ES2500922T3 - Agentes de formación de imágenes dirigidos al receptor de folato - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula:**Fórmula**

Description

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DESCRIPCIÓN

Agentes de formación de imágenes dirigidos al receptor de folato

Campo de la invención

La invención se refiere a compuestos y a procedimientos para dirigir un agente de formación de imágenes a células

5 de un animal. Más particularmente, los agentes de formación de imágenes a base de radionúclidos se dirigen a células que tienen receptores para una vitamina usando dicha vitamina, o un derivado de unión a los receptores de la vitamina o un análogo del mismo, como el ligando de direccionamiento para el agente de formación de imágenes.

Antecedentes y sumario de la invención

El transporte transmembrana es una función celular fundamental. Puesto que los médicos han reconocido la

10 importancia del transporte transmembrana para muchos campos de las ciencias biológicas y médicas, incluyendo la terapia farmacológica y la transferencia génica, se han realizado esfuerzos de investigación significativos dirigidos a la comprensión y la aplicación de dichos procedimientos. Así pues, por ejemplo, se ha intentado la administración transmembrana de ácidos nucleicos a través del uso de vehículos de proteínas, vehículos de anticuerpos, sistemas de administración liposómicos, electroporación, inyección directa, fusión celular, vehículos virales, choque osmótico

15 y transformación mediada por calcio-fosfato. Sin embargo, muchas de estas técnicas están limitadas tanto por los tipos de células en los que se produce el transporte transmembrana como por las condiciones necesarias para que se produzca un transporte transmembrana satisfactorio de moléculas exógenas. Además, muchas de estas técnicas están limitadas por el tipo y el tamaño de la molécula exógena que puede transportarse a través de la membrana celular sin pérdida de bioactividad.

20 Un mecanismo para el transporte transmembrana de las moléculas exógenas que tiene una amplia aplicabilidad es la endocitosis mediada por un receptor. Ventajosamente, la endocitosis mediada por un receptor se produce tanto in vivo como in vitro. La endocitosis mediada por un receptor implica el movimiento de ligandos unidos a receptores de la membrana hacia el interior de una zona limitada por la membrana a través de la invaginación de la membrana. El procedimiento se inicia o activa mediante la unión de un ligando específico del receptor con el receptor. Se han

25 caracterizado muchos sistemas endocitóticos mediados por receptores, incluyendo aquellos que generan la internalización de galactosa, manosa, manosa-6-fosfato, transferrina, asialoglucoproteína, folato, transcobalamina (vitamina B12), -2-macroglobulinas, insulina y otros factores de crecimiento peptídicos tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF).

La endocitosis mediada por un receptor se ha usado para administrar moléculas exógenas tales como proteínas y

30 ácidos nucleicos a células. Generalmente, un ligando específico se conjuga químicamente mediante unión covalente, iónica o de hidrógeno a una molécula exógena de interés, formando una molécula conjugada que tiene un resto (la parte de ligando) que todavía es reconocido en el conjugado por un receptor diana. Usando esta técnica, se ha conjugado la proteína fototóxica psoraleno con insulina, y se ha internalizado mediante la ruta endocitótica del receptor de insulina (Gasparro, Biochem. Biophys. Res. Comm. 141 (2) pág. 502-509, 15 de diciembre de 1986); se

35 ha usado el receptor específico de los hepatocitos para asialoglucoproteínas de galactosa terminales para la administración transmembrana específica de los hepatocitos de asialoorosomucoide-poli-lisina formando un complejo no covalentemente con un plásmido (Wu, G. Y., J. Biol. Chem., 262 (10), pág. 4429-4432, 1987); se ha usado el receptor celular para EGF para administrar polinucleótidos unidos covalentemente a EGF al interior de la célula (Myers, solicitud de patente europea 86810614.7, publicada el 6 de junio de 1988); se ha usado el receptor

40 celular ubicado en el intestino para el complejo organometálico de vitamina B12-factor intrínseco para mediar en la administración de un fármaco, una hormona, un péptido bioactivo y un inmunógeno que forme un complejo con vitamina B12 al sistema circulatorio tras la administración oral (Russell-Jones et al., solicitud de patente europea 86307849.9, publicada el 29 de abril de 1987); se ha usado el receptor de manosa-6-fosfato para administrar lipoproteínas de baja densidad a células (Murray, G. J. y Neville, D. M., Jr., J. Biol. Chem, vol. 255 (24), pág. 1194

45 11948, 1980); se ha usado el receptor de la subunidad de unión a la toxina del cólera para administrar insulina a células carentes de receptores de insulina (Roth y Maddox, J. Cell. Phys. vol. 115, pág. 151, 1983); y se ha empleado el receptor de gonadotropina coriónica humana para administrar una cadena a de ricina acoplada a GCH a células con el receptor de GCH apropiado (Oeltmann y Heath, J. Biol. Chem, vol. 254, pág. 1028 (1979)).

En una realización, la presente invención implica el transporte transmembrana de un agente de formación de

50 imágenes a base de radionúclido a través de una membrana que tiene receptores para una vitamina, o un derivado de unión a los receptores de la vitamina o un análogo del mismo. Se pone en contacto una membrana celular que porta receptores de la vitamina, o receptores de derivados o análogos de la vitamina, con un conjugado de vitaminaagente de formación de imágenes durante un tiempo suficiente para iniciar y permitir el transporte transmembrana del conjugado, y se monitoriza la biodistribución del conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes en el

55 animal. En otra realización, el resto dirigido a la vitamina/derivado o análogo de vitamina simplemente se une a un receptor de la vitamina de la superficie celular para concentrar el radionúclido quelado sobre la superficie celular.

La invención aprovecha (1) la ubicación de los receptores de la vitamina y (2) los procesos endocíticos mediados por receptores asociados. Por ejemplo, la invención aprovecha la expresión única, sobreexpresión o expresión de preferencia de receptores de vitamina, transportadores u otras proteínas presentes en la superficie que se unen específicamente a vitaminas, o derivados o análogos de las mismas, en células tumorales u otros tipos celulares que sobreexpresan dichos receptores. Por consiguiente, la invención se puede usar para detectar células, tales como células tumorales u otros tipos de células, que sobreexpresan los receptores de vitamina, o los receptores de

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5 derivados o análogos de vitamina, aprovechando los procesos endocíticos mediados por receptores que se producen cuando dichas células se ponen en contacto con el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes.

Los receptores de vitaminas tales como el receptor de folato (RF) de alta afinidad, se expresan a niveles altos, por ejemplo, en células cancerosas. Se ha publicado que todos los cánceres epiteliales de ovario, glándula mamaria,

10 colon, pulmón, nariz, garganta y cerebro expresan niveles elevados del RF. De hecho, se sabe que más del 90 % de todos los tumores de ovario humanos expresan grandes cantidades de este receptor. Por lo tanto, la presente invención se puede usar para la formación de imágenes de diagnóstico de una variedad de tipos de tumores y de otros tipos de células implicados en estados patológicos.

Se han usado quelantes de radionúclidos que forman complejos con ligandos como sondas no invasivas con el fin

15 de formar imágenes de diagnóstico. Por ejemplo, se han usado péptido intestinal vasoactivo, análogos de somatostatina y anticuerpos monoclonales como ligandos para localizar radionúclidos para células, tales como células tumorales. Los anticuerpos monoclonales, y diversos fragmentos de los mismos, recibieron inicialmente la mayor atención, porque se creía que era posible conseguir la dirección específica a un tumor precisa usando anticuerpos monoclonales como ligandos de direccionamiento. Desafortunadamente, este enfoque fue problemático

20 porque i) los anticuerpos tienen tiempos de circulación prolongados debido a su gran tamaño, lo que es desfavorable a efectos de la formación de imágenes; ii) los anticuerpos son costosos de producir; iii) los anticuerpos pueden ser inmunógenos, y por consiguiente, se deben humanizar cuando se usan múltiples dosis; y iv) las proporciones del tumor con respecto al tejido no diana (T/NT) de los radionúclidos ligados a anticuerpos son subóptimas. Por lo tanto, el centro de atención se ha dirigido recientemente hacia el uso de ligandos con especificidad tumoral más pequeños,

25 que no tienen dichas limitaciones.

Se han usado vitaminas tales como el ácido fólico para dirigir agentes de formación de imágenes a células tumorales, y son ventajosas debido a su pequeño tamaño. El primer complejo dirigido a base de ácido fólico descrito para la formación de imágenes de tumores in vivo fue un derivado de histamina que contenía 125yodo. Este complejo

125I

no se consideró un candidato clínico relevante debido al componente de radionúclido de larga vida.

30 Posteriormente, se desarrolló un conjugado de deferoxamina-folato para la formación de imágenes de tumores (la deferoxamina quela 67Ga, un radionúclido que emite radiación gamma que tiene una semivida de 78 horas). Se observó aclaramiento hepatobiliar con este conjugado y, por lo tanto, se detuvo el desarrollo preclínico debido a problemas anticipados en la formación de imágenes de manera precisa de ubicaciones de la región abdominal. Sin embargo, este obstáculo se superó sustituyendo el quelante de deferoxamina con el ácido dietilentriamina

35 pentaacético (DTPA), un quelante eficaz de 111In (semivida de 68 horas). Se confirmó que la vía principal de eliminación de 111In-DPTA-folato era a través de los riñones.

Más recientemente, se ha adoptado 99mPrc como el radionúclido preferido para la formación de imágenes, porque i) el radionúclido se obtiene fácilmente de generadores de 99Mo-99mTc disponibles en el mercado; ii) el coste de producción de grandes cantidades de 99mTc es insignificante en comparación con el coste de producción de 111In; y

40 iii) 99mTc tiene una semivida mucho más corta (6 horas), lo que permite que se administren mayores dosis de radionúclido, produciendo imágenes con mayor resolución sin el riesgo de exponer órganos vitales a radiación peligrosa.

Se han desarrollado varios conjugados de 99mTc a base de folato. Por ejemplo, los conjugados de folato de 99Tc-6hidrazinonicotinamido-hidrazido (HYNIC; Guo, et al., J. Nucl. Med., 40 (9): 1563-1569 (1999)), 99mTc-12-amino45 3,3,9,9-tetrametil-5-oxa-4,8-diaza-2,10-dodecanodiona-dioxima (OXA) (Linder, et al., Soc. Nucl. Med., Proc. XLVII Encuentro Anual, 2000, 41 (5): 119P), 99mTc-etilendicisteína (Ilgan, et al., Cancer Biother. & Radiopharm., 13 (6): 427-435 (1998)) y 99mTc-DTPA-folato (Mathias, et al., Bioconjug. Chem., 11 (2): 253-257 (2000)) han mostrado cualidades prometedoras de captación en tumores in vivo. Sin embargo, se necesitan conjugados de 99mTc a base de vitaminas alternativos, o conjugados a base de vitaminas que empleen otros radionúclidos, que presenten

50 proporciones de tumor con respecto al tejido no diana (T/NT) óptimas y se eliminen a través de los riñones. Dichos conjugados a base de vitaminas deben ser adecuados para un desarrollo clínico como agentes de formación de imágenes de tumores y para el diagnóstico de otros estados patológicos.

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La invención se refiere a un compuesto de fórmula:

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Un aspecto adicional de la invención se refiere a un conjugado que comprende el compuesto anterior quelado a un catión de un radionúclido.

5 Un aspecto adicional de la invención se refiere a una formulación de dosificación parenteral que comprende el conjugado anterior.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una formulación como la anterior para su uso en un procedimiento de diagnóstico del cáncer, comprendiendo dicho procedimiento la formación de imágenes de una población de células tumorales.

10 Un aspecto adicional de la invención se refiere a un uso de una formulación como la anterior para la fabricación de un agente de diagnóstico para el diagnóstico del cáncer, comprendiendo dicho diagnóstico la formación de imágenes de una población de células tumorales.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un conjugado como el anterior para su uso en un procedimiento de diagnóstico del cáncer, comprendiendo dicho procedimiento la formación de imágenes de una población de células

15 tumorales.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un uso de un conjugado como el anterior para la fabricación de un agente de diagnóstico para el diagnóstico del cáncer, comprendiendo dicho diagnóstico la formación de imágenes de una población de células tumorales.

En una realización, se proporciona un compuesto de fórmula:

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en la que V es una vitamina, o un derivado de unión al receptor de la vitamina o un análogo del mismo, L es un engarce divalente, R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H2NCHRCOOH, M es un catión de un radionúclido, n es 1 o 0; y k es 1 o 0. La vitamina es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo.

25 En otra realización, se proporciona una composición para la formación de imágenes de diagnóstico que comprende un compuesto de fórmula:

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en la que V es una vitamina, o un derivado de unión al receptor de la vitamina o un análogo del mismo, L es un engarce divalente, R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H2NCHRCOOH, M es un catión de un radionúclido, n es 1 o 0, y un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo. La vitamina es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo.

En otra realización más, se proporciona un procedimiento para la formación de imágenes de una población de células en un animal, en el que las células se caracterizan por un receptor de vitamina en la superficie de las mismas. El procedimiento comprende las etapas de administrar al animal una cantidad eficaz de una composición que comprende un compuesto de fórmula:

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en la que V es una vitamina, o un derivado de unión al receptor o un análogo del mismo, específica del receptor de vitamina de la superficie celular, L es un engarce divalente, R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H2NCHRCOOH, M es un catión de radionúclido, n es 1 o 0, y un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo, y monitorizar la biodistribución del compuesto en el animal.

