ES2521515T3

ES2521515T3 - Compuestos cíclicos peptidomiméticos con giro beta para tratar el ojo seco

Info

Publication number: ES2521515T3
Application number: ES09726969.0T
Authority: ES
Inventors: Garth Cumberlidge; Karen Meerovitch; Teresa Lama; Uri H. Saragovi
Original assignee: Mimetogen Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Mimetogen Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2008-04-04
Filing date: 2009-04-03
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2029-04-03
Also published as: CA2720141A1; JP5480242B2; US8293713B2; US9156882B2; AU2009232352B2; EP2271337B1; US9707267B2; EP2271337A1; US8748391B2; CN102046166B; US20120322747A1; US20110105410A1; KR101565185B1; CA2720141C; KR20110010712A; JP5870348B2; WO2009123761A1; JP2011516477A; HK1152898A1; JP2014080447A

Abstract

Compuesto cíclico peptidomimético con giro ß para uso en el tratamiento del ojo seco en un sujeto con necesidad del mismo, en el que dicho compuesto cíclico peptidomimético con giro ß se representa con la Fórmula estructural (I):**Fórmula** en la que R1 y R3 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C1 a C6, arilo, o un sustituyente de una cadena lateral de uno de los veinte aminoácidos proteicos; R2 y R4 son independientemente hidrógeno o alquilo; o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo; o R3 y R4 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo; R5 y R6 son hidrógeno o alquilo C1 a CR; Y es hidrógeno o uno o dos sustituyentes aromáticos; X se selecciona entre O, N, S, P, Se, C, alquileno de 1 a 6 átomos de carbono, SO, SO2 o NH; n es 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y CONECTOR seleccionado entre el grupo que consiste en: NH2, OH, SH, COOH, CH3CO, CHO, y NHCH2- COOH.

Description

Compuestos cíclicos peptidomiméticos con giro beta para tratar el ojo seco

Solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 61/208.873, presentada el 27 de febrero de 2009 y la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 61/123.036, presentada el 4 de abril de 2008.

Antecedentes de la invención

El ojo seco, también conocido como queratoconjuntivitis sica, es una enfermedad multifactorial de las lágrimas y de la superficie ocular que da como resultado síntomas de incomodidad, alteración visual, e inestabilidad de la película lagrimal con daño potencial para la superficie ocular. Va acompañado por un aumento de la osmolaridad de la película lagrimal e inflamación de la superficie ocular (The Ocular Surface, "The Definition and Classification of Dry Eye Disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop (2007) ", 5 (2): 75-92 (2007)). El ojo seco se reconoce como una alteración de la unidad funcional lagrimal, un sistema integrado que comprende las glándulas lagrimales, superficie ocular (córnea, conjuntiva y glándulas de Meibomio) y los párpados, y los nervios sensoriales y motores que los conectan. La unidad funcional lagrimal controla los principales componentes de la película lagrimal de una forma regulada y responde a influencias medioambientales, endocrinológicas, y corticales. La función de la unidad es conservar la integridad de la película lagrimal, la transparencia de la córnea, y la calidad de la imagen proyectada sobre la retina. La enfermedad o el daño en cualquier componente de la unidad funcional lagrimal (los nervios sensoriales aferentes, los nervios autonómicos y motores eferentes y las glándulas de secreción de lágrimas) pueden desestabilizar la película lagrimal y conducir a enfermedad de la superficie ocular que se expresa por sí misma como ojo seco.

Las principales clases de ojo seco son ojo seco deficiente en secreción de lágrimas acuosas (ADDE) y ojo seco evaporativo (EDE). El ADDE se debe a una insuficiencia de secreción de lágrimas por el lagrimal y esta clase se puede subdividir adicionalmente en ojo seco por síndrome de Sjögren (las glándulas lagrimales y salivares se dirigen mediante un proceso autoinmune, por ejemplo, artritis reumatoide) y ojo seco no por síndrome de Sjögren (disfunción lagrimal, pero se excluyen las características autoinmunes sistémicas del síndrome de Sjögren, por ejemplo, ojo seco relacionado con la edad). El EDE se debe a una pérdida excesiva de agua desde la superficie ocular expuesta en presencia de función secretora lagrimal normal. Sus causas pueden ser intrínsecas (debido a enfermedad intrínseca que afecta a las estructuras o a la dinámica del párpado, por ejemplo, disfunción de las glándulas de Meibomio) o extrínseca (cuando la enfermedad de la superficie ocular se produce debido a alguna exposición extrínseca, por ejemplo, deficiencia de vitamina A) (Véase The Ocular Surface, "The Definition and Classification of Dry Eye Disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop (2007)," 5 (2): 75-92 (2007)).

El Ojo Seco es uno de los problemas oculares más comunes con un predominio estimado de 4,91 millones de personas en los Estados Unidos que afecta aproximadamente 3,23 millones de mujeres y 1,68 millones de hombres de aproximadamente cincuenta años de edad (The Ocular Surface, "The Epidemiology of Dry Eye Disease," 5 (2): 93-107 (2007)). Las terapias actuales para el ojo seco son paliativas con un enfoque en la sustitución de lágrimas para reducir los síntomas. Existen formulaciones disponibles de lágrima artificial sin receta médica. Además, un enfoque no farmacológico para mejorar el contenido acuso de la película lagrimal es la oclusión del taponamiento puntual. Sin embargo, la oclusión del taponamiento puntual conlleva el riesgo de producción reducida de lágrimas, eliminación y sensación en la superficie ocular. Aunque estas terapias paliativas tienen beneficios sobre las terapias a corto plazo, tienen una utilidad limitada en la terapia de control a largo plazo para el ojo seco. RESTASIS® (ciclosporina A) es el primer producto con receta médica para terapia para el ojo seco. RESTASIS® aumenta la producción de lágrimas, en pacientes cuya producción de lágrimas está suprimida como resultado de una inflamación ocular asociada con la enfermedad del ojo seco. Sin embargo, existe una necesidad de terapias que tengan una mayor aplicación que la medicación con antiinflamatorios.

Varios estudios clínicos han encontrado que el NGF mejora la sensibilidad de la córnea en el ojo seco y aumenta el índice de densidad de células caliciformes de conjuntiva en un estudio con perros con ojo seco inducido quirúrgicamente (Bonini, S., et al., "Topical Treatment with Nerve Growth Factor for Neurotrophic Keratitis", Oftalmology, 107: 1347-1352 (2000)). Sin embargo, debido al hecho de que el NGF estimula el crecimiento de neuritas por células neurales, uno de los efectos secundarios de la administración del NGF por vía tópica es el daño ocular (Bonini. S., et al., "Topical Treatment with Nerve Growth Factor for Neurotrophic Keratitis", Oftalmology, 107: 1347-1352 (2000)). Además, el NGF tiene una farmacocinética y biodisponibilidad escasas y los costes de fabricación son elevados. Existe una necesidad en la técnica de métodos alternativos para el tratamiento del ojo seco.

Marco Coassin et al. (Graef. Arch. Clin. Exp. 2005, 243, 151 -155) analizan la eficacia del factor de crecimiento nervioso por vía tópica en perros afectados con ojo seco. Rios J David et al. (Invest Ophth. Vis. Sci. 2007, 48, 1543 1551) analizan el papel de neurotrofinas y receptores de neurotrofinas en secreciones y proliferación de células caliciformes de rata.

Resumen de la invención

La invención proporciona un tratamiento para el ojo seco en un sujeto con necesidad del mismo que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un compuesto cíclico peptidomimético con giro β. El compuesto

10 cíclico peptidomimético con giro β comprende un anillo macrocíclico de13 a 17 átomos de carbono y se representa con la Fórmula estructural (I’):

15 en la que R1 y R3 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C1 a C6, arilo o un sustituyente de la cadena lateral de uno de los veinte aminoácidos proteicos, en cualquier configuración enantiomérica; R2 y R4 son independientemente hidrógeno o alquilo C1 a C6; o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo; o R3 y R4 junto con el átomo de carbono al que

20 están unidos forman un grupo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo; R5 y R6 son hidrógeno o alquilo C1 a C6; Y es hidrógeno o uno o dos sustituyentes aromáticos; X se selecciona entre O, N, S, P, Se, C, alquileno de 1 a 6 átomos de carbono, SO, SO2 o NH; n es 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y CONECTOR es un grupo conector eficaz para formar dímeros del compuesto de fórmula (I) por reacción con un compuesto homo bifuncional. Los grupos CONECTORES adecuados incluyen, pero no se limitan a, NH2, OH, SH, COOH, CH3CO, CHO, y NH-CH2-COOH.

25 En otra realización de la presente invención X es O, S o NH, R1, R3, R5 y R6 son cada uno átomos de hidrógeno y el anillo macrocíclico tiene 14, 15 o 16 átomos en el anillo.

En otra realización, R1 y R3 se derivan de una secuencia de diferentes cadenas laterales de aminoácidos 30 proteinogénicos.

En otra realización de la presente invención, X es O, S o NH.

En una realización en particular, el compuesto cíclico peptidomimético con giro β de Fórmula I se representa con la 35 siguiente Fórmula:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En el presente documento, el compuesto se denomina D3. Se ha demostrado que D3 posee actividad moduladora de Trk.

En otra realización, el compuesto cíclico con giro β se selecciona entre el grupo que consiste en:

y

o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los anteriores. Estos compuestos pueden poseer actividad moduladora de Trk.

En una realización, la invención se refiere al tratamiento del ojo seco en un sujeto con necesidad del mismo que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un compuesto cíclico peptidomimético con giro β representado con la siguiente Fórmula estructural (D3):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otra realización, la invención se refiere al tratamiento del ojo seco en un sujeto con necesidad del mismo que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un compuesto cíclico peptidomimético con giro β representado con la Fórmula 3Aa:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otra realización más, la invención se refiere al tratamiento del ojo seco en un sujeto con necesidad del mismo que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un compuesto cíclico peptidomimético con giro β 15 representado con la Fórmula 3Ak:

5 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una realización, la invención se refiere a un compuesto de uso para estimular la secreción de mucina en un sujeto con necesidad del mismo en la que el compuesto es un compuesto cíclico peptidomimético con giro β tal como se describe en las reivindicaciones.

10 La invención también se refiere al uso de un compuesto que se describe en el presente documento (un compuesto cíclico peptidomimético con giro β de fórmula I) para la preparación de un medicamento para tratar el ojo seco en un sujeto con necesidad de tratamiento.

15 La invención también se refiere a una composición farmacéutica útil para tratar el ojo seco en un sujeto con necesidad de tratamiento. La composición farmacéutica comprende un compuesto que se describe en el presente documento (un compuesto cíclico peptidomimético con giro β de fórmula I) y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de las figuras

Lo mencionado anteriormente será evidente a partir de la siguiente descripción y más en particular de las realizaciones a modo de ejemplo de la invención, tal como se ilustra en las figuras adjuntas en las que los mismos

25 caracteres de referencia se refieren a las mismas partes a través de las diferentes visualizaciones. Las figuras no se presentan necesariamente a escala, poniéndose énfasis en su lugar a las realizaciones que ilustran la presente invención.

En la descripción de las Figuras y los experimentos de apoyo, las identificaciones del compuesto incluyen el prefijo

30 MIM. Las identificaciones del compuesto con el prefijo son las mismas que las identificaciones del compuesto en las que falta el prefijo. Por ejemplo, COMPUESTO D3, D3 y MIM-D3 se refieren al mismo compuesto.

La Figura 1A es el código para las estructuras principales con giro β, enumeradas como 1, 2 y 3, para compuestos moduladores de Trk.

35 La Figura 1B es el código para sustituyentes X de la estructura principal, marcados como A, B, C y D, para compuestos moduladores de Trk.

La Figura 1C es el código para los sustituyentes dipeptídicos R1 y R2 de la estructura principal para compuestos moduladores de Trk.

La Figura 1D ilustra los códigos de letras completos para compuestos cíclicos peptidomiméticos con giro β que incluyen la estructura principal (1, 2 o 3), sustituyentes X (A, B, C o D) y aminoácidos dipeptídicos (R1 y R2).

La Figura 2 es una tabla de datos de cuatro experimentos en células caliciformes de conjuntiva de ratas (Ratas 1-4) sometiendo a ensayo factor de crecimiento nervioso (NGF), carbacol (CCh), compuesto D3, compuesto 3Aa y compuesto 3Ak en dosis de 30 µM (micromolar), 10 µM, 1 µM y 0,3 µM. la tabla muestra el error medio (Med) y típico de la media (ETM).

La Figura 3 es un gráfico de barras de datos de experimentos en células caliciformes de conjuntiva de ratas (Ratas 1-4). El eje Y representa el incremento de la secreción de glicoconjugado por encima del valor basal. El eje X representa factor de crecimiento nervioso (NGF), carbacol (CCh), compuesto D3, compuesto 3Aa y compuesto 3Ak en dosis de 30 µM (micromolar), 10 µM, 1 µM y 0,3 µM.

La Figura 4 es un gráfico de barras de datos de experimentos en células caliciformes de conjuntiva de ratas (Ratas 1-3). El eje Y representa el incremento de la proliferación celular por encima del valor basal. El eje X representa suero bovino fetal (FBS), factor de crecimiento nervioso (NGF) 1 nM, compuesto D3, compuesto 3Aa y compuesto 3Ak en dosis de 30 µM (micromolar), 10 µM, 1 µM y 0,3 µM.

Las Figuras 5A-C muestran la morfología del crecimiento de células caliciformes en cultivo. La Figura 5A muestra que las células adherentes son visibles hacia el día nueve. La Figura 5B muestra que células individuales que se adhieren al pocillo de cultivo de tejidos presentan morfología empedrada y contienen gotitas translúcidas diminutas en vesículas citoplasmáticas. Las flechas abiertas de la Figura 5C muestran que a medida que las células proliferaban en el cultivo, se observaba que se formaban gotitas diminutas en la superficie de las células caliciformes, lo que sugiere un producto de secreción de tipo mucosa. La flecha cerrada de la Figura 5C muestra que a medida que crecían en cultivo estas células que contienen gotitas, las gotitas se unían en grupos.

Las Figuras 6A-C muestran el análisis histoquímico de cultivos primarios de células caliciformes con tinción de Ácido Periódico-Schiff (PAS). La Figura 6A muestra que las células tienen reactividad positiva hacia PAS. La flecha abierta de la Figura 6B muestra que se observaron muchas vesículas perinucleares citoplasmáticas. Las flechas cerradas de las Figuras 6B y 6C muestran que varias de estas vesículas se tiñeron intensamente con PAS lo que indica la presencia de glicoconjugados neutros dentro de gránulos secretores.

La Figura 7 es un gráfico de barras del efecto del 12-miristato-13-acetato de forbol (PMA) (0,1, 1 y 10 nM), NGF (0,1, y 10 nM) y compuesto D3 (2, 10 y 50 µM) en la secreción de glicoconjugado en el incremento sobre el valor basal (± etm). El eje Y representa incremento de la secreción de glicoconjugado sobre el valor basal ((± etm). El eje X representa basal, NGF (0,1, 1 y 10 nM), PMA (0,1, 1 y 10 nM) y compuesto D3 (2, 10 y 50 µM).

La Figura 8 es un gráfico de barras del efecto de NGF (0,01, 0,1, 1 y 10 nM) y compuesto D3 (3, 10, 30 y 100 µM) en la proliferación de células caliciformes. El eje Y representa el incremento de la proliferación celular sobre el valor basal (± DT). El eje X representa FBS, NGF (0,01, 0,1, 1 y 10 nM), y compuesto D3 (3, 10, 30, y 100 µM).

La Figura 9 muestra una transferencia de western del efecto del PMA (100 nM), NGF (1 nM y 10 nM) y compuesto D3 (10 µM y 50 µM) en la actividad de proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK).

La Figura 10 es un gráfico de barras de la cuantificación de la activación de MAPK con respecto a la proteína actina total para la medida basal, PMA (100 nM), NGF (1 nM y 10 nM) y compuesto D3 (10 µM y 50 µM). El eje Y representa el incremento de la activación de MAPK (± etm). El eje X representa la medida basal, PMA (100 nM), NGF (1 y 10 nM) y compuesto D3 (10 y 50 µM).

La Figura 11 es un gráfico de barras de las puntuaciones de tinción corneal con fluoresceína (puntuación (± etm) a partir de ratas de control negativo (sin tratar; n = 6 ratas), modelo de ratas con ojo seco inducido por escopolamina sistémica continuamente durante catorce días (escopolamina; n = 5 ratas), modelo de ratas con ojo seco tratadas con solución salina una vez por vía tópica en el día ocho (escopolamina + solución salina; n = 6 ratas), y modelo de ratas con ojo seco tratadas una vez por vía tópica en el día ocho con 50 ug de compuesto D3 al 1 % (escopolamina + compuesto D3 al 1 %; n = 7 ratas) en el día 14 después de la implantación de escopolamina.

