ES2504242T3 - Pronóstico de cáncer de mama - Google Patents

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Abstract

Método para evaluar el estado de un cáncer de mama, estadificar a los pacientes de cáncer de mama o determinar un protocolo de tratamiento del paciente en una muestra biológica obtenida de un paciente, que comprende las etapas de medir los niveles de expresión en la muestra de los genes que codifican un ARNm identificado por las SEQ ID NO: 96-111 en la Tabla 10, en el que los niveles de expresión génica por encima o por debajo de los niveles límite predeterminados son indicativos del estado de un cáncer de mama o del estadio de un cáncer de mama.

Description

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E10178199
18-09-2014
Pronóstico de cáncer de mama
Descripción
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al pronóstico de pacientes con cáncer de mama en base a los perfiles de expresión génica de muestras biológicas de los pacientes.
ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA
Aproximadamente el 60%-70% de los pacientes con cáncer de mama sin compromiso de los ganglios linfáticos (LNN) se curan mediante tratamiento local o regional solamente. Lancet (1998a) y Lancet (1998b). Se han desarrollado directrices para ayudar a los médicos a seleccionar a los pacientes que deben recibir tratamiento complementario. Las recomendaciones más ampliamente utilizadas son los criterios de St. Gallen (Goldhirsch et al. (2003)) y los criterios de consenso de los National Institutes of Health (NIH). Eifel et al. (2001). Estas directrices señalan al 85%-90% de los pacientes LNN como candidatos al tratamiento complementario sistémico.
Existe la necesidad de identificar específicamente el riesgo de reaparición de la enfermedad de un paciente para garantizar que recibe el tratamiento apropiado. Actualmente, existen pocas herramientas de diagnóstico disponibles para identificar a los pacientes en riesgo. Se han utilizado patrones de expresión génica para clasificar los tumores de mama en diferentes subtipos clínicamente pertinentes. Perou et al. (2000), Sorlie et al. (2001), Sorlie et al. (2003), Gruvberger et al. (2001), van't Veer et al. (2002), van de Vijver et al. (2002), Ahr et al. (2002), Huang et al. (2003), Sotiriou et al. (2003), Woelfle et al. (2003), Ma et al. (2003), Ramaswamy et al. (2003), Chang et al. (2003), Sotiriou et al. (2003) y Hedenfalk et al. (2001).
Actualmente, en pacientes LNN, la decisión de aplicar un tratamiento complementario después de la extirpación quirúrgica del tumor primario, y qué tipo (endocrinoterapia y/o quimioterapia), depende en gran medida de la edad del paciente, del estado menopáusico, del tamaño del tumor, del grado de diferenciación y del estado de los receptores de hormonas esteroideas. Estos factores se tienen en cuenta en directrices tales como los criterios de St. Gallen y los criterios de consenso de los National Institutes of Health (NIH). En base a estos criterios, más del 85%-90% de los pacientes LNN serían candidatos a recibir tratamiento complementario sistémico. Existe una clara necesidad de identificar mejor los factores pronósticos para guiar la selección de las opciones de tratamiento.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Reconociendo la complejidad de la evolución de la enfermedad, los autores informan en el presente documento acerca de una completa evaluación de la expresión génica de todo el genoma para identificar marcadores pronósticos ampliamente aplicables. Ntzani et al. (2003) y Wang et al. (2004).
La presente invención abarca un método para evaluar el estado de un cáncer de mama en una muestra biológica obtenida de un paciente con cáncer de mama tal como se define en las reivindicaciones.
La presente invención abarca un método para estadificar un cáncer de mama en una muestra biológica obtenida de un paciente con cáncer de mama tal como se define en las reivindicaciones.
La presente invención abarca un método para determinar un protocolo de tratamiento del paciente con cáncer de mama en una muestra biológica obtenida de un paciente con cáncer de mama tal como se define en las reivindicaciones.
La presente descripción proporciona un método para tratar a un paciente con cáncer de mama obteniendo una muestra biológica de un paciente con cáncer de mama; y midiendo los niveles de expresión en la muestra de genes seleccionados de entre aquellos que codifican un ARNm: correspondiente a las SEQ ID NO: 1-111; o reconocido por los conjuntos de sondas seleccionadas de entre los psids correspondientes a las SEQ ID NO: 1-111 como se muestra en la Tabla 10, en el que los niveles de expresión génica por encima o por debajo de los niveles límite predeterminados son indicativos de un alto riesgo de reaparición y; tratando al paciente con el tratamiento complementario si es un paciente de alto riesgo.
La presente descripción proporciona un método para realizar la validación cruzada de un perfil de expresión génica pronóstico para pacientes con cáncer de mama obteniendo datos de expresión génica a partir de un número estadísticamente significativo de muestras biológicas de pacientes; aleatorizando el orden de las muestras; dejando fuera los datos de aproximadamente el 10%-50% de las muestras; calculando, para las muestras restantes, el factor de interés en todas las variables y seleccionando las variables que satisfagan un límite del valor p (p); seleccionando las variables que se ajustan a un modelo de predicción utilizando una búsqueda hacia adelante y evaluando el error de aprendizaje hasta que dé con una tasa de error predeterminada; ensayando el modelo de predicción en el 10%-50% de las muestras dejadas fuera; repitiendo las etapas c., -g. con un nuevo conjunto de muestras retiradas; y
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siguiendo con las etapas c) -g) hasta haber ensayado el 100% de las muestras, y registrar el rendimiento de la clasificación.
La presente descripción proporciona un método para validar independientemente un perfil de expresión génica pronóstico para pacientes con cáncer de mama obteniendo datos de expresión génica a partir de un número estadísticamente significativo de muestras biológicas de pacientes; normalizando las variabilidades de partida en los datos de expresión génica; calculando el factor de interés en todas las variables que se han seleccionado con anterioridad; y ensayando el modelo de predicción en la muestra, y registrar el rendimiento de la clasificación.
La presente descripción proporciona un método para generar una Puntuación de Riesgo de Recidiva para permitir el pronóstico de los pacientes con cáncer de mama obteniendo datos de expresión génica a partir de un número estadísticamente significativo de muestras biológicas de pacientes; aplicando el análisis de regresión de Cox univariante a los datos para obtener los genes seleccionados; aplicando los niveles de expresión ponderados a los genes seleccionados con coeficientes estándar de Cox para obtener un modelo de predicción que puede aplicarse como Puntuación de Riesgo de Recidiva.
La presente descripción proporciona un método para generar un informe del paciente con pronóstico de cáncer de mama obteniendo una muestra biológica del paciente; midiendo la expresión génica de la muestra; aplicando una Puntuación de Riesgo de Recidiva a los resultados de la etapa b.; y utilizando los resultados obtenidos en la etapa c. para generar el informe y los informes de pacientes generados de este modo.
La presente invención abarca el uso de una composición que comprende un conjunto de sondas que consiste en: las SEQ ID NO: 96-111 en la Tabla 10 en un método de diagnóstico según se define en las reivindicaciones.
La presente invención abarca el uso de un kit para llevar a cabo un ensayo para determinar el pronóstico de cáncer de mama en una muestra biológica que contiene: materiales para detectar secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de los mismos de una combinación de genes seleccionados de entre aquellos que codifican un ARNm identificado por las SEQ ID NO: 1-111 en la Tabla 10.
La presente descripción proporciona artículos para evaluar el estado de un cáncer de mama que contienen: materiales para detectar secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de los mismos de una combinación de genes seleccionados de entre aquellos que codifican un ARNm: correspondiente a las SEQ ID NO: 96-111; o reconocido por los conjuntos de sondas correspondientes a las SEQ ID NO: 96-111 como se muestra en la Tabla 10.
La presente descripción proporciona una cartera de diagnóstico/pronóstico que contiene secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de los mismos de una combinación de genes seleccionados de entre aquellos que codifican un ARNm: correspondiente a las SEQ ID NO: 1-111; o reconocido por los conjuntos de sondas seleccionadas de entre los psids correspondientes a las SEQ ID NO: 1-111 como se muestra en la Tabla 10, en la que la combinación es suficiente para caracterizar el estado de un cáncer de mama o el riesgo de recidiva en una muestra biológica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 representa el perfil para la selección de muestras para el análisis y el análisis de algoritmos de agrupamiento no supervisado de los datos de expresión génica para 286 pacientes con cáncer de mama sin compromiso de los ganglios linfáticos (LNN). (A). Diagrama de flujo para seleccionar muestras de los pacientes para su análisis. Se utilizó el estado ER para identificar los subgrupos de pacientes. A continuación, se analizó cada subgrupo por separado a fin de seleccionar los marcadores. Se asignaron los pacientes en un subgrupo a un conjunto de aprendizaje o a un conjunto de prueba. Se combinaron los marcadores seleccionados de cada subgrupo para formar una sola firma para predecir la reaparición de tumores para todos los pacientes en el conjunto de prueba en su totalidad. (B). Análisis de algoritmos de agrupamiento no supervisado de los datos de expresión génica de 286 pacientes con cáncer de mama LNN. El panel de la izquierda es una vista de los 17.819 genes informativos. El color rojo indica alta expresión relativa; el verde indica baja expresión relativa. Cada columna es una muestra y cada fila es un gen. El panel de la derecha muestra las vistas ampliadas de dos clústers de genes dominantes identificados a partir de la vista de la izquierda que tenían una notoria expresión diferencial entre los dos subgrupos de pacientes. El clúster génico superior tiene un grupo de 282 genes con expresión disminuida en el subgrupo ER positivo. El clúster génico inferior está representado por un grupo de 339 genes con expresión aumentada en el subgrupo ER positivo. La barra de etiquetas en la parte inferior de cada dendrograma indica el estado ER del paciente medido mediante ensayos rutinarios.
Figura 2. Establecimiento del perfil de 76 genes y el análisis de Kaplan-Meier para la supervivencia libre de metástasis a distancia (DMFS) y la supervivencia global (OS). A. Selección de genes para la firma pronóstica. Los marcadores génicos para los grupos ER positivo y ER negativo se seleccionaron a partir de dos conjuntos de aprendizaje utilizando el análisis ROC. Sesenta genes fueron del grupo ER positivo y 16 genes fueron del grupo
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ER negativo (izquierda), y la curva ROC de la firma genética de 76 genes se obtuvo a partir del análisis de los 171 pacientes en el conjunto de prueba (derecha). B. Análisis DMFS (izquierda) y análisis OS (derecha) en el conjunto de validación de 171 pacientes LNN. El riesgo de fracaso para cada paciente se evaluó en base a la firma genética de 76 genes y el umbral se determinó mediante el conjunto de aprendizaje. Se utilizó el ensayo de rango logarítmico para ensayar las diferencias.
Figura 3. Análisis DMFS y OS en los subgrupos de pacientes LNN. DMFS (izquierda) y OS (derecha) en 84 pacientes premenopáusicas (A), 87 pacientes posmenopáusicas (B) y 79 pacientes con tumores de un tamaño que oscila entre 10 mm-20 mm (C). Los resultados son de los pacientes independientes en el conjunto de validación. El riesgo de reaparición para cada paciente se evaluó en base a la firma genética de 76 genes y el umbral se determinó mediante el conjunto de aprendizaje. Se utilizó el ensayo de rango logarítmico para ensayar las diferencias.
La Figura 4 representa el agrupamiento jerárquico en base a 5.121 genes.
La Figura 5 es un gráfico de barras que representa los niveles de expresión de 21 genes de control (Tabla 7).
La Figura 6 representa un flujo de trabajo del análisis de datos.
La Figura 7 representa el análisis PCA con conjuntos de genes filtrados.
La Figura 8 es un gráfico circular que representa el estado ER utilizado para asignar los subgrupos de pacientes. Los genes expresados de manera diferencial entre los sub-clústers ER positivo y ER negativo en las muestras de tejido en bruto y LCM se definieron mediante la t de Student.
La Figura 9 es una serie de gráficos de barras que representan los resultados del análisis de vías mediante ontología génica para los genes asociados exclusivamente con ER en las muestras LCM, exclusivamente en los tejidos en bruto, y para aquellos que son comunes al tejido en bruto y al LCM.
La Figura 10 muestra los resultados de la validación independiente. El diagrama de flujo en la Figura 10 muestra que los 132 pacientes se recogieron en cuatro fuentes diferentes. Se calculó una Puntuación de Riesgo de Recidiva para cada paciente en base a los niveles de expresión de la firma genética de 76 genes. Los pacientes se clasificaron en grupos de resultado bueno y malo.
La Figura 11 muestra A. características clínicas y patológicas de los pacientes y sus tumores para el estudio de validación y B. una curva ROC de la firma genética de 76 genes en el estudio de validación.
La Figura 12 representa el resultado de la clasificación de los 132 pacientes en el estudio de validación.
En el gráfico se muestran la curva de supervivencia de Kaplan-Meier y el ensayo de rango logarítmico en los grupos con predicción de resultado bueno y malo.
La Figura 13 representa los resultados del análisis de vías. El diagrama de flujo en la Figura 13 muestra el método utilizado para la selección de muestras para los análisis estadísticos. A. Se dividió al azar a los 286 pacientes en un conjunto de aprendizaje de 115 pacientes y un conjunto de prueba. B. Se dividió al azar a los 286 pacientes en un conjunto de aprendizaje de un 80% de los pacientes y un conjunto de prueba de un 20% de los pacientes. El conjunto de aprendizaje se utilizó para seleccionar los marcadores génicos y para construir una firma pronóstica. El conjunto de prueba se utilizó para la validación. Ambos procedimientos se repitieron 10 veces.
La Figura 14 representa los resúmenes del análisis por ontología GO. Cada barra representa una vía significativamente sobrerrepresentada en la firma genética de 76 genes (p <0,05). La desviación estándar se calcula a partir de los resultados de las firmas alternativas. A. Resultados de 10 firmas utilizando conjuntos de aprendizaje de 115 pacientes. B. Resultados de 10 firmas utilizando conjuntos de aprendizaje del 80% de los pacientes.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente invención abarca un método para evaluar el estado de un cáncer de mama en una muestra biológica obtenida de un paciente con cáncer de mama tal como se define en las reivindicaciones.
La presente invención abarca un método de estadificación de un cáncer de mama en una muestra biológica obtenida de un paciente con cáncer de mama tal como se define en las reivindicaciones. El método utiliza cualquier clasificación conocida en la técnica, incluido el sistema TNM (American Joint Committee on Cancer www.cancerstaging.org) y la comparación con los estadios correspondientes a pacientes con perfiles de expresión génica similares.
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La presente invención abarca un método para determinar el protocolo de tratamiento del paciente con cáncer de mama en una muestra biológica obtenida de un paciente con cáncer de mama tal como se define en las reivindicaciones.
La presente descripción proporciona un método para tratar a un paciente con cáncer de mama obteniendo una muestra biológica de un paciente con cáncer de mama; y midiendo los niveles de expresión en la muestra de genes seleccionados de entre aquellos que codifican un ARNm: correspondiente a las SEQ ID NO: 1-111; o reconocido por los conjuntos de sondas seleccionadas de entre los psids correspondientes a las SEQ ID NO: 1-111 como se muestra en la Tabla 10, en el que los niveles de expresión génica por encima o por debajo de los niveles límite predeterminados son indicativos de un alto riesgo de reaparición y; tratando al paciente con un tratamiento complementario si es un paciente de alto riesgo.
Preferentemente, las SEQ ID NO: son 36-95 para los pacientes con receptor de estrógeno (ER) positivo y 96-111 para los pacientes ER negativo.
La muestra puede prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluida la preparación del tejido en bruto y la microdisección por captura con láser. Las preparaciones de tejido en bruto pueden obtenerse a partir de una biopsia o de una pieza quirúrgica.
Los métodos anteriormente indicados pueden incluir adicionalmente medir el nivel de expresión de al menos un gen que codifica un ARNm identificado por las SEQ ID NO: 112-132 en la Tabla 10. También pueden incluir medir el nivel de expresión de al menos un gen expresado constitutivamente en el muestra.
Los métodos anteriormente indicados pueden incluir adicionalmente determinar el estado del receptor de estrógeno (ER) de la muestra. El estado ER puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluida la medición del nivel de expresión de al menos un gen indicativo del estado ER, la medición de la presencia de ER en la muestra y la medición mediante inmunohistoquímica.
Los métodos anteriormente indicados pueden utilizarse con muestras de cualquier fuente biológica. Preferentemente, la muestra se obtiene de un tumor primario.
Los métodos anteriormente indicados tienen preferentemente una especificidad de al menos un 40% y una sensibilidad de al menos un 90%.
Los métodos anteriormente indicados pueden utilizarse cuando el patrón de expresión de los genes se compara con un patrón de expresión indicativo de un paciente recidivante. La comparación puede ser mediante cualquier método conocido en la técnica, incluida la comparación de los patrones de expresión llevada a cabo con los métodos de reconocimiento de patrones. Los métodos de reconocimiento de patrones pueden ser cualesquiera de los conocidos en la técnica, incluido el análisis de riesgos proporcionales de Cox.
Los métodos anteriormente indicados pueden utilizarse cuando los niveles límite predeterminados son una sobreexpresión o subexpresión al menos 1,5 veces mayor en la muestra con respecto a las células benignas o al tejido normal. Preferentemente, los niveles límite predeterminados tienen al menos una sobreexpresión con un valor p estadísticamente significativo en la muestra que tiene células metastásicas con respecto a las células benignas o al tejido normal. Más preferentemente, el valor p es inferior a 0,05.
Los métodos anteriormente indicados pueden utilizarse cuando la expresión génica se mide en una micromatriz o matriz génica. Las micromatrices y matrices génicas adecuadas para su uso en el presente documento también se incluyen en la invención. La micromatriz puede ser una matriz de ADNc o una matriz de oligonucleótidos y puede contener adicionalmente uno o más reactivos de control interno.
Los métodos anteriormente indicados pueden utilizarse cuando la expresión génica se determina mediante amplificación de ácido nucleico llevada a cabo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del ARN extraído de la muestra. La PCR puede ser una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). La RT-PCR puede contener adicionalmente uno o más reactivos de control interno.
Los métodos anteriormente indicados pueden utilizarse cuando la expresión génica se detecta midiendo o detectando una proteína codificada por el gen. Puede utilizarse cualquier método conocido en la técnica, incluida la detección mediante un anticuerpo específico contra la proteína y la medición de una característica del gen. Las características adecuadas incluyen, sin limitación, la amplificación, la metilación, la mutación y la variación alélica de ADN.
La presente descripción proporciona un método para realizar la validación cruzada de un perfil de expresión génica pronóstico para pacientes con cáncer de mama obteniendo datos de expresión génica a partir de un número estadísticamente significativo de muestras biológicas de pacientes; aleatorizando el orden de las muestras; dejando fuera los datos de aproximadamente el 10%-50% de las muestras; calculando, para las muestras restantes, el factor
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de interés en todas las variables y seleccionando las variables que satisfagan un límite del valor p (p); seleccionando las variables que se ajustan a un modelo de predicción utilizando una búsqueda hacia adelante y evaluando el error de aprendizaje hasta que dé con una tasa de error predeterminada; ensayando el modelo de predicción en el 10%-50% de las muestras dejadas fuera; repitiendo las etapas c., -g. con un nuevo conjunto de muestras retiradas; y siguiendo con las etapas c) -g) hasta haber ensayado el 100% de las muestras, y registrar el rendimiento de la clasificación.
El método de validación cruzada puede utilizarse cuando los datos de expresión génica obtenidos en la etapa h. están representados por los genes seleccionados de entre aquellos que codifican un ARNm: correspondiente a las SEQ ID NO: 3, 4, 10, 18, 37, 40, 42, 43, 45, 55, 58, 64, 67, 72-74, 76, 81, 85-86, 89, 97, 100-101, 110-111, 125 y 132-442, o 2, 3, 5, 12, 20, 25, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 51, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 74, 76, 80, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 94, 97, 98, 101, 102, 104, 107, 110, 111, 132, 139, 142, 150, 151, 153, 154, 158, 161, 163, 167, 170, 171, 173, 175, 181, 182, 183, 186, 188, 190, 192, 204, 206, 207, 212, 215, 218, 221, 223, 225, 228, 231, 232, 236, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 246, 248, 249, 255, 257, 267, 269, 270, 271, 273, 280, 281, 282, 288, 290, 291, 299, 301, 304, 306, 311, 314, 315, 318, 327, 328, 338, 342, 346, 348, 354, 366, 368, 371, 375, 385, 388, 391, 395, 397, 402, 405, 409, 422, 424, 428, 429, 435, 436, 440, 651 y 443-650; o reconocido por los conjuntos de sondas seleccionadas del grupo que consiste en los psids correspondientes a las SEQ ID NO: 3, 4, 10, 18, 37, 40, 42, 43, 45, 55, 58, 64, 67, 72-74, 76, 81, 85-86, 89, 97, 100-101, 110-111, 125 y 132-442, o 2, 3, 5, 12, 20, 25, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 51, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 74, 76, 80, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 94, 97, 98, 101, 102, 104, 107, 110, 111, 132, 139, 142, 150, 151, 153, 154, 158, 161, 163, 167, 170, 171, 173, 175, 181, 182, 183, 186, 188, 190, 192, 204, 206, 207, 212, 215, 218, 221, 223, 225, 228, 231, 232, 236, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 246, 248, 249, 255, 257, 267, 269, 270, 271, 273, 280, 281, 282, 288, 290, 291, 299, 301, 304, 306, 311, 314, 315, 318, 327, 328, 338, 342, 346, 348, 354, 366, 368, 371, 375, 385, 388, 391, 395, 397, 402, 405, 409, 422, 424, 428, 429, 435, 436, 440, 651 y 443-650 como se muestra en la Tabla 10.