15 En otra realización, se proporciona un compuesto de fórmula:

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en la que V es una vitamina que es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo, o un derivado de unión al receptor de la vitamina o un análogo del mismo, L es un engarce divalente, R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H2NCHRCOOH, M es un catión de un radionúclido, n es 1 o 0, y k es 1 o 0.

20 En otra realización más, se proporciona una composición para la formación de imágenes de diagnóstico que comprende un compuesto de fórmula:

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en la que V es una vitamina que es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo, o un derivado de unión al receptor de la vitamina o un análogo del mismo, L es un engarce divalente, R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H2NCHRCOOH, M es un catión de un radionúclido, n es 1 o 0, y un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otra realización más, se proporciona un procedimiento para la formación de imágenes de una población de células en un animal, en el que las células se caracterizan por un receptor de vitamina en la superficie de las mismas. El procedimiento comprende las etapas de administrar al animal una cantidad eficaz de una composición que comprende un compuesto de fórmula:

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en la que V es la vitamina, o un derivado de unión al receptor o un análogo del mismo, específica para el receptor de vitamina de la superficie celular, L es un engarce divalente, R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H2NCHRCOOH, M es un catión de un radionúclido, n es 1 o 0, y un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo, y monitorizar la biodistribución del compuesto en el animal.

15 En cualquiera de estas realizaciones, V del compuesto es folato. En cualquiera de estas realizaciones, el radionúclido del compuesto se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en radioisótopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Estructura de EC20, un compuesto a modo de ejemplo usado como agente de formación de

20 imágenes de acuerdo con la invención. Figura 2. Radiocromatograma de HPLC de 99mTc-EC20. Las muestras de 99mTc-EC20 se eluyeron isocráticamente en una columna C18 (3,9 x 150 mm) Nova-Pak de Waters usando una fase móvil acuosa que contenía metanol al 20 % y ácido trifluoroacético al 0,2 % a un caudal de 1 ml/min. Se monitorizó el análisis de HPLC tanto con el detector UV (280 nm) como con un radiodetector FC-3200 de Bioscan. Pico A, 99mTc libre;

25 pico B, un quelato que contiene folato de estructura desconocida; picos C y D, diastereómeros que poseen una configuración bien syn o anti del enlace tecnecio-oxígeno en el anillo quelante Dap-Asp-Cys de EC20. Figura 3. Estructuras de los isómeros de Re-EC20 y 99mTc-EC20 (posición syn o anti del enlace metal-oxo). Figura 4. Bloqueo de la unión de 3H-ácido fólico a células KB con diversos competidores que contienen folato. Se incubaron células KB durante 15 min en hielo con 3H-ácido fólico 100 nM en presencia y ausencia de

30 concentraciones crecientes de los competidores. () Ácido fólico; (■) EC20; (▲) Isómero A de EC20:Re; (▼) Isómero B de EC20:Re; () DTPA-folato. Las barras de error representan 1 desviación estándar (n = 3). Figura 5. Asociación dependiente del tiempo de 99mTc-EC20. Se incubaron células KB con 99mTc-EC20 10 nM durante períodos crecientes de tiempo a 37 ºC. Tras múltiples lavados, se recogieron las células y se sometieron a recuento para determinar la radiactividad asociada. Las barras de error representan 1 desviación

35 estándar (n = 3). Figura 6. Asociación dependiente de la concentración de 99mTc-EC20. Se incubaron células KB durante 2 h a 37 ºC en presencia de concentraciones crecientes de 99mTc-EC20. Tras múltiples lavados, se recogieron las células y se sometieron a recuento para determinar la radiactividad asociada. Las barras de error representan 1 desviación estándar (n = 3).

40 Figura 7. Asociación dependiente de la concentración de 99mTc-EC20 "pico B". Se incubaron células KB durante 2 h a 37 ºC en presencia de concentraciones crecientes de "pico B" que se aisló de manera cromatográfica a

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partir de la formulación de 99mTc-EC20. Tras múltiples lavados, se recogieron las células y se sometieron a recuento para determinar la radiactividad asociada. Las barras de error representan 1 desviación estándar (n = 3). (), Pico B; (º), Pico B más ácido fólico 1 mM. Figura 8. Aclaramiento sanguíneo de 99mTc-EC20 en ratones Balb/c. Todos los animales recibieron una dosis

5 intravenosa de 50 g/kg de EC20 (67 nmol/kg) en aproximadamente 0,1 ml durante una breve anestesia con éter dietílico. En los tiempos designados tras la inyección, se sacrificó cada animal mediante asfixia con CO2, se extrajo sangre y se sometió a recuento para determinar la radiactividad asociada. Las barras de error representan 1 desviación estándar (n = 3 animales). Figura 9. Imágenes de radiación gamma de cuerpo entero (vista ventral). Las imágenes se obtuvieron 4 h

10 después de la administración intravenosa de 99mTc-EC20 a un ratón Balb/c que tenía un tumor M109 positivo en el receptor de folato subcutáneo. Solo los riñones (K) y el tumor (T) presentan una acumulación significativa de este radiotrazador. Figura 10. Estructuras de EC11, EC13, EC14, EC15, EC19, EC20, EC31 y EC53. Figura 11. Distribución tisular de 99mTc-EC20 en ratones Balb/c con tumores M109 positivos en RF y tumores

15 4T1 negativos en RF. Figura 12. Análisis de HPLC de EC11. Figura 13. Análisis de espectroscopía de masas de EC11. Figura 14. Análisis de RMN de EC11. Figura 15. Análisis de HPLC de EC13.

20 Figura 16. Análisis de RMN de EC14. Figura 17. Análisis de espectroscopía de masas de EC 15. Figura 18. Análisis de HPLC de EC19. Figura 19. Análisis de espectroscopía de masas de EC 19. Figura 20. Análisis de HPLC de EC31.

25 Figura 21. Análisis de HPLC de EC53. Figura 22. Análisis de espectroscopía de masas de EC53. Figura 23. Análisis de espectroscopía de masas de EC53.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con la invención, se proporcionan compuestos y usos para dirigir agentes de formación de imágenes a

30 base de radionúclidos a poblaciones de células que expresan de forma única, sobreexpresan o expresan preferentemente receptores de vitaminas. Por consiguiente, una vitamina, o un derivado de unión a un receptor o análogo del mismo, se usa como el ligando de direccionamiento para el agente de formación de imágenes. El conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes se puede usar para dirigir radionúclidos a células y para concentrar los radionúclidos en una población de células, tal como una población de células tumorales, para su uso

35 en la formación de imágenes de diagnóstico.

La invención se refiere a un compuesto de fórmula:

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Un aspecto adicional de la invención se refiere a un conjugado que comprende el compuesto anterior quelado a un catión de un radionúclido.

40 Un aspecto adicional de la invención se refiere a una formulación de dosificación parenteral que comprende el conjugado anterior.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una formulación como la anterior para su uso en un procedimiento de diagnóstico del cáncer, comprendiendo dicho procedimiento la formación de imágenes de una población de células tumorales.

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Un aspecto adicional de la invención se refiere a un uso de una formulación como la anterior para la fabricación de un agente de diagnóstico para el diagnóstico del cáncer, comprendiendo dicho diagnóstico la formación de imágenes de una población de células tumorales.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un conjugado como el anterior para su uso en un procedimiento de 5 diagnóstico del cáncer, comprendiendo dicho procedimiento la formación de imágenes de una población de células tumorales.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un uso de un conjugado como el anterior para la fabricación de un agente de diagnóstico para el diagnóstico del cáncer, comprendiendo dicho diagnóstico la formación de imágenes de una población de células tumorales.

10 La invención proporciona una composición para la formación de imágenes de diagnóstico que comprende un compuesto de fórmula:

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15 para su uso en dichos procedimientos. En el compuesto, V es una vitamina, o un derivado de unión al receptor de la vitamina o un análogo del mismo, L es un engarce divalente, R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H2NCHRCOOH, M es un catión de un radionúclido y n es 1 o 0. La vitamina, o derivado de unión al receptor de la vitamina o análogo del mismo, es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo.

La invención también proporciona los compuestos de las fórmulas:

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y en las que V es una vitamina, o un derivado de unión al receptor de la vitamina o un análogo del mismo, L es un engarce divalente, R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H2NCHRCOOH, M es un catión de un radionúclido, n es 1 o 0 y k es 1 o 0. La vitamina es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el

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5 receptor in vivo.

El compuesto es un compuesto denominado EC20 representado en la Fig. 1. Los ejemplos de otros compuestos para su uso de acuerdo con la presente divulgación son compuestos denominados EC11, EC13, EC14, EC15, EC19, EC31 y EC53 (véase la Fig. 10). El resto de vitamina (por ejemplo, el resto de ácido fólico de EC20) proporciona una unión de alta afinidad a los RF celulares. Los compuestos también contienen un quelante a base de

10 péptido bifuncional que proporciona el sitio para la quelación del radionúclido, por ejemplo, 99mTc (véase la Fig. 1), y los compuestos pueden, opcionalmente, contener un engarce a través del cual el resto de vitamina se une covalentemente al resto quelante.

De acuerdo con la divulgación, el resto de vitamina de los compuestos es una vitamina que es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por receptores in vivo, o un derivado de unión al receptor de la vitamina o un

15 análogo del mismo. La vitamina se une, opcionalmente, a través de un engarce (L) con la parte de quelante de los compuestos. En la invención, y como se muestra en la Fig. 1, EC20 comprende un análogo de ácido fólico unido al resto quelante, porque EC20 tiene el ácido glutámico en la configuración D. La parte de quelante comprende un resto de ácido ,-diaminopropiónico unido a un grupo cisteína a través de un tercer residuo de aminoácido. La parte de quelante del compuesto está adaptada a unirse a un catión radionúclido (M) (en el que k = 1).

20 De acuerdo con la invención, los compuestos con radionúclido unido se denomina "conjugados de vitamina-agente de formación de imágenes".

La estructura del engarce, si está presente, no es de importancia fundamental para la invención. Por lo tanto, por ejemplo, puede ser cualquier engarce divalente biocompatible. Por lo general, el engarce comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 átomos de carbono, más comúnmente de aproximadamente 2 a 25 aproximadamente 20 átomos de carbono. Normalmente, se emplean engarces de menor peso molecular (es decir, aquellos que tienen un peso molecular aproximado de aproximadamente 30 a aproximadamente 300). Además, el resto de vitamina puede ser una vitamina, o un derivado o análogo de la misma. Por ejemplo, el folato contiene un ácido glutámico en la configuración L unido a ácido pteroico. EC11 y EC14 contienen dos residuos de ácido glutámico y, por tanto, estos compuestos, por ejemplo, también se pueden considerar derivados de ácido fólico (Fig.

30 10).

Entre las vitaminas que se cree que desencadenan la endocitosis mediada por un receptor y que tienen aplicación de acuerdo con el procedimiento desvelado en el presente documento están la niacina, el ácido pantoténico, el ácido fólico, la riboflavina, la tiamina, la biotina, la vitamina B12 y las vitaminas liposolubles A, D, E y K. Estas vitaminas, y sus análogos y derivados, constituyen vitaminas que se pueden acoplar con agentes de formación de imágenes para

35 formar los conjugados de vitamina-quelante para su uso de acuerdo con la invención. Los restos de vitamina preferidos incluyen ácido fólico, biotina, riboflavina, tiamina, vitamina B12, y los análogos y derivados de estas moléculas de vitamina, y otras moléculas de unión a receptores de vitaminas relacionados.

De acuerdo con la invención, se pueden usar ácido fólico, ácido folínico, ácido pteroico, ácido pteropoliglutámico y pteridinas de unión a los receptores de folato tales como tetrahidropterinas, dihidrofolatos, tetrahidrofolatos y sus 40 análogos desaza y didesaza. Las expresiones análogos "desaza" y "didesaza" se refieren a los análogos de folato reconocidos en la técnica que tienen un átomo de carbono sustituido con uno o dos átomos de nitrógeno en la estructura del ácido fólico natural. Por ejemplo, los análogos desaza incluyen los análogos 1-desaza, 3-desaza, 5desaza, 8-desaza y 10-desaza. Los análogos didesaza incluyen, por ejemplo, los análogos 1,5-didesaza, 5,10didesaza, 8,10-didesaza y 5,8-didesaza. Los anteriores son derivados o análogos de folato y se pueden unir a los

45 receptores de folato. Otros derivados o análogos de folato útiles de acuerdo con la invención son los análogos de unión a los receptores de folato aminopterina, ametopterina (metotrexato), N10-metilfolato, 2-desamino-hidroxifolato, análogos desaza tales como 1-desazametopterina o 3-desazametopterina y ácido 3',5'-dicloro-4-amino-4-desoxi-N10metilpteroilglutámico (diclorometotrexato).

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La vitamina o derivado o análogo de la misma, puede ser capaz de unirse selectivamente a la población de células que se va a visualizar debido a la expresión de preferencia en las células diana de un receptor para la vitamina, o derivado o análogo, en el que el receptor es accesible para la unión. El sitio de unión para la vitamina puede incluir receptores para cualquier molécula de vitamina capaz de unirse específicamente a un receptor, siendo el receptor u

5 otra proteína expresado de manera única, sobreexpresado o preferentemente expresado por la población de células que se va a visualizar. Una proteína presente en la superficie expresada de manera única, sobreexpresada o expresada preferentemente por las células que se van a visualizar es un receptor no presente o presente en cantidades menores en otras células, proporcionando un medio para la visualización sensible, rápida y selectiva de las células diana para la formación de imágenes de diagnóstico usando los conjugados de vitamina-agente de formación de imágenes de la presente invención.