La Figura 12 es un gráfico de puntuaciones de producción de lágrimas (ensayo de Schirmer) (mum ± etm) (eje Y) a partir de ratas de control negativo (sin tratar; n = 6 ratas), modelo de ratas con ojo seco inducido por escopolamina sistémica continuamente durante catorce días (escopolamina; n = 5 ratas), modelo de ratas con ojo seco tratadas una vez por vía tópica en el día ocho con solución salina (escopolamina + solución salina; n = 6 ratas), y modelo de ratas con ojo seco tratadas una vez por vía tópica en el día ocho con 50 ug de compuesto D3 al 1 % (escopolamina + compuesto D3 al 1 %; n = 7 ratas) en un número de días después de la implantación de escopolamina (eje X).

La Figura 13 es un gráfico de puntuaciones de eliminación de fluoresceína de las lágrimas (FU/mm ± etm) (eje Y) a partir de ratas de control negativo (sin tratar; n = 6 ratas), modelo de ratas con ojo seco inducido por escopolamina sistémica continuamente durante catorce días (escopolamina; n = 5 ratas), modelo de ratas con ojo seco tratadas una vez por vía tópica en el día ocho con solución salina (escopolamina + solución salina; n = 6 ratas), y modelo de ratas con ojo seco tratadas una vez por vía tópica en el día ocho con 50 ug de compuesto D3 al 1 % (escopolamina + compuesto D3 al 1 %; n = 7 ratas) en un número de días después de la implantación de

escopolamina (eje X).

La Figura 14 es un gráfico de barras que muestra la concentración de mucina antes y después de la administración tópica de compuesto D3 y tratamiento con NGF en ratas normales. El eje Y representa la concentración de mucina (ng/µl ± etm). El eje X representa solución salina y compuesto D3 (0.4, 1,0 y 2,5 %) y NGF.

La Figura 15 es un gráfico de barras que muestra el cambio de la concentración de mucina a partir de la medida inicial después de la administración tópica del compuesto D3 y tratamiento con NGF en ratas normales. El eje Y representa el cambio de la concentración de mucina (ng/µl ± etm). El eje X representa solución salina y compuesto D3 (0,4, 1,0 y 2,5 %) y NGF.

La Figura 16 es un gráfico del diseño del estudio y programación de las evaluaciones del punto final del Ejemplo

3. La Figura 17A es un gráfico de barras del tiempo de ruptura lagrimal (TBUT) (seg, media ± etm) en ratas sin tratamiento previo e implantadas con escopolamina tratadas con solución salina, NGF al 0,00053 % y compuesto D3 al 2,5 %, al 1,0 % y al 0,4 % (que corresponde al compuesto D3 a 25 mg/ml, 10 mg/ml y 4 mg/ml, respectivamente) en el día 13, día 21 y día 28. El eje Y representa TBUT (seg, media ± etm). El eje X representa ratas sin tratamiento previo e implantadas con escopolamina tratadas con solución salina, NGF al 0,00053 % y compuesto D3 al 2,5 %, al 1,0 % y al 0,4 % en el día 13, día 21 y día 28.

La Figura 17B es una representación del tiempo de ruptura lagrimal (TBUT) (seg ± etm) (eje Y) en ratas sin tratamiento previo e implantadas con escopolamina tratadas con solución salina, compuesto D3 al 0,4 %, 1,0 %, 2,5 %, y NGF al 0,00053 % en un número de días después de la implantación de escopolamina (eje X).

La Figura 18A es un gráfico de barras de tinción corneal (media ± etm) en ratas sin tratamiento previo e implantadas con escopolamina tratadas con solución salina, NGF al 0,00053 % y compuesto D3 al 2,5 %, 1,0 % y 0,4 % (que corresponde al compuesto D3 a 25 mg/ml, 10 mg/ml y 4 mg/ml, respectivamente) en el día 13, día 21 y día 28. El eje Y representa tinción corneal (CS) (seg, media ± etm). El eje X representa ratas sin tratamiento previo e implantadas con escopolamina tratadas con solución salina, NGF al 0,00053 % y compuesto D3 al 2,5 %, al 1,0%yal 0,4%en el día13, día21y día28.

La Figura 18B es una representación de tinción corneal (puntuación ± etm) (eje Y) en ratas sin tratamiento previo e implantadas con escopolamina tratadas con solución salina, compuesto D3 al 0,4 %, 1,0 %, 2,5 %, y NGF al 0,00053 % en un número de días después de la implantación de escopolamina (eje X).

La Figura 19A es un gráfico de barras de producción de mucina (ng/µl ± etm) en ratas sin tratamiento previo e implantadas con escopolamina tratadas con solución salina, NGF al 0,00053 % y compuesto D3 al 2,5 %, 1,0 % y al 0,4 % (que corresponde con el compuesto D3 a 25 mg/ml, 10 mg/ml y 4 mg/ml, respectivamente) en el día 12, día 19 y día 28. El eje Y representa producción de mucina (ng/ µl ± etm). El eje X representa ratas sin tratamiento previo e implantadas con escopolamina tratadas con solución salina, NGF al 0,00053 % y compuesto D3 al 2,5%, al 1,0%y al 0,4% en el día 13, día21ydía 28.

La Figura 19B es una representación de la producción de mucina (ng/ µl ± etm) (eje Y) en ratas sin tratamiento previo e implantadas con escopolamina tratadas con solución salina, compuesto D3 al 0,4 %, 1,0 %, 2,5 %, y NGF al 0,00053 % en un número de días después de la implantación de escopolamina (eje X).

Las Figuras 20A-C muestran gráficos de barras con el efecto del compuesto D3 en medidas seleccionadas del punto final. La Figura 20A muestra el cambio en TBUT (seg) para el grupo sin tratar, grupo con solución salina y el grupo tratado con el compuesto D3 al 1 % en el Día 28 frente al Día 13. La Figura 20B muestra el cambio en la tinción corneal (Puntuación) para el grupo sin tratar, grupo con solución salina y el grupo tratado con el compuesto D3 al 1 % en el Día 28 frente al Día 13. La Figura 20C muestra el cambio en la producción de mucina (ng/ µl) para el grupo sin tratar, grupo con solución salina y el grupo tratado con el compuesto D3 al 1 % a en el Día 28 frente al Día 13.

Las Figuras 21A-C muestran representaciones del efecto del compuesto D3 al 1 % en medidas seleccionadas del punto final. La Figura 21A muestra el cambio en TBUT (seg ± etm) (eje Y) para el grupo con solución salina y el grupo tratado con el compuesto D3 al 1 % en un número de días después de la implantación de escopolamina (eje X). La Figura 21B muestra el cambio en la tinción corneal (Puntuación ± etm) (eje Y) para el grupo con solución salina y el grupo tratado con el compuesto D3 al 1 % en un número de días después de la implantación de escopolamina (eje X). La Figura 21C muestra el cambio en la producción de mucina (ng/ul ± etm) (eje Y) para el grupo con solución salina y el grupo tratado con el compuesto D3 al 1 % en un número de días después de la implantación de escopolamina (eje X).

La Figura 22 es una representación de la producción de lágrimas (mm ± etm) (eje Y) en ratas sin tratamiento previo e implantadas con escopolamina tratadas con solución salina, compuesto D3 al 0,4 %, 1,0 %, 2,5 %, y NGF al 0,00053 % en un número de días después de la implantación de escopolamina (eje X).

La Figura 23 es una representación de la eliminación de fluoresceína de las lágrimas (Log FU/mm ± etm) en ratas sin tratamiento previo e implantadas con escopolamina tratadas con solución salina, compuesto D3 al 0,4 %, 1,0 %, 2,5 %, y NGF al 0,00053 % en un número de días después de la implantación de escopolamina (eje X).

La Figura 24 es un gráfico del peso corporal (g ± etm) (eje Y) para ratas de control sin tratar sin tratamiento previo, tratas implantadas con escopolamina tratadas con solución salina, compuesto D3 al 0,4 %, 1,0 %, 2,5 %, y NGF al 0,00053 % en un número de días después de la implantación de escopolamina (eje X).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al tratamiento del ojo seco en un sujeto con necesidad del mismo que comprende administrar a dicho sujeto un compuesto cíclico peptidomimético con giro β. Tal como se usa en el presente 10 documento, un "compuesto cíclico peptidomimético con giro β" se refiere a compuestos cíclicos, que imitan la región con giro β de ligandos de receptores de neurotrofina (por ejemplo, NGF, NT-3, NT-4 y BDNF). En una realización en particular, el compuesto cíclico peptidomimético con giro β de la presente invención puede ser un modulador del receptor de neurotrofina de tirosina quinasa (Trk). En otra realización en particular, el compuesto cíclico peptidomimético con giro β puede ser un modulador del receptor p75. En otra realización más, el compuesto cíclico

15 peptidomimético con giro β puede ser tanto un modulador del receptor p75 como un modulador del receptor Trk.

El compuesto cíclico peptidomimético con giro β se representa con la Fórmula estructural I. En una realización en particular, el compuesto cíclico peptidomimético con giro β es el compuesto D3 o derivados del compuesto D3.

20 En otra realización, el compuesto cíclico peptidomimético con giro β puede ser un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en: 1Ad, 3Aa, 3Ak, 3Ba, 3Bg, 3Bi, 3Ca, 3Ce, 3Cg, 3Ck, 1Aa, 1Ba, 3Ac y 3Ae

Aunque el compuesto cíclico peptidomimético con giro β de la presente invención puede ser un compuesto modulador del receptor Trk o un modulador del receptor p75, la utilidad del compuesto cíclico peptidomimético con 25 giro β en el tratamiento del ojo seco puede depender de otras actividades tales como la modulación del receptor TrkB o de cualquier otro receptor cuya modulación sea útil para el tratamiento del ojo seco. Además, la utilidad del compuesto cíclico peptidomimético con giro β de la presente invención en el tratamiento del ojo seco puede depender de otras modulaciones de actividades de tipo neurotrofina tales como, por ejemplo, efectos en el reclutamiento quimiotáctico de leucocitos, efectos en la diferenciación de granulocitos, efectos en neutrófilos,

30 mastocitos y eosinófilos, efectos en la proliferación celular del epitelio corneal, y neuropéptidos sensoriales selectivos de regulación positiva, sustancia P y péptidos relacionados con genes de calcitonina.

Tal como se usa en el presente documento un "compuesto modulador del receptor Trk" es un agonista del receptor TrkA, agonista del receptor TrkC, o un compuesto que es tanto un agonista del receptor TrkA como un agonista del 35 receptor TrkC.

Tal como se usa en el presente documento "que modula" o "modulador" se refiere a que agoniza o que antagoniza a un receptor.

40 Tal como se usa en el presente documento un " modulador del receptor p75" es un agonista o antagonista del receptor p75.

RECEPTORES DE NEUROTROFINAS Y NEUROTROFINA

45 Las neurotrofinas (NTF) son una familia de proteínas diméricas que regulan la proliferación, supervivencia, y diferenciación de neuronas en todas las especies de vertebrados. Los NTF incluyen Factor de Crecimiento Nervioso (NGF), Factor Neurotrófico Derivado de Cerebro (BDNF), Neurotrofina-3 (NT-3) y Neurotrofina-4 (NT-4). Estos NTF se unen a dos receptores transmembrana, la familia de receptores de alta afinidad de tirosina quinasa (Trk) (TrkA,

50 Trk B y Trk C) (Kd = 10 -100 pM) y al receptor p75 (Kd = 1 nM). Los ligandos de receptores de la familia de Trk son bastante selectivos (por ejemplo, NGF se une a TrkA, BDNF se une a TrkB; y NT-3 se une principalmente a TrkC).

Se han identificado neurotrofinas y sus receptores en células caliciformes de conjuntiva (CGC) (Rios, J. D., et al., "Role of Neurotrophins and Neurotrophin Receptors in Rat Conjunctival Goblet Cell Secretion and Proliferation,

55 Oftalmology & Visual Science, 48: 1543-1551 (2007)). Las CGC son la fuente principal de mucinas solubles grandes en la película lagrimal. Estas mucinas proporcionan una barrera física y química que protege la córnea y la conjuntiva de agentes exógenos (bacterianos o químicos) y facilita la aparición de una superficie de refracción lisa necesaria para la visión clara.

COMPUESTOS CÍCLICOS PEPTIDOMIMÉTICOS CON GIRO β

El compuesto cíclico peptidomimético con giro β comprende un anillo macrocíclico de 13 a 17 átomos de carbono y se representa con la Fórmula estructural (I):

en la que R1 y R3 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C1 a C6, arilo o sustituyentes de la cadena lateral de uno de los veinte aminoácidos proteicos, en cualquier configuración enantiomérica; R2 y R4 son 10 independientemente hidrógeno o alquilo C1 a C6; o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo; o R3 y R4 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo; R5 y R6 son hidrógeno o alquilo C1 a C6; Y es hidrógeno o uno o dos sustituyentes aromáticos; X se selecciona entre O, N, S, P, Se, C, alquileno de 1 a 6 átomos de carbono, SO, SO2 o NH; n es 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y CONECTOR es un grupo conector eficaz para formar

15 dímeros del compuesto de fórmula (I) por reacción con un compuesto homo bifuncional. Los grupos CONECTORES adecuados incluyen, pero no se limitan a, NH2, OH, SH, COOH, CH3CO, CHO, y NH-CH2-COOH.

Los veinte sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos incluyen las cadenas laterales de alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, 20 glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano, y tirosina. Por ejemplo, la cadena lateral del ácido glutámico es

En otra realización, R1 y R3 se derivan de una secuencia de diferentes cadenas laterales de aminoácidos de 30 proteínas.

En otra realización de la presente invención, X es O, S o NH.

En una realización en particular, el compuesto cíclico peptidomimético con giro β es D3 (véase Maliartchouk et al.,

35 Mol Pharmcol 57 (2): 385-391, 2000, y patente de Estados Unidos Nº 6.881.719), o derivados de D3. Se contempla un número de derivados de D3 y otros compuestos de Fórmula I para uso en los tratamientos de la invención e incluyen modificaciones sencillas como formas biotiniladas y moléculas en las que dos de dichas unidades están unidas por dímeros. Otros derivados de D3 y otros compuestos de Fórmula I incluyen cadenas laterales R1-R6 que

tienen sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos encontrados en los veinte aminoácidos de las proteínas.

Las cadenas laterales habituales de los aminoácidos de las proteínas (por ejemplo, Arg, Trp, His) permiten la formación/diseño de una diversidad de estructuras que son derivados de D3 generados fácilmente y otros compuestos de Fórmula I, y pueden incluir muchos tipos de grupos funcionales.

El sustituyente o sustituyentes Y pueden ser hidrógeno o uno o dos sustituyentes aromáticos por ejemplo nitro, amino, halo, alquilo por ejemplo alquilo de 1 a 6, preferentemente de 1 a 4 átomos de carbono, y arilo por ejemplo fenilo o naftilo. Los sustituyentes Y de alquilo y arilo pueden estar sin sustituir o sustituidos, siendo sustituyentes adecuados nitro y alquilo de 1 a 6 átomos de carbono. Además, Y se puede derivatizar con un grupo funcional, por ejemplo biotina. El grupo X puede ser cualquier átomo nucleófilo tal como O, N, S, P, Se, pero también pueden ser otros tales como C, o puede ser un radical alquileno por lo general de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo metileno; SO, SO2 o NH. El punto de conexión podría ser en la posición orto-o meta-con respecto al carbonilo del benzoílo. Los valores permisibles de "n" son 0, 1, 2, 3, 4, y 5. La cadena lateral de unión que incorpora X es alifática tal como se indica en la estructura (I).

Los grupos alquilo de cadena lateral R1, R2, R3, R4, R5, y R6 pueden variar de muchas formas para potenciar las actividades biológicas de estos compuestos. Por lo general, R1, R2, R3, y R4 son sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos encontrados en los veinte aminoácidos de las proteínas, por ejemplo las cadenas laterales de ácido glutámico, lisina, ornitina y treonina, en cualquier configuración enantiomérica. Si el sustituyente R1 es una cadena lateral de aminoácido, el otro sustituyente en ese carbono, R2, por lo general será hidrógeno, pero también podría ser metilo, etilo o bencilo. Como alternativa, R1 y R2 junto con sus átomos intermedios se pueden unir para dar restos de ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, y ciclohexano. R3 y R4 están relacionados de la misma forma que R1 y R2 tal como se ha descrito anteriormente. Es decir, uno de ellos será una cadena lateral de aminoácidos con el otro de estos dos sustituyentes siendo hidrógeno en la mayoría de los casos, pero también podría ser metilo, etilo, propilo o bencilo. Además, R3 y R4 junto con los átomos intermedios se pueden unir para dar restos de ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, y ciclohexano.

