ES2500265T3 - Proteína Tat Oyi mutada para prevenir o tratar SIDA - Google Patents

Abstract

Proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 que puede estimular una respuesta inmunitaria contra una proteína Tat, para su uso en la prevención o el tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en un paciente.

Description

Proteína Tat Oyi mutada para prevenir o tratar SIDA

La presente invención proporciona composiciones para su uso en la prevención o el tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en un paciente humano, y una vacuna contra una infección por VIH.

Antecedentes técnicos:

La búsqueda de una vacuna contra el SIDA sigue siendo una cuestión principal desde el descubrimiento del VIH-1 (Barre-Sinoussi et al., 1983). El fracaso de enfoques de vacuna clásicos que seleccionan como diana proteínas de la envuelta de VIH-1 señala el interés de usar otra diana tal como la proteína transactivadora de la transcripción de VIH-1 denominada Tat, debido a su función extracelular que implica el colapso de la respuesta inmunitaria celular contra células infectadas por VIH (Jeang et al., 1999).

Tat existe predominantemente en dos longitudes diferentes, 86-87 residuos o 99-101 residuos, que presentan actividades polifacéticas (Jeang et al., 1999). Las formas largas son predominantes en aislados clínicos de todos los subtipos de VIH-1 excepto el subtipo D, debido a la presencia de un polimorfismo de un solo nucleótido no sinónimo, que crea un codón de terminación en la secuencia que codifica para el segundo exón (Jeang et al., 1999). Tat se divide en seis regiones (Kuppuswamy et al., 1989) con una denominada región básica que está implicada en la mayoría de las actividades de Tat. Estudios de RMN de variantes de Tat biológicamente activas revelaron que la región básica y las demás regiones funcionales están muy expuestas al disolvente y rodean un núcleo compuesto por parte del extremo N-terminal con el Trp 11 bien conservado (Péloponèse et al., 2000; Gregoire et al., 2001, Watkins et al., 2008). Entre diferentes variantes de Tat este plegamiento es similar en disolución acuosa pero puede cambiar drásticamente cuando se expone a un disolvente hidrófobo (Péloponèse et al., 1999). Tat es una proteína flexible y son necesarios cambios estructurales para que se una a sus dianas farmacológicas (Loret et al., 1992).

Tat se encuentra principalmente en el núcleo de células infectadas donde funciona como activador transcripcional de actuación en trans (Wong-Staal et al, 1985; Fujisawa et al., 1985), donde se sabe que está implicado en la iniciación de la transcripción y el alargamiento de la cadena de ARN (Cullen, 1990) mediante un proceso complejo que implica interacciones con proteínas celulares y un ARN líder en tallo-bucle de protuberancia, TAR (región sensible a transactivación), en el ARNm viral y acetilación del Tat (Bres et al., 2002). Estudios han mostrado que también participa en la transcripción inversa del ARN de VIH-1 (Harrich et al., 1997).

A pesar de la falta de una secuencia señal, Tat es la única proteína de VIH-1 que va a secretarse por células infectadas por VIH-1 y se encuentra en niveles detectables en los sobrenadantes de cultivo de células infectadas por VIH-1 (0,1 -1 ng/ml) (Ensoli et al., 1990; Westendorp et al., 1995b; Chang et al, 1997) y en los sueros de pacientes infectados por VIH-1 (1-40 ng/ml) (Xiao et al., 2000; Westendorp et al., 1995b). Tat extracelular presenta actividades polifacéticas (Jeang et al., 1999), pero la más importante es desencadenar la apoptosis de células T no infectadas atravesando la membrana celular, conduciendo a apoptosis a través de la ruta mitocondrial (Chen et al., 2002, Campbell et al., 2004, de Mareuil et al., 2005). La neutralización de Tat extracelular in vivo en macacos expuestos a VIHS-1 induce un aumento de células T CD8+ y las células T CD4+ infectadas por VIH-1 se vuelven indetectables (Watkins et al., 2006).

Por tanto, el papel de Tat en la patogénesis de VIH-1 es no sólo como una proteína esencial para la replicación de VIH-1 en células infectadas, sino también como toxina extracelular (Gallo, 1999). Por tanto, es relevante desarrollar una vacuna que seleccione como diana Tat (Goldstein, 1996). Sin embargo, pacientes seropositivos que tienen anticuerpos contra Tat no pueden reconocer variantes de Tat de todos los subtipos de VIH-1 (Campbell et al., 2007b). Además, estos anticuerpos no pueden ralentizar la progresión de la enfermedad hasta SIDA (Senkaali et al., 2008).

Queda claro que una vacuna contra Tat usando Tat del subtipo B encontrado principalmente en Europa y América del Norte tal como se propuso previamente (Goldstein, 1996, Zagury et al., 1998, Cafaro et al., 1999) tiene una baja probabilidad de proporcionar un efecto terapéutico y preventivo contra la infección por VIH-1 en el resto del mundo y particularmente en África. Además, una vacuna contra Tat usando Tat del subtipo B tiene también una baja probabilidad de proporcionar un efecto terapéutico y preventivo incluso en Europa y América del Norte debido a la incapacidad del sistema inmunitario para neutralizar Tat extracelular.

Las dos estrategias de vacuna principales contra Tat hasta ahora usan una versión corta, de 86 residuos de una variante de Tat europea del subtipo B que o bien está inactivada (Zagury et al., 1998) o bien tiene actividad completa (Cafaro et al., 1999). Estos dos enfoques se sometieron a prueba en macacos seguido por una exposición a VIHS-1 homólogo (Cafaro et al., 1999; Pauza et al., 2000). Se observó una disminución significativa de la viremia en estos dos estudios llevados a cabo respectivamente en macacos cynomolgus (Cafaro et al., 1999) y rhesus (Pauza et al., 2000), sin mostrar protección completa durante la primo-infección. Otro estudio mostró un control a largo plazo de la infección tras la exposición a VIHS-1 en macacos cynomolgus vacunados contra Tat (Maggiorella et al., 2004). Estos estudios señalan que vacunas que usan Tat biológicamente activo parecen ser un enfoque seguro tal como se indica

por los estudios de seguridad llevados a cabo en monos en los que no se observaron efectos adversos o toxicidad sistémica o local (Cafaro et al., 1999, 2001; Caselli et al., 1999, Goldstein et al., 2000).

Es interesante indicar que aparecen resultados contradictorios en estudios de vacunas contra Tat en macacos puesto que no se observó protección con una exposición a VIS (Allen et al., 2002) o una vacunación con un virus recombinante que codifica para una proteína Tat-Rev (Verrier et al., 2002). Estos resultados contradictorios podrían explicarse por diferentes regímenes de inmunización, reservas virales, vías de exposición viral y especies animales. La diferencia entre Tat de VIS y Tat de VIH-1 en el primer estudio y la probabilidad de que una proteína recombinante Tat-Rev no tenga el plegamiento de Tat nativo o el plegamiento de Rev nativo para el segundo estudio pueden explicar la ausencia de protección. Sin embargo, más desconcertante es el resultado de otros dos estudios que usan vectores virales similares que expresan Tat, Env y Gag que proporcionan conclusiones opuestas. Un estudio muestra la eficacia de Tat vectorizado, pero no Gag y Env (Stittelaar et al., 2002), mientras que otro estudio mostró la eficacia de Gag y Env vectorizados, pero no Tat (Liang et al., 2005). La principal diferencia en los dos estudios es que uno está usando una exposición homóloga usando la secuencia de Tat Bru en tanto la vacuna como en el VIHS (Stittelaar et al., 2002) y el otro una exposición heteróloga con la secuencia de Tat Bru en la vacuna y Tat Jr en el VIHS (Liang et al., 2005). VIH-1 Jr y VIH-1 Bru son subtipos B (figura 1) pero sus secuencias de Tat tienen mutaciones no conservativas que inducen cambios conformacionales (Gregoire & Loret., 1996). Estas mutaciones entre la vacuna y el virus usados para la exposición podrían explicar la falta de eficacia de la vacuna vectorizada contra Tat en el segundo estudio (Liang et al., 2005). Queda claro que el segundo estudio se asemeja más estrechamente a la realidad puesto que una persona vacunada no es probable que se exponga a una infección por virus homóloga, pero en ese caso, ¿por qué se han usado Gag y Env homólogos (Liang et al., 2005)?