De acuerdo con la invención, el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes es capaz de unirse con una alta afinidad a los receptores en las células cancerosas u otras células que se vayan a visualizar. La unión de alta afinidad puede ser inherente al resto de vitamina o la afinidad de unión se puede mejorar mediante el uso de una vitamina modificada químicamente (es decir, un análogo o un derivado) o mediante el enlace químico particular

15 entre la vitamina y el resto quelante que está presente en el conjugado.

De acuerdo con la divulgación, el quelante se puede conjugar con múltiples vitaminas diferentes, o derivados o análogos de unión a receptores de vitaminas para aumentar la posibilidad de la unión con los respectivos receptores de membrana celular. Como alternativa, las partes independientes de la dosis de un conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes pueden constituir diferentes conjugados de vitamina-agente de formación de imágenes para aumentar la posibilidad de unión a los respectivos receptores de membrana celular.

En general, se puede usar cualquier manera de formar un complejo entre el quelante y la vitamina, o el derivado o análogo de unión al receptor de vitamina, de acuerdo con la presente invención. El quelante puede formar un complejo con la vitamina, o el derivado o análogo de unión al receptor de vitamina, mediante la conjugación directa del quelante y la vitamina usando de un engarce divalente. Como alternativa, la vitamina y el quelante se pueden

25 conjugar sin el empleo de un engarce. Si se usa un engarce, el engarce puede conjugar directamente la vitamina, o el derivado o análogo de unión al receptor de vitamina, y el quelante a través de un enlace de hidrógeno, iónico o covalente. Además, de acuerdo con la presente invención, el engarce divalente puede comprender un medio indirecto para asociar el quelante con la vitamina, o el derivado o análogo de unión al receptor de vitamina, tal como mediante la conexión a través de engarces intermedios, brazos espaciadores o moléculas puente. Los medios tanto directos como indirectos para la asociación no deben impedir la unión de la vitamina, o del derivado o análogo de unión al receptor de vitamina, con el receptor de vitamina sobre la membrana celular para el funcionamiento del procedimiento de la presente invención.

El enlace covalente de la vitamina, o derivado o análogo de unión al receptor de vitamina, y el quelante se puede producir, independientemente de si se emplea un engarce o no, a través de la formación de enlaces de tipo amida,

35 éster o imino entre grupos de ácido, de aldehído, hidroxi, amino o hidrazo. Por ejemplo, un ácido carboxílico del resto de vitamina o del quelante se puede activar usando carbonildiimidazol o reactivos de acoplamiento de carbodiimida convencionales tales como 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y, tras ello, hacer reaccionar con el otro componente del conjugado, o con un engarce, que tenga al menos un grupo nucleófilo, a saber, hidroxi, amino, hidrazo o tiol, para formar el conjugado vitamina-quelante acoplado, con o sin un engarce, a través de enlaces de tipo éster, amida o tioéster.

Los radionúclidos adecuados para la formación de imágenes de diagnóstico incluyen radioisótopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio, incluyendo los isótopos 111In, 99mTc, 64Cu, 67Cu, 67Ga o 68Ga. Estos radionúclidos son catiónicos y forman complejos con el quelante a través del grupo quelante del conjugado para formar el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes.

45 El conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes de acuerdo con la invención se usa para visualizar de manera selectiva, usando técnicas de formación de imágenes escintigráficas, una población de células en un animal en el que la población de células expresa de manera única, sobreexpresa o expresa preferentemente receptores para una vitamina, o un derivado de unión al receptor de vitamina o análogo del mismo. Se pueden usar el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes para visualizar poblaciones de células patógenas, siempre que las células expresen de manera única o preferentemente, o sobreexpresen receptores de vitamina o receptores que se unen a derivados o análogos de vitamina.

La invención es aplicable a poblaciones de células patógenas que provocan una variedad de patologías que incluyen cáncer y enfermedades mediadas por cualquier otro tipo de células patógenas que sobreexpresan receptores de vitamina, o receptores capaces de unirse a derivados o análogos de vitamina. Por lo tanto, la población de células 55 patógenas puede ser tumorígena, incluyendo tumores benignos y tumores malignos, o puede ser no tumorígena. Si la población de células es una población de células cancerosas, las células cancerosas pueden surgir espontáneamente o mediante procedimientos tales como mutaciones presentes en la línea germinal del animal huésped o mutaciones somáticas, o el cáncer puede inducirse de manera química, viral o mediante radiación. La invención se puede usar para la formación de imágenes de diagnóstico de cánceres tales como carcinomas, sarcomas, linfomas, enfermedad de Hodgkin, melanomas, mesoteliomas, linfoma de Burkitt, carcinomas

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nasofaríngeos y mielomas. La población de células cancerosas puede incluir, pero sin limitación, cáncer oral, nasofaríngeo, de tiroides, endocrino, de piel, gástrico, esofágico, laríngeo, de garganta, pancreático, de colon, de vejiga, de huesos, ovárico, de cuello uterino, uterino, de mama, de testículos, de próstata, rectal, renal, hepático, pulmonar y de cerebro. En realizaciones en las que la población de células es una población de células cancerosas,

5 usando el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes, es posible visualizar células tumorales, incluyendo células de tumor primario o células que han experimentado metástasis o están en el procedimiento de disociarse del tumor primario.

Los conjugados de vitamina-agente de formación de imágenes de la presente invención se pueden usar para diagnosticar un estado patológico o para monitorizar la progresión de una enfermedad. Por ejemplo, el

10 procedimiento de formación de imágenes de diagnóstico de acuerdo con la invención se puede usar para monitorizar la progresión del cáncer en combinación con tratamientos profilácticos para prevenir la reaparición de un tumor tras su eliminación mediante cualquier enfoque terapéutico, incluyendo la extirpación quirúrgica del tumor, radioterapia, quimioterapia o terapia biológica.

Las composiciones y los usos de la presente invención se puede usar para aplicaciones tanto de medicina clínica en

15 seres humanos como veterinarias. Así pues, el animal que alberga la población de células que se visualizan puede ser un ser humano o, en el caso de aplicaciones veterinarias, puede ser un animal de laboratorio, agrícola, doméstico o salvaje. La presente invención se puede aplicar a animales incluyendo, pero sin limitación, seres humanos, animales de laboratorio tales como roedores (por ejemplo, ratones, ratas, hámsteres, etc.), conejos, monos, chimpancés, animales domésticos tales como perros, gatos y conejos, animales agrícolas tales como vacas,

20 caballos, cerdos, ovejas, cabras, y animales salvajes en cautividad tales como osos, osos panda, leones, tigres, leopardos, elefantes, cebras, jirafas, gorilas, delfines y ballenas.

Las composiciones para la formación de imágenes de diagnóstico comprenden una cantidad del conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes eficaz para visualizar las células diana para la formación de imágenes de diagnóstico en un animal cuando se administra en una o más dosis. La composición de formación de imágenes de 25 diagnóstico que contiene el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes se administra preferentemente al animal por vía parenteral, por ejemplo, por vía intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o intratecal. Como alternativa, la composición que contiene el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes se puede administrar al animal mediante otros procedimientos médicamente útiles, y se puede usar cualquier dosis eficaz y forma farmacéutica adecuada, incluyendo formas farmacéuticas para inhalación

30 y orales.

Los ejemplos de formas farmacéuticas parenterales incluyen disoluciones acuosas del conjugado de vitaminaagente de formación de imágenes, en solución salina isotónica, glucosa al 5 % u otros vehículos líquidos farmacéuticamente aceptables bien conocidos tales como alcoholes, glicoles, ésteres y amidas líquidos. La forma farmacéutica parenteral de acuerdo con la presente invención puede estar en forma de un liofilizado que se puede

35 reconstituir que comprende la dosis del conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes.

La dosis del conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes en la composición de formación de imágenes de diagnóstico puede variar de manera significativa dependiendo del tamaño del animal, la población de células diana para la formación de imágenes de diagnóstico, el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes específico que se está usando y la vía de administración del conjugado. La cantidad eficaz que se administrará al

40 animal se basa en la superficie corporal, peso y evaluación realizada por el médico del estado del animal. Una dosis eficaz puede variar de aproximadamente 1 ng/kg a aproximadamente 1 mg/kg, más preferentemente de aproximadamente 100 ng/kg a aproximadamente 500 g/kg, y lo más preferentemente de aproximadamente 100 ng/kg a aproximadamente 25 g/kg.

Se puede usar cualquier pauta de dosificación eficaz para administrar la composición de formación de imágenes de

45 diagnóstico que contiene el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes. Por ejemplo, la composición de formación de imágenes de diagnóstico se puede administrar como una sola dosis, o se puede administrar en dosis múltiples, si es necesario, para conseguir la visualización de la población de células diana. Se pueden administrar inyecciones adicionales de la composición de formación de imágenes de diagnóstico que contiene el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes al animal en un intervalo de días o meses tras la/s

50 inyección/inyecciones inicial/es, y las inyecciones adicionales pueden se útiles para monitorizar el progreso del estado patológico. La composición de formación de imágenes de diagnóstico que contiene el conjugado de vitaminaagente de formación de imágenes también se puede administrar en combinación con vitamina sin marcar. "En combinación con" significa que la vitamina sin marcar bien se puede administrar junto con el agente de formación de imágenes o que la vitamina sin marcar se puede inyectar previamente antes de la administración del agente de

55 formación de imágenes para mejor la calidad de la imagen. Por ejemplo, el agente de formación de imágenes se puede administrar en combinación con de aproximadamente 0,5 ng/kg a aproximadamente 100 mg/kg, o de aproximadamente 1 g/kg a aproximadamente 100 mg/kg, o de aproximadamente 100 g/kg a aproximadamente 100 mg/kg de la vitamina sin marcar.

La composición de formación de imágenes de diagnóstico normalmente se formula para la administración parenteral 60 y se administra al animal en una cantidad eficaz para permitir la formación de imágenes de la población de células diana. Por lo general, la composición de formación de imágenes de diagnóstico que contiene la vitamina-agente de formación de imágenes dirigido se administra al animal, y tras un período de tiempo que permita la administración y la concentración del conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes en la población de células diana, al animal se somete al procedimiento de formación de imágenes, siendo la formación de imágenes posibilitada por el

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5 conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes. Cuando se usan para monitorizar la progresión de una enfermedad o un diagnóstico, los procedimientos de formación de imágenes normalmente se llevan a cabo de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 horas después de la administración de la composición de formación de imágenes de diagnóstico que contiene el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes.

La divulgación también proporciona un procedimiento de formación de imágenes de una población de células en un

10 animal, en el que las células se caracterizan por un receptor de vitamina en la superficie de las células. El procedimiento comprende las etapas de administrar al animal una cantidad eficaz de una composición que comprende un compuesto de fórmula:

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en las que V es la vitamina, o un derivado de unión al receptor o un análogo del mismo, específica del receptor de vitamina de la superficie celular, L es un engarce divalente, R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H2NCHRCOOH, M es un catión de un radionúclido y n es 1 o 0, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo, y monitorizar la biodistribución del compuesto en el animal.

20 El procedimiento se puede usar para la formación de imágenes de una población de células in vitro, por ejemplo, en cultivo celular, o in vivo, cuando las células forman parte de o existen de otra manera en tejido animal. Así pues, las células diana pueden incluir, por ejemplo, las células que revisten el tubo digestivo, tal como la mucosa oral o faríngea, las células que forman las vellosidades del intestino delgado o las células que revisten el intestino grueso. Dichas células del tubo digestivo pueden servir de diana de acuerdo con la presente invención mediante la

25 administración oral de una composición de formación de imágenes de diagnóstico que comprenda el conjugado de vitamina-agente de formación de imágenes. De igual manera, las células que revisten el sistema respiratorio (fosas nasales, pulmones) de un animal pueden servir de diana mediante la inhalación de los presente complejos, y las células de órganos internos, incluyendo las células de los ovarios y del cerebro, pueden servir de diana, particularmente, mediante la administración parenteral de la composición de formación de imágenes de diagnóstico.

30 La divulgación proporciona:

1. Un compuesto de fórmula:

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en la que V es una vitamina que es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo, o un derivado de unión al receptor de la vitamina o un análogo del mismo;

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L es un engarce divalente; R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H2NCHRCOOH; M es un catión de un radionúclido; n o 1 o 0; y

5 k es 1 o 0.

2.

El compuesto de 1, en el que V es una vitamina seleccionada del grupo que consiste en folato, riboflavina, tiamina, vitamina B12 y biotina, o un derivado de unión al receptor de la vitamina o un análogo del mismo.

3.

El compuesto de 1, en el que el radionúclido se selecciona del grupo que consiste en isótopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio.

10 4. El compuesto de 3, en el que el radionúclido es un isótopo de tecnecio.

5. El compuesto de 1, en el que V es folato, o un derivado de unión al receptor de folato o análogo del mismo.

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en la que V es una vitamina que es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in

15 vivo, o un derivado de unión al receptor de la vitamina o un análogo del mismo; L es un engarce divalente; R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H2NCHRCOOH; M es un catión de un radionúclido; n es 1 o 0; y

20 un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo.