Existe un gran alcance para la variación en R5 y R6, siendo hidrógeno o metilo los sustituyentes más habituales en estas posiciones. Esos sustituyentes también se pueden diseñar para que se correspondan con una de las cadenas laterales de los veinte aminoácidos de las proteínas, en particular, metilo.

Las cadenas laterales que se han encontrado como particularmente favorables para actividades biológicas son R1 y R3 como cadenas laterales de lisina, ácido glutámico, tirosina, iso-leucina, asparagina, y treonina, R2, R4, R5, y R6 como hidrógeno. Una o más de las cadenas laterales se seleccionan especialmente para que se correspondan con cadenas laterales dentro de las regiones de giro del NGF.

En general, los compuestos macrocíclicos tienen anillos de 13 a 16 miembros en los que el sustituyente X es O, N, S, SO, o SO2.

En otra realización, el compuesto cíclico peptidomimético con giro β se selecciona entre el grupo que consiste en: 1Ad, 3Aa, 3Ak, 3Ba, 3Bg, 3Bi, 3Ca, 3Ce, 3Cg, 3Ck, 1Aa, 1Ba, 3Ac y 3Ae.

En otra realización más, el compuesto cíclico peptidomimético con giro β es un compuesto que comprende un armazón cíclico de amino, éter o sulfuro (véase la Figura 1A), con diversos sustituyentes (por ejemplo, amina, guanidina o metilsulfonamida) (véase la Figura IB) y los grupos R1 y R2 que comprenden fragmentos de aminoácidos dipeptídicos (véase la Figura 1C). (Además véase la Figura 1D).

En una realización, la invención se refiere a un compuesto para estimular la secreción de mucina en un sujeto con necesidad del mismo en la que el compuesto es un compuesto cíclico peptidomimético con giro β de fórmula I.

El compuesto de la presente invención está presente en una cantidad eficaz. Tal como se usa en el presente documento, el término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad que, cuando se administra en un régimen de dosificación apropiado, es suficiente para tratar (terapéutica o profilácticamente) el trastorno diana. Por ejemplo, una cantidad eficaz es suficiente para reducir o para mejorar la gravedad, duración o avance del trastorno que se está tratando, prevenir el avance del trastorno que se está tratando, causar la regresión del trastorno que se está tratando, o potenciar o mejorar el efecto o efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia.

Tal como se usa en el presente documento, "ojo seco" es un concepto amplio que pretende incluir ojo seco deficiente en lágrimas acuosas, ojo seco evaporativo, ojo seco asociado con la menopausia, hipolagrimación, alacrimia, xeroftalmia, síndrome de Sjögren, queratoconjuntivitis sicca, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide ocular, blefaritis marginal, insuficiencia del cierre palpebral y parálisis del nervio sensorial, conjuntivitis alérgica asociada con ojo seco, ojo seco por conjuntivitis después de virus, ojo seco por cirugía después de cataratas, ojo seco crónico después de queratomileusis in situ asistida con láser (LASIK), ojo seco asociado a operaciones de VDT y ojo seco asociado al uso de lentes de contacto, ojo seco relacionado con la edad, lesión corneal, infección, síndrome de Riley-Day, alacrimia congénita, trastornos o deficiencias nutricionales (incluyendo vitamina), efectos

secundarios farmacológicos, estrés ocular y destrucción de glándulas y de tejidos, exposición ambiental a niebla mezclada con humo, humo, aire excesivamente seco, partículas en suspensión en el aire, trastornos autoinmunes y otros trastornos inmunodeficientes, y pacientes comatosos que se vuelven incapaces de parpadear. Además, "ojo seco" incluye enfermedades causadas por el ojo seco tales como lesión epitelial queratoconjuntiva, úlceras corneales epiteliales, úlceras corneales (tal como úlceras de la capa del estroma corneal) y enfermedad infecciosa ocular.

Sujeto, tal como se usa en el presente documento, se refiere a animales, tales como mamíferos, que incluyen, pero no se limitan a, primates (por ejemplo, seres humanos), vacas, ovejas, cabras, caballos, cerdos, perros, gatos, conejos, cobayas, ratas, ratones u otras especies bovina, ovina, equina, canina, felina, roedores o murinos. En una realización, el sujeto es un ser humano.

La expresión "que trata" incluye tanto tratamiento terapéutico como tratamiento profiláctico (que reducen la probabilidad de desarrollo). La expresión se refiere a disminuir, suprimir, atenuar, disminuir, detener, o estabilizar el desarrollo o progresión de una enfermedad (por ejemplo, una enfermedad o trastorno que se describen en el presente documento), disminuir la gravedad de la enfermedad o mejorar los síntomas asociados con la enfermedad.

Tal como se usa en el presente documento, el término sal farmacéuticamente aceptable se refiere a una sal de los compuestos administrados preparada a partir de ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables, incluyendo ácidos inorgánicos y ácidos orgánicos de los mismos. Son ejemplos de dichos ácidos inorgánicos clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, sulfúrico, y fosfórico. Los ácidos orgánicos apropiados se pueden seleccionar, por ejemplo, entre clases de ácidos orgánicos alifáticos, aromáticos, carboxílico y sulfónico, ejemplos de los cuales son fórmico, acético, propiónico, succínico, alcanforsulfónico, cítrico, fumárico, glucónico, isetiónico, láctico, málico, múcico, tartárico, para-toluenosulfónico, glicólico, glucurónico, maleico, furoico, glutámico, benzoico, antranílico, salicílico, fenilacético, mandélico, embónico (pamoico), metanosulfónico, etanosulfónico, pantoténico, bencenosulfónico (besilato), esteárico, sulfanílico, algínico, galacturónico, y similares.

La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento del ojo seco en un sujeto con necesidad de tratamiento. La composición farmacéutica comprende uno o más compuestos cíclicos peptidomiméticos con giro β de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden contener ingredientes inertes que no interactúan con las sustancias reguladoras/activas en las composiciones. Se pueden usar técnicas convencionales de formulación farmacéutica, tales como las que se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Los vehículos farmacéuticos adecuados para la administración parenteral incluyen, por ejemplo, agua estéril, solución salina fisiológica, solución salina bacteriostática (solución salina que contiene aproximadamente un 0,9 % en mg/ml de alcohol bencílico), solución salina tamponada con fosfato, solución de Hank, lactato de Ringer, dextrosa, etanol, tensioactivos tales como glicerol, o excipientes.

En una realización más, la composición farmacéutica comprende adicionalmente un agente terapéutico adicional (es decir, uno o más). Un agente terapéutico adicional adecuado para uso en los métodos y composiciones farmacéuticas que se describen en el presente documento, puede ser, pero no se limita, por ejemplo: agentes antiinflamatorios (por ejemplo, RESTASIS® (Allergan)), estimulantes de mucina (por ejemplo, Diquafasol (Inspire Pharmaceuticals) 15-(S)-HETE (Alcon), rebamipida (Otsuka) y ecabet (ISTA)), agentes hormonales y estimulantes de la glándula lagrimal (por ejemplo, lágrimas de andrógenos (Allergan)) y lágrimas artificiales.

MODOS DE ADMINISTRACIÓN

La composición se puede formular para aplicación oftálmica tópica, por ejemplo, en forma de soluciones, pomadas, cremas, lociones, pomadas oculares y, lo más preferentemente, gotas oculares o geles oculares y puede contener los aditivos convencionales apropiados, incluyendo, por ejemplo, conservantes, disolventes para ayudar a la penetración del fármaco, y emolientes en pomadas y cremas. Dichas formulaciones tópicas pueden contener vehículos convencionales compatibles, por ejemplo bases de crema pomada, y etanol o alcohol oleílico para lociones.

Como alternativa, los compuestos activos se pueden aplicar al ojo a través de liposomas. Además, los compuestos activos se pueden infundir en la película lagrimal a través de un sistema de bomba y catéter. Otra realización de la presente invención implica el compuesto activo contenido dentro de un dispositivo de liberación continua o selectiva, por ejemplo, membranas tales como las usadas en el Sistema de pilocarpina (Ocusert™) (Alza Corp., Palo Alto, Calif.). Como una realización adicional, los compuestos activos se pueden contener dentro de, transportar por, o unir a lentes de contacto que se colocan en el ojo. Otra realización de la presente invención implica el compuesto activo contenido dentro de un hisopo o esponja que se puede aplicar a la superficie ocular. Otra realización de la presente invención implica el compuesto activo contenido dentro de una pulverización líquida que se puede aplicar a la superficie ocular. Otra realización de la presente invención implica una inyección del compuesto activo directamente en los tejidos lacrimales o en la superficie ocular.

Cuando la composición farmacéutica de la presente invención para el tratamiento del ojo seco se usa como una solución oftálmica, se proporciona en cualquier forma de dosificación que se usa para solución oftálmica, por ejemplo, una gota ocular acuosa tal como solución oftálmica acuosa, solución oftálmica suspendida acuosa, solución oftálmica viscosa y solución oftálmica solubilizada, o una solución oftálmica no acuosa tal como solución oftálmica no acuosa y solución oftálmica suspendida no acuosa. Entre estas, es preferente la solución oftálmica acuosa.

Cuando la composición farmacéutica de la presente invención para el tratamiento del ojo seco se prepara en una solución oftálmica acuosa, diversos aditivos usados normalmente en la solución oftálmica acuosa se contienen convenientemente en la misma siempre y cuando el objetivo de la presente invención no se vea afectado de forma adversa. Los ejemplos de dichos aditivos incluyen tampones, agentes de isotonicidad, conservantes, solubilizantes (estabilizantes), agentes para el ajuste del pH, espesantes y agentes quelantes.

Los tampones se pueden seleccionar entre el grupo que comprende un tampón de fosfato, un tampón de borato, un tampón de citrato, un tampón de tartrato, un tampón de acetato (por ejemplo, acetato sódico) y un aminoácido.

Los agentes de isotonicidad se pueden seleccionar entre el grupo que comprende azúcares tales como sorbitol, glucosa y manitol, alcoholes polihídricos tales como glicerina, polietilenglicol y polipropilenglicol, y sales tales como cloruro sódico.

Los conservantes se pueden seleccionar entre el grupo que comprende cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, paraoxibenzoatos de alquino tales como paraoxibenzoato de metilo y paraoxibenzoato de etilo, alcohol bencílico, alcohol fenetílico, ácido sódico y sales del mismo, timerosal y clorobutanol.

Los solubilizantes (estabilizantes) se pueden seleccionar entre el grupo que comprende ciclodextrina y derivados de la misma, polímeros solubles en agua tales como poli(vinilpirrolidona), y tensioactivos tales como polisorbato 80 (nombre comercial: Tween 80).

Los agentes para el ajuste del pH se pueden seleccionar entre el grupo que comprende ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, hidróxido sódico, hidróxido potásico e hidróxido de amonio.

Los espesantes se pueden seleccionar entre el grupo que comprende hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y carboximetilcelulosa y sales de los mismos.

Los agentes quelantes se pueden seleccionar entre el grupo que comprende edetato sódico, citrato sódico y fosfato condensado sódico.

Cuando la composición farmacéutica de la presente invención para el tratamiento del ojo seco se prepara en una pomada oftálmica, debe estar presente un compuesto de base. La base de la pomada oftálmica se puede seleccionar entre el grupo que comprende lanolina purificada, VASELINE®, plastibase, parafina líquida y polietilenglicol.

Como alternativa, la composición de la invención se puede formular para administración oral usando excipientes para la formación de comprimidos farmacéuticamente aceptables que incluyen lactosa, celulosa microcristalina, almidón de maíz, ácido esteárico, o similares, que se pueden usar. La administración oral también puede comprender una composición líquida formulada en agua, glicoles, aceites, alcoholes o similares.

COADMINISTRACIÓN

Cuando los métodos de la invención incluyen coadministración, la coadministración se refiere a la administración de una primera cantidad de un compuesto cíclico peptidomimético con giro β o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y una segunda cantidad de al menos un agente seleccionado entre el grupo que consiste en agentes antiinflamatorios (por ejemplo, RESTASIS® (Allergan)), estimulantes de mucina (por ejemplo, Diquafasol (Inspire Pharmaceuticals) 15-(S)-HETE (Alcon), rebamipida (Otsuka) y ecabet (ISTA)), agentes hormonales y estimulantes de las glándulas lacrimales (por ejemplo, lágrimas de andrógenos (Allergan)) y lágrimas artificiales, en los que la primera y segunda cantidades en conjunto comprenden una cantidad eficaz para tratar el ojo seco en un sujeto con necesidad de tratamiento. La coadministración incluyen la administración de la primera y segunda cantidades de los compuestos de la coadministración de una forma básicamente simultánea, tal como en una sola composición farmacéutica, o en múltiples composiciones farmacéuticas. Además, dicha coadministración también incluye el uso de cada compuesto de una forma secuencial en cualquier orden. Cuando la coadministración implica la administración separada de la primera cantidad de compuesto cíclico peptidomimético con giro β o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y una segunda cantidad de al menos un agente seleccionado entre el grupo que consiste en agentes antiinflamatorios (tales como, por ejemplo, RESTASIS® (Allergan)), estimulantes de mucina (tales como, por ejemplo, Diquafasol (Inspire Pharmaceuticals) 15-(S)-HETE (Alcon), rebamipida (Otsuka) y ecabet (ISTA)), agentes hormonales y estimulantes de las glándulas lacrimales (tales como, por ejemplo, lágrimas de andrógenos (Allergan)) y lágrimas artificiales, los compuestos se administran en un período de tiempo lo

suficientemente próximo para conseguir el efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, el periodo de tiempo entre cada administración, que puede dar como resultado el efecto terapéutico deseado, puede variar de minutos a horas y se puede determinar teniendo en cuenta las propiedades de cada compuesto tales como potencia, solubilidad, biodisponibilidad, vida media en plasma y perfil cinético.

DOSIFICACIÓN

Una cantidad eficaz de un compuesto cíclico peptidomimético con giro β dependerá de la edad, sexo y peso del paciente, la afección médica actual del paciente y la naturaleza de la enfermedad de ojo seco que se está tratando. El experto en la materia será capaz de determinar las dosificaciones apropiadas dependiendo de éstos y otros factores. Por ejemplo, cuando la composición farmacéutica de la presente invención se usa como una solución oftálmica para el tratamiento del ojo seco, en un sujeto con necesidad de la misma, es deseable que una gota ocular en solución acuosa contenga un principio activo de un compuesto de la presente invención en una cantidad de aproximadamente un 0,001 a un 2,5 % en (p/v), tal como de un 0,02 a un 2,0 % en (p/v), por ejemplo de aproximadamente de un 0,03 a un 1,5 % en (p/v), por ejemplo de aproximadamente un 0,05 a un 1,0 % en (p/v). Tal como se usa en el presente documento, peso/volumen (p/v) se refiere a la masa específica de soluto en un volumen final específico (por ejemplo, g/ml). Cuando se administran, los compuestos y las composiciones de la presente invención se pueden proporcionar una vez al día o con múltiples dosis diarias tales como dos veces al día, tres veces al día y cuatro veces al día. En una realización particularmente preferente, el compuesto y las composiciones de la presente invención se pueden proporcionar en una dosis de una a cinco gotas, por ejemplo, una gota, dos gotas, tres gotas, cuatro gotas o cinco gotas.

Cuando la composición farmacéutica de la presente invención se usa como una pomada ocular, es deseable que una pomada popular contenga un principio activo de un compuesto de la presente invención en una cantidad de aproximadamente un 0,001 a un 2,5 % en (p/p), tal como de un 0,02 a un 2,0 % en (p/p), por ejemplo de aproximadamente un 0,03 a un 1,5 % en (p/p), por ejemplo de aproximadamente un 0,05 a un 1,0 % en (p/p).Tal como se usa en el presente documento, peso/peso (p/p) se refiere a peso de soluto en peso final de la solución, por ejemplo, g/g. Cuando se administran, los compuestos y las composiciones de la presente invención se pueden proporcionar una vez al día o con múltiples dosis diarias tal como dos veces al día, tres veces al día y cuatro veces al día.

A continuación se proporciona una descripción de realizaciones a modo de ejemplo de la invención.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

EFECTO DE COMPUESTOS CÍCLICOS PEPTIDOMIMÉTICOS CON GIRO β EN LA SECRECIÓN DE GLICOCONJUGADOS A PARTIR DE CÉLULAS CALICIFORMES DE LA CONJUNTIVA DE RATA

ANIMALES:

Se extrajo el tejido de la conjuntiva inferior de rata de ratas Sprague-Dawley Macho (n = 4) que pesaba entre 250 y 300 g.

