ES2506466T3 - Plásmido auto-supresor - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de producción de un plásmido sin gen marcador de selección que comprende las etapas de: a) cultivar un plásmido que contiene un gen marcador de selección flanqueado por sitios diana de recombinasa específica de sitio seleccionado de Ecdif, cer psi, pif y mwr en un primer entorno de célula huésped que es incapaz de efectuar la recombinación entre los sitios diana de recombinasa específica de sitio, en el que el primer entorno de célula huésped comprende una mutación inactivante en uno o más de los genes que codifican PepA, ArgR y ArcA; y b) posteriormente cultivar el plásmido en un segundo entorno de célula huésped que puede efectuar la recombinación entre los sitios diana de recombinasa específica de sitio, de forma que el gen marcador de selección se escinde, en el que el segundo entorno de célula huésped contiene versiones activas de PepA y ArgR o ArcA, y comprende una recombinasa específica de sitio seleccionada de XerC y XerD.
Description
ADN entre dos sitios diana de recombinasa específica de sitio. Por ejemplo, la recombinasa Flp del plásmido de dos micrómetros de levadura actúa invirtiendo una región del plásmido por recombinación de ADN entre sitios FRT. Por tanto, en una realización, el sitio diana de recombinasa específica de sitio puede ser un sitio FRT.
Tabla 1: Sitios de unión a modo de ejemplo para recombinasas específicas de sitio para su uso en la invención y sus sitios de unión
- Sitio
- Secuencia (5’-3’) Recombinasas Origen SEQ ID Nº
- Ecdif
- GGTGCGCATAATGTATATTATGTTAAAT XerC, XerD E. coli cromosoma SEQ ID Nº: 1
- cer
- GGTGCGTACAATTAAGGGATTATGGTAAAT XerC, XerD Plasmido de E. coli ColE1 SEQ ID Nº: 2
- psi
- GTGCGCGCAAGATCCATTATGTTAAAC XerC, XerD Salmonella plasmido PSC10I SEQ ID Nº: 3
- pif
- GGTGCGCGCAAGATCCATTATGTTAAAT XerC, XerD Hibrido dif-psi SEQID Nº: 4
- mwr
- GGTGCACGCAACAGATGTTATGGTAAAT XerC, XerD K. pneumoniae plasmido pJHCMW1 SEQ ID Nº: 5
- Bsdif
- ACTTCCTAGAATATATATTATGTAAACT CodV, RipX B. subtilis cromosoma SEQ ID Nº: 6
- loxP
- ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT Cre Bacteriófago P1 SEQ ID Nº:7
- FRT
- GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTT Flp Levadura SEQ ID Nº:8
- RS
- TTGATGAAAGAATACGTTATTCTTTCATCAA R Levadura SEQ ID Nº:9
En una realización, las secuencias diana de la recombinasa específica de sitio pueden ser iguales entre sí. En otra realización, las secuencias diana de la recombinasa específica de sitio pueden ser diferentes entre sí.
Como se trata anteriormente, se requieren secuencias accesorias para dirigir la recombinación específica de sitio entre sitios diana de recombinasa específica de sitio presentes sobre un plásmido. Por tanto, en una realización, uno
o más de los sitios diana de recombinasa específica de sitio pueden estar funcionalmente asociados a los sitios de unión para una o más proteínas accesorias.
Los sitios de unión para proteínas accesorias se denominan generalmente sitios accesorios.
En una realización, las secuencias accesorias pueden ser sitios de unión para una o más de la proteínas accesorias PepA, ArgR o ArcA. En realizaciones específicas, las secuencias accesorias pueden contener sitios de unión para PepA y tanto ArgR como ArcA.
En una realización, las secuencias accesorias pueden parecerse a las secuencias mostradas más adelante en las que los sitios de unión ArgR/ArcA están subrayados con una línea de puntos y los sitios de unión XerCD están subrayados con una línea continua sencilla. PepA se une a las secuencias accesorias alrededor de los sitios de unión ArgR/ArcA, pero no se ha definido la localización precisa.
Un sitio accesorio se considera que se parece a uno de los sitios enumerados más adelante si comprende o consiste en una cualquiera de SEC ID Nº: 17, 20 ó 23. Un sitio accesorio se considera que se parece a uno de los sitios enumerados más adelante si tiene el 50 % o más de identidad de secuencias con una cualquiera de SEC ID Nº: 17, 20 ó 23. Alternativamente, el sitio accesorio puede tener el 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o el 100 % de identidad de secuencias con una cualquiera de SEC ID Nº: 17, 20 ó 23: Esto puede ser equivalente a una secuencia que tiene 1, 2, 3 ó 4 sustituciones de nucleótidos en comparación con una cualquiera de SEC ID Nº: 17, 30 ó 23. Las secuencias que comprenden un fragmento de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 nucleótidos de una cualquiera de SEC ID Nº: 17, 20 ó 23 también están incluidas dentro del alcance de la invención. Las secuencias de fragmentos o de variante descritas anteriormente pueden ser capaces de unirse a PepA, ArgR o ArcA.
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