La presente descripción proporciona un método para validar de manera independiente un perfil de expresión génica pronóstico para pacientes con cáncer de mama obteniendo datos de expresión génica a partir de un número estadísticamente significativo de muestras biológicas de pacientes; normalizando las variabilidades de partida en los datos de expresión génica; calculando el factor de interés en todas las variables que se han seleccionado con anterioridad; y ensayando el modelo de predicción en la muestra, y registrar el rendimiento de la clasificación.
El método de validación independiente puede utilizarse cuando los datos de expresión génica obtenidos en la etapa d. están representados por los genes seleccionados de entre aquellos que codifican un ARNm correspondiente a las SEQ ID NO: 3, 4, 10, 18, 37, 40, 42, 43, 45, 55, 58, 64, 67, 72-74, 76, 81, 85-86, 89, 97, 100-101, 110-111, 125 y 132-442, o 2, 3, 5, 12, 20, 25, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 51, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 74, 76, 80, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 94, 97, 98, 101, 102, 104, 107, 110, 111, 132, 139, 142, 150, 151, 153, 154, 158, 161, 163, 167, 170, 171, 173, 175, 181, 182, 183, 186, 188, 190, 192, 204, 206, 207, 212, 215, 218, 221, 223, 225, 228, 231, 232, 236, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 246, 248, 249, 255, 257, 267, 269, 270, 271, 273, 280, 281, 282, 288, 290, 291, 299, 301, 304, 306, 311, 314, 315, 318, 327, 328, 338, 342, 346, 348, 354, 366, 368, 371, 375, 385, 388, 391, 395, 397, 402, 405, 409, 422, 424, 428, 429, 435, 436, 440, 651 y 443-650; o reconocido por los conjuntos de sondas seleccionadas del grupo que consiste en los psids correspondientes a las SEQ ID NO: 3, 4, 10, 18, 37, 40, 42, 43, 45, 55, 58, 64, 67, 72-74, 76, 81, 85-86, 89, 97, 100-101, 110-111, 125 y 132-442, o 2, 3, 5, 12, 20, 25, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 51, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 74, 76, 80, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 94, 97, 98, 101, 102, 104, 107, 110, 111, 132, 139, 142, 150, 151, 153, 154, 158, 161, 163, 167, 170, 171, 173, 175, 181, 182, 183, 186, 188, 190, 192, 204, 206, 207, 212, 215, 218, 221, 223, 225, 228, 231, 232, 236, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 246, 248, 249, 255, 257, 267, 269, 270, 271, 273, 280, 281, 282, 288, 290, 291, 299, 301, 304, 306, 311, 314, 315, 318, 327, 328, 338, 342, 346, 348, 354, 366, 368, 371, 375, 385, 388, 391, 395, 397, 402, 405, 409, 422, 424, 428, 429, 435, 436, 440, 651 y 443-650 como se muestra en la Tabla 10.
La presente descripción proporciona un método para generar una Puntuación de Riesgo de Recidiva para permitir el pronóstico de los pacientes con cáncer de mama obteniendo datos de expresión génica a partir de un número estadísticamente significativo de muestras biológicas de pacientes; aplicando el análisis de regresión de Cox univariante a los datos para obtener los genes seleccionados; aplicando los niveles de expresión ponderados a los genes seleccionados con coeficientes estándar de Cox para obtener un modelo de predicción que pueda aplicarse como Puntuación de Riesgo de Recidiva.
La Puntuación de Riesgo de Recidiva puede obtenerse mediante la fórmula:
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en la que
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A y B son constantes wi es el coeficiente de regresión de Cox estandarizado para gen X + marcador xi es el valor de la expresión de ER + marcador en escala log2 wj es el coeficiente de regresión de Cox estandarizado para gen X -marcador xj es el valor de la expresión de ER -marcador en escala log2 el gen X se selecciona del grupo que consiste en aquellos que codifican un ARNm:
i. correspondiente a las SEQ ID NO: 1-111; o
ii. reconocido por los conjuntos de sondas seleccionadas del grupo que consiste en los psids correspondientes a las SEQ ID NO: 1-111 como se muestra en la Tabla 10.
La presente descripción proporciona un método para generar un informe del paciente con pronóstico de cáncer de mama obteniendo una muestra biológica del paciente; midiendo la expresión génica de la muestra; aplicando una Puntuación de Riesgo de Recidiva a los resultados de la etapa b.; y utilizando los resultados obtenidos en la etapa c. para generar el informe y los informes de pacientes generados de este modo. El informe puede contener una evaluación de los resultados para el paciente y/o la probabilidad de riesgo con respecto a la población de pacientes.
La presente invención abarca el uso de una composición que comprende un conjunto de sondas que consiste en: las SEQ ID NO: 96-111 en la Tabla 10 en un método de diagnóstico como se define en las reivindicaciones. La composición puede contener al menos un conjunto de sondas seleccionadas de entre: las SEQ ID NO: 36-95; 96-111; ó 36-111. La composición puede contener adicionalmente reactivos para llevar a cabo un análisis de micromatrices, y un medio a través del cual se ensayan dichas secuencias de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de los mismos.
La presente invención abarca el uso de un kit para llevar a cabo un ensayo para determinar el pronóstico de cáncer de mama en una muestra biológica que contiene: materiales para detectar secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de los mismos de una combinación de genes que codifican un ARNm: identificado por las SEQ ID NO: 1-111 en la Tabla 10. El kit puede contener adicionalmente reactivos para llevar a cabo un análisis de micromatrices, y un medio a través del cual se ensayan dichas secuencias de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de los mismos.
La presente descripción proporciona artículos para evaluar el estado de un cáncer de mama que contiene: materiales para detectar secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de los mismos de una combinación de genes seleccionados de entre aquellos que codifican un ARNm: correspondiente a las SEQ ID NO: 1-111; o reconocido por los conjuntos de sondas seleccionadas de entre los psids correspondientes a las SEQ ID NO: 1-111 como se muestra en la Tabla 10. Los artículos pueden contener adicionalmente reactivos para llevar a cabo un análisis de micromatrices, y un medio a través del cual se ensayan dichas secuencias de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de los mismos.
Las micromatrices proporcionadas en el presente documento pueden contener secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de los mismos de una combinación de genes seleccionados de entre aquellos que codifican un ARNm: correspondiente a las SEQ ID NO: 1-111; o reconocido por los conjuntos de sondas seleccionadas de entre los psids correspondientes a las SEQ ID NO: 1-111 como se muestra en la Tabla 10, en la que la combinación es suficiente para caracterizar el estado de un cáncer de mama o el riesgo de recidiva en una muestra biológica.
La medición o caracterización de las micromatrices resulta preferentemente una sobreexpresión o subexpresión al menos 1,5 veces mayor. La micromatriz puede detectar unos niveles límite predeterminado que son una sobreexpresión o subexpresión al menos 1,5 veces mayor en la muestra con respecto a las células benignas o al tejido normal. Preferentemente, los niveles límite predeterminados tienen al menos una sobreexpresión con un valor p estadísticamente significativo en la muestra que tiene células metastásicas con respecto a las células benignas o al tejido normal. Más preferentemente, el valor p es inferior a 0,05.
La presente descripción proporciona una cartera de diagnóstico/pronóstico que contiene secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de los mismos de una combinación de genes seleccionados de entre aquellos que codifican un ARNm: correspondiente a las SEQ ID NO: 1-111; o reconocido por
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los conjuntos de sondas seleccionadas de entre los psids correspondientes a las SEQ ID NO: 1-111 como se muestra en la Tabla 10, en la que la combinación es suficiente para caracterizar el estado de un cáncer de mama o el riesgo de recidiva en una muestra biológica. La cartera puede detectar unos niveles límite predeterminados que son una sobreexpresión o subexpresión al menos 1,5 veces mayor en la muestra con respecto a las células benignas o al tejido normal. Preferentemente, los niveles límite predeterminados tienen al menos una sobreexpresión con un valor p estadísticamente significativo en la muestra que tiene células metastásicas con respecto a las células benignas o al tejido normal. Más preferentemente, el valor p es inferior a 0,05.
Las SEC ID NO: 1-650 se resumen en la Tabla 10. En cada una de las SEQ ID NO: 1-650, el marcador se identifica mediante un psid o denominación GeneChip de Affymetrix y representa el gen que codifica cualquier variante, alelo, etc. correspondiente a la SEQ ID NO dada. El marcador también se define como el gen que codifica un ARNm reconocido por la sonda correspondiente al psid dado. Más adelante se describen con más detalle determinados marcadores.
M83, SEQ ID NO: 45, se menciona en las solicitudes de patente de EE.UU. con número de publicación 20020110547, 20040009491 y 20030236392, y las PCT con número de publicación WO0149716, WO0170979, WO03025138, WO03042661, WO03016475, WO2004063355, WO2004047728 y WO2004030615.
ABLIM-s, SEQ ID NO: 43, se menciona en las solicitudes de patente de EE.UU. con número de publicación 20020131971, 20030087818, 20030166064, 20030236392 y 20040005560, y las PCT con número de publicación WO0036107, WO0159063, WO0160860, WO0174405, WO0177288, WO02059271, WO0212328, WO0224956, WO0229086, WO03025138, WO2004024097, WO2004037996, WO2004039956, WO2004043361 y WO2004047728.
ATAD2, SEQ ID NO: 54 se menciona en las solicitudes de patente de EE.UU. con número de publicación 20020064872, 20020085998, 20020150581, 20020156011, 20020192678, 20030069180, 20030073623, 20030104366, 20040005560, 20040013663 y 20040058340 y las PCT con número de publicación WO0060076, WO0142467, WO0155322, WO0160860, WO0170979, WO0179286, WO196388, WO02057414, WO02059377, WO02060317, WO02086443, WO0231198, WO0250279, WO03004989, WO03025138, WO03042661, WO03062379, WO2004047728, WO2004048938, WO2004048938, WO2004063355 y WO9938972.
C11ORF9, SEQ ID NO: 48, se menciona en las solicitudes de patente de EE.UU. con número de publicación 20030065157 y 20030073623 y las PCT con número de publicación WO0056880, WO0058473, WO0159063, WO0174405, WO02059260, WO0229086, WO03101283, WO2004031413 y WO2004060270.
C3, SEQ ID NO: 46, se menciona en las solicitudes de patente de EE.UU. con número de publicación 20040005560 y 20040058340 y las PCT con número de publicación WO9101999, WO0055350, WO0160860, WO0175067, WO0188088, WO0224956, WO0294629, WO03078572, WO2004028479, WO2004030615, WO2004041170 y WO2004060270.
CGI-41, SEQ ID NO: 65, se menciona en las solicitudes de patente de EE.UU. con número de publicación 20030073623 y 20030096982 y las PCT con número de publicación WO9514772, WO9940100, WO0154472, WO0157188, WO03046152, WO2004060270.
CLN8, SEQ ID NO: 36, se menciona en el documento EP 1 104 808 B1, las solicitudes de patente de EE.UU. número 20030073623 y 20040009491 y las PCT con número de publicación WO9845437, WO9935158, WO0142451, WO0190304, WO02090526, WO02095010, WO02102993, WO02102994, WO03004622, WO04024892 y WO04041170.
CKN1, SEQ ID NO: 60, se menciona en la solicitud de patente de EE.UU. con número de publicación 20040058340 y las PCT con número de publicación WO9938972 y WO2004037996.
DUSP4, SEQ ID NO: 57, se menciona en las solicitudes de patente de EE.UU. con número de publicación 20030073623, 20030194704, 20040058340 y 20040110194 y las PCT con número de publicación WO0100828, WO0204514, WO02059377, WO02103320, WO0224956, WO03004989, WO2004018641, WO2004023973, WO2004037996, WO2004039956, WO2004043361, WO2004047728, WO2004048938 y WO9423039.
FEN1, SEQ ID NO: 62, se menciona en la patente de EE.UU. número 5.874.283, las solicitudes de patente de EE.UU. con número de publicación 20020156011, 20030069180, 20030073623 y 20030194704 y las PCT con número de publicación WO0196388, WO03016475, WO03016500, WO03072035, WO03101283, WO2004022059, WO2004030615, WO2004039956, WO2004043361, WO2004047728, WO2004048938, WO2004060270 y WO2004079014.
FKBP2, SEQ ID NO: 63, se menciona en la solicitud de patente de EE.UU. con número de publicación 20030073623 y las PCT con número de publicación WO02059377, WO02070737, WO02081731, WO02083898, WO0224956, WO03016475, WO03054152, WO2004039956, WO2004043361 y WO9219745.
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GP73, SEQ ID NO: 37, se menciona en las solicitudes de patente de EE.UU. con número de publicación 20030022239, 20030073623, 20030236392, 20040009478, 20040034196 y 20040058340 y las PCT con número de publicación WO0012708, WO0061610, WO0078961, WO0140466, WO0160860, WO0177168, WO0194629, WO02059260, WO02083876, WO0224956, WO03004989, WO2004024892, WO2004031414 y WO2004053081.
H4FH, SEQ ID NO: 61, se menciona en la solicitud de patente de EE.UU. con número de publicación 20020151681 y las PCT con número de publicación WO0055174, WO0175067, WO0224956, WO03016476, WO2004039943.
IL-18, SEQ ID NO: 39, se menciona en la patente de EE.UU. número 6060283, la solicitud de patente de EE.UU. con número de publicación 20040115636 y las PCT con número de publicación WO0194629, WO02057414, WO0224956, WO0229086, WO03025138, WO03042661 y WO9724441.
KIAA0748, SEQ ID NO: 56, se menciona en las PCT número de publicación WO0021991, WO02094988 y WO2004003162.
KPNA2, SEQ ID NO: 64, se menciona en las solicitudes de patente de EE.UU. con número de publicación 20020151681, 20020156011, 20030069180 y 20040058340 y las PCT con número de publicación WO9712967, WO9964576, WO0055174, WO0146697, WO0170979, WO0196388, WO02057414, WO02059377, WO02086443, WO02102235, WO0224956, WO03010336, WO03025138, WO03027285, WO03042661, WO2004024097, WO02004024892, WO2004028479, WO2004037996, WO2004039956, WO2004043361, WO2004047728 y WO2004063355.
MGC11335, SEQ ID NO: 66, se menciona en las solicitudes de patente de EE.UU. con número de publicación 20030073623, 20030219744 y 20030236392 y las PCT con número de publicación WO0144448, WO0153312, WO0157182, WO0188088 y WO2004030615.
OR12D2, SEQ ID NO: 52, se menciona en las PCT con número de publicación WO0127158, WO02068652, WO02081498, WO02081517, WO030000735 y WO03091388.
ORC3, SEQ ID NO: 53, se menciona en la solicitud de patente de EE.UU. con número de publicación 20040013663 y las PCT con número de publicación WO9810067, WO9958642, WO0060078, WO0175067, WO02059377, WO02070737, WO02102235 y WO03042661.
PLK1, SEQ ID NO: 59, se menciona en el documento DE4329177, las solicitudes de patente de EE.UU. con número de publicación 20020081659 y 20020151681 y las PCT con número de publicación WO0055174, WO0055320, WO02070737, WO02086443, WO0224956, WO03003906, WO03016476, WO03018807, WO03025138, WO03042661, WO2004030615, WO2004037996, WO2004042022, WO2004047728, WO2004048938, WO2004063355 y WO2004070062.
PPP1CC, SEQ ID NO: 42, se menciona en las solicitudes de patente de EE.UU. con número de publicación 20030073623 y 20040013663 y las PCT con número de publicación WO03016476, WO0063438, WO0170979, WO0202623, WO02036766, WO02074237, WO0228999, WO03016475 y WO2004030615.
SMC4, SEQ ID NO: 55, se menciona en las solicitudes de patente de EE.UU. con número de publicación 20020123619, 20020168637 y 20040058340 y las PCT con número de publicación WO9938972, WO9964576, WO0175067, WO0190154, WO0204514, WO02059377, WO02074237, WO02086443, WO02102235, WO03003906, WO03016475, WO03025138, WO03042661, WO2003094848, WO0004024892, WO2004047728, WO2004048938, WO2004063355 y WO2004074301.
TRDL-1, SEQ ID NO: 44, se menciona en las patentes de EE.UU. número 6171787 y 6440694, las solicitudes de patente de EE.UU. con número de publicación 20020055474, 20020072089, 20020081659, 20030065157, 20030073623 y 20030219767 y las PCT con número de publicación WO9733902, WO9912965, WO9926976, WO9928462, WO9933980, WO9935170, WO9950416, WO9954460, WO0026244, WO0032776, WO0055320, WO0125256, WO0177291, WO2004020593, WO2004024892, WO2004033637 y 04037996.
Yif1p, SEQ ID NO: 38, se menciona en las solicitudes de patente de EE.UU. con número de publicación 20020131971, 20030166064 y 20040037842 y las PCT con número de publicación WO9933981, WO9947540, WO0173027, WO02060317, WO02070737, WO02076488, WO02095010, WO0224956, WO03004622, WO03038063, WO03042661, WO03054152, WO03064589, WO2004024892, WO2004037996, WO2004047728 y WO2004048938.
Mediante las matrices génicas Human U133a GeneChip de Affymetrix, se analizó la expresión de 22.000 transcritos utilizando ARN total de muestras de tumores congelados de 286 pacientes con cáncer de mama sin compromiso de los ganglios linfáticos (LNN) que no recibieron tratamiento complementario sistémico. Los inventores descubrieron que las medidas de la expresión génica en todo el genoma pueden identificar patrones de actividad
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génica que subclasifican los tumores y proporcionan un medio mejorado para la evaluación del riesgo individual en pacientes con cáncer de mama sin compromiso de los ganglios linfáticos.
En un conjunto de aprendizaje de 115 tumores, los inventores identificaron una firma genética de 76 genes compuesta por 60 genes para pacientes ER positivo y 16 genes para pacientes ER negativo. Esta firma presentó un 93% de sensibilidad y un 48% de especificidad en un conjunto de prueba independiente posterior de 171 pacientes LNN. El perfil genético fue muy informativo a la hora de identificar pacientes que desarrollan metástasis a distancia en un plazo de 5 años (cociente de riesgos instantáneos, HR: 5,67, intervalo de confianza del 95%, IC: 2,59-12,4), incluso cuando se corrige para los factores pronósticos tradicionales en el análisis multivariable (HR: 5,55, IC: 2,46-12,5). El perfil de 76 genes también representó un fuerte factor pronóstico para el desarrollo de metástasis en los subgrupos de 84 pacientes premenopáusicas (HR: 9,60, p = 1,6x10-4), 87 pacientes posmenopáusicas (HR: 4,04, p = 1,7x10-3) y 79 pacientes con un tamaño de tumor de entre 10 mm y 20 mm (HR: 14,1, p = 2,3x10-6), un grupo de pacientes para los que el pronóstico de la enfermedad resulta particularmente difícil.
En este estudio se proporcionan los resultados de un análisis de tumores primarios de 286 pacientes con cáncer de mama LNN de todos los grupos de edad y tamaño de tumor. Los pacientes no recibieron tratamiento complementario sistémico, haciendo de ésta la primera evaluación de pronóstico multigénica sin la contribución potencialmente generadora de confusión por factores predictivos relacionados con el tratamiento sistémico, debidamente validado por un conjunto de prueba independiente y sin restricciones para el tamaño de tumor y la edad. El algoritmo basado en la expresión génica descrito puede predecir, con alto grado de confianza en pacientes LNN, la probabilidad de desarrollar una reaparición a distancia.
Sólo en raras ocasiones la mera presencia o ausencia de secuencias concretas de ácido nucleico en una muestra de tejido ha resultado tener un valor diagnóstico o pronóstico. Por otro lado, se considera cada vez más importante la información acerca de la expresión de diversas proteínas, péptidos o ARNm. La mera presencia de secuencias de ácido nucleico con el potencial de expresar proteínas, péptidos o ARNm (tales secuencias denominadas "genes") dentro del genoma por sí misma no resulta determinante en cuanto a si una proteína, péptido o ARNm se expresa en una determinada célula. Que un determinado gen capaz de expresar proteínas, péptidos o ARNm lo haga o no y en qué medida se produzca dicha expresión, si acaso, viene determinado por diversos factores complejos. Independientemente de las dificultades en la comprensión y la evaluación de estos factores, el ensayo de la expresión génica puede proporcionar información útil sobre la aparición de eventos importantes, tales como la tumorogénesis, la metástasis, la apoptosis y otros fenómenos clínicamente pertinentes. Las indicaciones relativas del grado de actividad o inactividad de los genes pueden encontrarse en los perfiles de expresión génica. Los perfiles de expresión génica de la presente invención se utilizan para proporcionar un pronóstico y para tratar a los pacientes con cáncer de mama.
