoil)-N,N-dimetil-1,3-propanodiamina, “DCM” se define como diclorometano, “DMSO” se define como dimetilsulfóxido, “EtOAc” se define como acetato de etilo, “EtOH” se define como etanol, “HOBT” se define como 1-hidroxi-1H-benzotriazol, “MeOH” se define como metanol, “TFA” se define como ácido trifluoroacético y “THF” se define como tetrahidrofurano.

30

A. PREPARACIÓN DE LOS COMPUESTOS INTERMEDIOS

Ejemplo A1

35 a) Preparación del compuesto intermedio 1

imagen15

A una disolución de éster etílico de ácido 2-[4-(aminometil)-1-piperidinil]-5-pirimidinocarboxílico (0,0083 mol) y 1-(1

40 metil-1H-indol-3-il)etanona (0,01 mol) en 1,2-dicloroetano (150 ml) se le añadió etóxido de titanio (IV) (0,017 mol) a temperatura ambiente en flujo de N2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante cuatro días y se le añadió tris(acetato-α-O)hidroborato (1-) de sodio (0,017 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante tres días y después se vertió sobre carbonato de potasio al 10%. Se añadió DCM. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una hora y después se filtró a través de celita. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4) y se filtró y el

45 disolvente se evaporó. El residuo (5 g) se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/1). Se recogieron las fracciones puras y el disolvente se evaporó, con lo que se obtuvieron 1,9 g (54 %) del compuesto intermedio 1.

b) Preparación del compuesto intermedio 2 50

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imagen16

Una mezcla del compuesto intermedio 1 (0,0045 mol) e hidróxido de sodio (0,018 mol) en EtOH (190 ml) se agitó a reflujo durante 4 h y después se enfrió a temperatura ambiente y se evaporó hasta sequedad. El residuo se redisolvió en éter dietílico. El precipitado se separó por filtración y se secó, con lo que se obtuvieron 1,6 g (86 %) del compuesto intermedio 2, con un punto de fusión mayor de 260 °C.

c) Preparación del compuesto intermedio 3

imagen17

A una disolución del compuesto intermedio 2 (0,0039 mol) en THF (160 ml) y DCM (160 ml) se le añadieron EDC (0,0117 mol) y HOBT (0,0117 mol) en flujo de N2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 min y se le añadió O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)hidroxilamina (0,0117 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante

15 tres días, se vertió sobre agua helada y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4) y se filtró y el disolvente se evaporó. El residuo (3 g) se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 93/7/0,5). Se recogieron las fracciones puras y el disolvente se evaporó, con lo que se obtuvieron 1,55 g (82 %) del compuesto intermedio 3.

20 Ejemplo A2

a) Preparación del compuesto intermedio 4

imagen18

25 A una disolución del compuesto intermedio 8 (0,0038 mol) y 1-metil-3-(3-pirrolidinil)-1H-indol (0,0034 mol) en MeOH (70 ml) se le añadieron cianoborohidruro de sodio (0,0034 mol) y ácido acético (0,037 mol) a temperatura ambiente en flujo de N2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 48 h, se vertió sobre carbonato de potasio al 10 % y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4) y se filtró y el disolvente se evaporó. El

30 residuo (1,6 g) se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (5 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 99/1/0,05 a 94/6/0,3). Se recogieron las fracciones puras y el disolvente se evaporó, con lo que se obtuvieron 0,38 g (26 %) del compuesto intermedio 4.

b) Preparación del compuesto intermedio 5 35

imagen19

Una mezcla del compuesto intermedio 4 (0,0096 mol) e hidróxido de sodio (0,038 mol) en EtOH (450 ml) se agitó a reflujo durante 4 h y después se enfrió a temperatura ambiente y se recogió en éter dietílico. El precipitado se separó

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por filtración y se secó, con lo que se obtuvieron 3,8 g (90 %) del compuesto intermedio 5, con un punto de fusión mayor de 260 °C.

c) Preparación del compuesto intermedio 6

imagen20

A una disolución del compuesto intermedio 5 (0,0086 mol) en THF (400 ml) y DCM (400 ml) se le añadieron EDC (0,0172 mol) y HOBT (0,0172 mol) en flujo de N2. La muestra se agitó durante 45 min y se le añadió O-(tetrahidro

10 2H-piran-2-il)hidroxilamina (0,0172 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 h, se vertió sobre agua helada y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4) y se filtró y el disolvente se evaporó. El residuo (6,8 g) se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0,1). Se recogieron las fracciones puras y el disolvente se evaporó, con lo que se obtuvieron 3 g (68 %) del compuesto intermedio 6, con un punto de fusión de 80 °C.

15 Ejemplo A3

a) Preparación del compuesto intermedio 7

imagen21

A una suspensión de 4-piperidinometanol (0,086 mol) y carbonato de potasio (0,172 mol) en acetonitrilo (200 ml) se le añadió una disolución de éster etílico de ácido 2-(metilsulfonil)-5-pirimidinocarboxílico (0,094) en acetonitrilo (40 ml) a 10 °C en flujo de N2. La mezcla se llevó a temperatura ambiente y después se agitó durante 4 h, se vertió 25 sobre agua y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4) y se filtró y el disolvente se evaporó. El residuo (23 g) se cristalizó a partir de CH3CN/éster dietílico. El precipitado se separó por filtración y se secó, con lo que se obtuvieron 7,8 g (34 %) del compuesto intermedio 7. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (20-45 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0,1). Se recogieron las fracciones puras y el disolvente se evaporó, con lo que se obtuvieron 4,6 g (20 %) del compuesto intermedio 7, con un punto de

30 fusión de 129 °C.

b) Preparación del compuesto intermedio 8

imagen22

35 A una disolución de dicloruro de etanodioilo (0,061 mol) en DCM (110 ml) se le añadió DMSO (0,127 mol) a -78 °C en flujo de N2. La mezcla se agitó durante 15 min y se le añadió una disolución del compuesto intermedio 7 (0,051 mol) en DCM (200 ml). La mezcla se agitó a -78 °C durante una hora y 30 min y se le añadió trietilamina (0,26 mol) gota a gota. La mezcla se agitó a -78 °C durante 15 min, después se enfrió a temperatura ambiente durante 2 h y 30

40 min, se le añadió agua y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4) y se filtró y el disolvente se evaporó. El residuo (14 g) se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (20-45 µm) (eluyente: ciclohexano/EtOAc 70/30). Se recogieron las fracciones puras y el disolvente se evaporó, con lo que se obtuvieron 7,6 g (57 %) del compuesto intermedio 8.