7. La composición de 6, en la que V del compuesto es una vitamina seleccionada del grupo que consiste en folato, riboflavina, tiamina, vitamina B12 y biotina, o un derivado de unión al receptor de la vitamina o un análogo del mismo.

8. La composición de 6, la que el radionúclido del compuesto se selecciona del grupo que consiste en isótopos 25 de galio, indio, cobre, tecnecio y renio.

9.

La composición de 8, en la que el radionúclido del compuesto es un isótopo de tecnecio.

10.

La composición de 6 adaptada a la administración parenteral.

11.

El compuesto de 6, en el que V es folato, o un derivado de unión al receptor de folato o análogo del mismo.

12.

Un procedimiento de formación de imágenes de una población de células en un animal, en el que dichas

30 células se caracterizan por un receptor de vitaminas en la superficie de dichas células, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

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en la que V es la vitamina, o un derivado de unión al receptor de la vitamina o un análogo del mismo, específica

35 de dicho receptor de vitaminas de la superficie celular; L es un engarce divalente; R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H2NCHRCOOH; M es un catión de un radionúclido; n o 1 o 0; y

40 un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo; y monitorizar la biodistribución de dicho compuesto en el animal;

13. El procedimiento de 12, en el que V del compuesto es una vitamina seleccionada del grupo que consiste en folato, riboflavina, tiamina, vitamina B12 y biotina, o un derivado de unión al receptor de la vitamina o un análogo del mismo.

45 14. El procedimiento de 12, en el que el radionúclido del compuesto se selecciona del grupo que consiste en isótopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio.

15.

El procedimiento de 14, en el que el radionúclido del compuesto es un isótopo de tecnecio.

16.

El procedimiento de 12, en el que la composición se administra por vía parenteral al paciente.

17.

El compuesto de 12, en el que V es folato, o un derivado de unión al receptor de folato o análogo del mismo.

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18. Un compuesto de fórmula:

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en la que V es una vitamina que es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo, o un derivado de unión al receptor de la vitamina o un análogo del mismo; L es un engarce divalente; R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H2NCHRCOOH; M es un catión de un radionúclido; n o 1 o 0; y k es 1 o 0.

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vivo, o un derivado de unión al receptor de la vitamina o un análogo del mismo; L es un engarce divalente;

15 R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H2NCHRCOOH; M es un catión de un radionúclido; n o 1 o 0; y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo.

20. Un procedimiento de formación de imágenes de una población de células de un animal, en el que dichas

20 células se caracterizan por un receptor de vitaminas en la superficie de dichas células, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

en la que V es la vitamina, o un derivado de unión al receptor de la vitamina o un análogo del mismo, específica

25 de dicho receptor de vitaminas de la superficie celular; L es un engarce divalente; R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H2NCHRCOOH; M es un catión de un radionúclido; n o 1 o 0; y

30 un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo; y monitorizar la biodistribución de dicho compuesto en el animal.

Además, se desvelan:

1A. Un uso de un compuesto de fórmula:

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en la que V es un folato, siendo el folato un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo, o un derivado de unión al receptor de folato o un análogo del mismo; L es un engarce divalente;

5 R es una cadena lateral de un aminoácido; M es un catión de un radionúclido; n es 1 o 0; y k es 1 o 0; para la formación de imágenes de una población de células en un animal en el que se ha inyectado previamente

10 folato sin marcar. 2A. El uso de 1A, en el que el radionúclido del compuesto se selecciona del grupo que consiste en isótopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio. 3A. El uso de 1A o 2A, en el que el radionúclido del compuesto es un isótopo de tecnecio.

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células tumorales. 6A. El uso de 5A, en el que las células tumorales son células tumorales del ovario. 7A. El uso de uno cualquiera de 1A a 6A, en el que el compuesto es una forma de dosificación parenteral seleccionada del grupo que consiste en una forma de dosificación intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e intratecal. 8A. El uso de 7A, en el que la forma de dosificación es una forma de dosificación intravenosa.

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25 y un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo; en la que V es un folato, siendo el folato un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo, o un derivado de unión al receptor de folato o un análogo del mismo; L es un engarce divalente; R es una cadena lateral de un aminoácido;

30 M es un catión de un radionúclido; n es 1 o 0; y k es 1 o 0;

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en combinación con un folato sin marcar. 10A. La combinación de 9A, en la que el conjugado tiene la fórmula:

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11A. La combinación de 9A o 10A, en la que un catión de un radionúclido está unido al conjugado, donde el

5 radionúclido se selecciona del grupo que consiste en isótopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio. 12A. La combinación de uno cualquiera de 9A a 11A, en la que el radionúclido es un isótopo de tecnecio. 13A. La combinación de uno cualquiera de 9A a 12A, en la que el conjugado es una forma de dosificación adaptada a la administración parenteral. 14A. La combinación de 13A, en la que la forma de dosificación se selecciona del grupo que consiste en una

10 forma de dosificación intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e intratecal. 15A. La combinación de uno cualquiera de 9A a 14A, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable es un líquido. 16A. La combinación de 15A, en la que el vehículo líquido se selecciona del grupo que consiste en solución salina, glucosa al 5 %, alcoholes, glicoles, ésteres, amidas y una combinación de los mismos.

15 Ejemplo 1

Materiales

Se adquirió ácido N10-trifluoroacetilpteroico de Eprova AG, Schaffhausen, Suiza. Se adquirieron los reactivos para la síntesis de péptidos de NovaBiochem y Bachem. Syncor suministró el 99mTc-pertecnetato de sodio. Se preparó [Re02(en)2]Cl de acuerdo con Rouschias (Rouschias, G., Chem. Rev., 74:531 (1974)). Se adquirieron placas de

20 celulosa y placas de intercambio iónico de DEAE de J. T. Baker.

Ejemplo 2

Síntesis, purificación y caracterización analítica de EC20

Se preparó EC20 mediante un enfoque secuencial de soporte polimérico usando la estrategia de Fmoc (véase el Esquema 1 que se presenta a continuación; Fmoc = 9-fluorenilmetiloxicarbonilo; Boc = terc-butiloxicarbonilo; Dap = 25 ácido diaminopropiónico; DMF = dimetilformamida; DIPEA = diisopropiletilamina). Se sintetizó EC20 en una resina de Wang sensible a ácido cargada con Fmoc-L-Cys(Trt)-OH. Se aplicó hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-trispirrolidin-fosfonio (PyBOP) como reactivo activador para garantizar un acoplamiento eficaz usando equivalentes bajos de aminoácidos. Se eliminaron los grupos protectores de Fmoc tras cada etapa de acoplamiento en condiciones convencionales (piperidina al 20 % en DMF). Tras la última etapa de ensamblaje, se escindió el péptido

30 del soporte polimérico mediante el tratamiento con ácido trifluoroacético al 92,5 % que contenía etanoditiol al 2,5 %, triisopropilsilano al 2,5 % y agua desionizada al 2,5 %. Esta reacción también dio como resultado la eliminación simultánea de los grupos protectores de tritilo, Boc y t-Bu. Por último, se eliminó el resto de trifluoroacetilo en hidróxido de amonio acuoso, dando EC20.

Se purificó el producto EC20 bruto mediante HPLC usando una columna de 7 m, 30 x 300 mm, Xterra RP18

35 (Waters); fase móvil de HCl 32 mM (A), MeOH (B); condiciones de gradiente que parten con A al 99 % y B al 1 %, llegando a A al 89 % y B al 11 % en 37 min mediante un caudal de 20 ml/min. En estas condiciones, el monómero de EC20 normalmente eluyó a 14,38 min, mientras que el dímero de disulfuro de EC20 (contaminante minoritario) eluyó a 16,83 min. Todos los demás componentes mostrados en la Fig. 10 se pueden preparar usando un esquema de síntesis similar, a excepción de EC15, que se sintetiza como se muestra en el Esquema 2 que se presenta a

40 continuación.

Se disolvieron dos miligramos de EC20 purificado mediante HPLC en 0,62 ml de D2O2, y se recogió un espectro de RMN de 1H a 500 MHz. La Tabla 1 (véase a continuación) enumera los desplazamientos químicos, las formas de señal y los valores J para todos los protones no intercambiables en la molécula de EC20.

También se analizó EC20 mediante espectrometría de masas por electronebulización. Picos del ión positivo principal 45 (m/z, intensidad relativa): 746,1, 100; 747,1, 44; 556,8, 32; 570,8, 16.

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Esquema 1ª

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Tabla 1 Datos de RMN de 1H para EC20. Se disolvió EC20 en D2O y se recogió un espectro a 500 MHz. Los desplazamientos químicos () están en ppm. La señal para HOD a  = 4,80 ppm se usó como referencia, pD = 4,78; s = singlete; d = doblete; m = multiplete.

Residuo

Protones observados Desplazamiento químico () Señales Valores J

Pte

H-7 2 x H-9 H-12 a. H-16 H-13 a. H-15 8,76 4,64 7,68 6,8 s s d d 3J12,13 = 3J15,16 = 8,8 Hz

D-Glu

H-2 H-3a H-3B 2 x H-4 4,41 2,08 2,27 2,44 dd m m dd 3J2,3 = 39,1 Hz; 3J2,3b = 4,5 Hz 2J3a,3b = 14,2 Hz; 3J3a, 4 = 3J4b,4 = 5,6 Hz

Dpr

H-2 H-3A H-3B 4,1 3,52 3,72 dd; X del sistema ABX dd; A del sistema ABX dd; B del sistema ABX 3J2,3A-6,6 Hz; 3J2,3B = 4,7 Hz 2JA,B = 14,7 Hz

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(Continuación)

Residuo

Protones observados Desplazamiento químico () Señales Valores J

Asp

H-2 H-3A H-3B 4,71 2,62 2,81 dd; X del sistema ABX dd; A del sistema ABX dd; B del sistema ABX 3J2,3A = 9,5 Hz; 3J2,3B = 4,3 Hz 2JA,B = 16,1 Hz

Cys

H-2 H-3A H-3B 4,3 2,85 2,89 dd; X del sistema ABX dd; A del sistema ABX dd; B del sistema ABX 3J2,3A = 55 bz; 3J2,3B = 4,4 Hz 2JA,B = 14,1 Hz

Esquema 2ª

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5 Ejemplo 3

Preparación del vial de reactivo no radiactivo y de 99mTc-EC20

Se usaron kits de EC20 para la preparación de la sustancia farmacológica radiactiva de 99mTc-EC20. Cada kit contenía una mezcla liofilizada no pirógena, estéril, de 0,1 mg de EC20, 80 mg de -D-glucoheptonato de sodio, 80 mg de cloruro de estaño (II) dihidratado, y suficiente hidróxido de sodio o ácido clorhídrico para ajustar el pH a 6,8

10  0,2 antes de la liofilización. Se selló el polvo liofilizado en un vial de 5 ml bajo una atmósfera de argón. A continuación, se almacenaron los kits en congelación a -20 ºC hasta su uso o caducidad (la vida útil de almacenamiento actual es > 2 años). Es importante destacar que el componente cloruro de estaño (II) se requiere para reducir el 99mTc-pertecnetato añadido, mientras que el componente -D-glucoheptonato de sodio es necesario para estabilizar el 99mTc reducido recientemente antes de su quelación final para dar el compuesto EC20,

15 Se preparó 99mmTc-EC20 de la siguiente manera (es decir, quelación de 99mTc, dando EC20). En primer lugar, se preparó un baño de agua en ebullición que contenía un protector de vial de plomo parcialmente sumergido. Se limpió con hisopo la parte superior del vial de EC20 con etanol al 70 % para desinfectar la superficie y se colocó el vial en un recipiente de protección adecuado. Usando una jeringa protegida con aguja de calibre 27, se inyectó 1 ml de la inyección de 99mTc-pertecnetato de sodio estéril (de 15 a 20 mCi) en cloruro de sodio al 0,9 %, en el vial protegido. Antes de retirar la jeringa del vial, se extrajo un volumen de gas del vial igual al volumen de pertecnetato añadido con el fin de normalizar la presión en el interior del vial. Se agitó suavemente el vial durante 30 segundos para

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5 garantizar la completa disolución del polvo liofilizado. Luego, se colocó el vial en protector de plomo que estaba situado en el baño de agua en ebullición. Se calentó la disolución durante ~18 minutos y, a continuación, se enfrió hasta la temperatura ambiente durante un mínimo de 15 min. Esta disolución se puede almacenar a temperatura ambiente (15-25 ºC) protegida de la luz, pero se debe usar en un plazo de 6 horas de su preparación.

Se determinó la estabilidad radioquímica de la sustancia farmacológica radiactiva mediante HPLC tras su

10 almacenamiento a temperatura ambiente protegida de la luz durante hasta 24 horas. Se analizaron muestras de la solución de 99mTc-EC20 (20 l) usando un sistema de HPLC que consistía en un sistema de administración de múltiples disolventes 600E de Waters y un detector UV 490, un radiodetector EC-3200 de Bioscan, un programa informático de radiocromatograma Laura v1.5 y una columna C18 (3,9 x 150 mm) Nova-Pak de Waters. Se eluyeron isocráticamente las muestras inyectadas usando una fase móvil acuosa que contenía metanol al 20% y ácido

15 trifluoroacético al 0,1 % a un caudal de 1 ml/min. Se monitorizó el análisis por HPLC tanto con el detector UV (280 mm) como con el radiodetector de rayos gamma. En particular, la pureza radioquímica de 99mTc-EC20 se mantuvo superior al 90 % durante al menos 24 horas en todos los casos.