La preparación de muestras requiere la recolección de muestras de los pacientes. Las muestras de los pacientes utilizadas en el método de la invención son aquellas de las que se sospecha contienen células enfermas, tales como las células epiteliales extraídas del tumor primario en una muestra de mama. También resultan preferentes las muestras tomadas de los márgenes quirúrgicos. Sin embargo, lo más preferentemente, la muestra se toma de un ganglio linfático obtenido de una cirugía de cáncer de mama. La tecnología de microdisección por captura con láser (LCM) es una manera de seleccionar las células a estudiar, minimizando la variabilidad causada por la heterogeneidad del tipo de célula. Por consiguiente, pueden detectarse fácilmente cambios moderados o pequeños en la expresión génica entre las células normales y las cancerosas. Las muestras también pueden comprender células epiteliales circulantes extraídas de sangre periférica. Éstas pueden obtenerse según varios métodos, pero el método más preferente es la técnica de separación magnética descrita en la patente de EE.UU. 6.136.182. Una vez se ha obtenido la muestra que contiene las células de interés, se extrae y amplifica el ARN y se obtiene un perfil de expresión génica, preferentemente mediante micromatrices, para los genes en las carteras apropiadas.
Los métodos preferentes para el establecimiento de perfiles de expresión génica incluyen determinar la cantidad de ARN que es producida por un gen que puede codificar una proteína o péptido. Esto se logra mediante PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR), RT-PCR competitiva, RT-PCR en tiempo real, RT-PCR de presentación diferencial, transferencia Northern y otros ensayos relacionados. Aunque es posible llevar a cabo estas técnicas utilizando reacciones de PCR individuales, es mejor amplificar ADN complementario (ADNc) o ARN complementario (ARNc) producido a partir de ARNm y analizarlo mediante micromatrices. Los expertos en la materia conocen varios métodos y configuraciones de matriz diferentes para su producción y se describen en patentes de EE.UU. tales como: 5.445.934, 5.532.128, 5.556.752, 5.242.974, 5.384.261, 5.405.783, 5.412.087, 5.424.186, 5.429.807, 5.436.327, 5.472.672, 5.527.681, 5.529.756, 5.545.531, 5.554.501, 5.561.071, 5.571.639, 5.593.839, 5.599.695, 5.624.711, 5.658.734 y 5.700.637.
La tecnología de micromatrices permite medir el nivel de ARNm en estado estacionario de miles de genes simultáneamente, presentando de este modo una potente herramienta para identificar efectos tales como la aparición, la detención o la modulación de la proliferación celular incontrolada. Actualmente son de uso generalizado dos tecnologías de micromatrices. La primera son las matrices de ADNc y la segunda son las matrices de oligonucleótidos. Aunque existen diferencias en la construcción de estas matrices génicas, esencialmente los
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análisis de datos de bajada y la salida son iguales. El producto de estos análisis son por lo general mediciones de la intensidad de la señal recibida de una sonda marcada utilizada para detectar una secuencia de ADNc de la muestra que hibrida con una secuencia de ácido nucleico en una ubicación conocida en la micromatriz. Por lo general, la intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de ADNc y, por tanto de ARNm, expresado en las células de la muestra. Se dispone de, y resultan útiles, un gran número de tales técnicas. Los métodos preferentes para determinar la expresión génica pueden encontrarse en las patentes de EE.UU. 6.271.002, 6.218.122, 6.218.114 y
6.004.755.
El análisis de los niveles de expresión se lleva a cabo comparando las intensidades de señal. La mejor manera de hacerlo es generando una matriz de relación de las intensidades de expresión de los genes en una muestra de ensayo frente a las de una muestra de control. Por ejemplo, las intensidades de expresión génica de un tejido enfermo pueden compararse con las intensidades de expresión generadas a partir de tejido normal del mismo tipo (por ejemplo, muestra de tejido enfermo de mama vs. muestra de tejido normal de mama). Una relación de estas intensidades de expresión indica el número de veces que cambia la expresión génica entre las muestras de ensayo y de control.
Los perfiles de expresión génica también pueden presentarse de varias maneras. El método más común es disponer la matriz de relación o las intensidades de fluorescencia sin procesar en un dendrograma gráfico en el que las columnas indican las muestras de ensayo y las filas indican los genes. Los datos se disponen de manera que los genes con perfiles de expresión similares estén próximos entre sí. La relación de expresión para cada gen se visualiza como un color. Por ejemplo, una relación inferior a uno (que indica disminución de la expresión) puede aparecer en la porción azul del espectro mientras que una relación superior a uno (que indica aumento de la expresión) puede aparecer como un color en la porción roja del espectro. Se dispone de programas de software disponibles en el mercado para presentar tales datos, incluido GeneSpring de Agilent Technologies y el software Partek Discover™ y Partek Infer™ de Partek®.
Los genes modulados utilizados en los métodos de la invención se describen en los Ejemplos. Los genes expresados de manera diferencial presentan expresión aumentada o disminuida en pacientes con recidiva de cáncer de mama con respecto a los que no presentan recidiva. Aumento de la regulación y disminución de la regulación son expresiones relativas que significan que se encuentra una diferencia detectable (más allá de la contribución del ruido en el sistema utilizado para medirla) en la cantidad de expresión de los genes con respecto a una medida inicial. En este caso, la medida inicial es la expresión génica medida de un paciente no recidivante. Los genes de interés en las células enfermas (procedentes de pacientes recidivantes) presentan entonces expresión aumentada o disminuida con respecto al nivel inicial utilizando el mismo método de medición. Enfermo, en este contexto, se refiere a una modificación del estado de un cuerpo que interrumpe o altera, o tiene el potencial de alterar, el rendimiento adecuado de las funciones corporales tal como ocurre con la proliferación incontrolada de las células. Existe diagnóstico de enfermedad cuando algún aspecto del genotipo o fenotipo de esa persona es coherente con la presencia de la enfermedad. Sin embargo, el acto de llevar a cabo un diagnóstico o pronóstico incluye determinar cuestiones sobre la enfermedad/estado tales como determinar la probabilidad de recidiva y el seguimiento del tratamiento. En el seguimiento del tratamiento, se elaboran juicios clínicos referentes al efecto de un ciclo terapéutico determinado comparando la expresión de los genes a lo largo del tiempo para determinar si los perfiles de expresión génica han cambiado o están cambiando a patrones más coherentes con el tejido normal.
Preferentemente, los niveles de aumento y disminución de la expresión se distinguen en base a cambios en el número de veces de las mediciones de la intensidad de las sondas de micromatrices hibridadas. Resulta preferente una diferencia de 2,0 veces para hacer tales distinciones (o un valor p inferior a 0,05). Es decir, antes de decir que un gen se expresa de manera diferencial en células enfermas/recidivantes frente a las normales/no recidivantes, la célula enferma resulta producir al menos 2 veces más, o 2 veces menos intensidad que las células normales. Cuanto mayor sea la diferencia en el número de veces, más preferente es el uso del gen como herramienta de diagnóstico o pronóstico. Los genes seleccionados para los perfiles de expresión génica de la presente invención tienen niveles de expresión que dan como resultado la generación de una señal que puede distinguirse de la de los genes normales o no modulados por una cantidad que excede del nivel de fondo utilizando instrumentos de laboratorio clínico.
Pueden utilizarse valores estadísticos para distinguir con seguridad los genes modulados de los no modulados y del ruido. Las pruebas estadísticas encuentran los genes más significativamente diferentes entre los diversos grupos de muestras. La t de Student es un ejemplo de una prueba estadística robusta que puede utilizarse para encontrar diferencias significativas entre dos grupos. Cuanto menor sea el valor p, más convincente será la prueba de que el gen está mostrando una diferencia entre los diferentes grupos. Sin embargo, puesto que las micromatrices miden más de un gen a la vez, pueden realizarse al mismo tiempo decenas de miles de pruebas estadísticas. Debido a esto, es poco probable que se observen valores p pequeños sólo por casualidad y pueden hacerse ajustes para esto utilizando una corrección de Sidak, así como un experimento de aleatorización/permutación. Un valor p inferior a 0,05 mediante la t de Student es una prueba de que el gen es significativamente diferente. Una prueba más convincente es un valor p inferior a 0,05 después de tener en cuenta la corrección de Sidak. Para un gran número de muestras en cada grupo, un valor p inferior a 0,05 después del ensayo de aleatorización/permutación es la prueba más convincente de una diferencia significativa.
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Otro parámetro que puede utilizarse para seleccionar los genes que generan una señal superior a la del gen no modulado o al ruido es el uso de una medición de la diferencia de señal absoluta. Preferentemente, la señal generada por la expresión del gen modulado presenta una diferencia de al menos un 20% con respecto a la del gen normal o no modulado (sobre una base absoluta). Es aún más preferente que tales genes produzcan patrones de expresión que presenten una diferencia de al menos un 30% con respecto a los de los genes normales o no modulados.
Los genes pueden agruparse de manera que la información obtenida sobre el conjunto de genes en el grupo proporcione una base sólida para elaborar un juicio clínicamente pertinente, tal como un diagnóstico, un pronóstico o un tratamiento de elección. Estos conjuntos de genes componen las carteras de la invención. En este caso, los juicios respaldados por las carteras implican un cáncer de mama y su posibilidad de reaparición. Al igual que con la mayoría de los marcadores diagnósticos, suele ser deseable utilizar el menor número de marcadores suficiente para emitir un juicio médico correcto. Esto impide que un retraso en el tratamiento hasta un análisis más detallado, así como un uso inapropiado de tiempo y recursos.
Preferentemente, las carteras se establecen de manera que la combinación de los genes en la cartera presente una sensibilidad y especificidad mejoradas con respecto a genes individuales o combinaciones de genes seleccionados al azar. En el contexto de la presente invención, la sensibilidad de la cartera puede reflejarse en las diferencias del número de veces presentadas por la expresión de un gen en el estado enfermo con respecto al estado normal. La especificidad puede reflejarse en las mediciones estadísticas de la correlación de la señalización de la expresión génica con la afección de interés. Por ejemplo, puede utilizarse la desviación estándar como una medición de este tipo. Al considerar un grupo de genes para su inclusión en una cartera, una pequeña desviación estándar en las mediciones de expresión se correlaciona con una mayor especificidad. También pueden utilizarse otras mediciones de la variación tales como los coeficientes de correlación.
Un método para establecer carteras de expresión génica es a través del uso de algoritmos de optimización tal como el algoritmo de media-varianza ampliamente utilizado en el establecimiento de carteras de acciones. Este método se describe detalladamente en la patente de EE.UU. con número de publicación 20030194734. Esencialmente, el método requiere el establecimiento de un conjunto de entradas (acciones en las aplicaciones financieras, expresión tal como se mide mediante la intensidad en el presente documento) que optimice el rendimiento (por ejemplo, señal que se genera) que se recibe para utilizarlo al tiempo que se reduce al mínimo la variabilidad del rendimiento. Se dispone de muchos programas comerciales de software para llevar a cabo tales operaciones. Resulta preferente "Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application", denominado "Wagner Software" a lo largo de toda la presente memoria. Este software utiliza las funciones de la "Wagner Associates Mean-Variance Optimization Library" para determinar una frontera eficaz y resultan preferentes carteras óptimas en el sentido de Markowitz. El uso de este tipo de software requiere la transformación de los datos de micromatrices de manera que puedan tratarse como entrada de la manera en que se utilizan las mediciones de rendimiento y riesgo de las acciones cuando el software se utiliza para los fines de análisis financiero previstos.
El proceso de selección de una cartera también puede incluir la aplicación de reglas heurísticas. Preferentemente, tales reglas se formulan en base a la biología y la comprensión de la tecnología utilizada para producir resultados clínicos. Más preferentemente, se aplican a la salida del método de optimización. Por ejemplo, puede aplicarse a los datos de micromatrices el método de la media-varianza de selección de carteras, para varios genes expresados de manera diferencial en sujetos con cáncer de mama. La salida del método sería un conjunto de genes optimizado que podría incluir algunos genes que se expresan en sangre periférica así como en el tejido enfermo. Si las muestras utilizadas en el método de ensayo se obtienen de sangre periférica y determinados genes expresados de manera diferencial en los casos de cáncer de mama se expresan de manera diferencial en sangre periférica, entonces puede aplicarse una regla heurística en la que se selecciona una cartera de la frontera eficaz excluyendo los que se expresan de manera diferencial en sangre periférica. Por supuesto, la regla puede aplicarse antes de la formación de la frontera eficaz, por ejemplo, aplicando la regla durante la preselección de datos.
Pueden aplicarse otras reglas heurísticas que no estén necesariamente relacionadas con la biología en cuestión. Por ejemplo, puede aplicarse la regla de que sólo un porcentaje prescrito de la cartera pueda estar representado por un gen o grupo de genes concreto. El software disponible en el mercado, tal como el Wagner Software, se ajusta fácilmente a estos tipos de heurísticas. Esto puede ser útil, por ejemplo, cuando factores distintos de la exactitud y la precisión (por ejemplo, los derechos de licencia previstos) tienen un impacto sobre la conveniencia de incluir uno o más genes.
Un método de la invención implica la comparación de perfiles de expresión génica para diversos genes (o carpetas) para atribuir pronósticos. Los perfiles de expresión génica de cada uno de los genes que comprenden la cartera se fijan en un medio tal como un medio legible por ordenador. Este puede adoptar varias formas. Por ejemplo, puede establecerse una tabla en la que la entrada sea el intervalo de señales (por ejemplo, mediciones de intensidad) indicativo de enfermedad. A continuación, pueden compararse los datos reales del paciente con los valores de la tabla para determinar si las muestras del paciente son normales o enfermas. En una forma de realización más sofisticada, los patrones de las señales de expresión (por ejemplo, la intensidad de fluorescencia) se registran digitalmente o gráficamente.
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A continuación, se comparan los patrones de expresión génica de las carpetas de genes utilizados junto con las muestras del paciente, con los patrones de expresión. A continuación, puede utilizarse el software de comparación de patrones para determinar si las muestras del paciente tienen un patrón indicativo de reaparición de la enfermedad. Por supuesto, estas comparaciones también pueden utilizarse para determinar si no es probable que el paciente experimente reaparición de la enfermedad. A continuación, se comparan los perfiles de expresión de las muestras con la cartera de una célula de control. Si los patrones de expresión de la muestra son coherentes con el patrón de expresión para la reaparición de un cáncer de mama, entonces (en la ausencia de consideraciones médicas contrarias) se trata al paciente como podría tratarse a un paciente recidivante. Si los patrones de expresión de la muestra son coherentes con el patrón de expresión de la célula normal/de control, se obtiene un diagnóstico negativo para cáncer de mama.
Los perfiles preferentes de la presente descripción son la cartera de 35 genes compuesta por los genes de las SEQ ID NO: 1-35, la cartera de 60 genes compuesta por los genes de las SEQ ID NO: 36-95, que se utiliza preferentemente para el pronóstico de pacientes ER positivo, y la cartera de 16 genes compuesta por genes de las SEQ ID NO: 96-111 que se utiliza preferentemente para el pronóstico de pacientes ER negativo. Lo más preferentemente, la cartera está compuesta por genes de las SEQ ID NO: 36-111. Esta cartera más preferente segrega mejor los pacientes con cáncer de mama independientemente del estado ER con alto riesgo de recidiva de los que no lo son. Una vez identificados los pacientes con alto riesgo, éstos pueden tratarse con un tratamiento complementario.
En la presente invención, el método más preferente para analizar el patrón de expresión génica de un paciente para determinar el pronóstico de cáncer de mama es mediante el uso del programa de análisis de riesgos de Cox. Lo más preferentemente, el análisis se lleva a cabo utilizando el software S-Plus (disponible en el mercado de Insightful Corporation). Mediante tales métodos, se compara un perfil de expresión génica con el de un perfil que representa con seguridad recidiva (es decir, los niveles de expresión para la combinación de genes en el perfil son indicativos de recidiva). Se utiliza el modelo de riesgo de Cox con el umbral establecido para comparar la similitud de los dos perfiles (recidiva conocida frente a paciente) y a continuación determina si el perfil del paciente supera el umbral. Si lo hace, el paciente se clasifica como recidivante en el futuro y se da un tratamiento tal como un tratamiento complementario. Si el perfil del paciente no supera el umbral, entonces se clasifica como paciente no recidivante. También pueden utilizarse otras herramientas analíticas para responder a la misma pregunta, tales como el análisis discriminante lineal, la regresión logística y los enfoques de redes neuronales.
Se dispone de muchos otros métodos bien conocidos de reconocimiento de patrones. Las siguientes referencias proporcionan algunos ejemplos:
Votación ponderada: Golub et al. (1999).
Máquinas de vectores de soporte: Su et al. (2001); y Ramaswamy et al. (2001).
K vecinos más cercanos: Ramaswamy (2001).
Coeficientes de correlación: van’t Veer et al. (2002).
Los perfiles de expresión génica de la presente invención también pueden utilizarse junto con otros métodos de diagnóstico no genéticos útiles en el diagnóstico, el pronóstico o el seguimiento del tratamiento del cáncer. Por ejemplo, en algunas circunstancias resulta beneficioso combinar la potencia diagnóstica de los métodos en base a la expresión génica descritos anteriormente con los datos procedentes de marcadores convencionales tales como los marcadores seroproteicos (por ejemplo, el antígeno tumoral 27.29 ("CA 27.29")). Existe una variedad de tales marcadores, incluidos analitos tales como CA 27.29. En uno de tales métodos, se extrae periódicamente sangre de un paciente tratado y a continuación se somete a un inmunoensayo enzimático para uno de los marcadores séricos descritos anteriormente. Cuando la concentración del marcador sugiere la reaparición de tumores o el fracaso del tratamiento, se toma una fuente de muestras susceptible de análisis de la expresión génica. Cuando existe una masa sospechosa, se toma una biopsia por aspiración con aguja fina (FNA) y a continuación se analizan los perfiles de expresión génica de las células extraídas de la masa, como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, pueden tomarse muestras de tejido de las zonas adyacentes al tejido del que se eliminó con anterioridad un tumor. Este enfoque puede ser particularmente útil cuando otros ensayos producen resultados ambiguos.
Los artículos incluyen representaciones de los perfiles de expresión génica útiles para tratar, diagnosticar, pronosticar y evaluar de otra manera las enfermedades. Estas representaciones de perfiles se reducen a un medio que puede ser leído automáticamente por una máquina tal como medios legibles por ordenador (magnéticos, ópticos, y similares). Los artículos también pueden incluir instrucciones para evaluar los perfiles de expresión génica en tales medios. Por ejemplo, los artículos pueden comprender un CD ROM con instrucciones informáticas para comparar los perfiles de expresión génica de las carteras de los genes descritos anteriormente. Los artículos también pueden tener perfiles de expresión génica registrados digitalmente en los mismos de manera que puedan compararse con los datos de expresión génica de las muestras del paciente. Como alternativa, los perfiles pueden registrarse en diferentes formatos de representación. Un registro gráfico es uno de tales formatos. Los algoritmos de clustering, tales como los incorporados en el software Partek Discover™ y Partek Infer™ de Partek® mencionados anteriormente pueden ayudar a visualizar mejor tales datos.
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Los diferentes tipos de artículos de fabricación según la descripción son medios o ensayos formateados utilizados para poner de manifiesto los perfiles de expresión génica. Estos pueden comprender, por ejemplo, micromatrices en las que las sondas o los complementos de secuencia están fijados a una matriz con la que se combinan las secuencias indicativas de los genes de interés, creando un determinante legible de su presencia. Como alternativa, los artículos según la descripción pueden fabricarse en forma de kits de reactivos para llevar a cabo la hibridación, la amplificación y la generación de señales indicativas del nivel de expresión de los genes de interés para detectar un cáncer de mama.
Los kits fabricados según la invención incluyen ensayos formateados para determinar los perfiles de expresión génica. Estos pueden incluir todos o algunos de los materiales necesarios para llevar a cabo los ensayos, tales como reactivos e instrucciones.
La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos: Los genes analizados según la presente invención están por lo general relacionados con las secuencias de ácido nucleico de longitud completa que codifican la producción de una proteína o péptido. Un experto en la materia reconocerá que la identificación de secuencias de longitud completa no es necesaria desde un punto de vista analítico. Es decir, pueden seleccionarse porciones de las secuencias o EST, según principios bien conocidos, para las que pueden diseñarse sondas para evaluar la expresión génica para el gen correspondiente.
Ejemplo 1
Manipulación de muestras y trabajo con micromatrices.
