ES2511742T3 - Mejora de ensayos de fijación mediante análisis multiepitópico y determinación combinada de antígeno y anticuerpo - Google Patents

Mejora de ensayos de fijación mediante análisis multiepitópico y determinación combinada de antígeno y anticuerpo Download PDF

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Abstract

Método para determinar simultáneamente un antígeno y un anticuerpo dirigido específicamente contra este antígeno en una muestra, el cual comprende las siguientes etapas: (a) preparación de una fase sólida sobre la cual, en una primera área de ensayo, se inmoviliza un receptor capaz de fijar el antígeno buscado y en una segunda área de ensayo, apartada de la primera, se inmoviliza un receptor capaz de fijar el anticuerpo buscado, (b) puesta en contacto de la muestra con la fase sólida y un receptor libre, específico del analito, que lleva un grupo generador de señal o que puede unirse a un grupo generador de señal, y (c) detección de la presencia o/y cantidad del antígeno y del anticuerpo por determinación del grupo generador de señal en la fase sólida.

Description

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2. Comparación de un ensayo de anticuerpos anti-HIV en el formato de microspot con los métodos convencionales
5 En este ensayo se midieron muestras llamadas de seroconversión. Estas muestras son tomas sucesivas de diversas personas, cuyo resultado VIH-negativo en suero se convierte en VIH-positivo. Cuanto más sensible es un método, más pronto se puede detectar una señal de anticuerpo específico de VIH. Las muestras se midieron con el método (microspot) y, comparativamente, con un método conocido (Enzymun® de Boehringer Mannheim). Las sustancias específicas de VIH utilizadas para ello eran idénticas en ambos sistemas de ensayo, los cuales, por tanto, solo se 10 diferencian, sobre todo, en el análisis por puntos individuales separados. En la tabla siguiente se representan los índices del valor umbral (índice de valor umbral = señalmuestra–señalfondo/2x señalcontrol negativo) para ambos métodos, comparados además con datos de Western blot:
Panel de seroconversión de la firma BBI*
Día de la toma p24 RT Péptido gp41, 1 Péptido gp41, 2 Western blot Enzymun®
R 2ª toma
2 0,0 0,0 0,0 1,3 negativo 0,5
3ª toma
7 22,2 0,0 0,0 2,4 indiferente 15,4
4ª toma
13 17,4 2,6 4,4 36,4 positivo 36,0
AB 1ª toma
0 0,0 0,0 0,6 0,0 negativo 0,3
2ª toma
28 0,0 0,0 0,4 1,1 negativo 0,7
3ª toma
33 0,0 0,0 5,5 54,4 negativo 24,2
4ª toma
35 0,8 0,2 6,0 33,2 positivo 26,7
5ª toma
37 15,2 5,1 4,6 33,0 positivo 28,9
AD 5ª toma
21 0,0 0,0 0,0 0,0 negativo 0,3
6ª toma
25 0,2 0,0 1,6 3,7 positivo 0,9
7ª toma
28 14,1 0,3 11,1 65,5 positivo 24,5
AG 3ª toma
13 0,0 0,0 0,0 0,0 negativo 0,4
4ª toma
27 0,0 0,0 0,0 1,1 negativo 0,6
5ª toma
34 6,0 5,3 0,0 106,9 positivo 8,1
6ª toma
50 6,1 5,4 0,0 65,4 positivo 3,1
7ª toma
78 1,0 6,8 0,0 23,9 positivo 1,6
8ª toma
163 1,5 5,3 0,0 4,9 positivo 0,6
9ª toma
194 2,3 2,5 0,0 2,8 positivo 0,7
AI 1ª toma
0 0,0 0,0 1,2 0,1 indiferente 0,8
2ª toma
7 0,6 0,5 54,7 44,9 positivo 30,2
3ª toma
11 1,1 0,7 18,8 22,5 positivo 30,2
* Boston Biomedica Inc.
15 Esta comparación demuestra que la repartición en puntos individuales, con sus respectivas concentraciones óptimas de antígenos, mejoraba claramente la sensibilidad en comparación con los ensayos conocidos. De los 5 paneles de seroconversión se diagnosticaron tempranamente 7 tomas como positivas. Esto corresponde, según el panel, a una detección más temprana de la infección por VIH de 3 hasta 7 días. En comparación con el Western blot también se alcanzó un claro aumento de la sensibilidad, con 6 tomas diagnosticadas más pronto.
20
3. Comparación de una determinación combinada del antígeno p24 de VIH y de anticuerpos anti-gp41 y anti-RT en el formato de microspot con los métodos convencionales
Para evaluar la sensibilidad se midieron de nuevo las llamadas muestras de seroconversión. La determinación se
25 realizó con el método (microspot) y los datos obtenidos se compararon con los mejores ensayos anti-VIH entonces disponibles (véanse las fichas técnicas del fabricante de paneles de seroconversión, p.ej. de la firma BBI) o con el ensayo combinado Enzymun® de Boehringer Mannheim (determinación combinada del antígeno p24 y anticuerpos anti-VIH).
30 Para el fomato microspot se emplearon las siguientes áreas de ensayo (preparadas como en el ejemplo 1) (puntos individuales):
- anticuerpo monoclonal anti-p24 A para determinar el antígeno p24 del VIH subtipo B
- anticuerpo monoclonal anti-p24 B para determinar el antígeno p24 del VIH subtipo B y O 35 - péptido gp41 1 para determinar anticuerpos contra gp41
- péptido gp41 2 para determinar anticuerpos contra gp41
- transcriptasa inversa recombinante (RT) para determinar anticuerpos contra RT
Las sustancias específicas de VIH empleadas en el ensayo microspot eran comparables con las utilizadas en el 40 ensayo Enzymun®, de manera que ante todo el método microspot solo se distingue del método Enzymun® por el
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análisis en puntos individuales separados. En la tabla siguiente figuran los índices umbral (véase la determinación del ejemplo 2) de ambos métodos y además están comparados con los ensayos anti-VIH más sensibles conocidos hasta la fecha.
Panel de seroconversión (de la firma BBI**)
AMC <p24> A AMC <p24> B RT péptido gp41 1 péptido gp41 2 Ensayo anti-VIH más sensible Enzymun Kombi
Q 1ª toma
0,0 0,0 0,0 0,0 0,3 negativo 0,30
2ª toma
24,4 48 0,0 0,0 0,0 negativo 0,66
3ª toma
246 435 0,0 0,0 0,0 negativo 3,47
4ª toma
nd nd nd nd nd positivo 2,30
W 6ª toma
0,1 0,0 0,1 0,0 0,1 negativo 0,30
7ª toma
0,5 1,1 0,0 0,0 0,1 negativo 0,32
8ª toma
5,8 14,1 0,1 0,0 0,1 negativo 0,41
9ª toma
529 806 0,0 0,0 0,0 positivo 10,1
Z 2ª toma
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 negativo 0,31
3ª toma
20 25,5 0,1 0,0 0,1 negativo 0,61
4ª toma
226 262 0,0 0,0 0,0 negativo 2,96
5ª toma
0,9 1,1 3,7 82,6 277 positivo 18,0
AD 2ª toma
0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 negativo 0,30
3ª toma
2,5 6,4 0,1 0,0 0,1 negativo 0,33
4ª toma
96,8 200 0,0 0,0 0,0 negativo 1,5
5ª toma
663 832 0,0 0,0 0,0 positivo > 23,3
6ª toma
549 709 0,6 2,7 2,8 positivo > 23,3
AF 3ª toma
0,1 0,6 0,2 0,0 0,2 negativo 0,31
4ª toma
0,4 1,7 0,0 0,0 0,02 negativo 0,30
5ª toma
2,1 4,6 0,02 0,0 0,0 negativo 0,34
6ª toma
31,2 61,6 0,1 2,9 204 positivo 18,0
5 ** BBI Boston Biomedica Inc.
Esta comparación demuestra que la determinación combinada del antígeno p24 y de los anticuerpos de VIH se puede mejorar claramente mediante el formato de ensayo microspot en comparación con los métodos corrientes. El
10 ensayo microspot combinado es varias veces más sensible que el ensayo combinado Enzymun®, en el cual todos los antígenos y anticuerpos se hallan mezclados. En los cinco paneles de seroconversión investigados se detectaron más temprano nueve tomas positivas respecto al ensayo de anticuerpos más sensible e incluso seis tomas positivas respecto al ensayo combinado Enzymun®.
15 4. Determinación combinada del antígeno p24 y de anticuerpos anti-p24 según el principio de valoración por retroceso
Para la determinación combinada del antígeno p24 y de los anticuerpos contra p24 en el mismo sistema matricial se realizó un ensayo de antígeno p24 en el formato sándwich y un ensayo de anticuerpos anti-p24 en el formato de
20 valoración por retroceso.
Se prepararon matrices con los siguientes reactivos específicos de p24 en cada uno de los puntos individuales (véase ejemplo 1):
25 (a) Ensayo de panel con antígenos p24 y anticuerpos anti-p24:
(i) Ensayo de antígenos p24: área de ensayo 1: anticuerpo monoclonal anti-p24 A fragmento fab’, biotinilado (100 µg/ml) área de ensayo 2: anticuerpo monoclonal anti-p24 B fragmento fab’, biotinilado (100 µg/ml)
(ii) Ensayo de anti-p24 según el modelo de valoración por retroceso. 30 área de ensayo 3: antígeno p24 biotinilado (0,3 µg/ml)
(b) Panel comparativo con el ensayo de anticuerpos anti-p24 según el modelo puente: antígeno p24 biotinilado (14 µg/ml)