A lo largo de los últimos 20 años, se han sometido a prueba estudios de vacunas contra VIH-1 que seleccionan como diana las proteínas de la envuelta de VIH-1 usando un modelo de macaco/VIHS homólogo y han tenido éxito (Feinberg et al., 2002). Sin embargo, los ensayos clínicos no eran satisfactorios (Vanichseni et al., 2004). Esto se debe a la alta diversidad genética de VIH-1 y esto es por lo que debe usarse una exposición con VIHS heteróloga en macacos, con un virus genéticamente distinto, para determinar si una vacuna puede ser eficaz contra la infección por VIH-1 en seres humanos (Feinberg et al., 2002). Si una exposición con VIHS homóloga satisfactoria es útil para mostrar el interés de la vacunación contra Tat in vivo, el desarrollo de una vacuna contra Tat en seres humanos en todo el mundo tiene que tener en cuenta la diversidad genética de Tat. Es importante indicar que la inmunización con Tat Bru del subtipo B no estimula una respuesta eficaz contra variantes de Tat de los subtipos de VIH-1 A y C que corresponden al 75% de la contaminación en el mundo (Opi et al., 2002).

El interés de desarrollar una vacuna contra Tat aumentó con el descubrimiento de que pacientes seropositivos que no progresan a largo plazo (long-term non-Progressor, LTNP) tenían un nivel superior de anticuerpos frente a Tat que pacientes seropositivos que progresan rápidamente (Rapid Progressor, RP) (Re et al., 1995; van Baalen et al., 1997; Zagurry et al., 1998, Re et al., 2001; Addo et al., 2001, Belliard et al., 2003). Es interesante indicar que con una dilución de suero de 1:1000, Tat Bru se reconoce por sólo el 30% de los pacientes RP en Europa (Zagury et al., 1998) y sólo del 10 al 14% en África (Butto et al., 2003). Este porcentaje puede alcanzar hasta el 50% en África si se someten a prueba otras variantes de Tat de los subtipos A, C y D (Campbell et al., 2007). Este resultado esboza de nuevo cómo mutaciones en variantes de Tat pueden afectar a la inmunogenicidad pero también muestra que una gran cantidad de pacientes seropositivos no pueden reconocer Tat. Además, anticuerpos frente a Tat en pacientes RP africanos no tienen ningún efecto sobre la progresión a SIDA (Sankali et al., 2008). Muestra que, para la mayoría de los pacientes infectados por VIH-1, Tat no se reconoce aunque esta proteína está presente en su sangre y los pacientes que reconocen Tat no pueden neutralizar esta proteína. El motivo por el que Tat se reconoce tan mal por el sistema inmunitario humano podría deberse a la similitud de secuencia de la región básica de Tat con epítopos encontrados en proteínas humanas tales como la protamina. Queda claro que el desencadenamiento de una respuesta inmunitaria contra la región básica de Tat (región IV) podría conducir a una respuesta autoinmunitaria en seres humanos. La región IV está bien conservada entre variantes de Tat (figura 1) pero no se reconoce por sueros de pacientes infectados por VIH-1 (Campbell et al., 2007). Es interesante indicar que dos tercios de los niños recién nacidos de madres infectadas por VIH-1 consiguen escapar de la infección por VIH-1 (Beattie et al., 2001). Son seropositivos hasta los 18 meses de edad, entonces experimentan retro-seroconversión. Esta alta proporción de lactantes recién nacidos que resisten a la infección por VIH excluye factores genéticos que podrían deberse a una inmunidad innata contra VIH. Podría ser posible que existiese una represión del sistema inmunitario para reconocer Tat en adultos pero no entre lactantes recién nacidos puesto que la protamina aparece con la maduración sexual.

Debe prestarse más atención a la inmunidad natural que se produce en adultos contra VIH-1. Se observa inmunidad natural contra VIH-1 en una baja proporción de la población humana y cubre diferentes mecanismos que van desde mutaciones de quimiocinas hasta la capacidad para producir anticuerpos neutralizantes contra la envuelta de VIH-1 (véase Marmor et al., 2006 para una revisión). La inmunidad natural puede ser innata o adquirida, siendo esta última por supuesto la más interesante para el desarrollo de una vacuna. Los pacientes con inmunidad natural contra VIH-1 pueden ser pacientes expuestos y seronegativos de manera persistente (EPS) o pueden ser pacientes seropositivos y que no progresan a largo plazo (LTNP). En la mayoría de los casos, esta inmunidad natural resulta ser una inmunidad innata. Sin embargo, hay una categoría muy rara de pacientes altamente expuestos al virus que son resistentes a VIH-1 debido aparentemente a una inmunidad adquirida. Se han estudiado intensamente trabajadoras sexuales keniatas que son EPS y su resistencia a VIH-1 parece estar relacionada con su capacidad para desarrollar

una respuesta de células T CD8 eficaz contra VIH-1 (McMichael & Rowland-Jones, 2001). Sin embargo, la paradoja es que la respuesta de células T CD8 en trabajadoras sexuales keniatas EPS es cinco veces inferior en magnitud que la de trabajadoras sexuales keniatas seropositivas que desarrollan en última instancia SIDA (Alimonti et al., 2006). Para hacer que las cosas sean incluso más desconcertantes, estudios de cohortes similares de pacientes

5 EPS en Costa de Marfil, Vietnam y Camboya muestran que no tienen una respuesta de células T CD8 específica de VIH-1 sino una respuesta de células citotóxicas naturales (NK) (Scott-Algara et al., 2003; Jennes et al., 2006), anticuerpos contra proteínas de la envuelta de VIH-1 (Nguyen et al., 2006) o factores celulares que afectan a etapas de la entrada viral (Saez-Cirion et al., 2006). Aunque se cree que estas pacientes EPS keniatas tenían una inmunidad innata, resultó que era una inmunidad adquirida al menos para algunas de ellas que se volvieron seropositivas tras un periodo en el trabajo sexual (Kaul et al., 2001).

Más interesante fue el estudio de una cohorte EPS identificada en Gabón (Huet et al., 1989). Durante la década de 1980 en África, se observó en una zona remota de Gabón denominada “Haut Ogooué” que pacientes infectados por VIH-1 no estaban desarrollando SIDA (Delaporte et al., 1988). Se decidió hacer una investigación epidemiológica y

15 se llevó a cabo en 750 mujeres embarazadas durante dos años y 25 se identificaron como seropositivas (Huet et al., 1989). De estas 25 mujeres seropositivas, 23 experimentaron retro-seroconversión y se volvieron EPS durante los dos años de la investigación. Aunque los pacientes EPS no tienen normalmente virus detectable, fue posible aislar y clonar una cepa de VIH-1 de una paciente llamada Oyi cuando todavía era seropositiva (Huet et al., 1989). Al contrario que otra cohorte EPS de trabajadoras sexuales o consumidores de drogas que se constituyeron muchos años después de la primera exposición a VIH, la cohorte de Gabón se constituyó durante la primo-infección y explica por qué fue posible clonar un virus. Todas las mujeres infectadas con VIH-1 Oyi experimentaron retroseroconversión pero mantuvieron una respuesta de CTL contra VIH-1 y tenían anticuerpos contra P24 (Huet et al., 1989). La alta proporción de fenotipo EPS en esta cohorte (el 92%) indica que la retro-seroconversión se debía probablemente a una inmunidad adquirida y no a una inmunidad innata. Diez años después de la publicación de esta

25 investigación epidemiológica, las 23 mujeres tenían buena salud y ya no podía detectarse en su sangre el VIH-1 o un signo de infección. Además la infección por VIH-1 parece ser muy baja en Gabón en comparación con otros países de África central (Delaporte et al., 1996). VIH-1 Oyi tiene genes similares a cepas de VIH-1 regulares excepto por el gen tat, que tenía mutaciones nunca encontradas en otras variantes de Tat (Gregoire & Loret, 1996). La inmunización con Tat Oyi aumenta los anticuerpos en conejos que pueden reconocer diferentes variantes de Tat incluso con mutaciones de hasta el 38%, lo que no es posible con otras variantes de Tat (Opi et al., 2002). Tat Oyi parece inducir una respuesta inmunitaria humoral contra un epítopo tridimensional que está conservado en variantes de Tat y esta respuesta humoral podría hacer posible neutralizar Tat extracelular. El papel de Tat extracelular no se conocía durante la década de 1980 y la presencia de anticuerpos contra Tat no se sometió a prueba en esta cohorte de Gabón (Huet et al., 1989).