Ejemplo 4

Determinación de la pureza radioquímica de 99mTc-EC20 mediante CCF

20 Las impurezas radioquímicas principales en la preparación de 99mTc-EC20 serán 1) 99mTc-pertecnetato, 2) 99mTcglucoheptonato (precursor de intercambio de ligando), 3) 99mTc de unión inespecífica (99mTc unido a un sitio diferente del resto quelante Dap-Asp-Cys esperado de la molécula EC20) y 4) 99mTc hidrolizado. Dado que se estaba analizando el 99mTc-EC20 para determinar su posible uso clínico, se desarrolló un procedimiento a base de tres CCF para determinar las cantidades de cada impureza y estimar la pureza radioquímica global de 99mTc-EC20.

25 En el primer sistema, se reveló una placa de celulosa con agua desionizada. 99mTc-EC20, 99mTc-glucoheptonato, 99mTc de unión inespecífica y 99mTc-pertecnetato se mueven hacia el frente de disolvente (Rf = 1,0), mientras que 99mTc hidrolizado permanece en el origen (Rf = 0,0). Se cortó la placa de celulosa en dos fragmentos a Rf = 0,3 (1,5 cm del origen) y se realizó el recuento en cada fragmento usando un calibrador de dosis. Se calculó el porcentaje de 99mTc hidrolizado de la siguiente manera: A = % de hidrolizado; 99mTc = (Ci en el fragmento

30 inferior/Ci en ambos fragmentos) x 100.

En el segundo sistema, se reveló una placa de celulosa con acetona y NaCl al 0,9 % (7:3, v/v). El 99mTc-pertecnetato se mueve con Rf = 0,9, mientras que 99mTc-EC20, 99mTc-glucoheptonato, 99mTc de unión inespecífica y 99mTc hidrolizado permanecen en el origen (Rf = 0,0). Se cortó la placa de celulosa/acetona-solución salina en dos fragmentos a Rf = 0,6 (3,0 cm del origen) y se realizó el recuento en cada fragmento usando un calibrador de dosis.

35 Se calculó el porcentaje de 99mTc-pertecnetato de la siguiente manera: B = % de 99mTc-pertecnetato = (Ci en el fragmento superior/Ci en ambos fragmentos) x 100.

Por último, en el tercer sistema, se reveló una placa de intercambio iónico de DEAE con Na2SO4 0,3 M. El 99mTcglucoheptonato se mueve hacia el frente de disolvente (Rf = 1,0), 99mTc de unión inespecífica se mueve con Rf = 0,6 y 99mTc-EC20, 99mTc hidrolizado y 99mTc-pertecnetato permanecen cerca del origen (99mTc-EC20, Rf = 0,1; 99mTc

40 hidrolizado: Rf = 0,0; 99mTc-pertecnetato: Rf = 0,3). Se cortó la placa de celulosa/Na2SO4 en dos fragmentos a 2,5 cm del origen y se realizó el recuento en cada fragmento usando un calibrador de dosis. Se calculó el porcentaje de 99mTc-glucoheptonato y 99mTc de unión inespecífica de la siguiente manera: C = % de (99mTc-glucoheptonato + 99mTc de unión inespecífica) = (Ci en el fragmento superior/ Ci en ambos fragmentos) x 100. Se calculó entonces la pureza radioquímica global de 99mTc-EC20 de la siguiente manera: pureza radioquímica = 100 -(A+B+C).

45 Como se muestra en la Fig. 2, el análisis por HPLC de la formulación 99mTc-EC20 muestra cuatro componentes radioquímicos, denominados picos A a D. Se confirmó que el pico A era 99mTc libre y este subproducto está presente de manera reproducible a < 2 %. El pico B, que era diferente del de 99mTc-glucoheptonato (no se muestran los datos), eluyó con un tiempo de retención de 2,8 min. Este componente representó aproximadamente el 3 % de la mezcla y se creía que resultaba de la quelación de 99mTc en algún otro sitio de la molécula de EC20, además del

50 resto Dap-Asp-Cys esperado. Los picos C y D (tiempos de retención de 4,8 minutos y 13,2 minutos, respectivamente), representan la mayoría de la actividad radioquímica formulada.

Ejemplo 5

Síntesis de Re-EC20

Se disolvieron cincuenta y dos mg (0,010 mmol) de EC20 y [ReO2(en)2]Cl (52 mg, 0,14 mmol) en 6 ml y 1 ml de

55 tampón fosfato purgado con argón (0,05 M, pH 5,8), respectivamente. Se combinaron las dos soluciones y se calentaron bajo una atmósfera de argón en un baño de agua en ebullición durante 2 horas. Se congeló y se liofilizó durante una noche la mezcla de reacción. Se purificó el producto bruto mediante HPLC (columna Xterra RP18, 19 x 150 mm, NH4OAc 10 mM/CH3CN, caudal de 10 ml/mm; gradiente del 1 % al 8 %). Se recogieron las fracciones, se liofilizaron y se almacenaron a -20 ºC hasta su uso.

imagen39

Debido a la falta de instalaciones para espectros de masas para el análisis de materiales radiactivos, se analizó el

5 análogo de renio no radiactivo, Re-EC20. Tanto el renio como el tecnecio son metales del grupo VIIA que tienen una similitud significativa en cuanto a las propiedades químicas y físicas. También forman complejos similares con ligandos orgánicos. Este comportamiento químico análogo, con frecuencia, se ha usado en el esclarecimiento de las estructuras de nuevas clases de productos radiofarmacéuticos de tecnecio basados en análogos de renio no radiactivos. De manera interesante, el análisis por HPLC de Re-EC20 también mostró dos picos principales que

10 eluyeron a 5 y 14,2 minutos, respectivamente, similares a los picos C y D para 99mTc-EC20 (cromatograma no mostrado). El análisis de espectros de masas confirmó que estos dos componentes eran isómeros correspondientes al complejo Re-EC20 (m/z = 945). De hecho, es probable que estas especies fueran diastereómeros que poseían una configuración bien syn o anti del enlace de oxígeno del tecnecio en el anillo quelante Dap-Asp-Cys, como se representa en la Fig. 3. Debido a que i) los dos picos del cromatograma de Re-EC20 representan complejos

15 isoméricos, y ii) existen informes sobre el isomerismo similar en complejos de tecnecio, es probable que los componentes C y D del radiocromatograma de 99mTc-EC20 también sean isómeros.

Ejemplo 6

Cultivo celular

Se cultivaron células de manera continua en forma de una monocapa usando medio RPMI libre de folato (FFRPMI)

20 que contenía suero de ternero fetal inactivado por calor (HIFCS) al 10 % a 37 ºC en una atmósfera de CO2 al 5 %/humidificada con aire al 95 % sin antibióticos. El HIFCS contenía su complemento normal de folatos endógenos que permitió que las células crecieran de manera sostenida en este medio más fisiológicamente apropiado. Todos los experimentos celulares se realizaron usando FFRPMI que contenía HIFCS al 10 % (FFRPMYHIFCS) como medio de crecimiento, excepto cuando se indica lo contrario.

25 Ejemplo 7

Ensayo de afinidad relativa

Se determinó la afinidad relativa de diversos derivados de folato de acuerdo con el procedimiento descrito por Westerhoff et al. (Mol. Pharm., 48:459-471 (1995)) con una ligera modificación. En resumen, se tripsinizaron ligeramente células KB positivas en RF en tripsina al 0,25 %/PBS a temperatura ambiente durante 3 minutos, y se 30 diluyeron después en FFRPMNUFCS. Tras una centrifugación de 800 x g durante 5 minutos y un lavado con PBS, se suspendió el sedimento de células final en FFRPMI 1640 (sin suero). Se incubaron las células durante 15 min en hielo con 100 nM de 3H-ácido fólico en ausencia y presencia de concentraciones crecientes de artículos de ensayo que contenían folato. Se centrifugaron las células a 10.000 x g durante 5 min, se suspendieron los sedimentos de células en tampón, se transfirieron a viales individuales que contenían 5 ml del cóctel de centelleo y, a continuación, 35 se realizó el recuento para determinar la radiactividad. Los tubos de control negativo solo contenían el 3H-ácido fólico en FFRPMI (sin competidor). Los tubos de control positivo contenían una concentración final de ácido fólico 1 mM, y las CPM medidas en estas muestras (que representan la unión inespecífica del marcador) se restaron de todas las muestras. En particular, las afinidades relativas se definieron como la proporción molar inversa del compuesto requerido para desplazar el 50 % de 3H-ácido fólico unido a RF de KB, y la afinidad relativa del ácido fólico por el RF

40 se estableció en 1.

La capacidad de EC20 para competir de manera directa con el ácido fólico para unirse a los RF de superficie celular se midió usando este ensayo. Es importante destacar que un valor de afinidad relativa de 1,0 implica que el ligando del artículo de ensayo tiene una afinidad por el RF igual al ácido fólico. Así mismo, los valores inferiores a la unidad reflejan una afinidad más débil y los valores superiores a la unidad reflejan una afinidad más fuerte.

45 Se incubaron células KB cultivadas con 3H-ácido fólico 100 nM en presencia de concentraciones crecientes de ácido fólico no radiactivo, EC20, renio-EC20 (isómero A; pico C), renio-EC20 (isómero B; pico 0) o un producto radiofarmacéutico a base de folato relacionado, DTPA-folato. Tras una incubación durante 15 minutos a 4 ºC, se enjuagaron las células libres de material sin unir y se realizó el recuento para determinar la radiactividad asociada a las células residuales. La cantidad de radiactividad unida se representó frente a la concentración del ligando sin

50 marcar, y se estimaron los valores de CI50 (concentración de ligando necesaria para bloquear el 50 % de unión del 3H-ácido fólico). Como se muestra en la Fig. 4 y la Tabla 2 (que se presenta a continuación), se determinó que EC20 tenía una afinidad de 0,92 con respecto a la del ácido fólico por los RF humanos. Ambos isómeros de renio-EC20 mostraron valores de afinidad relativa que eran muy similares a, si no mejores que, la molécula de EC20 precursora (1,42 y 1,37 para el isómero A e isómero B de Re-EC20, respectivamente). El DTPA-folato, un agente

55 radiofarmacéutico de folato que quela a 111In, mostró una afinidad relativa de 0,87 por el receptor de folato. Por lo tanto, la modificación química de folato con diversos motivos quelantes de metal no alteró la afinidad intrínseca de la vitamina por el RF.

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Tabla 2. Estimaciones de la afinidad relativa. Las afinidades relativas (AR) se definieron como la proporción molar inversa de compuesto requerido para desplazar el 50 % del 3H-ácido fólico unido a células KB positivas en RF. La afinidad relativa del ácido fólico se estableció en 1. Se evaluó cada artículo de ensayo por triplicado.

Artículo de ensayo

CI50 (nM) D.E. AR D.E.

Ácido fólico

118  19 1,00

EC20

128  25 0,92  0,23

Isómero 1 de EC20:Re

83  16 1,42  0,36

Isómero 2 de EC20:Re

86  3 1,37  0,23

DTPA-folato

136  12 0,87  0,16

Ejemplo 8

5 Captación celular dependiente del tiempo

Se sembraron células KB en placas Falcon de 12 pocillos y se permitió la formación de monocapas subconfluentes durante una noche. Tras un enjuague con 1 ml de FFRPMI/HIFCS recién preparado, cada pocillo recibió 1 ml de FFRPMI/HIFCS que contenía 99mTc-EC20 10 nM. Se incubaron las células durante tiempos predeterminados a 37 ºC y, a continuación, se enjuagaron cuatro veces con 1 ml de PBS enfriado con hielo, pH 7,4. Se disolvieron las 10 monocapas de células en 0,5 ml de PBS, pH 7,4 que contenían dodecilsulfato de sodio al 1 % durante 15 min a temperatura ambiente y luego se realizó el recuento para determinar la radiactividad usando un contador de rayos gamma de Packard. Se cuantificó la proteína en cada muestra usando un kit de ensayo de proteínas DC de BioRad, y los valores de proteína celular se convirtieron en número de células usando el factor de conversión de 2,23 x 107 mg de proteína por célula. Se expresaron los valores tabulados finales en términos de moléculas de EC20 por

15 célula.

Usando este protocolo, se midió la cinética de captación de 99mTc-EC24 en células KB positivas en RF. Como se muestra en la Fig. 5, se alcanzó la captación en estado estacionario en el plazo de dos horas a 37 ºC, en el que aproximadamente 3,2 millones de moléculas de EC20 estaban asociadas a células, mientras que la mitad de la asociación celular máxima se produjo 9 minutos después de mezclar 10 nM de este producto radiofarmacéutico con

20 las células. Lo interesante es que la mitad del punto de saturación máximo se alcanzó en solo 37 segundos cuando se incubaron las células con una concentración 10 veces superior de 99mTc-EC20 (100 nM; datos no mostrados).

Ejemplo 9

Captación celular dependiente de la concentración

Se sembraron células KB en placas Falcon de 12 pocillos y se permitió la formación de monocapas subconfluentes

25 durante una noche. Tras un enjuague con 1 ml de FFRPMI/HIFCS fresco, cada pocillo recibió 1 ml de FFRPMI/HIFCS que contenía concentraciones crecientes de 99mTc-EC20. Se incubaron las células durante 2 horas a 37 ºC y luego se enjuagaron cuatro veces con 1 ml de PBS enfriado con hielo, pH 7,4. Se disolvieron las monocapas en 0,5 ml de PBS, pH 7,4 que contenían dodecilsulfato de sodio al 1 % durante 15 min a temperatura ambiente y, a continuación, se realizó el recuento para determinar la radiactividad usando un contador de rayos gamma de

30 Packard. Se determinó el contenido de proteína como se ha descrito anteriormente, y se expresaron los valores tabulados finales en términos de moléculas de EC20 por célula.

