ES2510865T3 - Microorganismo recombinante y procedimiento para producir L-lisina - Google Patents

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Abstract

ADN recombinante replicable de un modo autónomo en una bacteria Escherichia coli, en el que el ADN recombinante comprende un gen dapA de B. subtilis y en el que el gen dapA presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos por lo menos idéntica en un 90 % a la SEC ID n.º: 2, y en el que se sustituye el aminoácido histidina de la posición 119 con tirosina, presentando dicha proteína actividad de dihidrodipicolinatosintasa (DDPS).

Description

Microorganismo recombinante y procedimiento para producir L-lisina
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al campo de la biotecnología. En particular, la presente invención proporciona procedimientos para producir L-lisina mediante la proliferación de una bacteria Escherichia transformada, en particular E. coli, que comprende un gen dapA natural o variante de Bacillussubtilis, que se describen en la presente memoria.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La L-lisina es un aminoácido esencial que no se sintetiza en los animales. Se ha descubierto que muchas cepas bacterianas naturales y mutantes producen L-lisina. Al utilizarse ampliamente como suplemento alimenticio, medicamento, producto químico e ingrediente alimentario, se ha producido la L-lisina por fermentación a gran escala utilizando principalmente una bacteria Coryneform o una bacteria Escherichia.
En la mayoría de las bacterias, la L-lisina se sintetiza de un modo natural a partir de aspartato en una vía enzimática de nueve etapas, entre ellas dos etapas compartidas por las vías de biosíntesis de la metionina y la treonina (Anastassiadis, S., RecentpatentsonBiotechnology 2007, 1(1):11-24; Chen, N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268(13):9448-66). Por ejemplo, la dihidrodipicolinatosintasa ("DDPS"), una enzima que cataliza la primera etapa en la rama de la biosíntesis de la lisina, experimenta una autorregulación negativa por la L-lisina en bacterias gramnegativas (por ejemplo, E. coli, Bacillussphaericus y Methanobacteriumthermoautotrophicum), pero no en las bacterias grampositivas (por ejemplo Bacilluslicheniformis, Bacillusmegaterium, Bacillussubtilis, Corynebacteriumglutamicum, Bacilluscereus, y Bacilluslactofermentum) (Dobson, R. et al., Acta Cryst. 2005, D61:1116-24). Además, la regulación de la ruta de la biosíntesis de la lisina en Bacillussubtilis ("B. subtilis") es única porque implica una regulación doble mediante la lisina y uno de sus precursores, el diaminopimelato (Chen, N. et al.,
J. Biol. Chem. 1993, 268(13):9448-66).
Acorde con la diversa sensibilidad a la autorregulación negativa de la DDPS por la L-lisina, se observa una homología limitada en la secuencia proteica de la DDPS y en su gen correspondiente, el dapA, entre las cepas bacterianas de géneros distintos. La DDPS en B. subtilis presenta una secuencia de aminoácidos aproximadamente del 43 % y el 40 % idéntica a la de E. coli y CorynebacteriumGlutamicum ("C. glutamicum"), respectivamente (Chen,
N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268(13):9448-66). Incluso en el mismo género de bacterias, las distintas cepas bacterianas presentan una homología únicamente moderada. Por ejemplo, el gen dapA de Bacillusmethanolicus ("B. methanolicus") presenta una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos aproximadamente un 65 % idéntica a un gen dapA conocido previamente de B. subtilis (patente US n. 6.878.533).
Un modo de mejorar la producción de L-lisina por parte de una bacteria Escherichia es superar la autorregulación negativa de la DDPS por la L-lisina. Se han realizado mutaciones en el gen dapA natural de una bacteria Escherichia para desensibilizar la DDPS a la L-lisina (patente US n. 6.040.160). Se ha intentado asimismo introducir un gen dapA natural de una bacteria que no fuera Escherichia, en la que la DDPS correspondiente no experimentara autorregulación negativa por la L-lisina, en una bacteria Escherichia, pero no se ha conseguido obtener unos resultados coherentes y satisfactorios.
Un grupo coreano indicó que una introducción de un gen dapA natural de una cepa de C. glutamicum con hiperproducción de lisina en una cepa mutante de E. coli (TF1) que producía lisina permitió un aumento paralelo de la actividad de la DDPS sensible a la lisina y de la producción de lisina (Oh, J. et al., Biotech. Ltrs. 1991, 13(10):72732; patente coreana n. 10-1992-0008382). Sin embargo, la expresión del mismo gen dapA natural en otras dos cepas de E. coli (TF13 y TF23) no dio como resultado un alto rendimiento en la producción de lisina. Como justificación de la incoherencia de los resultados se mencionó que el mecanismo de regulación implicado en la biosíntesis de la lisina es más complejo en E. coli que en las bacterias de Coryneform.
La expresión de un gen dapA exógeno constituye un reto puesto que la xenoproteínaDDPS correspondiente se ve probablemente sometida a la descomposición por la proteasa y la formación de un cuerpo de inclusión insoluble en una bacteria Escherichia (patente US n. 6.040.160 ). Además, no se espera que una DDPS de C. glutamicum (Oh, J. et al., Biotech. Ltrs., 1991, 13(10):727-32; patente coreana n. 10-1992-0008382 ) o de B. methanolicus (patente US
n. 6.878.533 ) presente su actividad ventajosa, es decir, una actividad de la DDPS insensible a la lisina que produzca un alto rendimiento de la producción de lisina, en E. coli en parte debido a que la temperatura de cultivo óptima para C. glutamicum o B. methanolicus difiere de la de E. coli en aproximadamente diez o más grados.