35 Se inmunizaron siete macacos rhesus con Tat Oyi sintético complementado con un adyuvante, entonces se llevó a cabo una exposición heteróloga con el VIHS BX08 europeo en macacos vacunados con Tat Oyi y macacos control. Los macacos vacunados con Tat Oyi tenían una viremia inferior asociada con un aumento de las células T CD8 en comparación con los macacos control. Además, ya no podían detectarse células infectadas con VIHS a las 8 semanas tras la exposición en macacos vacunados con Tat Oyi. Es interesante indicar que el macaco que tenía la viremia más baja no tenía anticuerpos contra proteínas de la envuelta de VIHS. Se expuso el macaco de nuevo, se volvió durante un corto periodo seropositivo y experimentó seroconversión (Watkins et al., 2006). Por tanto, fue posible reproducir experimentalmente en macacos lo que se observaba en el campo con pacientes EPS. Es importante indicar que este “macaco EPS” tenía una viremia detectable (Watkins et al., 2006). Este es un resultado

45 muy prometedor porque era una exposición con VIHS heteróloga y muestra que es posible reducir drásticamente el nivel de células infectadas por VIH. Este objetivo nunca se había logrado en pacientes seropositivos en tratamiento con TARGA.

Sumario de la invención:

Se proporciona en el presente documento una composición para su uso en la prevención o el tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en un paciente, en el que al paciente se le administra una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos

(SEQ ID NO: 1), que puede estimular una respuesta inmunitaria contra proteínas Tat, o un polinucleótido que codifica para dicha proteína.

Preferiblemente, la proteína puede estimular una respuesta inmunitaria contra 2, 3, 4 o más subtipos de VIH-1. En una realización preferida, la proteína o variante puede estimular una respuesta inmunitaria contra proteínas Tat de dos, tres, cuatro, cinco o más subtipos de VIH-1 seleccionados de A, B, C, D, E, F, G, H, J y K. Lo más preferiblemente, la proteína puede estimular una respuesta inmunitaria contra cinco subtipos de VIH-1,

preferiblemente A, B, C, D y E. Preferiblemente, la proteína comprende, o consiste en la secuencia de aminoácidos

SEQ ID NO: 2 difiere de la proteína Tat Oyi de VIH descrita en el documento WO00/61067 en una cisteína en la posición 22, que restaura la capacidad de transactivación. La proteína usada en el presente documento presenta la actividad funcional de Tat, es decir, puede producir la transactivación del gen de VIH-1 en un ensayo de células

10 HeLa P4 (figura 4). La sustitución de serina por cisteína en la posición 22 fortalecía la inmunogenicidad de la secuencia de Tat Oyi original, tal como se muestra con sueros de una cohorte de 100 pacientes seropositivos que reconocen mejor Tat Oyi C22 que Tat Oyi S22. La actividad de transactivación de Tat Oyi Cys 22 confirma que la estructura tridimensional es correcta y permite caracterizar la proteína para un ensayo clínico.

15 Un objeto adicional de la invención es una vacuna que comprende como principio activo una proteína Tat Oyi de transactivación competente que comprende una cisteína en la posición 22, seleccionada preferiblemente de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

En una realización preferida, la vacuna comprende un adyuvante.

20 También se describe un método de inmunización de animales de sangre caliente que comprende inyectar una cantidad eficaz de una proteína que comprende al menos una de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y un adyuvante.

Este método puede comprender además la etapa de determinar si la proteína desencadena una respuesta

25 inmunitaria contra cinco o más subtipos de VIH-1, en el que la proteína estimula una respuesta inmunitaria contra proteínas Tat de al menos cinco subtipos de VIH-1.

Leyendas de las figuras:

30 La figura 1 es un gráfico que muestra la detección de IgG anti-Tat en tres cohortes, una era pacientes EPS vietnamitas (n=25), la segunda era pacientes seropositivos franceses (n=100) y la tercera era pacientes no expuestos seronegativos franceses (n=20). Se observaron tres tipos de patrón serológico con muestras de sangre de pacientes en las curvas de titulación mediante ELISA con variantes de Tat representativas de los cinco subtipos principales de VIH-1. La figura 1A muestra el reconocimiento de seis variantes de Tat obtenido con un suero de un

35 paciente EPS vietnamita. El nivel de anticuerpos frente a Tat no es el mismo con respecto a las seis variantes de Tat y Tat CM240 era la mejor reconocida para los pacientes vietnamitas. La figura 1B muestra otro paciente que reconoce sólo una o dos variantes de Tat y se observa principalmente en la cohorte seropositiva francesa (n=100). La figura 1C es la ausencia de reconocimiento de cualquier variante de Tat (DO inferior a 0,1), y es típica de la cohorte seronegativa francesa (n=20), pero también la mitad de la cohorte seropositiva francesa y un tercio de la

40 cohorte EPS vietnamita.

La figura 2 muestra una espectroscopía de masas de una alícuota de una subfracción purificada que tiene un único pico a 25 min en HPLC analítica. El peso molecular (PM) observado corresponde casi exactamente al PM esperado de 11578 para Tat Oyi Cys 22. La purificación fue satisfactoria sin trazas de péptidos con un peso molecular inferior

45 o superior a 11578. El pico a 5784,5 corresponde al pico de sombra (masa dividida entre dos) del pico a 11575.

La figura 3 es un gráfico que muestra un ensayo de transactivación con células HeLa transfectadas con LTR de VIH. Se sometió a prueba la actividad biológica de la Tat Oyi Cys 22 sintética con un ensayo de cultivo celular usando células HeLa P4 con un gen lac-Z bacteriano bajo el control de la LTR de VIH. La proteína Tat activa puede cruzar 50 las membranas citoplasmática y celular y “transactivar” el gen lac Z tal como se revela mediante la acumulación citoplasmática de β-galactosidasa. Se incubaron 2 x 105 células/pocillo en una placa de 24 pocillos a 37ºC, el 5% de CO2, en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con suero de ternero fetal al 10%. Tras 24 h, se lavaron las células con PBS y proteína Tat diluida en DMEM complementado con protamina al 0,01% (Sigma), y se añadió albúmina sérica bovina al 0,1% (Sigma). Se sometió a prueba una concentración de las dos

55 proteínas Tat (500 nM) con el fin de verificar que el nivel de β-galactosidasa es dependiente de la dosis con respecto a Tat extracelular. Tras 16 h a 37ºC, el 5% de CO2, se lavaron las células con PBS y se lisaron. Se extrajeron las proteínas y se midió el contenido en β-galactosidasa con un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas de captura de antígeno comercial (ELISA de β-galactosidasa, Roche Molecular Biochemicals). Se midieron los valores de absorbancia a 405 nm.

La figura 4 muestra espectros de dicroísmo circular (DC) de Tat Oyi Ser 22 y Tat Oyi Cys 22. Se registraron los

espectros de DC a 20ºC en presencia de tampón fosfato 20 mM, pH 4,5, a lo largo de un intervalo de 260-178 nm usando una longitud de trayectoria de 100 µm en un espectropolarímetro J-810 de JASCO Corp. (Japón). Se recogieron los datos a intervalos de 0,5 nm usando un procedimiento de autorrespuesta escalonado (JASCO). Se presentan los espectros de DC como Δε por amida. La concentración de proteína era de 1 mg/ml para Tat Oyi Ser22 y 0,3 mg/ml para Tat Oyi Cys22. Los dos espectros de DC son idénticos y muestran que la mutación cys22ser no induce un cambio que sea detectable mediante DC.

La figura 5 muestra el modelado molecular de Tat Oyi Cys22. Se llevó a cabo el modelado molecular con el paquete Insight II 2002 que incluye Biopolymer, Discover y Homology (Accelrys, San Diego, CA). Se construyeron dos modelos correspondientes a Tat Oyi Ser 22 (datos no mostrados) y Tat Oyi Cys 22. Se obtuvieron los modelos a partir de la estructura de RMN de Tat Eli (Watkins et al., 2008) usando el algoritmo de gradiente conjugado y campo de fuerza CV para la minimización de la energía. Los dos modelos eran idénticos y la mutación cys22ser no induce un cambio que pueda deducirse a partir del modelado molecular. Es interesante observar que el extremo C-terminal que contiene la mutación Glu 100 está muy próximo a las regiones 3 y 4 que tienen las secuencias más conservadas en variantes de Tat.