CULTIVO CELULAR:

Del mismo modo que los procedimientos de cultivo y ensayo celular que se describen en Rios, J. D., et al., "Role of Neurotrophins and Neurotrophin Receptors in Rat Conjunctival Goblet Cell Secretion and Proliferation, Oftalmology & Visual Science, 48: 1543-1551 (2007), se establecieron cultivos de explante a partir de tejido de la conjuntiva inferior de rata. Las células derivadas de los explantes se cultivaron en RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS) y penicilina (100 U/ml)/estreptomicina (100 µg/ml) a 37 ºC en una atmósfera humidificada con CO2 al 5 % durante setenta y dos horas. Las células no caliciformes contaminantes se retiraron mediante su raspado de la placa. Durante este periodo de tiempo, las células caliciformes migraron de las partes y comenzaron a proliferar. Después de una semana, las células caliciformes se tripsinaron y se sembraron en placas de cultivo de veinticuatro pocillos con medios de RPMI-1640 complementados con FBS al 10 %.

MEDIDA DE LA SECRECIÓN DE GLICOCONJUGADOS:

Para medir la secreción de glicoconjugados, las células caliciformes de conjuntiva se cultivaron hasta confluencia y se privaron de suero durante dos horas antes de la adición de factor de crecimiento nervioso (NGF), carbacol (Cch), compuesto D3, compuesto 3Aa y compuesto 3Ak durante dos horas. Los compuestos D3, 3Aa y 3Ak se

administraron a concentraciones de 30 µm (micromolar), 10 µM, 1 µM y 0,3 µM. Además, se incluyó el vehículo usado para disolver los compuestos, dimetilsulfóxido (DMSO). El DMSO se usó como el control basal para la concentración 30 µM del compuesto, que era de un 0,1 % (v/v). El agonista colinérgico carbacol (Cch), añadido a 100 µM (micromolar), era un control positivo para la secreción de glicoconjugado. La cantidad de glicoconjugado segregado en los medios se midió mediante ensayo de lectina unida a enzimas (ELLA). Los medios se recogieron y se analizaron para la cantidad de los glicoconjugados detectables con lectina, incluyendo mucinas. La cantidad de secreción se midió usando la lectina UEA-I que es específica para mucinas de células caliciformes de conjuntiva de rata. La lectina UEA-I biotinilada y la estreptavidina marcada con fosfatasa alcalina se usaron tal como se describe en Rios, J. D., et al., "Role of Neurotrophins and Neurotrophin Receptors in Rat Conjunctival Goblet Cell Secretion and Proliferation, Oftalmology & Visual Science, 48: 1543-1551 (2007). Las células se retiraron y se sonicaron, y el homogenado celular se analizó para la cantidad total de proteína usando el ensayo de proteína de Bradford. Este ensayo reveló que había cantidades iguales de proteína en cada pocillo. La secreción de glicoconjugado se expresó como el incremento (x veces) sobre el basal.

MEDIDA DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR:

Se cultivaron células caliciformes de conjuntiva hasta subconfluencia en placas de cultivo de 24 pocillos y a continuación se privaron de suero durante veinticuatro horas. Las células se incubaron, con o sin concentraciones crecientes de compuesto D3, compuesto 3Aa y compuesto 3Ak en RPMI sin suero complementado con BSA al 0,5 % como la fuente de proteína, durante veinticuatro horas (Figura 4). Los compuestos D3, 3Aa y 3Ak se administraron en concentraciones de 30 µM (micromolar), 10 µM, 1 µM y 0,3 µM. En estudios de proliferación celular, se usó RPMI complementado con FBS al 10 % como el control positivo. La proliferación de CGC se determinó con un ensayo de proliferación de WST-8, no radiactivo colorimétrico, que mide el número de células. Este procedimiento usa la sal monosódica de 2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio (WST-8), que se extiende por mitocondrias viables, en crecimiento para formar un producto de formazán de color azul oscuro que se detecta mediante un lector de fluorescencia de ELISA (Bio-Tek, Winooski, VT) a 460 nm.

PRESENTACIÓN DE DATOS:

Los datos para la secreción y la proliferación de glicoconjugados de CGC se expresaron como el incremento (x veces) sobre el valor basal, que se estandarizó a 1,0. Por ejemplo, para las dosis de 0,3 µM (micromolar), 1 µM y 10 µM, la secreción y la proliferación de glicoconjugado de CGC se expresaron como compuesto de ensayo sobre células sin tratar. Para la dosis de 30 µM, la secreción y la proliferación de glicoconjugado de CGC se expresaron como compuesto de ensayo sobre células sin tratar con DMSO. Los resultados se expresan como la media ± etm.

RESULTADOS:

Los resultados para la secreción de glicoconjugado de CGC se muestran en las Figuras 2 y 3. El NGF aumentó la secreción de glicoconjugado de CGC 1,3 ± 0,1 veces por encima del valor basal. Cch, un agonista conocido de células caliciformes, aumentó la secreción de glicoconjugado de CGC 1,3 ± 0,3 veces por encima del valor basal.

El compuesto D3 aumentó la secreción de glicoconjugado de CGC e indicó una tendencia dependiente de la concentración. El compuesto D3 aumentó la secreción de glicoconjugado de CGC tal como sigue a continuación: 1,7 ± 0,7 veces por encima del valor basal (30 µM), 1,6 ± 0,3 veces por encima del valor basal (10 µM), 1,6 ± 0,2 veces por encima del valor basal (1 µM) y 1,3 ± 0,2 veces por encima del valor basal (0,3 µM).

El compuesto 3Aa aumentó la secreción de glicoconjugado de CGC tal como sigue a continuación: 2,1 ± 0,7 veces por encima del valor basal (30 µM), 1,7 ± 0,4 veces por encima del valor basal (10 µM), 1,6 ± 0,3 veces por encima del valor basal (1 µM), y 2,1 ± 0,3 veces por encima del valor basal (0,3 µM). El compuesto 3Aa mostró un aumento más elevado en la secreción de glicoconjugado de CGC en comparación con NGF y Cch.

El compuesto 3Ak no mostró un efecto tan potente como los compuestos D3 y 3Aa pero demostró actividad. Los resultados para la secreción de glicoconjugado de CGC del compuesto 3Ak son tal como siguen a continuación: 1,1 ± 0,3 veces por encima del valor basal (30 µM), 1,2 ± 0,1 veces por encima del valor basal (10 µM), 1,1 ± 0,3 veces por encima del valor basal (1 µM) y 1,4 ± 0,3 veces por encima del valor basal (0,3 µM).

Los resultados para la proliferación celular se muestran en la Figura 4. En el ensayo de proliferación celular, ninguno de los compuestos en ninguna concentración sometida a ensayo indujo la proliferación de células caliciformes después de 24 horas de incubación. Como controles, el suero bovino fetal al 10 % (FBS) aumentó la proliferación de CGC en 3,4 ± 1,0 veces por encima del valor basal, y el NGF aumentó la proliferación de CGC en 1,6 ± 0,3 veces por encima del valor basal.

Los compuestos cíclicos peptidomiméticos con giro β sometidos a ensayo estimularon la secreción de mucina, y, por

lo tanto, pueden ser útiles en el método para el tratamiento de la enfermedad del ojo seco en un sujeto con necesidad de los mismos.

EJEMPLO 2

EFECTO DEL COMPUESTO D3 EN LA SECRECIÓN, PROLIFERACIÓN Y TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES DE GLICOCONJUGADOS EN CÉLULAS CALICIFORMES DE CONJUNTIVA DE RATA

La finalidad de este estudio era determinar la eficacia del compuesto D3 en la secreción y la proliferación de glicoconjugados de células caliciformes de conjuntiva de rata cultivadas, e investigar la vía de transducción de señales del compuesto D3 usado para estimular la secreción. ANIMALES:

Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley macho de seis a ocho semanas de edad de Charles River (Wilmington, MA). Se alojaron 2 animales por jaula en condiciones de luz constante (ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad), temperatura ambiente (22 ± 1 ºC) y humedad relativa (40-70 %). Todos los procedimientos de este estudio cumplieron con las políticas de bienestar animal de la Universidad McGill y fueron aprobados por el Comité para el Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Investigación Lady Davis (LDI). Los patrones para el cuidado y uso de animales están de acuerdo o superan los definidos en el Canadian Council on Animal Care (CCAC).

AISLAMIENTO DE TEJIDO CONJUNTIVAL:

Los animales se anestesiaron antes de la eutanasia en una cámara con Isofluorano al 99,9 % USB (Abraxis Bioscience, Richmond Hill, Ont). Los animales se sacrificaron mediante una dosis letal de 2 ml/0,4 kg o 300 mg/kg de pentobarbital sódico (Ceva Sante Animale, Libourne, Francia). Se extirpó el tejido de la conjuntiva, más específicamente la membrana nictitante y fórnix y se colocaron en solución salina equilibrada con Hanks" que contenía 3X de penicilina-estreptomicina (300 ug/ml). El fórnix se identificó como la banda que corre a lo largo de la parte más posterior del pie de en la intersección de la conjuntiva bulbar y palpebral. La porción nasal, inferior del fórnix se sujetó y se levantó, y se cortó desde la conjuntiva.

CULTIVO DE CÉLULAS CALICIFORMES DE CONJUNTIVA:

El medio de cultivo RPMI-1640, suero bovino fetal (FBS), penicilina-estreptomicina, y solución salina equilibrada con Hank se obtuvieron en Wisent (St. Bruno, Quebec). L-glutamina y tripsina al 0,05%-EDTA eran de Gibco (Grand Island, NY). Los matraces de cultivo celular y las placas de cultivo eran de Corning (Lowell, MA) y dos portaobjetos para la cámara Laboratory Tek eran de Nunc (Rochester, NY).

El cultivo de células caliciformes de conjuntiva a partir de cultivos de explante fue tal como se ha descrito anteriormente en Shatos, M. et al., "Isolation, Characterization, and Propagation of Rat Conjunctival Goblet Cells In Vitro," IOVS 42: 1455-1464 (2001), cuyo contenido total se incorpora en el presente documento por referencia. El tejido se cortó finalmente y las piezas individuales se fijaron en placas de cultivo de 6 pocillos ranuradas en 0,5 ml de RPMI-1640 completo (complementado con FBS al 10 %, glutamina 2 mM y 100 µg/ml de penicilina-estreptomicina) y se incubaron a 37 ºC en una atmósfera humidificada con CO2 al 5%. Los cultivos de explante se volvían a alimentar cada 2 días. En unos pocos días, las células caliciformes migraron de las piezas y comenzaron a proliferar. Después de aproximadamente una semana, se retiraron las conexiones de tejido y que se permitió que las células caliciformes crecieran hasta confluencia. Las células se pasaron una vez mediante tripsinización de células adherentes con tripsina al 0,05%-EDTA 0,53 mM (pH 7,4), y se sembraron en portaobjetos para cámara Laboratory Tek de 8 pocillos (histoquímica) o en placas de cultivo de 96 pocillos (proliferación), 24 pocillos (secreción), o 6 pocillos (transferencias de western) con medios completos de RPMI-1640.

HISTOQUÍMICA:

Las células se fijaron y se procesaron para la tinción con Ácido Peryódico-Schiff (PAS) y se hizo una contratinción con INICIA solución de Hematoxilina, kit Nº 3 de Gill (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente. En resumen, las células se fijaron durante 15 minutos en metanol. Los portaobjetos se aclararon con agua corriente durante 1 minuto, se tiñeron conSolución de Ácido Peryódico durante 5 minutos, se aclararon 5 veces en agua destilada, se sumergieron en reactivo de Schiff durante 15 minutos, se lavaron en agua corriente durante 5 minutos, se tiñeron en Solución de Hematoxilina durante 90 segundos, se aclararon en agua corriente durante 15-30 segundos, se secaron al aire y se montaron en Vectamount (Vector Labs, Burlingame, CA). Los portaobjetos se examinaron y se fotografiaron con un microscopio DM LB 2 de Leica equipado con una cámara DFC480 de Leica.

ARTÍCULOS DE ENSAYO Y PREPARACIÓN DE SOLUCIONES:

El compuesto D3 (sal de clorhidrato, número de lote 12-95) fabricado por Mimetogen Pharmaceuticals (Montreal,

Quebec, Canadá) se disolvió en solución salina para dar una solución de reserva a 10 mM.

El NGF (humano recombinante) es una solución de 3,16 mg/ml en tampón [acetato sódico 20 mM, cloruro sódico 136 mM, pH 5,5] y se almacenó refrigerado (2-8 ºC). La actividad biológica de esta solución se sometiera ensayo para su capacidad para producir diferenciación de células PC 12 en concentraciones nanomolares.

El 12-miristato-13-acetato de forbol (PMA) (Sigma, St. Louis, MO) se preparó como una solución de reserva de 10 mg/ml (16,2 mM) en DMSO.

Antes de los experimentos, los artículos de ensayo se diluyeron en medios para concentraciones finales tal como se describe en las figuras. Los cultivos basales se incubaron con el control de vehículo de solución salina.

CRECIMIENTO, MORFOLOGÍA Y CARACTERIZACIÓN DE CÉLULAS CALICIFORMES CULTIVADAS

En sólo dos 2 días después del establecimiento de la conexión tisular, las células comenzaran a crecer fuera del tejido que continúa creciendo de modo que hacia el día 9 las células adherentes son visibles alrededor de todo el tejido (Figura 5A). Con un aumento más elevado, aparecen células individuales que se adhieren al pocillo de cultivo tisular, presenta morfología empedrada y contienen gotitas diminutas translúcidas en las vesículas citoplasmáticas (Figura 5B). Tan pronto como las células proliferan en el cultivo, se observó que se formaban gotitas diminutas en la superficie de las células caliciformes, lo que sugiere un producto secretor similar a mucosa (Figura 5C, flechas abiertas). A medida que estas células que contienen gotitas crecían en el cultivo, las gotitas se combinaron en grupos, que aumentaron en tamaño y en número (Figura 5C, flecha cerrada). Los resultados son similares a los resultados publicados anteriormente (Shatos, M. et al., "Isolation, Characterization, and Propagation of Rat Conjunctival Goblet Cells In Vitro," IOVS 42: 1455-1464 (2001)).

Se determinó que estas células tienen una reactividad positiva hacia PAS, lo que indica que estas células estaban asociadas con un tipo neutro de producto de secreción de mucina (Figura 6A). Tras el uso de un aumento mayor (100x), se observaron muchas vesículas citoplasmáticas perinucleares (Figura 6B, flecha abierta). Durante el examen, varias de estas vesículas se tiñeron intensamente con PAS, lo que indica la presencia de glicoconjugados neutros (de color rosa a rojo) dentro de los gránulos secretores (Figura 6B y C, flechas cerradas). Las células se contratiñen de color azul con tinción de Hematoxilina/Eosina.

PUNTOS FINALES Y RESULTADOS:

Tal como se analiza con detalle a continuación, el compuesto D3 aumentó la secreción de mucina en células caliciformes de conjuntiva con el aumento más elevado observado en las dosis de 2 µM. Además, el compuesto D3 en concentraciones de hasta 100 µM no estimulaba la proliferación de células caliciformes hacia el día 4, sin diferencias entre las dosis. Por último, el tratamiento de células caliciformes de conjuntiva durante cinco minutos con el compuesto D3 aumentó la fosforilación de proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK).

SECRECIÓN DE GLICOCONJUGADOS:

Para medir la secreción celular, se cultivaron células caliciformes hasta confluencia y a continuación se privaron de suero durante 2 horas antes de la estimulación. Las células se incubaron con el compuesto D3 a 2, 10, y 50 µM, NGF a 0,1, 1 y 10 nM, y PMA a 0,1, 1, y 10 nM en RPMI sin suero durante 2 horas. La secreción de células caliciformes se midió usando un ensayo de lectina unido a enzimas (ELLA). En resumen, se transfirió una alícuota del sobrenadante del cultivo celular a una placa de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos por triplicado (Coming Life Sciences Nº 2592, Fisher Scientific, Nepean, Ont). En cada placa se incluyó una serie de dilución de mucina submaxilar bovina (BSM) (Sigma, St. Louis, MO) como patrón (los datos de la curva estándar y los datos que muestran la detección de BSM es lineal entre 0,003 y 0,1 µg no se muestran). Las placas se revistieron por evaporación a 37 ºC durante una noche. A continuación, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado [PBS que contiene BSA al 0,3 %, Tween-20 al 0,05 %] a continuación se bloquearon para la unión no específica con PBS que contiene BSA al 3 % y Tween-20 al 0,05 % a 37 ºC durante 1 hora. Los pocillos se aclararon tres veces en tampón de lavado, y a continuación se incubaron en 2 µg/ml de UEA-1 biotinilada diluida en tampón de lavado (Vector Labs, Burlingame, CA) a 37 ºC durante 1 hora. Los pocillos se aclararon tres veces en tampón de lavado, y a continuación se incubaron en 1 µg/ml de neutravidina conjugada con HRP diluida en tampón de lavado (Pierce, Rockford, IL) a 37 ºC durante 1 hora. Después de aclarar los pocillos tres veces en tampón de lavado, el desarrollodel color se realizó con TMB (Promega, Madison, WI) y se detuvo con Ácido sulfúrico 0,5 N. La absorbancia se leyó a 450 nm en un Benchmark Plus (Biorad). Las células caliciformes que permanecían en las pocillos de cultivo se rasparon en tampón RIPA [TritonX-100 al 1 %, Tris-HCl 20 mM a pH 7.5, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, desoxicolato de Na al 1 %, EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, SDS al 0,1 %, glicerol al 10 %, vanadato de Na 1 mM, fluoruro de Na10 mM, pirofosfato de Na 10 mM, inhibidores mini proteasa completos sin EDTA (Roche Applied Science, Indianápolis, IN)] o tampón Tris 1 M (pH 7,5), se recogieron y se sonicaron. La cantidad de proteína en el homogenado celular se

analizó usando el kit de ensayo de proteína de Bradford usando una serie de dilución de albúmina de suero bovino (BSA) como el patrón (BioRad, Montreal, PQ). La secreción de glicoconjugado se normalizó hasta proteína total en el homogenado. A continuación, los datos se expresaron como el incremento por encima del valor basal.