Se observó una regulación extremadamente complicada de la síntesis de lisina en células de E. coli, en la que se expresaban los genes implicados en la biosíntesis de la lisina en B. subtilis (Shevchenko, T.N. et al., TsitolGenet. 1984, 18(1):58-60). En particular, la expresión de dichos genes exógenos, entre ellos un gen dapA exógeno, en células de E. coli no consiguió aumentar la producción de lisina a un nivel elevado y satisfactorio. Se indicó que se
puede alcanzar un aumento considerable en la biosíntesis de lisina utilizando una cepa de E. coli o B. subtilis que presente mutaciones en sus genes naturales implicados en la biosíntesis de la lisina para desensibilizar la autorregulación negativa por la lisina y el diaminopimelato.
En la actualidad, no existe procedimiento eficaz alguno para producir L-lisina utilizando una bacteria Escherichia que comprenda un gen dapA natural o variante de B. subtilis. Puesto que la demanda de L-lisina, en particular para el pienso, aumenta continuamente junto con la expansión de la población mundial, existe la necesidad de desarrollar procedimientos nuevos y eficaces para mejorar la producción de la L-lisina utilizando una cepa bacteriana de Escherichia.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Según la presente invención, una introducción de un gen dapA salvaje natural o variante de B. subtilis en una bacteria Escherichia mejora la producción de L-lisina por parte de la bacteria Escherichia a niveles industriales. Además, se puede utilizar la bacteria Escherichia transformada para producir L-lisina en un medio de cultivo con un alto rendimiento (por ejemplo, por lo menos 25, 50, 75, 100, 125 o 150 gramos por litro).
La presente invención proporciona un ADN recombinante replicable de un modo autónomo en una bacteria Escherichia y que comprende un gen dapA natural o variante de B. subtilis. Un gen dapA variante de B. subtilis presenta una secuencia no idéntica pero sustancialmente idéntica (por ejemplo, en un 90 % 95 % o 99 %) a la secuencia de un gen dapA natural de B. subtilis. Se puede utilizar ADN recombinante para introducir un gen dapA de
B. subtilis en una bacteria Escherichia para aumentar la producción de L-lisina.
El gen dapA de B. subtilis puede presentar una secuencia de ácido nucleico idéntica o sustancialmente idéntica (por ejemplo, en un 90 %, 95 % o 99 %) a la de un gen dapA de B. subtilis tal como se establece en GenBank, número de registro, L08471 (SEC ID n.º: 1) y Chen, N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268(13):9448-66). Un gen dapA variante de B. subtilis puede comprender una o más modificaciones en los nucleótidos de la SEC ID n.º: 1. En una forma de realización específica no limitativa, un gen dapA variante de B. subtilis comprende dos mutaciones de G a T en el nucleótido 355 de T y a C en el nucleótido 360 de la SEC ID n.º: 1.
Además, el gen dapA de B. subtilis puede codificar una proteína que presenta una secuencia de ácido nucleico idéntica o sustancialmente idéntica (por ejemplo, en un 90 %, 95 % o 99 %) a la secuencia de aminoácidos deducida de un gen dapA de B. subtilis tal como se establece en GenBank, número de registro, L08471 (SEC ID n.º: 2) y Chen, N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268(13):9448-66). La proteína puede presentar una secuencia de aminoácidos que comprenda una o más modificaciones en la SEC ID n.º: 2. En una forma de realización específica no limitativa, un gen dapA variante de B. subtilis codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende una mutación de histidina a tirosina en el aminoácido 119 de la SEC ID n.º: 2 ("variante H119Y"). El gen dapA de B. subtilis puede codificar una proteína que presente actividad de DDPS.
La presente invención proporciona asimismo una bacteria Escherichia que comprende un gen dapA natural o variante de B. subtilis para producir L-lisina en un medio de cultivo. La bacteria Escherichia puede producir por lo menos 50 gramos por litro de L-lisina en el medio de cultivo. En una forma de realización específica no limitativa, se proporciona una bacteria Escherichia que comprende un gen dapA natural de B. subtilis para producir L-lisina. En una forma de realización adicional específica no limitativa, se proporciona una bacteria Escherichia que comprende un gen dapA variante H119Y de B. subtilis para producir L-lisina.
La presente invención proporciona además procedimientos para producir L-lisina mediante la proliferación de una bacteria Escherichia en un medio de cultivo y la extracción de L-lisina del medio de cultivo, comprendiendo la bacteria un gen dapA natural o variante de B. subtilis. Se permite que la L-lisina se acumule antes recoger o extraer la misma del medio de cultivo. Se puede extraer la L-lisina del medio de cultivo cuando la L-lisina alcanza, por lo menos 25, 50, 75, 100, 125 o 150 gramos por litro, preferentemente por lo menos 50 gramos por litro. En una forma de realización específica no limitativa, se hace proliferar en un medio de cultivo una bacteria Escherichia que comprende un gen dapA natural de B. subtilis y se extrae la L-lisina del medio de cultivo. En una forma de realización específica no limitativa adicional, se hace proliferar en un medio de cultivo una bacteria Escherichia que comprende un gen dapA variante H119Y de B. subtilis, y se extrae la L-lisina del medio de cultivo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona ventajosamente procedimientos, bacterias transformadas que pertenecen al género Escherichia y ADN recombinantes para producir L-lisina por fermentación. Se ha descubierto ahora que se puede producir L-lisina con un alto rendimiento mediante una bacteria Escherichia que comprende un gen dapA natural o variante de B. subtilis.
En aras de la claridad de la descripción y no a título limitativo, la presente invención se describirá más detalladamente en las subsecciones siguientes:
(1)
un ADN recombinante;
(2)
una bacteria Escherichia transformada; y
(3)
un procedimiento para producir L-lisina.
(1) ADN recombinante
El ADN recombinante de la presente invención presenta un gen dapA natural o variante de una cepa de B. subtilis, y se duplica de un modo autónomo en una cepa bacteriana de Escherichia. Se puede obtener introduciendo un fragmento de ADN que comprenda el gen dapA de B. subtilis en un vector de expresión replicable en una cepa bacteriana de Escherichia.
En la cepa de B. subtilis, se expresa el gen dapA y la DDPS correspondiente no experimenta una autorregulación negativa sustancial (por ejemplo, del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o superior) por la L-lisina. La cepa de B. subtilis puede ser productora o no de L-lisina. Una cepa preferida de B. subtilis es la W168, que no es productora de lisina. Esta cepa se encuentra disponible en BacillusGenetic Stock Center, Universidad Estatal de Ohio, EE.UU.
Se puede obtener un fragmento de ADN que comprende un gen dapA natural de B. subtilis ("gen BsdapA") a partir del ADN cromosómico de una cepa natural de B. subtilis. Se puede preparar el ADN cromosómico a partir de una cepa de B. subtilis, utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica. Se puede obtener el fragmento de ADN amplificando el gen dapA natural de B. subtilis a partir del ADN cromosómico utilizando un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se pueden preparar los cebadores de PCR aptos basándose en la secuencia del gen dapA publicada previamente en B. subtilis u otras cepas bacterianas (por ejemplo, E. coli and C. glutamicum) (Chen, N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268(13):9448-66). Por ejemplo, se puede utilizar un par de cebadores monocatenarios 21-mer, DapA-F (SEC ID n.º: 3) y DapA-R (SEC ID n.º: 4).
A continuación se muestran las secuencias de ácido nucleico SEC ID n.º: 3 y 4:
SEC ID n.: 3 (DapA-F)
CGGCGATCGTTTCTGTTGGCA
SEC ID n.: 4 (DapA-R)
ATCTGGGCCATATCACGCGCT
Se puede obtener un fragmento de ADN que comprende un gen dapA variante de B. subtilis de un modo similar a partir del ADN cromosómico de una cepa mutada de B. subtilis in vivo. Se puede obtener asimismo un gen dapA variante de B. subtilis introduciendo modificaciones en el gen dapA natural de B. subtilis in vitro mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida y la mutagénesis mediante PCR.
Se puede determinar la secuencia del fragmento de ADN resultante mediante un procedimiento conocido comúnmente utilizando cebadores aptos (por ejemplo, DapA-F y DapA-R).
El gen dapA de B. subtilis puede presentar una secuencia de ácido nucleico idéntica o sustancialmente idéntica (por ejemplo, en un 90 %, 95 % o 99 %) a la del gen dapA de B. subtilis tal como se establece en GenBank, número de registro, L08471 (SEC ID n.º: 1) y Chen, N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268(13):9448-66). Un gen dapA natural de B. subtilis puede presentar una secuencia de ácido nucleico idéntica a la SEC ID n.º: 1. Un gen dapA variante de B. subtilis puede comprender una o más modificaciones en los nucleótidos de la SEC ID n.º: 1. Por ejemplo, un gen dapA variante de B. subtilis puede comprender dos mutaciones de G a T en el nucleótido 355 y de T a C en el nucleótido 360 de la SEC ID n.º: 1. Se puede determinar el porcentaje de identidad de la secuencia utilizando un software estándar tal como BLAST o FASTA.
Además, el gen dapA de B. subtilis puede codificar una proteína que presenta una secuencia de ácido nucleico idéntica o sustancialmente idéntica (por ejemplo, en un 90 %, 95 % o 99 %) a la secuencia de aminoácidos deducida de un gen dapA de B. subtilis tal como se establece en GenBank, número de registro, L08471 (SEC ID n.º: 2) y Chen, N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268(13):9448-66). Un gen dapA natural de B. subtilis puede codificar una proteína que presente una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEC ID n.º: 2. Un gen dapA de B.subtilis puede codificar asimismo una proteína que presente una secuencia de aminoácidos que comprenda una o más modificaciones en la SEC ID n.º: 2. Por ejemplo, un gen dapA variante de B. subtilis puede codificar una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende una mutación de histidina a tirosina en el aminoácido 119 de la SEC ID n.º: 2 ("variante H119Y").
Las modificaciones de los aminoácidos comprenden sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos. Las modificaciones se pueden introducir mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida y la mutagénesis mediante PCR. Las sustituciones de aminoácidos pueden comprender aquellas en las que el aminoácido se sustituye con un aminoácido que presenta una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica las familias de aminoácidos que presentan cadenas laterales similares. Dichas familias comprenden aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina,
asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas en β (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).
Las sustituciones de aminoácidos pueden comprender asimismo aquellas que se correlacionan con las sustituciones de aminoácidos en el gen dapA natural de una bacteria Escherichia de la que se conoce que desensibiliza las DDPS correspondientes con respecto a la L-lisina.
El fragmento de ADN que comprende un gen dapA natural o variante de B. subtilis se puede ligar posteriormente con un vector de expresión apto para producir un ADN recombinante que comprenda el gen dapA. Un vector de expresión de ADN apto se duplica de un modo autónomo en una cepa bacteriana de Escherichia que comprende un marcador genético seleccionable. Un marcador genético seleccionable permite detectar la resistencia a un antibiótico (por ejemplo, ampicilina, tetraciclina, kanamicina y neomicina), un cambio de color o cualquier otra característica que permita distinguir los hospedadores transformados a partir de hospedadores no transformados. Los ejemplos de vectores aptos comprenden un vector de expresión de E. coli tal como pTrc99A, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 y pSTV28. Se prefiere introducir el fragmento de ADN en un vector de expresión de ADN de tal modo que el gen dapA se encuentre controlado por un activador fuerte de E. coli. Los ejemplos de promotores aptos comprenden trc, tac, lac y T7, preferentemente trc.
El gen dapA de B. subtilis puede codificar una proteína que presente actividad de DDPS. Se puede confirmar la presencia de un ADN recombinante que comprende un gen dapA de B. subtilis por el nivel elevado de actividad de la DDPS en una cepa bacteriana transformada con el ADN recombinante o debido a la recuperación de la auxotrofia en una cepa bacteriana distinta deficiente en DDPS (por ejemplo, la cepa de E. coli JE7627) transformada con el ADN recombinante.
(2) Bacteria Escherichia transformada
Se puede transformar una bacteria Escherichia con un ADN recombinante que comprenda un gen dapA natural o variante de B. subtilis utilizando procedimientos estándar conocidos en la técnica. La bacteria Escherichia progenitora (sin transformar) puede presentar un gen dapA natural o mutante, y expresar la DDPS correspondiente natural o mutante. La actividad enzimática de la DDPS natural puede experimentar autorregulación negativa por la Llisina. La bacteria Escherichia progenitora puede ser productora de L-lisina. Se puede mejorar la actividad de otra enzima natural implicada en la biosíntesis de la lisina. Por ejemplo, se puede utilizar una cepa de E. coli que comprenda un ADN que codifique una aspartocinasa III natural y que presente una mutación para desensibilizar la autorregulación negativa por la L-lisina (patente US n.º 6.040.160). Se prefiere que la cepa bacteriana de Escherichia sea E. coli. Se prefiere además que la bacteria Escherichia se una cepa de E. coli que se utilice comúnmente en la producción industrial de L-lisina.
Tras la transformación, la bacteria Escherichia presenta un gen dapA natural o variante de B. subtilis. Se puede determinar la presencia de un gen dapA de B. subtilis en la bacteria transformada mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica. El gen dapA de B. subtilis se puede encontrar en un plásmido. Se puede integrar asimismo en un cromosoma de la bacteria Escherichia transformada. La bacteria Escherichia transformada produce L-lisina con un alto rendimiento (por ejemplo, por lo menos 25, 50, 75, 100, 125 o 150 gramos por litro).
En una forma de realización, la cepa B-3996 de E. coli (disponible en el Research Institute for Genetics and Industrial Micro organism Breeding con el número de registro RIA 1867) se transforma con un ADN recombinante que comprende un gen dapA natural (por ejemplo, pTrc99A-BsdapA) tras expulsar el único plásmido pVIC40 (patente US n. 6.040.160) para crear una cepa bacteriana transformada B-399/pTrc99A-BsdapA. Se preparó de un modo similar una cepa de control B-399/pTrc99A mediante la transformación con un ADN recombinante correspondiente sin BsdapA (por ejemplo, pTrc99A). Se preparó el medio de cultivo mezclando una disolución esterilizada (que contenía 16 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4·7H2O, 0,01 g/l de FeSO4·7H2O, 0,01 g/l de MnSO4·5H2O, 2 g/l de extracto de levadura (Difco), 0,5 g/l de L-metionina, 0,1 g/l de L-treonina y 0,05 g/l de L-isoleucina a un pH de 7,0) con glucosa esterilizada al 20 % en una proporción de 4 a 1. Se puede proporcionar glucosa para mejorar la producción de L-lisina. A continuación se añadió CaCO3farmacopeico esterilizado a la mezcla y se disolvió hasta una concentración final de 30 g/l. Se pueden añadir asimismo antibióticos aptos (por ejemplo, 15 μg/ml de tetraciclina y 5 μg/ml de kanamicina). Ambas cepas se cultivaron con una agitación de 114 a 116 rpm y a 37 °C durante 48 horas. Se recogió la L-lisina del medio de cultivo y se analizó. Se esperaba que la cepa bacteriana B-399/pTrc99A-BsdapA produjera por lo menos 10 gramos por litro de L-lisina, lo que resultaría significativamente superior a la cepa de control B-399/pTrc99A.
En otra forma de realización, se utilizó una cepa bacteriana DC037 de E. coli de Global Technology Group Bio-Chem Company Limited para preparar una E. coli recombinante que comprendía un gen dapA natural de B. subtilis (LDC051), una E. coli recombinante que comprendía un gen dapA variante H119Y de B. subtilis (DC231), y una cepa de E. coli recombinante (DC073) como control, que producía L-lisina en 150, 180 y 20 gramos por litro,
respectivamente. La preparación y los ensayos con dichas cepas de E. coli recombinantes se describen en los Ejemplos 3 y 4.
El 26 de febrero de 2009 se depositaron las bacterias de las cepas DC051 y DC231 en el Centro General de Recogida de Cultivos Microbiológicos de China (CGMCC), según Tratado de Budapest, y se les dio los números de registro CGMCC n.º 2923 y CGMCC n.º 2924, respectivamente.
La actividad de la DDPS en la bacteria Escherichia transformada puede no experimentar una autorregulación negativa sustancial por la L-lisina (por ejemplo, de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o superior). La actividad de la DDPS en la bacteria Escherichia transformada se puede reducir no más del 50 % en presencia de L-lisina 10 mM.
Se puede determinar la actividad DDPS en una bacteria según el procedimiento descrito por Yugari, Y. y Gilvarg C. in J. Biol. Chem., 1965, 240(12):4710-16, o mediante cualquier otro procedimiento apto. Por ejemplo, se añade un extracto bacteriano a una disolución de la reacción que contiene imidazol-HCl 50 mM (pH 7,4), L-aspártico semialdehído 20 mM y piruvato sódico 20 mM, y se incuba a 37 °C durante 10 minutos. Se puede utilizar una disolución de la reacción sin piruvato sódico como testigo en blanco. La actividad de la DDPS se determina mediante la cantidad de dihidrodipicolinato generada por la reacción, que se detecta con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 270 nm. Se añadieron diversas cantidades de L-lisina a la mezcla de la reacción para valorar la sensibilidad a la lisina en la actividad de la DDPS.
(3)
Procedimiento para producir L-lisina
La L-lisina se puede producir mediante la proliferación de una bacteria Escherichia que comprende gen dapA natural
o variante de B. subtilis en un medio de cultivo. Resulta ventajoso un medio apto para la proliferación óptima de una bacteria Escherichia (Anastassiadis, S., Recent Patents On Biotechnology 2007, 1(1):11-24). Resulta ventajoso un antibiótico (por ejemplo, ampicilina) en el medio para mantener la selectividad y la estabilidad de la bacteria Escherichia transformada.
Por ejemplo, se preparó el medio de cultivo mezclando una disolución esterilizada (que contenía 16 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4·7H2O, 0,01 g/l de FeSO4·7H2O, 0,01 g/l de MnSO4·5H2O, 2 g/l de extracto de levadura (Difco), 0,5 g/l de L-metionina, 0,1 g/l de L-treonina y 0,05 g/l de L-isoleucina a un pH de 7,0) con glucosa esterilizada al 20 % en una proporción de 4 a 1. Se puede proporcionar glucosa para mejorar la producción de L-lisina. A continuación se añadió CaCO3farmacopeico esterilizado a la mezcla y se disolvió hasta una concentración final de 30 g/l. Se pueden añadir asimismo antibióticos aptos (por ejemplo, 15 μg/ml de tetraciclina y 5 μg/ml de kanamicina).
Resultan ventajosas unas condiciones óptimas de cultivo para una bacteria Escherichia (Anastassiadis, S., Recent Patents On Biotechnology 2007, 1(1):11-24). Se realiza el cultivo preferentemente en condiciones aeróbicas a una temperatura comprendida entre 25 °C y 45 °C y a un pH comprendido entre 5 y 8. La concentración de L-lisina alcanza un máximo tras cultivar durante aproximadamente entre 2 y 10 días. Se puede controlar la proliferación bacteriana basándose en la densidad celular del medio de cultivo determinada con un espectrofotómetro.
Se permite que la L-lisina se acumule en el medio de cultivo de una bacteria Escherichia transformada cultivada según la presente invención. Se puede recoger la L-lisina mediante diversos procedimientos (por ejemplo, procedimientos cromatográficos de intercambio iónico) para producir L-lisina-HCl antes o después de la separación celular mediante centrifugación y filtración del medio de cultivo; o se puede recoger el caldo de L-lisina para producir sulfato de L-lisina mediante un proceso de granulación (Anastassiadis, S., Recent Patents On Biotechnology 2007, 1(1):11-24; patente china n.º 200410050017.4 ). Se puede recoger o extraer la L-lisina del medio de cultivo cuando la L-lisina alcanza por lo menos entre 5 y 10 gramos por litro, o por lo menos 25, 50, 75, 100, 125 o 150 gramos por litro en un proceso de fermentación a gran escala, preferentemente por lo menos 50 gramos por litro. Se puede determinar la cantidad de L-lisina mediante diversos procedimientos analíticos conocidos en la técnica (por ejemplo, HPLC).
EJEMPLOS
A continuación se describirá la presente invención de un modo general, se podrá comprender más fácilmente haciendo referencia a los ejemplos siguientes, que se incorporan únicamente a título ilustrativo de ciertos aspectos y formas de realización de la presente invención, y no pretenden limitar la misma.
Ejemplo 1Construcción del plásmido pTrc99A-BsdapA
Se construyó el plásmido pTrc99A-BsdapA para que comprendiese un gen dapA natural de B. subtilis. Se preparó el ADN cromosómico a partir de la cepa natural W168 de B. subtilis (Bacillus Genetic Stock Center, la Universidad Estatal de Ohio, EE.UU.), utilizando un procedimiento conocido comúnmente. Se obtuvo un fragmento de ADN de 0,88 kb amplificando el gen dapA natural en el ADN cromosómico utilizando un par de cebadores, DapA-F (SEC ID n.º: 3) y DapA-R (SEC ID n.º: 4), que presentan las secuencias de ácido nucleico mostradas en las SEC ID n.º: 3 y 4,
respectivamente. Se recuperó el fragmento de ADN, se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII, y se ligó con un plásmido pTrc99A previamente digerido con las mismas enzimas de restricción para producir un plásmido pTrc99A-BsdapA. El plásmido pTrc99A-BsdapA comprendía una secuencia de ácido nucleico con la SEC ID n.º: 1. La secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos con la SEC ID n.º: 2.
Ejemplo 2. Construcción del plásmido pTrc99A-BsdapAH119Y
Se construyó el plásmido pTrc99A-BsdapAH119Y para que comprendiese un gen dapA variante H119Y de B. subtilis. Se introdujo la mutación utilizando el plásmido pTrc99A-BsdapA como plantilla de PCR y amplificando con un par de cebadores bsdapa119muts (SEC ID n.º: 5) y bsdapa119mutas (SEC ID n.º: 6). A continuación se muestran las secuencias de ácido nucleico SEC ID n.º: 5 y 6:
SEC ID n.: 5 (bsdapa119muts)
SEC ID n.: 6 (bsdapa119mutas)
Los sitios de mutación de los cebadores se indican con caracteres en negrita y cursiva.
Se transformaron células competentes de E. coli DH5α con un parte del producto de la PCR digerida con DpnI. Se extrajo el plásmido a partir de transformantes y se digirió con la enzima de restricción DraI para identificar el plásmido mutante pretendido pTrc99A-BsdapAH 119Y, que comprendía una secuencia de ácido nucleico que presentaba dos mutaciones de G a T en el nucleótido 355 y de T a C en el nucleótido 360 de la SEC ID n.º: 1 La secuencia del ácido nucleico codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende una mutación de histidina a tirosina en el aminoácido 119 de la SEC ID n.º: 2.
Ejemplo 3. E. coli recombinante que comprende el gen dapA natural de B. subtilis
Se preparó una E. coli recombinante que comprendía un gen dapA natural de B. subtilis (LDC051) a partir de una cepa bacteriana DC037 de E. coli, que se recibió de Global Bio-Chem Technology Group Company Limited. La DC037 presentaba dos plásmidos distintos, comprendiendo cada uno un gen dapA mutante de E. coli y un gen de resistencia a la tetraciclina o a la kanamicina. Se eliminaron dichos dos plásmidos y se sustituyeron con los plásmidos pDCtetBSdapA y pDCkanBSdapA, comprendiendo cada uno un gen BsdapA y un gen de resistencia a la tetraciclina o a la kanamicina como se especificará posteriormente.
Se construyó un plásmido pDCtetBSdapA que contenía un gen BsdapA y un gen de resistencia a la tetraciclina. Se obtuvo el BsdapA a partir de pTrc99A-BsdapA utilizando un par de cebadores, ptrcBSdapAl-F y ptrcBSdapA1-R, que presentaban secuencias de ácidos nucleicos tales como se muestran a continuación en las SEC ID n.º: 7 y 8, respectivamente. Se recuperó un fragmento de ADN de 1,6 kb y se digirió con las enzimas de restricción Tth111I y SpeI, y se ligó con el plásmido pDCtetdapA, que se había digerido previamente con las mismas enzimas de restricción, para preparar el plásmido pDCtetBSdapA.
Se construyó un plásmido pDCkanBSdapA que contenía un gen BsdapA y un gen de resistencia a la kanamicina. Se obtuvo el BsdapA a partir de pTrc99A-BsdapA utilizando un par de cebadores, ptrcBSdapA2-F y ptrcBSdapA2-R, que presentaban secuencias de ácidos nucleicos tales como se muestran a continuación en las SEC ID n.º: 9 y 10, respectivamente. Se recuperó un fragmento de ADN de 1,6 kb y se digirió con las enzimas de restricción NotI y PshAI, y se ligó con el plásmido pDCkandapA, que se había digerido previamente con las mismas enzimas de restricción, para preparar plásmido pDCkanBSdapA.
Se preparó la DC045 a partir de la DC037. Se trató la DC037 con 800 μg/ml de EB durante 24 horas, se cribó posteriormente con 5 μg/ml de tetraciclina y 50 μg/ml de kanamicina, respectivamente, para preparar la DC039, en la que se eliminó el pDCkandapA y se mantuvo el pDCtetdapA.
Se obtuvo un fragmento de 2,8 kb amplificando la E. coli W3110 con un par de cebadores, LDCup y f1DN, que presentan las secuencias de ácido nucleico que se muestran a continuación en las SEC ID n.º: 11 y 12, respectivamente. Se subclonó dicho fragmento en el vector pMD18simpleT para obtener el pMD18swtLDC.
Se obtuvo un gen de resistencia a la apramicina de 1,5 kb amplificando el pIJ773 con un par de cebadores, FRT5 y HPA1FRT3, que presentan las secuencias de ácido nucleico que se muestra a continuación en las SEC ID n.º: 13 y 14, respectivamente. Se digirió el pMD18swtLDC con HpaI como vector y se ligó con el fragmento del gen de resistencia a la apramicina de 1,5 kb para obtener el pMD18swtLDC-apra. Se aisló un fragmento de 4,5 kb digiriendo el pMD18swtLDC-apra con PvuII y se utilizó como fragmento recombinante para transformar la DC039 (pIJ790) y obtener la DC043, en la que se sustituyó el LDC natural por el LDC truncado del genoma de la DC039. Se obtuvo la
DC045 que contenía el LDC natural y el plásmido pDCtetdapA tras eliminar el gen de resistencia a la apramicina del genoma de la DC043 con la ayuda del plásmido pCP20.