Descripción detallada de la invención:

El inventor observó que pacientes que resisten a la infección por VIH (pacientes EPS vietnamitas) pueden reconocer las variantes de Tat representativas de los cinco subtipos principales de VIH-1 (figura 1A). Estos resultados muestran que anticuerpos frente a Tat que tienen la capacidad de reconocimiento cruzado con respecto a diferentes variantes de Tat podrían restaurar una respuesta inmunitaria celular eficaz contra VIH.

Basándose en esto, se proporciona un método de prevención o tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en un paciente, en el que al paciente se le administra una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: o 2, que puede estimular una respuesta inmunitaria contra proteínas Tat. Preferiblemente la proteína puede estimular una respuesta inmunitaria contra dos, tres, cuatro o más subtipos de VIH-1. Lo más preferiblemente la proteína puede estimular una respuesta inmunitaria contra variantes de Tat de al menos cinco subtipos de VIH-1.

En una realización preferida, al paciente se le administra una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, lo más preferiblemente una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2. En otra realización, al paciente se le administra una proteína que comprende una forma truncada de secuencia SEQ ID NO: 1 ó 2. Por ejemplo, la proteína puede estar truncada en de 1 a 10 aminoácidos, preferiblemente de 1 a 8, preferiblemente de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, preferiblemente 1 ó 2 aminoácidos en el extremo N-terminal. Al paciente también puede administrársele una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: o 2 truncada en de 1 a 14 aminoácidos, preferiblemente de 1 a 12, preferiblemente de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 8, preferiblemente de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, preferiblemente 1 ó 2 aminoácidos en el extremo C-terminal.

La variante de proteína que va a administrarse también puede comprender modificaciones químicas, por ejemplo modificación de enlaces peptídicos para dar un enlace pseudopeptídico.

El término “pseudopéptido” se refiere a compuestos que son similares al péptido de referencia pero en los que se sustituyen uno o más enlaces peptídicos --CO--NH--por un enlace que es equivalente al enlace peptídico, denominado pseudopéptido, tal como --CH 2--NH--, --CH 2--S--, --CH 2--O--, --CO--CH 2--CO--, --CH 2--CH 2-por ejemplo. El término “variante” abarca además la sustitución de uno o varios aminoácidos por un residuo químico que no es un aminoácido natural. También se incluyen sustituciones por L-aminoácidos. En otro aspecto de la invención, la proteína se une covalentemente a una molécula de polietilenglicol (PEG) por su extremo C-terminal o un residuo de lisina, notablemente un PEG de 1500 o 4000 PM, para lograr una disminución en el aclaramiento urinario y en las dosis terapéuticas y para lograr un aumento de la semivida en plasma sanguíneo. Aún en otra realización, la semivida de la proteína se aumenta incluyendo la proteína en un material de polímero biodegradable y biocompatible para obtener un sistema de administración de fármacos que forma microesferas. Polímeros y copolímeros son, por ejemplo, poli(D,L-lactida-co-glicolida) (PLGA) (tal como se ilustra en el documento US2007/0184015, SoonKap Hahn et al). Todavía en una realización adicional, la proteína se une a, o se asocia con, un portador. Se conocen portadores en la técnica (Plotkin, 1999). Los portadores bacterianos (es decir, portadores derivados de bacterias) incluyen, pero no se limitan a, subunidad B de la toxina del cólera (CTB); mutante de toxina diftérica (CRM 197); toxoide diftérico; proteína alfa C de estreptococos del grupo B; proteína de la membrana externa meningocócica (OMPC); toxoide del tétanos; proteína de la membrana externa de Haemophilus influenza no tipificable (tal como P6); porina de clase 3 recombinante (rPorB) de meningococos del grupo B; Brucella abortus inactivada por calor; Listeria monocytogenes inactivada por calor; y exoproteína A recombinante de Pseudomonas aeruginosa. Otro portador es hemocianina de lapa californiana (KLH). Se conocen en la técnica ejemplos de portadores derivados de virus e incluyen partículas de antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y antígeno de núcleo de la hepatitis B (HBcAg).

En una realización preferida, la variante de proteína, que puede estimular una respuesta inmunitaria contra proteínas Tat, preferiblemente de al menos cinco subtipos de VIH-1, puede producir transactivación. Ventajosamente la

variante de proteína puede estimular una respuesta inmunitaria contra proteínas Tat de los subtipos de VIH-1 A, B, C, D y E (las cepas de VIH del subtipo E se observan principalmente en el sureste de Asia pero se consideran a menudo como formas recombinantes de cepas del subtipo A). La proteína o variante puede ser una proteína recombinante, o preferiblemente una proteína sintetizada químicamente, que puede sintetizarse en una síntesis en fase sólida y preferiblemente una estrategia de FMOC rápida. Cuando la proteína se produce mediante síntesis química, el polipéptido según la invención puede sintetizarse en forma de una única secuencia, o en forma de varias secuencias que entonces se unen entre sí. La síntesis química puede llevarse a cabo en fase sólida o en disolución, siendo estas dos técnicas de síntesis bien conocidas por los expertos en la técnica. Estas técnicas se describen en particular por Atherton y Shepard en “Solid phase peptide synthesis (IRL press Oxford, 1989) y por Houbenweyl en “Methoden der organischen Chemie” [Methods in Organic Chemistry] publicado por E. Wunsch vol. 15-1 y II, Stuttgart, 1974, y también en los siguientes artículos, que se incorporan totalmente en el presente documento a modo de referencia: P E Dawson et al. (Science 1994; 266(5186):776-9); G G Kochendoerfer et al. (1999; 3(6):66571); et P E Dawson et al., Annu. Rev. Biochem. 2000; 69:923-60. La proteína también puede producirse usando técnicas de ingeniería genética bien conocidas por los expertos en la técnica. Cuando la proteína se produce mediante ingeniería genética, comprende, en el extremo NH2-terminal, un residuo de metionina adicional correspondiente a la traducción del primer codón de iniciación. Estas técnicas se describen en detalle en Molecular Cloning: a molecular manual, por Maniatis et al., Cold Spring Harbor, 1989. La proteína puede obtenerse por tanto en forma purificada, es decir, en una forma que presente un grado de pureza de al menos el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o mayor. El grado de pureza se define en relación con las otras proteínas presentes en la mezcla que se considera que son contaminantes. Este grado se evalúa mediante colorimetría de un SDS-PAGE usando azul de Coomassie. La medición densitométrica de las bandas hace posible cuantificar el grado de pureza. El grado de pureza también puede medirse mediante HPLC de fase inversa, midiendo el área de los diversos picos.

Pueden usarse varios tipos de composiciones terapéuticas para provocar una respuesta inmunitaria contra proteínas Tat de al menos cinco subtipos de VIH-1.

Un objeto de la invención es una composición farmacéutica que comprende una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 que puede estimular una respuesta inmunitaria contra proteínas Tat, preferiblemente de al menos cinco subtipos de VIH-1, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

Pueden prepararse composiciones inmunogénicas, que se propone que son adecuadas para su uso como una vacuna, de la manera más fácil directamente a partir de proteínas y/o péptidos Tat Oyi Cys 22 inmunogénicos (por ejemplo, SEQ ID NO: 1, 2 o fragmentos de SEQ ID NO: o 2) preparados de una manera dada a conocer en el presente documento. Preferiblemente, el material antigénico se dializa de manera extensa para eliminar moléculas de peso molecular pequeño no deseadas y/o liofilizarse para obtener una formulación más lista en un vehículo deseado.

La preparación de vacunas que contienen secuencias peptídicas como principios activos se entiende generalmente bien en la técnica, tal como se muestra a modo de ejemplo mediante las patentes estadounidenses 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792; y 4.578.770. Normalmente, tales vacunas se preparan como productos inyectables: también pueden prepararse como o bien disoluciones o bien suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para disolución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse. El principio inmunogénico activo se mezcla a menudo con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento del pH o adyuvantes que potencian la eficacia de las vacunas.

Las vacunas pueden administrarse convencionalmente por vía parenteral, mediante inyección, por ejemplo, o bien por vía subcutánea o bien por vía intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Para supositorios, los aglutinantes y portadores tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialcalenglicoles o triglicéridos: tales supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el principio activo en el intervalo del 0,5% al 10%, preferiblemente el 1-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes empleados normalmente tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman las formas de disoluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos o formulaciones de liberación sostenida y contienen el 10-95% de principio activo, preferiblemente el 25-70%.