Se seleccionaron muestras de tumores congelados de pacientes LNN tratados durante 1980-1995, pero no tratados con el tratamiento neocomplementario sistémico de nuestro banco de tumores en el Erasmus Medical Center (Rotterdam, Países Bajos). Todas las muestras de tumores se enviaron a nuestro laboratorio de referencia desde 25 hospitales regionales para las mediciones del receptor de hormonas esteroideas. Las directrices para el tratamiento primario fueron similares para todos los hospitales. Se seleccionaron los tumores de manera que se evitara el sesgo. En el supuesto de un 25%-30% en 5 años, y una pérdida sustancial de los tumores debido a razones de control de calidad, se procesaron 436 muestras de tumores invasivos. Se incluyeron pacientes con un resultado clínico malo, intermedio y bueno. Se rechazaron muestras en base al contenido insuficiente del tumor (53), la mala calidad del ARN (77) o la mala calidad de la matriz génica (20), lo que dejó 286 muestras aptas para su posterior análisis.
El protocolo de estudio fue aprobado por el comité de ética médica institucional (MEC. no. 02.953). La mediana de la edad de los pacientes en el momento de la cirugía (cirugía conservadora de mama: 219 pacientes; mastectomía radical modificada: 67 pacientes) fue de 52 años (intervalo, 26-83 años). Se administró radioterapia a 248 pacientes (87%) según nuestro protocolo institucional. Las proporciones de pacientes que se sometieron a tratamiento conservador de mama y radioterapia son normales para la enfermedad LNN. Los pacientes fueron incluidos independientemente del estado de la radioterapia, ya que este estudio no tuvo como objetivo investigar los efectos potenciales de un tipo específico de cirugía o de radioterapia complementaria. Además, los estudios han demostrado que la radioterapia no tiene un efecto claro sobre la reaparición a distancia de la enfermedad. Early Breast Cancer Trialists (1995). La negatividad de los ganglios linfáticos se basó en el examen patológico por parte de patólogos regionales. Foekens et al. (1989a).
Antes de la inclusión, se confirmó que las 286 muestras de tumor tenían tumor suficiente (> 70%) y una implicación uniforme del tumor en secciones congeladas de 5 µm teñidas con H&E. Se midieron los niveles de ER (y PgR) mediante ensayo de unión a ligando o inmunoensayo enzimático (EIA) (Foekens et al. (1989b)) o mediante inmunohistoquímica (en 9 tumores). Los valores límite utilizados para clasificar a los pacientes como positivos o negativos para ER y PR fue 10 fmol/mg de proteína o un 10% de células tumorales positivas. El seguimiento postoperatorio implicaba un examen cada 3 meses durante los primeros 2 años, cada 6 meses durante 3 a 5 años y cada 12 meses a partir del quinto año. La fecha del diagnóstico de metástasis se definió como la fecha de confirmación de metástasis después de los síntomas comunicados por el paciente, la detección de signos clínicos o en un seguimiento habitual. La mediana del período de seguimiento de los pacientes supervivientes (n = 198) fue de 101 meses (intervalo, 20-171). De los 286 pacientes incluidos, 93 (33%) presentaron pruebas de metástasis a distancia en un plazo de 5 años y se contaron como fracasos en el análisis de la supervivencia sin metástasis a distancia (DMFS). Cinco pacientes (2%) fallecieron sin pruebas de enfermedad y se censuraron en el último seguimiento. Ochenta y tres pacientes (29%) fallecieron después de una recidiva anterior. Por lo tanto, un total de 88 pacientes (31%) fueron fracasos en el análisis de la supervivencia global (OS).
Ejemplo 2
Análisis de expresión génica de los datos obtenidos en el Ejemplo 1
Se aisló ARN total de 20 a 40 secciones de criostato de 30 µm de espesor (50 mg-100 mg) con RNAzol B
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(Campro Scientific, Veenendaal, Países Bajos). Las dianas biotiniladas se prepararon utilizando métodos publicados (Affymetrix, CA, Lipshutz et al. (1999)) y se hibridaron con la micromatriz de oligonucleótidos de Affymetrix U133a GeneChip. Las matrices se escanearon utilizando los protocolos estándar de Affymetrix. Cada conjunto de sondas se trató como un gen separado. Los valores de la expresión se calcularon utilizando el software de análisis GeneChip de Affymetrix MAS 5.0. Las matrices génicas se rechazaron si la intensidad media era <40 o si la señal de fondo era > 100. Para normalizar las señales de las matrices génicas, los conjuntos de sondas se escalaron a una intensidad diana de 600 y no se seleccionaron los archivos de máscara de escala (scale mask files).
Ejemplo 3
Análisis estadístico de los genes identificados en el Ejemplo 2
Se filtraron los datos de expresión génica para incluir los genes invocados como "presente" en dos o más muestras. 17.819 genes pasaron este filtro y se utilizaron para el agrupamiento jerárquico. Antes del agrupamiento, se dividió el nivel de expresión de cada gen por la mediana de su nivel de expresión en los pacientes. Esta etapa de estandarización limitaba el efecto de la magnitud de la expresión de los genes y agrupaba los genes con patrones de expresión similares en el análisis de algoritmos de agrupamiento. Para identificar los subgrupos de pacientes, se llevó a cabo el agrupamiento jerárquico con enlace medio en los genes y en las muestras utilizando GeneSpring 6•0.
Para identificar los genes que discriminan a los pacientes que desarrollaron metástasis a distancia de aquellos que siguieron libres de metástasis durante 5 años, los inventores utilizaron dos enfoques de predicción de clases supervisados. En el primer enfoque, se asignaron al azar 286 pacientes a conjuntos de aprendizaje y de prueba de 80 y 206 pacientes, respectivamente. Se examinaron las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier (Kaplan et al. (1958)) para los dos conjuntos para garantizar que no hubiese diferencia significativa y la selección al azar de los conjuntos de aprendizaje y ensayo no introdujo ningún sesgo. En el segundo enfoque, se asignaron los pacientes a uno de los dos subgrupos estratificados mediante el estado ER (Fig. 1).
Se analizó por separado cada subgrupo de pacientes a fin de seleccionar los marcadores. Se asignaron al azar los pacientes en el subgrupo ER positivo a conjuntos de aprendizaje y ensayo de 80 y 129 pacientes, respectivamente. Se dividieron al azar los pacientes en el subgrupo ER negativo en conjuntos de aprendizaje y ensayo de 35 y 42 pacientes, respectivamente. Los marcadores seleccionados de cada conjunto de aprendizaje del subgrupo se combinaron para formar una sola firma para predecir la metástasis tumoral para los pacientes ER positivo y ER negativo en una validación independiente posterior.
El tamaño de la muestra del conjunto de aprendizaje se determinó mediante un método de remuestreo para garantizar su nivel de confianza estadística. En resumen, el número de pacientes en el conjunto de aprendizaje comenzó en 15 pacientes y se incrementó en etapas de 5. Para un tamaño de muestra determinado, se realizaron 10 conjuntos de aprendizaje con pacientes seleccionados al azar. Se construyó una firma genética a partir de cada uno de los conjuntos de aprendizaje y a continuación se ensayó en un conjunto de prueba establecido de pacientes mediante el análisis de la curva de eficacia diagnóstica (ROC) con metástasis a distancia en un plazo de 5 años como punto definitorio. Se calcularon la media y el coeficiente de variación (CV) del área bajo la curva (AUC) para un tamaño de muestra determinado. Se eligió un número mínimo de pacientes necesarios para el conjunto de aprendizaje en el punto en que la AUC media alcanzaba una meseta y el CV de las 10 AUC era inferior al 5%.
Los genes se seleccionaron de la siguiente manera. En primer lugar, se utilizó la regresión de riesgos proporcionales de Cox univariante para identificar los genes para los que la expresión (en la escala log2) se correlacionaba con la longitud de DMFS. Para reducir el efecto de múltiples ensayos y para ensayar la robustez de los genes seleccionados, se construyó el modelo de Cox con el método bootstrap de los pacientes en el conjunto de aprendizaje. Efron et al. (1981). En resumen, se construyeron 400 muestras bootstrap del conjunto de aprendizaje, cada una con 80 pacientes elegidos al azar con reemplazo. Se ejecutó un modelo de Cox en cada una de las muestras bootstrap. Se creó una puntuación bootstrap para cada gen eliminando el 5% de los valores p superior e inferior y a continuación promediando las inversas de los restantes valores p bootstrap. Se utilizó esta puntuación para clasificar los genes. Para construir una firma genética múltiple, se ensayaron combinaciones de marcadores génicos añadiendo los genes de uno en uno según el orden de clasificación. Se realizó el análisis ROC utilizando metástasis a distancia en un plazo de 5 años como punto definitorio para calcular el área bajo la AUC para cada firma con un número cada vez mayor de genes hasta alcanzar un valor de AUC máximo.
Se utilizó la puntuación de recidiva (RS) para calcular el riesgo de metástasis a distancia de cada paciente. La puntuación se definió como la combinación lineal de señales de expresión ponderadas con el coeficiente de regresión de Cox estandarizado como coeficiente de ponderación.
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en la que
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A y B son constantes
wi es el coeficiente de regresión de Cox estandarizado para ER + marcador
xi es el valor de la expresión de ER + marcador en una escala log2
wj es el coeficiente de regresión de Cox estandarizado para ER – marcador
xj es el valor de la expresión de ER -marcador en una escala log2
El umbral se determinó a partir de la curva ROC del conjunto de aprendizaje para garantizar el 100% de sensibilidad y la especificidad más alta. Se eligieron unos valores de las constantes A de 313,5 y B de 280 para centrar el umbral de la RS a cero para los pacientes ER positivo y los ER negativo. Los pacientes con puntuaciones RS positivas se clasificaron en el grupo de mal pronóstico y los pacientes con puntuaciones RS negativas se clasificaron en el grupo de buen pronóstico. La firma genética y el límite se validaron en el conjunto de prueba. Se utilizaron gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier y ensayos de rango logarítmico para evaluar las diferencias en el tiempo hasta la metástasis a distancia de los grupos con predicción de alto y bajo riesgo. Las oportunidades relativas (OR) se calcularon como la relación de las posibilidades de metástasis a distancia entre los pacientes con predicción de recidiva y aquellos con predicción de seguir libres de recidiva.
Los análisis univariable y multivariable con la regresión de riesgos proporcionales de Cox se realizaron en las variables clínicas individuales con y sin la firma genética. El HR y su intervalo de confianza del 95% (CI) se obtuvieron a partir de estos resultados. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software S-Plus 6.1 (Insightful, VA).
Ejemplo 4
Análisis de vías de los genes identificados en el Ejemplo 3
Se asignó una clase funcional a cada uno de los genes en el gen de firma pronóstica. Se realizó el análisis de vías con el software Ingenuity 1.0 (Ingenuity Systems, CA). Se utilizaron sondas de Affymetrix como entrada para buscar las redes biológicas construidas por el software. Las redes biológicas identificadas por el programa se evaluaron en el contexto de las clases funcionales generales mediante clasificación por ontología GO. Se seleccionaron y evaluaron las vías con dos o más genes en la firma pronóstica.
Ejemplo 5
Resultados para los Ejemplos 1-4
Características de los pacientes y de los tumores
Las características clínicas y patológicas de los 286 pacientes se resumen en la Tabla 1.
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Tabla 1. Características clínicas y patológicas de los pacientes y de sus tumores
Características
Todos Conjunto de Conjunto de Conjunto de
los pacientes
aprendizaje aprendizaje validación (%)
(%)
ER positivo (%) ER negativo (%)
Número
286 80 35 171
Edad (media ± DE)
54±12 54±13 54±13 54±12
≤ 40 años
36(13) 12(15) 3(9) 21(12)
41-55 años
129(45) 30(38) 17(49) 82(48)
56-70 años
89(31) 28(35) 11(31) 50(29)
>70 años
32(11) 1(13) 4(11) 18(11)
Estado menopáusico
Premenopáusica
139(49) 39(49) 16(46) 84(49)
Posmenopáusica
147(51) 41(51) 19(54) 87(51)
Estadio T
T1
146(51) 38(48) 14(40) 94(55)
T2
132(46) 41(51) 19(54) 72(42)
T3/4
8(3) 1(1) 2(6) 5(3)
Grado de diferenciación
Escaso
148(52) 37(46) 24(69) 87(51)
Moderado
42(15) 12(15) 3(9) 27(16)
Bueno
7(2) 2(3) 2(6) 3(2)
Desconocido
89(31) 2(36) 6(17) 54(32)
ER*
Positivo
209(73) 80(100) 0(0) 129(75)
Negativo
77(27) 0(0) 35(100) 42(25)
PgR*
Positivo
165(58) 59(74) 5(14) 101(59)
Negativo
111(39) 19(24) 29(83) 63(37)
Desconocido
10(3) 2(2) 1(3) 7(4)
Metástasis <5 años
Sí
93(33) 24(30) 13(37) 56(33)
No
183(64) 51(64) 17(49) 115(67)
Censurado si <5 años
10(3) 5(6) 5(14) 0(0)
*ER positivo y PgR positivo: > 10 fmol/mg de proteína o > 10% de células tumorales positivas
No hubo diferencias en la edad o el estado menopáusico. El grupo de aprendizaje ER negativo tuvo una proporción ligeramente mayor de tumores más grandes y, como se esperaba, más tumores con escaso grado de diferenciación que el grupo de aprendizaje ER positivo. El grupo de validación de 171 pacientes (129 ER positivo, 42 ER negativo) no se diferenció del grupo total de 286 pacientes con respecto a ninguno de las características de los pacientes o de los tumores.
Se utilizaron dos enfoques para identificar los marcadores predictivos de recidiva de la enfermedad. En primer lugar, se dividieron al azar los 286 pacientes (ER positivo y ER negativo combinados) en un conjunto de aprendizaje y un conjunto de prueba. Se seleccionaron treinta y cinco genes de 80 pacientes en el conjunto de aprendizaje y se construyó un modelo de Cox para predecir la aparición de metástasis a distancia. Se observó un valor pronóstico moderado. Tabla 2. El análisis de algoritmos de agrupamiento no supervisado mostró dos subgrupos distintos altamente correlacionados con estado ER del tumor (ensayo de chi cuadrado: p <0,0001). Figura 1B, que respaldaba el segundo enfoque en el que los pacientes se colocaban primero en subgrupos en base al estado ER.
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Tabla 2
SEQ ID NO:
Coeficiente de Cox Valor p
1
4,008 0,00006
2
-3,649 0,00026
3
4,005 0,00006
4
-3,885 0,00010
5
-3,508 0,00045
6
-3,176 0,00150
7
3,781 0,00016
8
3,727 0,00019
9
-3,570 0,00036
10
-3,477 0,00051
11
3,555 0,00038
12
-3,238 0,00120
13
-3,238 0,00120
14
3,405 0,00066
15
3,590 0,00033
16
-3,157 0,00160
17
-3,622 0,00029
18
-3,698 0,00022
19
3,323 0,00089
20
-3,556 0,00038
21
-3,317 0,00091
22
-2,903 0,00370
23
-3,338 0,00085
24
-3,339 0,00084
25
-3,355 0,00079
26
3,713 0,00021
27
-3,325 0,00088
28
-2,984 0,00284
29
3,527 0,00042
30
-3,249 0,00116
31
-2,912 0,00360
32
3,118 0,00182
33
3,435 0,00059
34
-2,971 0,00297
35
3,282 0,00103
Se analizó cada subgrupo con el fin de seleccionar los marcadores. Se seleccionaron setenta y seis genes de pacientes en los conjuntos de aprendizaje (60 para el grupo ER positivo, 16 para el grupo ER negativo) (Fig. 2A, izquierda). Con los genes seleccionados y el estado ER en conjunto, se construyó un modelo de Cox para predecir la reaparición del cáncer para todos los pacientes LNN. La validación del predictor de 76 genes en el conjunto de prueba de 171 pacientes produjo una ROC con un valor de AUC de 0,694, una sensibilidad del 93% (52/56) y una especificidad del 48% (55/115) (Fig. 2A, derecha). Los pacientes con una puntuación de recidiva por encima del umbral de la firma pronóstica tienen una OR 11•9 veces superior (IC del 95%: 4,04-35,1, p <0,0001) de desarrollar metástasis a distancia en un plazo de 5 años. Como control, se generaron conjuntos de 76 genes seleccionados al azar. Estos produjeron una ROC con un valor de AUC medio de 0,515, una sensibilidad del 91% y una especificidad del 12% en el grupo de prueba. Los pacientes estratificados mediante un conjunto de genes de este tipo tendrían una oportunidad relativa de 1,3 (0,50-3,90, p = 0,8) de desarrollar metástasis, lo que indica una clasificación aleatoria. Además, el análisis de Kaplan-Meier para la supervivencia libre de metástasis a distancia (DMFS) y la supervivencia global (OS) en función de la firma genética de 76 genes mostró diferencias muy significativas en el tiempo hasta la metástasis entre los grupos con predicción de buen y mal pronóstico (Fig. 2). A los 60 y 80 meses, las respectivas diferencias absolutas en DMFS entre los grupos con predicción de buen y mal pronóstico eran del 40% (93% vs. 53%) y del 39% (88% vs. 49%) y aquellos en OS eran del 27% (97% vs. 70%) y del 32% (95% vs. 63%), respectivamente.
El perfil de 76 genes también representó un factor pronóstico sólido para el desarrollo de metástasis a distancia en los subgrupos de 84 pacientes premenopáusicas (HR: 9,60), 87 pacientes posmenopáusicas (HR: 4,04) y 79 pacientes con tamaños de tumor de 10 mm a 20 mm (HR: 14,1) (Fig. 3.).
La regresión de Cox univariante y multivariable se resumen en la Tabla 3.
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Tabla 3: Análisis univariante y multivariable para DMFS en el conjunto de prueba de 171 pacientes LNN
Análisis univariante Análisis multivariable*
HR†
(95% CI)† Valor p HR† (95%CI)† Valor p
Edad ‡
Edad2 vs. Edad1
1,16 (0,51 -2,65) 0,7180 1,14 (0,45 -2,91) 0,7809
Edad3 vs. Edad1
1,32 (0,56 -3,10) 0,5280 0,87 (0,26 -2,93) 0,8232
Edad4 vs. Edad1
0,95 (0,32 -2,82) 0,9225 0,61 (0,15 -2,60) 0,5072
Menopáusica
1,24 (0,76 -2,03) 0,3909 1,53 (0,68 -3,44) 0,3056
Estado§
Estadio
1,08 (0,66 -1,77) 0,7619 2,57 (0,23 -29,4) 0,4468
Diferenciación ¶
0,38 (0,16 -0,90) 0,0281 0,60 (0,24 -1,46) 0,2590
Tamaño de tumor**
1,06 (0,65 -1,74) 0,8158 0,34 (0,03 -3,90) 0,3849
ER††
1,09 (0,61 -1,98) 0,7649 1,05 (0,54 -2,04) 0,8935
PR†† Firma genética de 76 genes
0,83 5,67 (0,51 -1,38) (2,59 -12,4) 0,4777 1,5 x 10-5 0,85 5,55 (0,47 -1,53) (2,46 -12,5) 0,5882 3,6 x 10-5
* El modelo multivariable incluía 162 pacientes, debido a que faltaban valores en 9 pacientes
† Cociente de riesgos instantáneos e intervalo de confianza del 95%
‡ Edad1 es ≤ 40 años, Edad2 es de 41 a 55 años, Edad3 es de 56 a 70 años, Edad4 es > 70 años §Posmenopáusica vs. premenopáusica
Estadio: II y III vs. I ¶Grado de diferenciación: moderado/bueno vs. escaso, grado de diferenciación desconocido se incluyó
como grupo distinto ** Tamaño de tumor > 20 mm vs. ≤20mm
†† Positivo vs. negativo
Aparte de la firma genética de 76 genes, sólo de grado de diferenciación fue significativo en el análisis univariante y se asoció una diferenciación moderada/buena con una DMFS favorable. La estimación de regresión multivariable de HR para la aparición de metástasis tumoral en un plazo de 5 años fue de 5,55 (p <0,0001), lo que indica que el conjunto de 76 genes representa una firma pronóstica independiente fuertemente asociada con un mayor riesgo de metástasis tumoral. Los análisis univariante y multivariable también se realizaron por separado para los pacientes ER positivo y ER negativo. La firma genética de 76 genes también fue una variable pronóstica independiente en los subgrupos estratificados por el estado ER.
Se analizó la función de los 76 genes (Tabla 4) en la firma pronóstica para relacionar los genes con las vías biológicas.
Tabla 4
Estado ER SEQ ID NO. Coeficiente de Cox est. Valor p de Cox
+
36 -3,83 0,00005
+
37 -3,865 0,00001
+
38 3,63 0,00002
+
39 -3,471 0,00016
+
40 3,506 0,00008
+
41 -3,476 0,00001
+
42 3,392 0,00006
+
43 -3,353 0,00080
+
44 -3,301 0,00038
+
45 3,101 0,00033
+
46 -3,174 0,00128
+
47 3,083 0,00020
+
48 3,336 0,00005
+
49 -3,054 0,00063
+
50 -3,025 0,00332
+
51 3,095 0,00044
+
52 -3,175 0,00031
+
53 -3,082 0,00086
+
54 3,058 0,00016
+
55 3,085 0,00009
+
56 -2,992 0,00040
15
25
35
45
55
65
Estado ER + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
SEQ ID NO. 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95
-96 -3,495 0,00011 -97 3,224 0,00036 -98 -3,225 0,00041 -99 -3,145 0,00057 -100 -3,055 0,00075 -101 -3,037 0,00091 -102 -3,066 0,00072 -103 3,06 0,00077 -104 -2,985 0,00081 -105 -2,983 0,00104 -106 -3,022 0,00095 -107 -3,054 0,00082 -108 -3,006 0,00098 -109 -2,917 0,00134 -110 -2,924 0,00149 -111 -2,882 0,0017
Aunque 18 de los 76 genes tienen una función desconocida, se identificaron varias vías o actividades
bioquímicas que fueron bien representadas, tales como la muerte celular, el ciclo celular y la proliferación, la
replicación y reparación del ADN y la respuesta inmunitaria (Tabla 5).
20
Coeficiente de Cox est.
-2,791 -2,948 2,931 -2,896 2,924 2,915 -2,968 2,824 -2,777 -2,635 -2,854 2,842 -2,835 2,777 -2,759 -2,745 2,79 2,883 -2,794 -2,743 -2,761 -2,831 2,659 -2,715 2,836 -2,687 -2,631 -2,716 2,703 -2,641 -2,686 -2,654 2,695 -2,758 2,702 -2,694 2,711 -2,771 2,604 Valor p de Cox 0,00020 0,00039 0,00020 0,00052 0,00050 0,00055 0,00099 0,00086 0,00398 0,00160 0,00053 0,00051 0,00033 0,00164 0,00222 0,00086 0,00049 0,00031 0,00139 0,00088 0,00164 0,00535 0,00073 0,00376 0,00029 0,00438 0,00226 0,00089 0,00232 0,00537 0,00479 0,00363 0,00095 0,00222 0,00084 0,00518 0,00049 0,00156 0,00285
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Tabla análisis 5. Análisis de vías de los 76 genes de la firma pronóstica
Clase funcional Firma genética de 76 genes
Muerte celular TNFSF10, TNFSF13, MAP4, CD44, IL18, GAS2, NEFL, EEF1A2, BCLG, C3
Ciclo celular CCNE2, CD44, MAP4, SMC4L1, TNFSF10, AP2A2, FEN1, KPNA2, ORC3L,
PLK1
Proliferación CD44, IL18, TNFSF10, TNFSF13, PPP1CC, CAPN2, PLK1, SAT
Recombinación/reparación, TNFSF10, SMC4L1, FEN1, ORC3L, KPNA2, SUPT16H, POLQ, ADPRTL1
replicación de ADN
Respuesta inmunitaria TNFSF10, CD44, IL18, TNFSF13, ARHGDIB, C3
Crecimiento PPP1CC, CD44, IL18, TNFSF10, SAT, HDGFRP3
Ensamblaje y organización MAP4, NEFL, TNFSF10, PLK1, AP2A2, SMC4L1
celular
Transcripción KPNA2, DUSP4, SUPT16H, DKFZP434E2220, PHF11, ETV2
Señalización e interacción CD44, IL18, TNFSF10, TNFSF13, C3
intercelular
Supervivencia TNFSF10, TNFSF13, CD44, NEFL
Desarrollo IL18, TNFSF10, COL2A1
Morfología celular CAPN2, CD44, TACC2
Síntesis de proteínas IL18, TNFSF10, EEF1A2
Unión a ATP PRO2000, URKL1, ACACB
Unión a ADN HIST1H4H, DKFZP434E2220, PHF11
Formación de colonias CD44, TNFSF10
Adhesión CD44, TMEM8
Neurogénesis CLN8, NEURL
Aparato de Golgi GOLPH2, BICD1
Actividad quinasa CNK1, URKL1
Actividad transferasa FUT3, ADPRTL1
Se descubrieron genes implicados en la evolución de la enfermedad, incluidos calpaina2, proteína de reconocimiento del origen, fosfatasas de doble especificidad, inhibidor de la disociación Rho-GDP, proteína de la superfamilia TNF, componente 3 del complemento, proteína asociada a microtúbulos, proteína fosfatasa 1 y regulador de la apoptosis BCL-G. Además, en la firma genética había genes pronósticos caracterizados con anterioridad tales como ciclina E2 (Keyomarsi et al. (2002)) y CD44 (Herrera-Gayol et al. (1999)).
Ejemplo 6
Análisis de los Ejemplos 1-5
Los inventores proporcionan resultados de un análisis de tumores primarios de 286 pacientes con cáncer de mama sin compromiso de los ganglios linfáticos de todos los grupos de edad y tamaños de tumor. Los pacientes no habían recibido tratamiento complementario sistémico, por lo que la evaluación de pronóstico multigénica no estaba sujeta a las contribuciones potencialmente generadoras de confusión por factores predictivos relacionados con el tratamiento sistémico.
Este estudio puso de manifiesto una firma genética de 76 genes que predice con exactitud la reaparición de tumores a distancia. Esta firma es aplicable a todos los pacientes de cáncer de mama LNN independientemente de la edad, el tamaño y el grado de diferenciación del tumor y del estado ER. En el análisis multivariable de Cox para DMFS la firma genética de 76 genes fue la única variable significativa, reemplazando a las variables clínicas, incluido el grado de diferenciación. Al cabo de 5 años, las diferencias absolutas en DMFS y OS entre los pacientes con las firmas genéticas de 76 genes buenas y malas fueron del 40% y del 27%, respectivamente. De los pacientes con una firma de pronóstico bueno, el 7% desarrolló metástasis a distancia y el 3% murió en un plazo de 5 años. Si se valida más a fondo, esta firma pronóstica producirá un valor predictivo positivo del 37% y un valor predictivo negativo del 95%, en el supuesto de una tasa de reaparición de la enfermedad del 25% en pacientes LNN. En concreto, esta firma puede ser valiosa para definir el riesgo de reaparición para la creciente proporción de tumores T1 (< 2 cm). La comparación con las directrices del St. Gallen y del NIH fue instructiva. Aunque garantizando que el mismo número de los pacientes de alto riesgo reciba el tratamiento necesario, la firma genética de 76 genes recomendaría la quimioterapia complementaria sistémica sólo al 52% de los pacientes de bajo riesgo, en comparación con el 90% y el 89% según las directrices del St. Gallen y del NIH, respectivamente (Tabla 6).
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Tabla 6. Comparación de la firma genética de 76 genes y el actual consenso convencional sobre el tratamiento del cáncer de mama
Pacientes orientados a recibir quimioterapia complementaria en el conjunto de prueba
Método
Enfermedad metastásica Libre de enfermedad metastásica a los 5 años (%)
a los 5 años (%) St. Gallen 52/55 (95) 104/115 (90) NIH 52/55 (95) 101/114 (89) Firma genética de 76 genes
52/56 (93)
60/115 (52) Los criterios de consenso convencionales. St. Gallen: tumor ≥ 2 cm, ER negativo, grado de diferenciación 2-3, paciente <35 años (cualquiera de estos criterios); NIH: tumor > 1 cm.
Por lo tanto, la firma genética de 76 genes puede dar como resultado una reducción del número de pacientes LNN de bajo riesgo a los que se recomienda un tratamiento complementario sistémico innecesario.
Los 76 genes en la firma pronóstica pertenecen a muchas clases funcionales, lo que sugiere que diferentes vías podrían conducir a la evolución de la enfermedad. La firma incluía genes bien caracterizados y 18 genes desconocidos. Este hallazgo podría explicar el rendimiento superior de esta firma en comparación con otros factores pronósticos. Aunque se encontraron genes implicados en la muerte celular, la proliferación celular y la regulación de la transcripción en ambos grupos de pacientes estratificados por el estado ER, los 60 genes seleccionados para el grupo ER positivo y los 16 genes seleccionados para el grupo ER negativo no tuvieron ninguna superposición. Este resultado respalda la idea de que la medida de la heterogeneidad y los mecanismos subyacentes para la evolución de la enfermedad podrían diferir para los dos subgrupos basados en el ER de los pacientes con cáncer de mama.
La comparación de nuestros resultados con los del estudio de van de Vijver et al. (2002) es difícil debido a las diferencias en los pacientes, las técnicas y los materiales utilizados. Van de Vijver et al. incluyeron pacientes sin compromiso de los ganglios linfáticos y con compromiso de los ganglios linfáticos, que habían recibido o no tratamiento complementario sistémico, y sólo mujeres menores de 53 años. Además, las plataformas de micromatrices utilizadas en los estudios son diferentes, Affymetrix vs. Agilent. De los 70 genes del estudio de van't Veer (2002), sólo 48 están presentes en la matriz Affymetrix U133A, mientras que de nuestros 76 genes sólo 38 están presentes en la matriz Agilent. Hay un solapamiento de 3 genes entre las dos firmas (ciclina E2, complejo de reconocimiento del origen y proteínas de la superfamilia TNF). A pesar de la aparente diferencia, ambas firmas incluían genes que identificaban varias vías comunes que podrían estar implicados en la reaparición de tumores. Este hallazgo respalda la idea de que si bien pudiera haber redundancia en los miembros génicos, podrían ser necesarias firmas eficaces para incluir la representación de las vías específicas.
Las fortalezas de nuestro estudio en comparación con el estudio de van de Vijver et al. (2002) son el mayor número de pacientes LNN no tratados (286 vs. 141) y la independencia de nuestra firma genética de 76 genes con respecto a la edad, el estado menopáusico y el tamaño de los tumores. El conjunto de validación de nuestros pacientes está completamente libre de solapamiento con el conjunto de aprendizaje a diferencia del 90% de los demás informes. Ransohoff (2004). En conclusión, ya que sólo aproximadamente el 30%-40% de los pacientes LNN no tratados desarrollan la reaparición de tumores, la firma pronóstica podría proporcionar una poderosa herramienta para identificar a los pacientes con bajo riesgo, evitando el tratamiento excesivo en un número considerable de pacientes. La recomendación de un tratamiento complementario sistémico en pacientes con cáncer de mama primario podría ser orientada en el futuro por esta firma pronóstica. El valor predictivo de nuestra firma genética con respecto a la eficacia de los diferentes modos de tratamiento sistémico podría ensayarse en el contexto de tratamiento complementario o en pacientes con enfermedad metastásica.
Ejemplo 7
Comparación de un perfil genético de un tumor de mama generado a partir de microdisección por captura con láser y tejido en bruto en un cáncer de mama en estadio I/II
La determinación de perfiles de expresión génica ha demostrado ser una potente herramienta de diagnóstico y pronóstico para diversos tipos de cáncer. Casi exclusivamente en todos los casos se utilizó ARN de tumor en bruto para la hibridación en la matriz génica. Los estrógenos juegan un papel importante en el desarrollo y crecimiento de los tumores dependientes de hormonas.
Aproximadamente el 75% de los cánceres de mama expresan el receptor de estrógeno (ER), que es un indicador para el tratamiento con tamoxifeno (complementario) y se asocia con los resultados del paciente.
Para comprender mejor los mecanismos desencadenados por el estrógeno en las células epiteliales de mama y su asociación con la tumorogénesis, se utilizó la microdisección por captura con láser (LCM) para conseguir una población histológicamente homogénea de células tumorales de 29 tumores de mama primario en estadio temprano, en combinación con el análisis de expresión GeneChip. De estos 29 pacientes, 11 eran ER negativo y 17
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eran ER positivo en base a la unión a ligando cuantitativa o inmunoensayos enzimáticos en citosoles tumorales. Para la comparación, también se obtuvieron los perfiles de expresión génica utilizando ARN de tejido en bruto aislado a partir del mismo grupo de 29 pacientes.
5 Las muestras nuevas de tejido congelado se recogieron de 29 pacientes con cáncer de mama sin compromiso de los ganglios linfáticos (para las características de los tumores, Tabla 2) que habían sido tratados quirúrgicamente de un tumor de mama y no habían recibido tratamiento neocomplementario sistémico. Para cada muestra de tejido del paciente, se utilizó en primer lugar el portaobjetos H&E para evaluar la morfología celular. Se aisló ARN de las células tumorales obtenidas mediante LCM (PALM) realizada en secciones de criostato y a partir de secciones de criostato enteras, es decir, tejido en bruto del mismo tumor. Se analizó la calidad de la muestra de ARN mediante un Agilent Bioanalyzer. Las muestras de ARN se hibridaron con la matriz génica Affymetrix human U133A que contiene aproximadamente 22.000 conjuntos de sondas. Se cuantificó la fluorescencia y se normalizaron las intensidades. Se utilizaron el análisis de algoritmos de agrupamiento y el análisis de componentes principales para agrupar a los pacientes con perfiles de expresión génica similares. Se seleccionaron los genes que se expresan de
15 manera diferencial entre las muestras ER positivo y ER negativo.
El ARN total aislado a partir de las células de cáncer de mama obtenidas mediante LCM se sometió a dos rondas de amplificación con T7 en la preparación diana, frente a una ronda de amplificación con ARN de tejido en bruto. Los niveles de expresión de 21 genes de control (Tabla 7) se compararon entre conjunto de datos LCM y el conjunto de tejido en bruto para demostrar la fidelidad de la amplificación lineal.
Tabla 7: Lista de genes de control
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35
45
SEQ ID NO:
Nombre
112
proteína fosfatasa 2, subunidad reguladora B (B56), isoforma delta
113
factor de unión a CCCTC (proteína con dedos de cinc)
114
familia 4 de transportadores de solutos (intercambiador de aniones), miembro 1, proteína adaptadora
115
ribonucleasa P
116
proteína hipotética FLJ20188
117
proteína KIAA0323
118
ADNc FLJ12469
119
factor de iniciación de la traducción eIF-2b subunidad delta
120
ribonucleoproteína nuclear heterogénea K
121
hidroximetilbilano sintasa
122
ADNc DKFZp586O0222
123
fase de lectura abierta 4 del cromosoma 20
124
interaccionador 4 del receptor de la hormona tiroidea
125
hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (síndrome de Lesch-Nyhan)
126
homólogo de DnaJ (Hsp40), subfamilia C, miembro 8
127
fosfatasa de doble especificidad 11 (de interacción con el complejo 1 ARN/RNP)
128
autoantígeno 1 relacionado con la atopia de unión al calcio
129
factor 2 derivado de células del estroma
130
región del punto de rotura 1 del sarcoma Ewing
131
complejo de transcripción CCR4-NO, subunidad 2
132
proteína única 7 con caja F
Los resultados obtenidos se representan en la Tabla 8 y en las Figuras 4-9. Tabla 8. Características clínicas de los pacientes
Característica
Nº de pacientes (%)
Edad en años
< 40
1 (3)
40-44
5 (17)
45-49
8 (28)
≥ 50
15 (52)
Diámetro del tumor en mm
≤ 20
11 (40)
> 20
17 (59)
Grado de diferenciación histológica
II (intermedio)
5 (17)
III (escaso)
12 (41)
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Característica
Nº de pacientes (%)
Estado del receptor de estrógeno
Negativo
11 (40)
Positivo
17 (59)
Cirugía
Tratamiento conservador de mama
26 (90)
Mastectomía
3 (10)
Quimioterapia
No
29 (100)
Tratamiento hormonal
No
29 (100)
Supervivencia libre de enfermedad en meses
≤ 48
13 (45)
> 48
16 (55)
La Figura 4 es un agrupamiento jerárquico en base a 5.121 genes y muestra que las muestras LCM y de tejido en bruto se separan completamente en base a los perfiles globales de expresión de ARN. La Figura 5 es un gráfico de barras que representa los niveles de expresión de 21 genes de control (Tabla 6) en aislados de ARN de muestras LCM y de tejidos en bruto y muestra que una ronda de amplificación lineal adicional utilizada para el ARN obtenido mediante LCM no ocasionó la expresión diferencial de los genes de control. La Figura 6 es una vía de análisis de datos y la Figura 7 muestra el análisis PCA con conjuntos de genes filtrados. La Figura 8 es un gráfico circular en el que se utilizó el estado ER para asignar los subgrupos de pacientes. Los genes expresados de manera diferencial entre los sub-clústers ER positivo y ER negativo en las muestras LCM y de tejido en bruto se definieron mediante la t de Student. La Figura 9 es una serie de gráficos de barras que muestran los resultados del análisis de vías mediante ontología génica para los genes asociados exclusivamente con ER en muestras LCM, exclusivamente en los tejidos en bruto y para aquellos que son comunes en LCM y en tejido en bruto.
En resumen, los resultados obtenidos muestran varias conclusiones importantes. En primer lugar, genes relacionados con la proliferación celular y el metabolismo energético se vieron expresados de manera diferencial en pacientes ER-/ER+ en los conjuntos de datos de tejido en bruto y en los conjuntos de datos LCM. En segundo lugar, debido al enriquecimiento de las células de cáncer de mama mediante LCM, los genes implicados en la transducción de señales por unión a receptor de superficie celular, la transducción de señales RAS, la transducción de señales JAK-STAT y la apoptosis se encontraron asociados al estado ER. Estos genes no se identificaron en el conjunto de datos masivos. En tercer lugar, la microdisección proporciona un enfoque sensible al estudio de las células tumorales epiteliales y una mejor comprensión de la vía de señalización asociada con los receptores de estrógeno. Por lo tanto, es evidente que la aplicación del perfil de expresión génica descrito en el presente documento a las células tumorales aisladas mediante LCM es acorde con los resultados obtenidos en el tejido en bruto heterogéneo.
Ejemplo 8
Validación y análisis de vías de la firma pronóstica de 76 genes en el cáncer de mama
Este ejemplo presenta los resultados de un estudio de validación en el que se utilizó la firma genética de 76 genes para predecir los resultados de 132 pacientes obtenidos de 4 fuentes independientes.
Además, con el fin de evaluar la robustez de esta firma genética, este ejemplo proporciona adicionalmente la identificación de componentes sustituibles de la firma y describe cómo las sustituciones conducen a la identificación de las vías claves en una firma eficaz.
Se obtuvieron muestras nuevas de tejido congelado de 132 pacientes que habían sido tratados quirúrgicamente por un tumor de mama y no habían recibido tratamiento complementario sistémico. Las muestras de los pacientes utilizadas se recogieron entre 1980 y 1996 (Fig. 10). Para cada muestra de tejido del paciente, se utilizó un portaobjetos H&E para evaluar la morfología celular. A continuación, se prepararon muestras de ARN total y se analizó la calidad de la muestra mediante Agilent Bioanalyzer. Las muestras de ARN se analizaron mediante análisis de micromatrices. Se cuantificó la fluorescencia y se normalizaron las intensidades. Se calculó una Puntuación de Riesgo de Recidiva para cada paciente en base a los niveles de expresión de la firma genética de 76 genes. Los pacientes se clasificaron en grupos de resultado bueno y malo. Figuras 11 y 12.
Con el fin de evaluar la robustez de esta firma genética, se diseñaron y utilizaron dos análisis estadísticos. Figura 13. En primer lugar, se repitieron los procedimientos de selección de genes y construcción de la firma que se utilizaron para descubrir la firma genética de 76 genes. Como se muestra en la Tabla 8, se seleccionaron al azar diez conjuntos de aprendizaje de 115 pacientes cada uno, de un total de 286 pacientes. El resto de los pacientes se utilizó como conjunto de prueba.
En segundo lugar, se aumentó el número de pacientes en un conjunto de aprendizaje hasta el 80% de los
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286 pacientes y se utilizó el 20% restante de los pacientes como conjunto de prueba. Este procedimiento de selección también se repitió 10 veces. En ambos procedimientos, se utilizaron las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para garantizar que no hubiera diferencia significativa en la supervivencia libre de enfermedad entre el par de aprendizaje y de prueba. Se seleccionaron los genes y se construyó una firma a partir de cada uno de los conjuntos de aprendizaje utilizando la regresión de riesgos proporcionales de Cox. Se validó cada firma en el correspondiente conjunto de prueba. Además, se asignó la firma pronóstica de 76 genes a grupos funcionales utilizando la clasificación por ontología GO. Se seleccionaron las vías que incluyen un número significativo de genes en la firma (valor p <0,05 y > 2 coincidencias). Las vías seleccionadas también se evaluaron en todas las firmas pronósticas obtenidas de diferentes conjuntos de aprendizaje.
En la Tabla 9, A. contiene los resultados de 10 firmas que utilizan conjuntos de aprendizaje de 115 pacientes y B. contiene los resultados de 10 firmas que utilizan conjuntos de aprendizaje del 80% de los pacientes
A
B
AUC de ROC
0,62 (0,55-0,70) AUC de ROC 0,62 (0,53-0,72)
Sensibilidad
86% (0,84 -0,88) Sensibilidad 83% (0,81 -0,85)
Especificidad
34% (0,21 -0,56) Especificidad 46% (0,28 -0,62)
Frec. de recidiva
33% Frec. de recidiva 33%
PPV
40% (0,35 -0,49) PPV 47% (0,32 -0,58)
NPV
81% (0,75 -0,89) NPV 82% (0,78 -0,89)
Oportunidad relativa
3,5 (1,7-7,9) Oportunidad relativa 5,6 (1,7-15)
Los resultados obtenidos en este Ejemplo demuestran que:
25  La firma genética de 76 genes se valida con éxito en 132 pacientes independientes, dando un valor de AUC de 0,757 en los 132 pacientes con cáncer de mama LNN de 4 fuentes independientes. La firma presenta un 88% de sensibilidad y un 41% de especificidad.  El AUC media para las firmas con sustitución es 0,64 (IC del 95%: 0,53-0,72). Este resultado es coherente con la del predictor de 76 genes (AUC de 0,69). Veintiún vías sobrerrepresentadas en la firma genética de 76 genes también se encontraron en las demás firmas pronósticas, lo que sugiere que en la reaparición de tumores están implicadas vías biológicas comunes.  Estos resultados sugieren que los perfiles de expresión génica proporcionan un enfoque de gran alcance para realizar la evaluación del riesgo del resultado para el paciente. Los datos destacan la viabilidad de un ensayo pronóstico molecular que proporciona a los pacientes una medición cuantitativa de recidiva del
35 tumor.