A continuación, se construyó el pDCamBSdapA para rechazar el plásmido pDCtetdapA de la DC045.
5 Se extrajo y se digirió el plásmido pIJ773 con las enzimas de restricción EcoRI y ClaI. Se aisló un fragmento de 1,3 kb. Se obtuvo un fragmento de 3,4 kb digiriendo el pDCtetBSdapA con el enzima de restricción PvuII y se ligó posteriormente con el plásmido pMD18simple, que se había digerido previamente con la misma enzima de restricción para construir el pMD18s(BStet). El pMD18s(BStet) se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y ClaI
10 y se obtuvo un fragmento de 4,5 kb que se utilizó como vector. El fragmento de 1,3 kb obtenido a partir del pIJ773 se ligó con el fragmento vector de 4,5 kb. Se transformaron las células competentes DH5α con la mezcla de ligación y se hicieron proliferar en placas que contenían ampicilina / apramicina. Se extrajo el ADN del plásmido de las bacterias transformadas y se digirió con la enzima de restricción PvuII, obteniéndose un fragmento de 3,5 kb como un fragmento recombinante de brazo largo.
15 La BW25113 (pIJ790) transformada con pDCtetBSdapA se transformó además con el fragmento recombinante de brazo largo. Se extrajo el plásmido recombinante pDCamBSdapA de las bacterias transformadas y se utilizó para transformar la DC045. La DC045 transformada contenía dos plásmidos, pDCtetdapA y pDCamBSdapA. Gracias al rechazo de dos orígenes de duplicación, se obtuvo una DC049-1 en la que se retiró el pDCtetdapA y se mantuvo el
20 pDCamBSdapA. Se obtuvo la DC051 tras transformar la DC049-1 con pDCtetBSdapA y pDCkanBSdapA.
El 26 de febrero de 2009 se depositaron las bacterias de la cepa DC051 en el Centro General de Recogida de Cultivos Microbiológicos de China (CGMCC), según Tratado de Budapest, y se les dio el número de registro CGMCC n.º 2923.
25 La DC073, que presenta el vector de expresión pTrc99A, se preparó de un modo similar a un control. A diferencia de la LDC051, la DC073 no comprende pBsdapA.
A continuación se muestran las secuencias de ácido nucleico SEC ID n.º: 7 a 14: 30
SEC ID n.: 7 (ptrcBSdapA1-F)
GGACACTGTCTAATGTGAGTTAGCGCG
SEC ID n.: 8 (ptrcBSdapA1-R)
CACTAGTATTGAAGCATTTATCAGGGT
SEC ID n.: 9
GCGGCCGCTGTGCAGGTC
SEC ID n.: 10
GACCACTGTCAGGGTTATTGTCTCAT
SEC ID n.: 11 (LDCup)
ATGAACATCATTGCCATTATGGG
SEC ID n.: 12 (f1DN)
TTACTGCTCATACAGTTCCAACG
SEC ID n.: 13 (FRT5)
ATTCCGGGGATCCGTCGACC
SEC ID n.º: 14 (HPA1FRT3)
Se hicieron proliferar DC051 y DC073 en un medio de cultivo con ampicilina a 37 °C durante 3 días y produjeron 150 35 y 20 gramos por litro, respectivamente, de L-lisina en el medio.
Ejemplo 4. E. coli recombinante que comprende el gen dapA variante H119Y de B. subtilis
Se preparó una E. coli recombinante que comprendía un gen dapA variante H119Y de B. subtilis (DC231) utilizando
40 el procedimiento descrito en el ejemplo 3, con la excepción de que se utilizó el plásmido pTrc99A-BsdapAH119Y para sustituir el plásmido pTrc99A-BsdapA. Se obtuvo la DC231 tras transformar la DC049-1 con pDCkanBSdapAH119Y y pDCtetBSdapAH119Y.
El 26 de febrero de 2009 se depositaron las bacterias de la cepa DC231 en el Centro General de Recogida de 45 Cultivos Microbiológicos de China (CGMCC), según Tratado de Budapest, y se les dio el número de registro CGMCC n.º 2924.