Como se muestra en la Fig. 6, se descubrió que la captación celular de 99mTc-EC20 dependía de la concentración extracelular. Se determinó que las células KB usadas en particular se unían a un máximo de cuatro millones de moléculas del producto radiofarmacéutico de folato por célula. El análisis de Scatchard de los datos estimó que la KD

35 de unión era 3,2 nM, un valor comparable con la KD observada para la unión de la vitamina folato con estas mismas células.

Aunque no se estableció la identidad completa del componente del pico B, el análisis de absorción UV indicó que contenía un resto de folato (es decir, el espectro de absorción contenía el pico de absorción secundario característico del folato a 363 nm). Se recogió este material radiomarcado purificado mediante HPLC (material del 5 formulación minoritario también se puede dirigir a células positivas en RF con fines radiodiagnósticos.

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Ejemplo 10

Aclaramiento sanguíneo

Se mantuvieron los animales usados para el presente estudio con una dieta libre de folato (Harlan Nº TD-90261) durante aproximadamente tres semanas antes de la administración de la dosis. La aclimatación a esta dieta especial

10 es esencial, porque las dietas para roedores habituales contienen grandes cantidades de ácido fólico (6 mg/kg de comida) y promueven altos niveles de folato sérico en ratones. Además, estudios anteriores han demostrado que los ratones sometidos a una dieta libre de folato durante 3 semanas mantuvieron un nivel de folato sérico seguro de 25  7 nM, que es ligeramente superior a la concentración de 9-14 nM medible en el suero humano.

Se preparó la solución de 99mTc-EC20 el día de su uso que contenía inicialmente 100 g de EC20 por mililitro. Se

15 diluyó adicionalmente la solución con solución salina estéril para preparar las soluciones madre de trabajo. Se estimó mediante CCF que la pureza radioquímica del producto era del ~94 %. Cada animal recibió una dosis de 50 g/kg de EC20 (67 nmol/kg) en un volumen i.v. de aproximadamente 0,1 ml a través de la vena de la cola durante una breve anestesia con éter dietílico. A los tiempos designados (véase la Fig. 8) posteriores a la inyección, se sacrificó cada animal mediante asfixia con CO2, y se extrajo inmediatamente sangre mediante punción cardiaca.

20 Como se muestra en la Fig. 8, el 99mTc-EC20 se eliminó rápidamente de la circulación en el ratón Balb/c. Se estimó que la semivida plasmática de este producto radiofarmacéutico fue de ~4 minutos, y menos del 0,2 % de la dosis de99mTc-EC20 inyectada permaneció en circulación después de cuatro horas (suponiendo que la sangre representa el 5,5 % de la masa corporal total). Estos datos indican que los conjugados de folato se eliminan rápidamente de la circulación tras la administración intravenosa, y que se pueden obtener datos de biodistribución tisular valiosos

25 transcurridas solo unas cuantas horas de la inyección sin la preocupación de que se produzca una captación tisular inespecífica debido a la radiactividad transmitida por la sangre.

Ejemplo 11

Estudios de distribución tisular

Se evaluó la capacidad de 99mTc-EC20 para dirigirse a tumores in vivo usando un modelo M109 positivo en RF.

30 Estas células tumorales son singénicas para el ratón Balb/c y forman de manera reproducible tumores sólidos subcutáneos en el plazo de dos semanas tras la inoculación. También se evaluaron en este bioensayo 99mTc-EC14, que es estructuralmente similar a 99mTc-EC20, a excepción de que contiene un residuo de D-Glu adicional (es decir, Pte-D-Glu-D-Glu-Dpr-Asp-Cys), 99mTc-EC28 (un control que no contiene pteroato que consiste en benzoil-D-Glu-n-Glu-Dpr-Asp-Cys) y el producto radiofarmacéutico de 111In-DTPA-folato previamente publicado. Es importante

35 destacar que el agente de control 99mTc-EC28 no se unirá a los RF de la superficie celular, porque carece de un resto de anillo de pteridina esencial.

Se adquirieron ratones (raza Balb/c) de cuatro a cinco semanas de edad de Harlan Sprague Dawley, Inc. (Indianápolis, IN) y se mantuvieron con una dieta libre de folato durante un total de tres semanas antes del experimento. Se inocularon células tumorales M109 positivas en RF, singénicas (1 x 106 por animal) en el tejido 40 subcutáneo de la axila derecha dos semanas antes del experimento. Todos los ratones eran hembras, y los pesos de los tumores eran de 54,2  29,8 mg el día del experimento. Se preparó una solución madre de 99mTc-EC20 que contenía 100 g del agente por mililitro el día de su uso, y tenía una pureza radioquímica era de > 96 %. También se prepararon los dos agentes quelantes de 99mTc adicionales, 99mTc-EC14 y 99mTc-EC28, así como 111In-DTPA-folato hasta una pureza radioquímica > 90 %. Se diluyeron todas las soluciones bien solo con solución salina o con una

45 solución salina que contenía 100 equivalentes de ácido fólico (para competencia) de manera que la concentración del producto radiofarmacéutico final resultó ser de 10 umol/ml.

Los animales recibieron una dosis i.v. de aproximadamente 40 mol/kg del artículo de ensayo en un volumen de 100 l a través de una vena lateral de la cola durante una breve anestesia con éter dietílico. Cuatro horas después de la inyección, se sacrificaron los animales mediante asfixia con CO2 y se diseccionaron. Se extirparon los tejidos

50 seleccionados, se pesaron y se realizó el recuento para determinar la distribución de 99mTc. Se corrigieron los valores de CPM por la degradación y se tabularon los resultados como el % de dosis inyectada por gramo de peso húmedo de tejido.

Como se muestra en la Tabla 3 (que figura a continuación), los tres productos radiofarmacéuticos que contenían "folato", 99mTc-EC14, 99mTc-EC20 y 111In-DTPA-folato, se acumularon predominantemente en los riñones y el tumor 55 positivo en RF; sin embargo, los riñones concentraron un porcentaje superior de dosis inyectada por gramo de tejido (% de DI/g) que el tumor. Lo interesante es que la acumulación neta del tumor de 111In-DTPA-folato y 99mTc-EC20

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fue casi la misma (19 y 17 % de DI/g, respectivamente), mientras que la captación del tumor de 99mTc-EC14 fue algo inferior al ~10 % de DI/g. No obstante, los tres agentes mostraron altas proporciones de tumor con respecto a la sangre (de > 30 a 1).

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Tabla 3. Biodistribución de productos radiofarmacéuticos de folato en ratones Balb/c que tienen tumores M109 subcutáneos

% de dosis inyectada por gramo de tejido (4 h después de la inyección intravenosa)*

99mTc-EC14

99mTc-EC14 + Ácido fólico 99mTc-EC20 99mTc-EC20 + Ácido fólico 111In-DTPA-Folato 111In-DTPA-Folato + Ácido fólico 99mTc-EC28

Sangre Corazón Pulmón Hígado Bazo Intestino Riñón Músculo Estómago Tumor Tumor/ Sangre

0,31  0,14 2,39  0,64 2,08  0,40 3,44  2,19 2,68  2,49 1,70  0,55 98,0  40,7 0,99  0,28 1,47  0,58 9,83  2,77 34,1  7,41 0,19  0,07 0,08  0,01 0,15  0,04 1,37  0,98 2,99  1,43 0,32  0,11 5,94  0,52 0,09  0,11 0,10  0,03 0,43  0,52 2,00  2,00 0,34  0,03 1,57  0,26 2,22  0,63 3,56  0,25 0,95  0,15 2,56  0,61 1,38  12,4 0,67  0,20 1,45  0,55 17,2  1,02 51,0  8,20 0,09  0,02 0,08  0,01 0,31  0,26 1,15  0,22 0,38  0,33 2,93  1,49 5,64  2,13 0,06  0,02 3,35  5,19 0,45  0,18 4,70  1,30 0,21  0,10 257  0,82 1,72  0,61 5,21  2,63 3,30  2,33 1,87  0,69 1,91  79,2 1,19  0,48 1,62  0,65 19,3  5,86 102  43,4 0,09  0,04 0,06  0,02 0,09  0,2 0,81  0,03 1,46  0,73 0,82  0,14 3,14  1,96 0,05  0,04 0,25  0,20 0,46  0,42 5,00  4,60 0,06  0,04 0,03  0,01 0,05  0,01 0,50  0,26 0,60  0,38 0,47  0,19 0,62  0,14 0,02  0,01 0,21  0,19 0,11  0,06 2,00  0,50

* Los valores mostrados representan la media  la D.E. de los datos de 3 animales.

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Se demostró además la dirección específica hacia el folato mediante dos procedimientos distintos. En primer lugar, se bloqueó de manera eficaz (> 94 %) la acumulación de 99mTc-EC14, 99mTc-EC20 y 111In-DTPA-folato en el tumor positivo en RF y en los riñones al administrar conjuntamente estos agentes con un exceso de 100 veces de ácido fólico. En segundo lugar, el agente de control 99mTc-EC28 no se acumuló de manera apreciable en los riñones ni en

5 el tumor. Ambas observaciones muestran que se requiere un resto "de tipo folato" (o pteroato) intacto para proporcionar la captación dirigida y la retención de estos agentes radiofarmacéuticos en los tejidos positivos en RF.

Ejemplo 12

Gammagrafía

Se inocularon células tumorales M109 (1 x 106 por animal) en el tejido subcutáneo de la axila derecha de ratones

10 Balb/c dos semanas antes del experimento. Los animales recibieron una dosis i.v. de aproximadamente 50 mol/kg del artículo de ensayo en un volumen de 100 l a través de una vena lateral de la cola durante una breve anestesia con éter dietílico. Cuatro horas después de la inyección, se sacrificaron los animales mediante asfixia con CO2 y se colocaron después en la parte superior de una superficie de adquisición de imágenes. Se realizó la adquisición de imágenes de todo el cuerpo durante 1 minuto y a una velocidad de recuento de 50-75.000 recuentos por minuto

15 usando una cámara para rayos gamma radioisótopos Sigma 410 Omega 500 de Technicare. Se analizaron todos los datos usando un ordenador basado en MS-DOS de Medasys dotado del programa informático Pinnacle de Medasys.

Usando este protocolo de gammagrafía, se demostró la captación de 99mTc-EC20 por los tumores M109 positivos en RF y los riñones. Como se muestra en la Fig. 9, una imagen ventral de un ratón al que se inyectó 99mTc-EC20 como se ha descrito anteriormente localiza la radiación gamma en los dos riñones (K) y la masa tumoral M109 (T; zona del

20 hombro). No se observó ningún radiotrazador apreciable en otros tejidos corporales. Se ha informado de un perfil de imagen similar para el producto radiofarmacéutico 111In-DTPA-folato.

Ejemplo 13

Excreción urinaria y metabolismo

Se obtuvo el perfil de especiación por HPLC urinario de 99mTc-EC20 usando ratones Balb/c. Se inyectó a los ratones

25 (cada uno de ~20 g) 1 mCi (6,7 nmol) de 99mTc-EC20 a través de una vena lateral de la cola. Tras un período de tiempo de 1, 4 o 6 horas, se sacrificaron grupos de dos ratones mediante asfixia con CO2 y se recogió la orina. Tras la filtración a través de un filtro Millex GV13, se evaluó la especiación radioquímica usando un sistema de HPLC dotado de una columna C18, de 3,9 x 150 mm, Nova-Pak y un detector radioquímico. Se eluyó isocráticamente el sistema con metanol al 20 % que contenía TFA al 0,1 % a un caudal de 1 ml/minuto.

30 Se determinó previamente que la vía de eliminación principal del 111In-DTPA-folato era a través de la orina. De manera similar al perfil de HPLC mostrado en la Fig. 2, tanto el patrón de 99mTc-EC20 como las muestras de orina presentaron cuatro picos radiactivos. Como se muestra en la Tabla 4 (que figura a continuación), la pureza radioquímica del patrón (suma de los picos C y D presumiblemente correspondientes a 99mTc-EC20 syn y anti) permaneció constante al ~93 % durante las 6 horas que duró el presente experimento. La cantidad de 99mTc libre en

35 el patrón (pico A) fue del ~2 %. Es importante destacar que se cree que el pico B de este perfil radioquímico es EC20 quelado con 99mTc en una posición menos estable, no convencional; sin embargo, no se incluyó la radiactividad medida en esta fracción en la estimación de la pureza radioquímica global para 99mTc-EC20. Estos datos indican, en conjunto, que la formulación permaneció estable en solución salina a largo de estas 6 horas de investigación.