Las proteínas pueden formularse para dar la vacuna como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del péptido) y las que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. También pueden derivarse sales formadas con los grupos carboxilo libres de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, y similares.

Las vacunas se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en cantidad tal que serán terapéuticamente eficaces e inmunogénicas. La cantidad que va a administrarse depende del sujeto que va a tratarse, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, y el grado de protección deseado. Las cantidades precisas de principio activo requerido que van a administrarse dependen del juicio del profesional sanitario. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados son del orden de varios cientos de microgramos de principio activo por vacunación. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de refuerzo también son variables, pero se tipifican mediante una administración inicial seguida por inoculaciones posteriores u otras administraciones.

La manera de aplicación puede variarse ampliamente. Son aplicables cualquiera de los métodos convencionales para la administración de una vacuna. Se cree que estos incluyen aplicación oral en una base fisiológicamente aceptable sólida o en una dispersión fisiológicamente aceptable, por vía parenteral, mediante inyección o similar. La dosificación de la vacuna dependerá de la vía de de administración y variará según el tamaño del huésped.

En una realización preferida, la composición de la invención comprende además un adyuvante. El adyuvante puede seleccionarse de cualquier sustancia, mezcla, soluto o composición que facilite o aumente la inmunogenicidad de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, en el que el adyuvante puede potenciar una respuesta inmunitaria. Los ejemplos de adyuvantes incluyen preferentemente fosfato de calcio pero también fosfato de ALUM, hidróxido de ALUM, Montanide CpG, QS21, ISCOM o monofosforil lípido A.

Otros métodos para lograr un efecto adyuvante para la vacuna incluyen el uso de agentes tales como fosfato o hidróxido de aluminio (alum), usados comúnmente como una disolución a del 0,05 al 0,1 por ciento en solución salina tamponada con fosfato, mezcla con polímeros sintéticos de azúcares (Carbopol) usados como disolución al 0,25 por ciento, agregación de la proteína en la vacuna mediante tratamiento térmico con temperaturas que oscilan entre 70º y 101ºC durante periodos de 30 segundos a 2 minutos respectivamente. También puede emplearse agregación mediante reacción con anticuerpos frente a albúmina tratados con pepsina (Fab), mezcla con células bacterianas tales como C. parvum o endotoxinas o componentes de lipopolisacárido de bacterias Gram negativas, emulsión en vehículos oleosos fisiológicamente aceptables tales como monooleato de manida (Aracel A) o emulsión con disolución al 20 por ciento de un perfluorocarbono (Fluosol-DA) usado como sustituto de bloque.

En muchos casos, será deseable tener múltiples administraciones de la vacuna, sin exceder habitualmente seis vacunaciones, más habitualmente sin exceder cuatro vacunaciones y preferiblemente una o más, habitualmente al menos aproximadamente tres vacunaciones. Las vacunaciones serán normalmente a intervalos de dos a doce semanas, más habitualmente intervalos de desde tres hasta cinco semanas. Serán deseables refuerzos periódicos a intervalos de 1-5 años, habitualmente tres años, para mantener niveles protectores de los anticuerpos. El curso de la inmunización puede seguirse mediante ensayos para anticuerpos para los antígenos.

La composición de proteína según la presente invención puede prepararse usando cualquier método convencional conocido por los expertos en la técnica. Convencionalmente, la proteína se mezcla con un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como agua o disolución salina tamponada con fosfato. El excipiente o diluyente se seleccionará en función de la forma farmacéutica elegida, del método y la vía de administración, y también de la práctica farmacéutica. Se describen en detalle excipientes o diluyentes adecuados, y también los requisitos en cuanto a la formulación farmacéutica, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, que representa un trabajo de referencia en este campo.

Otra composición farmacéutica comprende un polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Tal composición farmacéutica se administra a un huésped, por ejemplo inyectada (conocida como vacunación de ADN) y dicho ácido nucleico expresa in vivo el polipéptido Tat. Tales vacunas de ADN consisten habitualmente en vectores de plásmido. Se ha mostrado que la administración de ADN desnudo es escasamente eficaz, y se necesitan habitualmente algunos portadores para mejorar la administración y captación de ADN en el interior de las células. Se han desarrollado ya dos tipos de portadores: (1) portadores virales (adenovirus, lentivirus, virus del sarampión), o (2) portadores no virales tales como polímeros (y especialmente polímeros catiónicos), ADN encapsulado (liposomas, que comprenden lípidos catiónicos que interaccionan espontánea y rápidamente con polianiones, tales como ADN y ARN, dando como resultado complejos de liposoma/ácido nucleico)

o ADN unido a micropartículas de oro. Además, pueden usarse ventajosamente agentes que ayudan en la captación celular de ácido nucleico, tales como iones calcio, proteínas bacterianas, proteínas virales y otros agentes que facilitan la transfección.

Las composiciones mencionadas anteriormente pueden administrarse mediante cualquier vía convencional usada habitualmente en el campo de las vacunas, tales como la vía parenteral (intravenosa, intramuscular, subcutánea, etc.). En el contexto de la presente invención, se usará preferiblemente administración intramuscular para las composiciones inyectables. Una administración de este tipo puede tener lugar ventajosamente en los músculos del muslo o el brazo. Las composiciones según la presente invención también pueden administrarse ventajosamente por vía oral. La administración mediante la mucosa nasal, vaginal o rectal también puede recomendarse en el contexto de la presente invención. La administración también puede llevarse a cabo proporcionando una única dosis o dosis

repetidas, por ejemplo en D0 y a 1 mes, 3 meses, 6 meses y 12 meses. Se usarán preferiblemente inyecciones a J0 y a 1 mes y 3 meses, con un refuerzo, cuya periodicidad puede determinarse fácilmente por el médico encargado. Generalmente, cada dosis comprenderá entre aproximadamente 5 µg y aproximadamente 500 µg de la proteína, preferiblemente entre 10 y 200 µg. Una dosificación más preferida puede ser de aproximadamente 50 µg de la proteína como inmunógeno. Otros intervalos de dosificación pueden contemplarse también por un experto en la técnica. Las dosis iniciales pueden ir seguidas opcionalmente por refuerzos repetidos, cuando sea deseable.

La presente invención también pretende cubrir las composiciones farmacéuticas para su uso como producto medicinal, en particular para su uso como vacuna profiláctica o terapéutica contra la infección por VIH.

Según un aspecto preferido, un objeto de la presente invención es el uso de una proteína tal como se describe en el presente documento, o un polinucleótido que codifica para dicha proteína, para inmunizar el cuerpo humano. La presente invención se refiere por tanto preferiblemente a un método para administrar dicho polipéptido o polinucleótido para inducir una respuesta humoral específica.

Se proporciona por tanto un método para inducir anticuerpos neutralizantes de VIH que comprende la administración de una cantidad de una composición farmacéutica tal como se definió anteriormente que es suficiente para inducir dicha respuesta humoral.

La expresión “una respuesta humoral específica” pretende significar una respuesta que comprende la producción de anticuerpos dirigidos específicamente contra una superficie bien conservada entre variantes de Tat. La producción de anticuerpos específicos puede determinarse fácilmente usando técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica, tales como ELISA, RIA o inmunotransferencia de tipo Western.

La proteína Tat usada en el presente documento es un candidato valioso para desarrollar una vacuna que puede usarse para la protección y/o el tratamiento de un gran número, o incluso todos, los individuos que corren el riesgo de o infectados con VIH. Se reconoce un efecto terapéutico si pacientes seropositivos que no tienen tratamiento antiviral tienen una viremia inferior, una elevación de células de linfocitos CD4 y/o un contenido inferior en células de linfocitos CD8. Más particularmente, se reconoce un efecto terapéutico cuando el 30% de una cohorte de al menos 55 pacientes seropositivos para VIH mantienen su viremia por debajo de 50 copias/ml tras la interrupción de su tratamiento TARGA durante seis meses. En pacientes con SIDA declarado, tal vacuna anti-Tat podría limitar la incidencia de determinados estados patológicos tales como sarcoma de Kaposi o síndromes neurológicos que parecen estar vinculados por una acción directa de la proteína Tat tras su secreción por células infectadas por VIH.

En pacientes asintomáticos, se espera que la composición farmacéutica de la invención retrase la progresión hacia SIDA debido a una viremia inferior, una elevación de células de linfocitos CD4 y/o un contenido inferior en células de linfocitos CD8. Una vacuna de este tipo permitiría al paciente restaurar una respuesta inmunitaria celular eficaz contra células infectadas por VIH, tal como parece que no es el caso al comienzo de la infección. En particular, la restauración de la actividad de linfocitos T citotóxicos (CTL), células NK y macrófagos, pero cuya actividad se inhibe por Tat. La vacunación tendría la consecuencia de permitir a los pacientes que se convirtiesen al menos en pacientes que no progresan. Se proporciona en el presente documento una vacunación para eliminar células infectadas por VIH y proporcionar un tratamiento curativo contra el SIDA.

Las figuras y los ejemplos ilustran la invención sin limitar su alcance.

Ejemplos:

Materiales y métodos

Síntesis de proteínas. Se ensamblaron las proteínas Tat según el método de Barany y Merrifield (1980) sobre resina precargada con HMP (0,5-0,65 mmol) (Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Forster City, CA) en un sintetizador automatizado (ABI 433A, Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc.)

Ensayo de transactivación con células HeLa transfectadas con LTR de VIH. Se sometió a prueba la actividad biológica de la Tat Oyi Cer22 sintética con un ensayo de cultivo celular usando células HeLa P4 con un gen lac-Z bacteriano bajo el control de la LTR de VIH. La proteína Tat activa puede cruzar las membranas citoplasmática y celular y “transactivar” el gen lac Z tal como se revela por la acumulación citoplasmática de β-galactosidasa. Se incubaron 2 x 105 células/pocillo en una placa de 24 pocillos a 37ºC, el 5% de CO2, en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con suero de ternero fetal al 10%. Tras 24 h, se lavaron las células con PBS y proteína Tat diluida en DMEM complementado con protamina al 0,01% (Sigma), y se añadió albúmina sérica bovina al 0,1% (Sigma). Se sometió a prueba una concentración de las dos proteínas Tat (500 nM) con el fin de verificar que el nivel de β-galactosidasa es dependiente de la dosis con respecto a Tat extracelular. Tras 16 h a 37ºC, el 5% de CO2, se lavaron las células con PBS y se lisaron. Se extrajeron las proteínas y se midió el contenido en β-galactosidasa con un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas de captura de antígeno comercial (ELISA de β-galactosidasa, Roche Molecular Biochemicals). Se midieron los valores de absorbancia a 405 nm.

Dicroísmo circular (DC). Se registraron espectros de DC a 20ºC en presencia de tampón fosfato 20 mM, pH 4,5, a lo largo de un intervalo de 260-178 nm usando una longitud de trayectoria de 100 µm en un espectropolarímetro J-810 de JASCO Corp. (Japón). Se recogieron los datos a intervalos de 0,5 nm usando un procedimiento de autorrespuesta escalonado (JASCO). Se presentan los espectros de DC como Δε por amida.

Modelado molecular: Se llevó a cabo modelado molecular con el paquete Insight 11 2002 que incluye Biopolymer, Discover y Homology (Accelrys, San Diego, CA). Se obtuvieron los modelos a partir de la estructura de RMN de Tat Eli (Watkins et al., 2008) usando el algoritmo de gradiente conjugado y campo de fuerza CV para la minimización de la energía.

Sueros humanos. Los pacientes expuestos seronegativos de manera persistente (EPS) (n=25) eran consumidores de drogas intravenosas (CDI) vietnamitas que habían estado altamente expuestos al riesgo de infección por VIH-1 al compartir agujas y que se seguían desde 1996 (Truong et al, 2003) y dieron su consentimiento para los estudios científicos (Tran et al, 2006). Se obtuvieron muestras de sangre humana francesa de un grupo de 20 pacientes caucásicos seronegativos para VIH-1 y 100 seropositivos para VIH-1. Se recogieron en centros hospitalarios en Marsella. La mayoría de los pacientes seropositivos para VIH-1 siguen una terapia antirretroviral (TARGA). A los participantes incluidos en la cohorte seronegativa francesa se les informó del propósito del estudio (según la declaración de Helsinki de 1975 y revisada en 1983). Se recogieron todas las muestras de sangre y se congelaron en el país de origen de cada población.

Ensayo de ELISA. Se detectaron anticuerpos contra tat en seres humanos o ratones mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) convencional usando inmunoplacas Maxisorp U96 (Nunc). Se recubrieron las placas durante 16 h a 4ºC con 0,5 µg/pocillo para cada una de las variantes de Tat diluidas en tampón fosfato 100 mM pH 4,5. En la actualidad, hay cinco subtipos principales de VIH-1 en el mundo: los subtipos A y C son predominantes (72%) y se encuentran principalmente en África, India y América del Sur; el subtipo B (10%) se encuentra principalmente en Europa y América del Norte; el subtipo D se encuentra principalmente en África y el subtipo E (descrito ahora como la forma recombinante CRF_01AE) se encuentra principalmente en el sureste de Asia (Hemelaar et al., 2006). La variabilidad de Tat sigue esta diversidad geográfica con mutaciones de hasta el 40% observadas entre variantes de Tat de los subtipos de VIH-1 A, B, C, D y E, que no modifican la actividad de Tat pero que afectan a las propiedades inmunitarias de Tat (Opi et al., 2002, 2004). Esto es por lo que se usaron Tat Ug 11 RP, Tat HXB2, Tat 92Br, Tat Eli y Tat CM240 para representar los subtipos de VIH-1 A, B, C, D y E. Estas cinco proteínas sintéticas tienen la actividad biológica de Tat y un tamaño que va de desde 99 hasta 101 residuos que es ahora la forma dominante de Tat en el campo (Jeang et al., 1999). Se comparó el reconocimiento de Tat Oyi Cys 22 y Tat Oyi Ser 22 en una misma placa con estas cinco variantes de Tat. Entonces se incubaron las placas durante 1 h a TA con 200 µl de PBS complementado con leche al 2%. Se añadieron sueros (un suero para una placa) en diferentes diluciones de PBS complementado con leche al 0,2% y agitaron suavemente durante 1 h a TA. Se añadió anticuerpo secundario (IgG anti-ser humano o anti-ratones con peroxidasa de Sigma) diluido 1:1000 en PBS complementado con leche al 0,2% a cada pocillo y se agitaron y suavemente durante 1 h a TA. Se lavaron las placas 3X con 200 µl de 1 X PBS/Tween 20 al 0,05% (Genaxis) entre cada etapa posterior. Se llevó a cabo el revelado con 100 µl de ABTS (ácido 2,2’-azino-bis-3-etilbenzo-tiazolin-6-sulfónico de Sigma) añadido a cada pocillo y se leyó la absorbancia en un lector de microplacas universal EL800 (BIO-TEK INSTRUMENT, INC) a 405 nm.

Ejemplo 1: Sueros de pacientes EPS vietnamitas pueden reconocer variantes de Tat de los cinco subtipos principales de VIH-1 incluyendo Tat Oyi.

IgG anti-Tat detectada en pacientes EPS: Pudieron detectarse anticuerpos frente a Tat en una cohorte de pacientes EPS en Vietnam. Se llevó a cabo una prueba de ELISA con variantes de Tat representativas de los cinco subtipos principales de VIH-1 incluyendo Tat Oyi sobre tres cohortes, una era pacientes EPS vietnamitas (n=25), la segunda era pacientes seropositivos franceses (n=100) y la tercera era pacientes no expuestos seronegativos franceses (n=20). Se observaron tres tipos de patrón serológico en la prueba de Elisa (figura 1). El primero se caracteriza por el reconocimiento específico (DO superior a 0,1) de todas las variantes de Tat y se observa sólo en la cohorte EPS (n=25). La figura 1A muestra el reconocimiento de seis variantes de Tat obtenido con un plasma de un paciente EPS vietnamita. El nivel de anticuerpos frente a Tat no es el mismo con respecto a las seis variantes de Tat y Tat de VIH1 CM240 (Carr et al., 1996) es la mejor reconocida para este paciente. El segundo patrón serológico se caracteriza por la ausencia de reconocimiento específico para al menos una variante de Tat y se observa principalmente en la cohorte seropositiva (n=100). La figura 1B muestra el reconocimiento de sólo una variante de Tat obtenido con un suero de un paciente seropositivo francés. Los pacientes seropositivos pueden reconocer más de una variante de Tat pero no pueden reconocer todas las variantes de Tat (Campbell et al., 2007). El tercer patrón serológico es el no reconocimiento de ninguna variante de Tat, que se caracteriza por una DO inferior a 0,1. La figura 1C muestra el no reconocimiento de variantes de Tat obtenido con un suero de un paciente seronegativo francés. Este patrón serológico se observa en todos los voluntarios de las cohortes seronegativas francesas de pacientes no expuestos, pero también en la mitad de los pacientes seropositivos franceses, y en un tercio de la cohorte EPS vietnamita (datos no mostrados). Es interesante observar que Tat CM240 es la mejor reconocida en la cohorte vietnamita seguida por Tat Oyi tal como se muestra en la figura 1A. Tat CM240 es representativa del subtipo E de VIH-1 que es

endémico en Vietnam (Lan et al., 2003). El buen reconocimiento de Tat Oyi en estos pacientes vietnamitas muestra la característica inmunitaria específica de Tat Oyi.