Para determinar si el compuesto D3 estimula la secreción de mucina de las células caliciformes, se incubaron células caliciformes con pasajes en cultivo durante 2 horas en presencia del compuesto D3 (2, 10 y 50 µM), o NGF (0,1, 1 y 10 nM, el control positivo (Rios, J. et al., "Role of Neurotrophins and Neurotrophin Receptors in Rat Conjunctival Goblet Cell Secretion and Proliferation," IOVS 48: 1543-1551 (2007)) o PMA (0,1, 1 y 10 nM, otro control positivo (Dartt, D. et al., "Regulation of Conjunctival Goblet Cell Secretion by Ca2+ and Protein Kinase," C. Exp Eye Res 71: 619-628 (2000)). Un ELLA determinó la cantidad de glicoproteínas de alto peso molecular segregadas en el medio usando la lectina UEA-1 biotinilada tal como se ha descrito anteriormente en Rios, J. et al., "Immunolocalization of Muscarinic and VIP Receptor Subtypes and Their Role in Stimulating Goblet Cell Secretion", IOVS 40: 1102-1111 (1999)). Los datos sin procesar de la secreción de mucina a partir de células caliciformes cultivadas de cuatro ratas independientes se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1: Datos sin Procesar de Secreción de Glicoconjugado de Células Caliciformes

Secreción de Glicoconjugado (µg de glicoconjugado/mg de proteína total)

Rata 1: Rata 2 Rata 3 Rata 4

Muestra: Placa 1 Placa 2 Placa 1 Placa 2 Placa 1 Placa 1 Placa 2 Mean ± DT

Basal: 5,1 3,9 2,0 2,3 4,9 8,6 9,9 5,7 ± 3,0

NGF (0,1 nM): 7,6 2,4 4,6 10,6 6,3 ± 3,6

NGF (1 nM): 13,6 1,7 4,9 10,8 7,8 ± 5,4

NGF (10 nM)): 10,4 4,4 3,6 2,7 9,7 10,2 6,8 ± 3,6

PMA (0,1 nM): 3,2 6,9 5,1 ± 2,6

PMA (1nM): 4,1 4,1 4,1 ± 0

PMA (10 nM): 11,3 3,5 3,0 6,1 8,4 6,5 ± 3,5

MIM-D3 (2 µM): 2,5 10,5 9,3 7,4 ± 4,3

MIM-D3 (10 µM): 2,5 5,1 11,6 6,4 ± 4,7

MIM-D3 (50 µM): 5,4 3,3 5,7 9,5 6,0 ± 2,6

Se produjo una pequeña diferencia en la secreción de mucina de rata a rata, con la secreción basal variando entre 2,0 y 9,9 µg de glicoconjugado/mg de proteína. El NGF de control positivo aumentó la secreción de mucina de una forma dependiente de la dosis (hasta 1,55 ± 0,18 veces a 10 nM) (Tabla 2). El otro control positivo, PMA aumentó la secreción de mucina en ~1,4 veces, que no era dependiente de la dosis. El compuesto D3 aumentó la secreción de mucina; el mayor aumento se observó a 2 µM (1,49 ± 0,33 veces). Ninguno de los tratamientos era estadísticamente significativo entre sí (P = 0,7429). Una representación gráfica de los datos se presenta en la Figura 7.

Tabla 2: Incremento de la Secreción de Glicoconjugado 5

Secreción de Glicoconjugado (incremento por encima del basal)

Muestra: Rata 1 Rata 2 Rata 3 Rata 4 Media ± etm

Basal: 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 6 0,00

NGF (0,1 nM): 1,49 1,20 0,94 1,24 1,22 6 0,11

NGF (1 nM): 2,67 0,85 1,00 1,26 1,44 6 0,42

NGF (10 nM)): 1,58 1,49 1,98 1,19 1,55 6 0,18

PMA (0,1 nM): 1,39 1,41 1,40 6 0,01

PMA (1 nM): 1,05 1,78 1,42 6 0,37

PMA (10 nM): 1,56 1,30 1,24 0,85 1,30 6 0,25

MIM-D3 (2 µM): 1,25 2,14 1,09 1,49 6 0,33

MIM-D3 (10 µM): 1,25 1,04 1,35 1,21 6 0,09

MIM-D3 (50 µM): 1,38 1,65 1,16 1,11 1,33 6 0,12

PROLIFERACIÓN CELULAR:

La proliferación celular se midió usando Azul de Alamar de Biosource (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Células caliciformes cultivadas a partir de dos ratas se privaron de suero en RPMI sin suero complementado con BSA al 0,5 % durante 24 horas antes de la adición de FBS (al 10 %, el control positivo), NGF (de 10 pM a 10 nM), compuesto D3 (de 0,1 a 100 µM) o NGF (de 10 pM a 10 nM) en presencia de MIM-D3 10 o 100 µM, y se incubaron adicionalmente a 37 ºC en una atmósfera humidificada con CO2 al 5 %. Después de 24 horas, se añadió Azul de Alamar al 10 % durante 6 horas y se leyó la absorbancia a 570 y 600 nm en un Benchmark Plus (Biorad). El porcentaje de reducción de Azul de Alamar se calculó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las placas que contenían Azul de Alamar se incubaron adicionalmente a 37 ºC durante 48, 72 y 96 horas, y las placas se volvieron a leer cada día.

La proliferación de células caliciformes se midió en presencia de FBS al 10 % hasta cuatro días. Se obtuvo un aumento estadísticamente significativo en la proliferación en el tiempo con FBS al 10 % (247 ± 2 veces el día 3, P < 0,0001). Después de tres días de incubación con FBS al 10 %, el porcentaje de reducción de Azul de Alamar disminuyó debido al número de células elevado o a los tiempos de incubación prolongados. Para determinar si el compuesto D3 y NGF estimula la proliferación de células caliciformes, se incubaron células caliciformes en medios sin suero en presencia de concentraciones crecientes del compuesto D3 (Figura 8) o NGF hasta cuatro días. El NGF en todas las concentraciones no aumentó la proliferación hasta el día cuatro. El compuesto D3 en concentraciones de hasta 100 µM no estimuló la proliferación de células caliciformes hacia el día cuatro (las concentraciones inferiores a 3 µM no se muestran) sin diferencias entre la respuesta a la dosis (P = 0,1098). La combinación del NGF con el compuesto D3 10 µM o 100 µM no tuvo efecto en la proliferación (los datos no se muestran).

MAPK:

La activación de p42/44 MAPK se examinó usando técnicas de transferencia de Western. Las células caliciformes se privaron de suero en RPMI sin suero durante 4-6 hrs horas antes de la adición de PMA (100 nM), NGF (1 o 10 nM),

o MIM-D3 (10 o 50 µM) durante 5 minutos a 37 ºC. A continuación, las células se aclararon una vez en PBS frío, se rasparon en 100 µl de tampón de muestra de SDS-PAGE 1 x [Tris-HCl 62,5 mM a pH 6,8, glicerol al 10 %, SDS al 2 %, β-mercaptoetanol al 5 %, 0,02 mg/ml de azul de bromofenol] y se sonicaron durante 20 minutos. Los homogéneos centrifugaron a 14.900 g durante 15 min a 4 ºC. Las proteínas en una alícuota de 30 µl del sobrenadante se separaron por SDS-PAGE (geles de acrilamida al 8 %) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon durante 2 horas en leche deshidratadas sin grasa al 5 % en tampón que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, y Tween-20 al 0,01 % (TBST). Las transferencias se investigaron a continuación con un anticuerpo dirigido frente a la forma fosforilada de MAPK1/2 (Calbiochem, San Diego, CA) a 0,1 1 µ/ml en TBST que contenía BSA al 5 % durante una noche a 4 ºC, seguido de un periodo de incubación de 1 hora en anticuerpo anti-ratón secundario conjugado con HRP (Sigma, St. Louis, MO) a temperatura ambiente en TBST que contenía leche deshidratada sin grasa al 5 %. Se visualizaron bandas inmunorreactivas usando el método de quimioluminiscencia potenciada (Perkin Elmer, Waltham, MA). Las trasferencias se separaron a 55 ºC durante 30 minutos en tampón de separación [Tris-HCl 62,5 mM a pH 6,8, SDS al 2 %, β-mercaptoetanol 0,1 M] seguido de re-exploración con un anticuerpo dirigido frente a actina (dilución a 1:5000, Sigma, St. Louis, MO) en TBST que contenía leche deshidratada sin grasa al 5 % e incubación en anticuerpo anti-conejo secundario conjugado con HRP. Las bandas inmunorreactivas se exploraron digitalmente en un escáner EPSON y se analizaron usando NIH ImageJ v1.38x. La cantidad de MAPK fosforilada en cada muestra se estandarizó a la cantidad de proteína actina total en la muestra.

Para determinar si el compuesto D3 y NGF inducían la secreción de glicoconjugados a través de la activación de la ruta de MAPK, se estimularon células caliciformes cultivadas a partir de 3 ratas independientes con el compuesto D3 10 y 50 µM, NGF 1 y 10 nM o PMA (100 nM, el control positivo) durante 5 minutos y la actividad de MAPK se midió mediante análisis de transferencia de western. Una transferencia de western representativa a partir de 3 cultivos de células caliciformes de rata independientes se muestra en la Figura 9, y la cuantificación se muestra en la Figura 10. Se produjo un efecto estadísticamente significativo del tratamiento en la activación de MAPK (P < 0,0001).

El compuesto D3 aumentó la actividad de MAPK por encima de la basal en 2,5 ± 0,3 veces a 10 µM y 2,2 ± 0,5 veces a 50 µM y NGF aumentó la actividad de MAPK en 2,8 ± 0,5 a 1 nM (P < 0,05) y 1,7 ± 0,2 a 10 nM. El PMA de control positivo aumentó de forma estadísticamente significativa la actividad de MAPK en 6,1 ± 0,7 veces (P < 0,01).

PRESENTACIÓN DE DATOS Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO:

Los datos se expresan como el aumento (x veces) por encima del valor basal, que se estandarizó a 1,0. los resultados se expresan como la media ± ETM. Los datos se analizaron con ANOVA de una vía usando GraphPad Prism v4.0c (GraphPad Software Inc. La Jolla, CA). P < 0,05 se considera estadísticamente significativo. Para la comparación con el ajuste del control basal control se usó ensayo de Dunnett.

EJEMPLO 3

MODELO DE OJO SECO INDUCIDO POR ESCOPOLAMINA (COMPUESTO D3)

La finalidad de este estudio era usar el modelo de escopolamina de ojo seco para estudiar la eficacia del compuesto D3. El modelo de escopolamina se eligió en base a la investigación más temprana comparando una cámara de entorno controlado (CEC) con el modelo de escopolamina de ojo seco.

ANIMALES:

Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley macho que pesaban entre 300 g y 350 g en Charles River (Wilmington, MA). Los animales se alojaron en cuartos para animales con temperatura ambiente (22 ± 1 ºC), condiciones de luz (ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad), y humedad (40-60 %) constantes. Los animales se anestesiaron antes del experimento quirúrgico y del examen clínico con isofluorano. INDUCCIÓN DE OJO SECO MEDIANTE BLOQUEO COLINÉRGICO:

El ojo seco se indujo usando escopolamina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), que se administró continua y sistémicamente a los animales a través de una bomba osmótica (2ML4 Alzet®; CedarLane, Burlington, Ontario) rellena con escopolamina e implantada por vía subcutánea en el área dorsal media entre las cápsulas. La herida se cerró con 2-3 clips para heridas. Después de la cirugía y de nuevo al día siguiente, los animales se inyectaron por vía subcutánea con Carprofeno (0,5 mg/100 g), un fármaco antiinflamatorio no esteroideo y analgésico de larga duración, potente en roedores. Los animales se anestesiaron antes de la implantación de la bomba quirúrgica y antes del ensayo del punto final clínico en una cámara de Isofluorano al 99,9 % USP (Abraxis Bioscience, Richmond Hill, Ontario). La escopolamina se administró a 12,5 mg/día y, por razones técnicas, los datos evaluaron el día 14.

La solución estéril de 0,175 g/ml de bromhidrato de escopolamina (Sigma-Aldrich, St. Louis MO) se preparó en solución salina (0,9 %) y se filtró a través de un filtro con extremo de jeringa de 0,22 um (Millex-GC, Millipore Corp., Bedford, MA). Las bombas 2ML4 Alzet® se rellenaron con 2 ml de una solución de 0,175 g/ml de escopolamina de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

GRUPOS DE TRATAMIENTO:

Los grupos de ojos de ratas sometidos a ensayo fueron tal como sigue a continuación:

 Grupo 1: Ratas de control (n = 12 ojos de 6 ratas).

 Grupo 2: Ratas (n = 12 ojos de 6 ratas) se indujeron con ojo seco por administración sistémica de escopolamina continuamente y la medida de la tinción con se tomó el día catorce.

 Grupo 3: Ratas (n = 14 ojos de 7 ratas) se indujeron con ojo seco por administración sistémica de escopolamina continuamente se trataron una vez por vía tópica en el día ocho con solución salina.

 Grupo 4: Ratas (n = 14 ojos de 7 ratas) se indujeron con ojo seco por administración sistémica de escopolamina

continuamente y se trataron una vez por vía tópica en el día ocho con una instilación de 5 µl del compuesto D3 al

1 % (10 mg/ml).

PUNTOS FINALES CLÍNICOS PARA EL OJO SECO Y RESULTADOS:

Tal como se analiza con detalle a continuación, el grupo tratado con compuesto D3 al 1 % por vía tópica en el día ocho presentaba una reducción significativa (p < 0,0001) en la tinción corneal con fluoresceína, con una puntuación media de 1,1 ± 0,1 en comparación con el control tratado con solución salina en el día catorce, pero no tenía efecto alguno en la producción lagrimal acuosa y la renovación lagrimal acuosa se midió el día trece en comparación con los controles sin tratar o tratados con escopolamina.

No hubo mortalidad, pero hubo dos morbilidades (una en el Grupo 2 y una en el Grupo 3) en las que los sitios de la herida por incisión se volvieron abrir debido a mordedura y a las bombas expuestas. Los datos de signos clínicos se excluyeron para estos dos animales. Se observó irritación ocular de leve a grave en todos los animales tratados con escopolamina (Grupos 2-4) a partir del día dos en adelante. La mayoría de los ojos de los animales tratados con escopolamina mostraron congestión conjuntival, hinchazón y secreción sanguinolenta de la conjuntiva. La congestión y la secreción sanguinolenta de la conjuntiva normalmente se resolvían. Sin embargo, la hinchazón conjuntival continuó a lo largo del estudio. Se observó irritación ocular durante la dosificación de los animales, incluso con anestesia.

El peso corporal medio, antes del tratamiento, era de aproximadamente 350 g, y no era estadísticamente diferente entre grupos (P = 0,3999). El peso medio corporal en los grupos de control sin tratar (Grupo 1) aumentó a

aproximadamente 420 g hacia el Día 14. En los tres grupos que recibieron escopolamina (Grupo 2-Grupo 4), el peso medio corporal aumentó a aproximadamente 375 g. Hubo un efecto del tratamiento estadísticamente significativo para disminuir el peso corporal comenzando en el Día 7, continuando hacia el Día 14 (P = 0,0042).