Aunque la invención precedente se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo por
razones de claridad de comprensión, las descripciones y ejemplos no deben interpretarse como limitativos del
alcance de la invención.
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Tabla 10
5
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Identificación de secuencias
SEQ ID NO:
psid Nombre del gen Número de registro Descripción del gen
1
213165_at CDABP0086 Al041204
2
217432_s_at AF179281 iduronato 2-sulfatasa (síndrome de Hunter)
3
221500_s_at BE782754 sintaxina 16 /
4
208452_x_at MYO9B NM_004145 miosina IXB
5
220234_at CA8 NM_004056 anhidrasa carbónica VIII
6
207865_s_at BMP8 NM_001720 proteína morfogenética ósea 8 (proteína osteogénica 2
7
201769_at KIAA0171 NM_014666 producto del gen KIAA0171
8
218940_at FLJ13920 NM_024558 proteína hipotética FLJ13920
9
209018_s_at BRPK BF432478 proteína quinasa BRPK
10
216647_at DKFZp586L1 824 AL117663 del clon DKFZp586L1824
11
213405_at DKFZp564E1 22 N95443 del clon DKFZp564E122
12
202921_s_at ANK2 NM_001148 anquirina 2, neuronal, variante de transcrito 1
13
208401_s_at U01157 receptor del péptido 1 similar a glucagón con repetición de dinucleotido CA
14
218090_s_at WDR11 NM_018117 proteína WD40 con dominio de repetición 11
15
218139_s_at FLJ10813 NM_018229 proteína hipotética FLJ10813
16
202485_s_at MBD2 NM_003927 proteína 2 con dominio de unión a metil-CpG, variante de transcrito 1
17
201357_s_at SF3A1 NM_005877 factor de corte y empalme 3a, subunidad 1, 120 kD
18
214616_at H3FD NM_003532 familia de histonas H3, miembro D
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19
207719 x at KIAA0470 NM_014812 producto del gen KIAA0470
20
202734_at TRIP10 NM_004240 interaccionador 10 del receptor de la hormona tiroidea
21
202175_at FLJ22678 NM_024536 proteína hipotética FLJ22678
22
213870_at AL031228 clon 1033B10 en el cromosoma 6p21.2-21.31
23
208967_s_at adk2 U39945 adenilato quinasa 2
24
204312_x_at Al655737 proteína 1 de unión a elemento sensible a cAMP
25
203815_at GSTT1 NM_000853 glutatión S-transferasa ζ 1
26
207996_s_at C18ORF1 NM_004338 fase de lectura abierta 1 del cromosoma 18
27
221435_x_at HT036 NM_031207 proteína hipotética HT036
28
219987_at FLJ12684 NM_024534 proteína hipotética FLJ12684
29
221559_s_at MGC:2488 BC000229 clon MGC: 2488
30
207007_at NR1I3 NM_005122 subfamilia de receptores nucleares 1, grupo I, miembro 3
31
219265_at FLJ13204 NM_024761 proteína hipotética FLJ13204
32
40420_at AB015718 ARNm de lok para la proteína quinasa
33
202266_at AD022 NM_016614 proteína asociada a receptor de TRAF y TNF
34
219522_at FJX1 NM_014344 supuesto ligando secretado homólogo a fjx1
35
212334_at AKAP350C BE880245 AKAP350C, con corte y empalme alternativo
36
219340_s_at CLN8 AF123759 Supuesta proteína transmembrana
37
217771_at GP73 NM_016548 proteína de membrana de Golgi (LOC51280)
38
202418_at Yif1p NM_020470 supuesta proteína transmembrana; homóloga de la proteína de membrana de Golgi de levadura
39
206295_at IL-18 NM_001562 interleucina 18
40
201091_s_at BE748755 proteína similar a heterocromatina
41
204015_s_at DUSP4 BC002671 fosfatasa de doble especificidad 4
42
200726_at PPP1CC NM_002710 proteína fosfatasa 1, subunidad catalítica, isoforma γ
43
200965_s_at ABLIM-s NM_006720 proteína LIM de unión a actina 1, variante de transcrito
44
210314_x_at TRDL-1 AF114013 Ligando de muerte 1 γ relacionado con factor de necrosis tumoral
45
221882_s_at M83 Al636233 proteína transmembrana de cinco cruces
46
217767_at C3 NM_000064 componente 3 del complemento
47
219588_s_at FLJ20311 NM_017760 proteína hipotética
48
204073_s_at C11ORF9 NM_013279 fase de lectura abierta 9 del cromosoma 11
49
212567 s at AL523310 supuesto factor de iniciación de la traducción
50
211382_s_at TACC2 AF220152
51
201663_s_at CAP-C NM 005496 polipéptido C asociado a cromosoma
52
221344_at OR12D2 NM_013936 receptor olfativo, familia 12, subfamilia D, miembro 2
53
210028_s_at ORC3 AF125507 subunidad 3 del complejo de reconocimiento del origen
54
218782_s_at PRO2000 NM_014109 proteína PRO2000
55
201664_at SMC4 AL136877 (mantenimiento estructural del cromosoma 4, similar a levadura)
56
219724_s_at KIAA0748 NM_014796 producto del gen KIAA0748
57
204014_at DUSP4 NM_001394 fosfatasa de doble especificidad 4
58
212014_x_at CD44 Al493245 CD44
59
202240_at PLK1 NM_005030 quinasa 1 similar a Polo (Drosophila)
60
204740_at CNK1 NM_006314 potenciador de conector de similar a KSR (supresor quinasa de ras de Drosophila)
61
208180_s_at H4FH NM_003543 familia de histonas H4, miembro de H
62
204768_s_at FEN1 NM_004111 endonucleasa específica de estructura Flap
63
203391_at FKBP2 NM_004470 proteína 2 de unión a FK506
64
211762_s_at KPNA2 BC005978 carioferina α 2 (cohorte 1 de RAG, importina α 1)
65
218914_at CGI-41 NM_015997 proteína CGI-41
66
221028_s_at MGC11335 NM_030819 proteína hipotética MGC11335
67
211779_x_at MGC13188 BC006155 Clon MGC: 13188
68
218883_s_at FLJ23468 NM_024629 proteína hipotética FLJ23468
69
204888_s_at AA772093 Similar a Neuralized (Drosophila)
70
217815_at FACTP140 NM_007192 factor de elongación de la transcripción específico de cromatina, subunidad de 140 kD
71
201368_at Tis11d U07802
72
201288_at ARHGDIB NM_001175 Inhibidor de la disociación de Rho GDP (GDI) β
73
201068_s_at PSMC2 NM_002803 Proteasoma (prosoma, macropaína) subunidad 26S, ATPasa, 2
E10178199
18-09-2014
15
25
35
45
55
74
218478_s_at DKFZP434E2220 NM_017612 proteína hipotética DKFZP434E2220
75
214919_s_at KIAA1085 R39094
76
209835_x_at BC004372 Similar a CD44
77
217471_at AL117652
78
203306_s_at SLC35A1 NM_006416 Familia de portador de soluto 35 (transportador de CMP-ácido siálico), miembro 1
79
205034_at CCNE2 NM_004702 ciclina E2
80
221816_s_at BF055474 supuesto antígeno proteína dedo de zinc NY-REN-34
81
219510_at POLQ NM_006596 polimerasa (dirigida a ADN) ζ
82
217102_at AF041410 proteína asociada al cáncer
83
208683_at CANP M23254 subunidad grande de proteasa neutra activada por Ca2
84
215510_at AV693985 gen variante ets 2
85
218533_s_at FLJ20517 NM_017859 proteína hipotética FLJ20517
86
215633_x_at LST-1 N AV713720 ARNm para la proteína LST-1 N
87
221928_at AI057637 Hs234898 ESTs, débilmente similar al factor de crecimiento de linfocitos B 2109260A
88
214806_at BICD U90030 Bicaudal-D
89
204540_at EEF1A2 NM_001958 factor de elongación de la traducción eucariota 1 α 2
90
221916_at BF055311 proteína hipotética
91
216693_x_at DKFZp434C1722 AL133102
92
209500_x_at AF114012 ligando de muerte 1β relacionado con el factor de necrosis tumoral
93
209534_at FLJ10418 AK001280 moderadamente similar al factor de crecimiento derivado de hepatoma
94
207118_s_at MMP23A NM_004659 metaloproteinasa de matriz 23A
95
211040_x_at BC006325 expresada en fase S y G-2, 1
96
218430_s_at FLJ12994 NM_022841 proteína hipotética FLJ12994
97
217404_s_at X16468 colágeno tipo II, α-1
98
205848_at GAS2 NM_005256 específica de detención del crecimiento 2
99
214915_at FLJ11780 AK021842 clon HEMBA1005931, débilmente similar a la proteína con dedos de zinc 83
100
216010_x_at D89324 α (1,31,4) fucosiltransferasa
101
204631_at MYH2 NM_017534 miosina, polipéptido pesado 2, músculo esquelético adulto
102
202687_s_at U57059 ARNm del ligando Apo-2
103
221634_at BC000596 Similar a proteína ribosómica L23a, clon MGC:2597
104
220886_at GABRQ NM_018558 receptor de ácido γ-aminobutírico (GABA), ζ
105
202237_at ADPRTL1 NM_006437 similar a ADP-ribosiltransferasa (NAD+; poli (ADPribosa) polimerasa), 1
106
204218_at DKFZP564M 082 NM_014042 proteína DKFZP564M082
107
221241_s_at BCLG NM_030766 regulador de la apoptosis BCL-G
108
209862_s_at BC001233 Similar al producto del gen KIAA0092, clon MGC:4896
109
217019_at RPS4X AL137162 Contiene nuevo gen y 5 parte de gen para nueva proteína similar a proteína ribosómica 4 unida a X
110
210593_at M55580 espermidinespermina N1-acetiltransferasa
111
216103_at KIAA0707 AB014607 KIAA0707
112
202513_s_at PPP2R5D NM_006245 proteína fosfatasa 2, subunidad reguladora B (B56), isoforma delta
113
202521_at CTCF NM_006565 factor de unión a CCCTC (proteína con dedos de cinc)
114
218682_s_at SLC4A1AP NM_018158 familia 4 de transportadores de solutos (intercambiador de aniones), miembro 1, proteína adaptadora
115
203436_at RPP30 NM_006413 ribonucleasa P
116
220127 s at FLJ20188 NM_017703 proteína hipotética FLJ20188
117
212355_at KIAA0323 Al075450 proteína KIAA0323
118
215158_s_at FLJ12469 AK022531 ADNc FLJ12469
119
209429_x_at AF112207 subunidad delta del factor de iniciación de la traducción elF-2b
120
200097_s_at Al701949 ribonucleoproteína nuclear heterogénea K
E10178199
18-09-2014
5
15
25
35
45
55
121
203040_s_at HMBS NM_000190 hidroximetilbilano sintasa
122
221647_s_at DKFZp586O0222 AL136935 clon DKFZp586O0222
123
218089_at C20orf4 NM_015511 fase de lectura abierta 4 del cromosoma 20 DKFZP564N1363
124
203732_at TRIP4 NM_016213 interaccionador 4 del receptor de la hormona tiroidea
125
202854_at HPRT1 NM_000194 hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (síndrome de Lesch-Nyhan)
126
205545_x_at DNAJC8 NM_014280 homólogo de DnaJ (Hsp40), subfamilia C, miembro 8
127
202703_at DUSP11 NM_003584 fosfatasa de doble especificidad 11 (de interacción con el complejo 1 ARN/RNP)
128
216903_s_at CBARA1 AK022697 autoantígeno 1 relacionado con la atopia de unión a calcio
129
203090_at SDF2 NM_006923 factor 2 derivado de células del estroma
130
209214_s_at EWSR1 BC004817 región del punto de rotura 1 del sarcoma de Ewing
131
217798_at CNOT2 Al123426 complejo de transcripción CCR4-NOT, subunidad 2
132
201178_at FBXO7 NM_012179 proteína única 7 con caja F
133
212160_at Al984005 exportina, ARNt (receptor de exportación nuclear para los ARNt)
134
201111_at CSE1 AF053641 proteína cerebral de susceptibilidad a apoptosis celular
135
201112_s_at CSE1L NM_001316 Similar a segregación de cromosomas 1 (homólogo de levadura)
136
204817_at KIAA0165 NM_012291 polos del huso extra, S. cerevisiae, homólogo de (KIAA0165)
137
215623_x_at FLJ11338 AK002200 muy similar al ARNm del polipéptido C asociado a cromosoma
138
38158_at KIAA0165 D79987
139
201076_at NHP2L1 NM_005008 similar a proteína cromosómica no histona 2 (S. cerevisiae), 1
140
201947_s_at CCT2 NM_006431 chaperonina que contiene TCP1, subunidad 2 (beta)
141
202647_s_at NRAS NM_002524 homólogo de oncogén viral RAS de neuroblastoma (vras)
142
202705_at CCNB2 NM_004701 ciclina B2
143
204009_s_at NM_004985 homólogo de oncogén viral del sarcoma de rata v-Kiras2 Kirsten 2
144
204566_at PPM1D NM_003620 proteína fosfatasa 1D dependiente de magnesio, isoforma delta
145
214710_s_at BE407516
146
202095_s_at BIRC5 NM_001168 que contiene repetición de IAP de baculovirus 5 (survivina)
147
204900 x at SAP30 NM_003864 polipéptido asociado a sin3, 30 kD
148
201986_at KIAA0593 AB011165 ARNm de proteína KIAA0593, cds parcial
149
201987_at Al984051 proteína asociada al receptor de hormona tiroidea, subunidad de 240 kDa
150
203605_at SRP54 NM_003136 partícula de reconocimiento de señales 54kD
151
213226_at Al346350 autoantígeno 1 de la polimiositis-esclerodermia (75kD)
152
205757_at ENTPD5 NM_001249 ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 5
153
212062_at KIAA0611 AB014511 ARNm para la proteína KIAA0611
154
213007_at W74442 polimerasa (dirigida a ADN), Y
155
203362_s_at MAD2L1 NM_002358 similar a MAD2 (deficiente para la detención de la mitosis, levadura, homólogo), 1
156
204641_at NEK2 NM_002497 quinasa 2 relacionada con NIMA (gen a nunca en mitosis)
157
206983_at CCR6 NM_004367 receptor de quimiocinas (motivo C-C) 6
158
210375_at EP3a2 X83858 receptor de prostaglandina E
159
213933_at DKFZp586M 0723 AW242315 del clon DKFZp586M0723
160
201756_at RPA2 NM_002946 proteína de replicación A2 (32 kDa)
161
208688_x_at elF3 U78525 factor de iniciación de la traducción eucariota
162
212655_at KIAA0579 AB011151 proteína KIAA0579
E10178199
18-09-2014
15
25
35
45
55
163
213124_at BG538800 proteína DKFZP434N043
164
213520_at RECQL4 NM_004260 similar a proteína RecQ, 4
165
218277_s_at FLJ22060 NM_024612 proteína hipotética FLJ22060
166
201938_at DOC1 NM_004642 delecionado en el cáncer de boca (ratón, homólogo) 1
167
202692_s_at UBTF NM_014233 factor de transcripción de unión cadena arriba, ARN polimerasa I
168
203616_at POLB NM_002690 polimerasa (dirigida a ADN), β
169
204407_at AF080255 proteína lodestar
170
206188_at KIAA0628 NM_014789 producto del gen KIAA0628
171
209831_x_at AB004574 desoxirribonucleasa II, lisosómica
172
211980_at Al922605 colágeno, tipo IV, alfa 1
173
214853_s_at Al091079 proteína transformadora 1 (que contiene dominio de homología 2 con Src)
174
215888_at FLJ23236 AK026889 clon COL00725
175
216037_x_at AA664011 similar a factor de transcripción 7, 2 (específica de linfocitos T, caja HMG)
176
202666_s_at BAF53A NM_004301 BAF53
177
204146_at BE966146 proteína de interacción con RAD51
178
203920_at NR1H3 NM_005693 subfamilia 1 de receptores nucleares, grupo H, miembro 3
179
205322_s_at AW182367 factor de transcripción 1 de regulación de metales
180
206644_at NR0B1 NM_000475 subfamilia 0 de receptores nucleares, grupo B, miembro 1
181
201558_at RAE1 NM_003610 (exportador de ARN 1, S. pombe) homólogo
182
209448_at BC002439 proteína de interacción con Tat (30 kD)
183
220960_x_at RPL22 NM_000983 proteína ribosómica L22
184
207320_x_at STAU NM_004602 variante de transcrito T4 staufen (Drosophila, proteína de unión a ARN)
185
208948_s_at MGC:4921 BC000830 MGC:4921
186
213037_x_at AJ132258 proteína staufen, Drosophila parcial, proteína de unión a ARN)
187
200725_x_at RPL10 NM_006013 proteína ribosómica L10
188
200937_s_at RPL5 NM_000969 proteína ribosómica L5
189
208696_at PNAS-102 AF275798 ARNm de chaperonina PNAS-102 que contiene TCP1, subunidad 5 (épsilon)
190
209593_s_at FKSG18 AF317129 FKSG18
191
209619_at K01144 cadena Y de antígeno MHC II
192
218336_at PFDN2 NM_012394 prefoldina 2
193
219390_at FLJ20731 NM_017946 proteína hipotética FLJ20731
194
206976_s_at HSP105B NM_006644 choque térmico 105 kDa
195
204444_at KNSL1 NM_004523 similar a quinesina, 1
196
206364_at KIAA0042 NM_014875 producto del gen KIAA0042
197
209408_at U63743 quinesina asociada a centrómero mitótico
198
202629_at APPBP2 AV681579 proteína de unión a proteína precursora de β amiloide (cola citoplasmática), 2
199
202630_at APPBP2 AA046411 proteína de unión a proteína precursora de β amiloide (cola citoplasmática), 2
200
202631_s_at APPBP2 NM_006380 proteína de unión a proteína precursora de β amiloide (cola citoplasmática), 2
201
210629_x_at AF000425 variante de corte y empalme cLST1A
202
204670_x_at HLA-DRB5 NM_002125 MHC, clase II, DR β 5
203
208306_x_at HLA-DRB4 NM_021983 MHC, clase II, DR β 4
204
206654_s_at RPC32 NM_006467 polimerasa (ARN) III (dirigida a ADN) (32 kD)
205
218360_at RAB22A NM_020673 RAB22A, miembro de la familia de oncogenes RAS
206
209380_s_at CFTRMRP AF146074 proteína ABC, casete de unión a TP, subfamilia C
207
201114_x_at PSMA7 NM_002792 subunidad de proteasoma (prosoma, macropaína), tipo α, 7
208
202243_s_at PSMB4 NM_002796 subunidad de proteasoma (prosoma, macropaína), tipo β, 4
209
202244_at PSMB4 NM_002796 subunidad de proteasoma (prosoma, macropaína), tipo β, 4
210
203878_s_at MMP11 NM_005940 metaloproteinasa de matriz 11 (estromelisina 3)
211
216474_x_at AF206667 β I triptasa de mastocitos, con corte y empalme alternativo
212
217009_at AL121974 secuencia de ADN del clon RP3-417L20 en el cromosoma 6p12-21.3
E10178199
18-09-2014
5
15
25
35
45
55
213
202968_s_at Dyrk2 Y09216 ARNm para la proteína quinasa, Dyrk2
214
202969_at Al216690 quinasa regulada por fosforilación en tirosina (Y) de doble especificidad, 2
215
204092_s_at STK15 NM_003600 serina treonina quinasa 15
216
204171_at RPS6KB1 NM_003161 proteína quinasa S6 ribosómica, 70 kD, polipéptido 1
217
204825_at KIAA0175 NM_014791 producto del gen KIAA0175
218
208079_s_at STK6 NM_003158 serina treonina quinasa 6
219
219148_at TOPK NM_018492 quinasa de unión a PDZ; proteína quinasa de linfocitos T
220
219813_at LATS1 NM_004690 homólogo de LATS (supresor tumoral grande, Drosophila) 1
221
202779_s_at E2-EPF NM_014501 proteína transportadora de ubiquitina
222
217978_s_at HSA243666 NM_017582 proteína NICE-5
223
210413_x_at SCCA2 U19557 antígeno de carcinoma de células escamosas 2
224
219478_at WFDC1 NM_021197 dominio 1 de núcleo con cuatro puentes disulfuro WAP
225
204319_s_at RGS10 NM_002925 regulador de la señalización de proteína G 10
226
204017_at KDELR3 NM_006855 receptor de retención de proteínas en el retículo endoplasmático KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu), 3
227
206150_at TNFRSF7 NM_001242 superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 7
228
205926_at WSX-1 NM_004843 receptor de citocinas de clase I
229
205400_at WAS NM_000377 Síndrome de Wiskott-Aldrich (eczema-trombocitopenia)
230
209539_at KIAA0006 D25304 ARNm para el gen KIAA0006
231
221922_at AW195581 proteína KIAA0761
232
200614_at CLTC NM_004859 clatrina, polipéptido pesado (Hc)
233
202550_s_at VAPB NM_004738 proteína B y C asociada a VAMP (proteína de membrana asociada a vesículas)
234
212159_x_at Al125280 complejo proteico 2 relacionado con el adaptador, subunidad α 2
235
202733_at P4HA2 NM_004199 procolágeno-prolina 2-oxoglutarato 4-dioxigenasa (prolina 4hidroxilasa) α polipéptido II
236
208905_at BC005299 citocromo C, clon MGC:12367
237
32137_at JAG2 AF029778 Jagged2
238
201088_at KPNA2 NM_002266 carioferina α 2 (cohorte 1 de RAG, importina α 1)
239
202824_s_at TCEB1 NM_005648 factor de elongación de la transcripción B (SIII), polipéptido 1 (15 kD, elongina C)
240
201584_s_at DDXL NM_005804 helicasa de ARN nuclear, variante DECD de la familia con cajas DEAD
241
218461_at LOC51184 NM_016301 proteína x 0004 (LOC51184)