Falta de reconocimiento cruzado de las seis variantes de Tat observado en pacientes seronegativos:

La principal diferencia con pacientes EPS se muestra en la figura 1B. Sólo la mitad de los pacientes tenían anticuerpos frente a Tat y sus sueros generalmente podían reconocer una o dos variantes de Tat (figura 1B). Este resultado es muy similar a lo que se observó con una cohorte de Uganda de pacientes seropositivos (Campbell et al., 2007). Sin embargo, el diseño de este estudio era diferente puesto que se realizaron cinco tomas de muestras de sangre durante un año en la cohorte seropositiva francesa. Era muy interesante observar que los anticuerpos contra Tat podían desaparecer en algunos pacientes y cuando tienen de nuevo anticuerpos contra Tat, es la misma variante de Tat la que se reconoce (datos no publicados). La mayoría de los pacientes seropositivos franceses (el 75%) estaban infectados por una cepa de VIH-1 del subtipo B y el 75% reconocen eficazmente Tat HXB2, Tat Oyi Ser 22 o Tat Oyi Cys 22. Sin embargo, es interesante observar que Tat Oyi se reconoce mejor que Tat HXB2, aunque la secuencia de Tat HXB2 tiene la homología más cercana con variantes de Tat del subtipo B europeas. Como para la cohorte vietnamita EPS, estos resultados confirman la característica inmunitaria específica de Tat Oyi. Se esperaba que la mutación Ser/cys 22 no alterase el reconocimiento inmunitario de Tat Oyi. Esto se confirmó mediante la cohorte seronegativa francesa puesto que la mutación Cys 22 no alteró el reconocimiento de Tat Oyi. Es interesante observar que el reconocimiento de Tat Oyi Cys 22 es incluso mejor en comparación con Tat Oyi S22 debido probablemente a la homología de la región rica en cisteínas con variantes de Tat de tipo natural. Las curvas de titulación son a menudo idénticas para Tat Ug 11RP y Tat CM240 en las cohortes seropositivas francesas (datos no mostrados). Esto sugiere que se reconoce un epítopo similar en estas dos variantes y aumentan artificialmente el número de pacientes que reconocen estas dos variantes. Las curvas de titulación son diferentes para Tat Ug 11RP y Tat CM240 en pacientes EPS vietnamitas tal como se ilustra en la figura 1A en la que la curva superior se debe a Tat CM240. Esto indica que existe otro epítopo común con Tat CM240 y variantes de Tat del subtipo E en Vietnam. Las curvas de titulación también son a menudo idénticas entre Tat Oyi y Tat HXB2 para pacientes tanto vietnamitas como franceses (datos no mostrados). Se muestra que no hay un epítopo común entre variantes de Tat puesto que la prueba de Elisa permite casi identificar el subtipo de VIH-1 que infectó a los pacientes (figura 1). En consecuencia, es muy improbable la posibilidad de que la detección de anticuerpos de IgG frente a Tat en pacientes EPS pueda deberse a la infección por un patógeno que no sea VIH-1.

Discusión

Tat Oyi (101 residuos) tiene mutaciones nunca encontradas en variantes de Tat de pacientes que progresan rápidamente (Grégoire & Loret, 1996), y se supone que estas mutaciones proporcionan a Tat Oyi la capacidad de tener un epítopo tridimensional que corresponde a una región bien conservada en variantes de Tat (Opi et al., 2002, Watkins et al., 2006). Por tanto, es sorprendente que Tat Oyi se reconozca muy bien en la cohorte EPS vietnamita y este reconocimiento no puede explicarse por un epítopo común con Tat HXB2. Este estudio revela que Tat de VIH-1 CM240 identificada en un paciente tailandés (Carr et al., 1996) es la mejor reconocida en pacientes EPS vietnamitas. VIH-1 CM240 es típico del sureste de Asia y este resultado indica que se producía probablemente una respuesta humoral adquirida contra Tat en EPS y podría ser la causa de su resistencia a VIH-1 a pesar de la exposición múltiple. También se observó una respuesta humoral específica en esta cohorte vietnamita EPS con respecto al complejo CD4-GP120 (Lopalco et al., 2005). Esta cohorte vietnamita EPS tiene signos similares de inmunidad frente a VIH-1 con respecto a una cohorte EPS de pacientes europeos (Lopalco et al., 2005), y el reconocimiento de Tat CM240 confirma que los pacientes vietnamitas EPS estaban infectados por VIH y resistían satisfactoriamente a la infección por VIH-1. Por otro lado, parece que un tercio de los pacientes EPS no tienen anticuerpos frente a Tat detectables y su resistencia a VIH no se debe a anticuerpos frente a Tat (datos no mostrados). Se identificó recientemente inmunidad innata en esta misma cohorte EPS vietnamita, en las que cinco pacientes tenían mutaciones en sus factores celulares de linfocitos CD4 que afectan a las etapas de entrada del VIH (Saez-Cirion et al., 2006). Es interesante saber que uno de estos pacientes está entre los pacientes EPS que no reconocen Tat en este estudio. Se han detectado anticuerpos frente a Tat en sueros de pacientes seropositivos y se observó una correlación con el estado de no progresión a largo plazo (LTNP) (Zagury et al., 1998; Re et al., 2001; Belliard et al., 2003). Se usaron péptidos o variantes de Tat desnaturalizados en estos estudios y sólo se detectaron anticuerpos frente a Tat en un tercio de los pacientes seropositivos (Zagury et al., 1998). Se desarrolló un nuevo protocolo para detectar anticuerpos frente a Tat usando variantes de Tat completas a pH 4,5 para mantener la estructura tridimensional de Tat y comenzando la detección a dilución baja (1/4) de muestras de sangre. Este nuevo protocolo hace posible aumentar la detección de anticuerpos frente a Tat específicos hasta el 50% de pacientes seropositivos. Sin embargo, es sorprendente que el 50% de los pacientes seropositivos que tienen Tat extracelular en su sangre no reconocen ninguna variante de Tat. Por otro lado, aunque la concentración de anticuerpos frente a Tat es dos veces más alta en pacientes seropositivos con respecto a pacientes EPS, la cantidad de anticuerpos frente a Tat sigue siendo enorme en pacientes EPS con respecto a la cantidad potencial de células infectadas por VIH que producen Tat. Lo que es extraño en los vietnamitas es el reconocimiento de Tat Oyi. En un primer experimento de examen con las cohortes vietnamitas usando una dilución de muestras de sangre de 1/1000, pudo detectarse la presencia de anticuerpos contra Tat Oyi en el 56% de los pacientes EPS. El nuevo protocolo que parte de una dilución de muestras de sangre de ¼ hace posible señalar que las otras variantes de Tat se reconocían significativamente en la cohorte EPS (figura 1A).

Conclusión:

Sólo la mitad de los pacientes seropositivos tienen anticuerpos contra Tat y no pueden reconocer las seis variantes de Tat. Además, estos anticuerpos contra Tat pueden desaparecer. Estas características podrían explicar su incapacidad para neutralizar Tat extracelular. Se mostró que Tat puede inducir apoptosis en linfocitos T citotóxicos (Westendorp et al., 1995) e inhibir macrófagos debido a la sobreexpresión del ligando Fas (Cohen et al., 1999). La única respuesta celular contra VIH-1 en la cohorte EPS se debía a células citotóxicas naturales (NK) y Tat puede inducir apoptosis celular en células NK (Poggi et al., 2002). Los resultados sugieren que anticuerpos frente a Tat que tienen la capacidad de producir reconocimiento cruzado con respecto a diferentes variantes de Tat podrían restaurar una respuesta inmunitaria celular eficaz contra VIH. La presencia de IgG que reconoce específicamente Tat entre una mayoría de pacientes en la cohorte EPS sugiere que se producía una inmunidad adquirida contra Tat y hacía posible una recuperación de su inmunidad celular. Esta inmunidad adquirida podría deberse a mutaciones en una variante de Tat vietnamita similar a las mutaciones observadas en Gabón con Tat Oyi. Entre las mutaciones que son específicas de Tat Oyi, Glu 100 parece ser muy interesante porque la aparición de una carga negativa podría inducir inmunogenicidad frente a una superficie de Tat Oyi que corresponde a una superficie altamente conservada entre variantes de Tat.