Se hizo proliferar la DC231 en un medio de cultivo utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 3. Se produjeron 180 gramos por litro de L-lisina en el medio. 50
LISTADO DE LA SECUENCIA
<110> Global Bio-Chem Technology Group Company Limited. Yang, Sheng Huang, He
5 Wang, Dehui
<120> MICROORGANISMO RECOMBINANTE Y PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR L-LISINA
<130> CP1090198P 10
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<151> 2008-03-03
<160> 14 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7016 20 <212> ADN
<213>Bacillus subtilis
<220>
<221> gen 25 <222> (5665).. (6537)
<223> gen dapA
<400> 1
5 <210> 2
<211> 290
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
10 <400> 2
25 30
<210> 3 <211> 21 <212> A DN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético
35
<220> <221> Dudoso <222> (1)..(21) <223> Cebador DapA-F
40
<400> 3 cggcgatcgt ttctgttggc a 21
45
<210> 4 <211> 21 <212> A DN <213> Secuencia artificial
50
<220> <223> Oligonucleótido sintético
55
<220> <221> Dudoso <222> (1).. (21) <223> Cebador DapA-R
<400> 4 atctgggcca tatcacgcgc t
21
60
<210> 5 <211> 45 <212> A DN <213> Secuencia artificial
65
<220> <223> Oligonucleótido sintético
5
<220> <221> Dudoso <222> (1) .. (45) <223> Cebador bsdapa119muts
10
<400> 5 tcaagaagga atgtaccagt atttcaaagc aattgcggca gagac 45
15
<210> 6 <211> 45 <212> A DN <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> Oligonucleótido sintético
25
<220> <221> Dudoso <222> (1).. (45) <223> Cebador bsdapa119mutas
<400> 6 gtctctgccg caattgcttt gaaatactgg tacattcctt cttga
45
30
<210> 7 <211> 27 <212> A DN <213> Secuencia artificial
35
<220> <223> Oligonucleótido sintético
40
<220> <221> Dudoso <222> (1) .. (27) <223> Cebador ptrcBSdapA1-F
45
<400> 7 ggacactgtc taatgtgagt tagcgcg 27
50
<210> 8 <211> 27 <212> A DN <213> Secuencia artificial
55
<220> <223> Oligonucleótido sintético
60
<220> <221> Dudoso <222> (1).. (27) <223> Cebador ptrcBSdapA1-R
<400> 8 cactagtatt gaagcattta tcagggt
27
65
5
<210> 9 <211> 18 <212> A DN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido sintético
10
<220> <221> Dudoso <222> (1).. (18) <223> Cebador ptrcBSdapA2-F
15
<400> 9 gcggccgctg tgcaggtc 18
20
<210> 10 <211> 26 <212> A DN <213> Secuencia artificial
25 30
<220> <223> Oligonucleótido sintético <220> <221> Dudoso <222> (1)..(26) <223> Cebador ptrcBSdapA2-R <400> 10 gaccactgtc agggttattg tctcat 26
35
<210> 11 <211> 23 <212> A DN <213> Secuencia artificial
40
<220> <223> Oligonucleótido sintético
45
<220> <221> Dudoso <222> (1).. (23) <223> Cebador LDCup
<400> 11 atgaacatca ttgccattat ggg
23
50
<210> 12 <211> 23 <212> A DN <213> Secuencia artificial
55
<220> <223> Oligonucleótido sintético
60
<220> <221> Dudoso
65
<222> (1).. (23) <223> Cebador f1DN
5
<400> 12 Ttactgctca tacagttcca acg 23
10
<210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Oligonucleótido sintético
15
<220> <221> Dudoso <222> (1)..(20) <223> Cebador FRT5
20
<400> 13 attccgggga tccgtcgacc
20
25
<210> 14 <211> 59 <212> ADN <213> Secuencia artificial
30 35
<220> <223> Oligonucleótido sintético <220> <221> Dudoso <222> (1).. (59) <223> Cebador HPA1FRT3 <400> 14 Aacagcacgt tactcgcccg gaagccgctc tggcaagtta tgtaggctgg agctgcttc 59

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1. ADN recombinante replicable de un modo autónomo en una bacteria Escherichia coli, en el que el ADN recombinante comprende un gen dapA de B. subtilis y en el que el gen dapA presenta una secuencia de
    5 nucleótidos que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos por lo menos idéntica en un 90 % a la SEC ID n.º: 2, y en el que se sustituye el aminoácido histidina de la posición 119 con tirosina, presentando dicha proteína actividad de dihidrodipicolinatosintasa (DDPS).
  2. 2. ADN recombinante según la reivindicación 1, en el que el gen dapA presenta una secuencia de nucleótidos que
    10 codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos de SEC ID n.º: 2, y en el que se sustituye el aminoácido histidina de la posición 119 con tirosina.
  3. 3. Bacteria Escherichia coli que puede producir L-lisina y que comprende un gen dapA de B. subtilis, en el que el gen dapA presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos
    15 por lo menos idéntica en un 90 % a la SEC ID n.º: 2, y en el que se sustituye el aminoácido histidina de la posición 119 con tirosina, presentando dicha proteína actividad de dihidrodipicolinatosintasa (DDPS).
  4. 4. Bacteria según la reivindicación 3, en el que el gen dapA presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una
    proteína con una secuencia de aminoácidos de SEC ID n.º: 2, y en el que se sustituye el aminoácido histidina de 20 la posición 119 con tirosina.
  5. 5. Bacteria que presenta el número de registro CGMCC n.º 2923 depositada en el Centro General de Recogida de Cultivos Microbiológicos de China.
    25 6. Bacteria que presenta el número de registro CGMCC n.º 2924 depositada en el Centro General de Recogida de Cultivos Microbiológicos de China.
  6. 7. Bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en la que la bacteria produce por lo menos 50 gramos
    por litro de L-lisina en un medio de cultivo. 30
  7. 8. Procedimiento para producir L-lisina que comprende hacer proliferar la bacteria Escherichia coli que comprende un gen dapA de B. subtilis en un medio de cultivo y en el que el gen dapA presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos por lo menos idéntica en un 90 % a la SEC ID n.º: 2, y en el que se sustituye el aminoácido histidina de la posición 119 con tirosina, presentando dicha proteína
    35 actividad de dihidrodipicolinatosintasa (DDPS), y extraer L-lisina del medio de cultivo.
  8. 9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el gen dapA presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos de SEC ID n.º: 2, y en el que se sustituye el aminoácido histidina de la posición 119 con tirosina.
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