45 c) Preparación del compuesto intermedio 9

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imagen23

A una disolución del compuesto intermedio 8 y 1-metil-3-(3-piperidinil)-1H-indol (0,0012 mol) en 1,2-dicloroetano (25 ml) se le añadió etóxido de titanio (IV) (0,0019 mol) a temperatura ambiente en flujo de N2. La mezcla se agitó a 5 60 °C durante 24 h, se enfrió después a 5 °C y se le añadió tris(acetato-α-O)hidroborato (1-) de sodio (0,0036 mol) en flujo de N2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 48 h y después se vertió sobre carbonato de potasio al 10%. Se añadió DCM y la mezcla se filtró a través de celita. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4) y se filtró y el disolvente se evaporó. El residuo (J g) se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (1540 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0,1). Se recogieron las fracciones puras y el disolvente se evaporó, con

10 lo que se obtuvieron 0,36 g (44 %) del compuesto intermedio 9.

d) Preparación del compuesto intermedio 10

imagen24

15 Una mezcla del compuesto intermedio 9 (0,0008 mol) e hidróxido de sodio (0,0032 mol) en EtOH (40 ml) se agitó a reflujo durante 4 h y 30 min y después se enfrió a temperatura ambiente y se evaporó hasta sequedad. El residuo se redisolvió en éter dietílico. El precipitado se separó por filtración y se secó, con lo que se obtuvieron 0,36 g (100 %) del compuesto intermedio 10, con un punto de fusión mayor de 260 °C.

20 e) Preparación del compuesto intermedio 11

imagen25

25 A una disolución del compuesto intermedio 10 (0,0008 mol) en THF (40 ml) y DCM (40 ml) se le añadieron EDC (0,0024 mol) y HOBT (0,0024 mol) a temperatura ambiente en flujo de N2. La mezcla se agitó durante 15 min y se le añadió O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)hidroxilamina (0,0024 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante cuatro días, se vertió sobre agua y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4) y se filtró y el disolvente se evaporó. El residuo (0,49 g) se purificó por cromatografía en columna sobre Kromasil (5 µm) (eluyente:

30 DCM/MeOH/NH4OH 98/2/0,2 a 93/7/0,7). Se recogieron las fracciones puras y el disolvente se evaporó, con lo que se obtuvieron 0,26 g (61 %) del compuesto intermedio 11.

Ejemplo de referencia A4

35 a) Preparación del compuesto intermedio 12

imagen26

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A una disolución del compuesto intermedio 8 (0,0104 mol) y 1-metil-3-(3-pirrolidinil)-1H-indol (0,0115 mol) en 1,2dicloroetano (50 ml) se le añadió etanolato de titanio (4+) (0,0172 mol) a temperatura ambiente en flujo de N2. La mezcla se agitó a 60 °C durante 3 h y después se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió tris(acetato-α-O)hidroborato (1-) de sodio (0,0345 mol) de forma porcionada. La mezcla se agitó a temperatura

5 ambiente durante la noche y se vertió sobre agua helada. Se añadió DCM y la mezcla se filtró a través de celita. El filtrado se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4) y se filtró y el disolvente se evaporó. El residuo (3,2 g) se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (15-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0,2). Se recogieron las fracciones puras y el disolvente se evaporó, con lo que se obtuvieron 0,55 g (11 %) del compuesto intermedio 12.

10 b) Preparación del compuesto intermedio 13

imagen27

15 Una mezcla del compuesto intermedio 12 (0,0012 mol) e hidróxido de sodio (0,0024 mol) en EtOH (40 ml) se agitó a 60 °C durante 8 h y después se enfrió a temperatura ambiente. El precipitado se filtró, se lavó con EtOH y después con éter dietílico y se secó, con lo que se obtuvieron 0,6 g (100 %) del compuesto intermedio 13, aislado como sal de sodio.

20 c) Preparación del compuesto intermedio 14

imagen28

A una disolución del compuesto intermedio 13 (0,0016 mol) y trietilamina (0,0048 mol) en DCM/THF (20 ml) se le

25 añadieron HOBT (0,0024 mol) y EDC (0,0024 mol) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 min y se le añadió O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)hidroxilamina (0,0032 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 48 h, se vertió sobre agua y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4) y se filtró y el disolvente se evaporó. El residuo (0,6 g) se purificó por cromatografía en columna sobre Kromasil (10 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0,3). Se recogieron las fracciones puras y el disolvente se

30 evaporó, con lo que se obtuvieron 0,046 g (6 %) del compuesto intermedio 14.

B. PREPARACIÓN DE LOS COMPUESTOS FINALES

Ejemplo B1

35 Preparación del compuesto 1

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40 . 0,32 C2HF3O2 1,24 H2O

Una mezcla del compuesto intermedio 3 (0,003 mol) en TFA (7,5 ml) y MeOH (150 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 24 h y después se evaporó a 30 °C. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice recubierto de grupos amino (25-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/agua 80/20/2). Se recogieron las fracciones 45 puras y el disolvente se evaporó. El residuo (0,453 g, 37 %) se cristalizó a partir de MeOH/CH3CN/éter dietílico. El

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precipitado se separó por filtración y se secó, con lo que se obtuvieron 0,255 g (18 %) del compuesto 1, con un punto de fusión de 296 °C. Ejemplo B2 Preparación del compuesto 2

imagen30

10 . 0,84 C2HF3O2

Una mezcla del compuesto intermedio 6 (0,0003 mol) en TFA (0,9 ml) y MeOH (18 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 24 h y después se evaporó hasta sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice recubierto de grupos amino (25-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/agua 90/10/1). Se recogieron las

15 fracciones puras y el disolvente se evaporó. El residuo (0,195 g) se redisolvió varias veces con éter dietílico. La mezcla se evaporó y se secó, con lo que se obtuvieron 0,122 g (66 %) del compuesto 2, con un punto de fusión de 231 °C.

Ejemplo B3

20 Preparación del compuesto 3

imagen31

25 . 1,38 C2HF3O2

Una mezcla del compuesto intermedio 11 (0,0005 mol) en TFA (1,5 ml) y MeOH (30 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 24 h y después se evaporó a 30 °C. El residuo se cristalizó a partir de CH3CN/MeOH/éter dietílico. El precipitado se separó por filtración y se secó, con lo que se obtuvieron 0,17 g (56 %) del compuesto 3, con un

30 punto de fusión de 224 °C.

Ejemplo de referencia B4

Preparación del compuesto 4 35

imagen32

Una mezcla del compuesto intermedio 14 (0,00009 mol) en TFA (0,2 ml) y MeOH (2 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 24 h y después se evaporó hasta sequedad. El residuo (0,05 g) se purificó por cromatografía en

40 columna sobre gel de sílice recubierto de grupos amino (25-40 µm) (eluyente: DCM/MeOH/agua 85/15/1). Se recogieron las fracciones puras y el disolvente se evaporó, con lo que se obtuvieron 0,022 g (56 %) del compuesto 4, con un punto de fusión de 70 °C.

Ejemplo de referencia B5

45 Preparación del compuesto 5

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imagen33

A una disolución del compuesto intermedio 13 (0,0006 mol), 1,2-bencenodiamina (0,0016 mol) y hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(pirrolidino)fosfonio (0,0014 mol) en DCM (5 ml) y THF (5 ml) se le añadió trietilamina

5 (0,0027 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 72 h, se vertió sobre agua y se extrajo con DCM. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4) y se filtró y el disolvente se evaporó. El residuo (0,8 g) se purificó por cromatografía en columna sobre Kromasil (3,5 µm) (eluyente: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0,3 a 92/8/0,3). Se recogieron las fracciones puras y el disolvente se evaporó, con lo que se obtuvieron 0,014 g (4 %) del compuesto 5, con un punto de fusión de 90 °C.