242
204489_s_at CD44 NM_000610 CD44
243
204490_s_at CDw44 M24915 antígeno CDw44
244
207165_at HMMR NM_012485 receptor para motilidad mediada por hialuronano (RHAMM)
245
210916_s_at CD44 AF098641 CD44 isoforma RC
246
212063_at CMPX1 BE903880 proteína con dedos de zinc 6
247
204470_at GRO1 NM_001511 oncogén GRO1 (actividad estimuladora del crecimiento de melanoma, alfa)
248
207430_s_at MSMB NM_002443 microseminoproteína, β
249
210297_s_at U22178 proteína secretora prostática 57
250
213009_s_at FLJ12639 AK022701 ADNc FLJ12639
251
203536_s_at CIAO1 NM_004804 proteína Ciao1 WD40
252
204026_s_at ZWINT NM_007057 interaccionador ZW10
253
204435_at KIAA0410 NM_014778 producto del gen KIAA0410
254
209271_at AB032251 ARNm de BPTF para el factor de transcripción con dedo PHD bromodominio
255
212074_at KIAA0810 BE972774 proteína KIAA0810
256
218009_s_at PRC1 NM_003981 regulador proteico de la citocinesis 1
257
218768_at NUP107 NM_020401 proteína de complejo de poros nucleares
258
M33197_3_at GAPDH M33197 gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
259
203524_s_at MPST NM_021126 mercaptopiruvato sulfurtransferasa
260
206335_at GALNS NM_000512 galactosamina (N-acetil)-6-sulfato sulfatasa, (síndrome de Morquio, mucopolisacaridosis tipo IVA)
261
203503_s_at PEX14 NM_004565 factor de biogénesis de peroxisomas 14
E10178199
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5
15
25
35
45
55
262
202673_at DPM1 NM_003859 polipéptido 1 de dolicol-fosfato manosiltransferasa, subunidad catalítica 1
263
207543_s_at P4HA1 NM_000917 procolágeno-prolina, 2-oxoglutarato 4-dioxigenasa (prolina 4-hidroxilasa), α polipéptido I
264
204192_at CD37 NM_001774 antígeno CD37
265
204960_at PTPRCAP NM_005608 proteína tirosina fosfatasa, de tipo receptor, proteína asociada a C
266
211991_s_at M27487 MHC de clase II DPw3-cadena alfa-1
267
200822_x_at TPI1 NM_000365 triosafosfato isomerasa 1
268
219502_at FLJ10858 NM_018248 proteína hipotética FLJ10858
269
219499_at FLJ10578 NM_018144 proteína hipotética FLJ10578
270
209238_at BE966922 sintaxina 3A
271
212593_s_at N92498
272
201598_s_at INPPL1 NM_001567 similar a inositol polifosfato fosfatasa, 1
273
201760_s_at LOC55884 NM_018639 proteína WD que contiene caja CS
274
222077_s_at AU153848 proteína activadora de GTPasa
275
203764_at KIAA0008 NM_014750 producto del gen KIAA0008
276
59705_at AA911739
277
204070_at RARRES3 NM_004585 respondedor al receptor de ácido retinoico (inducido por tazaroteno) 3
278
212149_at AW470003
279
214039_s_at DKFZp586E1 124 T15777 DKFZp586E1124
280
217956_s_at MASA NM_021204 enzima E-1
281
200994_at BG291787 proteína 7 de unión a RAN
282
200995_at Al741392
283
205106_at MTCP1 NM_014221 proliferación de linfocitos T maduros 1
284
209035_at hMK-1 M69148 Midquina (factor promotor del crecimiento de neuritas 2)
285
210311_at FGF5 AF171928 factor de crecimiento de fibroblastos 5 variante corta
286
211251_x_at NFY-C U78774 ARNm de NFY-C
287
220406_at TGFB2 NM_003238 factor de crecimiento transformante, β 2
288
206967_at CCNT1 NM_001240 ciclina T1
289
204252_at M68520 ARNm de proteína quinasa relacionada con cdc2
290
205955_at FLJ11136 NM_018336 proteína hipotética FLJ11136
291
203258_at DRAP1 NM_006442 proteína 1 asociada a DR1 (cofactor negativo 2 α)
292
204022_at Al668780
293
207660_at NM_004019 distrofina (distrofia muscular, tipos Duchenne y Becker),
294
215050_x_at BG325734 proteína quinasa 2 activada por proteína quinasa activada por mitógenos
295
204337_at AL514445 regulador 4 de señalización de proteína G
296
217687_at AA224446
297
221546_at BC000794 factor de corte y empalme de pre-ARNm similar a Prp de S. cerevisiae,18
298
206546_at SYCP2 NM_014258 proteína del complejo sinaptonemal 2
299
206278_at D10202 ARNm para el receptor del factor activador de plaquetas
300
206429_at F2RL1 NM_005242 similar al receptor del factor de coagulación II (trombina), 1
301
216408_at AJ302584 gen para el receptor olfativo, línea celular BM28.7
302
221306_at GPR27 NM_018971 receptor acoplado a proteína G, 27
303
221442_at MC3R NM_019888 receptor de melanocortina 3
304
201446_s_at BF692742
305
205018_s_at NM_005757 proteína con dedos de zinc tipo C3H; similar a proteína B muscleblind de D. melanogaster (MBLL)
306
214379_at Al954458 AI954458
307
214698_at AW190873
308
219336_s_at NM_015947 proteína CGI-18 (LOC51008)
309
220760_x_at FLJ14345 NM_024733 proteína hipotética FLJ14345
310
221480_at BG180941
311
221615_at PPIE AF104013 peptidil-prolil cis-trans isomerasa E
312
221923_s_at AA191576 nucleofosmina (fosfoproteína nucleolar B23, numatrina)
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55
313
201211_s_at DDX3 AF061337 ARN helicasa DDX3 con caja DEAD
314
205638_at BAI3 NM_001704 inhibidor de la angiogénesis específico del cerebro 3
315
205881_at ZNF74 NM_003426 proteína con dedos de zinc 74 (Cos52)
316
206179_s_at NM_007030 proteína específica del cerebro p25 alfa (p25)
317
206308_at AJ223333 ARNm para supuesta ADN metiltransferasa
318
207361_at HBP1 NM_012257 proteína 1 que contiene caja HMG
319
208902_s_at BF431363
320
209603_at AI796169
321
214174_s_at BE043700
322
215747_s_at X06130 ARNm para gen del ciclo celular RCC1
323
216480_x_at AF10CALM AF060927 proteína de fusión AF10CALM tipo I
324
216711_s_at M73444 ARNm de CCG1p
325
222115_x_at BC003693 similar a gen 3930401 K13 de ADNc de RIKEN
326
221686_s_at DKFZp434J0450 AL136869 DKFZp434J0450
327
210533_at MSH4 AF104243 homólogo de MutS específico de meiosis
328
217485_x_at hPMS3 D38435 ARNm de hPMS3
329
202162_s_at Al769416 complejo de transcripción CCR4-NO, subunidad 8
330
202401_s_at SRF NM_003131 factor de respuesta sérica (factor de transcripción de unión al elemento de respuesta sérica c-fos)
331
206067_s_at NM_024426 tumor de Wilms 1 (WT1), variante de transcrito D
332
206127_at ELK3 NM_005230 proteína con dominio ETS (proteína accesoria a SRF 2)
333
207402_at ZNF132 NM_003433 proteína con dedos de zinc 132
334
207768_at EGR4 NM_001965 respuesta de crecimiento precoz 4
335
208414_s_at HOXB3 NM_002146 caja homeótica B3
336
214879_x_at AY007087 clon TCCCIA00046, factor de transcripción cadena arriba 2, de interacción con c-fos
337
219314_s_at ZNF219 NM_016423 proteína con dedos de zinc 219
338
219779_at FLJ20980 NM_024721 proteína hipotética FLJ20980
339
220653_at ZIM2 NM_015363 dedo de zinc, sellado 2
340
219778_at FOG2 NM_012082 Friend of GATA2
341
203947_at CSTF3 NM_001326 factor de estimulación de la escisión, 3 pre-ARN, subunidad 3, 77kD
342
220096_at FLJ20378 NM_017795 proteína hipotética FLJ20378
343
201326_at BE737030 TCP1 que contiene chaperonina, subunidad 6A (zeta 1)
344
206769_at TMSB4Y NM_004202 Timosina, beta 4, cromosoma Y
345
211197_s_at KIAA0653 AL355690 EST del clon 34465, inserto completo
346
204994_at MX2 NM_002463 resistencia a mixovirus (influenza) 2, homólogo de murino
347
201662_s_at D89053 Acil-CoA sintetasa 3
348
206141_at MOCS3 NM_014484 molibdopterina sintasa sulfurilasa
349
209992_at AB044805 6-fosfofructo-2-quinasa isoforma cardíaca
350
210160_at BC000398 acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas, isoforma Ib, subunidad beta (30 kD),
351
218016_s_at FLJ10509 NM_018119 proteína hipotética FLJ10509
352
220582_at FLJ12190 NM_025071 proteína hipotética FLJ12190
353
222294_s_at AW971415
354
202239_at ADPRTL1 NM_006437 similar a ADP-ribosiltransferasa (NAD+; poli(ADPribosa)polimerasa), 1
355
205342_s_at AF026303 familia sulfotransferasa, citosólica, 1C, miembro 1
356
202294_at Al126490
357
201597_at COX7A2 NM_001865 Cyt C oxidasa subunidad VIIa polipéptido 2 (hígado)
358
206353_at COX6A2 NM_005205 Cyt C oxidasa subunidad VIa polipéptido 2
359
218739_at LOC51099 NM_016006 proteína CGI-58
360
217557_s_at AV710357
361
202413_s_at USP1 NM_003368 proteasa específica de ubiquitina 1
362
213661_at Al671186 proteína DKFZP586H2123
363
212729_at Al916274 proteína KIAA1232
364
202951_at BE048506 proteína serina treonina quinasa
365
207667_s_at MAP2K3 NM_002756 proteína quinasa activada por mitógenos quinasa 3
366
212565_at BE302191 proteína KIAA0965
367
212740_at BF740111 fosfoinosítido-3-quinasa, subunidad reguladora 4, p150
368
213490_s_at Al762811 proteína quinasa activada por mitógenos quinasa 2
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15
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369
213595_s_at KIAA0451 AA127643 producto del gen KIAA0451
370
220640_at CSNK1G1 NM_022048 caseína quinasa 1, gamma 1
371
207569_at ROS1 NM_002944 homólogo de oncogén del virus del sarcoma UR2 aviar vros, 1
372
209041_s_at BG395660 enzima conjugadora de ubiquitina E2G 2
373
207214_at PEC-60 NM_014471 péptido gastrointestinal
374
214425_at AV645756 precursor de alfa-1-microglobulina/bicunina
375
203650_at EPCR NM_006404 receptor de proteína C, endotelial
376
210733_at PRO1292 AF130055 FLB4941 PRO1292, proteína de membrana de asociación a cadena de translocación
377
220056_at IL22R NM_021258 receptor de interleucina 22
378
205049_s_at CD79A NM_001783 antígeno CD79A (alfa asociado a inmunoglobulina) variante de transcrito 1
379
211245_x_at AF002256 homólogo del receptor inhibidor de linfocitos citolíticos, cl-9, ARNm, receptor similar a Fean, dos dominios, cola citoplasmática de largo, 4
380
212128_s_at AW411370 distroglicano 1 (glicoproteína asociada a distrofina 1)
381
205019_s_at VIPR1 NM_004624 receptor del péptido intestinal vasoactivo 1
382
206001_at NPY NM_000905 neuropéptido Y
383
216289_at MAMMA1002 427 AU148039 MAMMA1002427
384
208250_s_at DMBT1 NM_004406 delecionado en tumores cerebrales malignos 1
385
202091_at BC003087 ligante de Arl Two, clon MGC:1121
386
205068_s_at BE671084 regulador de GTPasa asociado con la quinasa de adhesión focal pp125 (FAK)
387
221136_at GDF2 NM_016204 factor de diferenciación de crecimiento 2
388
202688_at TNFSF10 NM_003810 superfamilia de factores de necrosis tumoral (ligando), miembro 10
389
214336_s_at TNFSF10 Al621079 complejo proteico coatómero, subunidad α, superfamilia de TNF (ligando), miembro 10
390
213055_at BF693956 antígeno CD47 (antígeno relacionado con Rh, transductor de señales asociado a integrina)
391
201719_s_at EPB41 L2 NM_001431 similar a proteína banda 4.1 de membrana de eritrocitos, 2
392
208353_x_at ANK1 NM_020480 anquirina 1, variante de transcrito eritrocítica 7
393
215717_s_at X62009 ARNm parcial para fibrilina 5
394
206826_at PMP2 NM_002677 proteína de mielina periférica 2
395
207542_s_at AQP1 NM_000385 acuaporina 1 (proteína integral de formación de canal, 28 kD)
396
207596_at PRO2176 NM_018515 proteína hipotética PRO2176
397
208297_s_at EVI5 NM_005665 sitio de integración de virus ecotrópicos 5
398
217289_s_at G6PT AF097831 transportador de glucosa-6-fosfato
399
205972_at NM_006841 proteína transportadora; transportador de glutamina acoplado a Na+ y H+, sistema N1 (G17)
400
218835_at SFTPA2 NM_006926 proteína asociada a surfactante pulmonar A2
401
219716_at APOL6 NM_030641 apolipoproteína L, 6
402
218928_s_at SLC37A1 NM_018964 familia de transportadores de solutos 37 (transportador de glicerol-3-fosfato), miembro 1
403
214205_x_at FLJ12069 AK022131 FLJ12069
404
205008_s_at KIP2 NM_006383 proteína de interacción con la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN, 2
405
211272_s_at DAGK1 AF064771 diacilglicerol quinasa α del clon 24
406
206316_s_at KIAA0166 NM_014708 producto del gen KIAA0166
407
209737_at KIAA0705 AB014605 proteína KIAA0705
408
213117_at FLJ10262 AW138594 proteína hipotética FLJ10262
409
217161_x_at X17406 proteoglicano específico de cartílago
410
209436_at KIAA0762 AB018305 proteína KIAA0762
411
213993_at AI885290 espondina 1, proteína de la matriz extracelular (fespondina)
412
214354_x_at T91506 similar a N-acilesfingosina amidohidrolasa (ceramidasa ácida)
413
205799_s_at M95548 proteína transportadora de aminoácidos
E10178199
18-09-2014
5
15
25
35
45
55
414
213522_s_at AA527578 familia de transportadores de solutos 16 (transportadores de ácido monocarboxílico), miembro 3
415
212393_at AL096767 secuencia de ADN del clon 579N16 en el cromosoma 22
416
219179_at LOC51339 NM_016651 proteína del nuevo gen del carcinoma hepatocelular 3
417
201502_s_at AI078167 factor nuclear del inhibidor del potenciador del gen del polipéptido ligero kappa en linfocitos B, α
418
201512_s_at BC003633 homólogo A de translocasa de la membrana mitocondrial externa 70 (levadura)
419
201576_s_at GLB1 NM_000404 galactosidasa, beta 1
420
201765_s_at AL523158
421
215155_at HEXA J04178 cadena α de β-hexosaminidasa anómala
422
203518_at CHS1 NM_000081 síndrome de Chediak-Higashi 1
423
220801_s_at HAO2 NM_016527 hidroxiácido oxidasa 2 (cadena larga)
424
204690_at STX8 NM_004853 sintaxina 8
425
201126_s_at MGAT1 NM_002406 manosil (α-,3-)-glicoproteína β-,2-Nacetilglucosaminiltransferasa
426
206925_at SIAT8D NM_005668 sialiltransferasa 8(α-2 8-polisialitransferasa)D
427
205319_at PSCA NM_005672 antígeno de células madre de próstata
428
206199_at CEACAM7 NM_006890 molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario, 7
429
207695_s_at IGSF1 NM_001555 superfamilia de inmunoglobulinas, miembro 1
430
219249_s_at FLJ22041 NM_021939 proteína hipotética FLJ22041
431
213413_at FLJ13555 BG434174 FLJ13555
432
219793_at SNX16 NM_022133 nexina de direccionamiento 16
433
212035_s_at KIAA1067 Al817079 proteína KIAA1067
434
202730_s_at PDCD4 NM_014456 muerte celular programada 4
435
202130_at sudD AA725102 supresor de bimD6, homólogo de Aspergillus nidulans
436
206623_at PDE6A NM_000440 fosfodiesterasa 6A, específica de cGMP, bastón, α
437
222201_s_at KIAA1315 AB037736 proteína KIAA1315
438
221752_at KIAA1298 AL041728 proteína KIAA1298
439
205003_at KIAA0716 NM_014705 producto del gen KIAA0716
441
205006_s_at NMT2 NM_004808 N-miristoiltransferasa 2
442
205677_s_at DLEU1 NM_005887 delecionado en la leucemia linfocítica, 1
443
204947_at E2F1 NM_005225 factor de transcripción E2F, 1
444
207505_at PRKG2 NM_006259 proteína quinasa, dependiente de GMPc, tipo II
445
211036_x_at BC006301 subunidad del complejo promotor de la anafase 5, clon MGC:13295,
446
211269_s_at K03122 ARNm del receptor de interleucina 2 (forma corta)
447
202610_s_at TRAP170 AF135802 componente del complejo proteico asociada al receptor de hormona tiroidea
448
204762_s_at BE670563 proteína de unión a nucleótidos de guanina (proteína G), polipéptido O con acción activadora de alfa
449
201313_at ENO2 NM_001975 enolasa 2, (γ, neuronal)
450
203225_s_at FLJ11149 NM_018339 proteína hipotética FLJ11149
451
221567_at NOP AF064599 proteína nucleolar Nop30
452
201518_at CBX1 NM_006807 homólogo 1 de cromobox (HP1 beta de Drosophila)
453
204970_s_at NM_002359 familia de oncogenes del fibrosarcoma musculoaponeurótico vmaf (aviar), proteína G (MAFG),
454
214615_at P2Y10 NM_014499 supuesto receptor purinérgico
455
221386_at OR3A2 NM_002551 familia de receptores olfativos 3, subfamilia A, miembro 2
456
200014_s_at HNRPC NM_004500 ribonucleoproteína nuclear heterogénea C (C1C2)
457
200053_at SPAG7 NM_004890 antígeno asociado a esperma 7
458
203462_x_at EIF3S9 NM_003751 factor de iniciación de la traducción 3 sub 9 (eta 116kD)
459
205917_at ZNF264 NM_003417 proteína con dedos de zinc 264
460
207753_at ZNF304 NM_020657 proteína con dedos de zinc 304
461
209751_s_at AF291676 proteína-2A de interacción con MBP-1
462
217403_s_at BC228680 AC074331 cromosoma 19, BAC CIT-HSPC_204F22
463
219571_s_at GIOT-3 NM_016265 GIOT-3 para represor de la transcripción inducible por gonadotropina-3
E10178199
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5
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25
35
45
55
464
203119_at MGC2574 NM_024098 proteína hipotética MGC2574
465
203721_s_at LOC51096 NM_016001 proteína CGI-48
466
204880_at MGMT NM_002412 O-6-metilguanina-ADN metiltransferasa
467
205664_at KIN NM_012311 determinante antigénico de homólogo de proteína recA (ratón)
468
212597_s_at AL079310 mapeo del nuevo gen humano al cromosoma 22
469
212759_s_at Al703074 similar a factor de transcripción 7, 2 (específico de linfocitos T, caja HMG)
470
213824_at AF221520 proteína 2 de unión a proteína quinasa C
471
218137_s_at FLJ13159 NM_021940 proteína hipotética FLJ13159
472
220445_s_at TRAG3 NM_004909 gen asociado a resistencia a taxol 3
473
203720_s_at NM_001983 deficiencia para la reparación en roedores de la reparación por escisión por complementación cruzada, grupo de complementación 1
474
201046_s_at RAD23A NM_005053 homólogo A de RAD23 (S. cerevisiae)
475
202344_at HSF1 NM_005526 factor de transcripción de choque térmico 1
476
202580_x_at FOXM1 NM_021953 caja forkhead M1
477
205690_s_at G10 NM_003910 transcrito G10 materno
478
206307_s_at FOXD1 NM_004472 caja forkhead D1
479
213090_s_at Al744029 factor asociado a proteína de unión a caja TATA (TBP)
480
218215_s_at NR1H2 NM_007121 subfamilia de receptores nucleares 1, grupo H, miembro 2
481
207469_s_at PIR NM_003662 pirina
482
209062_x_at RAC3 AF010227 coactivador asociado al receptor 3
483
200823_x_at RPL29 NM_000992 proteína ribosómica L29
484
202868_s_at POP4 NM_006627 homólogo de POP4 (procesamiento del precursor, S. cerevisiae)
485
217747_s_at RPS9 NM_001013 proteína ribosómica S9
486
32723_at L02547 subunidad de 50 kDa del factor de estimulación de escisión (clon pZ50-19)
487
212105_s_at BE910323 polipéptido de la caja DEADH (Asp-Glu-Ala-AspHis) 9
488
207320_x_at NM_004602 staufen (Drosophila, proteína de unión a ARN) (STAU), variante de transcrito T4,
489
200081_s_at BE741754 proteína ribosómica S6
490
217559_at Al001784 muy similar a proteína ribosómica A42735, L10, citosólica
491
217907_at HSPC071 NM_014161 proteína HSPC071
492
213504_at W63732 subunidad 6 de COP9 (homólogo de MOV34, 34 kD)
493
204102_s_at EEF2 NM_001961 factor de elongación de la traducción eucariota 2