40 Después de 1 y 4 horas posteriores a la inyección en ratones Balc/C, el perfil de especiación radioquímica de 99mTc-EC20 en la orina del ratón permaneció invariable. Sin embargo, la radiactividad presente en la orina a las 6 horas de la inyección fue demasiado baja para someterse a ensayo de manera precisa mediante HPLC. La proporción de fármaco original entre las especies radiactivas recuperadas en la orina permaneció relativamente constante al aproximadamente 90 % a lo largo de las cuatro horas durante las cuales se pudo cuantificar. Este valor es muy

45 similar a la pureza del 93 % del patrón que indica que el 99mTc-EC20 se excreta predominantemente en la orina en una forma no modificada.

imagen45

Tabla 4. Excreción y metabolismo de 99mTc-Ec20 de los ratones Balb/c. Se inyectó a los ratones 1 mCi (6,7 nmol) de 99mTc-EC20 a través de una vena lateral de la cola. En los puntos temporales indicados, se sacrificaron grupos de dos ratones y se extrajo la orina. A continuación, se determinó la especiación radioquímica mediante HPLC. La suma de los picos C y D (isómeros syn y anti) en porcentaje de superficie se usa para calcular la pureza global de 99mTc-Ec20 intacto.

Pico

t.a. (min) Porcentaje de superficie

Patrón de 99mTc-EC20

Muestras de orina (dos ratones/punto temporal)

0 h

1 h 6 h 1 h 4 h

A (pertecnetato)

1,4 2 2,1 1,8 8,3 6,3 9,4 10,2

B (desconocido)

3,4 4,5 4,5 4,8 2,5 2,6 5,4 0

C (isómero 1)

5,5 15,5 15,7 15,9 20,4 18,1 7,3 11,1

D (isómero 2)

18,5 78 77,7 77,5 68,8 73 77,9 78,7

Suma de C y D

93,5 93,4 93,4 89,2 91,1 85,2 89,8

Ejemplo 14

Unión de proteína sérica

Se usaron suero de rata recién preparado y suero comercial de ser humano varón (donantes de tipo AB, Sigma

10 Chemical Co.) para evaluar la unión in vitro de 99mTc-EC20 con proteínas séricas. Un minuto después de mezclar el 99mTc-EC20 con 1 ml de suero a temperatura ambiente, se transfirieron 0,3 ml de la solución de suero a un dispositivo de ultrafiltración limpio Centrifree de Amicon (30.000 NMWL) por triplicado. Durante un minuto de carga de la centrifugadora con la solución de suero, se centrifugó el dispositivo a 1.000 x g durante 20 minutos a 20 ºC. Se transfirieron 50 l de muestras de la solución original, y del filtrado de cada dispositivo, a un tubo limpio y se realizó

15 el recuento en un contador gamma automático. Se ultrafiltró una solución de control de 99mTc-EC20 mezclada con 1 ml de solución salina normal de una manera idéntica. Se calculó el porcentaje de 99mTc libre para cada una de las tres muestras.

Aunque el 99mTc-EC20 solo presentó un nivel menor de unión inespecífica con el dispositivo de ultrafiltración (5 %), se descubrió que aproximadamente el 70 % del mismo se asoció predominantemente con la fracción de proteína

20 sérica de > 30 kDa en soluciones suero de rata o humano (69 % y 72 %, respectivamente). Es importante destacar que, como el 99mTc-EC20 se acumula eficaz y preferentemente dentro de los tejidos positivos en RF (véase la Tabla 2 y la Fig. 8), su evidente afinidad por las proteínas séricas no parece afectar a la capacidad de este radiotrazador para dirigirse a los RF in vivo.

Ejemplo 15

25 Estudios de distribución tisular

Los protocolos usados en el presente ejemplo son similares a los descritos en el Ejemplo 11. Se evaluó además la capacidad de 99mTc-EC20 para dirigirse a tumores in vivo usando un modelo M109 positivo en RF y un modelo de tumor 4T1 negativo en RF. Se adquirieron ratones Balb/c hembra de seis semanas de edad (n = 3/grupo de dosis) de Harlan Sprague Dawley, Inc. (Indianápolis, IN) y se mantuvieron con una dieta libre de folato (Harlan TEKLAD)

30 durante un total de siete días antes de la inoculación de las células tumorales.

Se inocularon células tumorales M109 positivas en RF, singénicas (2 x 106 P0 por animal) o células 4T1 negativas en RF (5 x 105 P0 por animal) subcutáneamente en 100 l de RPMI-1640 libre de folato que contenía suero murino singénico. Se preparó una solución madre de 99mTc-EC20 que contenía 100 g de agente por mililitro el día que se usó como se ha descrito anteriormente.

35 Dieciséis días después de la inoculación de las células tumorales, se inyectaron a los animales por vía intravenosa 500 o 1.800 nmol/kg de EC20 para los animales portadores de tumores M109 y 500 nmol/kg de EC20 para los animales portadores de tumores 4T1 (3 ratones por grupo de dosis). Todas las inyecciones fueron en volúmenes de 100 l. Cuatro horas después de la inyección, se sacrificaron los animales por asfixia con CO2, se extrajo la sangre por punción cardiaca y se diseccionaron los animales. Se extirparon los tejidos seleccionados (corazón, pulmones, hígado, bazo, riñones, intestinos, estómago, musculares y tumorales), se pesaron y se realizó el recuento en un contador gamma automático para determinar la distribución de 99mTc. La captación del producto radiofarmacéutico en términos de porcentaje de dosis inyectada de peso húmedo de tejido (% DI/g) se calculó por referencia a

imagen46

5 patrones preparados a partir de diluciones de la preparación inyectada.

Como se muestra en la Fig. 11, se demostró la dirección específica al receptor de folato, porque el 99mTc-EC20 se acumuló predominantemente en los tumores M109 positivos en RF y en los riñones, y no en los tumores 4T1 negativos en RF. La captación en los tumores 4T1 negativos en RF fue 7,6 veces inferior que en los tumores M109 positivos en RF. La captación de 99mTc-EC20 en los tejidos normales, a excepción, como era de esperar, del riñón,

10 fue baja. Estos resultados muestran que la dirección de 99mTc-EC20 es específica de los RF.

Ejemplo 16

Estudios de distribución tisular

Los protocolos usados en el presente ejemplo son similares a los descritos en el Ejemplo 11. Se evaluó la capacidad de 99mTc-EC11 (péptido A1), 99mTc-EC13 (péptido A3) y 99mTc-EC14 (péptido A2) para dirigirse a tumores in vivo 15 usando un modelo de tumor KB positivo en RF. Se mantuvieron ratones atímicos macho de cuatro semanas de edad (n = 4/grupo) a una dieta libre de folato durante un total de diez días antes de la inoculación de las células tumorales.

Se inocularon células tumorales KB positivas en RF (0,25 x 106 por animal) subcutáneamente en la región intracapsular. Catorce días después de la inoculación de las células tumorales, se inyectaron a los animales (n = 4/grupo) por vía intravenosa 99mTc-EC11, 99mTc-EC13 y 99mTc-EC14 a las dosis (aproximadamente 12 g/kg) de los 20 conjugados mostrados en la Tabla 5 que figura a continuación. Las soluciones madre de 99mTc-EC11, 99mTc-EC13 y 99mTc-EC14 se prepararon el día de su uso como se ha descrito anteriormente. Se administró conjuntamente un exceso de aproximadamente 20 veces de folato libre (unos 200 g/kg) a los animales de control (n = 4/grupo). Cuatro horas después de la inyección, se sacrificaron los animales por asfixia con CO2, se extrajo la sangre por punción cardiaca y se diseccionaron los animales. Se extirparon los tejidos seleccionados, se pesaron y se realizó el

25 recuento en un contador gamma automático para determinar la distribución de 99mTc. La captación del producto radiofarmacéutico en términos de porcentaje de dosis inyectada de peso húmedo de tejido (% DI/g) se calculó por referencia a patrones preparados a partir de diluciones de la preparación inyectada.

Como se muestra en la Tabla 5, se demostró la dirección específica al receptor de folato porque 99mTc-EC11, 99mTc-EC13 y 99mTc-EC14 se acumularon predominantemente en los tumores KB positivos en RF y en los riñones. La

30 acumulación fue bloqueada por la administración de ácido fólico libre. Estos resultados muestran que 99mTc-EC11, 99mTc-EC13 y 99mTc-EC14 se pueden dirigir a tumores in vivo de manera específica de los RF.

Se obtuvieron resultados similares (véase la Tabla 6 que figura más adelante) con 99mTc-EC53 (el enantiómero D completo de EC20) usando protocolos similares, a excepción de que la dosis de 99mTc-EC53 fue de aproximadamente 50 g, y que se usó un exceso 100 superior de folato libre o EC53 frío. Como se muestra en la

35 Tabla 6, se demostró la dirección específica del receptor de folato, porque el 99mTc-EC53 se acumula predominantemente en los tumores KB positivos en RF y en los riñones. La acumulación fue bloqueada por la administración de ácido fólico libre. Estos resultados muestran que 99mTc-EC53 se puede dirigir a tumores in vivo de manera específica del RF.

TABLA 5 (Continuación)

Porcentaje de dosis de 99mTc inyectada por gramo (Masa húmeda de tejido)

Péptido A1-Folato (EC 11)

Péptido A2-Folato (EC14) Péptido A3-Folato (EC13) HYNIC-Folato

Masa tumoral (g):

0,112  0,027 0,125 ± 0,032 0,160 ± 0,037 0,171 ± 0,044 0,213 ± 0,067 0,0773 ± 0,041 0,179 ± 0,060 0,150 ± 0,068

Masa del animal (g):

28,9 ± 1,3 27,1 ± 1,6 27,6 ± 0,6 27,3 ± 2,7 30,0 ± 1,3 27,5 ± 1,4 27,5 ± 1,4 29,0 ± 2,0

Cantidad de animales y género:

4M 4M 4M 4M 4M 4M 4M 4M

Dosis de conjugado de folato (g/kg):

11,9 ± 0,5 13,04 ± 1,12 12,6 ± 0,4 12,87 ± 1,53 11,7 ± 0,9 13,03 ± 1,05 1,58 ± 0,03 1,46 ± 0,08

Dosis de ácido fólico dihidratadot (g/kg): (mol/kg):

0 0 195,1 ± 17,9 0,41 ± 0,04 0 0 192,6 ± 22,9 0,40 ± 0,05 0 0 191,7 ± 15,5 0,40 ± 0,03 0 0 169,6 ± 9,4 0,36 ± 0,02

imagen47

Porcentaje de dosis de 99mTc inyectada por gramo (Masa húmeda de tejido)

Péptido A1-Folato (EC 11)

Péptido A2-Folato (EC14) Péptido A3-Folato (EC13) HYNIC-Folato

Sangre:

0,21 ± 0,01 0,25 ± 0,01 0,19 ± 0,02 0,12 ± 0,02 0,25 ± 0,03 0,16 ± 0,02 0,31 ± 0,06 0,25 ± 0,01

Corazón:

2,5 ± 0,3 0,36 ± 0,03 3,0 ± 0,5 0,24 ± 0,01 1,6 ± 0,1 0,20 ± 0,03 3,4 ± 0,3 0,28 ± 0,02

Pulmones:

1,2 ± 0,2 0,35 ± 0,03 1,6 ± 0,3 0,24 ± 0,02 1,1 ± 0,1 0,23 ± 0,02 1,2 ± 0,2 0,29 ± 0,03

Hígado y vesícula:

5,4 ± 1,4 1,6 ± 0,1 4,5 ± 1,0 0,66 ± 0,07 3,5 ± 0,7 0,65 ± 0,04 3,9 ± 0,9 0,62 ± 0,02

Bazo:

0,38 ± 0,03 0,23 ± 0,01 0,41 ± 0,06 0,15 ± 0,01 0,39 ± 0,06 0,15 ± 0,02 0,39 ± 0,12 0,17 ± 0,02

Riñón (uno):

67,8 ± 6,9 55,5 ± 2,3 44,2 ± 6,4 20,6 ± 2,4 54,5 ± 2,4 29,1 ± 2,2 41,2 ± 8,4 38,4 ± 2,6

Estómago,intestinos ycontenido:

1,4 ± 0,1 1,1 ± 0,3 1,4 ± 0,1 0,50 ± 0,10 2,5 ± 0,2 3,7 ± 0,7 1,5 ± 0,2 1,2 ± 1,0

Músculo:

1,8 ± 0,1 0,38 ± 0,06 2,4 ± 0,4 0,25 ± 0,02 1,7 ± 0,2 0,21 ± 0,03 2,2 ± 0,3 0,36 ± 0,06

Tumor:

2,95 ± 0,57 1,47 ± 0,24 5,57 ± 0,76 2,0 ± 0,5 5,46 ± 0,45 1,67 ± 0,24 4,64 ± 0,67 2,31 ± 0,27

Tumor/Sangre:

13,7 ± 2,1 5,9 ± 0,9 29,3 ± 5,2 17,0 ± 4,5 22,5 ± 1,4 10,2 ± 1,5 15,1 ± 2,1 9,1 ± 1,0

Tumor/Hígado:

0,57 ± 0,14 0,94 ± 0,09 1,3 ± 0,3 3,0 ± 0,6 1,6 ± 0,2 2,6 ± 0,3 1,3 ± 0,3 3,7 ± 0,5

Tumor/Riñón:

0,043 ± 0,005 0,027 ± 0,005 0,13 ± 0,03 0,10 ± 0,01 0,10 ± 0,01 0,058 ± 0,010 0,11 ± 0,01 0,069 ± 0,003

Tumor/Músculo:

1,6 ± 0,3 3,9 ± 0,08 2,4 ± 0,6 7,7 ± 1,7 3,3 ± 0,3 8,2 ± 2,0 2,1 ± 0,4 6,5 ± 1,3

Los valores mostrados representan la media ± la desviación típica. Se supuso que la sangre representaba el 5,5 % de la masa corporal total. Las proporciones de tumor/tejido de fondo se basaron en los correspondientes datos de % de dosis inyectada por gramo. t Dosis de ácido fólico inyectada junto con la dosis de conjugado de 99mTc-Folato. n = 3

TABLA 6 (Continuación)

99mTc-EC53

99mTc-EC53 más ácido fólico 99mTc-EC53 más EC53

Media

D.E. Media D.E. Media D.E.