10 La tabla F-1 ofrece una lista de los compuestos preparados de acuerdo con uno de los ejemplos anteriores.

Tabla F-1

imagen34

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0,32 C2HF3O2 1,24 H2O; compuesto n°1; ejemplo [B1]

0,84 C2HF3O2; compuesto n°2; ejemplo [B2]

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1,38 C2HF3O2; compuesto n°3; ejemplo [B3]

compuesto n°4; ejemplo de referencia [B4]

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compuesto n°5; ejemplo de referencia [B5]

15 C. EJEMPLO FARMACOLÓGICO

El ensayo in vitro de inhibición de histona-desacetilasas (véase el ejemplo C1) mide la inhibición de la actividad enzimática de las HDAC que se obtiene con los compuestos de la fórmula (I).

20 La actividad celular de los compuestos de la fórmula (I) se determinó en células tumorales A2780 mediante un ensayo colorimétrico de toxicidad o supervivencia celular (Mosmann Tim, Journal of Immunological Methods 65: 5563, 1983) (véase el ejemplo C2).

La solubilidad de un compuesto mide la capacidad de dicho compuesto de permanecer en disolución. En el primer

25 procedimiento, se mide la capacidad de un compuesto de permanecer en disolución acuosa después de su dilución (véase el ejemplo C3.a). Las disoluciones de partida en DMSO se diluyen con un único disolvente tampón acuoso en diferentes etapas consecutivas. Las mezclas se analizan después en el analizador de solubilidad BD Gentest para determinar si se ha producido precipitación. En el segundo procedimiento, puede medirse la solubilidad de un compuesto a diferentes pH con el uso de un detector de nitrógeno quimioluminiscente (véase el ejemplo C3.b).

30 La permeabilidad de un fármaco expresa su capacidad para moverse de un medio a otro o a través de otro.

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Específicamente, su capacidad para moverse a través de la membrana intestinal a la corriente sanguínea y/o desde la corriente sanguínea a su diana. La permeabilidad (véase el ejemplo C4) puede medirse a través de la formación de una bicapa fosfolipídica como membrana artificial inmovilizada en un filtro. En el ensayo de la membrana artificial inmovilizada en un filtro se forma un “sándwich” con una placa de microtitulación de 96 pocillos y una placa de filtro

5 de 96 pocillos, de modo que cada pocillo compuesto está dividido en dos cámaras con una disolución donante en el fondo y una disolución receptora en la parte superior, separadas por un disco microfiltrante de 125 µm (0,45 µm de poro), recubierto con una disolución de dioleilfosfatidilcolina al 2 % (p/v) en dodecano, en condiciones tales que se forman bicapas multilaminares dentro de los canales del filtro cuando el sistema entra en contacto con una disolución tampón acuosa. La permeabilidad de los compuestos a través de esta membrana artificial se mide en cm/s. La finalidad es analizar la penetración de los fármacos a través de una membrana artificial paralela a dos pH diferentes: 4,0 y 7,4. La detección de los compuestos se lleva a cabo por espectrometría de UV, a longitudes de onda óptimas entre 250 y 500 nm.

El metabolismo de los fármacos significa que un compuesto xenobiótico o endobiótico soluble en lípidos se

15 transforma enzimáticamente en (un) metabolito(s) polar(es) soluble(es) en agua. El principal órgano para el metabolismo de fármacos es el hígado. Con frecuencia, los productos metabólicos son menos activos que el fármaco originario o son inactivos. Sin embargo, algunos metabolitos pueden tener mayor actividad o efectos tóxicos. Por lo tanto, el metabolismo de los fármacos puede incluir tanto procesos de “desintoxicación” como de “intoxicación”. Uno de los principales sistemas enzimáticos que determinan la capacidad del organismo de reaccionar a los fármacos y sustancias químicas está representado por las citocromo-P450-monooxigenasas, que son enzimas dependientes de NADPH. La estabilidad metabólica de los compuestos puede determinarse in vitro con el uso de tejido humano subcelular (véase el ejemplo C5). En este caso, la estabilidad metabólica de los compuestos se expresa como el % del fármaco metabolizado después de 15 min de incubación de estos compuestos con microsomas. La cuantificación de los compuestos se determinó mediante análisis de CL-EM.

25 Se ha demostrado que una amplia diversidad de agentes antitumorales activa la proteína p21, incluidos agentes que dañan el ADN e inhibidores de histona-desacetilasas. Los agentes que dañan el ADN activan el gen p21 a través del supresor tumoral p53, mientras que los inhibidores de histona-desacetilasas activan transcripcionalmente el gen p21 a través del factor de transcripción Sp1. Por lo tanto, los agentes que dañan el ADN activan el promotor de p21 a través del elemento de respuesta a p53, mientras que los inhibidores de histona-desacetilasas activan el promotor de p21 a través de sitios sp1 (situados en la región de -60 pb a +40 pb con respecto a la caja TATA), lo que, en ambos casos conduce a un aumento de la expresión de la proteína p21. Si el promotor de p21 en una célula consta de un fragmento de 1.300 pb del promotor de p21 que no comprende elementos de respuesta a p53, no será sensible a los agentes que dañan el ADN.

35 La capacidad de los compuestos para inducir p21 puede evaluarse examinando la capacidad de los compuestos para inducir p21 como consecuencia de la inhibición de las HDAC a nivel celular. Las células pueden transfectarse de manera estable con un vector de expresión que contiene un fragmento del promotor de p21 de 1.300 pb que no comprende los elementos de respuesta a p53 y, de este modo, un aumento de la expresión de un gen indicador, en comparación con los niveles de control, identifica el compuesto como con capacidad de inducción de p21. El gen indicador es una proteína fluorescente y la expresión del gen indicador se mide como la cantidad de luz fluorescente emitida (véase el ejemplo C6.a).

El último procedimiento es un procedimiento in vivo en el que se usan ratones para analizar la actividad farmacéutica

45 de un compuesto. Las células tumorales transformadas de manera estable descritas anteriormente pueden administrarse a ratones en una cantidad suficiente para causar la producción de un tumor. Después de que las células tumorales han tenido el tiempo suficiente para formar un tumor, puede administrarse a los animales un compuesto potencialmente activo y el efecto de dicho compuesto en las células tumorales se evalúa midiendo la expresión del gen indicador. La incubación con compuestos farmacéuticamente activos resultará en un aumento de la expresión del gen indicador en comparación con los niveles de control (véase el ejemplo C6.b).