Tinción Corneal:

Se evaluaron los signos clínicos de sequedad corneal mediante impregnación de la córnea con fluoresceína. Una gota de una solución de fluoresceína sódica al 1 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) preparada en solución salina estéril se instiló en el saco conjuntival del animal anestesiado. A partir de os su momento, la córnea se observó con luz azul usando un oftalmoscopio Portátil con Lámpara de Rendija con filtro de cobalto azul (Reichert Opthalmic Instruments, Depew, NY) tres minutos después de la instilación de fluoresceína. Para cada animal, el área de la córnea positiva para fluorescencia punteada de la superficie ocular se registró de una forma ciega. La puntuación de este ensayo se clasificó de 0 a 4, en el que 0 es igual a sin tinción, 1 = < 25 % de tinción superficial, 2 = 25-50 % de tinción superficial, 3 = 50-75 % de tinción superficial y 4 = > 75 % de tinción superficial.

Tal como se muestra en la Figura 11, el grupo de control (sin tratamiento previo) mostró una ausencia casi completa de tinción corneal con fluoresceína, con una puntuación media (Puntuación ± DT) de 0,8 ± 0,1. El grupo de ojo seco sin tratar (solamente escopolamina) mostró un grado significativo de tinción corneal con fluoresceína punteado y difuso, con una puntuación media de 2,3 ± 0,3 el día catorce después de la implantación de bomba con escopolamina. El grupo tratado con solución salina por vía tópica en el día ocho después de la implantación de bomba con escopolamina también mostró un grado significativo de tinción corneal con fluoresceína en el día catorce, similar al del grupo de ojo seco sin tratar, con una puntuación media de 2,9 ± 0,3. El grupo tratado con compuesto D3 al 1 % por vía tópica en el día ocho presentaba una reducción significativa (p < 0,0001) en la tinción corneal con fluoresceína, con una puntuación media de 1,1 ± 0,1 en comparación con el control tratado con solución salina en el día catorce. Además, en el día catorce, el valor medio en el grupo tratado con compuesto D3 al 1 % por vía tópica (1,1 ± 0,1) pero estadísticamente diferente al del Grupo 1 (control sin tratar, 0,8 ± 0,1, p > 0,05).

Ensayo de Schirmer:

La producción de lágrimas se midió con hilos con rojo fenol estandarizado de Zone-Quick (FCI Oftalmics, Marshfield Hills, MA) en animales ligeramente sedados con Isoflurano. Los hilos se insertaron en el canto lateral inferior y se dejaron en el lugar durante treinta segundos. La longitud de la parte del hilo humedecida y teñida se midió en milímetros, usando la escala proporcionada por los hilos hasta una precisión de 1 mm. El ensayo de Schirmer se combinó de forma rutinaria con eliminación de fluoresceína lagrimal tal como se describe en la sección que sigue a continuación.

En la medida inicial, la puntuación media de Schirmer antes del tratamiento para todos los grupos era 13,7 ± 4,2 mm (P = 0,6943). Después de seis días, los animales tratados con escopolamina presentaban puntuaciones de Schirmer menores (es decir, menos lágrimas) que los controles sin tratar (9,2 ± 2,5 mm en comparación con 16,0 ± 5,4 mm, P < 0,0001), que corresponde a la inducción de ojo seco. Una sola dosis por vía tópica con solución salina (Grupo 3) o con compuesto D3 al 1 % (Grupo 4) en el día ocho, fue seguido de un periodo de 5 días sin tratamiento. En el día trece, los grupos que recibieron escopolamina presentaron estadísticamente puntuaciones de Schirmer significativamente menores que el control sin tratar (Grupo 1) (P < 0,0001), sin diferencia estadísticamente significativa entre los grupos dosificados (Figura 12). Una sola instilación por vía tópica del compuesto D3 al 1 % en el día ocho no tiene efectos sobre la producción lagrimal acuosa tal como se mide en el día trece (cinco días después) en comparación con los controles sin tratar o tratados con escopolamina.

Eliminación de Fluoresceína Lagrimal:

La eliminación de fluoresceína lagrimal se evaluó tal como se describe para seres humanos (Afonso, AA. et al., "Correlation of Tear Fluorescein Clearance and Schirmer Test Scores with Ocular Irritation Symptoms", Oftalmology

106: 803-810 (1999)) y modificado para ratas (Chen, W. et al., "Keratoconjunctivitis Sicca Modifies Epithelial Stem Cell Proliferation Kinetics in Conjunctiva," Cornea 26: 1101-1106 (2007)). Los animales se sedaron ligeramente con Isoflurano y se aplicaron dos microlitros de solución de fluoresceína sódica al 1 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (en solución salina estéril) en el saco conjuntival inferior. Los animales se despertaron a los dos minutos. Después de quince minutos, los animales se volvieron a sedar y el fluido lagrimal teñido con fluoresceína se recogió con un hilo de algodón de color rojo fenol (exactamente tal como para el ensayo de Schirmer). Los hilos se sellaron inmediatamente en tubos Eppendorf de polipropileno de 1,5 ml protegidos de la luz hasta el análisis fluorofotométrico. La longitud del algodón humedecido en mm determinó el volumen de del fluido lagrimal recogido.

A continuación, se añadieron 100 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS), los tubos centrifugaron a

12.000 rpm durante cinco minutos y el fluido se transfirió a una placa de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos (Corning Life Sciences Nº 2592, Fisher Scientific, Nepean, Ont.). Se preparó un pocillo estándar en cada placa, que consistía en un hilo de rojo fenol colocado en 100 µl de PBS que contenía 2 µl de solución de fluoresceína sódica al 1 %. La fluorescencia se midió inmediatamente usando un lector de microplacas con fluorescencia (FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech, Alemania) después de ajustar la ganancia al pocillo estándar. La concentración de

fluoresceína en las lágrimas se calculó a partir de las unidades de fluorescencia (FU) dividido entre los mm de algodón humedecido (FU/mm).

La renovación de lágrima acuosa se midió por eliminación de fluoresceína. En la medida inicial, el valor medio de eliminación de fluoresceína era 606 ± 496 FU/mm (P = 0,8920). En exámenes posteriores en el día seis y trece, numéricamente, los grupos que recibieron escopolamina presentaron valores más elevados (es decir, menos tear renovación de lágrimas) que el Grupo 1 (control sin tratar). Esta diferencia era estadísticamente significativa el día 13 (0,0304), pero no el día 6 (P = 0,1117) (Figura 13). Una sola inspiración por vía tópica del compuesto D3 al 1 % en el día ocho no tiene efecto en la renovación de lágrima acuosa tal como se mide el día trece (5 días después) en comparación con los controles sin tratar o tratados con escopolamina.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO:

La desviación media y la estándar (DT) se usaron para caracterizar los datos para cada grupo de estudio. Se realizó un análisis de la varianza de una vía (ANOVA) para el peso corporal y para las señales oftálmicas para los grupos de tratamiento en cada observación usando GraphPad Prism 4.0c (GraphPad Software Inc. La Jolla, CA). Se realizaron comparaciones por pares cuando se estratificó el día del examen, cuando el grupo de tratamiento era estadísticamente significativo (p ≤ 0,05, bilateral). Para la comparación con el control sin tratar (Grupo 1 o A), se usó ajuste con ensayo de Dunnett. No se hicieron correcciones para las comparaciones múltiples. Los valores de P entre grupos no se muestran y no se muestra la diferencia entre cada una de un par de medias (valores de P indicados como > 0,05, < 0,05, < 0,01 o < 0,001). EJEMPLO 4

PRODUCCIÓN DE MUCINA LAGRIMAL EN RATAS SIN TRATAMIENTO DESPUÉS DE INSTILACIÓN POR VÍA TÓPICA DEL COMPUESTO D3

Se realizaron estudios de clasificación de dosis en las instilación es por vía tópica del compuesto D3 en la estimulación de la producción de mucina en ratas sin tratamiento previo. Se dividieron treinta ratas sprague dawley macho en cinco grupos de seis ratas por grupo y se trataron bilateralmente una vez cada hora durante seis horas consecutivas con cualquiera de solución salina, compuesto D3 al 0,4 %, compuesto D3 al 1,0 %, compuesto D3 al 2,5 % y un 0,00053 % de NGF. Una vez anestesiado, cada animal recibió una instilación por vía tópica de 5 µl de artículo de ensayo en el saco conjuntival inferior de ambos ojos usando una micropipeta calibrada.

Se combinaron lavados de fluido lagrimal de ambos ojos y se recogieron antes del tratamiento y después de instilaciones por hora de solución salina, compuesto D3 y NGF. Todos los lavados de fluido lagrimal se evalúan para la concentración de mucina con un ensayo de lectina unidad a enzimas (ELLA).

La desviación media y la estándar (DT) se usaron para caracterizar los datos. Las diferencias en la concentración de mucina se calcularon a partir de grupos de ratas tratados menos la medida inicial. Se evaluaron los cambios continuos de mucina entre dos grupos a partir de la medida inicial usando el ensayo de t emparejado. Los cambios de mucina entre más de dos grupos de tratamiento se analizaron usando un análisis de varianza. Los cambios medios de mucina entre grupos de tratamiento se compararon frente a una media teórica de cero usando el ensayo de suma de clasificación de Wilcoxon. Se consideró que un ensayo bilateral con P < 0,05 era estadísticamente significativo. El análisis estadístico se realizó usando GraphPad Prism 4.0C (GraphPad Software Inc. La Jolla, CA).

Los resultados demuestran que, después del tratamiento, la diferencia entre grupos no era estadísticamente significativa (p = 0,1430). Cuando se hicieron comparaciones por pares entre grupos tratados y de la medida inicial, se produjo un aumento estadísticamente significativo en la concentración de mucina en animales tratados con el compuesto D3 al 2,5 % (Figura 14) (de 3,0 ± 1,9 ng/µl a 7,0 ± 4,5 ng/µl, p = 0,0413), pero no otros grupos (p = 0,1799 a 8454). Además, la diferencia entre grupos no era estadísticamente significativa (p = 0,0818). Cuando la diferencia entre grupos se comparó frente a la media teórica de cero, se produjo un aumento estadísticamente significativo en el grupo tratado con un 2,5 % del compuesto D3 (4,0 ± 3,5 ng/µl p = 0,0312), pero no otros grupos (p = 0,1562 a 1,1250). Numéricamente, los aumentos en los cambios en la media de la concentración de mucina en todos los grupos tratados con el compuesto D3 eran dependientes de la dosis (Figura 15).

EJEMPLO 5

MODELO DE OJO SECO DE RATA INDUCIDO POR ESCOPOLAMINA (COMPUESTO D3 Y FACTOR DE CRECIMIENTO NERVIOSO)

ANIMALES:

Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley macho (seis a ocho semanas de edad) que pesaban entre 360 g y 470 g de Charles River (Wilmington, MA). Los animales se alojaron en cuartos para animales con temperatura ambiente (22 ± 1 ºC), condiciones de luz (ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad), y humedad relativa (32-61 %) constantes. Los

animales se anestesiaron antes de la implantación de la bomba quirúrgica y antes de todo el ensayo clínico del punto final en una cámara de isoflurano al 99,9 % (Abraxis Bioscience, Richmond Hill, Ontario).

INDUCCIÓN DE OJO SECO MEDIANTE BLOQUEO COLINÉRGICO:

5 El ojo seco se indujo usando bromhidrato de escopolamina (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri), que se administraba continua y sistémicamente a los animales a través de una bomba osmótica (2ML4 Alzet®; CedarLane, Burlington, Ontario) rellena con escopolamina e implantada por vía subcutánea en el área dorsal media entre las escápulas. La escopolamina se administró durante un periodo de tiempo de veintiocho días a 12,5 mg/día, que se convirtió en 30,0

10 ± 1,5 mg/kg a través de bomba osmótica.

Se preparó una solución estéril de 0,175 g/ml de bromhidrato de escopolamina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en solución salina. La solución se filtró a través de un filtro con extremo de jeringa de 0,22 um (Millex-GC, Millipore Corp, Bedford, MA), y se almacenó refrigerado durante una noche. Las bombas osmóticas Alzet® (Modelo 2ML4,

15 LOTE Nº 10187-08, CedarLane Laboratories, Burlington, Ontario) se llenaron con 2 ml de la solución de escopolamina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó una técnica estéril durante el llenado y la manipulación de las bombas.

Después de la cirugía y de nuevo al día siguiente, los animales inyectaron por vía subcutánea con Caprofeno (0,5

20 mg/100 g), un fármaco antiinflamatorio en esteroideo y analgésico de larga duración, potente en roedores. Los animales se pesaron antes de la implantación de la bomba el Día 1, y a continuación una vez a la semana durante cuatro semanas. Se indicó que este régimen de dosificación inducía ojo seco en ratas (Viau S et al., "Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model," Graefes Arch Clin Exp Oftalmol., 246: 857-867 (2008)).

GRUPOS DE TRATAMIENTO:

Tal como se observa en la Tabla 3 y en la Figura 16, los grupos de ojos de rata sometidos a ensayo fueron como 30 sigue a continuación:

 Ratas de control (n = 10 ojos de 5 ratas) sin bombas implantadas y no se trataron a lo largo del estudio (este grupo también se denomina "G1" en el presente documento).

 Ratas (n = 10 ojos de 5 ratas) se indujeron con ojo seco por administración sistémica de escopolamina 35 continuamente y se trataron diariamente por vía tópica con 5 µl de solución salina comenzando el día cinco y continuando hasta el día veintiuno (este grupo también se denomina "G2" en el presente documento).

 Ratas (n = 10 ojos de 5 ratas) se indujeron con ojo seco por administración sistémica de escopolamina continuamente y se trataron diariamente por vía tópica con 5 µl de una solución del compuesto D3 al 0,4 % (4 mg/ml) comenzando el día cinco y continuando hasta el día veintiuno (este grupo también se denomina "G3" en

40 el presente documento).

 Ratas (n = 10 ojos de 5 ratas) se indujeron con ojo seco por administración sistémica de escopolamina continuamente y se trataron diariamente por vía tópica con 5 µl de una solución del compuesto D3 al 1,0 % (10 mg/ml) comenzando el día cinco y continuando hasta el día veintiuno (este grupo también se denomina "G4" en el presente documento).

45  Ratas (n = 10 ojos de 5 ratas) se indujeron con ojo seco por administración sistémica de escopolamina continuamente y se trataron diariamente por vía tópica con 5 µl de una solución del compuesto D3 al 2,5 % (25 mg/ml) comenzando el día cinco y continuando hasta el día veintiuno (este grupo también se denomina "G5" en el presente documento).

 Ratas (n = 10 ojos de 5 ratas) se indujeron con ojo seco por administración sistémica de escopolamina

50 continuamente y se trataron diariamente por vía tópica con 5 µl de una solución de NGF al 0,00053 % (0,00526 mg/ml) comenzando el día cinco y continuando hasta el día veintiuno (este grupo también se denomina "G6" en el presente documento).

Los tratamientos para G2-G6 continuaron diariamente durante diecisiete días (hasta un día veintiuno incluido). A

55 partir de ese momento, los tratamientos finalizaron, pero el estudio continúo durante otra semana. Durante el tratamiento, cada animal se anestesió en una cámara de isoflurano. Una vez despierto, cada animal recibió una instilación tópica de 5 µl del artículo de ensayo en el saco conjuntival inferior de ambos ojos usando una micropipeta calibrada. Si además se estaba sometiendo a ensayo un punto final clínico, el artículo de ensayo se instilaba por vía tópica al final del ensayo.

Tabla 3 -Grupos de Tratamiento

Grupo: Escopolamina Nº Ratas Artículo de Ensayo (Ambos Ojos) Ruta (bilateral) Frecuencia Volumen Dosis Concentración Artículo de Ensayo (%)

G1: No 5 - - - - -

G2: Sí 5 Solución Salina Instilación tópica 1x al día, Días 5-21 5 µl -

G3: Sí 5 Compuesto -D3 Instilación tópica 1x al día, Días 5-21 5 µl 0.4

G4: Sí 5 Compuesto -D3 Instilación tópica 1x al día, Días 5-21 5 µl 1.0

G5: Sí 5 Compuesto -D3 Instilación tópica 1x al día, Días 5-21 5 µl 2.5

G6: Sí 5 NGF Instilación tópica 1x al día, Días 5-21 5 µl 0,00053

5 PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN DE DOSIFICACIÓN:

El compuesto D3 se preparó usando una formación diseñada por Mimetogen Pharmaceuticals, que es solución salina tamponada ~pH 7 (tal como se determina con tiras indicadoras de pH, EMD Chemicals). Se prepararon tres soluciones de dosificación por vía tópica:

10  Se preparó una solución de dosificación por vía tópica de un 0,4 % usando 4,0 mg de compuesto disuelto en 845 µl de agua milliQ estéril. La solución se ajustó a ~pH 7 con 6,5 µl de NaOH 1,0 N (VWR) usando tiras indicadoras de pH y se hizo isotónica (NaCl al 0,9 %) por adición de 148,5 µl de NaCl 1,0 M estéril.