494
208696_at AF275798 PNAS-102
495
209275_s_at CLN3 AF015593 proteína CLN3
496
214591_at BF215673 proteína similar a Kelch de Drosophila
497
201642_at IFNGR2 NM_005534 receptor de interferón gamma 2 (transductor de interferón gamma 1)
498
219080_s_at CTPS2 NM_019857 CTP sintasa II
499
202282_at HADH2 NM_004493 hidroxiacil-coenzima A deshidrogenasa, tipo II
500
201453_x_at RHEB2 NM_005614 homólogo de Ras enriquecido en el cerebro 2
501
208733_at NM_002865 RAB2, miembro de la familia de oncogenes RAS
502
211004_s_at BC002553 similar a aldehído deshidrogenasa 7
503
201400_at PSMB3 NM_002795 proteasoma (prosoma, macropaína) sub β tipo 3
504
208799_at BC004146 proteasoma (prosoma, macropaína) sub β tipo 5
505
216088_s_at AL078633 secuencia de ADN del clon RP5-1005F21 en el cromosoma 20
506
213912_at KIAA0984 AW134976 proteína KIAA0984
507
213913_s_at KIAA0984 AW134976 proteína KIAA0984
508
205356_at USP13 NM_003940 proteasa específica de ubiquitina 13 (isopeptidasa T-3)
509
208166_at MMP16 NM_022564 metaloproteinasa de matriz 16 (insertada en membrana) variante de transcrito 2,
510
202018_s_at LTF NM_002343 lactotransferrina
511
213829_x_at FLJ20478 AK000485 FLJ20478
512
212766_s_at AW294587 similar a proteína hipotética FLJ12484,
513
202969_at Y09216 quinasa regulada por fosforilación en tirosina (Y) de doble especificidad, 2
514
203218_at W37431 proteína quinasa activada por mitógeno 9
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515
204171_at RPS6KB1 NM_003161 proteína S6 quinasa ribosómica,
516
204906_at BC002363 proteína S6 quinasa ribosómica, 90 kD, polipéptido 2,
517
205126_at VRK2 NM_006296 quinasa relacionada con vaccinia 2
518
214716_at DKFZp434P0 116 AW504018 proteína hipotética DKFZp434P0116
519
37170_at HRIHFB2017 AB015331 HRIHFB2017
520
211474_s_at BC004948 MGC:10846,
521
204237_at CED-6 NM_016315 proteína CED-6
522
203005_at LTBR NM_002342 receptor de linfotoxina β (superfamilia de TNFR, miembro 3
523
211000_s_at gp130-RAPS AB015706 gp130 de la forma soluble portadora del péptido antigénico de la artritis reumatoide
524
202679_at NPC1 NM_000271 enfermedad de Niemann-Pick, tipo C1
525
205282_at LRP8 NM_004631 proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad 8, receptor de apolipoproteína E
526
207270_x_at CMRF35 NM_006678 receptor similar a inmunoglobulina de leucocitos CMRF35
527
211846_s_at AF110314 receptor similar a inmunoglobulina de herpesvirus HIgR
528
201810_s_at AL562152 proteína de unión a dominio SH3 5 (asociada a BTK)
529
213684_s_at BF671400 proteína LIM (similar a enigma de unión a proteína quinasa C de rata)
530
206636_at RASA2 NM_006506 activador de proteína p21 de RAS, 2
531
219907_at SNT-2 NM_006653 diana de factor neurotrófico asociado a suc1, 2 (adaptador de señalización de FGFR)
532
201281_at GP110 NM_007002 glicoproteína de membrana celular, 110000M(r) (antígeno de superficie)
533
209462_at U48437 proteína similar a precursor de amiloide 1
534
210880_s_at AB001467 Efs2,
535
212567_s_at AL523310 CS0DC001YN06 (3 prima)
536
202222_s_at DES NM_001927 desmina
537
219615_s_at KCNK5 NM_003740 canal de potasio, subfamilia K, miembro 5 (TASK-2)
538
214210_at AL049764 clon RP3-362J20 en cromosoma 22q13.1-13.31
539
52078_at Al828080
540
203765_at GCL NM_012198 grancalcina
541
213308_at AB028945 proteína de unión a dominio SH3 de cortactina
542
203082_at KIAA0187 NM_014753 producto del gen KIAA0187
543
212543_at AIM1 U83115 proteína similar a β gamma-cristalina no lente
544
209709_s_at RHAMM U29343 receptor de ácido hialurónico
545
205807_s_at TUFT1 NM_020127 tuftelina 1
546
213895_at BF445047 proteína de membrana epitelial 1
547
201565_s_at ID2 NM_002166 inhibidor de la unión a ADN 2, proteína hélice-buclehélice dominante negativa
548
202639_s_at Al689052 proteína de unión a RAN 3
549
209230_s_at COM1 AF135266 homólogo de proteína p8
550
218626_at 4E-T NM_019843 transportador de elF4E
551
221506_s_at BG258639 carioferina beta 2b, transportina
552
221521_s_at BC003186 proteína HSPC037, clon MGC:673,
553
202069_s_at AI826060 isocitrato deshidrogenasa 3 (NAD+) α
554
203524_s_at MPST NM_021126 mercaptopiruvato sulfurtransferasa
555
201916_s_at SEC63L NM_007214 SEC63, similar a componente de translocon de retículo endoplasmático (S. cerevisiae)
556
217776_at ARSDR1 AF167438 deshidrogenasa/reductasa de cadena corta regulada por andrógenos 1
557
218623_at LOC51617 NM_015980 proteína HMP19
558
208777_s_at AF001212 subunidad de proteasoma 26S, 9
559
203971_at SLC31A1 NM_001859 familia de transportadores de solutos 31 (transportadores de cobre), miembro 1
560
215243_s_at AF099730 gen de conexina 31 (GJB3),
561
201591_s_at NM_007184 receptor candidato de imidazolina (I-1),
562
205466_s_at HS3ST1 NM_005114 heparán sulfato (glucosamina) 3-O-sulfotransferasa 1
563
207829_s_at BNIP1 NM_013978 proteína 1 de interacción con Bcl-2 adenovirus E1B 19kD, variante de transcrito BNIP1-a,
E10178199
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5
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55
564
205742_at TNNI3 NM_000363 troponina I, cardíaca
565
211178_s_at AF038602 proteína 1 de unión a CD2, forma corta
566
219113_x_at LOC51171 NM_016246 deshidrogenasa/reductasa de cadena corta retiniana retSDR3
567
217807_s_at GLTSCR2 NM_015710 gen de región candidato supresor de tumores glioma 2
568
206133_at HSXIAPAF1 NM_017523 factor 1 asociado a XIAP
569
201379_s_at TPD52L2 NM_003288 similar a proteína tumoral D52, 2
570
209373_at BC003179 MGC:4419,
571
210142_x_at AF117234 flotilina
572
218942_at FLJ22055 NM_024779 proteína hipotética FLJ22055
573
216716_at U15197 proteína ABO de grupo histo-sanguíneo, secuencia 3 UTR parcial.
574
218185_s_at FLJ10511 NM_018120 proteína hipotética FLJ10511
575
219215_s_at FLJ20327 NM_017767 proteína hipotética FLJ20327
576
214683_s_at Al251890 quinasa 1 similar a CDC
577
202612_s_at CRSP2 NM_004229 cofactor necesario para la activación de la transcripción de Sp1, subunidad 2 (150 kD)
578
208932_at BC001416 proteína fosfatasa 4 (anteriormente X), subunidad catalítica,
579
206766_at ITGA10 AF112345 subunidad de integrina α 10
580
216213_at AF155113 antígeno NY-REN-55
581
205609_at ANGPT1 NM_001146 angiopoyetina 1
582
204644_at tNOX AF207881 hidroquinona (NADH) oxidasa asociada a tumores
583
206812_at ADRB3 NM_000025 adrenérgico, β-3-, receptor
584
202176_at ERCC3 NM_000122 deficiencia para la reparación en roedores de la reparación por escisión por complementación cruzada, grupo de complementación 3 (grupo B de complementación de xeroderma pigmentosum)
585
219816_s_at FLJ10482 NM_018107 proteína hipotética FLJ10482
586
200934_at DEK NM_003472 oncogén DEK (unión a ADN)
587
206098_at ZID NM_006626 proteína con dedos de zinc con dominio de interacción
588
206987_x_at FGF18 NM_003862 factor de crecimiento de fibroblastos 18
589
208392_x_at IFI75 NM_004510 proteína inducida por interferón 75, 52 kD
590
213048_s_at W26593 translocación de SET (asociado a leucemia mieloide)
591
220861_at AF118067 PRO1578
592
222115_x_at BC003693 similar al gen 3930401K13 de ADNc de RIKEN
593
222236_s_at FLJ20246 AK000253 FLJ20246
594
41644_at KIAA0790 AB018333 proteína KIAA0790,
595
204107_at NM_002505 factor de transcripción nuclear Y, α
596
209706_at AF247704 proteína con caja homeótica Nkx3.1
597
210174_at AF228413 factor de transcripción de hepatocitos
598
213844_at HOXA5 NM_019102 caja homeótica A5
599
214108_at Al346181 proteína MAX
600
212064_x_at Al471665 Proteína con dedos de zinc asociada a MYC (factor de transcripción de unión a purina)
601
214316_x_at Al348935 calreticulina
602
201514_s_at G3BP NM_005754 proteína de unión a dominio SH3 de la proteína activadora de Ras-GTPasa
603
203092_at hTIM44 AF026030 supuesto receptor de importación de proteínas de la membrana interna mitocondrial
604
208725_at AL031668 secuencia de ADN del clon RP1-64K7 en el cromosoma 20q11.21-11.23.
605
219819_s_at HSPC007 NM_014018 proteína HSPC007
606
200724_at BC003358 proteína ribosómica L10,
607
214350_at AI762021 sintrofina, beta 2 (proteína A1 asociada adistrofina, 59kD, componente básico 2)
608
210197_at BC003622 similar a inositol 1,3,4-trifosfato 56 quinasa,
609
218150_at ARL5 NM_012097 similar a factor de ribosilación de ADP 5
610
214241_at AA723057 NADH deshidrogenasa (ubiquinona) subcomplejo 1 beta, 8 (19 kD, ASHI)
E10178199
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5
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55 15
611
206253_at DLG2 NM_001364 homólogo de discos grandes (Dros.) 2 (chapsina-110)
612
205435_s_at KIAA1048 NM_014911 proteína KIAA1048
613
215154_at DKFZp434G043 AL080134 DKFZp434G043
614
215771_x_at X15786 gen ret-II.
615
213795_s_at BF740139 clon RP4-534B8, cromosoma 20
616
209042_s_at BC001738 Similar a enzima conjugadora de ubiquitina E2G 2 (homóloga a UBC7 de levadura),
617
201602_s_at NM_002480 miosina fosfatasa, subunidad diana 1
618
211133_x_at AF009643 proteína transcrito 5 similar a inmunoglobulina de clon 6
619
211245_x_at AF002256 homólogo del receptor inhibidor de linfocitos citolíticos cl-9
620
210713_at U61166 proteína que contiene dominio SH3, SH3P17
621
210840_s_at KIAA0051 D29640 KIAA0051
622
218157_x_at SPEC1 NM_020239 efector de proteína pequeña 1 de Cdc42
623
208292_at BMP10 NM_014482 proteína morfogenética ósea 10
624
210518_at AB035305 ARNm de CDH8 para cadherina-8,
625
205064_at SPRR1B NM_003125 proteína pequeña rica en prolina 1B (cornifina)
626
206990_at TNR NM_003285 tenascina R (restrictina, janusina)
627
211304_x_at D50134 canal de K de rectificación interna
628
203950_s_at CIC-6a NM_001286 canal de cloruro 6 (CLCN6), variante de transcrito
629
214211_at AA083483 ferritina, polipéptido pesado 1
630
211056_s_at BC006373 clon MGC:12762
631
212185_x_at MT2A NM_005953 metalotioneína 2A
632
203415_at PDCD6 NM_013232 muerte celular programada 6
633
205388_at TNNC2 NM_003279 troponina C2, rápida
634
208871_at D31840 DRPLA
635
218840_s_at FLJ10631 NM_018161 proteína hipotética FLJ10631
636
206400_at LGALS7 NM_002307 lectina de unión a galactósido, soluble, 7 (galectina 7)
637
207733_x_at PSG9 NM_002784 glicoproteína beta-1 específica del embarazo 9
638
207850_at GRO3 NM_002090 oncogén GRO3
639
210884_s_at AF168619 HE2 gamma1
640
220162_s_at LOC64170 NM_022352 proteína con dominio de reclutamiento de caspasa 9
641
209749_s_at Al623989 enzima convertidora de angiotensina I (peptidildipeptidasa A) 1
642
216010_x_at D89324 ADN para alfa (1,31,4) fucosiltransferasa,
643
203970_s_at PEX3 NM_003630 factor de biogénesis de peroxisomas 3
644
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649
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650
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Claims (13)

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    REIVINDICACIONES
    1.
    Método para evaluar el estado de un cáncer de mama, estadificar a los pacientes de cáncer de mama o determinar un protocolo de tratamiento del paciente en una muestra biológica obtenida de un paciente, que comprende las etapas de medir los niveles de expresión en la muestra de los genes que codifican un ARNm identificado por las SEQ ID NO: 96-111 en la Tabla 10, en el que los niveles de expresión génica por encima o por debajo de los niveles límite predeterminados son indicativos del estado de un cáncer de mama o del estadio de un cáncer de mama.
  2. 2.
    Método según la reivindicación 1 en el que la etapa corresponde a la clasificación mediante el sistema TNM o a pacientes con perfiles de expresión génica similares.
  3. 3.
    Método según la reivindicación 1 que comprende adicionalmente medir los niveles de expresión de genes seleccionados del grupo que consiste en aquellos que codifican un ARNm identificado por las SEQ ID NO: 36-95 en la Tabla 10, en el que los niveles de expresión génica por encima o por debajo de los niveles límite predeterminados son indicativos del estado de un cáncer de mama o del estadio de un cáncer de mama; particularmente en el que el método proporciona un pronóstico para los pacientes ER positivo o ER negativo.
  4. 4.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la muestra se prepara mediante un método seleccionado del grupo que consiste en la preparación de tejido en bruto (preferentemente obtenido a partir de una pieza quirúrgica o de una biopsia) y la microdisección por captura con láser.
  5. 5.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende adicionalmente:
    (a)
    medir el nivel de expresión de al menos un gen que codifica un ARNm identificado por las SEQ ID NO: 112-132 en la Tabla 10; o
    (b)
    medir el nivel de expresión de al menos un gen expresado constitutivamente en la muestra; o
    (c)
    determinar el estado del receptor de estrógeno (ER) de la muestra; particularmente en el que el estado ER se determina (i) midiendo el nivel de expresión de al menos un gen indicativo del estado ER o midiendo la presencia de ER en la muestra o en el que la presencia de ER se mide mediante inmunohistoquímica o (ii) midiendo el nivel de expresión de al menos un gen indicativo del estado ER o midiendo la presencia de ER en la muestra o en el que la presencia de ER se mide mediante inmunohistoquímica.
  6. 6.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que
    (a)
    la muestra se obtiene de un tumor primario; o
    (b)
    el patrón de expresión de los genes se compara con un patrón de expresión indicativo de un paciente recidivante; particularmente en el que la comparación de los patrones de expresión se lleva a cabo con los métodos de reconocimiento de patrones; más particularmente en el que los métodos de reconocimiento de patrones incluyen el uso de un análisis de riesgos proporcionales de Cox.
  7. 7.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el que
    (a)
    los niveles límite predeterminados son una sobreexpresión o subexpresión al menos 1,5 veces mayor en la muestra con respecto a las células benignas o al tejido normal; o
    (b)
    los niveles límite predeterminados tienen al menos una sobreexpresión con un valor p estadísticamente significativo en la muestra que tiene células metastásicas con respecto a las células benignas o al tejido normal, particularmente en el que el valor p es inferior a 0,05; o
    (c)
    la expresión génica se mide en una micromatriz o matriz génica, particularmente en el que (i) la micromatriz es una matriz de ADNc o una matriz de oligonucleótidos o (ii) la micromatriz o matriz génica comprende adicionalmente uno o más reactivos de control interno; o
    (d)
    en el que la expresión génica se determina mediante la amplificación de ácidos nucleicos llevada a cabo mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ARN extraído de la muestra; particularmente en el que dicha PCR es una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), que opcionalmente comprende además uno o más reactivos de control interno.
  8. 8.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la expresión génica se detecta
    (a)
    midiendo o detectando una proteína codificada por el gen, particularmente en el que la proteína es detectada por un anticuerpo específico para la proteína; o
    (b)
    midiendo una característica del gen, particularmente en el que la característica medida está seleccionada del grupo que consiste en la amplificación, metilación, mutación y variación alélica de ADN.
  9. 9.
    Uso de una composición que comprende un conjunto de sondas que consiste en sondas para detectar los genes identificados por las SEQ ID NO: 96-111 en la Tabla 10 en un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3.
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  10. 10. Uso de un kit para llevar a cabo un ensayo para determinar el pronóstico de cáncer de mama en una muestra biológica en el que el kit comprende materiales para detectar secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de los mismos de una combinación de genes que codifican un ARNm identificado por las SEQ ID NO: 96-111 en la Tabla 10, en el que el kit opcionalmente comprende además materiales para detectar
    5 secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de los mismos de una combinación de genes seleccionados del grupo que consiste en aquellos que codifican un ARNm identificado por las SEQ ID NO: 36-95 en la Tabla 10, que opcionalmente comprende además
    i. reactivos para llevar a cabo un análisis de micromatrices; o
    ii. un medio a través del cual se ensayan dichas secuencias de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de los mismos.
  11. 11. Micromatriz o matriz génica para llevar a cabo el método según las reivindicaciones 1 ó 3; que consiste en secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de los mismos de una combinación de genes
    15 que codifican un ARNm identificado por las SEQ ID NO: 96-111 en la Tabla 10 y opcionalmente uno o más reactivos de control interno; en el que la combinación es suficiente para caracterizar el estado de un cáncer de mama o el riesgo de recidiva en una muestra biológica;
  12. 12.
    Micromatriz o matriz génica según la reivindicación 11; en la que (i) la medición o caracterización es una sobreexpresión o subexpresión al menos 1,5 veces mayor; o (ii) la medición proporciona una sobreexpresión o subexpresión con un valor p estadísticamente significativo.
  13. 13.
    Micromatriz o matriz génica según la reivindicación 11 ó 12
    25 (a) en la que el valor p es inferior a 0,05 o en la que la micromatriz comprende una matriz de ADNc o una matriz de oligonucleótidos; y/o
    (b) que comprende una matriz de ADNc o una matriz de oligonucleótidos.
    43
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