Los inhibidores específicos de las HDAC no deben inhibir otras enzimas como las abundantes proteínas CYP P450. Las proteínas CYP 450 (expresadas en E. coli) 3A4, 2D6 y 2C9 convierten sus sustratos específicos en moléculas fluorescentes. La proteína CYP3A4 convierte 7-benciloxitrifluorometilcumarina (BFC) en 7

55 hidroxitrifluorometilcumarina. La proteína CYP2D6 convierte 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamino)etil]-7-metoxi-4metilcumarina (AMMC) en clorhidrato de 3-[2-(N,N,dietilamino)etil]-7-hidroxi-4-metilcumarina y la proteína CYP2C9 convierte 7-metoxi-4-trifluorometilcumarina (MFC) en 7-hidroxitrifluorometilcumarina. Los compuestos que inhiben la reacción enzimática resultarán en una disminución de la señal fluorescente (véase el ejemplo C7).

Ejemplo C1: ensayo in vitro de inhibición de histona-desacetilasas

Se usó el ensayo de actividad fluorescente de HDAC del kit de descubrimiento de fármacos de Biomol (n° de catálogo: AK-500-0001). El ensayo de actividad fluorescente de HDAC se basa en la combinación de sustrato y revelador Fluor de Lys (del inglés, Fluorogenic Histone deAcetylase Lysyl). El sustrato de Fluor de Lys comprende

65 una cadena lateral de lisina acetilada. La desacetilación del sustrato sensibiliza dicho sustrato de modo que, en una segunda etapa, el tratamiento con el revelador de Fluor de Lys produce un fluoróforo.

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Se incubaron extractos nucleares de HeLa (proveedor: Biomol) a una concentración de 60 µg/ml con el sustrato a una concentración de 75 µM. El sustrato Fluor de Lys se añadió en un tampón que contenía Tris 25 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM y MgCl2.6H2O 1 mM a pH 7,4. Después de 30 min se añadió un volumen del revelador. El

5 fluoróforo se excitó con luz de 355 nm y la luz emitida (450 nm) se detectó en un lector fluorométrico de placas.

Para cada experimento se llevaron a cabo paralelamente los controles (que contenían el extracto nuclear de HeLa y el tampón), una incubación en blanco (que contenía el tampón, pero sin extracto nuclear de HeLa) y las muestras (que contenían el compuesto disuelto en DMSO y diluido adicionalmente en el tampón y el extracto nuclear de HeLa). En primer lugar, los compuestos se probaron a una concentración de 10-5 M. Cuando los compuestos mostraron actividad a 10-5 M, se llevó a cabo una curva de respuesta a la concentración en la que los compuestos se probaron a concentraciones entre 10-5 M y 10-9 M. Todas las muestras se probaron cuatro veces. En cada prueba se sustrajo el valor del blanco de los valores del control y de las muestras. La muestra de control representó el 100 % de desacetilación del sustrato. Para cada muestra, la fluorescencia se expresó como porcentaje del valor medio de

15 los controles. En caso apropiado, se computaron los valores de la CI50 (concentración del fármaco necesaria para reducir la cantidad de metabolitos al 50 % del control) mediante un análisis de probit para datos graduales. En este documento, los efectos de los compuestos de prueba se expresan como pCI50 (el logaritmo negativo del valor de la CI50) (véase la tabla F-2).

Ejemplo C2: determinación de la actividad antiproliferativa en células A2780

Todos los compuestos probados se disolvieron en DMSO y las diluciones posteriores se hicieron en medio de cultivo. Las concentraciones finales de DMSO nunca excedieron el 0,1 % (v/v) en los ensayos de proliferación celular. Los controles contenían células A2780 y DMSO sin ningún compuesto y los blancos contenían DMSO pero

25 no células. La sustancia MTT se disolvió a una concentración de 5 mg/ml en PBS. Se preparó un tampón de glicina que comprendía glicina 0,1 M y NaCl 0,1 M, tamponado a pH 10,5 con NaOH (1 N) (todos los reactivos fueron de Merck).

Las células de carcinoma ovárico humano A2780 (proporcionadas amablemente por el Dr. T. C. Hamilton (Fox Chase Cancer Centre, Pensilvania, EE. UU.)) se cultivaron en el medio RPMI 1640 enriquecido con L-glutamina 2 mM, 50 µg/ml de gentamicina y suero bovino fetal al 10 %. Las células se mantuvieron rutinariamente como cultivos monocapa a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 %. Las células se transfirieron una vez a la semana usando una disolución de tripsina y EDTA, con una relación de división de 1:40. Todos los medios y complementos se obtuvieron de Life Technologies. Las células no estaban contaminadas por micoplasmas, según se determinó

35 mediante el kit de detección de micoplasmas en cultivos de tejidos Gen-Probe (proveedor: BioMérieux).

Las células se sembraron en placas de cultivo NUNCTM de 96 pocillos (proveedor: Life Technologies) y se les dejó adherirse al plástico durante la noche. Las densidades usadas para la siembra de las placas fueron de 1.500 células por pocillo en un volumen total de 200 µl de medio. Después de la adhesión de las células a las placas se cambió el medio y se añadieron los fármacos y/o disolventes hasta un volumen final de 200 µl. Después de cuatro días de incubación, el medio se sustituyó por 200 µl de medio fresco y se determinó la densidad y la viabilidad celular por medio de un ensayo a base de MTT. A cada pocillo se añadieron 25 µl de una disolución de MTT y las células se siguieron incubando durante 2 h a 37 °C. El medio se succionó entonces cuidadosamente y el producto azul MTTformazán se solubilizó mediante la adición de 25 µl de tampón de glicina, seguidos de 100 µl de DMSO. Las placas

45 de microensayo se agitaron durante 10 min en un agitador de microplacas y se midió la absorbancia a 540 nm mediante un espectrofotómetro Emax para 96 pocillos (proveedor: Sopachem). Dentro de un experimento, los resultados para cada condición experimental son la media de tres pocillos replicados. Para una selección inicial, los compuestos se probaron a una única concentración fija de 10-6 M. Los experimentos se repitieron para los compuestos activos para establecer curvas completas de respuesta a la concentración. Para cada experimento, se llevaron a cabo paralelamente los controles (que no contenían ningún fármaco) y una incubación en blanco (sin células ni fármacos). El valor del blanco se sustrajo de los valores de todos los controles y muestras. Para cada muestra, el valor medio del crecimiento celular (en unidades de absorbancia) se expresó como porcentaje del valor medio del crecimiento celular del control. En caso apropiado, se computaron los valores de la CI50 (concentración del fármaco necesaria para reducir el crecimiento celular al 50 % del control) mediante un análisis de probit para datos

55 graduales (Finney, D. J., Probit Analyses, 2a edición, capítulo 10, Graded Responses, Cambridge University Press, Cambridge 1962). En este documento, los efectos de los compuestos de prueba se expresan como pCI50 (el logaritmo negativo del valor de la CI50) (véase la tabla F-2).