Para llevar a cabo el ensayo se pipetearon en cada panel 30 µl de muestra diluida 1:1 con tampón de muestra y se
35 incubaron 45 minutos, agitando a una temperatura de 37ºC. Después de aspirar la muestra y lavar con tampón de lavado se añadieron 30 µl de solución reactiva 1 que contenía una mezcla de todos los antígenos de VIH marcados con digoxigenina y los anticuerpos de VIH, y se incubó 10 minutos, agitando a una temperatura de 37ºC. Se usaron los siguientes reactivos específicos de p24:
40 (a) Ensayo de panel con antígenos p24 y anticuerpos anti-p24: ─ anticuerpo monoclonal anti-p24 D fragmento F(ab’)2, biotinilado (500 µg/ml) ─ anticuerpo monoclonal anti-p24 E fragmento F(ab’)2, biotinilado (500 µg/ml)
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(b) Panel comparativo con el ensayo de anticuerpos anti-p24 según el modelo puente: ─ antígeno p24 digoxigenilado (30 ng/ml)
5 Después de aspirar la solución reactiva 1 y lavar con tampón de lavado se añadieron 30 µl de solución reactiva 2 con reactivo de detección (véase ejemplo 1). Este reactivo de detección se incubó 5 minutos agitando a 37ºC y a continuación se aspiró, se lavó y se secó.
El área de ensayo se irradió con un láser de He-Ne de 633 nm de longitud de onda y se midió la fluorescencia a una 10 longitud de onda de 670 nm con un escáner de láser confocal.
Con ambos paneles se midieron 11 muestras negativas de VIH y 19 muestras positivas de VIH: en la tabla siguiente se indican los índices umbral (COI) de ambos formatos de ensayo.
Número de muestra
COI <p24> valoración por retroceso* COI <p24> formato puente**
Control negativo
2412 Cts 93 Cts
Control positivo
1276 Cts 24651 Cts
Muestra negativa 145
1,39 0,3
Muestra negativa 196
1,54 0,2
Muestra negativa 122
1,43 0,1
Muestra negativa 160
1,41 0,2
Muestra negativa 141
1,28 0,2
Muestra negativa 168
1,58 0,2
Muestra negativa 222
1,38 0,2
Muestra negativa 280
1,42 0,2
Muestra negativa 232
1,32 0,2
Muestra negativa 201
1,54 0,3
Muestra negativa 211
1,33 0,2
Muestra positiva 154
0,31 534
Muestra positiva 132
0,47 537
Muestra positiva 130
0,42 547
Muestra positiva 138
0,46 473
Muestra positiva 163
0,47 591
Muestra positiva 176
0,39 505
Muestra positiva 204
0,39 531
Muestra positiva 167
0,39 588
Muestra positiva 221
0,79 351
Muestra positiva 174
0,30 506
Muestra positiva 285
0,43 506
Muestra positiva 150
0,76 422
Muestra positiva 179
0,58 596
Muestra positiva 236
0,55 573
Muestra positiva 337
0,60 491
Muestra positiva 203
0,35 573
Muestra positiva 147
0,72 610
Muestra positiva 285
0,47 584
Muestra positiva 289
0,30 496
*COI = señalmuestra – señalfondo/0,7 x señalcontrol negativo; COI > 1,0 = negativo **COI = señalmuestra – señalfondo/2 x señalcontrol negativo; COI > 1,0 = positivo
15 Tanto las muestras negativas como positivas se pudieron detectar correctamente con el principio de valoración por retroceso. Mediante la combinación libre de interacciones de los ensayos de antígeno p24 y anticuerpos anti-p24 se pudieron detectar tempranamente las muestras de seroconversión y además se incrementó la seguridad en cuanto a detecciones de falsos negativos.
20
5. Mejora de la especificidad del ensayo mediante cálculo de valores umbral específicos de las áreas de ensayo
En los ensayos rutinarios disponibles hasta la fecha se mezclan todos los antígenos y anticuerpos necesarios para la determinación y se establece un valor umbral óptimo para esta mezcla. Este límite está marcado por la fijación 25 inespecífica de la “peor” sustancia empleada. En cambio, con la tecnología microspot de la presente invención se puede calcular un valor umbral específico del área de ensayo y para cada sustancia empleada.
Con idéntico cálculo del valor umbral para cada área de ensayo (COI = señalmuestra – señalfondo/2 x señalcontrol negativo) y con el ensayo de VIH combinado (ejemplo 3) se pudo alcanzar la siguiente especificidad en 1264 muestras:
11
imagen8

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
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