Ejemplo 2: Síntesis, purificación y caracterización de Tat Oyi Cys 22

Se ensambló Tat OyiCys22 (SEQ ID NO: 2) en síntesis de péptidos en fase sólida. Antes de la escisión de la resina, se obtuvieron 330 mg de material bruto a partir de una cantidad teórica de 707 mg. El rendimiento de síntesis era del 46,7% y es similar al observado con la síntesis de Tat Oyi Ser 22. Se escindieron la resina y los grupos protectores del contenido de proteína con ácido trifluoroacético. Se purificó en primer lugar el contenido en proteína mediante una precipitación con terc-butil éter (TBE) para eliminar grupos protectores libres que son solubles en TBE. Se secó el sedimento y se resuspendió en un tampón acuoso con TFA al 0,1% y entonces se retiró la resina mediante filtración (0,22 µm). Se liofilizó el contenido de proteína libre de resina (aproximadamente 240 mg) y se resuspendió en tampón acuoso con TFA al 0,1% a una concentración de hasta 20 mg/ml en cuatro fracciones de aproximadamente 60 mg denominadas F1, F2, F3 y F4. Cada fracción contenía alrededor de 15 unidades de DO. Se llevó a cabo la purificación en cada fracción usando un aparato de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de Beckman con una columna de fase inversa C8 de Beckman (10x150 mm). El tampón A era agua con TFA al 0,1% y el tampón B era acetonitrilo (Merck) con TFA al 0,1%. El gradiente fue tampón B del 15-35% en 40 minutos con una velocidad de flujo de 2 ml/min. A partir de las diferentes subfracciones obtenidas tras la separación en fase inversa C8, fue posible detectar el espectro de absorción típico de Trp en las subfracciones. Se llevó a cabo análisis de HPLC con una columna RP-8 de Merck (4,6x100 mm) con tampones similares pero usando un gradiente del 10-50% en 40 minutos con una velocidad de flujo de 0,8 ml por minuto. Se caracterizó la subfracción que tenía el espectro de absorción típico de Trp mediante un único pico a 25 min que tiene el mismo tiempo de retención que Tat Oyi Ser 22 (datos no mostrados). La mutación no cambiaba la hidrofobicidad de Tat Oyi. Se observó una masa correspondiente al PM de 11578 esperado de Tat Oyi Cys 22 con la subfracción que tiene un único pico a 25 min en la HPLC (figura 2). No se observaron contaminantes mediante espectroscopía de masas. Es interesante observar que se obtuvo el mismo espectro de masas tras seis mes con Tat Oyi Cys22 almacenada a -22ºC. La ausencia de degradación del principio activo es esperanzadora para una campaña de vacunación. La cantidad total de Tat Oyi Cys 22 purificada corresponde a un tercio de las unidades de DO a 280 nm y 1/5 de la cantidad total de contenido de proteína. Se llevó a cabo una caracterización adicional tal como ensayo de transactivación (figura 3) y dicroísmo circular (figura 4) con Tat Oyi Cys 22. Se llevaron a cabo ensayos de transactivación con Tat HXB2 como control. Se observó transactivación con Tat Oyi Cys 22 con un nivel similar a Tat HXB2, mientras que la variante Tat Oyi Ser 22 no puede producir transactivación. La mutación Cys 22 hace posible tener una prueba biológica que muestra que Tat Oyi Cys 22 tiene una estructura similar a otras variantes de Tat activas. Se llevó a cabo dicroísmo circular (DC) en Tat Oyi Cys 22 y Tat Oyi Ser 22 el mismo día. Los espectros de DC (figura 4) revelan que la mutación Cys22Ser no induce un cambio estructural detectable con DC. Para evaluar un posible cambio que pudiese inducirse por la mutación pero no detectarse con DC, se llevó a cabo un modelado molecular de la Tat Oyi Cys22 y Tat Oyi Ser22 (figura 5). El modelado molecular confirma que la mutación Ser22Cys no induce un cambio estructural. La única diferencia entre Ser y Cys es un átomo diferente (oxígeno en lugar de un azufre) en la cadena lateral. El azufre y el oxígeno están en la misma columna de la tabla de Mendelief y comparten una similitud química como nucleófilos. El azufre es más grande que el oxígeno y el hidrógeno unido a azufre es más lábil que el unido a oxígeno. Esta parece ser la única explicación de por qué Tat OyiCys22 puede producir transactivación y Tat OyiSer22 no. Es interesante observar que el extremo C-terminal que contiene la mutación Glu 100 está muy cerca de las regiones 3 y 4 que tienen las secuencias más conservadas en variantes de Tat.

Ejemplo 3: Inmunización con Tat Oyi Cys 22

Se llevó a cabo la inmunización de ratones con Tat Oyi Cys 22 (SEQ ID NO: 2). No se observó toxicidad en ratones con una concentración de Tat Oyi Cys 22 que es 1000 veces superior en comparación con la que se planea para los ensayos clínicos (datos no mostrados).

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Lista de secuencias

10 <110> Université de la Méditerranée

<120> Composiciones y métodos para la prevención o el tratamiento del SIDA

<130> B0718

<160> 2

<170> PatentIn versión 3.3 20 <210> 1

<211> 77

<212> PRT

<213> Virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1

<400> 1

<210> 2

<211> 101

<212> PRT

<213> Virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1

40 <400> 2

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 que puede estimular una respuesta

   inmunitaria contra una proteína Tat, para su uso en la prevención o el tratamiento del síndrome de 5 inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en un paciente.

2. 2.

   Proteína para su uso en la prevención o el tratamiento del SIDA en un paciente según la reivindicación 1, en la que puede estimular una respuesta inmunitaria contra dos, tres, cuatro o más subtipos de VIH-1, preferiblemente en la que puede estimular una respuesta inmunitaria contra cinco subtipos de VIH-1.

3. 3.

   Proteína para su uso en la prevención o el tratamiento del SIDA en un paciente según la reivindicación 1, en la que i) comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2; o ii) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 truncada de 1 a 10 aminoácidos, preferiblemente de 1 a 8, preferiblemente de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, preferiblemente 1 ó 2 aminoácidos en el extremo N

   15 terminal; o iii) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 truncada de 1 a 14 aminoácidos, preferiblemente de 1 a 12, preferiblemente de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 8, preferiblemente de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, preferiblemente 1 ó 2 aminoácidos en el extremo C-terminal.
4. 4. Proteína para su uso en la prevención o el tratamiento del SIDA en un paciente según las reivindicaciones 1

   20 a 3, en la que la proteína puede estimular una respuesta inmunitaria contra proteínas Tat de dos, tres, cuatro, cinco o más subtipos de VIH-1 seleccionados de A, B, C, D, E, F, G, H, J y K.
5. 5. Proteína para su uso en la prevención o el tratamiento del SIDA en un paciente según cualquiera de las

   reivindicaciones 1 a 4, en la que la proteína es una proteína sintetizada químicamente, o es una proteína 25 recombinante.
6. 6. Composición farmacéutica que comprende una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

   30 7. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que la proteína es tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.
7. 8. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, para su uso como vacuna profiláctica o terapéutica contra una infección por VIH-1.
8. 9. Composición farmacéutica que comprende un polinucleótido que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

   40 10. Composición farmacéutica según la reivindicación 9, para su uso como vacuna profiláctica o terapéutica contra una infección por VIH, preferiblemente una infección por VIH-1.
9. 11. Vacuna que comprende como principio activo una proteína Tat Oyi de transactivación competente que comprende una cisteína en la posición 22.

10. 12.

    Vacuna según la reivindicación 11, en la que la proteína se selecciona de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

11. 13.

    Vacuna según la reivindicación 11 ó 12, que comprende además un adyuvante.

    50 14. Proteína que comprende al menos una de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y un adyuvante, para su uso en la inmunización de animales de sangre caliente mediante inyección.