Ejemplo C3: solubilidad y estabilidad

C3.a: solubilidad cinética en medios acuosos

Se preparan disoluciones de partida en DMSO de concentraciones de 5.000 a 9,8 µM (diluciones 1/2) en una placa de disoluciones de partida de 96 pocillos (200 µl por pocillo). Las muestras se mezclan después de cada dilución. A 65 continuación se transfieren alícuotas de estas disoluciones en DMSO (2 µl) a otras dos placas de tampón de 96

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pocillos que contienen 200 µl de tampón acuoso por pocillo. Cada una de las placas de tampón contiene tampón acuoso a pH 7,4 o tampón acuoso a pH 4,0. Después de la última dilución, las placas de tampón se mezclan y las muestras se estabilizan a temperatura ambiente durante media hora. La dilución se realiza por duplicado para cada compuesto para excluir errores ocasionales. A continuación, las mezclas se analizan en el analizador de solubilidad 5 BD Gentest para determinar si se ha producido precipitación. La solubilidad cinética se calcula por interpolación sobre la base de la ausencia o presencia de precipitados en las mezclas. Se efectúa una clasificación en tres clases. Los compuestos con una alta solubilidad obtuvieron una puntuación de 3 y tienen una solubilidad superior o igual a 50 µM. Los compuestos con solubilidad media obtuvieron una puntuación de 2 y tienen una solubilidad superior a 10 µM e inferior a 50 µM. Los compuestos con baja solubilidad obtuvieron una puntuación de 1 y la solubilidad de estos

10 compuestos es inferior o igual a 10 µM (véase la tabla F-2).

C3.b: solubilidad

La solubilidad de un compuesto a diferentes valores de pH también puede medirse mediante un detector de 15 nitrógeno luminiscente (véase la tabla F-2).

Ejemplo C4: análisis de permeabilidad a través de una membrana artificial paralela

Las muestras de partida (alícuotas de 10 µl de una disolución de partida 5 M en DMSO al 100 %) se diluyeron en

20 una placa de pocillos hondos o una placa de premezcla con 2 ml de un sistema tampón acuoso a pH 4 o pH 7,4 (PSR4 System Solution Concentrate (pION)).

Antes de añadir las muestras a la placa de referencia, se añadieron 150 µl de tampón a los pocillos y se llevó a cabo una medida de UV en blanco. A continuación, el tampón se desechó y la placa se usó como placa de referencia.

25 Todas las medidas se llevaron a cabo en placas resistentes a UV (proveedor: Costar o Greiner).

Después de la medida en blanco de la placa de referencia, se añadieron 150 µl de las muestras diluidas a dicha placa de referencia y 200 µl de las muestras diluidas a la placa donante 1. Una placa filtrante receptora 1 (proveedor: Millipore, tipo MAIP N45) se recubrió con 4 µl de la disolución formadora de la membrana artificial (1,2-dioleil-sn

30 glicero-3-fosfocolina en dodecano con 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol al 0,1 %) y se colocó sobre la placa donante 1 para formar un “sándwich”. El tampón (200 µl) se añadió a los pocillos receptores de la parte superior. El sándwich se cubrió con una tapa y se almacenó durante 18 h a temperatura ambiente en la oscuridad.

Se llevó a cabo una medida en blanco de la placa receptora 2 mediante la adición de 150 µl de tampón a los

35 pocillos, seguida de una medida de UV. Después de la medida en blanco de la placa receptora 2, el tampón se desechó y se transfirieron 150 µl de la disolución receptora desde la placa filtrante receptora 1 a la placa receptora 2. Después, la placa filtrante receptora 1 se retiró del sándwich. Después de la medida en blanco de la placa donante 2 (véase anteriormente), se transfirieron 150 µl de la disolución donante de la placa donante 1 a la placa donante 2. Se analizaron los espectros de UV de los pocillos de la placa donante 2, la placa receptora 2 y la placa de referencia

40 (con un aparato SpectraMAX 190). Todos los espectros se procesaron para calcular la permeabilidad con el programa PSR4p Command. Todos los compuestos se midieron por triplicado. Como estándares en cada experimento se usaron carbamacepina, griseofulvina, acicloguanisina, atenolol, furosemida y clorotiazida. Los

10-6

compuestos se clasificaron en tres categorías como de baja permeabilidad (efecto medio < 0,5 x cm/s; puntuación 1), de permeabilidad media (1 x 10-6 cm/s > efecto medio ≥ 0,5 x 10-6 cm/s; puntuación 2) o alta

45 permeabilidad (≥ 1 x 10-6 cm/s; puntuación 3).

Ejemplo C5: estabilidad metabólica

Las preparaciones de tejidos subcelulares se hicieron de acuerdo con Gorrod y col. (Xenobiotica 5: 453-462, 1975)

50 por separación centrífuga después de la homogeneización mecánica del tejido. El tejido hepático se lavó en tampón de Tris-HCl 0,1 M (pH 7,4) helado para eliminar el exceso de sangre. Después el tejido se secó con papel de filtro, se pesó y se cortó en piezas gruesas mediante tijeras quirúrgicas. Las piezas de tejido se homogeneizaron con una mano de mortero de teflón o un homogeneizador Sorvall Omni-Mix durante 7 x 10 s. En ambos casos, el recipiente se mantuvo en/sobre hielo durante el proceso de homogeneización.

55 Los tejidos homogeneizados se centrifugaron a 9.000 x g durante 20 min a 4 °C mediante una centrífuga Sorvall o una ultracentrífuga Beckman. El sobrenadante resultante se almacenó a -80 °C y se denomina “S9”.

La fracción S9 puede centrifugarse adicionalmente a 100.000 x g durante 60 min (4 °C) mediante una ultracentrífuga

60 Beckman. El sobrenadante resultante se succionó cuidadosamente, se distribuyó en alícuotas y se denominó “citosol”. El sedimento se resuspendió en tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,4) en un volumen final de 1 ml por 0,5 g de peso de tejido original y se denominó “microsomas”.

Todas las fracciones subcelulares se distribuyeron en alícuotas, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido 65 y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

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Para las muestras de prueba, la mezcla de incubación contenía PBS (0,1 M), el compuesto (5 µM), microsomas (1 mg/ml) y un sistema generador de NADPH (glucosa-6-fosfato 0,8 mM, cloruro de magnesio 0,8 mM y 0,8 unidades de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa). Las muestras de control contenían el mismo material, pero los microsomas se

5 sustituyeron por microsomas termoinactivados (10 min a 95 °C). La recuperación de los compuestos en las muestras de control fue siempre del 100 %.

Las mezclas se preincubaron durante 5 min a 37 °C. La reacción se inició en el momento cero (t = 0) mediante la adición de NADP 0,8 mM y las muestras se incubaron durante 15 min (t = 15). La reacción se terminó mediante la adición de dos volúmenes de DMSO. Después, las muestras se centrifugaron durante 10 min a 900 x g y los sobrenadantes se almacenaron a temperatura ambiente durante no más de 24 h antes de su análisis. Todas las incubaciones se realizaron por duplicado. El análisis de los sobrenadantes se llevó a cabo por CL-EM. La elución de las muestras se llevó a cabo en un aparato Xterra MS C18 (50 x 4,6 mm, 5 µm, Waters, EE. UU.). Se usó un sistema de HPLC Alliance 2790 (proveedor: Waters, EE. UU.). La elución se llevó a cabo con el tampón A (acetato de

15 amonio 25 mM (pH 5,2) en H2O/acetonitrilo (95/5)), con acetonitrilo como disolvente B y metanol como disolvente C a una tasa de flujo de 2,4 ml/min. El gradiente empleado aumentó la concentración de la fase orgánica desde el 0 %, pasando por el 50 % de B y el 50 % de C en 5 min, hasta el 100 % de B en 1min de manera lineal y la concentración de la fase orgánica se mantuvo estacionaria durante 1,5 min más. El volumen total de inyección de las muestras fue de 25 µl.

Como detector se usó un espectrofotómetro de masas de triple cuadrupolo Quattro (proveedor: Micromass, Manchester, Reino Unido) equipado con una fuente de ESI. Las temperaturas de la fuente y la desolvatación se ajustaron a 120 y 350 °C, respectivamente y se usó nitrógeno como gas de nebulización y secado. Los datos se adquirieron en modo de barrido positivo (reacción de iones individuales). La tensión de cono se ajustó a 10 V y el

25 tiempo de permanencia fue de 1 s.

La estabilidad metabólica se expresó como el % del metabolismo del compuesto después de 15 min de incubación en presencia de microsomas activos

imagen39

Los compuestos con un porcentaje de metabolismo inferior al 20% se definieron como de alta estabilidad metabólica. Los compuestos con un metabolismo del 20 al 70 % se definieron como de estabilidad intermedia y los compuestos que mostraron un porcentaje de metabolismo superior al 70 % se definieron como de baja estabilidad

35 metabólica. Siempre que se llevó a cabo un análisis de estabilidad metabólica se incluyeron tres compuestos de referencia. Como compuesto de baja estabilidad metabólica se incluyó verapamilo (% de metabolismo = 73 %). Como compuesto de estabilidad metabólica media se incluyó cisaprida (% de metabolismo = 45 %) y como compuesto con estabilidad metabólica intermedia a alta se incluyó propanol (25 % de metabolismo) Estos compuestos de referencia se usaron para validar el ensayo de estabilidad metabólica. Se probaron los compuestos 2 y 3 y resultaron tener una estabilidad metabólica alta e intermedia, respectivamente.

Ejemplo C6: capacidad de inducción de p21

Ejemplo C6.a: procedimiento celular

45 Se cultivaron células A2780 (ATCC) en el medio RPMI 1640 enriquecido con suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM y gentamicina a 37 °C en un incubador humidificado con CO2 al 5 %. Todas las disoluciones de cultivo fueron proporcionadas por Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, EE. UU.). Otros materiales fueron proporcionados por Nunc.

Se extrajo el ADN genómico de las células A2780 en proliferación y se usó como molde para aislamiento del promotor de p21 por PCR anidada. La primera amplificación se realizó durante 20 ciclos a una temperatura de hibridación de 55 °C con el par de oligonucleótidos GAGGGCGCGGTGCTTGG y TGCCGCCGCTCTCTCACC y el ADN genómico como molde. El fragmento de 4,5 kb resultante que contenía el fragmento de -4.551 a +88 con respecto a la caja TATA se reamplificó con los oligonucleótidos TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG y

55 ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC durante 20 ciclos con hibridación a 88 °C, lo que resultó en un fragmento de 4,5 kb, y después con el par de oligonucleótidos TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC y ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC durante 20 ciclos con hibridación a 88 °C, lo que resultó en un fragmento de 1,3 kb que contenía el fragmento de -1.300 a +88 con respecto a la caja TATA. Los sitios de restricción XhoIy KpnI presentes en los oligonucleótidos (secuencia subrayada) se usaron para la subclonación.

El indicador luciferasa se escindió del plásmido pGL3-basic y se sustituyó por el indicador ZsGreen (del plásmido pZsGreen1-N1) en los sitios de restricción KpnIy XbaI. El plásmido pGL3-basic-ZsGreen-1300 se construyó por inserción del fragmento de 1,3 kb anteriormente mencionado de la región promotora del gen p21 humano en pGL3-basic-ZsGreen en los sitios de restricción XhoIy KpnI. Todas las enzimas de restricción fueron proporcionadas por

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Boehringer Mannheim (Alemania). Las células A2780 se sembraron en una placa de seis pocillos a una densidad de 2 x 105 células, se incubaron durante 24 h y se transfectaron con 2 µg de pGL3-basic-ZsGreen-1300 y 0,2 µg del vector pSV2neo con el uso de Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Bruselas, Bélgica), según describe el fabricante. Las células transfectadas se seleccionaron durante 10 días con G418 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD. EE. UU.) y se

5 cultivaron suspensiones de células individuales. Después de tres semanas se obtuvieron clones individuales.

Los clones seleccionados de células A2780 se dejaron crecer y se sembraron a una densidad de 10.000 por pocillo en placas de 96 pocillos. A las 24 h de la siembra, las células se trataron durante otras 24 h con los compuestos (que afectan a los sitios sp1 en la zona promotora proximal de p21). A continuación, las células se fijaron con PFA al 4 % durante 30 min y se sometieron a contratinción con el colorante de Hoechst. La activación del promotor de p21 que conduce a la producción de ZsGreen y, por lo tanto, de fluorescencia se monitorizó mediante un aparato Ascent Fluoroskan (Thermo Labsystems, Bruselas, Bélgica).

Para cada experimento, se llevaron a cabo paralelamente controles (que no contenían ningún fármaco) y una

15 incubación en blanco (sin células ni fármacos). El valor del blanco se sustrajo de los valores de todos los controles y muestras. Para cada muestra, el valor de la inducción de p21 se expresó como el porcentaje del valor de p21 presente en el control. Un porcentaje de inducción superior al 130 % se definió como inducción significativa.

Se probaron los compuestos 1, 2 y 3, que mostraron una inducción significativa a una concentración de 100 nM.

Ejemplo C6.b: procedimiento in vivo

Un clon seleccionado se inyectó por vía subcutánea (107 células/200 µl) en la ijada de ratones sin pelo y después de 12 días se obtuvo un tumor que podía medirse con un calibre. A partir del día 12, los ratones recibieron, por vía oral

25 o intravenosa, dosis diarias durante 6 días de disolvente y 20-40 mg/kg de los compuestos (4-10 animales en cada caso). Los tumores se evaluaron por fluorescencia mediante el sistema automático de obtención de imágenes del cuerpo completo desarrollado en nuestro laboratorio (microscopio estereoscópico de fluorescencia del tipo Olympus® SZX12, equipado con un filtro de GFP y acoplado a una cámara CCD del tipo JAI® CV-M90 controlada por un paquete de software basado en el software IMAQ Vision de National Instruments®).

Se probó el compuesto 2, que mostró un aumento de la fluorescencia en comparación con el control.

Ejemplo C7: capacidad de inhibición de P450

35 Todos los compuestos probados se disolvieron en DMSO (5 mM) y se llevó a cabo una dilución adicional hasta 5 x 10-4 en acetonitrilo. Se realizaron otras diluciones en el tampón de ensayo (tampón de fosfato de NaK 0,1 M, pH 7,4) y la concentración final de disolvente nunca fue superior al 2 %.

El ensayo para la proteína CYP3A4 comprende, por pocillo, 15 pmol de P450/mg de proteína (en tampón de fosfato de NaK 0,01 M + KCl al 1,15 %), un sistema generador de NADPH (glucosa-6-fosfato 3,3 mM, 0,4 U/ml de glucosa6-fosfato-deshidrogenasa, NADP 1,3 mM y MgCl2.6H2O 3,3 mM en el tampón de ensayo) y el compuesto en un volumen de ensayo total de 100 µl. Después de una preincubación de 5 min a 37 °C, la reacción enzimática se inició con la adición del sustrato de la sonda fluorescente BFC a una concentración de 150 µM en el tampón de ensayo. Después de una incubación de 30 min a temperatura ambiente, la reacción se terminó con la adición de dos

45 volúmenes de acetonitrilo. La determinación de fluorescencia se llevó a cabo a una longitud de onda de excitación de 405 nm y una longitud de onda de emisión de 535 nm. Como compuesto de referencia, en este experimento se incluyó ketoconazol (valor de CI50 = 3 x 10-8 M).

El ensayo para la proteína CYP2D6 comprende, por pocillo, 6 pmol de P450/mg de proteína (en tampón de fosfato de NaK 0,01 M + KCl al 1,15 %), un sistema generador de NADPH (glucosa-6-fosfato 0,41 mM, 0,4 U/ml de glucosa6-fosfato-deshidrogenasa, NADP 0,0082 mM y MgCl2.6H2O 0,41 mM en el tampón de ensayo) y el compuesto en un volumen de ensayo total de 100 µl. Después de una preincubación de 5 min a 37 °C, la reacción enzimática se inició mediante la adición del sustrato de la sonda fluorescente AMMC a una concentración de 3 µM en el tampón de ensayo. Después de una incubación de 45 min a temperatura ambiente, la reacción se terminó con la adición de dos

55 volúmenes de acetonitrilo. Las determinaciones de fluorescencia se llevaron a cabo a una longitud de onda de excitación de 405 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm. Como compuesto de referencia, en este experimento se incluyó quinidina (valor de CI50 < 5 x 10-8 M).

El ensayo para la proteína CYP2C9 comprende, por pocillo, 15 pmol de P450/mg de proteína (en tampón de fosfato de NaK 0,01 M + KCl al 1,15 %), un sistema generador de NADPH (glucosa-6-fosfato 3,3 mM, 0,4 U/ml de glucosa6-fosfato-deshidrogenasa, NADP 1,3 mM y MgCl2.6H2O 3,3 mM en el tampón de ensayo) y el compuesto en un volumen de ensayo total de 100 µl. Después de una preincubación de 5 min a 37 °C, la reacción enzimática se inició mediante la adición del sustrato MFC de la sonda fluorescente a una concentración de 200 µM en el tampón de ensayo. Después de una incubación de 30 min a temperatura ambiente, la reacción se terminó con la adición de dos 65 volúmenes de acetonitrilo. Las determinaciones de fluorescencia se llevaron a cabo a una longitud de onda de

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excitación de 405 nm y una longitud de onda de emisión de 535 nm. Como compuesto de referencia, en este experimento se incluyó sulfafenazol (valor de CI50 = 6,8 x 10-7 M).

10-5

Para una selección inicial, los compuestos se probaron a una única concentración fija de 1 x M. Los

5 experimentos se repitieron para los compuestos activos para establecer curvas completas de respuesta a la concentración. Para cada experimento, se llevaron a cabo paralelamente controles (que no contenían ningún fármaco) y una incubación en blanco (sin células ni fármacos). Todos los compuestos se ensayaron por cuadruplicado. El valor del blanco se sustrajo de los valores de todos los controles y muestras. Para cada muestra, el valor medio de la actividad de P450 de la muestra (en unidades relativas de fluorescencia) se expresó como

10 porcentaje del valor medio de la actividad de P450 del control. En caso apropiado, se computaron los valores de la CI50 (concentración del fármaco necesaria para reducir la actividad de P450 al 50 % del control).

Tabla F-2: resultados de los compuestos probados de acuerdo con los ejemplos C1, C2, C3.a y C3.b

Comp. n°

Actividad enzimática pCI50 C1 Actividad celular pCI50 C2 Solubilidad C3.a pH=7,4 µM Solubilidad C3.b pH=2,3 mg/ml

1

9,0 7,5 7,8

2

8,9 7,3 9,4 1,35

3

8,3 7,5 15,6

15 D. EJEMPLO DE COMPOSICIÓN: COMPRIMIDOS RECUBIERTOS CON PELÍCULA

Preparación del núcleo del comprimido

Una mezcla de 100 g de un compuesto de la fórmula (I), 570 g de lactosa y 200 g de almidón se mezcla bien y a

20 continuación se humidifica con una disolución de 5 g de dodecilsulfato de sodio y 10 g de polivinilpirrolidona en aproximadamente 200 ml de agua. La mezcla de polvo húmedo se tamiza, se seca y se vuelve a tamizar. Después se le añaden 100 g de celulosa microcristalina y 15 g de aceite vegetal hidrogenado. El conjunto se mezcla bien y se comprime en comprimidos, con lo que se obtienen 10.000 comprimidos, cada uno de los cuales comprende 10 mg de un compuesto de la fórmula (I).

25 Recubrimiento

A una disolución de 10 g de metilcelulosa en 75 ml de etanol desnaturalizado se le añade una disolución de 5 g de etilcelulosa en 150 ml de diclorometano. Después, se añaden 75 ml de diclorometano y 2,5 ml de 1,2,3-propanotriol.

30 Se funden 10 g de polietilenglicol y se disuelven en 75 ml de diclorometano. Esta última disolución se añade a la primera y después se añaden 2,5 g de octadecanoato de magnesio, 5 g de polivinilpirrolidona y 30 ml de una suspensión coloreada concentrada y el conjunto se homogeneíza. Los núcleos de los comprimidos se recubren con la mezcla así obtenida en un aparato de recubrimiento.