Dosis del artículo de ensayo (ug/kg)

50,0 50,0 50,0

(nmol/kg)

67,0 67,0 67,0

Competidor coadministrado (nmol/kg)

6700,0 6700,0

Masa tumoral (g)

0,2 0,17 0,20 0,14 0,19 0,15

Animales

3F 3F 3F

Sangre

0,38 0,03 0,244 0,028 0,24 0,06

Corazón

1,09 0,28 0,15 0,03 0,19 0,03

Pulmón

0,89 0,30 0,23 0,04 0,26 0,07

Hígado

3,86 0,96 4,49 1,15 3,77 0,48

Intestino

3,53 0,86 4,33 3,67 3,96 1,86

imagen48

99mTc-EC53

99mTc-EC53 más ácido fólico 99mTc-EC53 más EC53

Riñón

77,99 6,19 10,12 6,91 7,97 1,52

Músculo

0,76 0,31 0,11 0,04 0,12 0,06

Bazo

0,67 0,22 0,27 0,06 0,41 0,11

Estómago

1,04 0,36 0,30 0,15 0,18 0,01

Tumor

11,77 4,26 0,53 0,11 1,88 1,56

Tumor/Sangre

31,4 13,7 2,2 0,6 4,5 4,8

Tumor/Hígado

3,4 2,2 0,1 0,0 0,3 0,4

Tumor/Músculo

17,1 7,0 5,2 1,4 8,5 8,0

Tumor/Riñón

0,2 0,07 0,07 0,05 0,14 0,16

Análisis

La divulgación proporciona un conjugado de una vitamina y un quelante de radionúclido para el desarrollo clínico como agente de formación de imágenes. La invención proporciona dicho agente de formación de imágenes que es 5 el quelante de radionúclido a base de folato recientemente diseñado, sintetizado y caracterizado radioquímicamente, 99mTc-EC20.

99mTc-EC20, un derivado peptídico de bajo peso molecular de folato que contiene un enlace peptídico D--Glu (véase la Fig. 1), se sintetizó usando un procedimiento sintético eficaz en fase sólida. En su forma natural, el folato (o pteroil-glutamato) tiene un solo residuo de glutamilo presente en una configuración L. Sin embargo, se incorporó un

10 residuo de enantiómero D-Glu en la molécula de EC20. Es importante destacar que, al igual que en EC20, la sustitución del residuo de L-Glu en el ácido fólico con un residuo de D-Glu no modifica la capacidad del ácido fólico para unirse al RF de alta afinidad.

Se descubrió que EC20 quela eficazmente 99mTc cuando está en presencia de -D-glucoheptonato y cloruro de estaño (II). Cuando se analizó mediante HPLC radioquímica, > 95 % de la formulación de 99mTc-EC20 resultante

15 consistía en una mezcla de estereoisómeros syn y anti, cada uno igualmente capaz de unirse a RF con alta afinidad (véase la Fig. 3). Aproximadamente el 3 % del 99mTc de la formulación estaba quelado a EC20 en algún otro sitio de la molécula de EC20 diferente del resto de Dap-Asp-Cys esperado. Aunque este componente no se aisló en cantidad suficiente para realizar una caracterización óptima, se demostró que se une a RF con alta afinidad (véase la Fig. 6). Finalmente, el 2 % restante de la radiactividad de la formulación de 99mTc-EC20 se atribuyó al 99mTc libre.

20 99mTc-EC20 demostró una asociación dependiente tanto del tiempo como de la concentración con células positivas en RF. 99mTc-EC20 se aclaró rápidamente de la sangre (T1/2 ~4 min), lo cual es importante para los agentes de formación de imágenes de diagnóstico, y 99mTc-EC20 se acumuló preferentemente en grandes cantidades dentro de los tumores positivos en RF.

El rendimiento de 99mTc-EC20 se comparó directamente con el de un agente de dirección a RF similar, 111In-DTPA

25 folato, usando dos procedimientos diferentes. En primer lugar, se descubrió que ambos productos radiofarmacéuticos a base de folato compiten por igual con el ácido fólico para unirse a los RF de KB (véase la Fig. 3 y la Tabla 1). En segundo lugar, la biodistribución de cada agente en ratones portadores del tumor fue casi idéntica (véase la Tabla 2). Se midieron la alta captación de los tumores y las altas proporciones de tumor con respecto a la sangre para 99mTc-EC20. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que al igual que el 111In-DTPA-folato, el

30 99mTc-EC20 se localizará eficazmente en los tumores positivos en RF cuando se administra clínicamente a los pacientes.

Son varios los conjugados de 99mTc a base de folato ya descritos. Hay datos de biodistribución limitada disponibles sobre un conjugado de 99mTc-12-amino-3,3,9,9-tetrametil-5-oxa-4,8,diaza-2,10-dodecanodiona-dioxima (OXA)-folato; sin embargo, se ha informado sobre niveles moderados (~7 % DI/g) de captación de trazador en un tumor KB. 35 También se han publicado estudios que incluyen la biodistribución de un conjugado de 99mTc-etilendicisteína-folato en ratas portadoras de tumores de mama. Las ratas de aquel estudio se alimentaron con una dieta rica en folato. De este modo, se obtuvieron una baja captación tumoral y bajas proporciones de tumor con respecto a la sangre. Por último, se observó la acumulación de un derivado de 99mTc-6-hidrazinonicotinamido-hidrazido (HYNIC)-folato (HYNIC-folato) en grandes cantidades dentro de tumores 24JK-FBP. Curiosamente, el 99mTc-EC20 se acumuló 40 dentro de tumores M109 a niveles casi idénticos a los de HYNIC-folato en tumores 241K-FBP (~17 % de DI/g) (Tabla 2). Estos dos agentes también presentaron unas proporciones de tumor con respecto a la sangre de 50:1 a las 4

imagen49

horas de la inyección intravenosa.

En resumen, se creó un nuevo derivado de péptido de folato para quelar eficazmente 99mTc. Este nuevo compuesto, el 99mTc-EC20, se une con avidez a las células tumorales positivas en RF in vitro e in vivo. Se descubrió que EC20 se une a células tumorales positivas en el receptor de folato (RF) cultivadas de una manera dependiente tanto del 5 tiempo como de la concentración con muy alta afinidad (KD ~3 nM). Usando un ensayo de afinidad relativa in vitro, también se descubrió que EC20 compite eficazmente con 3H-ácido fólico por la unión celular cuando se presenta bien solo o en forma de un quelato de metal formulado. Tras la inyección intravenosa en ratones Balb/c, el 99mTc-EC20 se retiró rápidamente de la circulación (t1/2 en plasma ~4 min) y se excretó en la orina en forma no metabolizada. Los datos de gammografía y los estudios cuantitativos de biodistribución realizados en los ratones

10 Balb/c portadores de tumores M109 confirmaron que 99mTc-EC20 se acumula predominantemente en los tejidos tumorales positivos en RF y renales. Estos resultados muestran que 99mTc-EC20 es un agente de formación de imágenes de radiodiagnóstico eficaz y no invasivo para la detección de tumores positivos en RF. Otros agentes de formación de imágenes relacionados con EC20 también demostraron ser eficaces, incluyendo EC11, EC13, EC14 y EC53.

15 Cada año, en Estados Unidos, a ~26.000 mujeres se les diagnostica cáncer de ovario, y menos del 50 % de las mujeres sobrevive más de cinco años. Una de las razones de la baja tasa de supervivencia es la dificultad de diagnosticar este tipo de cáncer. Debido al temor de romper una masa abdominal no identificada y al potencial de propagación del cáncer a lo largo de la cavidad abdominal, no se suele realizar la biopsia con aguja fina. En su lugar, el diagnóstico y la estadificación de las masas ováricas sospechosas normalmente se realizan a través de una

20 laparotomía quirúrgica, que es un procedimiento invasivo y costoso. Como el 99mTc-EC20 se une estrechamente con el RF presente en grandes cantidades en los cánceres ováricos (entre otros), este producto radiofarmacéutico proporciona un procedimiento barato y no invasivo, pero fiable para el diagnóstico precoz del cáncer ovárico maligno. Es importante destacar que el 99mTc-EC20 también puede ayudar a guiar el procedimiento de toma de decisiones clínicas, haciendo posible un diagnóstico más definitivo y más precoz de la enfermedad recurrente o

25 residual.

Claims (20)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto de fórmula:

   imagen2
2. 2. Un conjugado que comprende el compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 quelado a un catión de un 5 radionúclido.

3. 3.

   El conjugado de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el radionúclido es un radioisótopo de galio, indio, cobre, tecnecio o renio.

4. 4.

   El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, en el que el radionúclido es 99mTc, 111ln,64Cu, 67Cu, 67Ga o 68Ga.

   10 5. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en el que el radionúclido es 99mTc.

5. 6. Una formulación de dosificación parenteral que comprende un conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 2
6. 5.
7. 7. La formulación de dosificación parenteral de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la formulación es una formulación acuosa que comprende además un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable.

   15 8. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en la que el vehículo líquido farmacéuticamente aceptable está seleccionado de entre solución salina isotónica, glucosa al 5 %, alcohol líquido, glicol, ésteres o amidas.

8. 9.

   La formulación de acuerdo con la reivindicación 6 en forma de un liofilizado reconstituible.

9. 10.

   Una formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-9 para su uso en un procedimiento de

   20 diagnóstico del cáncer, comprendiendo dicho procedimiento la formación de imágenes de una población de células tumorales.
10. 11. Uso de una formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-9 para la fabricación de un agente de diagnóstico para el diagnóstico del cáncer, comprendiendo dicho diagnóstico la formación de imágenes de una población de células tumorales.

    25 12. La formulación para su uso o uso de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en la que la formulación es proporcionada como una sola o varias dosificaciones del conjugado de 1 ng/kg a 1 mg/kg de un animal del que se van a generar imágenes.
11. 13. La formulación para su uso o uso de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la dosificación del conjugado es

    de 100 ng/kg a 500 g/kg de un animal del que se van a generar imágenes o de 100 ng/kg a 25 g/kg de un animal 30 del que se van a generar imágenes.

12. 14.

    La formulación para su uso o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en la que dicha formulación se usa en combinación con ácido fólico sin marcar o folato sin marcar.

13. 15.

    La formulación para su uso o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-14, en la que los tumores de dicho cáncer son positivos en receptor de folato.

    35 16. La formulación para su uso o uso de acuerdo con la reivindicación 10-15, en la que el diagnóstico del cáncer es el diagnóstico de un estado canceroso.

    31

    imagen3

14. 17.

    La formulación para su uso o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-15, en la que el cáncer está seleccionado del grupo que consiste en un carcinoma, un carcinoma nasofaringeo, un sarcoma, un linfoma, linfoma de Burkitt, enfermedad de Hodgekin, un melanoma, mesotelioma y un mieloma.

15. 18.

    La formulación para su uso o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-15, en la que el cáncer

    5 está seleccionado del grupo que consiste en cáncer oral, cáncer nasofaríngeo, cáncer de tiroides, cáncer endocrino, cáncer de piel, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de laringe, cáncer de garganta, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, cáncer ovárico, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer de mama, cáncer de testículo, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer hepático, cáncer pulmonar y cáncer cerebral.

    10 19. Uso del conjugado de acuerdo con la reivindicación 5 o la formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-9 para la detección in vitro de células tumorales positivas en receptor de folato.
16. 20. Un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-5 para su uso en un procedimiento de diagnóstico del cáncer, comprendiendo dicho procedimiento la formación de imágenes de una población de células tumorales.

    15 21. Uso de un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-5 en la fabricación de un agente de diagnóstico para el diagnóstico del cáncer, comprendiendo dicho diagnóstico la formación de imágenes de una población de células tumorales.
17. 22. El conjugado para su uso o uso de acuerdo con la reivindicación 20 o 21, en el que dicho compuesto se usa en combinación con ácido fólico sin marcar o folato sin marcar.

    20 23. El conjugado para su uso o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20-22, en el que los tumores de dicho cáncer son positivos en receptor de folato.

18. 24.

    El conjugado para su uso o uso de cualquiera de las reivindicaciones 20-23, en el que el diagnóstico del cáncer es el diagnóstico de un estado canceroso.

19. 25.

    El conjugado para su uso o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20-23, en el que el cáncer

    25 está seleccionado del grupo que consiste en un carcinoma, un carcinoma nasofaringeo, un sarcoma, un linfoma, linfoma de Burkitt, enfermedad de Hodgekin, un melanoma, mesotelioma y un mieloma.
20. 26. El conjugado para el uso o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20-23, en el que el cáncer está seleccionado del grupo que consiste en cáncer oral, cáncer nasofaríngeo, cáncer de tiroides, cáncer endocrino, cáncer de piel, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de laringe, cáncer de garganta, cáncer de páncreas,

    30 cáncer de colon, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, cáncer ovárico, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer de mama, cáncer de testículo, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer hepático, cáncer pulmonar y cáncer cerebral.

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