15  Se preparó una solución de dosificación por vía tópica de un 1,0 % usando 10,0 mg de compuesto disuelto en 845 µl de agua milliQ estéril. La solución se ajustó a ~pH 7 con 20 µl de NaOH 1,0 N, y se hizo isotónica por adición de 135 µl de NaCl 1,0 M estéril.

 Se preparó una solución de 2,5 % (solubilidad máxima) usando 25,0 mg de compuesto disuelto en 845 µl de

20 agua milliQ estéril. La solución se ajustó a ~pH 7 con 20 µl de NaOH 1,0 N. La solución se hizo isotónica por adición de 135 µl de NaCl 1,0 M estéril. Todas las soluciones se sonicaron durante 5 min. Todas las soluciones de compuesto D3 se almacenaron refrigeradas (2-8 ºC) durante el periodo de tiempo del estudio.

Se preparó una solución de dosificación por vía tópica de NGF al 0,00053 % por dilución de 1 µl de los 3,16 mg/ml

25 de solución de reserva en 600 µl de inyección estéril de cloruro sódico al 0,9 %, USP (LOTE 63-922-FW EXP 20100301). Se preparó una solución de dosificación recién diluida cada semana, y se almacenó refrigerada (2-8 ºC). Se indicó que esta concentración de NGF tenía eficacia en i) perros que desarrollaron ojo seco después de la escisión de la tercera glándula lagrimal del párpado (Coassin M Lambiase A, Costa N, et al: Efficacy of topical nerve growth factor treatment in dogs affected by dry eye. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology

30 2005; 243:151-155) y ii) conejos que desarrollan daño nervioso corneal después de Queratectomía fotorrefractiva (PRK) (Esquenazi S, Bazan HEP, Bui V, et al: Topical Combination of NGF and DHA Increases Rabbit Corneal Nerve Regeneration after Photorefractive Keratectomy. Investigative Oftalmology & Visual Science 2005; 46:31213127).

35 Se usó una solución de dosificación por vía tópica de una inyección estéril de cloruro sódico al 0,9 %, USP (LOTE 63-922-FW EXP 20100301). La solución salina se almacenó a temperatura ambiente.

PUNTOS FINALES CLÍNICOS PARA OJO SECO Y RESULTADOS:

40 Tal como se analiza con detalle a continuación, la evaluación de los efectos de las dosis del compuesto D3 al 0,4, 1,0 o al 2,5 % después del periodo de recuperación de siete días, mostraron que la dosis del compuesto D3 al 1 % aumentaba el tiempo de ruptura lagrimal (TBUT), aumentaba la producción de mucina y restauraba casi completamente la tinción corneal, en comparación con el control sin tratar, pero no presentaba ninguna diferencia estadísticamente significativa en comparación con el control para la producción de lágrimas (ensayo de Schirmer),

45 determinación de proteínas o eliminación de fluoresceína.

TBUT:

Los tiempos de ruptura lagrimal se sometieron a ensayo el día 13 (después de 8 tratamientos diarios), día 21 (después de 16 tratamientos diarios), y día 28 (después el tratamiento se detuvo durante 7 días). El TBUT se evaluó por instilación de 10 µl de solución de fluoresceína sódica (0,2 % en solución salina estéril) en el saco conjuntival superior del animal anestesiado. Los párpados movieron manualmente para distribuir la fluoresceína con la película lagrimal. Con la luz azul cobalto de un oftalmoscopio portátil con lámpara de hendidura (Reichert Oftalmic Instruments, Depew, NY), el ojo se mantuvo abierto y se registró el tiempo hasta que aparecieron una o más estrías de color negro en la película lagrimal precorneal. Para cada ojo, se prepararon un mínimo de lecturas por triplicado con solución de fluoresceína recién preparada.

El tiempo de ruptura lagrimal fue más elevado (es decir, mejor) en el Grupo 1 (control sin tratar) que en cualquiera de los grupos que recibieron escopolamina (Tabla 4 y Figura 17A y B). Se produjo un efecto estadísticamente significativo del tratamiento en todas las observaciones (p < 0,0001, 0,0349, y < 0,0001, respectivamente). Durante el tratamiento (Día 13), todos los grupos que recibían escopolamina eran estadísticamente diferentes de forma significativa del Grupo 1 (p < 0,0001 a 0,0012). Cuando se hicieron comparaciones adicionales por pares para el Grupo 5 (7,0 ± 2,3 seg, Compuesto D3 al 2,5 %), se observaron diferencias estadísticamente significativas a partir del Grupo 4 (3,9 ± 1,2 seg, Compuesto D3 al 1,0 %, p = 0,0160). Durante el tratamiento (Día 21), todos los grupos que recibían escopolamina eran estadísticamente diferentes de forma significativa del Grupo 1 (p = 0,0167 to 0,0289), con la excepción de los Grupos 4 y 5 (Compuesto D3 al 1,0 % y al 2,5 %). En el Día 28, todos los grupos que recibían escopolamina eran estadísticamente diferentes de forma significativa del Grupo 1 (p < 0,0001 a 0,0054). Cuando se realizaron comparaciones por pares para el Grupo 4 (6.4 ± 1,2 seg, Compuesto D3 al 1,0 %), se observaron sin diferencias estadísticamente significativas a partir del Grupo 3 (4,3 ± 0,8 seg, Compuesto D3 al 0,4 %, p = 0,0204) y el Grupo 6 (4,2 ± 0,8 seg, NGF, p = 0,0165). Después del periodo de recuperación de siete días, la dosis del compuesto D3 al 1 % aumentó el TBUT en comparación con el control sin tratar. Por el contrario, no hubo diferencia en el TBUT para las dosis del compuesto D3 al 0,4 % y al 2,5 % después del periodo de recuperación de siete días. La dosis más elevada puede haber insensibilizado a los receptores de NGF en las células caliciformes haciéndolas resistentes a la actividad agonista del compuesto D3. La dosis más baja simplemente puede haber sido subóptima.

Aunque no existen valores de medida inicial para TBUT, el efecto de la dosis del compuesto D3 al 1 % en comparación con el grupo de control sin tratar y el grupo de solución salina se pueden observar mediante la evaluación de los cambios en TBUT el Día 28 en comparación con el Día 13. La dosis del compuesto D3 al 1 % mejoró estadísticamente de forma significativa el TBUT en comparación con los grupos de control sin tratar y de solución salina (p = 0,0001) (Figura 20A). Además, la Figura 21A ilustra los datos de medidas de punto final para el TBUT en el tiempo en comparación con el Día 13 en el grupo de control de solución salina y el grupo tratado con dosis del compuesto D3 al 1 %.

Tabla 4 -Datos del Tiempo de Separación Lagrimal

Tiempo de Separación Lagrimal (segundos ± DT)ª

Grupos5a

Día: 1 2 3 4 5 6 Valor de P

13: 11,8 ± 1,4 5,9 ± 1,9 4,5 ± 1,7b 3,9 ± 1,2c 7,0 ± 2,3 5,2 ± 1,6 < 0,0001

21: 8,0 ± 2,6 4,5 ± 1,8 4,4 ± 1,7 5,1 ± 1,9 5,8 ± 2,1 4,7 ± 0,8 0,0523

28: 9,4 ± 2,3 4,9 ± 0,9 4,3 ± 0,8 6,4 ± 1,2 5,0 ± 1,3 4,2 ± 0,8 < 0,0001

an = 5 en cada observación, excepto el Día 13 para G3 y G4 bn=3 cn=4 5Código del Grupo: 1) Sin Tratamiento; 2) Escopolamina + Solución Salina; 3) Escopolamina + Compuesto D3 al 0,4 %; 4) Escopolamina + Compuesto D3 al 1,0 %; 5) Escopolamina + Compuesto D3 al 2,5 %; 6) Escopolamina + NGF al 0,00053 %

Tinción Corneal:

Inmediatamente después de la evaluación de TBUT, se evaluaron los signos clínicos de sequedad corneal mediante tinción de la córnea con fluoresceína y se sometió ensayo el día 13 (después de 8 tratamientos diarios), el día 21 (después de 16 tratamientos diarios), y el día 28 (después el tratamiento se detuvo durante 7 días). Una gota de una solución de fluoresceína sódica al 0,2 % preparada en solución salina estéril se instiló en el saco conjuntival superior del animal anestesiado. A partir de ese momento, la córnea se observó con luz azul usando un oftalmoscopio Portátil con Lámpara de Hendidura con filtro de cobalto azul (Reichert Oftalmic Instruments, Depew, Nueva York) de dos a tres minutos después de la instilación de fluoresceína. Para cada animal, el área de la córnea teñida con fluoresceína punteada se registró de una forma enmascarada. La puntuación de este ensayo se clasificó de 0 a 4, en el que 0 es igual a sin tinción, 1 es inferior a un 25 % de tinción superficial, 2 es un 25-50 % de tinción superficial, 3 es un 50-75 % de tinción superficial, y 4 es superior a un 75 % de tinción superficial.

Numéricamente, los grupos que recibieron escopolamina presentaron valores más elevados (es decir, más daño) que el Grupo 1 (control sin tratar) (Tabla 5 y Figuras 18A-B). La diferencia entre grupos era estadísticamente significativa los Días 13 y 28 (p < 0,0001), pero no el Día 21 (p = 0,0682). En el Día 13, cada uno de los grupos que recibieron escopolamina era estadísticamente diferente de forma significativa del Grupo 1 (p < 0,0001 a 0,0003), pero no entre sí (p > 0,0677), con la excepción del Grupo 5, que era estadísticamente diferente de forma significativa del Grupo 4 (p = 0,0352). En el Día 28, los Grupos 2, 3, 5 y 6 eran estadísticamente diferentes de forma significativa del Grupo 1 (p < 0,0001 a 0,0007). El valor medio en el Grupo 4 (Compuesto D3 al 1 %), 1,3 ± 0,3, no era estadísticamente diferente de forma significativa del Grupo 1 (control sin tratar, 0,9 ± 0,7, p = 0,5136). Además, en este examen, el Grupo 4 estadísticamente diferente de forma significativa de los valores más elevados observados en los Grupos 2, 3, 5 y 6 (p < 0,0001 a 0,0047). Después del periodo de recuperación de siete días, la dosis del compuesto D3 al 1 % restauró casi completamente la tinción corneal en comparación con el grupo de control sin tratar. Por el contrario, no hubo diferencia en la tinción corneal para las dosis de un 0,4 % y de un 2,5 % del compuesto D3 después del periodo de recuperación de siete días. La dosis más elevada puede haber insensibilizado los receptores del NGF en las células caliciformes haciéndolas resistentes a la actividad agonista del compuesto D3. La dosis más baja simplemente puede haber sido subóptima.

Aunque no existen valores de medida inicial para tinción corneal, el efecto de la dosis del compuesto D3 al 1 % en comparación con el grupo de control sin tratar y el grupo de solución salina se pueden observar mediante la evaluación de los cambios en la tinción corneal el Día 28 en comparación con el Día 13. La dosis del compuesto D3 al 1 % estadísticamente mejoró de forma significativa la tinción corneal en comparación con los grupos de control sin tratar y de solución salina (p < 0,0001) (Figura 20B). Además, la Figura 21B ilustra los datos de la medida del punto final para la tinción corneal en el tiempo en comparación con el Día 13 en el grupo de control de solución salina y el grupo tratado con la dosis del compuesto D3 al 1 %.

Tabla 5 -Datos de Tinción Corneal

Tinción Corneal (Puntuación ± DT)ª

Grupos6b

Día

1 2 3 4 5 6ValordeP

13 0,6 ± 0,4 2,4 ± 0,2 2,7 ± 0,4: 2,8 ± 0,6 2,1 ± 0,7 2,6 ± 0,5 < 0,0001

21 1,0 ± 0,6 2,0 ± 0,9 2,1 ± 0,4: 2,3 ± 0,6 2,1 ± 1,0 2,3 ± 0,6 0,0682

28 0,9 ± 0,7 2,7 ± 0,3 2,4 ± 0,7: 1,3 ± 0,3 2,6 ± 0,4 2,2 ± 0,3 < 0,0001

aPuntuación: 0 a 4

bn = 5 ratas en cada observación

6Código del Grupo:

1) Sin Tratamiento;

2) Escopolamina + Solución Salina;

3) Escopolamina + Compuesto D3 al 0,4 %;

4) Escopolamina + Compuesto D3 al 1,0 %;

5) Escopolamina + Compuesto D3 al 2,5 %;

6) Escopolamina + NGF al 0,00053 %

Se observó una correlación inversa significativa entre los valores de tBUT y las puntuaciones de tinción corneal entre grupos en todos los exámenes. Los valores de tBUT disminuyeron a medida que aumentaban las puntuaciones de tinción corneal (Spearman r = -0.7606, p<0,0001, n = 87 pares XY).

Determinación de la Producción de Mucina:

Se recogieron fluidos de lavado lagrimal de los seis grupos de ratas el día 12 (después de 7 tratamientos diarios), el día 19 (después de 14 tratamientos diarios) y el día 28 (después el tratamiento se detuvo durante 7 días) después de la instilación de 5 µl de solución salina estéril en el saco conjuntival inferior del animal anestesiado. Los párpados se movieron suavemente para mezclar la película lagrimal con la solución salina. El fluido lagrimal diluido se recogió con un tubo capilar de vidrio de 5 µl de volumen (Drummond Scientific Co, Broomhall, Pensilvania) por acción capilar desde el menisco lagrimal en el canto lateral. Se recogieron de forma rutinaria aproximadamente 4-5 µl. En ojos muy secos, se instiló una segunda alícuota de 5 µl antes de la recogida.

Las concentraciones de glicoproteína de tipo mucina en los lavados de fluido lagrimal diluido se determinaron mediante un ensayo de lectina unida a enzimas (ELLA). Una mezcla que contenía 3 µg de proteína total se diluyó hasta 100 µl en tampón de carbonato a pH 9,2 y se transfirió a una placa de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos (Corning Life Sciences Nº 2592, Fisher Scientific, Nepean, Ontario). Como patrón se incluyó en cada placa una serie de dilución de mucina submaxilar de bovino (Sigma, St. Louis, Missouri). Las placas se revistieron por evaporación a 37 ºC durante una noche. Después, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado [PBS que contenía BSA al 0,3 %, Tween-20 al 0,05 %] a continuación se bloqueó para la unión no específica con PBS que contenía BSA al 3 % y Tween-20 al 0,05 % a 37 ºC durante una hora. Los pocillos se aclararon tres veces en tampón de lavado, y a continuación se incubaron en 2 µg/ml de UEA-1 biotinilada diluida en tampón de lavado (Vector Labs, Burlingame, CA) a 37 ºC durante una hora. Los pocillos se aclararon tres veces en tampón de lavado, y a continuación se incubaron en 1 µg/ml de neutravidina conjugada con HRP diluida en tampón de lavado (Pierce, Rockford, Illinois) a 37 ºC durante una hora. Después de aclarar los pocillos tres veces en tampón de lavado, eldesarrollo del color se realizó con TMB (Promega, Madison, Wisconsin) y se detuvo con Ácido sulfúrico 0,5 N. A concentración de mucina en los lavados de fluido lagrimal se calculó como los ng de mucina dividido entre el volumen de lavado de fluido lagrimal en µl que proporcionó 3 µg de proteína total.

Se midió la producción de mucina y la diferencia entre grupos no era estadísticamente significativa (p = 0,1066 a 0,7844) en cada observación (Tabla 6 y Figura 19A-B). Numéricamente, los valores medios más elevados en cualquier grupo de tratamiento se observaron en el Grupo 4 (dosis del compuesto D3 al 1 %) en cada uno de estos periodos (3,3, 9,1 y 6,8 ng/µl), en comparación con el Grupo 1 (controles sin tratar, 2,9, 6,8, y 1,5 ng/µl, respectivamente). Esta diferencia era estadísticamente significativa el día 28 (p = 0,0312), pero no otros días (p = 0,6992 a 0,9973). Después del periodo de recuperación de siete días, este aumento estadísticamente significativo en la producción de mucina con la dosis del compuesto D3 al 1 % puede haber mejorado la calidad y la estabilidad de la película lagrimal. Por el contrario, no hubo diferencia en la producción de mucina para las dosis al 0,4 % y al 2,5 % del compuesto D3 después del periodo de recuperación de siete días. La dosis más elevada puede haber insensibilizado a los receptores de NGF en las células caliciformes haciéndolas resistentes a la actividad agonista del compuesto D3. La dosis más baja simplemente puede haber sido subóptima.