Claims (10)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto de la fórmula (I),

   imagen1

   las formas N-óxido, las sales de adición farmacéuticamente aceptables y las formas estereoquímicamente isoméricas de los mismos, en el que:

   10 n es 0 o 1 y cuando n es 0, quiere indicarse un enlace directo;

   m es 0, 1 o 2 y cuando m es 0, quiere indicarse un enlace directo;

   p es 0 o 1 y cuando p es 0, quiere indicarse un enlace directo; 15 X es N;

   cada Y es independientemente O, NH, N-alquilo C1-6, CH o CH2 y cuando Y es CH, el sustituyente está unido al átomo Y de la estructura de anillo; 20 R1 es hidroxi o un radical de la fórmula (a-1)

   imagen2

   25 enlaque

   R9 es hidroxi o -NH2;

   R10 es hidrógeno, tienilo, furanilo o fenilo y cada tienilo, furanilo o fenilo puede estar sustituido opcionalmente

   30 con halo, amino, nitro, ciano, hidroxi, fenilo, alquilo C1-6, dialquilamino C1-6, alquiloxi C1-6, fenilalquiloxi C1-6, hidroxialquilo C1-6, alquiloxicarbonilo C1-6, hidroxicarbonilo, alquilcarbonilo C1-6, polihaloalquiloxi C1-6, polihaloalquilo C1-6, alquilsulfonilo C1-6, hidroxicarbonilalquilo C1-6, alquilcarbonilamino C1-6, aminosulfonilo, aminosulfonilalquilo C1-6, isoxazolilo, aminocarbonilo, fenilalquenilo C2-6, fenilalquinilo C3-6 o piridinilalquinilo C3-6;

   35 R6, R7 y R8 son independientemente hidrógeno, -NH2, nitro, furanilo, halo, alquilo C1-6, alquiloxi C1-6, trifluorometilo, tienilo, fenilo, alquilcarbonilamino C1-6, aminocarbonilalquilo C1-6 o -C≡C-CH2-R11; en donde R11 es hidrógeno, alquilo C1-6, hidroxi, amino o alquiloxi C1-6;

   40 R2 es alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7, alquilaminocarbonilo C1-6 o alquiloxicarbonilo C1-6;

   R3 es hidrógeno, alquilo C1-6, cicloalquilo C3-7, hidroxialquilo C1-6, alquiloxi C1-6 alquilo C1-6, alquiloxicarbonilo C1-6 o alquilaminocarbonilo C1-6; o

   45 R2 y R3 pueden unirse (es decir, formar un sistema de anillo cíclico) mediante un puente de metileno, etileno o propileno;

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   R12 R13

   R4 es hidrógeno, alquilo C1-6, -C(=O)-CHR12R13 o -S(=O)2-N(CH3)2; en que cada uno de y es independientemente hidrógeno, amino, alquilo C1-6, o aminoalquilo C1-6; y

   R5

   es hidrógeno, hidroxi, amino, halo, alquilo C1-6, polihaloalquilo C1-6, alquiloxicarbonilo C1-6, hidroxicarbonilo, 5 alquilcarbonilamino C1-6, alquiloxi C1-6 o mono o dialquilamino C1-6.
2. 2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que n es 1; p es 0; cada Y es CH; R10 es hidrógeno; R6, R7 y R8 son independientemente hidrógeno; R2 es alquilo C1-6 y R3 es hidrógeno o R2 y R3 pueden unirse mediante un puente de metileno, etileno o propileno; R4 es alquilo C1-6; y R5 es hidrógeno.

   10
3. 3. Un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2, en el que n es 1; m es 1 o 2; p es 0; cada X es N; cada Y es CH; R2 y R3 están unidos mediante un puente de metileno, etileno o propileno; R4 es alquilo C1-6; y R5 es hidrógeno.

   15 4. Un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 y 3, en que dicho compuesto es el compuesto n° 2 o el compuesto n°3.

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4. 5. Una composición farmacéutica que comprende vehículos farmacéuticamente aceptables y, como principio activo, 20 una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto según se reivindica en las reivindicaciones 1 a 4.
5. 6. Un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica según se reivindica en la reivindicación 5, en que los vehículos farmacéuticamente aceptables y un compuesto según se reivindica en las reivindicaciones 1 a 4 se mezclan íntimamente.

   25

6. 7.

   Un compuesto según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso como medicamento.

7. 8.

   Uso de un compuesto según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de un

   medicamento para el tratamiento de enfermedades proliferativas. 30
8. 9. Una combinación de un agente anticancerígeno y un inhibidor de HDAC según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
9. 10. Un procedimiento para la preparación de un compuesto según se reivindica en la reivindicación 1, caracterizado 35 porque

   a) se hace reaccionar un compuesto intermedio de la fórmula (II) con un ácido apropiado para obtener un ácido hidroxámico de la fórmula (I), en el que R1 es hidroxi, denominado en este documento como compuesto de la fórmula (I-a),

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   imagen5

   b) se hace reaccionar un compuesto intermedio de la fórmula (III), en la que M representa hidrógeno, sodio o litio o un catión de metal alcalino, con un compuesto intermedio de la fórmula (IV) en presencia de los reactivos apropiados y en un disolvente adecuado, con la formación de un compuesto de la fórmula (I), en el que R1 es un radical de la fórmula (a-1) y R9 es -NH2, denominado en este documento como compuesto de la fórmula (I-b),

   imagen6

   10 c) se hace reaccionar un compuesto intermedio de la fórmula (V) con un ácido apropiado en un disolvente adecuado, con la formación de un compuesto de la fórmula (I-b), o

   imagen7

   15 d) se hace reaccionar un compuesto intermedio de la fórmula (VI), en la que TBDMS significa tercbutil(dimetil)silanilo, con fluoruro de tetrabutilamonio en un disolvente adecuado, con la formación de un compuesto de la fórmula (I), en el que R1 es un radical de la fórmula (a-1) y R9 es hidroxi, denominado en este documento como compuesto de la fórmula (I-c).

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10. 11. Un compuesto de la fórmula (A), en el que Q es alquiloxicarbonilo C1-2, hidroxicarbonilo o tetrahidropiraniloxiaminocarbonilo y n, m, p, X, Y, Z, R2, R3, R4 y R5 son según se definen para la fórmula (I) y las formas N-óxido, las sales de adición farmacéuticamente aceptables y las formas estereoquímicamente isoméricas del mismo.

    imagen9

    10 12. Un procedimiento para la preparación de un compuesto según se reivindica en la reivindicación 11, caracterizado porque

    a) se hace reaccionar un compuesto intermedio de la fórmula (III-a) con un compuesto intermedio de la fórmula (VII) para formar un compuesto de la fórmula (A) en el que Q es tetrahidropiraniloxiaminocarbonilo, representado por la 15 fórmula (II):

    imagen10

    b) se hace reaccionar un compuesto intermedio de la fórmula (X) con una disolución ácida apropiada para formar 20 una compuesto de la fórmula (A), en el que Q es hidroxicarbonilo, denominado en este documento como compuesto de la fórmula (III),

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    c) se hace reaccionar un compuesto intermedio de la fórmula (XI) con un compuesto intermedio de la fórmula (XII) para formar un compuesto de la fórmula (A), en el que Q es alquiloxicarbonilo C1-2 y R3 es hidrógeno, denominado en este documento como compuesto de la fórmula (X-a), o

    imagen12

    d) se hace reaccionar un compuesto intermedio de la fórmula (XIII) con un compuesto intermedio de la fórmula (XIV)

    10 para formar un compuesto de la fórmula (A), en el que Q es alquiloxicarbonilo C1-2 y R2 y R3 están unidos por un puente, en que la línea punteada representa un puente de metileno, etileno o propileno, denominado en este documento como compuesto intermedio de la fórmula (X-b).

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