Aunque no existen valores de medida inicial para la producción de mucina, el efecto de la dosis del compuesto D3 al 1 % en comparación con el grupo de control sin tratar y el grupo de solución salina se pueden observar mediante la evaluación de los cambios en la producción de mucina el Día 28 en comparación con el Día 12. La dosis del compuesto D3 al 1 % aumentó estadísticamente de forma significativa la producción de mucina en comparación con los grupos de control sin tratar y de solución salina (p = 0,0013) (Figura 20C). Además, la Figura 21C ilustra los datos de medidas de punto final para la producción de mucina en el tiempo en comparación con el Día 12 en el grupo de control de solución salina y el grupo tratado con dosis del compuesto D3 al 1 %.

Tabla 6 -Producción de Mucina en Lavados de Fluido Lagrimal Mucina Lagrimal (ng/µl ± DT)

Grupos7a

Día: 1 2 3 4 5 6 Valor de P

12: 2,9 ± 2,0 3,4 ± 2,8 2,7 ± 2,2 3,3 ± 1,9 1,6 ± 0,9 3,0 ± 2,3 0,7844

19: 6,8 ± 2,3 4,9 ± 1,2 6,8 ± 3,2 9,1 ± 5,1 6,5 ± 2,4 6,8 ± 3,8 0,5320

28: 1,5 ± 1,5 3,2 ± 1,7 4,4 ± 3,8 6,8 ± 4,9 3,0 ± 1,1 2,4 ± 2,0 0,1066

an = 5 ratas en cada observación 7Código del Grupo: 1) Sin Tratamiento; 2) Escopolamina + Solución Salina; 3) Escopolamina + Compuesto D3 al 0,4 %; 4) Escopolamina + Compuesto D3 al 1,0 %; 5) Escopolamina + Compuesto D3 al 2,5 %; 6) Escopolamina + NGF al 0,00053 %

Ensayo de Schrimer:

La producción de la prima se controló usando el ensayo de Schirmer los días 5, 7, 14, 20 y 29 después de la inducción del ojo seco. La producción de lágrimas se midió con hilos con rojo fenol estandarizado de Zone-Quick (FCI Oftalmics, Marshfield Hills, Massachusetts) en animales ligeramente sedados con Isoflurano. Los hilos se insertaron en el canto lateral inferior y se dejaron en el lugar durante treinta segundos. La longitud de la parte del hilo humedecida y teñida se midió en milímetros, usando la escala proporcionada por los hilos hasta una precisión de 1 mm.

La media del ensayo prequirúrgico de lágrima de Schirmer para 30 ratas (60 ojos) fue 11,9 ± 3,8 mm (p = 0,7228). Después de 2 días, los animales tratados con escopolamina presentaron puntuaciones de Schirmer menores (es decir, menos lágrimas) que los controles sin tratar (9,6 ± 3,2 mm en comparación con 15,2 ± 5,4 mm, p = 0,1671), y los animales se asignaron en grupos (Tabla 7). El Día 5, los animales tratados presentaban una puntuación media de Schirmer de 8,5 ± 2,2 mm en comparación con los controles sin tratar (17,7 ± 4,4 mm) y esta diferencia era estadísticamente significativa (p < 0,0001), lo que corresponde a la inducción del ojo seco. En exámenes posteriores, los grupos que recibieron escopolamina presentaban puntuaciones de Schirmer estadísticamente significativas menores que las del control sin tratar (G1) (p < 0,0001 a 0,0541 -límite en el día 14), sin diferencia estadísticamente significativa entre los grupos que recibieron escopolamina (Tabla 8 y Figura 22).

Tabla 7 -Grupo de Asignación

Ensayo de Schirmer (mm ± DT)

Grupo2a: Día -1 Día 2

1: 14,1 ± 4,3 15,2 ± 5,2

2: 11,6 ± 3,6 9,2 ± 3,6

3: 11,9 ± 4,4 9,6 ± 3,0

4: 11,3 ± 4,5 9,8 ± 4,0

5: 11,5 ± 2,2 9,8 ± 2,4

6: 11,2 ± 3,7 9,9 ± 4,9

an = 5 en cada observación 2Código del Grupo: 1) Sin Tratamiento; 2) Escopolamina + Solución Salina 3) Escopolamina + Compuesto D3 al 0,4 4) Escopolamina + Compuesto D3 al 1,0 5) Escopolamina + Compuesto D3 al 2,5 6) Escopolamina + NGF al 0,00053 %

Tabla 8 -Datos del Ensayo de Schirmer Ensayo de Schirmer (mm ± DT)

Grupos3a

Día: 1 2 3 4 5 6 Valor de P

-1: 14,1 ± 4,0 11,6 ± 2,6 11,9 ± 4,2 11,3 ± 3,0 11,5 ± 1,8 11,2 ± 3,2 0,7228

2: 15,2 ± 5,4 9,2 ± 3,1 9,6 ± 3,0 9,8 ± 3,8 9,8 ± 2,4 9,9 ± 4,8 0,1671

5: 17,7 ± 4,4 7,8 ± 0,4 7,9 ± 3,2 7,9 ± 2,3 9,6 ± 1,8 9,2 ± 2,5 <0,0001

7: 15,8 ± 3,6 6,6 ± 2,1 7,9 ± 1,6 9,5 ± 4,2 9,1 ± 1,9 7,8 ± 1,4 0,0002

14: 12,5 ± 2,7 8,3 ± 3,0 8,6 ± 3,0 7,3 ± 2,3 9,4 ± 1,4 8,6 ± 2,1 0,0541

20: 13,4 ± 4,8 7,5 ± 2,9 7,2 ± 1,8 6,8 ± 0,8 9,1 ± 2,3 7,1 ± 2,4 0,0075

29: 16,8 ± 4,8 7,3 ± 2,0 9,4 ± 2,0 9,0 ± 2,9 7,7 ± 1,6 7,5 ± 2,5 0,0001

an = 5 ratas en cada observación 3Código del Grupo: 1) Sin Tratamiento; 2) Escopolamina + Solución Salina; 3) Escopolamina + Compuesto D3 al 0,4 %; 4) Escopolamina + Compuesto D3 al 1,0 %; 5) Escopolamina + Compuesto D3 al 2,5 %; 6) Escopolamina + NGF al 0,00053 %

Eliminación de Fluoresceína Lagrimal:

La renovación del fluido lagrimal se midió usando el ensayo de eliminación de fluoresceína los días 5, 7, 14 y 20 después de la inducción del ojo seco. La eliminación de fluoresceína lagrimal se evaluó tal como se describe para seres humanos (Alfonso, A.A., et al., "Correlation of Tear Fluorescein Clearance and Schirmer Test Scores with Ocular Irritation Symptoms," Oftalmology 106: 803-810 (1999)) y se modificó para ratas (Chen, W., et al., "Keratoconjunctivitis Sicca Modifies Epithelial Stem Cell Proliferation Kinetics in Conjunctiva," Cornea 26: 1101-1106 (2007)). Los animales se sedaron ligeramente con Isoflurano y se aplicaron dos microlitros de solución de fluoresceína sódica al 1 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) (en solución salina estéril) en el saco conjuntival inferior. Los animales se despertaron a los dos minutos. Después de quince minutos, los animales se volvieron a sedar y el fluido lagrimal teñido con fluoresceína se recogió con un hilo de algodón de color rojo fenol (tal como se describe para el ensayo de Schirmer). Los hilos se sellaron inmediatamente en tubos Eppendorf de polipropileno de 1,5 ml protegidos de la luz hasta el análisis fluoro fotométrico. El volumen del fluido lagrimal recogido se determinó mediante la longitud del algodón humedecido en mm. A continuación, se añadieron 100 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS), los tubos centrifugaron a 12.000 rpm durante cinco minutos y el fluido se transfirió a una placa de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos (Corning Life Sciences Nº 2592, Fisher Scientific, Nepean, Ontario). Se preparó un pocillo patrón en cada placa, que consistía en un hilo de color rojo fenol colocado en 100 µl de PBS que contenía 2 µl de solución de fluoresceína sódica al 1 %. La fluorescencia se midió inmediatamente usando un lector de fluorescencia de microplacas (FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech, Alemania) después de ajustar la ganancia al pocillo patrón. La concentración de fluoresceína en las lágrimas se calculó a partir de las unidades de fluorescencia dividido entre los mm de algodón humedecido (Fu/mm).

En la medida inicial, el valor medio de eliminación de fluoresceína fue 387 ± 427 FU/mm (p = 0,7506). En los exámenes posteriores, numéricamente, los grupos que recibieron escopolamina presentaron valores más elevados (es decir, menos renovación de lágrimas) que el Grupo 1 (control sin tratar). Esta diferencia era estadísticamente significativa el día 7 (0,0378), pero no otros días (p = 0,1242 a 0.4472). No hubo una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos que recibieron escopolamina (Tabla 9 y Figura 23).

Tabla 9 -Datos de Eliminación de Fluoresceína Lagrimal Eliminación de Fluoresceína Lagrimal (FU/mm ± DT)

Grupos4a

Día

1 2 3 4 5 6ValordeP

-1 178 ± 151 372 ± 409 288 ± 247: 575 ± 682 428 ± 312 483 ± 562 0,7506

2 282 ± 308 699 ± 389 516 ± 305: 880 ± 673 777 ± 592 933 ± 824 0,4472

5 120 ± 69 1018 ± 874 969 ± 732: 550 ± 369 671 ± 344 804 ± 432 0,1377

7 113 ± 49 1058 ± 1101 296 ± 156: 1098 ± 639 561 ± 231 1080 ± 572 0,0378

14 228 ± 119 779 ± 759 635 ± 599: 686 ± 306 791 ± 235 1097 ± 1112 0,4245

20 96 ± 66 659 ± 746 667 ± 508: 1067 ± 773 673 ± 170 861 ± 414 0,1242

an = 5 ratas en cada observación

4Código del Grupo:

1) Sin Tratamiento;

2) Escopolamina + Solución Salina;

3) Escopolamina + Compuesto D3 al 0,4 %;

4) Escopolamina + Compuesto D3 al 1,0 %;

5) Escopolamina + Compuesto D3 al 2,5 %;

6) Escopolamina + NGF al 0,00053 %

Se observó una correlación inversa significativa entre valores de eliminación de fluoresceína en las lágrimas y los valores del ensayo de Schirmer entre grupos en todos los exámenes. La concentración de fluoresceína en las lágrimas aumentaba a medida que la producción de lágrimas acuosas disminuía (Spearman r = -0,3306, p < 0,0001, n = 180 pares XY).

Efecto de la Escopolamina en Ratas:

No hubo mortalidad. Se observó irritación ocular de leve a grave en todos los animales tratados con escopolamina (G2-6) a partir del Día 2 en adelante. La mayoría de los ojos de los animales tratados con escopolamina mostraron congestión conjuntival, hinchazón y secreción sanguinolenta de la conjuntiva. La congestión conjuntival y la secreción sanguinolenta de la conjuntiva normalmente se resolvían al día siguiente, pero la hinchazón conjuntival continuó a lo largo del estudio. El peso corporal medio, antes del tratamiento, era de aproximadamente 400 g, y no era estadísticamente diferente entre grupos (p = 0,3927) (Tabla 10). El peso medio corporal en los grupos de control sin tratar (G1) aumentó a aproximadamente 575 g a lo largo del estudio. En los cinco grupos que recibieron escopolamina (G2-G6), el peso medio corporal aumentó de aproximadamente 425 a 450 g. Hubo un efecto del tratamiento estadísticamente significativo para disminuir el peso corporal comenzando en el Día 14, continuando hacia el Día 28 (p < 0,0001 a 0,0426) (Figura 24).

Tabla 10 -Pesos Corporales Pesos Corporales (g ± DT)

Grupos1a

Día: 1 2 3 4 5 6 Valor de P

-1: 407 ± 20 403 ± 31 421 ± 34 436 ± 29 431 ± 33 417 ± 16 0,3927

7: 436 ± 25 379 ± 33 399 ± 30 414 ± 23 405 ± 32 396 ± 20 0,0648

14: 456 ± 27 393 ± 38 407 ± 35 424 ± 27 425 ± 33 399 ± 18 0,0426

20: 479 ± 34 409 ± 39 416 ± 38 430 ± 27 436 ± 30 417 ± 16 0,0261

29: 574 ± 59 430 ± 41 440 ± 36 460 ± 30 459 ± 29 438 ± 22 < 0,0001

an = 5 ratas en cada observación 1Código del Grupo: 1) Sin Tratamiento; 2) Escopolamina + Solución Salina; 3) Escopolamina + Compuesto D3 al 0,4 %; 4) Escopolamina + Compuesto D3 al 1,0 %; 5) Escopolamina + Compuesto D3 al 2,5 %; 6) Escopolamina + NGF al 0,00053 %

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Cuando se pudo aplicar, los datos del ojo se promediaron para cada rata, y por lo tanto el animal experimental se convirtió en la unidad analizada (n = 5). La media y la desviación típica (DT) se usaron para caracterizar los datos para cada grupo de estudio. Se realizó un análisis de varianza de dos vías para el peso corporal y las señales oftálmicas con factores de grupo de tratamiento, el día del examen, y el día del examen del grupo de tratamiento (PROC GLM) (PC-SAS, versión 9.1., SAS Institute, Cary NC). Se realizaron comparaciones por pares cuando se estratificó el día del examen, cuando el grupo de tratamiento era estadísticamente significativo (p ≤ 0,05, bilateral). Para la comparación con el control sin tratar (Grupo 1), se usó un ajuste de LSMEANS con Dunnett. Para la comparación entre otros grupos, se usó LSMEANS. Los valores p entre grupos se indican en las tablas de datos y se evaluaron los valores de p deductivos para todas las comparaciones por pares (los datos no se incluyen). Se usó el coeficiente de correlación de Spearman para clasificación para evaluar la correlación entre diversas medidas de puntos finales usando GraphPad Prism 4.0c (GraphPad Software Inc. La Jolla, CA).

Posteriormente, se realizó un cálculo de potencia. Whitley, E. y Ball, J., "Statistics Review 4: Muestra Size Calculations," Critical Care, 6: 335-341 (2002). El estudio presentó una potencia de un 80 % (beta) (con un alfa = 0,05 bilateral) para detectar una diferencia tan pequeña como 54 g en el peso corporal, 4,9 mm en la puntuación de Schirmer, 830 FU/mm en la eliminación de fluoresceína, 2,8 segundos en tBUT, puntuación 0,9 en la tinción corneal, y 4,5 ng/µl de mucina.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Compuesto cíclico peptidomimético con giro β para uso en el tratamiento del ojo seco en un sujeto con necesidad

del mismo, en el que dicho compuesto cíclico peptidomimético con giro β se representa con la Fórmula estructural 5 (I):

en la que R1 y R3 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C1 a C6, arilo, o un sustituyente de 10 una cadena lateral de uno de los veinte aminoácidos proteicos; R2 y R4 son independientemente hidrógeno o alquilo;

o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo; o R3 y R4 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo; R5 y R6 son hidrógeno o alquilo C1 a CR; Y es hidrógeno o uno o dos sustituyentes aromáticos; X se selecciona entre O, N, S, P, Se, C, alquileno de 1 a 6 átomos de carbono, SO, SO2 o NH; n es 0, 1,

15 2, 3, 4 o 5; y CONECTOR seleccionado entre el grupo que consiste en: NH2, OH, SH, COOH, CH3CO, CHO, y NH-CH2-COOH.
2. El compuesto de la reivindicación 1 para uso en el tratamiento del ojo seco en un sujeto con necesidad del mismo,

en el que X es O, S o NH, R1, R3, R5 y R6 son cada uno átomos de hidrógeno y el anillo macrocíclico tiene 14, 15 o 20 16 átomos en el anillo.
3. El compuesto de la reivindicación 1 para uso en el tratamiento del ojo seco en un sujeto con necesidad del mismo, en el que R1 y R3 se derivan de una secuencia de cadenas laterales de aminoácidos diferentes.

25 4. El compuesto de la reivindicación 3 para uso en el tratamiento del ojo seco en un sujeto con necesidad del mismo, en el queX esO, So NH.
5. El compuesto de la reivindicación 1 para uso en el tratamiento del ojo seco en un sujeto con necesidad del mismo, en el que dicho compuesto cíclico peptidomimético con giro β se representa con la Fórmula D3:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
6. El compuesto de la reivindicación 1 para uso en el tratamiento del ojo seco en un sujeto con necesidad del mismo, en el que dicho compuesto cíclico peptidomimético con giro β se selecciona entre el grupo que consiste en:

un compuesto representado con la Fórmula D3,

un compuesto representado con la Fórmula 3Aa,

y un compuesto representado con la Fórmula 3Ak,

5 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
7. Uso de un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para el tratamiento del ojo seco en un sujeto con necesidad del mismo.

10 8. Compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso en la estimulación de secreción de mucina lagrimal en un sujeto con necesidad del mismo.
9. Uso de un compuesto decualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para

estimular la secreción de mucina lagrimal en un sujeto con necesidad del mismo. 15

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción