ES2523217T3 - Anticuerpos monoclonales humanos para el receptor de tirotropina que actúan como antagonistas - Google Patents

Anticuerpos monoclonales humanos para el receptor de tirotropina que actúan como antagonistas Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano aislado para el Receptor de Hormona Estimulante del Tiroides (TSHR) que es un antagonista de la Hormona Estimulante del Tiroides (TSH) y tiene una afinidad de unión por el TSHR humano de longitud completa de aproximadamente 109 l/mol, en donde el anticuerpo comprende una región 5 VH que comprende: SNYMS (CDR1); VTYSGGSTSYADSVKG (CDR2); y GGRYCSSISCYARSGCDY (CDR3), y una región VL que comprende: RASQSISNYLN (CDR1); AASSLQS (CDR2); y QQSYSSPSTT (CDR3).

Description

Anticuerpos monoclonales humanos para el receptor de tirotropina que actúan como antagonistas
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos que son reactivos con el receptor de tirotropina (TSH) (TSHR) y, en particular, aunque no exclusivamente, a anticuerpos que se unen con el TSHR y que pueden bloquear la estimulación del TSHR por anticuerpos estimulantes de TSH o TSHR.
Antecedentes
La tirotropina, u hormona estimulante del tiroides (TSH), es una hormona de la hipófisis que regula la función tiroidea mediante el TSHR (Szkudlinski MW, Fremont V, Ronin C, Weintraub BD 2002 Thyroid-stimulating hormone and TSHR structure function relationships. Physiological Reviews 82: 473-502). El TSHR es un receptor acoplado a proteína G y está compuesto de tres dominios: un dominio rico en leucina (LRD), un dominio de escisión (CD) y un dominio transmembrana (TMD) (Nunez Miguel R, Sanders J, Jeffreys J, Depraetere H, Evans M, Richards T, Blundell TL, Rees Smith B, Furmaniak J 2004 Analysis of the thyrotropin receptor-thyrotropin interaction by comparative modelling. Thyroid 14: 991-1011). La unión de TSH con el TSHR desencadena la señalización del receptor que conduce a la estimulación de la formación y liberación de hormonas tiroideas; tiroxina (T4) y triyodotironina (T3). Un mecanismo de retroalimentación negativa que implica los niveles T4 y T3 en la circulación controla la liberación de TSH de la hipófisis (y hormona liberadora de tirotropina secretada por el hipotálamo) que a su vez controla la estimulación del tiroides y los niveles de hormonas tiroideas en el suero.
Está bien documentado en la técnica que algunos pacientes con enfermedad de tiroides autoinmunitaria (AITD) tienen autoanticuerpos reactivos con TSHR (Rees Smith B, McLachlan SM, Furmaniak J 1988 Autoantibodies to the thyrotropin receptor. Endocrine Reviews 9: 106-121). En la mayoría de los casos, estos anticuerpos se unen con el TSHR e imitan las acciones de la TSH estimulando de este modo al tiroides para que produzca altos niveles de T4 y T3. Estos autoanticuerpos se describen como autoanticuerpos estimulantes del tiroides o autoanticuerpos de TSHR (TRAb) con actividad estimulante o actividad agonista de TSH. El mecanismo de retroalimentación fisiológica de control de la función tiroidea mencionado anteriormente no es eficaz en presencia de dichos anticuerpos estimulantes del tiroides y pacientes presentes con síntomas de hiperactividad tiroidea o tirotoxicosis (exceso de hormonas tiroideas en el suero). Esta afección se conoce como enfermedad de Graves. En algunos pacientes se cree que los TRAb con actividad estimulante son responsables de la interacción con TSHR en tejidos retro-orbitales y que contribuyen a las señales oculares de la enfermedad de Graves. Se ha descrito con detalle un autoanticuerpo monoclonal humano que actúa como un potente estimulante del tiroides (hMAb TSHR1) en la Solicitud de Patente WO2004/050708A2.
A diferencia de algunos pacientes con AITD, los autoanticuerpos se unen con el TSHR, impiden que la TSH se una con el receptor pero no tienen la capacidad de estimular al TSHR. Estos tipos de autoanticuerpos se conocen como TRAb con actividad de bloqueo o actividad antagonista de TSH, y los pacientes que tienen TRAb de bloqueo en su suero pueden presentar síntomas de un tiroides hipofuncionante (hipotiroidismo) (Rees Smith B, McLachlan SM, Furmaniak J 1988 Autoantibodies to the thyrotropin receptor. Endocrine Reviews 9: 106-121). En particular, los TRAb con actividad de bloqueo cuando están presentes en el suero de mujeres embarazadas cruzan la placenta y pueden bloquear los TSHR de tiroides fetal conduciendo a hipotiroidismo neonatal y consecuencias graves para el desarrollo. Además, pueden encontrarse TRAb con actividad de bloqueo en la leche materna de madres afectadas y esto puede contribuir además al hipotiroidismo clínico en el bebé. Hasta la fecha no han estado disponibles autoanticuerpos monoclonales humanos para el TSHR con actividad antagonista de TSH. En consecuencia, los estudios detallados de cómo este tipo de autoanticuerpos interacciona con el TSHR, y cómo sus interacciones con el TSHR se comparan con las de tipo estimulante de autoanticuerpos (tales como M22) y con TSH, han estado limitados.
La gonadotropina coriónica humana es una hormona producida durante el embarazo que tiene efectos estimulantes del tiroides leves.
La caracterización de las propiedades de TRAb con actividades de estimulación o bloqueo es de importancia crítica en estudios que se dirigen a mejorar el diagnóstico y control de enfermedades asociadas con una respuesta autoinmunitaria al TSHR. La invención descrita en la Solicitud de Patente WO2004/050708A2 proporciona detalles acerca de las propiedades de un autoanticuerpo monoclonal humano con actividad estimulante potente y su interacción con el TSHR. Además la Solicitud de Patente WO2006/016121A desvela una preparación de TSHR mutado que incluye al menos una mutación puntual que puede usarse en la exploración e identificación diferencial de autoanticuerpos de TSHR estimulantes en suero de pacientes, autoanticuerpos de TSHR de bloqueo en suero de pacientes y TSH en una muestra de fluido corporal de un paciente que se explora. La Solicitud de Patente WO2004/050708A2 también describe un anticuerpo monoclonal de ratón (9D33) con actividad de bloqueo de TSHR. 9D33 se une con el TSHR con alta afinidad (2x1010 l/mol) y es un antagonista eficaz de TSH, hMAb TSHR1 (M22) y TRAb en suero de pacientes con actividades de estimulación o de bloqueo (Solicitud de Patente WO2004/050708A2
y J, Allen F, Jeffreys J, Bolton J, Richards T, Depraetere H, Nakatake N, Evans M, Kiddie A, Premawardhana LD, Chirgadze DY, Miguel RN, Blundell TL, Furmaniak J, Rees Smith B 2005 Characteristics of a monoclonal antibody to the thyrotropin receptor that acts as a powerful thyroid-stimulating autoantibody antagonist. Thyroid 15: 672-682). Aunque el anticuerpo monoclonal de ratón 9D33 muestra al menos algunas de las características de los TRAb de suero de pacientes con actividad de bloqueo, es un anticuerpo de ratón generado por inmunización de un animal experimental con el TSHR y como tal puede no ser verdaderamente representativo de autoanticuerpos de TSHR generados en el proceso de una respuesta autoinmunitaria al TSHR en seres humanos. Como un anticuerpo monoclonal de ratón sería necesario humanizar 9D33 para aplicaciones in vivo en seres humanos. Esto puede ser desventajoso a la vista del gasto y la complicación implicados en el proceso de humanización.
Los efectos de una serie de mutaciones en el dominio rico en leucina de TSHR sobre la capacidad de los anticuerpos monoclonales estimulantes del tiroides y la TSH para unirse con el receptor y estimular la producción de AMP cíclico en células CHO transfectadas con TSHR se conocen de Jane Sanders Jane Bolton, Paul Sanders, Jennifer Jeffreys, Nobuhiro Nakatake, Tonya Richards, Michele Evans, Angela Kiddle, Sara Summerhayes, Emma Roberts, Ricardo Nunez Miguel, Jadwiga Furmaniak y Bernard Rees Smith 2006 Effects of TSH Receptor Mutations on Binding and Biological Activity of Monoclonal Antibodies and TSH. Thyroid 16: 1195-1206.
La presente invención resulta de la producción y propiedades de un autoanticuerpo monoclonal humano (5C9) para el TSHR que es un antagonista eficaz de TSH y de TRAb estimulantes en sueros de pacientes. Se ha aislado 5C9 de los linfocitos periféricos de un paciente con hipotiroidismo y altos niveles de autoanticuerpos de TSHR. Los linfocitos se inmortalizaron por infección con virus de Epstein Barr (EBV) y clones positivos fusionados con una línea celular de ratón/humana para generar un clon estable. Se purificó IgG de sobrenadantes de cultivos de clones y se evaluó la capacidad del IgG 5C9 para unirse con el TSHR e influir en la actividad del TSHR. En particular, se estudió la capacidad de 5C9 para inhibir la unión de TSH con el TSHR, y para inhibir la actividad estimulante de AMP cíclico de TSH. Además, también se evaluó la capacidad de 5C9 para inhibir la unión de TRAb del suero de pacientes estimulantes o de bloqueo con el TSHR y para inhibir su actividad biológica. Además, se investigó el uso de 5C9 en ensayos para anticuerpos de TSHR, TSH y compuestos relacionados. Se secuenciaron genes de región variable (región V) de las cadenas pesada (HC) y ligera (LC) de 5C9 y se asignaron las regiones determinantes de complementariedad (CDR).
Sumario de la invención
De acuerdo con un primer aspecto de la invención se proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado para el Receptor de la Hormona Estimulante del Tiroides (TSHR) que es un antagonista de la Hormona Estimulante del Tiroides (TSHR) y tiene una afinidad de unión por el TSHR humano de longitud completa de 109 l/mol, en el que el anticuerpo comprende una región VH que comprende: SNYMS (CDR1); VTYSGGSTSYADSVKG (CDR2); y GGRYCSSISCYARSGCDY (CDR3), y una región VL que comprende: RASQSISNYLN (CDR1); AASSLQS (CDR2); y QQSYSSPSTT (CDR3).
Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede comprender adicionalmente la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 9, o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 7 y la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 10, o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 8.
Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede tener una afinidad de unión por el TSHR de longitud completa humano de aproximadamente 109 l/mol. Preferentemente, un anticuerpo de acuerdo con la invención tiene una afinidad de unión por el TSHR de longitud completa humano de aproximadamente 109 l/mol.
La invención ayuda al experto destinatario a entender los mecanismos inmunológicos que conducen el desarrollo y producción de autoanticuerpos de TSHR de estimulación y bloqueo. Adicionalmente, la invención ayuda al destinatario experto a entender las diferencias moleculares entre los autoanticuerpos de TSHR con actividad estimulante del tiroides y con actividad de bloqueo. Además, el método de tratamiento médico y composiciones farmacéuticas de la invención proporcionan nuevos tratamientos para afecciones relacionadas con el tiroides.
Un anticuerpo preferido de acuerdo con la invención es 5C9. Se ha descubierto que 5C9 inhibe inesperadamente la actividad constitutiva del receptor de hormonas estimulantes del tiroides, es decir la producción de AMP cíclico en un sistema de ensayo en ausencia de hormona estimulante del tiroides o M22. Esto puede ser particularmente ventajoso en el planteamiento de células cancerosas de tiroides que permanecen en el tiroides, o en metástasis, especialmente en la prevención o el retardo del recrecimiento ya que las células crecerán más rápidamente como consecuencia de la actividad constitutiva del receptor de la hormona estimulante del tiroides.
El término “anticuerpo” y términos afines, tales como “anticuerpos”, usados en el presente documento abarca según el contexto restos de unión basados en inmunoglobulinas tales como anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos multiespecíficos y también restos de unión, con los que el destinatario experto puede sustituir dichos restos de unión basados en inmunoglobulina, tales como anticuerpos de dominio, diacuerpos, IgGΔCH2, F(ab’)2, Fab, scFv, VL, VH, dsFv, Minicuerpo, Triacuerpo, Tetracuerpo, (scFv)2, scFv-Fc,
F(ab’)3 (Holliger P, Prospero T, Winter G 1993 “Diabodies: small bivalent and bispecific antibody fragments” Proc Natl Acad Sci USA 90: 6444-6448.), (Carter PJ 2006 “Potent antibody therapeutics by design” Nat Rev Immunol 6: 343357).
El término “TSHR” se refiere a receptores de la hormona estimulante del tiroides humano de longitud completa que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4 o variantes o fragmentos de los mismos que tienen alta homología con receptores de la hormona estimulante del tiroides. Preferentemente, dichas variantes y fragmentos tienen del 70 al 99,9 % de homología con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4.
De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un nucleótido que comprende:
a) una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un vector que comprende un nucleótido de acuerdo con el aspecto anterior de la invención.
El vector puede ser un plásmido, virus o fragmento del mismo. Se conocen muchos tipos de vectores diferentes por el destinatario experto.
De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona una célula aislada que incluye un anticuerpo; nucleótidos y/o vector de acuerdo con la invención. La célula aislada puede expresar un anticuerpo de acuerdo con la invención. Preferentemente, la célula aislada secreta un anticuerpo de acuerdo con la invención. Preferentemente, una célula aislada de acuerdo con la invención es de una línea celular de hetero-hibridoma estable.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona una composición que comprende una concentración definida de autoanticuerpos de TSHR e incluyendo un anticuerpo de acuerdo con la invención. Dicha composición puede comprender una concentración definida de autoanticuerpos de TSHR con actividad antagonista de TSH, e incluye un anticuerpo de acuerdo con la invención.
Como alternativa, una composición de acuerdo con este aspecto de la invención puede comprender una concentración definida de autoanticuerpos de TSHR que son antagonistas de anticuerpos estimulantes del tiroides, e incluye un anticuerpo de acuerdo con la invención. Una composición puede comprender una concentración definida de autoanticuerpos del TSHR con actividad antagonista de TSH y que son antagonistas de anticuerpos estimulantes del tiroides, e incluye un anticuerpo de acuerdo con la invención.
De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona una composición farmacéutica para su administración en un sujeto mamífero para su uso en el tratamiento de una afección relacionada con el tiroides que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La afección relacionada con el tiroides puede seleccionarse de hiperactividad tiroidea, enfermedad ocular de Graves, hipertiroidismo neonatal, hipertiroidismo inducido por gonadotropina coriónica humana, mixoedema pre-tibial, cáncer de tiroides y tiroiditis.
Una composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede ser adecuada para administración humana. Preferentemente una composición farmacéutica de acuerdo con la invención no tiene ningún efecto adverso significativo en el sistema inmunitario del sujeto.
Una composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede incluir un antagonista del receptor de la hormona estimulante del tiroides adicional. Un antagonista del receptor de la hormona estimulante del tiroides adicional adecuado es 9D33 como se desvela en el documento WO2004/050708.
Se contemplan diversos formatos para composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención. Una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de una afección relacionada con el tiroides puede ser en un formato inyectable. Una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de mixoedema pre-tibial está preferentemente en un formato tópico. Una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de enfermedad ocular de Graves está preferentemente en forma de colirio.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenderán cualquier anticuerpo de acuerdo con la invención de la presente invención, con cualquier transportador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. Los transportadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero sin limitación, intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas del suero, tales como albúmina de suero humano, sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido ascórbico, sorbato potásico, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, fosfatos de hidrógeno disódico, fosfato de hidrógeno potásico, cloruro sódico, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras,
polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse por vía oral, por vía parenteral, por pulverización de inhalación, por vía tópica, por colirios, por vía rectal, por vía nasal, por vía bucal, por vía vaginal o mediante un depósito implantado. Los inventores prefieren la administración oral o administración por inyección. El término “parenteral” como se usa en el presente documento incluye técnicas de inyección o infusión subcutáneas, intracutáneas, intravenosas, intramusculares, intraarticulares, intrasinoviales, intraesternales, intratecales, intralesionales e intracraneales.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una preparación inyectable estéril, por ejemplo, como una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Está suspensión puede formularse de acuerdo con técnicas conocidas en este campo usando agentes de dispersión o humectantes adecuados (tales, por ejemplo, Tween 80) y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1,3butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están manitol, agua, solución de Ringer y solución de cloruro sódico isotónico. Además, se emplean convencionalmente aceites fijos, estériles como un disolvente o medio de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite fijo insípido incluyendo mono
o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como ácido oleico y sus derivados de glicéridos son útiles en la preparación de inyectables, como lo son los aceites farmacéuticamente aceptables naturales, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones oleosas también pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga tal como Ph. Helv o un alcohol similar.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse por vía oral en cualquier forma de dosificación aceptable por vía oral incluyendo, pero sin limitación, cápsulas, comprimidos y suspensiones y soluciones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, los vehículos que se usan habitualmente incluyen lactosa y almidón de maíz. También se añaden normalmente agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio. Para administración oral en una forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se administran suspensiones acuosas por vía oral, el principio activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, pueden añadirse ciertos agentes edulcorantes, saporíferos y/o colorantes.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden administrarse en forma de supositorios para administración rectal. Estas composiciones pueden prepararse mezclando un compuesto de la presente invención con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperatura ambiente pero líquido a temperatura rectal y por lo tanto se fundirá en el recto para liberar los componentes activos. Dichos materiales incluyen, pero sin limitación, manteca de cacao, cera de abejas y polietilenglicoles.
La administración tópica de las composiciones farmacéuticas de la presente invención es especialmente útil cuando el tratamiento deseado implica áreas u órganos fácilmente accesibles por aplicación tópica. Para aplicación por vía tópica a la piel, la composición farmacéutica debería formularse con una pomada adecuada que contiene los componentes activos suspendidos o disueltos en un vehículo. Los vehículos para administración tópica de los compuestos de la presente invención incluyen, pero sin limitación, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol, compuesto de polioxietileno polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Como alternativa, la composición farmacéutica puede formularse con una loción o crema adecuada que contiene el compuesto activo suspendido o disuelto en un vehículo. Los vehículos adecuados incluyen, pero sin limitación, aceite mineral, sorbitán monoestearato, polisorbato 60, cera de cetil ésteres, alcohol cetarílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden aplicarse por vía tópica al tracto intestinal inferior por formulación de supositorio rectal o en una formulación de enema adecuada. También se incluyen parches transdérmicos por vía tópica en la presente invención.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse por aerosol nasal o inhalación. Dichas composiciones se preparan de acuerdo con técnicas bien conocidas en el campo de la formulación farmacéutica y pueden prepararse como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarburos y/u otros agentes solubilizantes o de dispersión conocidos en la técnica.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona un método para producir un anticuerpo de acuerdo con la invención, comprendiendo el método cultivar una o más células aisladas de acuerdo con la dimensión por lo que el anticuerpo se expresa por la célula. Preferentemente, el anticuerpo se secreta por la célula.
De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de una afección relacionada con el tiroides. Como alternativa, se proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención para su uso en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una afección relacionada con el tiroides.
También se proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención para su uso en la terapia médica. En particular, se proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de una afección relacionada con el tiroides. La afección relacionada con el tiroides puede seleccionarse de la hiperactividad del tiroides, enfermedad ocular de Graves, hipertiroidismo neonatal, hipertiroidismo inducido por gonadotropina coriónica
5 humana, mixoedema pre-tibial, cáncer de tiroides y tiroiditis.
De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un método para caracterizar anticuerpos de TSHR que comprende determinar la unión de un anticuerpo de TSHR que se ensaya con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos relacionada con TSHR en el que el método implica una etapa de método que incluye el
10 uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención. Preferentemente, el método comprende determinar los efectos de un anticuerpo de acuerdo con la invención en la unión de un anticuerpo de TSHR con ese polipéptido. El polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos relacionada con TSHR preferentemente comprende TSHR humano de longitud completa.
15 De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un método para caracterizar la TSH y moléculas relacionadas, que comprende determinar la unión de la TSH, o una molécula relacionada que se ensaya, con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos relacionada con TSHR, en el que el método implica una etapa del método que incluye el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención. Los métodos para caracterizar anticuerpos de TSHR o TSH y métodos relacionados descritos anteriormente pueden ser en un formato de ELISA.
20 De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un método para determinar los aminoácidos de TSHR implicados en la unión de los autoanticuerpos de TSHR que actúan como antagonistas, comprendiendo el método proporcionar un polipéptido que tiene una primera secuencia de aminoácidos relacionada con TSHR con la que se une un anticuerpo de acuerdo con la invención, modificar al menos un aminoácido en la secuencia de aminoácidos
25 relacionada con TSHR y determinar el efecto de dicha modificación en la unión del anticuerpo.
Un método de modificación de un anticuerpo de acuerdo con la invención, comprendiendo el método modificar al menos un aminoácido del anticuerpo y determinar un efecto de dicha modificación en la unión con una secuencia relacionada con TSHR. Preferentemente se seleccionan anticuerpos de TSHR modificados que tienen una afinidad
30 potenciada por el TSHR.
De acuerdo un otro aspecto de la invención se proporciona un método para identificar moléculas que inhiben los anticuerpos estimulantes del tiroides que se unen con el TSHR, comprendiendo el método proporcionar al menos un anticuerpo de acuerdo con la invención como referencia. Preferentemente, se seleccionan moléculas que se
35 ensayan que impiden la unión de los anticuerpos estimulantes del tiroides con el TSHR.
También se proporciona un método para identificar moléculas que inhiben la unión de los anticuerpos de bloqueo del tiroides con el TSHR, comprendiendo el método proporcionar al menos un anticuerpo de acuerdo con la invención como referencia. Preferentemente se seleccionan moléculas que impiden la unión de los anticuerpos que bloquean
40 el tiroides con TSHR.
Breve descripción de los dibujos
Se describirán ahora anticuerpos y métodos de acuerdo con la invención, solamente como ejemplo, con referencia a 45 los dibujos adjuntos, Figuras 1 a 4, en los que
La Figura 1 es una serie de tres gráficos que ilustra una comparación de los efectos de los sueros de pacientes con enfermedad de Graves (n = 40) y donantes de sangre sanos (n = 10) en la unión de 125I-IgG 5C9, 125I-TSH o 125I-M22 con tubos recubiertos con TSHR.
50 a unión de 125I-IgG 5C9 frente a 125I-TSH
b unión de 125I-IgG 5C9 frente a 125I-IgG M22
55 c unión de 125I-TSH frente a 125I-IgG M22;
la Figura 2 proporciona secuencias de las secuencias de región variable de cadena pesada (HC) de 5C9
a la secuencia oligonucleotídica de HC 5C9 mostrada en formas no anotada y anotada. En las formas
60 anotadas, las secuencias usadas para cebadores de PCR son las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDR) individuales están encuadradas; y las regiones constantes están en negrita.
b la secuencia de aminoácidos de HC 5C9 derivada de la secuencia oligonucleotídica mostrada en formas anotada y no anotada;
la Figura 3 proporciona secuencias de las secuencias de región variable de la cadena ligera (LC) 5C9:
a la secuencia oligonucleotídica de LC 5C9 mostrada en formas no anotada y anotada (según la figura 2)
b la secuencia de aminoácidos de LC 5C9 derivada de la secuencia oligonucleotídica mostrada en formas no anotada y anotada; y
la Figura 4 ilustra la secuencia de aminoácidos consenso del TSHR humano (nº de referencia P16473, http://www.ncbi. nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&val=62298994).
Descripción detallada
Métodos
Aislamiento de linfocitos y clonación del autoanticuerpo de TSHR monoclonal humano 5C9
El autoanticuerpo monoclonal 5C9 se aisló generalmente usando el procedimiento descrito en el documento WO2004/050708A2. Los linfocitos se aislaron en primer lugar de una muestra de sangre recogida de un paciente con hipotiroidismo posparto y niveles altos de TRAb (se obtuvo la aprobación del Comité de Ética Local). Los linfocitos se infectaron con Virus de Epstein Barr (VEB) (Colección Europea de Cultivos Celulares -ECACC; Porton Down, SP4 0JG, Reino Unido) y se cultivaron en capas de alimentación de macrófagos de ratón como se describe en el documento WO2004/050708A2. Se fusionaron linfocitos inmortalizados que secretan autoanticuerpos de TSHR con una línea celular híbrida de ratón/humana K6H6/B5 (ECACC) y se clonaron cuatro veces por dilución limitante para obtener una única colonia. La presencia de autoanticuerpos de TSHR en sobrenadantes de cultivo celular en diferentes estadios de clonación se detectó mediante la inhibición de la unión de TSH marcada con 125I con el TSHR (documento WO2004/050708A2). Se expandió un único clon que producía el autoanticuerpo de TSHR y se recogieron sobrenadantes de los cultivos para purificación de autoanticuerpos.
Purificación y marcaje de preparaciones de IgG de 5C9
Se purificó IgG 5C9 de sobrenadantes de cultivo usando cromatografía de afinidad de proteína A en MabSelect™ (GE Healthcare, Reino Unido) como se describe en Sanders J, Jeffreys J, Depraetere H, Evans M, Richards T, Kiddie A, Brereton K, Premawardhana LD, Chirgadze DY, Nunez Miguel R, Blundell TL, Furmaniak J, Rees Smith B 2004 Characteristics of a human monoclonal autoantibody to the thyrotropin receptor: sequence structure and function. Thyroid 2004 14: 560-570 y se evaluó la pureza por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (PAGE).
El isotipo de cadena pesada de 5C9 se determinó usando un ensayo de difusión radial (The Binding Site; Birmingham, B29 6AT, Reino Unido), y se determinó el isotipo de cadena ligera por transferencia de Western con anticuerpos monoclonales de ratón específicos anti-cadena kappa humana y anti-cadena lambda humana (Sigma-Aldrich Company Ltd, Poole, Reino Unido).
Se incubó IgG 5C9 a 10 mg/ml en acetato sódico 20 mmol/l pH 4,5 con pepsina inmovilizada preparada de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Perbio Science UK Ltd, Cramlington, Reino Unido) durante 4½ horas a temperatura ambiente con agitación. A continuación, se retiró la pepsina inmovilizada por centrifugación (1000 x g, 5 minutos a temperatura ambiente) y el sobrenadante se dializó frente a NaCl 300 mmol/l, Tris-HCl 10 mmol/l pH 7,5 durante una noche a 4 ºC. La mezcla dializada que contenía F(ab’)2 5C9 y cantidades pequeñas de IgG intacto se separó usando una Matriz de Alta Resolución S-300 de Sephacryl (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Reino Unido). Las preparaciones de F(ab’)2 5C9 purificadas de esta manera no contenían IgG como se valoró por análisis de filtración en gel de SDS-PAGE y HPLC.
Además, se redujo F(ab’)2 usando una concentración final de L-cisteína 100 mmol/l durante 1 hora a 37 ºC. La reacción se detuvo con una concentración final de yodoacetamida de 50 mmol/l durante 30 minutos a temperatura ambiente. El F(ab’) se purificó usando una columna S-300 Sephacryl como anteriormente. Las preparaciones de F(ab’) purificadas de esta manera no contenían F(ab’)2 como se valoró por análisis de filtración en gel SDS-PAGE y HPLC.
Además, se trató IgG 5C9 con mercuripapaína (Sigma, Reino Unido) a una relación de enzima/proteína de 1:100, se dializó en NaCl 50 mmol/l, Tris-HCl pH 9,0 y se pasó a través de una columna de Sepharose de intercambio aniónico (Q-Sepharose Fast flow de GE Healthcare) para separar IgG intacto o Fc de la preparación de Fab. El análisis por SDS-PAGE y la filtración en gel (columna de S-300 Sephacryl; como anteriormente) indicó que IgG intacto era indetectable en la preparación de Fab.
IgG 5C9 se marcó con 125I como se describe en Sanders J, Oda Y, Roberts S, Kiddie A, Richards T, Bolton J, McGrath V, Walters S, Jaskolski D, Furmaniak J, Rees Smith B 1999. The interaction of TSH receptor autoantibodies with 125I-labelled TSH receptor. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 1999 84: 3797-3802) o con hidracida de biotina (Perbio Science, Cramlington, Reino Unido).
Inhibición de la unión de I-TSH o I-M22 o I-5C9 con el TSHR
Se llevaron a cabo ensayos de inhibición de la unión usando tubos recubiertos con TSHR como se describe en el documento WO2004/050708A2. En el ensayo, se incubaron 100 µl de muestra de ensayo (preparación de MAb, suero de pacientes o TSH no marcado) y 50 µl de tampón de partida (RSR Ltd) en tubos recubiertos con TSHR durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Después de la aspiración, los tubos se lavaron y se añadieron 100 µl de proteína marcada con 125I (5 x 104 cpm) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Después los tubos se aspiraron, lavaron y contaron en un contador gamma.
La inhibición de unión de proteína marcada se calculó como:
El material de control fue un grupo de sueros de donantes de sangre sanos o sueros de donantes de sangre sanos 15 individuales u otros materiales como se indica en los resultados de diversos experimentos.
Análisis de Scatchard de la unión de IgG 5C9 con el TSHR
Se incubaron IgG 5C9 no marcado en 50 µl de tampón de ensayo (NaCl 50 mmol/l, Tris 10 mmol/l pH 7,8 y Triton X100 1 %) y 50 µl de IgG 5C9 marcado con 125I (30.000 cpm en tampón de ensayo) en tubos recubiertos con TSHR durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación (la unión máxima se produjo en estas condiciones), se aspiraron, se lavaron dos veces con 1 ml de tampón de ensayo y se contaron en un contador gamma. La concentración de IgG unido frente a unido/libre se representó (Scatchard G 1949 The attraction of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences 51: 660-672) para derivar la constante de
25 asociación.
Análisis de la estimulación de la producción de AMP cíclico
⎡ ⎢⎣
La capacidad de IgG 5C9 y otras preparaciones para estimular la producción de AMP cíclico en células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con el TSHR humano se ensayó como se describe en el documento WO2004/050708A2. Se sembraron células CHO que expresaban aproximadamente 5 x 104 o aproximadamente 5 x 105 TSHR por célula en placas de 96 pocillos a 3 x 104 por pocillo, se adaptaron en DMEM (Invitrogen Ltd, Paisley, Reino Unido) sin suero de ternero fetal y después se añadieron muestras de ensayo (TSH, IgG o suero de paciente) (100 µl diluidos en tampón de ensayo de AMP cíclico, es decir, solución de Sales Tamponadas de Hank sin NaCl
35 que contenían glucosa 1 g/l, HEPES 20 mmol/l, sacarosa 222 mmol/l, albúmina de suero bovino 15 g/l y 3 isobutil-1metilxantina 0,5 mmol/l pH 7,4) y se incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Después de la retirada de las soluciones de ensayo, las células se lisaron y se ensayó la concentración de AMP cíclico en los lisados por uno de dos métodos: 1) usando un sistema de inmunoensayo de enzimas Biotrak de GE Healthcare, Chalfont St Giles, Reino Unido; o 2) usando kits Correlate-EIA de AMP Cíclico Directo de Assay Designs; Cambridge Bioscience, Reino Unido. Los resultados se expresan como pmol/ml de AMP cíclico en el lisado celular (200 µl) o como fmol por pocillo celular.
Medición de la actividad antagonista (bloqueo)
Se evaluó la capacidad de IgG 5C9 y otras preparaciones para inhibir la actividad estimulante de TSH porcina (p),
45 TSH humana nativa (h) y TSH humana recombinante (rh), MAb M22 y TRAb de suero de pacientes en células CHO que expresaban TSHR. Esto se llevó a cabo comparando el efecto estimulante de TSH, M22 o TRAb en ausencia y en presencia de IgG 5C9 (u otras preparaciones que se ensayan). El ensayo se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente excepto que se añadieron 50 µl de 5C9 (u otras preparaciones que se ensayan) diluidas en tampón de ensayo de AMP cíclico a la célula seguido de 50 µl de TSH o M22 o suero de pacientes (diluido según sea apropiado en tampón de ensayo de AMP cíclico) y se incubó y se ensayó como para el ensayo de estimulación descrito anteriormente.
Se ensayaron otros MAb y sueros de pacientes con TRAb de tipo bloqueo en este ensayo además de 5C9.
55 Análisis de genes de región variable
Los genes de región variable de las cadenas pesada y ligera de 5C9 se determinaron como se describe en el documento WO2004/050708A2, usando ARN total preparado a partir de 1 x 107 células de hetero-hibridoma que secretaban IgG 5C9 para producir ARNm para reacciones de RT-PCR (PCR de transcriptasa inversa). Se diseñaron cebadores oligonucleotídicos de cadena con sentido y antisentido IgG1 HC y LC kappa específicos usando el Vbase de Medical Research Council (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) y se sintetizaron por Invitrogen (Paisley, PA4 9RF, Reino Unido). La reacción de RT se llevó a cabo a 50 ºC durante 15 minutos seguido de 40 ciclos de PCR a 94 ºC durante 15 segundos, 50 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 30 segundos. Se clonaron productos de ADN
cpm unido en presencia de material de ensayo
⎤
100
×
−
⎥⎦
cpm unido en presencia de material de control
en pUC18 y se secuenciaron por el método de Sanger-Coulson (Sanger F, Nicklen S, Coulson AR 1977 DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA 74: 54635467). Las secuencias de región V se compararon con secuencias disponibles de genes Ig humanos usando Ig blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/).
Análisis de los efectos de mutaciones de aminoácidos en la secuencia de TSHR humano en la actividad de 5C9
Los métodos usados para introducir mutaciones específicas en la secuencia de TSHR se han descrito en la Solicitud de Patente WO2006/016121A. Además, la transfección de construcciones de TSHR mutado en células CHO usando el sistema Flp-In también se describe en el documento WO2006/016121A.
Se sembraron células Flp-In-CHO que expresaban TSHR de tipo silvestre o mutados en placas de 96 pocillos y se usaron para ensayar la capacidad de preparaciones de 5C9 para bloquear la actividad estimulante de TSH, M22 o TRAb de suero de pacientes como se ha descrito anteriormente.
Ensayos basados en 5C9 para anticuerpos de TSHR, TSH y moléculas relacionadas
Se dializó IgG 5C9 a 2,55 mg/ml en tampón de fosfato sódico 100 mmol/l pH 8,5 y se hizo reaccionar con NHS-LC-Biotina EZ-Link (Perbio) usando una relación molar de IgG y biotina de 1/10. Se incubaron muestras de suero en ensayo (75 µl) en pocillos de placas de ELISA recubiertos con TSHR (RSR Ltd) durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación (500 agitaciones por minuto). Después de retirar las muestras de ensayo y lavar, se añadió IgG 5C9 marcado con biotina (2 ng en 100 µl) y se continuó la incubación durante 25 min a temperatura ambiente sin agitación. Los pocillos se vaciaron, se lavaron y se añadieron 100 µl de estreptavidina-peroxidasa (10 ng en 100 µl; RSR Ltd) y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente sin agitación. Los pocillos se lavaron después
25 tres veces, se añadió el sustrato de peroxidasa tetrametil bencidina (TMB; 100 µl; RSR Ltd) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad sin agitación. Después se añadieron 50 µl de H2SO4 0,5 mol/l para detener la reacción y se leyó la absorbancia de cada pocillo de la placa a 450 nm usando un lector de placas de ELISA. La inhibición de la unión de IgG 5C9-biotina se calculó como:
⎡ absorbancia de muestra de ensayo a 450nm
⎤
100
×
−
⎢⎣
Resultados
Aislamiento y clonación de la línea celular secretora de 5C9
35 Se infectaron linfocitos (27 x 106) obtenidos de 20 ml de la sangre del paciente con VEB y se sembraron a 1x106 células por pocillo en una placa de 48 pocillos en capas de alimentación de macrófagos de ratón. El día 13 después de la infección por VEB los sobrenadantes de pocillos de placas se controlaron con respecto a inhibición de la unión de 125I-TSH. Se expandieron células de los pocillos positivos y se fusionaron con la línea celular de hibridoma K6H6/B5 y se sembraron en placas de 96 pocillos. Se obtuvo un clon que producía de forma estable anticuerpo con actividad inhibidora de la unión de 125I-TSH y se volvió a clonar 4 veces. El anticuerpo monoclonal, designado 5C9, purificado de sobrenadantes de cultivo de hetero-hibridoma era de la subclase de IgG1 con cadenas ligeras kappa.
Actividades de unión con TSHR y bloqueo de IgG 5C9
45 La capacidad de diferentes concentraciones de IgG 5C9 para inhibir la unión de TSH marcada o M22 marcado o 5C9 marcado en sí mismo con el TSHR se muestra en la Tabla 1. Como se muestra en la Tabla 1, se observó 12 % de inhibición de la unión de 125I-TSH con tan poco como 0,005 µg/ml de IgG 5C9 y la inhibición aumentó de una manera dependiente de la dosis hasta el 84 % de la inhibición a 100 µg/ml de 5C9. Esto puede compararse con la inhibición de la unión de 125I-TSH por IgG de suero donante; 13 % de inhibición a 0,05 mg/ml aumentando de una manera dependiente de dosis hasta 94 % de inhibición a 1 mg/ml. En el caso del plasma donante, se observó 16 % de inhibición de la unión de 125I-TSH a una dilución 1:160 en suero agrupado de donantes de sangre sanos y 95 % de inhibición a dilución 1:10.
55 IgG 5C9 también tuvo un efecto en la unión de 125I-IgG M22 con el TSHR que recubría los tubos (Tabla 1). Se observó 9 % de inhibición de la unión de 125I-IgG M22 a 0,01 µg/ml de IgG 5C9 y el aumento de las concentraciones dio como resultado un aumento dependiente de dosis de la inhibición hasta el 85 % a 100 µg/ml. IgG de suero donante fue eficaz a 0,01 mg/ml provocando 9 % de inhibición y el efecto aumentó de una manera dependiente de dosis al 89 % de inhibición a 1 mg/ml. El plasma de suero de donante mostró 13 % de inhibición de la unión de 125I-IgG M22 a una dilución 1:320 y 91 % de inhibición a una dilución 1:10.
IgG 5C9 no marcado fue capaz de inhibir la unión de 125I-5C9 con los tubos recubiertos con TSHR de una manera dependiente de dosis (11 % de inhibición a 0,005 µg/ml hasta 88 % de inhibición a 100 µg/ml) (Tabla 1). La unión de
⎥⎦
absorbancia de suero de control negativo a 450nm
125I-5C9 también se inhibió por IgG de suero de donante (15 % de inhibición a 0,05 mg/ml y 91 % de inhibición a 1 mg/ml) así como diluciones de plasma donante (10 % de inhibición a una dilución 1:320 y 92 % a una dilución 1:10).
La capacidad de IgG 5C9 para bloquear la estimulación mediada por M22 y TSH del AMP cíclico en células CHO que expresaban el TSHR se muestran en las Tablas 2a-c. La TSH porcina (3 ng/ml) estimuló fuertemente la producción de AMP cíclico (19.020 ± 2154 fmol/pocillo celular; media ± DT; n = 3) (Tabla 2a). En presencia de IgG 5C9 0,1 µg/ml la actividad estimulante de TSH porcina se redujo a 11874 ± 4214 fmol/pocillo celular; (media ± DT; n = 3) y el efecto inhibidor fue dependiente de la concentración de 5C9 produciéndose solamente 2.208 ± 329 fmol/pocillo celular de AMP cíclico en presencia de 5C9 1 µg/ml (Tabla 2a). El suero de donante de linfocitos también tuvo un fuerte efecto inhibidor en la estimulación de AMP cíclico mediada por TSH en células CHO-TSHR. Como se muestra en la Tabla 2a, la inhibición de la producción de AMP cíclico hasta aproximadamente 6000 fmol/pocillo celular se produjo en presencia de suero donante a dilución 1:10 (concentración de IgG en suero total a esta dilución de 1,43 mg/ml) en comparación con 19000 fmol/pocillo celular en ausencia de suero. Este efecto correspondía al efecto de aproximadamente 0,37 µg/ml de IgG 5C9 purificado (calculado a partir de la curva de dilución del efecto de diferentes concentraciones de IgG 5C9 mostrado en la Tabla 2a). Esto indica que IgG 5C9 purificado es aproximadamente 3900 veces más activo que el IgG de suero de donante con respecto a la capacidad para bloquear la capacidad de TSH para estimular la producción de AMP cíclico.
Fragmentos de 5C9, tales como F(ab’)2 5C9 y Fab 5C9 también fueron inhibidores eficaces de la estimulación de TSH. En particular, la actividad inhibidora de la estimulación por TSH de IgG 5C9, F(ab’)2 5C9 y Fab 5C9 a 100 µg/ml fue igual (Tabla 2b). A 10 µg/ml las tres preparaciones: IgG 5C9, F(ab’)2 5C9 y Fab 5C9 también fueron inhibidores potentes de la actividad estimulante de TSH. Sin embargo, IgG 5C9 parecía ser más eficaz que F(ab’)2 5C9 o Fab 5C9 (Tabla 2b).
Fab M22 (3 ng/ml) es un estimulante potente de AMP cíclico 9.432 ± 822 fmol/pocillo celular) (Tabla 2c) y en presencia de 5C9 el efecto estimulante de Fab M22 se inhibió de una manera dependiente de dosis, con niveles de AMP cíclicos reducidos a 1.298 ± 134 fmol/pocillo celular en presencia de IgG 5C9 0,1 µg/ml. Se produjo inhibición completa de la estimulación por M22 a 100 µg/ml de 5C9 (Tabla 2c).
El análisis de Scatchard indicó que 5C9 marcado con 125I se unía con el TSHR con una constante de asociación de 4 x 1010 l/mol.
Inhibición de la unión de 125I-IgG 5C9 con el TSHR por TRAb del suero
Se muestra la capacidad de TRAb del suero para inhibir la unión de 125I-IgG 5C9 con tubos recubiertos con TSHR en la Tabla 3 y la Figura 1. Se muestra también para comparar el efecto de los mismos TRAb del suero en la unión de125I-TSH y la unión de 125I-IgG M22.
La unión de 125I-IgG 5C9 con el TSHR no se inhibió notablemente (intervalo de inhibición 3,4-18,9 %) por sueros de 10 donantes de sangre sanos diferentes (N1-N10, Tabla 3). Los sueros de 40 pacientes con enfermedad de Graves (G1-G40, Tabla 3) todos positivos para autoanticuerpos de TSHR en ensayos de inhibición de 125I-TSH y 125I-M22 (Tabla 3) inhibieron la unión de 125I-5C9 con tubos recubiertos con TSHR (intervalo de inhibición 22,0 – 85,2 %) en un mayor grado que los sueros de donantes de sangre sanos (Tabla 3). La capacidad de los TRAb de suero de pacientes para inhibir la unión de 125I-IgG 5C9, 125I-TSH o 125I-IgG M22 con el TSHR fue comparable con un coeficiente de correlación de Pearson r = 0,95 (125I-IgG 5C9 frente a 125I-TSH; Figura Ia) y r = 0,95 (125I-IgG 5C9 frente a 125I-IgG M22; Figura 1b). La Figura 1c muestra la comparación de la inhibición de 121I-TSH y 125I-IgG M22 por los mismos sueros (coeficiente de Pearson r = 0,99).
Estos experimentos muestran que la unión de IgG 5C9 con el TSHR se inhibe eficazmente por TRAb del suero y que el efecto inhibidor de TRAb del suero en la unión de IgG 5C9 es similar a su efecto inhibidor en la unión de TSH o M22.
La Tabla 4 muestra la inhibición de la unión de 125I-IgG 5C9 por diferentes diluciones de TRAb de suero de pacientes con actividad de bloqueo de TSH (B1-B5) y TRAb de suero de pacientes con potente actividad estimulante de tiroides (S1, S2, S4). Se inhibió la unión de 125I-IgG 5C9 de una manera dependiente de dosis por los sueros B1-B5 así como por los sueros S1, S2 y S4. Los mismos sueros de bloqueo y estimulación también inhibieron la unión de125I-TSH y 125I-IgG M22 de una manera dependiente de dosis. Además el porcentaje de inhibición con los tres ligandos marcados fue comparable a las mismas diluciones de sueros (Tabla 4a y b).
Estos resultados indican que los autoanticuerpos de TSHR con actividades tanto de estimulación como de bloqueo inhiben la unión de 5C9 con el TSHR.
Inhibición de la unión de 125I-IgG 5C9 con el TSHR por MAb de ratón con actividad de inhibición de la unión de TSH
La capacidad de diferentes MAb de TSHR de ratón con actividad de inhibición de la unión 125I-TSH para inhibir la unión de 125I-5C9 con el TSHR se ensayó y se comparó con el efecto en la unión de 125I-IgG M22 (Tabla 5). Como se muestra en la Tabla 5 todos los MAb que tenían la capacidad para inhibir la unión de 125I-TSH y 125I-IgG M22 también inhibieron la unión de 125I-5C9 aunque en el caso de algunos MAb el efecto inhibidor en la unión de 125I-5C9 y 125I-M22 fue más débil que en la unión de 125I-TSH.
Estos experimentos que sugieren que hay un solapamiento considerable entre los sitios de unión en el TSHR para 5C9 y para MAb de TSHR de ratón que tiene la capacidad de inhibir la unión de THS.
Efecto de IgG 5C9 en la estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR por sueros de pacientes
Como se muestra en la Tabla 2, IgG 5C9 fue capaz de bloquear la estimulación por TSH o M22 de los niveles de AMP cíclico en células CHO que expresaban TSHR. En una serie diferente de experimentos se ensayó el efecto de IgG 5C9 en la actividad estimulante de TRAb de suero de pacientes y los resultados se muestran en la Tabla 6a. Los sueros T1-T9 y T11-T18 estimularon la producción de AMP cíclico en células CHO-TSHR y la incubación con un MAb de control IgG (2G4 específico para peroxidasa de tiroides humano) no tuvo ningún efecto en sus actividades estimulantes. Sin embargo, en presencia de IgG 5C9 (50 µl de 200 µg/ml), la actividad estimulante de todos los sueros ensayados se redujo notablemente (Tabla 6a).
Se muestran efectos de respuesta a dosis de 6 sueros diferentes (T1, T6, T3, T19, T20, T21) en las Tablas 6b-g. En estos experimentos, las concentraciones de IgG 5C9 que variaban de 0,1 µg/ml a 100 µg/ml provocaron una reducción dependiente de la dosis de la actividad estimulante de suero y el efecto de IgG 5C9 fue comparable al efecto de 9D33, un anticuerpo monoclonal de ratón para el TSHR con actividad de bloqueo (descrito en el documento WO2004/050708A2) en todos los sueros ensayados excepto el suero T3. En el caso del suero T3 (Tabla 6a y 6d) se observó una inhibición de aproximadamente el 50 % de la producción de AMP cíclico en presencia de IgG 5C9 100 µg/ml, mientras que IgG 9D33 100 µg/ml dio como resultado inhibición casi completa. Esto sugirió que podría haber algunas diferencias menores entre los epítopos reconocidos por 5C9 y 9D33.
Efecto de IgG 5C9 en la producción de AMP cíclico basal (es decir, no estimulada) en células CHO que expresaban TSHR
Además de inhibir la actividad estimulante de anticuerpos de TSH y TSHR, 5C9 inhibió la cantidad de AMP cíclico producida en ausencia de estos estimulantes de tiroides. En particular, la Tabla 6b muestra 1207 ± 123 fmol/pocillo celular de AMP cíclico producido en presencia de IgG monoclonal de control (2G4) 100 µg/ml reducido a 301 ± 38 fmol/pocillo celular en presencia de IgG 5C9 100 µg/ml. Los efectos de IgG 9D33 fueron menores con 721 ± 183 fmol/pocillo celular producidos en presencia de IgG 9D33 100 µg/ml. Se obtuvieron resultados similares en los experimentos separados mostrados en las Tablas 6d, 6e, 6f y 6g. Esto indica que IgG 5C9 tiene un efecto notable en la actividad basal o constitutiva del TSHR.
Efecto de IgG 5C9 en la estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan THSR que contienen mutaciones de aminoácidos
Los efectos de mutaciones de aminoácidos individuales en el TSHR en la capacidad de 5C9 para bloquear la actividad estimulante de AMP cíclico de TSH porcino en células CHO-TSHR se muestran en la Tabla 7. En particular, el efecto de 5C9 en la estimulación de la producción de AMP cíclico se estudió en células CHO que expresaban el TSHR con los siguientes restos mutados a alanina: Lys 58, Ile 60, Arg 80, Tyr 82, Thr 104, Arg 109, Lys 129, Phe 134, Asp 151, Lys 183, Gln 235, Arg 255, Trp 258, Ser 281. Además, se estudió el efecto de una mutación de cambio de carga en el caso de restos de TSHR: Arg80Asp, Asp151Arg, Lys183Asp, Arg255Asp, en los que de acuerdo con la notación convencional el resto de aminoácido que se reemplaza, y su posición en el polipéptido de secuencia primaria, se indica antes del resto de aminoácido de reemplazo. Estudios previos han mostrado que la mutación de cambio de carga de Asp160Lys de TSHR provocaba una pérdida de sensibilidad del TSHR a TSH mientras que la respuesta a M22 no se veía afectaba (Solicitud de Patente WO2006/016121A). En consecuencia, se estudió el efecto de la mutación Asp160Lys de TSHR en la actividad biológica de 5C9 usando M22 como un estimulante de AMP cíclico en células CHO-TSHR (Tabla 7l).
De todas las mutaciones de TSHR estudiadas, se descubrió que solamente tres mutaciones afectaban a la capacidad de 5C9 para actuar como un antagonista. La mutación de Lys129 a Ala (Tabla 7h) dio como resultado una pérdida completa de la capacidad de IgG 5C9 para bloquear la estimulación por TSH de la producción de AMP cíclico.
Además la mutación de TSHR Lys183Ala provocó una reducción parcial de la actividad de bloqueo de IgG 5C9; se observó una inhibición del 28 % de la estimulación de TSH a 1 µg/ml cuando se ensayó con la mutación Lys183Ala
de TSHR en comparación con 84 % de inhibición con TSHR de tipo silvestre (Tabla 7m). Incluso a 100 µg/l de IgG 5C9, solamente era detectable inhibición parcial de la estimulación de TSH (43 %) en los experimentos con mutación Lys183Ala de TSHR mientras que a esta concentración se observaba un bloqueo completo de la actividad estimulante de TSH (93 %) en los experimentos con receptores de tipo silvestre (Tabla 7m). Cuando se mutó Lys 183 con carga positiva a ácido aspártico con carga negativa, el efecto de la actividad biológica de 5C9 era similar al observado con la mutación Lys 183 Ala (Tabla 7m). Esto sugiere que Lys183 es importante para la actividad biológica de 5C9. En el caso de la mutación de Asp151Ala, se observó una ligera reducción de la actividad de bloqueo de IgG 5C9: 49 % de inhibición a 1 µg/ml en comparación con 88 % de inhibición con el tipo silvestre (Tabla 7j). Sin embargo, en presencia de IgG 5C9 100 µg/ml la actividad era igual que con el TSHR de tipo silvestre. Cuando Asp151 con carga negativa se mutó a arginina con carga positiva, no se observó una reducción significativa en la actividad de bloqueo de IgG 5C9 (Tabla 7k).
El efecto de las mutaciones de TSHR en la actividad de 5C9 puede compararse con los efectos de las mutaciones de TSHR en la actividad de 9D33. Como se describe en la Solicitud de Patente WO2006/016121A, las mutaciones de TSHR Lys 58, Arg 80, Tyr 82, Arg 109, Lys 129 y Phe 134 tuvieron un efecto en la actividad de 9D33. Ninguna de estas mutaciones excepto Lys129, sin embargo, tuvo ningún efecto además en la actividad de 5C9. Además, ninguna de las mutaciones excepto Lys 129 que afectaron a la actividad de M22 (Arg 80, Tyr 82, Glu 107, Arg 109, Lys 129, Phe 130, Lys 183, Tyr 185, Arg 255 y Trp 258) como se describe en la Solicitud de Patente WO 2006/016121 A afectó a la actividad de 5C9. Además, la mutación de Lys 183 tuvo un efecto parcial en la actividad de 5C9 y la actividad de M22 pero no tuvo ningún efecto en la actividad de 9D33.
Estos resultados indican que hay diferencias con respecto a los restos de TSHR importantes para la interacción con el autoanticuerpo humano estimulante de tiroides M22, con el anticuerpo de bloqueo de ratón 9D33 y con el autoanticuerpo de bloqueo humano 5C9. En consecuencia, una combinación de 5C9 con otros anticuerpos de TSHR con actividades antagonistas (tales como 9D33) puede ser un medio particularmente eficaz para inhibir la actividad estimulante de TRAb de suero de pacientes, otros estimulantes y/o la actividad constitutiva de TSHR.
Secuencias de región variable de 5C9
El análisis de secuencia de los genes que codificaban 5C9 indicó que los genes de la región V HC eran de la familia VH3-53, los genes D de la familia D2-2 y los genes J de la familia JH4. En el caso de la LC, los genes de la región V eran de la familia 012 y los genes de la región J de la línea germinal JK2. Se muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de HC en las Figuras 2a y 2b, respectivamente, y se muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de LC en las Figuras 3a y 3b, respectivamente.
Hay mutaciones somáticas en la secuencia génica de HC comparada con las secuencias de línea germinal; en particular 1 mutación silenciosa en FWR1, 2 mutaciones de reemplazo en CDR2, 1 mutación silenciosa y 1 de reemplazo en CDR3 y una mutación silenciosa en FWR4. Sin embargo, la secuencia de región V HC se caracteriza por dos inserciones; una de 6 pares de bases de longitud entre los genes V y D y una de 15 pares de bases de longitud entre los genes D y J. En consecuencia, la CDR1 HC es de 5 aminoácidos de longitud, la CDR2 es de 16 aminoácidos de longitud y la CDR3 es de 18 aminoácidos de longitud (Figura 2b).
En la secuencia de LC hay: 1 mutación silenciosa en FWR1, 1 mutación de reemplazo en CDR1, 1 mutación de reemplazo en CDR3 y una inserción de 6 pares de bases de longitud entre los genes V y J. La CDR1 LC está compuesta de 11 aminoácidos, CDR2 de 7 aminoácidos y CDR3 de 10 aminoácidos (Figura 3b).
Ensayos basados en 5C9 para la detección de TSH o TRAb
Se muestra un ejemplo de un ELISA basado en la unión de IgG 5C9 biotina con pocillos de placas recubiertos con TSHR para la detección de autoanticuerpos de TSHR en la Tabla 8. En este ensayo todas las muestras positivas para la inhibición de la unión de TSH-biotina también fueron positivas para la unión de IgG 5C9-biotina. Además, la señal de absorbancia, el porcentaje de inhibición y los valores de unidades/l derivados eran comparables en los ensayos de TSH-biotina y 5C9-biotina (Tabla 8).
Efecto de IgG 5C9 en la actividad estimulante de anticuerpos monoclonales estimulantes del tiroides de ratón (MAb de TSHR de ratón; TSMAb) en células CHO que expresan TSHR
Como se muestra en la Tabla 9, IgG 5C9 fue capaz de bloquear la estimulación de la producción de AMP cíclico por los cinco TSMAb (1, 2, 4, 5 y 7) ensayados. Por ejemplo, TSMAb1 (Tabla 9) estimuló los niveles de AMP cíclico a 18,94 ± 7,4 pmol/ml mientras que en presencia de IgG 5C9 100 µg/ml solamente se producían 1,24 ± 0,07 pmol/ml de AMP cíclico. Esto puede compararse con los niveles de AMP cíclico de 16,5 ± 1,1 pmol/ml en presencia del MAb 2G4 de control 100 µg/ml (Tabla 9).
Los niveles de AMP cíclico mostrados en la Tabla 9, así como en las Tablas 10-15 posteriores, se expresan en pmol/ml, es decir, los niveles de AMP cíclico por pocillo celular son: pmol/ml ÷ 5 (que representa 200 µl de la
muestra de cada pocillo ensayado).
Efecto de IgG 5C9 en la actividad estimulante de TSH humana nativa y TSH humana recombinante en células CHO que expresan TSHR
La capacidad de IgG 5C9 para bloquear la estimulación de AMP cíclico de TSH porcina se muestra en la Tabla 2 y en la Tabla 10. Además IgG 5C9 mostró la capacidad de inhibir la estimulación de AMP cíclico tanto de TSH humana nativa (preparación de referencia NIBSC 81/565 del Instituto Nacional para los Patrones y Control Biológicos, South Mimms, Potters Bar EN6 3QG Reino Unido) como de TSH recombinante (preparación de referencia de NIBS 94/674) (Tabla 10). En particular la estimulación de la producción de AMP cíclico por 100 ng/ml de TSH humana recombinante o nativa requiere 0,1 – 1,0 µg/ml de IgG 5C9 para obtener la inhibición completa de la producción de AMP cíclico. En el momento de la recogida de sangre para el aislamiento de 5C9 los niveles de TSH en circulación en el suero donante fueron de 160 mU/l (aproximadamente 32 ng/ml), los resultados obtenidos (Tabla 2a y Tabla 10) indican que este nivel de TSH en circulación se bloquearía completamente en presencia de IgG 5C9 32-320 ng/ml en el suero. Se estimó que los niveles de autoanticuerpos de TSHR en el suero donante, usando la inhibición de la unión de 125I-M22 con el TSHR (como se describe en Nakatake N, Sanders J, Richards T, Burne P, Barrett C, Dal Pra C, Presotto F, Betterle C, Furmaniak J, Rees Smith B 2006 Estimation of serum TSH receptor autoantibody concentration and affinity. Thyroid 16: 1077-1084), eran de 1700 ng/ml (120 ng/ml), es decir, varias veces mayores que la concentración de 5C9 requerida para bloquear la estimulación de tiroides por TSH.
Efecto de IgG 5C9 en la actividad de AMP cíclico basal (es decir, no estimulada) en células CHO que expresan TSHR con las mutaciones de activación S281I, I568T y A623I
IgG 5C9 fue capaz de reducir la cantidad de AMP cíclico producido en células CHO que expresaban TSHR con mutaciones de activación cuando estaban ausentes estimulantes del tiroides (es decir, anticuerpos de TSH o TSHR). Como se muestra en la Tabla 11a la concentración de AMP cíclico basal en células CHO que expresaban el TSHR con la mutación de activación S281I fue de 9,90 ± 1,51 pmol/ml en ausencia de 5C9 y esta se redujo a 4,17 ± 0,60 pmol/ml en presencia de IgG 5C9 0,01 µg/ml y a 3,44 ± 0,63 pmol/ml en presencia de IgG 5C9 1 µg/ml. El MAb de TSHR de ratón de bloqueo 9D33 tuvo poco efecto, como también lo tuvo el MAb 2G4 de control (Tabla 11a).
Se obtuvieron resultados similares con la mutación de activación de TSHR I568T (Tabla 11b), que mostró una concentración de AMP cíclico basal de 21,39 ± 5,31 pmol/ml. Esta se redujo a 5,29 ± 0,75 pmol/ml tras la adición de IgG 5C9 1 µg/ml en comparación con 20,52 ± 0,95 pmol/ml y 21,65 ± 1,99 pmol/ml en el caso de la adición de IgG 2G4 e IgG 5C9, respectivamente. En el caso de una tercera mutación de activación de TSHR estudiada, es decir, A623I con concentración de AMP cíclico basal de 36,89 pmol/ml, la adición de IgG 5C9 1 µg/ml redujo los niveles de AMP cíclico a 16,43 ± 1,27 pmol/ml en comparación con pocos efectos con IgG 2G4 de control 1 µg/ml (28,96 ± 2,29 pmol/ml) o IgG 9D33 1 µg/ml (40,09 ± 7,73 pmol/ml) (Tabla 11c).
Estos resultados indican que 5C9 a diferencia del MAb de bloqueo de ratón 9D33 tiene un efecto notable en la producción de AMP cíclico asociada con las mutaciones de activación de TSHR incluso cuando las mutaciones están en diferentes partes del TSHR (es decir, S281I en el dominio extracelular, I568T en el segundo bucle extracelular del dominio transmembrana y A623I en el tercer bucle intracelular del dominio transmembrana).
Comparación del efecto de 5C9 y un anticuerpo monoclonal de bloqueo de TSHR de ratón 9D33 y la mezcla de los dos anticuerpos en la estimulación mediada por TSH de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan el TSHR de tipo silvestre
El MAb 5C9 que bloquea el TSHR humano y el MAb 9D33 que bloquea el TSHR de ratón a concentraciones tan bajas como 1 µg/ml tienen la capacidad de bloquear la actividad estimulante de AMP cíclico de TSHR de TSH en células CHO-TSHR como se ha mostrado en experimentos previos y en la Tabla 12. Los efectos de IgG 9D33 e IgG 5C9 en la estimulación mediada por TSH del AMP cíclico fueron aditivos como se muestra en la Tabla 12; Experimentos 1-5. Se observó el mismo efecto aditivo cuando se usaron dos concentraciones diferentes de TSH (3 ng/ml y 0,3 ng/ml) para estimulación (Tabla 12; Experimentos 1-3 y Experimentos 4 y 5, respectivamente).
Comparación del efecto de 5C9 y un anticuerpo monoclonal de bloqueo de TSHR de ratón 9D33 y la mezcla de los dos anticuerpos en la estimulación mediada por M22 de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan el TSHR de tipo silvestre
Como se ha mostrado antes, 5C9 y 9D33 también eran capaces de inhibir la estimulación mediada por Fab M22 del AMP cíclico en células CHO-TSHR. Los efectos del IgG 9D33 e IgG 5C9 en la estimulación mediada por M22 del AMP cíclico fueron aditivos (Tabla 13 Experimentos 1-4). Se observó el mismo efecto aditivo cuando se usaron dos concentraciones diferentes de Fab M22 (3 ng/ml y 0,3 ng/ml) para estimulación (Tabla 13; Experimentos 1 y 2 y Experimentos 3 y 4, respectivamente).
Los efectos aditivos de IgG 5C9 e IgG 9D33 fueron similares para la estimulación mediada tanto por TSH como por M22 de la producción de AMP cíclico (Tablas 12 y 13).
Efecto de 5C9 en la actividad de AMP cíclico basal (es decir no estimulada) en células CHO que expresan un número alto de TSHR de tipo silvestre por célula
Una línea celular CHO que expresaba aproximadamente 5 x 105 receptores por célula mostró niveles mayores de AMP cíclico basal (es decir no estimulado) en comparación con una línea celular CHO convencional (que expresaba aproximadamente 5 x 104 TSHR por célula) usada en experimentos previos (por ejemplo Tablas 9-13) es decir 47,1 ± 11,7 pmol/ml en comparación con aproximadamente 1,0 pmol/ml, respectivamente. El efecto de IgG 5C9 e IgG 9D33 en la actividad basal de TSHR de tipo silvestre se evaluó usando la línea celular que expresaba un número alto de receptores por célula. La incubación con IgG 9D33 y un anticuerpo de control negativo para GAD (5B3) dio como resultado una inhibición de la actividad de AMP cíclico basal de 0-5,3 % (Tabla 14; Experimento 1) lo que indica que el MAb de ratón de bloqueo 9D33 o el MAb de control no tienen ningún efecto en la producción de AMP cíclico basal en las células CHO que expresan el TSHR de tipo silvestre. Sin embargo, en el caso de IgG 5C9 se observó una clara inhibición de la actividad de AMP cíclico basal (Tabla 14; Experimento 2) provocando 0,1 µg/ml y 10 µg/ml una inhibición del 45,7 % y 74,6 % respectivamente. Además, Fab 5C9 y F(ab’) 5C9 también fueron inhibidores eficaces de la actividad de AMP cíclico basal en células CHO que expresaban un alto número de TSHR por célula (Tabla 14 experimento 3). Por ejemplo, Fab 5C9 1 µg/ml y 100 µg/ml mostraron 39 % y 61 % de inhibición de la producción de AMP cíclico basal, respectivamente en comparación con el 48 % de inhibición por F(ab’) 5C9 a 100 µg/ml (Tabla 14 experimento 3).
Efecto de los autoanticuerpos de TSHR de suero del paciente con actividad antagonista (es decir de bloqueo) en la actividad de AMP cíclico basal (es decir, no estimulada) en células CHO que expresan TSHR con la mutación de activación I568T
La producción de AMP cíclico basal por células TSHR I568T en presencia de tampón de ensayo de AMP cíclico de 20,5 ± 8,7 pmol/ml esencialmente no se vio afectada por la adición de sueros agrupados normales de donantes de sangre sanos (NPS) o 3 sueros de donantes de sangre sanos individuales (N1-N3) ensayados a una dilución 1/10 y 1/50. La producción de AMP cíclico basal en presencia de NPS y sueros N1-N3 mostró una inhibición del 0-14 % en comparación con la producción de AMP cíclico basal en presencia de tampón de ensayo de AMP cíclico (Tabla 15). Sin embargo, en presencia de 4 sueros diferentes con altos niveles de TRAb de tipo bloqueo (B2-B5) se observó una inhibición de la producción de AMP cíclico basal del 23-89 % (Tabla 15). En presencia de IgG 5C9 (1 µg/ml), se observó una inhibición de la actividad de AMP cíclico basal por TSHR I568T del 83 %. También se muestra el efecto de respuesta a dosis de 2 sueros de bloqueo (B3 y B4) en la producción de AMP cíclico basal en células CHO que expresan TSHR con mutación I568T en la Tabla 15.
Estos resultados indican que 5C9 tienen la característica de actividad de bloqueo de TSHR de autoanticuerpos de TSHR de bloqueo de pacientes en particular con respecto a la inhibición de la producción de AMP cíclico basal en el mutante de activación de TSHR I568T.
Efecto de los autoanticuerpos de TSHR de suero de pacientes con actividad antagonista en la actividad de AMP cíclico basal (es decir no estimulada) en células CHO que expresan TSHR con la mutación de activación S281I
La producción de AMP cíclico basal por células TSHR S281I en presencia de tampón de ensayo de AMP cíclico fue de 11,2 ± 2,0 pmol/ml y la incubación con sueros agrupados de donantes de sangre sanos o sueros de donantes de sangre sanos individuales (diluidos 1/10 o 1/50) no tuvo ningún efecto (Tabla 16). Por el contrario, en presencia de 4 sueros diferentes con altos niveles de tipo bloqueo de TRAb (B2-B5) se observó una inhibición de la producción de AMP cíclico basal del 31-56 % (Tabla 16). IgG 5C9 a 1 µg/ml provocó una inhibición del 71 % de la actividad de AMP cíclico basal en los experimentos con TSHR S281I.
Efecto de los autoanticuerpos de TSHR de suero de pacientes con actividad antagonista en la actividad de AMP cíclico basal (es decir no estimulada) en células CHO que expresan TSHR con la mutación de activación A623I
La producción de AMP cíclico basal en el caso de células de TSHR A623I fue de 43,5 ± 11,2 pmol/ml en presencia de tampón de ensayo de AMP cíclico y esencialmente no se vio afectada por la incubación con sueros agrupados o individuales de donantes de sangre sanos (Tabla 17). La incubación con cuatro sueros diferentes con altos niveles de tipo de bloqueo de TRAb (B2-B5) provocó una inhibición del -1 % al 56 % del AMP cíclico en estos experimentos (Tabla 17). Esto puede compararse con la inhibición del 49 % por IgG 5C9 a 1 µg/ml en el mismo experimento.
Efecto de los autoanticuerpos de TSHR de suero de pacientes con actividad antagonista en la actividad de AMP cíclico basal (es decir no estimulada) en células CHO que expresan aproximadamente 5x105 TSHR de tipo silvestre por célula.
La producción de AMP cíclico basal en células CHO que expresaban un mayor número de TSHR de tipo silvestre
por célula fue de 28,1 ± 0,7 pmol/ml en esta serie de experimentos. Cuando las células se incubaron con sueros agrupados o individuales de donantes de sangre sanos (N1-N3) a diluciones de 1/10 los niveles de AMP cíclico basales variaron entre el 99 % y el 146 % de los niveles de AMP cíclico en presencia de tampón de ensayo de AMP cíclico mientras que a las diluciones 1/50 el intervalo fue del 93 % al 137 %. De 4 sueros con autoanticuerpos de TSHR de tipo bloqueo ensayados, un suero (B2) no tuvo ningún efecto en la producción de AMP cíclico basal (Tabla 18). En el caso de dos sueros (B3 y B5) los niveles de AMP cíclico aumentaron en relación con los niveles observados en presencia de tampón de ensayo de AMP cíclico (Tabla 18). Podría ser que los sueros B3 y B5 contengan una mezcla de autoanticuerpos de TSHR con actividades estimulantes y de bloqueo. Por el contrario, el suero B4 tuvo un claro efecto inhibidor en la producción de AMP cíclico basal a dilución 1/10 y 1/50, es decir, 31 % y 61 % respectivamente de los niveles de AMP cíclico basales en relación con los niveles en presencia de tampón de ensayo de AMP cíclico (Tabla 18). Esto puede compararse con los niveles en presencia de IgG 5C9 a 1 µg/ml de 33 % en relación con los niveles en presencia de tampón de ensayo de AMP cíclico (Tabla 18).
En general IgG 5C9 muestra efectos similares en la producción de AMP cíclico basal en células CHO transfectadas con TSHR de tipo silvestre o con TSHR con mutaciones de activación a los efectos observados con sueros de pacientes positivos para autoanticuerpos de TSHR de tipo bloqueo. Sin embargo, el efecto de los sueros de pacientes individuales varía en el caso de mutaciones diferentes (Tabla 19). En el caso de TSHR de tipo silvestre algunos sueros muestran un efecto estimulante supuestamente debido a la presencia de autoanticuerpos estimulantes de TSHR así como autoanticuerpos de bloqueo (Tabla 19).
Efecto de 5C9 en la estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR que contienen mutaciones de aminoácidos
El efecto de 5C9 en la estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR con mutaciones de aminoácidos se extendió para incluir las siguientes mutaciones a alanina: Asp43, Glu61, His105, Glu107, Phe130, Glu178, Tyr185, Asp203, Tyr206, Lys209, Asp232, Lys250, Glu251, Thr257, Arg274, Asp276 (Tabla 20 a-p y resumido en la Tabla 21).
La mutación de los aminoácidos de TSHR Asp43, Glu61, His105, Glu107, Tyr185, Asp232 y Thr257 a alanina no tuvo ningún efecto en la capacidad de IgG 5C9 para inhibir la producción de AMP cíclico estimulada por TSH. La capacidad de 5C9 para inhibir la producción de AMP cíclico estimulada por TSH se redujo por mutación de TSHR Phe130, Glu178, Asp203, Tyr206, Lys250, Glu251 y Asp276 a alanina. En el caso de 2 mutaciones Lys209Ala y Arg274Ala, se potenció la capacidad de IgG 5C9 para inhibir la producción de AMP cíclico mediada por TSH.
En resumen (Tablas 7, 20 y 21), todos los 10 restos de TSHR Lys129, Phe130, Asp151, Glu178, Lys183, Asp203, Tyr206, Lys250, Glu251 y Asp276 redujeron la capacidad de 5C9 para inhibir la estimulación de AMP cíclico por TSH en comparación con el TSHR de tipo silvestre. La mutación de TSHR Lys129 y Asp203 mostró el mayor efecto y provocó inhibición completa de la actividad de 5C9.
Efecto de los sueros de bloqueo B2-B5 en la estimulación mediada por TSH de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresaban TSHR de tipo silvestre en comparación con TSHR mutado Asp203Ala
El efecto de bloqueo de 5C9 1 µg/ml en el TSHR de tipo silvestre (92 % de inhibición de la estimulación de AMP cíclico inducida por TSH) se redujo al 4 % en el caso de la mutación de TSHR Asp203Ala (Tabla 22).
La actividad de suero de bloqueo B4 no se vio afectada por la mutación de TSHR Asp203Ala mientras que se vio una ligera reducción del porcentaje de inhibición de la estimulación de AMP cíclico inducida por TSH con los sueros de bloqueo B2 y B3 en el caso de TSHR Asp203Ala en comparación con el TSHR de tipo silvestre.
En el caso de un suero B5, se observó una reducción notable en el porcentaje de inhibición de la estimulación de AMP cíclico inducida por TSH; es decir 69 % de inhibición en comparación con el 30 % de inhibición en TSHR de tipo silvestre y mutado respectivamente.
El efecto de la mutación de TSHR Asp203Ala en la actividad de 5C9 fue mayor que el efecto en la actividad de los sueros de bloqueo, sin embargo, la actividad de bloqueo de 3/4 sueros ensayados se vio afectada en diversos grados. Esto puede indicar que los sitios de unión para los autoanticuerpos de TSHR de bloqueo y 5C9 se solapan pero hay algunas diferencias en los aminoácidos de TSHR que de hecho están en contacto con sueros diferentes.
Sumario y conclusiones
Los experimentos descritos anteriormente proporcionan pruebas de que un anticuerpo de acuerdo con la invención tal como 5C9 es capaz de bloquear la actividad de estimulación de diferentes estimulantes de tiroides, incluyendo anticuerpos estimulantes de TSHR humano y de ratón, TSH humana y animal nativa y TSH humana recombinante. Además, se proporcionan pruebas de que dos anticuerpos de tipo bloqueo diferentes, es decir, un MAb 5C9 humano y un MAb 9D33 de ratón que, cuando se ensayan individualmente, tienen la capacidad de bloquear la estimulación mediada por TSH o M22 del AMP cíclico en células CHO que expresan el TSHR, muestran efecto de bloqueo aditivo
en la estimulación por TSH o M22 cuando se mezclan entre sí.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención tales como 5C9 tienen un efecto nuevo en la actividad de AMP cíclico basal (es decir no estimulada) por TSHR. Estos efectos se han estudiado por experimentos usando células CHO 5 transfectadas con TSHR que tienen mayores niveles de AMP cíclico basal, es decir, el efecto de bloqueo de los anticuerpos de acuerdo con la invención, tal como 5C9, en la actividad de AMP cíclico basal se ha confirmado. Además, se ha mostrado que algunos sueros con autoanticuerpos de TSHR con actividad de bloqueo (antagonista) tienen la capacidad de bloquear la actividad de AMP cíclico basal en estas células transfectadas con TSHR. Los experimentos también proporcionan pruebas del efecto de bloqueo de los anticuerpos de acuerdo con la invención,
10 tales como 5C9, y los autoanticuerpos de bloqueo de TSHR del suero en la actividad de AMP cíclico basal asociada con mutaciones de TSHR de activación.
Estos resultados enfatizan que 5C9 es un MAb humano que muestra las características de autoanticuerpos de TSHR de tipo bloqueo, es decir que es representativo de los autoanticuerpos de TSHR del suero de pacientes
15 asociados con enfermedad de tiroides autoinmunitarias.
Los experimentos descritos también permitieron la identificación de algunos de los aminoácidos de TSHR importantes para la actividad de bloqueo de los anticuerpos de acuerdo con la invención.
20 En general, los resultados indican que los anticuerpos de acuerdo con la invención, tales como 5C9, muestran actividad de unión a TSHR similar y efectos biológicos similares en la función de TSHR como autoanticuerpos de bloqueo de TSHR hallados en diferentes sueros de pacientes con enfermedad de tiroides autoinmunitaria. En consecuencia, teniendo características y actividad biológica de autoanticuerpos de TSHR de bloqueo de suero, los anticuerpos de acuerdo con la invención, tales como 5C9, tienen aplicaciones para la inactivación del TSHR en
25 diversas condiciones clínicas. Estas condiciones incluyen la activación de TSHR mediada por TSH, la activación de TSHR mediada por autoanticuerpos de TSHR estimulantes del tiroides, actividad de TSHR basal (no estimulada, constitutiva) y la activación de TSHR asociada con mutaciones de TSHR activadoras. En consecuencia, los anticuerpos de acuerdo con la invención, tales como 5C9 tienen aplicaciones para el tratamiento y control de las afecciones asociadas con la activación de TSHR mencionadas anteriormente; por ejemplo enfermedad de Graves,
30 oftalmopatía de Graves, hipertiroidismo debido a mutaciones activadoras de TSHR, hipertiroidismo debido a niveles anómalos de TSH (patológicos o farmacológicos), cáncer de tiroides y metástasis de cáncer de tiroides.
Tabla 1
Inhibición de la unión de 125I-TSH, 125I-IgG M22 o 125I-IgG 5C9 con tubos recubiertos con TSHR por IgG 5C9, IgG de donante de linfocitos y plasma de donante de linfocitos
Muestra
125I-TSH (% de inhibición) 125I-IgG M22 (% de inhibición) 125I-5C9 (% de inhibición)
Plasma donante (diluido en grupo de HBD)
1/5
97 92 93
1/10
95 91 92
1/20
82 85 82
1/40
57 75 56
1/80
30 53 29
1/160
16 29 13
1/320
8 13 10
IgG de donante (diluido en IgG agrupado de HBD 1 mg/ml
1 mg/ml
94 89 91
0,5 mg/ml
90 86 89
0,25 mg/ml
63 79 64
0,1 mg/ml
29 51 26
0,05 mg/ml
13 29 15
0,025 mg/ml
2 17 5
0,01 mg/ml
5 9 1
IgG 5C9 (diluido en 2G4 100 µg/ml)
100 µg/ml
84 85 88
50 µg/ml
76 81 80
25 µg/ml
67 69 71
10 µg/ml
54 60 59
5 µg/ml
47 53 54
2,5 µg/ml
42 43 49
1 µg/ml
37 31 42
0,5 µg/ml
33 32 41
0,1 µg/ml
29 22 3 4
0,05 µg/ml
25 19 30
0,01 µg/ml
13 9 15
0,005 µg/ml
12 5 11
0,001 µg/ml
3 2 3
El % promedio de unión de indicador marcado con tubos recubiertos con TSHR fue: 14 % en los experimentos con 125I-TSH; 21 % en los experimentos con 125I-IgG M22 y 20 % en los experimentos con 125I-5C9 Grupo de HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos 2G4 = IgG de control (MAb humano para peroxidasa de tiroides)
Tabla 2a
Efecto de IgG 5C9 o IgG de suero de donante de linfocitos en la estimulación por TSH de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR humano
Muestra
Concentración de IgG AMP cíclico (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3)
pTSH (3 ng/ml) solamente
19020 ± 2154
IgG 5C9 solamente
1 µg/ml 141 ± 5
IgG 5C9 + pTSH (3 ng/ml)
1 µg/ml 2208 ± 329
IgG 5C9 + pTSH (3 ng/ml)
0,5 µg/ml 4754 ± 876
IgG 5C9 + pTSH (3 ng/ml)
0,1 µg/ml 11874 ± 4214
IgG 5C9 + pTSH (3 ng/ml)
0,08 µg/ml 14525 ± 3690
IgG 5C9 + pTSH (3 ng/ml)
0,06 µg/ml 132901
IgG 5C9 + pTSH (3 ng/ml)
0,04 µg/ml 13928 ± 1572
IgG 5C9 + pTSH (3 ng/ml)
0,02 µg/ml 16432 ± 9286
IgG 5C9 + pTSH (3 ng/ml)
0,01 µg/ml 18969 ± 5308
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
207 ± 51
Suero de donantea 1/10
1,43 mg/mlb 1102 ± 46
Suero de donante 1/10 + pTSH (3 ng/ml)
1,43 mg/ml 5931 ± 350
Suero de donante 1/20 + pTSH (3 ng/ml)
0,715 mg/ml 16886 ± 728
Suero de donante 1/30 + pTSH (3 ng/ml)
0,477 mg/ml 16453 ± 3455
Suero de donante 1/40 + pTSH (3 ng/ml)
0,358 mg/ml 17716 ± 1753
Suero de donante 1/50 + pTSH (3 ng/ml)
0,286 mg/ml 17928 ± 4772
Suero de donante 1/100 + pTSH (3 ng/ml)
0,143 mg/ml 18226 ± 2268
1Determinación individual aEl suero del donante se diluyó en tampón de ensayo de AMP cíclico como se indicabLa concentración de IgG de suero no diluido determinada por nefelometría fue de 14,3 mg/ml IgG 5C9 y TSH se diluyeron en tampón de ensayo de AMP cíclico
Tabla 2b
Inhibición de la producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR por IgG 5C9, fragmentos F(ab’)2 y Fab Ejemplo 1
Muestra
AMP cíclico (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3)
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
586 ± 148
TSH 3 ng/ml solamente
18557 ± 363
Fab 5C9 100 µg/ml solamente
235 ± 35
Fab 5C9 100 µg/ml + TSH
938 ± 93
Fab 5C9 10 µg/ml + TSH
1283 ± 239
F(ab’)2 5C9 100 µg/ml solamente
204 ± 12
F(ab’)2 5C9 100 µg/ml + TSH
877 ± 195
F(ab’)2 5C9 10 µg/ml + TSH
916 ± 188
IgG 5C9 100 µg/ml solamente
237 ± 54
IgG 5C9 100 µg/ml + TSH
754 ± 177
IgG 5C9 10 µg/ml + TSH
247 ± 115
IgG 2G4 100 µg/ml + TSH
60821
Ejemplo 2
Muestra
AMP cíclico (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3)
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
584 ± 111
TSH 3 ng/ml solamente
19363 ± 5198
IgG 2G4 100 µg/ml solamente
608 ± 169
IgG 2G4 100 µg/ml + TSH
18147 ± 972
IgG 2G4 10 µg/ml + TSH
18114 ± 6544
F(ab’)2 5C9 100 µg/ml solamente
414 ± 22
F(ab’)2 5C9 100 µg/ml + TSH
1058 ± 223
F(ab’)2 5C9 10 µg/ml + TSH
1333 ± 443
IgG 5C9 100 µg/ml solamente
338 ± 108
IgG 5C9 100 µg/ml + TSH
1109 ± 375
IgG 5C9 10 µg/ml + TSH
723 ± 71
Fab 5C9 100 µg/ml solamente
212 ± 37
Fab 5C9 100 µg/ml + TSH
867 ± 127
Fab 5C9 10 µg/ml + TSH
4131 ± 776
1media de muestras por duplicado 2G4 = IgG de control (MAb humano para peroxidasa de tiroides). Las preparaciones de anticuerpo y TSH se diluyeron en tampón de ensayo de AMP cíclico.
Tabla 2c
Efecto de IgG 5C9 e IgG 9D33 en la estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR humano por TSH o Fab M22
Muestra de ensayo
Producción de AMP cíclico (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3)
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
473 ± 21
pTSH 3 ng/ml solamente
12.270 ± 980
IgG 5C9 100 µg/ml solamente
426 ± 27
IgG 5C9 10 µg/ml solamente
360 ± 53
IgG 5C9 1 µg/ml solamente
376 ± 18
IgG 5C9 0,1 µg/ml solamente
404 ± 42
IgG 5C9 0,01 µg/ml solamente
578 ± 65
IgG 5C9 0,001 µg/ml solamente
554 ± 47
IgG 5C9 100 µg/ml + pTSH 3 ng/ml
1094 ± 70
IgG 5C9 10 µg/ml + pTSH 3 ng/ml
1028 ± 47
IgG 5C9 1 µg/ml + pTSH 3 ng/ml
1872 ± 168
IgG 5C9 0,1 µg/ml + pTSH 3 ng/ml
3920 ± 464
IgG 5C9 0,01 µg/ml + pTSH 3 ng/ml
15.050 ± 386
IgG 5C9 0,001 µg/ml + pTSH 3 ng/ml
14.147 ± 1,310
IgG 9D33 100 µg/ml solamente
626 ± 127
IgG 9D33 100 µg/ml + pTSH 3 ng/ml
2.218 ± 5
Fab M22 3 ng/ml solamente
9.432 ± 822
IgG 5C9 100 µg/ml + Fab M22 3 ng/ml
354 ± 56
IgG 5C9 10 µg/ml + Fab M22 3 ng/ml
6381 ± 190
IgG 5C9 1 µg/ml + Fab M22 3 ng/ml
956 ± 169
IgG 5C9 0,1 µg/ml + Fab M22 3 ng/ml
1.298 ± 134
IgG 5C9 0,01 µg/ml + Fab M22 3 ng/ml
9.978 ± 919
IgG 5C9 0,001 µg/ml + Fab M22 3 ng/ml
11.614 ± 393
IgG 9D33 100 µg/ml + Fab M22 3 ng/ml
1.048 ± 10
1media de muestras por duplicado 9D33 es un anticuerpo de ratón que bloquea la estimulación mediada tanto por TSH como por TRAb de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan el TSHR. Se diluyeron preparaciones de anticuerpo y TSH en tampón de ensayo de AMP cíclico.
Tabla 3
Unión de 125I-IgG 5C9, 125I-TSH y 125I-IgG M22 con tubos recubiertos con TSHR e inhibición por muestras de suero de pacientes
Muestra de suero
Inhibición de la unión de 125I5C9 (%) Inhibición de la unión de 125I-TSH (%) Inhibición de la unión de 125I-M22 (%)
N1
15,7 0 9,3
N2
3,3 1,2 7,2
N3
15,3 1,9 0,7
N4
4,0 4,2 0
N5
18,9 6,3 11,4
N6
5,9 2,9 1,4
N7
17,1 7,2 9,4
N8
5,5 0 0
N9
11,2 4,2 2,9
N10
10,5 6,5 5,8
G1
79,6 83,6 80,5
G2
75,8 77,5 73,5
G3
82,2 77,5 78,1
G4
77,7 74,9 74,8
G5
77,0 73,6 71,5
G6
64,7 71,6 69,1
G7
75,6 74,3 66,0
G8
73,7 74,7 77
G9
76,1 78,5 79,2
G10
75,9 75,8 69,9
G11
81,6 82,5 79,7
G12
71,6 76,6 73,9
G13
72,3 71,1 70,2
G14
81,9 85,8 80,9
G15
84,9 85,3 84,4
G16
80,5 84,9 81,7
G17
85,0 86,9 85,3
G18
84,9 85 84,2
G19
85,1 87,3 85,4
G20
84,4 89,3 87,7
G21
77,6 84,9 77,0
G22
67,1 59,7 61,5
G23
57,5 62,2 59,5
G24
65,7 67,1 64,4
G25
59,3 56,3 62,3
G26
38,4 67,7 69,4
G27
22,0 59,1 58,9
G28
68,3 69,7 72,8
G29
40,9 54,2 50,4
G30
71,2 69,1 72
G31
62,2 59,2 62,0
G32
46,0 40,6 49,2
G33
44,0 25,9 37,2
G34
52,0 48 55,0
G35
60,1 54,4 60,7
G36
29,3 31,4 43,2
G37
49,0 44,1 45,5
G38
40,1 26,7 29,8
G39
66,4 54,7 58,9
G40
48,8 48,5 48,5
N1-10 = sueros de donantes de sangre sanos G1-G40 = sueros de pacientes con un historial de enfermedad de Graves
Los resultados son la media de determinaciones por duplicado en estrecho acuerdo.
⎡
×
100
⎤
⎥⎦
A
% de inhibición 100
−
=
⎢⎣
B
en la que A = unión en presencia de suero de ensayo; B = unión en presencia de un grupo de sueros de donantes de sangre sanos (grupo de HBD).
125I-5C9 en presencia del grupo de HBD proporcionó 20 % de unión, 125I-TSH en presencia del grupo de HBD proporcionó 12 % de unión y 125I-M22 en presencia del grupo de HBD proporcionó 17 % de unión.
Tabla 4a
Comparación de la inhibición de la unión de 125I-IgG 5C9, 125I-TSH y 125I-IgG M22 con tubos recubiertos con TSHR por suero de pacientes con actividad de bloqueo o estimulante
Muestras de ensayo
Inhibición de la unión de 125I-5C9 (%) Inhibición de la unión de 125I-TSH (%) Inhibición de la unión de 125I-M22 (%)
Calibradores de ensayo
40 U/l
87 90 84,4
8 U/l
62 67 63,0
2 U/l
15 27 25,6
1 U/l
4,3 15 14,8
Suero de control positivo
34 35 38,7
Sueros de bloqueo
B1
1/5
93 95 91,7
1/10
92 94 89,2
1/20
91 91 85,9
1/40
85 80 78,8
1/80
67 55 67,4
1/160
33 33 45,9
1/320
20 17 26,4
B2
1/5
92 91 86,6
1/10
85 85 79,5
1/20
NE 73 66,2
1/40
68 51 50,0
1/80
42 34 29,7
1/160
19 22 20,3
1/320
NE 13 7,8
B3
1/5
89 93 85,5
1/10
82 84 76,3
1/20
62 64 61,7
1/40
37 44 42,5
1/80
14 26 26,2
1/160
NE 12 16,6
1/320
NE 7 8,9
B4
1/5
93 94 90,3
1/10
93 95 88,5
1/20
92 93 85,1
1/40
89 89 81,1
1/80
78 76 72,1
1/160
56 54 56,9
1/320
34 37 39,9
B5
1/5
94 93 90,3
1/10
91 92 87,0
1/20
87 87 82,2
1/40
74 72 71,7
1/80
56 47 54,6
1/160
31 29 36,4
1/320
19 17 21,4
Suero de estimulación
S1
1/5
89 91 84,9
1/10
80 84 75,4
1/20
63 67 62,9
1/40
42 50 46,2
1/80
26 34 31,9
1/160
9 21 16,3
1/320
16 4 10,6
Tabla 4b
Muestras de ensayo
Inhibición de la unión de 125I-5C9 (%) Inhibición de la unión de 125I-TSH (%) Inhibición de la unión de 125I-M22 (%)
Calibradores de ensayo
40 U/l
87,2 90,4 82,2
8 U/l
62,0 67,2 63,3
2 U/l
21,3 22,0 27,9
1 U/l
15,0 13,0 21,8
Suero de control positivo
34,2 31,4 38,6
Grupo de HBD
6,2 -0,6 12,5
S2
Puro
91,8 95,1 88,6
1/5
76,7 84,5 72,7
1/10
62,3 71,4 66,4
1/20
48,2 57,0 51,9
1/40
31,8 39,3 41,4
1/80
21,3 19,4 32,9
1/160
16,8 9,7 25,1
S4
Puro
91,0 92,9 86,2
1/5
71,0 72,4 68,7
1/10
55,5 55,6 57,4
1/20
39,9 34,0 46,3
1/40
27,3 16,4 35,4
1/80
17,0 8,6 25,4
1/160
16,1 2,1 19,5
B1-B5 son sueros de pacientes con altos niveles de TRAb con actividad antagonista (de bloqueo). B3 es suero del donante de linfocitos para 5C9 S1, S2 y S4 son sueros de pacientes con altos niveles de TRAb con actividad agonista (estimulante).
Los calibradores de ensayo 40 U/l, 8 U/l, 2 U/l y 1 U/l son diluciones de IgG M22 en un grupo de sueros de donantes de sangre sanos (grupo de HBD) con actividades en U/l de NIBSC 90/672 evaluadas por la inhibición de la unión de TSH marcada con tubos recubiertos de TSHR.
⎡
×
100
⎤
⎥⎦
A
% de inhibición 100
−
=
⎢⎣
B
en la que A = muestra de ensayo; B = grupo de HBD NE = No Ensayado 1/5, 1/10, etc. indican el factor de dilución de sueros de ensayo en grupo de HBD, puro = suero no diluido
En presencia del grupo de HBD aproximadamente el 20 %, 17 % y 12 % del IgG M22, IgG 5C9 y TSH marcados con125I se unieron respectivamente con los tubos recubiertos con TSHR.
Tabla 5
Inhibición de la unión de TSH marcada con 125I, 125I-IgG M22 y 125I-IgG 5C9 con tubos recubiertos con TSHR por diferentes concentraciones de MAb de ratón con el TSHR
Muestra de ensayo
125I-TSH (% de inhib.) 125I-IgG M22 (% de inhib.) 125I-IgG 5C9 (% de inhib.)
IgG 5C9 100 µg/ml IgG 5C9 10 µg/ml IgG 5C9 1 µg/ml IgG 5C9 0,1 µg/ml IgG 5C9 0,01 µg/ml
50 30 21 8 2 53 22 14 6 5 65,5 42 27 10 0
IgG 7C711 100 µg/ml IgG 7C71 10 µg/ml IgG 7C71 1 µg/ml IgG 7C71 0,1 µg/ml IgG 7C71 0,01 µg/ml
65 55 47 28 8 68 64 58 37 14 82 65 53 17 5
IgG 10C311 100 µg/ml IgG 10C31 10 µg/ml IgG 10C31 1 µg/ml IgG 10C31 0,1 µg/ml IgG 10C31 0,01 µg/ml
68 56 52 39 15 69 71 62 48 24 76 62 54 36 8
IgG 2E711 100 µg/ml IgG 2E71 10 µg/ml IgG 2E71 1 µg/ml IgG 2E71 0,1 µg/ml IgG 2E71 0,01 µg/ml
51 41 35,5 30 14,5 63 62 59 43 15 60 52 48 32 17,5
IgG 3E711 100 µg/ml IgG 3E71 10 µg/ml IgG 3E71 1 µg/ml IgG 3E71 0,1 µg/ml IgG 3E71 0,01 µg/ml
49 37 37 21,5 12 51 51 45 28 15 65 50 40 21 3
IgG 14D31 100 µg/ml IgG 14D3 10 µg/ml IgG 14D3 1 µg/ml IgG 14D3 0,1 µg/ml IgG 14D3 0,01 µg/ml
57 52 37 12,5 4 62 60 37 15 3 63 50,5 35 10 1
IgG 16E51 100 µg/ml IgG 16E5 10 µg/ml IgG 16E5 1 µg/ml IgG 16E5 0,1 µg/ml IgG 16E5 0,01 µg/ml
48 44 39 26 9 53 51 40 22 12 59 53 47 34 20
IgG 17D21 100 µg/ml IgG 17D2 10 µg/ml IgG 17D2 1 µg/ml IgG 17D2 0,1 µg/ml IgG 17D2 0,01 µg/ml
56 43 24 7 3 49 39 24 13 1 55 43 26 11 3
IgG M22 100 µg/ml IgG M22 10 µg/ml IgG M22 1 µg/ml IgG M22 0,1 µg/ml IgG M22 0,01 µg/ml
95 95 94 77 22 95 94 93 79 32 88 89 87 72 24
IgG 9D332 100 µg/ml IgG 9D33 10 µg/ml IgG 9D33 1 µg/ml IgG 9D33 0,1 µg/ml IgG 9D33 0,01 µg/ml
69 65 55 31 8 61 60 48 27 13 70 60 48 29 13
IgG 2G43 100 µg/ml IgG 2G4 10 µg/ml IgG 2G4 1 µg/ml IgG 2G4 0,1 µg/ml
3 3 0 4 3 4 0 6 6 10 8 4
IgG 2G4 0,01 µg/ml
0 0 0
IgG 2B44 100 µg/ml IgG 2B4 10 µg/ml IgG 2B4 1 µg/ml IgG 2B4 0,1 µg/ml IgG 2B4 0,01 µg/ml
88,5 85 82 56 13,5 30 19 9 12 1 72 48 42 23 8
IgG 8E34 100 µg/ml IgG 8E3 10 µg/ml IgG 8E3 1 µg/ml IgG 8E3 0,1 µg/ml IgG 8E3 0,01 µg/ml
82,5 72 53 17 5 27 18 8 0,5 0 65 42 23 9 0
IgG 4E24 100 µg/ml IgG 4E2 10 µg/ml IgG 4E2 1 µg/ml IgG 4E2 0,1 µg/ml IgG 4E2 0,01 µg/ml
76 74 57 25 4 24 21 15 2 1 32 32 20 11 5
IgG 1D54 100 µg/ml IgG 1D5 10 µg/ml IgG 1D5 1 µg/ml IgG 1D5 0,1 µg/ml IgG 1D5 0,01 µg/ml
77 72 55 23 4 26 20 8 0 0 26 20 13 3 0
IgG 7C44 100 µg/ml IgG 7C4 10 µg/ml IgG 7C4 1 µg/ml IgG 7C4 0,1 µg/ml IgG 7C4 0,01 µg/ml
78 76 72 38 9 24 22 22 7 6 51 35 36 19 6
IgG 3E64 100 µg/ml IgG 3E6 10 µg/ml IgG 3E6 1 µg/ml IgG 3E6 0,1 µg/ml IgG 3E6 0,01 µg/ml
84 79 71 28 3 46 31 16 5 0 55 40 29 9 6
IgG 1C524 100 µg/ml IgG 1C52 10 µg/ml IgG 1C52 1 µg/ml IgG 1C52 0,1 µg/ml IgG 1C52 0,01 µg/ml
64 39 22 5 0 22 9 5 4 2 30 15 15 11 10
IgG 7B724 100 µg/ml IgG 7B72 10 µg/ml IgG 7B72 1 µg/ml IgG 7B72 0,1 µg/ml IgG 7B72 0,01 µg/ml
88 77 50 16 8 32 21 14 2 1 39 27 22 13 4
IgG 8E25 100 µg/ml IgG 8E2 10 µg/ml IgG 8E2 1 µg/ml IgG 8E2 0,1 µg/ml IgG 8E2 0,01 µg/ml
52 24,5 8 13 0 52 24 3 1 0 32 12 1 8 13
IgG 18C56 100 µg/ml IgG 18C5 10 µg/ml IgG 18C5 1 µg/ml IgG 18C5 0,1 µg/ml IgG 18C5 0,01 µg/ml
57 17 3,5 3 0,7 50 14 2 0 0 51 24 17 13 14
IgG 2G27 100 µg/ml IgG 2G2 10 µg/ml IgG 2G2 1 µg/ml IgG 2G2 0,1 µg/ml IgG 2G2 0,01 µg/ml
0,1 3 6 2 2 0 0,6 1,5 0,2 1,4 11 10 12 9 11
1MAb de TSHR de ratón con actividad estimulante del tiroides 2MAb de TSHR de ratón que bloquea la estimulación mediada tanto por TSH como por TRAb de la producción de AMP cíclico (véase Tabla 2)3MAb humano para MAb de peroxidasa de tiroides (control negativo)4MAb de TSHR de ratón con actividad de bloqueo de TSH (reconoce un epítopo formado por los aminoácidos
de TSHR 381-385) 5MAb de TSHR de ratón con actividad de bloqueo de TSH (reconoce un epítopo formado por los aminoácidos de TSHR 36-42) 6MAb de TSHR de ratón con actividad de bloqueo de TSH (reconoce un epítopo formado por los aminoácidos de TSHR 246-260) 7MAb de Tg de ratón (control negativo)
Los anticuerpos se diluyeron en un grupo de sueros de donantes de sangre sanos (grupo de HBD)
⎡
⎤
A
% de inhibición 100
×
100
−
=
⎢⎣
⎥⎦
B
5 en la que A = % de unión en presencia de muestra de ensayo; B = % de unión en presencia de grupo de HBD.
En presencia del grupo de HBD, aproximadamente el 13 %, 24 % y 15 % de IgG 5C9, IgG M22 y TSH marcados con125I se unieron respectivamente con los tubos recubiertos con TSHR.
10 Tabla 6a
Efecto de IgG 5C9 en la estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresaban TSHR humano por TRAb en sueros de pacientes Experimento 1a
Muestra de ensayo
AMP cíclico (fmol/pocillo celular media ± DT; n = 3)
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
378 ± 21
Grupo de HBD solamente
352 ± 38
Grupo de HBD + IgG 2G4
316 ± 54
Grupo de HBD + IgG 5C9
136 ± 46
T1 solamente
13734 ± 580
T1 + IgG 2G4
10928 ± 740
T1 + IgG 5C9
142 ± 4
T2 solamente
1716 ± 185
T2 + IgG 2G4
1362 ± 190
T2 + IgG 5C9
146 ± 4
T3 solamente
11722 ± 1280
T3 + IgG 2G4
11948 ± 3200
T3 + IgG 5C9
5660 ± 790
T4 solamente
6388 ± 820
T4 + IgG 2G4
6022 ± 710
T4 + IgG 5C9
188 ± 65
T5 solamente
3084 ± 990
T5 + IgG 2G4
2152 ± 240
T5 + IgG 5C9
152 ± 15
T6 solamente
14802 ± 1475
T6 + IgG 2G4
10878 ± 675
T6 + IgG 5C9
232 ± 25
Experimento 1b
Muestra de ensayo
AMP cíclico (fmol/pocillo celular media ± DT; n = 3)
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
434 ± 52
Grupo de HBD solamente
518 ± 216
Grupo de HBD + IgG 2G4
378 ± 34
Grupo de HBD + IgG 5C9
178 ± 47
T7 solamente
7388 ± 1250
T7 + IgG 2G4
5696 ± 715
T7 + IgG 5C9
id
T8 solamente
17361
T8 + IgG 2G4
13921
T8 + IgG 5C9
id
T9 solamente
50521
T9 + IgG 2G4
50001
T9 + IgG 5C9
id
Experimento 1c
Muestra
AMP cíclico (fmol/pocillo celular media ± DT; n = 3)
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
366 ± 316
Grupo de HBD solamente
646 ± 62
Grupo de HBD + IgG 2G4
496 ± 42
Grupo de HBD + IgG 5C9
294 ± 92
T13 solamente
4030 ± 1146
T13 + IgG 2G4
3330 ± 63
T13 + IgG 5C9
540 ± 36
T14 solamente
5490 ± 197
T14 + IgG 2G4
4470 ± 1867
T14 + IgG 5C9
510 ± 146
Tr15 solamente
2130 ± 387
T15 + IgG 2G4
2380 ± 320
T15 + IgG 5C9
id
T16 solamente
4990 ± 155
T16 + IgG 2G4
5270 ± 941
T16 + IgG 5C9
id
T17 solamente
4410 ± 470
T17 + IgG 2G4
4460 ± 288
T17 + IgG 5C9
id
T18 solamente
910 ± 126
T18 + IgG 2G4
830 ± 21
T18 + IgG 5C9
id
Experimento 1d
Muestra
AMP cíclico (fmol/pocillo celular media ± DT; n = 3)
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
487 ± 75
Grupo de HBD solamente
285 ± 71
Grupo de HBD + IgG 2G4
311 ± 68
Grupo de HBD + IgG 5C9
108 ± 33
T11 solamente
4052 ± 233
T11 + IgG 2G4
4659 ± 1260
T11 + IgG 5C9
154 ± 33
T12 solamente
4058 ± 721
T12 + IgG 2G4
5556 ± 593
T12 + IgG 5C9
145 ± 24
id = indetectable 1 = determinación por duplicado El grupo de HBD es un grupo de suero de donante de sangre sano; se usó dilución 1:10 en tampón de ensayo de AMP cíclico en estos experimentos. T1-T9 y T11-T18 son sueros que estimulan la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan el TSHR. T1-T9 y T11-T18 se ensayaron diluidos 1:10 en tampón de ensayo de AMP cíclico 2G4 es un anticuerpo monoclonal humano para peroxidasa de tiroides (control negativo). Se ensayaron IgG 2G4 e IgG 5C9 a 100 µg/ml.
Tabla 6b
Efectos de respuesta a dosis de IgG 5C9 e IgG 9D33 en la estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR humano por TRAb en sueros de pacientes Experimento 2
Muestras de ensayo
AMP cíclico (fmol/pocillo celular media ± DT; n = 3)
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
707 ± 147
Grupo de HBD solamente
503 ± 80
T1 solamente
20336 ± 1539
IgG 2G4 100 µg/ml (IgG de control negativo) solamente
1207 ± 123
T1 + IgG 2G4 100 µg/ml
22078 ±6 2546
T1 + IgG 2G4 10 µg/ml
18868 ± 1806
T1 + IgG 2G4 1 µg/ml
19025 ±6 1450
T1 + IgG 2G4 0,1 µg/ml
16659 ± 1031
T1 + IgG 2G4 0,01 µg/ml
20876 ± 1887
T1 + IgG 2G4 0,001 µg/ml
18134 ± 2126
IgG 9D33 100 µg/ml solamente
721 ± 183
T1 + IgG 9D33 100 µg/ml
1061 ± 104
T1 + IgG 9D33 10 µg/ml
1464 ± 191
T1 + IgG 9D33 1 µg/ml
4990 ± 1670
T1 + IgG 9D33 0,1 µg/ml
17867 ± 2220
T1 + IgG 9D33 0,01 µg/ml
19943 ± 1834
T1 + IgG 9D33 0,001 µg/ml
21648 ± 502
IgG 5C9 100 µg/ml solamente
301 ± 38
T1 + IgG 5C9 100 µg/ml
724 ± 28
T1 + IgG 5C9 10 µg/ml
1119 ± 348
T1 + IgG 5C9 1 µg/ml
2428 ± 594
T1 + IgG 5C9 0,1 µg/ml
16152 ± 3577
T1 + IgG 5C9 0,01 µg/ml
20314 ± 279
T1 + IgG 5C9 0,001 µg/ml
16868 ± 912
T1 es una muestra de suero de paciente que estimula la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan el TSHR; se usó una dilución 1:10 en el tampón de ensayo de AMP cíclico en estos experimentos. 2G4 es un anticuerpo monoclonal humano para peroxidasa de tiroides (control negativo). 9D33 es un anticuerpo monoclonal de ratón para el TSHR que bloquea la producción de AMP cíclico estimulada tanto por TSH como por TRAb (véase Tabla 2).
Tabla 6c
Efectos de respuesta a dosis de IgG 5C9 en la estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR humano por TRAb de sueros de pacientes Experimento 3
Muestras de ensayo
AMP cíclico (fmol/pocillo celular media ± DT; n = 3)
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
757 ± 138
Grupo de HBD solamente
512 ± 76
T6 solamente
14216 ± 3985
IgG 9D33 100 µg/ml solamente
729 ± 31
T6 + IgG 9D33 100 µg/ml
1052 ± 702
T6 + IgG 9D33 10 µg/ml
2256 ± 1088
T6 + IgG 9D33 1 µg/ml
5447 ± 313
T6 + IgG 9D33 0,1 µg/ml
8700 ± 665
T6 + IgG 9D33 0,01 µg/ml
10290 ± 495
T6 + IgG 9D33 0,001 µg/ml
102961
IgG 5C9 100 µg/ml solamente
360 ± 38
T6 + IgG 5C9 100 µg/ml
295 ± 30
T6 + IgG 5C9 10 µg/ml
1027 ± 368
T6 + IgG 5C9 1 µg/ml
2368 ± 528
T6 + IgG 5C9 0,1 µg/ml
9533 ± 1679
T6 + IgG 5C9 0,01 µg/ml
13883 ± 1718
T6 + IgG 5C9 0,001 µg/ml
11843 ± 1241
1determinación individual Véase Tabla 6a y 6b para notas explicativas.
Tabla 6d
Efectos de respuesta a dosis de IgG 5C9 en la estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR humano por TRAb en sueros de pacientes
Muestra
AMP cíclico (fmol/pocillo celular media ± DT; n = 3)
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
622 ± 79
Grupo de HBD solamente
479 ± 53
T3 solamente
14023 ± 2487
IgG 2G4 100 µg/ml solamente
745 ± 136
T3 + IgG 2G4 100 µg/ml
12086 ± 2613
T3 + IgG 2G4 10 µg/ml
12862 ± 250
T3 + IgG 2G4 1 µg/ml
12931 ± 891
T3 + IgG 2G4 0,1 µg/ml
13853 ± 1589
T3 + IgG 2G4 0,01 µg/ml
11939 ± 131
T3 + IgG 2G4 0,001 µg/ml
13650 ± 1679
IgG 9D33 100 µg/ml solamente
616 ± 111
T3 + IgG 9D33 100 µg/ml
1597 ± 323
T3 + IgG 9D33 10 µg/ml
4262 ± 367
T3 + IgG 9D33 1 µg/ml
7385 ± 554
T3 + IgG 9D33 0,1 µg/ml
11960 ± 1390
T3 + IgG 9D33 0,01 µg/ml
12178 ± 1676
T3 + IgG 9D33 0,001 µg/ml
12159 ± 2970
IgG 5C9 100 µg/ml solamente
212 ± 40
T3 + IgG 5C9 100 µg/ml
6136 ± 558
T3 + IgG 5C9 10 µg/ml
7806 ± 793
T3 + IgG 5C9 1 µg/ml
8075 ± 610
T3 + IgG 5C9 0,1 µg/ml
10414 ± 1094
T3 + IgG 5C9 0,01 µg/ml
13743 ± 1687
T3 + IgG 5C9 0,001 µg/ml
11641 ± 2168
Véase Tabla 6a y 6b para notas explicativas.
Tabla 6e
Efectos de respuesta a dosis de IgG 5C9 en la estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR humano por TRAb de sueros de pacientes
Muestra
AMP cíclico (fmol/pocillo celular media ± DT; n = 3)
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
616 ± 161
Grupo de HBD solamente
312 ± 56
T19 solamente
6014 ± 280
IgG 2G4 100 µg/ml solamente
1058 ± 75
T19 + IgG 2G4 100 µg/ml
7142 ± 215
T19 + IgG 2G4 10 µg/ml
6182 ± 46
T19 + IgG 2G4 1 µg/ml
7280 ± 1052
T19 + IgG 2G4 0,1 µg/ml
7275 ± 145
T19 + IgG 2G4 0,01 µg/ml
6820 ± 729
T19 + IgG 2G4 0,001 µg/ml
7620 ± 870
IgG 9D33 100 µg/ml solamente
592 ± 168
T19 + IgG 9D33 100 µg/ml
550 ± 65
T19 + IgG 9D33 10 µg/ml
448 ± 76
T19 + IgG 9D33 1 µg/ml
404 ± 36
T19 + IgG 9D33 0,1 µg/ml
23941
T19 + IgG 9D33 0,01 µg/ml
57651
T19 + IgG 9D33 0,001 µg/ml
7088 ± 668
IgG 5C9 100 µg/ml solamente
1862
T19 + IgG 5C9 100 µg/ml
220 ± 90
T19 + IgG 5C9 10 µg/ml
275 ± 150
T19 + IgG 5C9 1 µg/ml
187 ± 34
T19 + IgG 5C9 0,1 µg/ml
375 ± 129
T19 + IgG 5C9 0,01 µg/ml
5747 ± 411
T19 + IgG 5C9 0,001 µg/ml
64671
1 media de muestras por duplicado 2 determinación individual Véase Tabla 6a y 6b para notas explicativas.
Tabla 6f
Efectos de respuesta a dosis de IgG 5C9 en la estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR humano por TRAb en sueros de pacientes
Muestra
AMP cíclico (fmol/pocillo celular media ± DT; n = 3)
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
255 ± 40
Grupo de HBD solamente
200 ± 82
T20 solamente
4764 ± 732
IgG 2G4 100 µg/ml solamente
835 ± 94
T20 + IgG 2G4 100 µg/ml
6684 ± 931
T20 + IgG 2G4 10 µg/ml
4571 ± 776
T20 + IgG 2G4 1 µg/ml
5744 ± 727
T20 + IgG 2G4 0,1 µg/ml
4323 ± 849
T20 + IgG 2G4 0,01 µg/ml
6396 ± 1314
T20 + IgG 2G4 0,001 µg/ml
6789 ± 893
IgG 9D33 100 µg/ml solamente
382 ± 142
T20 + IgG 9D33 100 µg/ml
287 ± 164
T20 + IgG 9D33 10 µg/ml
204 ± 49
T20 + IgG 9D33 1 µg/ml
9801
T20 + IgG 9D33 0,1 µg/ml
5362 ± 574
T20 + IgG 9D33 0,01 µg/ml
5389 ± 1139
T20 + IgG 9D33 0,001 µg/ml
7514 ± 785
IgG 5C9 100 µg/ml solamente
224 ± 109
T20 + IgG 5C9 100 µg/ml
NE
T20 + IgG 5C9 10 µg/ml
NE
T20 + IgG 5C9 1 µg/ml
1811
T20 + IgG 5C9 0,1 µg/ml
2184 ± 1078
T20 + IgG 5C9 0,01 µg/ml
6486 ± 436
T20 + IgG 5C9 0,001 µg/ml
48561
1 media de muestras por duplicado NE = No Ensayado Véase Tabla 6a y 6b para notas explicativas.
Tabla 6g
Efectos de respuesta a dosis de IgG 5C9 en la estimulación de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR humano por TRAb en sueros de pacientes
Muestra
AMP cíclico (fmol/pocillo celular media ± DT; n = 3)
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
466 ± 65
Grupo de HBD solamente
390 ± 118
T21 solamente
9781 ± 1672
IgG 2G4 100 µg/ml solamente
999 ± 55
T21 + IgG 2G4 100 µg/ml
10848 ± 373
T21 + IgG 2G4 10 µg/ml
10355 ± 469
T21 + IgG 2G4 1 µg/ml
10831 ± 140
T21 + IgG 2G4 0,1 µg/ml
12215 ± 793
T21 + IgG 2G4 0,01 µg/ml
13014 ± 855
T21 + IgG 2G4 0,001 µg/ml
10500 ± 162
IgG 9D33 100 µg/ml solamente
534 ± 89
T21 + IgG 9D33 100 µg/ml
442 ± 32
T21 + IgG 9D33 10 µg/ml
605 ± 254
T21 + IgG 9D33 1 µg/ml
1383 ± 66
T21 + IgG 9D33 0,1 µg/ml
8719 ± 389
T21 + IgG 9D33 0,01 µg/ml
10772 ± 799
T21 + IgG 9D33 0,001 µg/ml
10229 ± 714
IgG 5C9 100 µg/ml solamente
253 ± 25
T21 + IgG 5C9 100 µg/ml
210 ± 60
T21 + IgG 5C9 10 µg/ml
303 ± 107
T21 + IgG 5C9 1 µg/ml
418 ± 65
T21 + IgG 5C9 0,1 µg/ml
7483 ± 415
T21 + IgG 5C9 0,01 µg/ml
10441 ± 122
T21 + IgG 5C9 0,001 µg/ml
11281 ± 911
Véase Tabla 6a y 6b para notas explicativas.
Tabla 7a
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys58 mutada a Alanina. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
315 ± 39 822 ± 52 260
TSH solamente
10730 ±1737 13228 ± 1428 123
2G4 10 µg/ml + TSH
11707 ± 2291 12883 ± 2107 110
2G4 100 µg/ml + TSH
9640 ± 1664 10148 ± 3680 105
5C9 0,01 µg/ml + TSH
7341 ± 343 7913 ± 880 108
5C9 0,1 µg/ml + TSH
4635 ± 257 48151 104
5C9 1,0 µg/ml + TSH
918 ± 159 1794 ± 308 195
5C9 10 µg/ml + TSH
351 ± 187 955 ± 405 272
5C9 100 µg/ml + TSH
528 ± 363 1001 ± 306 190
5C9 100 µg/ml solamente
47 ± 15 <25 -
1 media de determinaciones por duplicado concentración de pTSH = 3 ng/ml Todas las diluciones en tampón de ensayo de AMP cíclico 2G4 es un anticuerpo monoclonal humano para peroxidasa de tiroides (control negativo para 5C9).
Tabla 7b
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Ile60 mutada a Alanina. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
470 ± 92 837 ± 78 114
TSH solamente
186541 22935 ± 2542 123
2G4 10 µg/ml + TSH
175551 22960 ± 4312 131
2G4 100 µg/ml + TSH
18654 ± 3979 24488 ± 4501 131
5C9 0,01 µg/ml + TSH
8018 ± 276 18952 ± 1811 236
5C9 0,1 µg/ml + TSH
7097 ± 613 11609 ± 1415 164
5C9 1,0 µg/ml + TSH
1568 ± 133 3290 ± 64 210
5C9 10 µg/ml + TSH
1772 ± 632 1211 ± 343 68
5C9 100 µg/ml + TSH
1733 ± 132 3134 ± 794 181
5C9 100 µg/ml solamente
61 ± 8 260 ± 43 426
Véase Tabla 7a para notas explicativas.
Tabla 7c
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Arg80 mutada a Alanina. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
775 ± 66 1165 ± 32 150
TSH solamente
12467 ± 510 12930 ± 179 104
2G4 10 µg/ml + TSH
13600 ± 1555 14849 ± 462 109
2G4 100 µg/ml + TSH
11726 ± 177 13539 ± 314 115
5C9 0,01 µg/ml + TSH
14410 ± 1331 14273 ± 1845 99
5C9 0,1 µg/ml + TSH
11256 ± 1627 9278 ± 837 82
5C9 1,0 µg/ml + TSH
6704 ± 791 1358 ± 500 20
5C9 10 µg/ml + TSH
2107 ± 264 1163 ± 415 55
5C9 100 µg/ml + TSH
2234 ± 540 518 ± 133 23
5C9 100 µg/ml solamente
244 ± 92 494 ± 163 202
Véase Tabla 7a para notas explicativas.
Tabla 7d
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Arg80 mutada a ácido Aspártico. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
548 ± 67 637 ± 96 116
TSH solamente
13598 ± 3445 19400 ± 1684 143
2G4 10 µg/ml + TSH
14795 ± 2776 19430 ± 1779 131
2G4 100 µg/ml + TSH
15500 ± 897 16003 ± 237 103
5C9 0,01 µg/ml + TSH
130821 21021 ± 2838 161
5C9 0,1 µg/ml + TSH
6326 ± 358 4420 ± 182 70
5C9 1,0 µg/ml + TSH
2635 ± 326 1912 ± 101 73
5C9 10 µg/ml + TSH
1906 ± 146 1249 ± 329 66
5C9 100 µg/ml + TSH
1613 ± 176 1274 ± 15 79
5C9 100 µg/ml solamente
300 ± 45 523 ± 3 174
Véase Tabla 7a para notas explicativas.
Tabla 7e
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Tyr80 mutada a Alanina. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
557 ± 27 1219 ± 49 219
TSH solamente
12674 ± 234 15327 ± 2041 121
2G4 10 mg/ml + TSH
13587 ± 967 175851 129
2G4 100 mg/ml + TSH
13518 ± 894 15395 ± 1777 113
5C9 0,01 mg/ml + TSH
13902 ± 1970 15737 ± 1442 113
5C9 0,1 mg/ml + TSH
6250 ± 1143 12692 ± 3138 203
5C9 1,0 mg/ml + TSH
1600 ± 467 2955 ± 732 185
5C9 10 mg/ml + TSH
822 ± 99 1646 ± 308 200
5C9 100 mg/ml + TSH
978 ± 102 1028 ± 216 105
5C9 100 mg/ml solamente
289 ± 30 1427 ± 419 494
Véase Tabla 7a para notas explicativas.
Tabla 7f
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Thr104 mutada a Alanina. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
590 ± 59 640 ± 95 108
TSH solamente
11294 ± 1307 14247 ± 3093 126
2G4 10 µg/ml + TSH
14255 ± 1410 13227 ± 1782 93
2G4 100 µg/ml + TSH
13422 ± 2337 15499 ± 2042 115
5C9 0,01 µg/ml + TSH
12307 ± 1080 11733 ± 422 95
5C9 0,1 µg/ml + TSH
7097 ± 79 9506 ± 738 134
5C9 1,0 µg/ml + TSH
3699 ± 391 6196 ± 1075 168
5C9 10 µg/ml + TSH
1796 ± 417 3094 ± 740 172
5C9 100 µg/ml + TSH
2218 ± 395 3110 ± 412 140
5C9 100 µg/ml solamente
195 ± 23 264 ± 102 135
Véase Tabla 7a para notas explicativas.
Tabla 7g
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Arg109 mutada a Alanina. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
381 ± 28 675 ± 50 177
TSH solamente
13823 ± 5141 9769 ± 372 71
2G4 10 µg/ml + TSH
14428 ± 8959 9524 ± 1014 66
2G4 100 µg/ml + TSH
19307 ± 3130 8800 ± 631 46
5C9 0,01 µg/ml + TSH
10820 ± 1644 9651 ± 1066 89
5C9 0,1 µg/ml + TSH
4011 ± 1290 1719 ± 40 43
5C9 1,0 µg/ml + TSH
1206 ± 88 827 ± 157 69
5C9 10 µg/ml + TSH
706 ± 282 827 ± 147 117
5C9 100 µg/ml + TSH
1230 ± 120 561 ± 164 46
5C9 100 µg/ml solamente
228 ± 45 335 ± 14 147
Véase Tabla 7a para notas explicativas.
Tabla 7h
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys129 mutada a Alanina. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
370 ± 97 590 ± 17 159
TSH solamente
15632 ± 2362 15502 ± 547 99
2G4 10 µg/ml + TSH
11344 ± 3278 14787 ± 986 130
2G4 100 µg/ml + TSH
12580 ± 2397 14148 ± 1033 112
5C9 0,01 µg/ml + TSH
10545 ± 161 12161 ± 1797 115
5C9 0,1 µg/ml + TSH
2714 ± 154 13257 ± 2414 488
5C9 1,0 µg/ml + TSH
1008 ± 229 12837 ± 1148 1274
5C9 10 µg/ml + TSH
548 ± 26 111751 2039
5C9 100 µg/ml + TSH
491 ± 73 15929 ± 1228 3244
5C9 100 µg/ml solamente
107 ± 18 217 ± 36 203
Véase Tabla 7a para notas explicativas.
Tabla 7i
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Phe134 mutada a Alanina. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
347 ± 88 867 ± 129 250
TSH solamente
17641 ± 2133 15497 ± 1691 88
2G4 10 µg/ml + TSH
13759 ± 116 17235 ± 1602 125
2G4 100 µg/ml + TSH
11224 ± 4039 16213 ± 1948 144
5C9 0,01 µg/ml + TSH
13584 ± 1268 15872 ± 1140 117
5C9 0,1 µg/ml + TSH
8702 ± 1542 6368 ± 778 73
5C9 1,0 µg/ml + TSH
4542 ± 104 1944 ± 838 43
5C9 10 µg/ml + TSH
2394 ± 44 1058 ± 189 44
5C9 100 µg/ml + TSH
1393 ± 128 1069 ± 65 77
5C9 100 µg/ml solamente
212 ± 6 337 ± 60 159
Véase Tabla 7a para notas explicativas.
Tabla 7j
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp151 mutada a Alanina. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
508 ± 341 1236 ± 88 243
TSH solamente
11266 ± 76 10455 ± 771 93
2G4 10 µg/ml + TSH
15208 ± 1686 10713 ± 1859 70
2G4 100 µg/ml + TSH
11915 ± 1366 10416 ± 3434 114
5C9 0,01 µg/ml + TSH
11245 ± 1583 12616 ± 1295 112
5C9 0,1 µg/ml + TSH
6949 ± 99 9956 ± 983 143
5C9 1,0 µg/ml + TSH
1388 ± 238 6450 ± 2088 465
5C9 10 µg/ml + TSH
380 ± 108 2276 ± 1238 599
5C9 100 µg/ml + TSH
945 ± 180 1535 ± 378 162
5C9 100 mg/ml solamente
176 ± 49 395 ± 42 224
Véase Tabla 7a para notas explicativas.
Tabla 7k
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp151 mutada a Arginina. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
703 ± 107 768 ± 82 109
TSH solamente
11131 ± 3208 19990 ± 458 180
2G4 10 µg/ml + TSH
15927 ± 2244 18846 ± 3293 118
2G4 100 µg/ml + TSH
13643 ± 3195 21275 ± 1580 156
5C9 0,01 µg/ml + TSH
12351 ± 5559 18254 ± 1877 148
5C9 0,1 µg/ml + TSH
6694 ± 3111 10561 ± 1025 158
5C9 1,0 µg/ml + TSH
2754 ± 166 2591 ± 472 94
5C9 10 µg/ml + TSH
12171 1609 ± 69 132
5C9 100 µg/ml + TSH
1572 ± 515 2330 ± 273 148
5C9 100 µg/ml solamente
260 ± 156 409 ± 88 157
Véase Tabla 7a para notas explicativas.
Tabla 7l
Producción de AMP cíclico inducida por M22 en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp160 mutada a Lisina. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
787 ± 119 1252 ± 274 159
M22 solamente
16750 ± 1515 14288 ± 1260 85
2G4 10 µg/ml + M22
16188 ± 1463 15476 ± 468 96
2G4 100 µg/ml + M22
15505 ± 2665 12638 ± 819 82
5C9 0,01 µg/ml + M22
16719 ± 541 15239 ± 445 91
5C9 0,1 µg/ml + M22
9385 ± 4006 7704 ± 703 82
5C9 1,0 µg/ml + M22
821 ± 268 963 ± 204 117
5C9 10 µg/ml + M22
208 ± 89 642 ± 386 309
5C9 100 µg/ml + M22
301 ± 182 657 ± 87 218
5C9 100 µg/ml solamente
429 ± 49 458 ± 8 107
M22 solamente (determinación repetida)
16702 ± 2170 18892 ± 2113 113
concentración de M22 = 3 ng/ml
Véase Tabla 7a para otras notas explicativas.
5
Tabla 7m
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys183 mutada a Alanina. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
642 ± 34 1153 ± 236 180
TSH solamente
22385 ± 532 20210 ± 1366 90
2G4 10 µg/ml + TSH
20148 ± 2625 23254 ± 3027 115
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys183 mutada a Alanina. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
2G4 100 µg/ml + TSH
19926’ 22442 ± 2489 113
5C9 0,01 µg/ml + TSH
179741 23284 ± 2243 130
5C9 0,1 µg/ml + TSH
11499 ± 892 24289 ± 720 211
5C9 1,0 µg/ml + TSH
3489 ± 606 14586 ± 155 418
5C9 10 µg/ml + TSH
1234 ± 357 7568 ± 605 618
5C9 100 µg/ml + TSH
1456 ± 838 11448 ± 933 786
5C9 100 µg/ml solamente
384 ± 19 747 ± 230 195
Véase Tabla 7a para notas explicativas.
Tabla 7n
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys183 mutada a ácido Aspártico. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
486 ± 151 737 ± 54 152
TSH solamente
14730 ± 1647 17668 ± 597 120
2G4 10 µg/ml + TSH
14234 ± 1097 17133 ± 2281 120
2G4 100 µg/ml + TSH
14737 ± 1905 16071 ± 1188 109
5C9 0,01 µg/ml + TSH
12911 ± 2357 20614 ± 2552 160
5C9 0,1 µg/ml + TSH
8577 ± 615 17344 ± 2898 202
5C9 1,0 µg/ml + TSH
3424 ± 135 12655 ± 835 370
5C9 10 µg/ml + TSH
1114 ± 112 6587 ± 1480 591
5C9 100 µg/ml + TSH
1720 ± 119 9007 ± 1295 524
5C9 100 µg/ml solamente
<12,5 54 ± 8 -
Véase Tabla 7a para notas explicativas.
Tabla 7o
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Gln235 mutada a Alanina. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
478 ± 94 713 ± 52 149
TSH solamente
14882 ± 944 15844 ± 922 106
2G4 10 µg/ml + TSH
17754 ± 3150 18900 ± 3098 106
2G4 100 µg/ml + TSH
129911 18598 ± 2708 143
5C9 0,01 µg/ml + TSH
7181 ± 618 17535 ± 3692 244
5C9 0,1 µg/ml + TSH
7784 ± 1111 7437 ± 1183 96
5C9 1,0 µg/ml + TSH
2545 ± 471 2416 ± 423 95
5C9 10 µg/ml + TSH
532 ± 65 1023 ± 400 192
5C9 100 µg/ml + TSH
747 ± 114 727 ± 168 97
5C9 100 µg/ml solamente
119 ± 28 256 ± 86 215
Véase Tabla 7a para notas explicativas.
Tabla 7p
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Arg255 mutada a Alanina. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
538 ± 12 797 ± 113 148
TSH solamente
14362 ± 3305 15143 ± 2093 106
2G4 10 µg/ml + TSH
14444 ± 3161 19042 ± 1085 132
2G4 100 µg/ml + TSH
16810 ± 3461 17710 ± 4886 105
5C9 0,01 µg/ml + TSH
6624 ± 1236 8124 ± 395 123
5C9 0,1 µg/ml + TSH
3788 ± 838 4137 ± 537 109
5C9 1,0 µg/ml + TSH
966 ± 150 1941 ± 113 201
5C9 10 µg/ml + TSH
867 ± 100 692 ± 152 80
5C9 100 µg/ml + TSH
1013 ± 247 809 ± 248 80
5C9 100 µg/ml solamente
321 248 ± 94 775
Véase Tabla 7a para notas explicativas.
Tabla 7q
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Arg255 mutada a ácido Aspártico. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
620 ± 33 6161 99
TSH solamente
17531 ± 1730 18081 ± 2439 103
2G4 10 µg/ml + TSH
19870 ± 2766 15519 ± 702 78
2G4 100 µg/ml + TSH
18265 ± 1999 19638 ± 1505 108
5C9 0,01 µg/ml + TSH
17518 ± 2407 15654 ± 148 89
5C9 0,1 µg/ml + TSH
6604 ± 1552 5583 ± 655 85
5C9 1,0 µg/ml + TSH
3375 ± 227 1932 ± 677 57
5C9 10 µg/ml + TSH
1244 ± 565 735 ± 9 59
5C9 100 µg/ml + TSH
1506 ± 151 1414 ± 568 94
5C9 100 µg/ml solamente
278 ± 125 559 ± 97 201
Véase Tabla 7a para notas explicativas.
Tabla 7r
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Trp258 mutada a Alanina. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
354 ± 28 382 ± 55 108
TSH solamente
21023 ± 2104 7095 ± 1086 33
2G4 10 µg/ml + TSH
19564 ± 1076 7070 ± 148 36
2G4 100 µg/ml + TSH
21591 ± 2652 6066 ± 336 28
5C9 0,01 µg/ml + TSH
19471 ± 1456 6619 ± 511 34
5C9 0,1 µg/ml + TSH
10455 ± 1968 1944 ± 168 19
5C9 1,0 µg/ml + TSH
2616 ± 118 1127 ± 24 43
5C9 10 µg/ml + TSH
1192 ± 253 357 ± 11 30
5C9 100 µg/ml + TSH
1316 ± 283 484 ± 247 37
5C9 100 µg/ml solamente
211 6 35 423 ± 109 200
Véase Tabla 7a para notas explicativas.
Tabla 7s
Producción de AMP cíclico inducida por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Ser281 mutada a Alanina. Efecto de diferentes diluciones de IgG 5C9
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
496 ± 72 1094 ± 132 221
TSH solamente
13562 ± 3416 264501 195
2G4 10 µg/ml + TSH
16805 ± 1139 25086 ± 1730 149
2G4 100 µg/ml + TSH
14334 ± 860 27672 ± 3549 193
5C9 0,01 µg/ml + TSH
13791 ± 3221 28966 ± 3443 210
5C9 0,1 µg/ml + TSH
9071 ± 1696 15560 ± 5836 172
5C9 1,0 µg/ml + TSH
3732 ± 514 3550 ± 725 95
5C9 10 µg/ml + TSH
802 ± 215 1551 ± 545 193
5C9 100 µg/ml + TSH
1078 ± 158 1601 ± 720 149
5C9 100 µg solamente
201 ± 41 78 ± 188 391
Véase Tabla 7a para notas explicativas.
Tabla 8
Comparación de los resultados de ensayo de TRAb de suero obtenidos con ELISA basados en la inhibición de la unión de TSH-biotina o la unión de IgG 5C9-biotina
Ensayo de referencia de TSH-biotina
Ensayo de IgG 5C9-biotina
Muestras de ensayo
Abs 450 nm % de inhibición Concentración (U/l) Abs 450 nm % de inhibición Concentración (U/l)
Control de ensayo negativo
2,143 0 0 2,421 0 0
Calibradores de ensayo
1 U/l
1,821 15 1 2,027 16 1
2 U/l
1,564 27 2 1,747 28 2
8 U/l
0,66 69 8 0,532 78 8
40 U/l
0,132 94 40 0,092 96 40
Control de ensayo positivo
1,273 41 3,22 1,344 44 3,28
Sueros de pacientes
A
2,122 1 0,14 2,209 9 0,44
B
1,081 50 4,24 1,029 58 4,54
C
0,225 90 26,03 0,173 93 18,4
D
2,069 3 0,24 2,27 6 0,31
E
1,789 16 1,12 2,189 10 0,49
F
1,454 32 2,43 1,791 26 1,85
G
1,053 51 4,41 1,123 54 4,12
H
1,242 42 3,37 1,309 46 3,4
I
0,208 90 28,01 0,174 93 18,32
Sueros de donantes de sangre sanos
4276
2,182 -2 0 2,451 -1 0
4280
2,292 -7 0 2,621 -8 0
4281
2,138 0 0 2,529 -4 0
4282
2,204 -3 0 2,6 -7 0
4284
2,306 -8 0 2,613 -8 0
4285
2,328 -9 0 2,756 -14 0
4286
2,34 -9 0 2,691 -11 0
4289
2,381 -11 0 2,628 -9 0
Los calibradores de ensayo 40 U/l, 8 U/l, 2 U/l y 1 U/l son diluciones de IgG M22 en un grupo de sueros de donantes de sangre sanos (grupo de HBD) con actividades en U/l de NIBSC 90/672 evaluadas por inhibición de la unión de TSH marcada con tubos recubiertos de TSHR. El control de ensayo negativo es un grupo de HBD.
Tabla 9
Efectos de IgG 5C9 en la estimulación de TSHR por MAb de ratón estimulantes del tiroides (mTSMAb)
Concentración de AMP cíclico (media de pmol/ml DT; n = 3) en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre después de la adición de TSMAb y:-
Muestra de ensayo a
Tampón solamente IgG 5C9 100 g/ml IgG 2G4b 100 g/ml
TSMAb 1 1 µg/ml
18,94 ± 7,4 1,24 ± 0,07 16,5 ± 1,1
TSMAb 2 1 µg/ml
9,71 ± 0,96 2,26 ± 0,05 8,96 ± 1,28
TSMAb 4 10 ng/ml
34,5 ± 2,04 2,20 ± 0,20 33,1 ± 1,25
TSMAb 5 100 ng/ml
27,26 ± 2,14 0,85 ± 0,01 22,5 ± 2,4
TSMAb 7 100 ng/ml
9,90 ± 1,52 1,26 ± 0,59 9,07 ± 0,65
Tampón solamente
3,39 ± 1,35 1,56 ± 1,84 4,32 ± 0,95
adilución en tampón de ensayo de AMP cíclicob2G4 es un autoanticuerpo monoclonal humano de control para peroxidasa de tiroides.
Tabla 10
Efecto de IgG 5C9 en la estimulación de TSHR por diferentes preparaciones de TSH Experimento 1
Muestra de ensayo diluida en tampón de ensayo de AMP cíclico
Concentración de AMP cíclico (pmol/ml media DT; n = 3) en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre
Tampón solamente
0,37 ± 0,15
TSH humana nativa 100 ng/ml solamente
36,14 ± 1,83
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 0,001 µg/ml.
36,0 ± 6,1
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 0,01 µg/ml
18,0 ± 5,4
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 0,1 µg/ml
0,20 ± 0,06
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 1,0 µg/ml
0,14 ± 0,02
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 10 µg/ml
0,11 ± 0,04
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 100 µg/ml
0,16 ± 0,03
TSH humana recombinante 100 ng/ml solamente
12,73 ± 4,0
TSH humana recombinante 100 ng/ml e IgG 5C9 0,001 µg/ml.
13,63 ± 1,7
TSH humana recombinante 100 ng/ml e IgG 5C9 0,01 µg/ml
8,13 ± 2,13
TSH humana recombinante 100 ng/ml e IgG 5C9 0,1 µg/ml
0,12 ± 0,06
TSH humana recombinante 100 ng/ml e IgG 5C9 1,0 µg/ml
0,10 ± 0,03
TSH humana recombinante 100 µg/ml e IgG 5C9 10 µg/ml
0,12 ± 0,05
TSH humana recombinante 100 ng/ml e IgG 5C9 100 µg/ml
0,19 ± 0,08
Experimento 2
Muestra de ensayo diluida en tampón de ensayo de AMP cíclico
Concentración de AMP cíclico (pmol/ml media DT; n = 3) en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre
Tampón solamente
0,18 ± 0,08
TSH 100 humana nativa ng/ml solamente
40,8 ± 6,92
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 0,001 µg/ml,
37,6 ± 6,35
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 0,01 µg/ml
34,4 ± 2,28
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 0,1 µg/ml
15,8 ± 1,39
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 1,0 µg/ml
0,13 ± 0,03
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 10 µg/ml
0,18 ± 0,05
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 100 µg/ml
0,21 ± 0,10
TSH humana recombinante 100 ng/ml solamente
16,72 ± 2,90
TSH humana recombinante 100 ng/ml e IgG 5C9 0,001 µg/ml,
20,0 ± 1,73
TSH humana recombinante 100 ng/ml e IgG 5C9 0,01 µg/ml
20,6 ± 1,57
TSH humana recombinante 100 ng/ml e IgG 5C9 0,1 µg/ml
7,39 ± 1,74
TSH 100 humana recombinante ng/ml e IgG 5C9 1,0 µg/ml
0,07 ± 0,01
TSH humana recombinante 100 ng/ml e IgG 5C9 10 mg/ml
0,07 ± 0,01
TSH humana recombinante 100 ng/ml e IgG 5C9 100 µg/ml
0,11 ± 0,03
TSH porcina nativa 0,3 ng/ml solamente
40,2 ± 4,0
TSH porcina nativa 0,3 ng/ml e IgG 5C9 0,001 µg/ml,
32,7 ± 4,0
TSH porcina nativa 0,3 ng/ml e IgG 5C9 0,01 µg/ml
28,2 ± 2,04
TSH porcina nativa 0,3 ng/ml e IgG 5C9 0,1 µg/ml
18,0 ± 1,36
TSH nativa porcina 0,3 ng/ml e IgG 5C9 1,0 µg/ml
2,14 ± 0,85
TSH porcina nativa 0,3 ng/ml e IgG 5C9 10 µg/ml
0,20 ± 0,14
TSH porcina nativa 0,3 ng/ml e IgG 5C9 100 µg/ml
0,18 ± 0,13
Experimento 3
Muestra de ensayo diluida en tampón de ensayo de AMP cíclico
Concentración de AMP cíclico (pmol/ml media DT; n = 3) en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre
Tampón solamente
2,0 ± 0,8
TSH humana nativa 100 ng/ml solamente
31,1 ± 2,55
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 0,001 µg/ml,
36,0 ± 3,27
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 0,01 µg/ml
28,4 ± 3,55
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 0,1 µg/ml
7,22 ± 3,20
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 1,0 µg/ml
0,67 ± 0,46
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 10 µg/ml
0,8 ± 0,45
TSH humana nativa 100 ng/ml e IgG 5C9 100 µg/ml
1,35 ± 1,0
TSH humana recombinante 100 ng/ml solamente
26,4 ± 3,53
TSH humana recombinante 100 ng/ml e IgG 5C9 0,001 mg/ml,
25,6 ± 2,45
TSH humana recombinante 100 ng/ml e IgG 5C9 0,01 mg/ml
22,9 ± 7,4
TSH humana recombinante 100 ng/ml e IgG 5C9 0,1 mg/ml
1,18 ± 0,49
TSH humana recombinante 100 ng/ml e IgG 5C9 1,0 µg/ml
0,81 ± 0,05
TSH humana recombinante 100 ng/ml e IgG 5C9 10 µg/ml
0,74 ± 0,42
TSH humana recombinante 100 ng/ml e IgG 5C9 100 µg/ml
0,88 ± 0,55
TSH porcina nativa 0,3 ng/ml solamente
35,7 ± 4,82
TSH porcina nativa 0,3 ng/ml e IgG 5C9 0,001 µg/ml,
38,2 ± 2,54
TSH porcina nativa 0,3 ng/ml e IgG 5C9 0,01 µg/ml
26,6 ± 3,22
TSH porcina nativa 0,3 ng/ml e IgG 5C9 0,1 µg/ml
10,1 ± 1,79
TSH porcina nativa 0,3 ng/ml e IgG 5C9 1,0 µg/ml
2,28 ± 0,71
TSH porcina nativa 0,3 ng/ml e IgG 5C9 10 µg/ml
0,68 ± 0,21
TSH porcina nativa 0,3 ng/ml e IgG 5C9 100 µg/ml
1,03 ± 0,63
Tabla 11a
Efectos de IgG 5C9 e IgG 9D33 en la actividad constitutiva de TSHR con una mutación activadora S281I
Muestra de ensayo diluida en tampón de ensayo de AMP cíclico
Concentración de AMP cíclico (pmol/ml media DT; n = 3) en células CHO que expresan TSHR S281I
Tampón solamente
9,90 ± 1,51
IgG 2G4a 0,001 µg/ml
6,83 ± 0,37
IgG 2G4 0,01 µg/ml
7,74 ± 0,78
IgG 2G4 0,1 µg/ml
8,58 ± 1,12
IgG 2G4 1 µg/ml
8,37 ± 1,10
IgG 5C9 0,001 µg/ml
4,31 ± 0,16
IgG 5C9 0,01 µg/ml
4,17 ± 0,60
IgG 5C9 0,1 µg/ml
3,20 ± 0,63
IgG 5C9 1 µg/ml
3,44 ± 0,63
IgG 9D33 0,001 µg/ml
5,97 ± 0,94
IgG 9D33 0,01 µg/ml
9,27 ± 1,4
IgG 9D33 0,1 µg/ml
8,13 ± 0,72
IgG 9D33 1 µg/ml
7,33 ± 1,17
a2G4 es un anticuerpo monoclonal humano de control para peroxidasa de tiroides.
Tabla 11b
Efecto de IgG 5C9 e IgG 9D33 en la actividad constitutiva de TSHR con una mutación activadora I568T
Muestra de ensayo diluida en tampón de ensayo de AMP cíclico
Concentración de AMP cíclico (pmol/ml media DT; n = 3) en células CHO que expresan TSHR I568T
Tampón solamente
21,39 ± 5,31
IgG 2G4 0,001 µg/ml
19,13 ± 2,77
IgG 2G4 0,01 µg/ml
16,67 ± 1,87
IgG 2G4 0,1 µg/ml
19,92 ± 0,91
IgG 2G4 1 µg/ml
20,52 ± 0,95
IgG 5C9 0,001 µg/ml
18,81 ± 1,39
IgG 5C9 0,01 µg/ml
9,24 ± 0,83
IgG 5C9 0,1 µg/ml
6,02 ± 1,93
IgG 5C9 1 µg/ml
5,29 ± 0,75
IgG 9D33 0,001 µg/ml
16,58 ± 0,00
IgG 9D33 0,01 µg/ml
17,03 ± 2,36
IgG 9D33 0,1 µg/ml
19,96 ± 1,66
IgG 9D33 1 µg/ml
21,65 ± 1,99
Tabla 11c
Efecto de IgG 5C9 e IgG 9D33 en la actividad constitutiva de TSHR con una mutación activadora A623I
Muestra de ensayo diluida en tampón de ensayo de AMP cíclico
Concentración de AMP cíclico (pmol/ml media DT; n = 3) en células CHO que expresan TSHR A623I
Tampón solamente
36,89a
IgG 2G4 0,001 µg/ml
28,46 ± 2,31
IgG 2G4 0,01 µg/ml
33,44 ± 1,12
IgG 2G4 0,1 µg/ml
30,40 ± 7,93
IgG 2G4 1 µg/ml
28,96 ± 2,29
IgG 5C9 0,001 µg/ml
26,52 ± 1,33
IgG 5C9 0,01 µg/ml
27,03 ± 2,13
IgG 5C9 0,1 µg/ml
19,79 ± 0,48
IgG 5C9 1 µg/ml
16,43 ± 1,27
IgG 9D33 0,001 µg/ml
29,55 ± 3,15
IgG 9D33 0,01 µg/ml
27,64 ± 3,49
IgG 9D33 0,1 µg/ml
31,78 ± 9,18
IgG 9D33 1 µg/ml
40,09 ± 7,73
adeterminación por duplicado
Tabla 12
Efectos de 5C9 más 9D33 en el bloqueo de la estimulación por pTSH de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre Experimento 1
Muestra de ensayo en tampón de ensayo de AMP cíclico
Concentración de AMP cíclico (pmol/ml media DT; n = 3)
Tampón solamente
1,9 ± 1,0
TSH 3 ng/ml
48,5 ± 14
9D33 10 µg/ml
2,9 ± 1,0
5C9 10 µg/ml
0,45 ± 0,31
9D33 10 µg/ml + 5C9 10 µg/ml
1,12 ± 0,4
9D33 10 µg/ml + TSH
23,8 ± 8,7
5C9 10 µg/ml + TSH
3,7 ± 2,7
9D33 10 µg/ml + 5C9 10 µg/ml + TSH
4,9 (n = 2)
9D33 1 µg/ml + TSH
28,7 ± 1,8
5C9 1 µg/ml + TSH
13,9 ± 3,1
9D33 1 µg/ml + 5C9 1 µg/ml + TSH
12,6 ± 2,5
Experimento 2
Muestra de ensayo en tampón de ensayo de AMP cíclico
Concentración de AMP cíclico (pmol/ml media DT; n = 3)
Tampón solamente
0,72 ± 0,63
TSH 3 ng/ml
34,3 ± 3,1
9D33 10 µg/ml
1,6 ± 1,3
5C9 10 µg/ml
0,4 ± 0,4
9D33 10 µg/ml + 5C9 10 µg/ml
0,03 (n = 1)
9D33 10 µg/ml + TSH
9,5 ± 1,7
5C9 10 µg/ml + TSH
3,1 ± 1,0
9D33 10 µg/ml + 5C9 10 µg/ml + TSH
3,3 ± 2,0
9D33 1 mg/ml + TSH
19,0 ± 3,2
5C9 1 mg/ml + TSH
6,1 ± 0,6
9D33 1 mg/ml + 5C9 1 mg/ml + TSH
5,9 ± 0,6
Experimento 3
Muestra de ensayo en el tampón de ensayo de AMP cíclico
Concentración de AMP cíclico (pmol/ml media DT; n = 3)
Tampón solamente
0,99 ± 0,03
TSH 3 ng/ml
51,3 ± 5,0
9D33 100 µg/ml
1,14 ± 0,13
5C9 100 µg/ml
0,50 ± 0,04
9D33 100 µg/ml + 5C9 100 µg/ml
0,66 ± 0,9
9D33 100 µg/ml + TSH
10,53 ± 0,84
5C9 100 µg/ml + TSH
1,4 ± 0,18
9D33 100 µg/ml + 5C9 100 µg/ml + TSH
1,3 ± 0,36
9D33 10 µg/ml + TSH
13,5 ± 2,9
5C9 10 µg/ml + TSH
1,9 ± 1,1
9D33 10 µg/ml + 5C9 10 µg/ml + TSH
1,2 ± 0,1
9D33 1 µg/ml + TSH
27,8 ± 2,2
5C9 1 µg/ml+ TSH
5,4 ± 1,8
9D33 1 µg/ml + 5C9 1 µg/ml + TSH
5,2 ± 0,3
9D33 0,1 µg/ml + TSH
35,1 ± 2,3
5C9 0,1 µg/ml + TSH
18,7 ± 3,4
9D33 0,1 µg/ml + 5C9 0,1 mg/ml + TSH
14,4 ± 1,0
9D33 0,01 µg/ml + TSH
47,1 ± 1,9
5C9 0,01 µg/ml + TSH
33,9 ± 7,8
9D33 0,01 µg/ml + 5C9 0,01 µg/ml + TSH
27,8 ± 1,3
Tampón solamente
1,4 ± 0,5
TSH 0,3 µg/ml
46,6 ± 12,9
9D33 100 µg/ml
0,99 ± 0,62
5C9 100 µg/ml
0,15 ± 0,12
9D33 100 µg/ml + 5C9 100 µg/ml
0,41 ± 0,40
9D33 100 µg/ml + TSH
3,53 ± 1,1
5C9 100 µg/ml + TSH
0,29 ± 0,15
9D33 100 µg/ml + 5C9 100 mg/ml + TSH
0,63 ± 0,38
9D33 10 µg/ml + TSH
4,23 ± 0,81
5C9 10 µg/ml + TSH
0,23 ± 0,08
9D33 10 µg/ml + 5C9 10 µg/ml + TSH
0,52 ± 0,15
9D33 1 µg/ml + TSH
9,01 ± 0,67
5C9 1 µg/ml + TSH
1,65 ± 0,47
9D33 1 µg/ml + 5C9 1 µg/ml + TSH
1,21 ± 0,67
9D33 0,1 µg/ml + TSH
20,2 ± 2,2
5C9 0,1 µg/ml + TSH
6,2 ± 1,8
9D33 0,1 µg/ml + 5C9 0,1 µg/ml + TSH
7,6 ± 1,3
Experimento 5
Muestra de ensayo en el tampón de ensayo de AMP cíclico
Concentración de AMP cíclico (pmol/ml media DT; n = 3)
Tampón solamente
1,83 ± 0,64
TSH 0,3 ng/ml
17,26 ± 1,5
9D33 10 µg/ml
2,07 ± 0,52
5C9 10 µg/ml
0,38 ± 0,2
9D33 10 µg/ml + 5C9 10 µg/ml
0,96 ± 0,14
9D33 10 µg/ml + TSH
3,57 ± 0,58
5C9 10 µg/ml + TSH
1,17 ± 0,00
9D33 10 µg/ml + 5C9 10 µg/ml + TSH
1,58 ± 0,20
9D33 5 µg/ml + TSH
3,71 ± 0,10
5C9 5 µg/ml + TSH
1,21 ± 0,36
9D33 1 µg/ml + TSH
6,38 ± 1,35
5C9 1 µg/ml + TSH
2,57 ± 0,65
9D33 1 µg/ml + 5C9 1 µg/ml + TSH
1,46 ± 0,59
9D33 0,1 µg/ml + TSH
14,67 ± 4,69
5C9 0,1 µg/ml + TSH
12,43 ± 1,59
9D33 0,1 µg/ml + 5C9 0,1 µg/ml + TSH
9,99 ± 3,78
Tabla 13
Efecto de 5C9 más 9D33 en el bloqueo de la estimulación mediada por Fab M22 de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre Experimento 1
Muestra de ensayo en tampón de ensayo de AMP cíclico
Concentración de AMP cíclico (pmol/ml media DT; n = 3)
Tampón solamente
1,45 ± 0,46
M22 3 µg/ml
49,1 ± 9,8
9D33 100 µg/ml
1,51 ± 0,22
5C9 100 µg/ml
0,35 ± 0,30
9D33 100 µg/ml + 5C9 100 µg/ml
1,57 ± 0,13
9D33 100 µg/ml + M22
2,13 ± 0,74
5C9 100 µg/ml + M22
0,35 ± 0,08
9D33 100 µg/ml + 5C9 100 µg/ml + M22
0,70 ± 0,40
9D33 10 µg/ml + M22
2,5 ± 0,8
5C9 10 µg/ml + M22
0,36 ± 0,25
9D33 10 µg/ml + 5C9 10 µg/ml + M22
0,52 ± 0,12
9D33 1 µg/ml + M22
5,25 ± 0,55
5C9 1 µg/ml + M22
0,93 ± 0,07
9D33 1 µg/ml + 5C9 1 µg/ml + M22
0,69 ± 0,13
9D33 0,1 µg/ml + M22
27,6 ± 2,5
5C9 0,1 µg/ml + M22
6,0 ± 2,6
9D33 0,1 µg/ml + 5C9 0,1 µg/ml + M22
13,7 ± 7,5
9D33 0,01 µg/ml + M22
47,5 ± 4,5
5C9 0,01 µg/ml + M22
48,1 ± 5,4
9D33 0,01 µg/ml + 5C9 0,01 µg/ml + M22
47,5 ± 4,5
Experimento 2
Muestra de ensayo en tampón de ensayo de AMP cíclico
Concentración de AMP cíclico (pmol/ml media DT; n = 3)
Tampón solamente
1,69 ± 0,47
M22 3 ng/ml
68,3 ± 6,3
9D33 100 µg/ml
1,76 ± 0,43
5C9 100 µg/ml
0,69 ± 0,18
9D33 100 µg/ml + 5C9 100 µg/ml
1,16 ± 0,35
9D33 100 µg/ml + M22
1,42 ± 1,20
5C9 100 µg/ml + M22
indetectable
9D33 100 µg/ml + 5C9 100 µg/ml + M22
0,14 (n=2)
9D33 10 µg/ml + M22
0,67 (n=2)
5C9 10 µg/ml + M22
0,14 (n=1)
9D33 10 µg/ml + 5C9 10 µg/ml + M22
2,41 (n=1)
9D33 1 µg/ml + M22
6,03 ± 1,15
5C9 1 µg/ml + M22
2,54 (n=1)
9D33 1 µg/ml + 5C9 1 µg/ml + M22
1,51 (n=1)
9D33 0,1 µmg/ml + M22
38,7 ± 8,1
5C9 0,1 µg/ml + M22
4,17 ± 1,7
9D33 0,1 µg/ml + 5C9 0,1 µg/ml + M22
5,17 ± 2,85
9D33 0,01 µg/ml + M22
60,2 ± 8,0
5C9 0,01 µg/ml + M22
57,3 ± 13,7
9D33 0,01 µg/ml + 5C9 0,01 µg/ml + M22
40,4 ± 5,3
9D33 0,001 µg/ml + M22
79,1 ± 26,3
5C9 0,001 µg/ml + M22
63,3 ± 19,0
9D33 0,001 µg/ml + 5C9 0,001 µg/ml + M22
40,2 ± 8,7
Experimento 3
Muestra de ensayo en tampón de ensayo de AMP cíclico
Concentración de AMP cíclico (pmol/ml media DT; n = 3)
Tampón solamente
0,86 ± 0,12
M22 0,3 ng/ml
21,8 ± 3,23
9D33 100 µg/ml
0,88 ± 0,30
5C9 100 µg/ml
0,58 ± 0,28
9D33 100 µg/ml + 5C9 100 µg/ml
0,81 ± 0,36
9D33 100 µg/ml + M22
1,03 ± 0,32
5C9 100 µg/ml + M22
0,05 (n=2)
9D33 100 µg/ml + 5C9 100 µg/ml + M22
0,06 (n=2)
9D33 10 µg/ml + M22
0,97 6 0,48
5C9 10 µg/ml + M22
0,20 (n=2)
9D33 10 µg/ml + 5C9 10 µg/ml + M22
0,14 ± 0,08
9D33 1 µg/ml + M22
0,83 ± 0,21
5C9 1 µg/ml + M22
0,02 (n=2)
9D33 1 µg/ml + 5C9 1 µg/ml + M22
0,13 ± 0,13
9D33 0,1 µmg/ml + M22
5,38 ± 1,71
5C9 0,1 µg/ml + M22
1,43 ± 1,09
9D33 0,1 µg/ml + 5C9 0,1 µg/ml + M22
2,39 ± 1,0
9D33 0,01 µg/ml + M22
15,2 ± 1,42
5C9 0,01 µg/ml + M22
13,1 ± 1,34
9D33 0,01 µg/ml + 5C9 0,01 µg/ml + M22
12,7 ± 3,4
9D33 0,001 µg/ml + M22
12,8 ± 1,60
5C9 0,001 µg/ml + M22
13,3 ± 0,89
9D33 0,001 µg/ml + 5C9 0,001 µg/ml + M22
15,8 ± 2,15
Experimento 4
Muestra de ensayo en tampón de ensayo de AMP cíclico
Concentración de AMP cíclico (pmol/ml media DT; n = 3)
Tampón solamente
1,29 ± 0,68
M22 0,3 ng/ml
31,1 ± 9,4
9D33 100 µg/ml
2,38 ± 1,11
5C9 100 µg/ml
0,12 ± 0,09
9D33 100 µg/ml + 5C9 100 µg/ml
0,81 ± 0,15
9D33 100 µg/ml + M22
2,00 ± 0,87
5C9 100 µg/ml + M22
0,22 ± 0,11
9D33 100 µg/ml + 5C9 100 µg/ml + M22
0,40 ± 0,18
9D33 10 µg/ml + M22
1,25 ± 0,09
5C9 10 µg/ml + M22
0,40 ± 0,17
9D33 10 µg/ml + 5C9 10 µg/ml + M22
0,45 ± 0,31
9D33 1 µg/ml + M22
2,66 ± 0,64
5C9 1 µg/ml + M22
0,21 ± 0,18
9D33 1 µg/ml + 5C9 1 µg/ml + M22
0,14 ± 0,07
9D33 0,1 µmg/ml + M22
27,6 ± 2,5
5C9 0,1 µg/ml + M22
6,0 ± 2,6
9D33 0,1 µg/ml + 5C9 0,1 µg/ml + M22
7,2 ± 3,9
9D33 0,01 µg/ml + M22
38,9 ± 6,4
5C9 0,01 µg/ml + M22
31,5 ± 4,0
9D33 0,01 µg/ml + 5C9 0,01 µg/ml + M22
20,6 ± 5,3
9D33 0,001 µg/ml + M22
43,2 ± 7,9
5C9 0,001 µg/ml + M22
33,1 ± 4,0
9D33 0,001 µg/ml + 5C9 0,001 µg/ml + M22
25,3 ± 6,0
Tabla 14
Efecto de IgG 5C9 y 9D33 en la producción de AMP cíclico basal en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre (aproximadamente 5 x 105 receptores por célula) Experimento 1
Muestra de ensayo
Concentración de AMP cíclico pmol/ml (media DT; n = 3) % de inhibición de la producción de AMP cíclico basal.
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
47,1 ± 11,7 0
TSH 3 ng/ml
152,0 ± 28,2 -vo
IgG 5B3a 100 µg/ml
44,5 ± 5,2 5,3
IgG 5B3a 10 µg/ml
45,4 ± 6,3 3,4
IgG 5B3a 1 µg/ml
52,0 ± 12,1 -vo
IgG 9D33 100 µg/ml
74,2 ± 7,2 -vo
IgG 9D33 10 µg/ml
56,5 ± 4,0 -vo
IgG 9D33 1 µg/ml
65,8 ± 9,8 -vo
IgG 9D33 0,1 µg/ml
61,7 ± 13,3 -vo
IgG 9D33 0,01 µg/ml
52,0 ± 5,1 -vo
IgG 9D33 0,001 µg/ml
61,6 ± 3,8 -vo
Experimento 2
Muestra de ensayo
Concentración de AMP cíclico pmol/ml (media DT; n = 3) % de inhibición de la producción de AMP cíclico basal.
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
58,0 6 15,2 0
TSH 3 ng/ml
156,5 6 22,2 -vo
IgG 5B3a 100 µg/ml
52,7 6 7,8 9,1
IgG 5B3a 10 µg/ml
43,7 6 10,4 24,7
IgG 5B3a 1 µg/ml
55,9 6 12,2 3,7
IgG 5C9 100 mg/ml
26,2 6 2,7 54,9
IgG 5C9 10 mg/ml
14,7 6 1,7 74,6
IgG 5C9 1 mg/ml
16,8 6 4,2 71,0
IgG 5C9 0,1 mg/ml
31,5 6 8,8 45,7
IgG 5C9 0,01 mg/ml
36,4 6 4,5 37,2
IgG 5C9 0,001 mg/ml
51,7 6 9,8 10,8
Experimento 3
Efectos de Fab y F(ab’) 5C9 en la producción de AMP cíclico basal en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre
Muestra de ensayo en tampón de ensayo de AMP cíclico
Concentración de AMP cíclico pmol/ml (media DT; n = 3) % de inhibición de la producción de AMP cíclico basal.
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
59,4 ± 8,6 0
IgG 9D33 100 µg/ml
67,8 ± 1,0 -vo
IgG 9D33 10 µg/ml
79,4 ± 9,8 -vo
IgG 9D33 1 µg/ml
71,5 ± 8,8 -vo
IgG 9D33 0,1 µg/ml
75,6 ± 8,9 -vo
IgG 9D33 0,01 µg/ml
60,5 ± 7,5 -vo
IgG 9D33 0,001 µg/ml
52,3 ± 6,3 12
IgG 5C9 100 µg/ml
26,2 ± 1,8 56
IgG 5C9 10 µg/ml
24,5 ± 5,8 59
IgG 5C9 1 µg/ml
22,9 ± 2,1 61
IgG 5C9 0,1 µg/ml
59,1 ± 2,6 1
IgG 5C9 0,01 µg/ml
64,3 ± 8,4 -vo
IgG 5C9 0,001 µg/ml
67,3 ± 9,8 -vo
Fab 5C9 100 µg/ml
23,3 ± 2,3 61
Fab 5C9 10 µg/ml
32,1 ± 4,8 46
Fab 5C9 1 µg/ml
36,4 ± 1,5 39
Fab 5C9 0,1 µg/ml
52,8 ± 1,9 11
Fab 5C9 0,01 µg/ml
61,1 ± 2,4 -vo
Fab 5C9 0,001 µg/ml
62,5 ± 7,3 -vo
F(ab’) 5C9 100 µg/ml
30,9 ± 2,6 48
F(ab’) 5C9 10 µg/ml
36,5 ± 3,4 39
F(ab’) 5C9 1 µg/ml
45,9 ± 4,5 23
F(ab’) 5C9 0,1 µg/ml
48,2 ± 3,1 19
F(ab’) 5C9 0,01 µg/ml
62,3 ± 5,7 -vo
F(ab’) 5C9 0,001 µg/ml
57,9 ± 9,1 3
En células CHO de control, que no expresan el TSHR, la producción de AMP cíclico basal en presencia de tampón de ensayo de AMP cíclico fue de 0,03 pmol/ml (n = 2) y en presencia de TSH 3 ng/ml fue de 0,40 ± 0,09 pmol/ml (media ± DT; n = 3). -vo = negativo es decir sin inhibición de la producción de AMP cíclico. a5B3 es un anticuerpo monoclonal humano para ácido glutámico descarboxilasa (GAD) (control negativo para 5C9). En células CHO de control, que no expresan el TSHR, la producción de AMP cíclico basal en presencia de tampón de ensayo de AMP cíclico fue de 0,03 pmol/ml (n = 2) y en presencia de TSH 3 ng/ml fue de 0,40 ± 0,09 pmol/ml (media ± DT; n = 3). -vo = negativo es decir sin inhibición de la producción de AMP cíclico. a5B3 es un anticuerpo monoclonal humano para ácido glutámico descarboxilasa (GAD) (control negativo para 5C9). En células CHO de control, que no expresan el TSHR, la producción de AMP cíclico basal en presencia de tampón de ensayo de AMP cíclico fue de 0,03 pmol/ml (n = 2) y en presencia de TSH 3 ng/ml fue de 0,40 ± 0,09 pmol/ml (media ± DT; n = 3). -vo = negativo, es decir sin inhibición de la producción de AMP cíclico. F(ab’) preparado por reducción de F(ab’)2; véase el texto para detalles.
Tabla 15
Efecto de los autoanticuerpos de TSHR de sueros de pacientes con actividad antagonista (B2-B5) en los niveles de AMP cíclico basales en células CHO que expresan la mutación activadora de TSHR I568T Experimento 1
Muestra de ensayo y dilución de suero
Concentración de AMP cíclico pmol/ml (media DT; n = 3) % de inhibición de la producción de AMP cíclico basal.
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
20,5 ± 8,7 0
Grupo de HBD /10
19,5 ± 3,4 5
Grupo de HBD /50
25,7 ± 2,8 -vo
N1 /10
20,7 ± 5,5 -vo
N1 /50
18,5 ± 1,5 10
N2 /10
23,3 ± 1,7 -vo
N2 /50
17,6 ± 1,8 14
N3 /10
20,3 ± 2,4 1
N3 /50
23,6 ± 5,9 -vo
B2 /10
5,3 ± 1,3 74
B2 /50
9,6 ± 2,8 53
B3 /10
8,3 ± 3,1 60
B3 /50
10,5 ± 2,5 49
B4 /10
2,2 ± 0,5 89
B4 /50
3,0 ± 0,3 86
B5 /10
15,9 ± 3,3 23
B5 /50
14,5 ± 1,3 29
Experimento 2
Muestra de ensayo y dilución de suero
Concentración de AMP cíclico pmol/ml (media DT; n = 3) % de inhibición de la producción de AMP cíclico basal.
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
19,7 ± 3,7 0
Grupo de HBD /10
28,0 ± 1,6 -vo
Grupo de HBD /50
18,1 ± 3,9 8
Grupo de HBD /100
18,0 ± 1,6 9
Grupo de HBD /500
17,8 ± 1,3 10
Grupo de HBD /1000
20,7 ± 2,9 -vo
Grupo de HBD /5000
15,6 ± 2,1 20
B3 /10
14,7 ± 2,2 25
B3 /50
13,7 ± 1,3 31
B3 /100
12,6 ± 0,6 36
B3 /500
19,0 ± 0,8 4
B3 /1000
18,4 ± 4,6 7
B3 /5000
17,6 ± 0,9 11
B4 /10
4,0 ± 0,5 80
B4 /50
3,6 ± 0,8 81
B4 /100
3,8 ± 1,1 81
B4 /500
7,2 ± 2,6 64
B4 /1000
12,0 ± 0,6 39
B4 /5000
17,7 ± 2,7 10
-vo = negativo, es decir sin inhibición de la producción de AMP cíclico. Grupo de HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos N1-N3 = suero de donantes de sangre sanos individuales Todos los sueros se diluyeron en tampón de ensayo de AMP cíclico.
Tabla 16
Efecto de los autoanticuerpos de TSHR de sueros de pacientes con actividad antagonista (B2-B5) en los niveles de AMP cíclico basales en células CHO que expresan la mutación activadora de TSHR S281I
Muestras de ensayo y dilución de suero
Concentración de AMP cíclico pmol/ml (media ± DT; n = 3) % de inhibición de la producción de AMP cíclico basal.
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
11,2 ± 2,0 0
HBD /10
12,1 ± 0,6 -8
HBD /50
10,0 ± 2,0 11
N1 /10
8,0 ± 1,6 28
N1 /50
10,8 ± 3,3 4
N2 /10
8,8 ± 1,4 21
N2 /50
8,8 ± 2,3 22
N3 /10
10,0 ± 0,8 17
N3 /50
9,3 ± 1,7 17
B2 /10
7,7 ± 039 31
B2 /50
5,7 ± 1,3 49
B3 /10
5,4 ± 0,5 52
B3 /50
6,6 ± 1,1 41
B4 /10
5,4 ± 1,1 52
B4 /50
4,9 ± 0,7 56
B5 /10
9,1 ± 2,5 18
B5 /50
7,6 ± 0,8 32
Véase Tabla 15 para notas explicativas. IgG 5C9 a 1 µg/ml provocó 71 % de inhibición de la actividad de AMP cíclico basal en los experimentos con TSHR S281I.
Tabla 17
Efecto de los autoanticuerpos de TSHR de sueros de pacientes con actividad antagonista (B2-B5) en los niveles de AMP cíclico basales en células CHO que expresan la mutación activadora de TSHR A623I
Muestras de ensayo y dilución de suero
Concentración de AMP cíclico pmol/ml (media ± DT; n = 3) % de inhibición de la producción de AMP cíclico basal
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
43,5 ± 11,2 0
Grupo de HBD /10
34,7 ± 4,5 20
Grupo de HBD /50
49,9 ± 5,7 -15
N1 /10
32,1 ± 2,5 26
N1 /50
43,9 ± 12,0 -1
N2 /10
51,1 ± 8,4 -17
N2 /50
32,6 ± 2,1 26
N3 /10
47,2 ± 7,1 -10
N3 /50
57,3 ± 16,5 -32
B2 /10
28,8 ± 1,1 34
B2 /50
43,9 ± 2,7 -1
B3 /10
33,5 ± 3,5 23
B3 /50
44,2 ± 12,7 -1
B4 /10
27,2 ± 6,6 37
B4 /50
23,9 ± 1,0 45
B5 /10
19,2 ± 6,3 56
B5 /50
40,6 ± 10,9 7
Véase Tabla 15 para notas explicativas. IgG 5C9 a 1 µg/ml provocó 49 % de inhibición de la actividad de AMP cíclico basal en experimentos con TSHR A623I.
Tabla 18
Efecto de los autoanticuerpos de TSHR de sueros de pacientes con actividad antagonista (B2-B5) en los niveles de AMP cíclico basales en una línea celular CHO que expresa TSHR de tipo silvestre (aproximadamente 5 x 105 receptores por célula)
Muestras de ensayo y dilución de suero
Concentración de AMP cíclico pmol/ml (media ± DT; n = 3) Cambio en la producción de AMP cíclico basal (%)
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
28,1 ± 0,7 100
HBD /10
37,5 ± 6,9 133
HBD /50
37,2 ± 2,4 132
N1 /10
27,7 ± 5,7 99
N1 /50
26,0 ± 4,8 93
N2 /10
41,0 ± 2,7 146
N2 /50
27,0 ± 1,2 96
N3 /10
34,3 ± 2,7 122
N3 /50
38,5 ± 7,8 137
B2 /10
39,7 ± 1,7 141
B2 /50
41,4 ± 3,8 147
B3 /10
74,0 ± 11,2 263
B3 /50
46,5 ± 8,7 165
B4 /10
8,7 ± 0,3 31
B4 /50
17,2 ± 1,9 61
B5 /10
54,2 ± 6,0 193
B5 /50
48,0 ± 10,5 171
Cambio en la producción de AMP cíclico basal (%) =
producción de AMP cíclico en presencia de muestra de ensayo x 100 producción de AMP cíclico en presencia de tampón de ensayo de AMP cíclico
En presencia de IgG 5C9 a 1 µg/ml, los niveles de AMP cíclico basales se redujeron al 33 % en relación con los niveles en presencia de tampón de ensayo de AMP cíclico.
Tabla 19
Sumario de los efectos de los autoanticuerpos de TSHR de sueros de pacientes con actividad antagonista (B2-B5) en los niveles de AMP cíclico basales en células CHO transfectadas con TSHR
Células CHO Concentración de AMP cíclico (fmol/pocillo celular; media DT, n =3) en presencia de:transfectadas con Grupo de HBD B2 B3 B4 B5 IgG 5C9
TSHR de tipos silvestre 5531 ± 1140 7949 ± 340 14804 ± 2240 1740 ± 68 10849 ± 1206 1872 ± 288
TSHR I568T 3900 ± 671 1066 ± 266 1660 ± 628 438 ± 90 3180 ± 650 548 ± 78 TSHR A623I 6420 ± 968 5760 ± 224 6700 ± 704 5440 ± 1324 7680 ± 1260 1914 ± 176 TSHR S281I 2420 ± 130 1538 ± 175 1080 ± 96 1080 ± 218 1822 ± 494 655 ± 60
Grupo de HBD = grupo de sueros de donantes de sangre sanos. El grupo de HBD y los sueros B2-B5 se usaron a dilución 1:10 en tampón de ensayo de AMP cíclico. IgG 5C9 se usó a una concentración de 1 µg/ml en tampón de ensayo de AMP cíclico. B2-B5 bloqueó la estimulación tanto de TSH como de M22 de la producción de AMP cíclico en células CHO que expresaban TSHR de tipo silvestre.
Tabla 20a
Efecto de IgG 5C9 en la producción de AMP cíclico estimulada por pTSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp43 mutado a Alanina.
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
277 ± 109 173 ± 81 76
TSH solamente
13924 ± 717 11651 ± 465 84
5B3a 10 µg/ml + TSH
14263 ± 2791 17452 ± 2160 122
5B3a 100 µg/ml + TSH
18892 ± 1222 126851 67
5C9 0,01 µg/ml + TSH
131451 12722 ± 695 97
5C9 0,1 µg/ml + TSH
7813 ± 505 6726 ± 488 86
5C9 1,0 µg/ml + TSH
2021 ± 515 471 ± 217 23
5C9 10 µg/ml + TSH
306 ± 287 119 ± 68 39
5C9 100 µg/ml + TSH
84 ± 93 312 37
5C9 100 µg/ml solamente
47 ± 23 206 ± 107 438
1media de determinaciones por duplicado2determinación individual concentración de pTSH = 3 ng/ml Todas las diluciones en tampón de ensayo de AMP cíclico a5B3 es un anticuerpo monoclonal humano para ácido glutámico descarboxilasa (GAD) (control negativo para 5C9).
Tabla 20b
Efecto de IgG 5C9 en la producción de AMP cíclico estimulada por pTSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Glu61 mutado a Alanina.
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
210 ± 101 146 ± 22 70
TSH solamente
12818 ± 2224 15398 ± 982 120
5B3a 10 µg/ml + TSH
11522 ± 2220 19750 ± 2950 171
5B3a 100 µg/ml + TSH
14090 ± 2394 15680 ± 2708 111
5C9 0,01 µg/ml + TSH
13806 ± 1188 18050 ± 2948 131
5C9 0,1 µg/ml + TSH
2886 ± 422 2114 ± 592 73
5C9 1,0 µg/ml + TSH
536 ± 150 766 ± 354 143
5C9 10 µg/ml + TSH
254 ± 208 346 ± 292 136
5C9 100 µg/ml + TSH
2021 328 ± 96 162
5C9 100 µg/ml solamente
218 ± 46 254 ± 48 117
Véase Tabla 20a para notas explicativas.
Tabla 20c
Efecto de IgG 5C9 en la producción de AMP cíclico estimulada por pTSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con His 105 mutado a Alanina.
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
245 ± 98 590 ± 72 241
TSH solamente
14214 ± 2111 17979 ± 1735 126
5B3a 10 µg/ml + TSH
13214 ± 3233 21359 ± 1501 162
5B3a 100 µg/ml + TSH
17232 ± 2641 24044 ± 3398 140
5C9 0,01 µg/ml + TSH
16652 ± 2252 24168 ± 1690 145
5C9 0,1 µg/ml + TSH
3511 ± 590 2869 ± 1460 82
5C9 1,0 µg/ml + TSH
454 ± 11 561 ± 393 124
5C9 10 µg/ml + TSH
289 ± 84 434 ± 392 150
5C9 100 µg/ml + TSH
2231 1341 60
5C9 100 µg/ml solamente
234 ± 50 520 ± 198 222
Véase Tabla 20a para notas explicativas.
Tabla 20d
Efecto de IgG 5C9 en la producción de AMP cíclico estimulada por pTSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Glu107 mutado a Alanina. Experimento 1
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
326 ± 157 1898 ± 594 582
TSH solamente
14838 ± 1396 13435 ± 2613 91
5B3a 10 µg/ml + TSH
14018 ± 3049 17074 ± 1442 122
5B3a 100 µg/ml + TSH
15949 ± 1340 16009 ± 4606 100
5C9 0,01 µg/ml + TSH
17001 ± 5209 15008 ± 1053 88
5C9 0,1 µg/ml + TSH
59501 5783 ± 3213 97
5C9 1,0 µg/ml + TSH
1058 ± 396 394 ± 314 37
5C9 10 µg/ml + TSH
496 ± 52 449 ± 116 91
5C9 100 µg/ml + TSH
193 ± 196 203 ± 56 105
5C9 100 µg/ml solamente
1266 ± 359 462 ± 324 36
Experimento 2
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
167 ± 148 1824 ± 354 1092
TSH solamente
17569 ± 3919 19358 ± 2365 110
5B3a 10 µg/ml + TSH
11692 ± 1161 21255 ± 2597 182
5B3a 100 µg/ml + TSH
24141 ± 1869 22933 ± 6554 95
5C9 0,01 µg/ml + TSH
18585 ± 5353 21028 ± 1432 113
5C9 0,1 µg/ml + TSH
4221 ± 1003 1544 ± 732 37
5C9 1,0 µg/ml + TSH
738 ± 48 281 4
5C9 10 µg/ml + TSH
214 ± 343 321 ± 514 150
5C9 100 µg/ml + TSH
2381 642 27
5C9 100 µg/ml solamente
211 ± 75 408 ± 138 193
Véase Tabla 20a para notas explicativas.
Tabla 20e
Efecto de IgG 5C9 en la producción de AMP cíclico estimulada por pTSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Phe130 mutado a Alanina.
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
345 ± 119 410 ± 85 119
TSH solamente
15897 ± 1291 16392 ± 1318 103
5B3a 10 µg/ml + TSH
18414 ± 1662 15765 ± 1088 86
5B3a 100 µg/ml + TSH
19561 ± 1078 21673 ± 3165 111
5C9 0,01 µg/ml + TSH
15255 ± 2166 17414 ± 1020 114
5C9 0,1 µg/ml + TSH
2712 ± 462 9015 ± 1835 332
5C9 1,0 µg/ml + TSH
398 ± 378 2235 ± 1635 562
5C9 10 µg/ml + TSH
151 ± 195 1139 ± 146 754
5C9 100 µg/ml + TSH
240 ± 199 603 ± 141 251
5C9 100 µg/ml solamente
334 ± 75 446 ± 41 134
Véase Tabla 20a para notas explicativas.
Tabla 20f Tabla 20g
Efecto de IgG 5C9 en la producción de AMP cíclico estimulada por pTSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Glu178 mutado a Alanina.
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
183 ± 77 366 ± 300 200
TSH solamente
8900 ± 1185 7666 ± 1659 86
5B3a 10 µg/ml + TSH
9160 ± 3180 10828 ± 1650 118
5B3a 100 µg/ml + TSH
12920 ± 1300 9428 ± 1350 73
5C9 0,01 µg/ml + TSH
12580 ± 2700 8166 ± 195 65
5C9 0,1 µg/ml + TSH
4354 ± 920 7314 ± 1830 168
5C9 1,0 µg/ml + TSH
688 ± 140 3570 ± 850 519
5C9 10 µg/ml + TSH
630 ± 140 1904 ± 360 302
5C9 100 µg/ml + TSH
7121 894 ± 120 126
5C9 100 µg/ml solamente
196 ± 58 134 ± 153 68
Véase Tabla 20a para notas explicativas.
Efecto de IgG 5C9 en la producción de AMP cíclico estimulada por pTSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Try185 mutado a Alanina.
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
139 ± 40 163 ± 72 117
TSH solamente
12649 ± 1577 8305 ± 870 66
5B3a 10 µg/ml + TSH
16974 ± 205 10088 ± 1856 59
5B3a 100 µg/ml + TSH
17089 ± 2282 10920 ± 2111 64
5C9 0,01 µg/ml + TSH
17264 ± 4257 9368 ± 2069 54
5C9 0,1 µg/ml + TSH
6217 ± 2064 4536 ± 724 73
5C9 1,0 µg/ml + TSH
1664 ± 636 1199 ± 1042 72
5C9 10 µg/ml + TSH
481 ± 380 301 ± 199 63
5C9 100 µg/ml + TSH
275 ± 206 ID
5C9 100 µg/ml solamente
123 ± 38 163 ± 60 133
ID = por debajo del límite de detección del ensayo. Véase Tabla 20a para otras notas explicativas.
Tabla 20h Tabla 20i
Efecto de IgG 5C9 en la producción de AMP cíclico estimulada por pTSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp203 mutado a Alanina.
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
298 ± 164 742 ± 122 249
TSH solamente
11770 ± 398 12594 ± 400 107
5B3a 10 µg/ml + TSH
13266 ± 1105 12232 ± 1819 92
5B3a 100 µg/ml + TSH
14125 ± 704 13006 ± 2452 92
5C9 0,01 µg/ml + TSH
15454 ± 422 14651 ± 511 95
5C9 0,1 µg/ml + TSH
4445 ± 405 13142 ± 1589 296
5C9 1,0 µg/ml + TSH
1352 ± 249 14678 ± 6312 1086
5C9 10 µg/ml + TSH
807 ± 479 12634 ± 1036 1566
5C9 100 µg/ml + TSH
367 ± 67 12721 ± 3187 3446
5C9 100 µg/ml solamente
330 ± 46 1368 ± 206 415
Véase Tabla 20a para notas explicativas.
Efecto de IgG 5C9 en la producción de AMP cíclico estimulada por pTSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Try206 mutado a Alanina.
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
380 ± 166 402 ± 96 106
TSH solamente
15360 ± 670 18440 ± 1390 120
5B3a 10 µg/ml + TSH
15880 ± 1150 21000 ± 2340 132
5B3a 100 µg/ml + TSH
19100 ± 3090 19680 ± 3200 103
5C9 0,01 µg/ml + TSH
16100 ± 2360 18420 ± 670 114
5C9 0,1 µg/ml + TSH
6220 ± 1500 10820 ± 1750 174
5C9 1,0 µg/ml + TSH
1306 ± 123 3460 ± 360 265
5C9 10 µg/ml + TSH
396 ± 158 1564 ± 176 395
5C9 100 µg/ml + TSH
292 ± 130 506 ± 120 173
5C9 100 µg/ml solamente
444 ± 98 482 ± 286 109
Véase Tabla 20a para notas explicativas.
Tabla 20j Tabla 20k
Efecto de IgG 5C9 en la producción de AMP cíclico estimulada por pTSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys209 mutado a Alanina.
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
316 ± 38 288 ± 80 91
TSH solamente
14200 ± 1420 9500 ± 1620 67
5B3a 10 µg/ml + TSH
12280 ± 610 11200 ± 3000 91
5B3a 100 µg/ml + TSH
16000 ± 1470 13240 ± 1530 83
5C9 0,01 µg/ml + TSH
15440 ± 2180 5960 ± 950 39
5C9 0,1 µg/ml + TSH
4700 ± 339 278 ± 40 6
5C9 1,0 µg/ml + TSH
1184 ± 59 360 ± 146 30
5C9 10 µg/ml + TSH
984 ± 117 482 ± 100 49
5C9 100 µg/ml + TSH
602 ± 240 354 ± 184 59
5C9 100 µg/ml solamente
272 ± 49 280 ± 104 103
Véase Tabla 20a para notas explicativas.
Efecto de IgG 5C9 en la producción de AMP cíclico estimulada por TSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp232 mutado a Alanina.
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
650 ± 87 652 ± 300 100
TSH solamente
15681 ± 866 14884 ± 1587 95
5B3a 10 µg/ml + TSH
15210 ± 1697 17800 ± 3219 117
5B3a 100 µg/ml + TSH
19704 ± 1173 17478 ± 3150 89
5C9 0,01 µg/ml + TSH
17600 ± 1347 15330 ± 1593 87
5C9 0,1 µg/ml + TSH
7329 ± 860 6556 ± 1668 89
5C9 1,0 µg/ml + TSH
1072 ± 705 1882 ± 653 176
5C9 10 µg/ml + TSH
794 ± 406 710 ± 596 89
5C9 100 µg/ml + TSH
166 ± 95 55 ± 51 33
5C9 100 µg/ml solamente
522 ± 84 991 19
Véase Tabla 20a para notas explicativas.
Tabla 20l Tabla 20m
Efecto de IgG 5C9 en la producción de AMP cíclico estimulada por pTSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Lys250 mutado a Alanina.
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
590 ± 86 1020 ± 104 173
TSH solamente
13332 ± 1177 10933 ± 1510 82
5B3a 10 µg/ml + TSH
11292 ± 1784 13410 ± 2930 119
5B3a 100 µg/ml + TSH
14236 ± 3521 14049 ± 3372 99
5C9 0,01 µg/ml + TSH
15191 ± 4117 14460 ± 2690 95
5C9 0,1 µg/ml + TSH
6295 ± 1897 8486 ± 2961 135
5C9 1,0 µg/ml + TSH
643 ± 207 2567 ± 841 399
5C9 10 µg/ml + TSH
286 ± 116 862 ± 398 301
5C9 100 µg/ml + TSH
158 ± 244 96 ± 57 61
5C9 100 µg/ml solamente
458 ± 94 448 ± 280 98
Véase Tabla 20a para notas explicativas.
Efecto de IgG 5C9 en la producción de AMP cíclico estimulada por pTSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Glu251 mutado a Alanina.
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
380 ± 84 960 ± 372 253
TSH solamente
18379 ± 987 17492 ± 1332 95
5B3a 10 µg/ml + TSH
15152 ± 4365 19951 ± 2362 132
5B3a 100 µg/ml + TSH
18169 ± 3454 20461 ± 1345 113
5C9 0,01 µg/ml + TSH
21197 ± 1280 21950 ± 936 104
5C9 0,1 µg/ml + TSH
8640 ± 2123 15532 ± 2571 180
5C9 1,0 µg/ml + TSH
915 ± 139 5240 ± 332 573
5C9 10 µg/ml + TSH
752 ± 127 1881 ± 212 250
5C9 100 µg/ml + TSH
496 ± 166 1170 ± 123 236
5C9 100 µg/ml solamente
460 ± 102 406 ± 212 88
Véase Tabla 20a para notas explicativas.
Tabla 20n Tabla 20o
Efecto de IgG 5C9 en la producción de AMP cíclico estimulada por pTSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Thr257 mutado a Alanina.
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
626 ± 153 1140 ± 153 182
TSH solamente
16928 ± 2079 18563 ± 1573 110
5B3a 10 µg/ml + TSH
17542 ± 1874 23341 ± 4203 133
5B3a 100 µg/ml + TSH
18948 ± 1444 20101 ± 2902 106
5C9 0,01 µg/ml + TSH
18722 ± 3876 21088 ± 1810 113
5C9 0,1 µg/ml + TSH
6143 ± 1233 7944 ± 1138 129
5C9 1,0 µg/ml + TSH
1396 ± 172 1594 ± 156 114
5C9 10 µg/ml + TSH
638 ± 58 972 ± 12 152
5C9 100 µg/ml + TSH
591 ± 99 611 ± 52 103
5C9 100 µg/ml solamente
566 ± 143 637 ± 300 111
Véase Tabla 20a para notas explicativas.
Efecto de IgG 5C9 en la producción de AMP cíclico estimulada por pTSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Arg274 mutado a Alanina.
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
124 ± 103 86 ± 38 69
TSH solamente
21347 ± 1112 11432 ± 2511 54
5B3a 10 µg/ml + TSH
18654 ± 3700 12961 ± 2609 69
5B3a 100 µg/ml + TSH
26203 ± 4753 13138 ± 2248 50
5C9 0,01 µg/ml + TSH
16345 ± 3974 9557 ± 2479 58
5C9 0,1 µg/ml + TSH
4997 ± 1392 1320 ± 158 26
5C9 1,0 µg/ml + TSH
808 ± 510 177 ± 120 22
5C9 10 µg/ml + TSH
684 ± 182 1081 16
5C9 100 µg/ml + TSH
246 ± 165 172 7
5C9 100 µg/ml solamente
111 ± 26 34 ± 43 31
Véase Tabla 20a para notas explicativas.
Tabla 20p Tabla 21
Efecto de IgG 5C9 en la producción de AMP cíclico estimulada por pTSH en células CHO que expresan TSHR de tipo silvestre y TSHR con Asp276 mutado a Alanina. Experimento 1
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
365 ± 166 1454 ± 258 398
TSH solamente
17500 ± 727 22416 ± 2570 128
5B3a 10 µg/ml + TSH
19354 ± 1794 25180 ± 5609 130
5B3a 100 µg/ml + TSH
21671 ± 2064 25707 ± 4101 119
5C9 0,01 µg/ml + TSH
17236 ± 2705 26212 ± 2597 152
5C9 0,1 µg/ml + TSH
5594 ± 723 16856 ± 2110 301
5C9 1,0 µg/ml + TSH
7591 4788 ± 553 631
5C9 10 µg/ml + TSH
366 ± 145 1384 ± 602 378
5C9 100 µg/ml + TSH
344 ± 566 565 ± 176 164
5C9 100 µg/ml solamente
300 ± 242 602 ± 274 201
Experimento 2
Muestra de ensayo
AMP cíclico producido (fmol/pocillo celular; media ± DT, n=3) Mutado/tipo silvestre (%)
TSHR de tipo silvestre
TSHR mutado
Tampón de ensayo de AMP cíclico solamente
156 ± 30 601 ± 190 385
TSH solamente
13852 ± 756 14616 ± 453 106
5B3a 10 µg/ml + TSH
13025 ± 3292 177061 136
5B3a 100 µg/ml + TSH
14245 ± 1024 18041 ± 4561 127
5C9 0,01 µg/ml + TSH
14066 ± 2291 21213 ± 3443 151
5C9 0,1 µg/ml + TSH
4462 ± 363 7320 ± 1614 164
5C9 1,0 µg/ml + TSH
657 ± 257 1513 ± 835 230
5C9 10 µg/ml + TSH
541 ± 224 1301 ± 911 240
5C9 100 µg/ml + TSH
286 ± 184 288 ± 87 101
5C9 100 µg/ml solamente
208 ± 15 314 ± 69 151
Véase Tabla 20a para notas explicativas.
Sumario de efectos de las mutaciones de TSHR (en relación con el tipo silvestre) en la capacidad de IgG 5C9 e IgG 9D33 para bloquear la estimulación por TSH de la producción de AMP cíclico en células CHO transfectadas con TSHR
Mutación de TSHR
Estimulación (en relación con el tipo silvestre) de la producción de AMP cíclico por pTSH Bloqueo (en relación con el tipo silvestre) de la estimulación por TSH de la producción de AMP cíclico por IgG 5C9 Bloqueo (en relación con el tipo silvestre) de la estimulación por TSH de la producción de AMP cíclico por IgG 9D33
Tipo silvestre
+++++ +++++ +++++
Asp 43 Ala
+++ +++++ +++++
Lys 58 Ala
+++++ +++++ 0
Ile 60 Ala
+++++ +++++ +++++
Glu 61 Ala
++++ +++++ +++++
Arg 80 Ala
+++++ +++++ 0
Tyr 82 Ala
+++++ +++++ 0
Thr 104 Ala
+++++ +++++ NE
His 105 Ala
+++++ +++++ NE
Glu 107 Ala
+++ +++++ +++++
Arg 109 Ala
+++++ +++++ 0
Lys 129 Ala
+++++ 0 0
Phe 130 Ala
+++++ +++ +++++
Phe 134 Ala
+++++ +++++ ++
Asp 151 Ala
+++++ ++++ NE
Glu 178 Ala
++++ +++ ++++
Lys 183 Ala
+++++ + +++++
Tyr 185 Ala
++++ +++++ +++++
Asp 203 Ala
++++ 0 +++++
Tyr 206 Ala
++++ +++ +++++
Lys 209 Ala
++++ +++++++ +++++
Asp 232 Ala
+++ +++++ +++++
Gln 235 Ala
+++++ +++++ +++++
Lys 250 Ala
+++++ ++++ ++++
Glu 251 Ala
+++++ +++ +++++
Arg 255 Ala
+++++ +++++ +++++
Thr 257 Ala
+++++ +++++ +++++
Trp 258 Ala
+++++ +++++ +++++
Arg 274 Ala
+++++ +++++++ +++++++
Asp 276 Ala
+++++ ++++ +++++
Ser 281 Ala
++++ +++++ ++++
Arg 80 Asp
++++ +++++ 0
Asp 151 Arg
+++++ +++++ NE
Lys 183 Asp
+++ + +++++
Arg 255 Asp
+++++ +++++ +++++++
Asp 160 Lys
0 +++++a NE
concentración de pTSH usada = 3 ng/ml. Los efectos relativos de las mutaciones de TSHR se expresaron como un porcentaje de la actividad observada con el tipo silvestre de la siguiente manera: +++++ = 100 % de actividad de tipo silvestre; ++++ = < 100-80 % de actividad de tipo silvestre; +++ = <80-60 % de actividad de tipo silvestre; ++ = <60-40 % de actividad de tipo silvestre; + = <40-20 % de actividad de tipo silvestre; 0 = <20 % de actividad de tipo silvestre, y actividad aumentada en relación con el tipo silvestre: >100 % = +++++++. NE = No Ensayado. aLa estimulación de AMP cíclico para este experimento se ensayó usando M22 debido a la falta de respuesta a TSH (véase el texto para detalles)
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> R S R Limited 5 <120> Productos
<130> P108503PCT
<150> GB 0702990.3
<151>
<150> GB 0714036.1
<151> 15 <160> 11
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1 25
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
55 <210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5 5
<210> 6
<211> 10 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
<210> 7
<211> 699
<212> ADN 20 <213> Homo sapiens
<400> 7
25
<210> 8
<211> 617
<212> ADN
<213> Homo sapiens
30
<400> 8
<210> 9
<211> 233
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9 <210> 10
<211> 205
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10 <210> 11
<211> 764
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11

Claims (28)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado para el Receptor de Hormona Estimulante del Tiroides (TSHR) que es un antagonista de la Hormona Estimulante del Tiroides (TSH) y tiene una afinidad de unión por el TSHR humano de longitud completa de aproximadamente 109 l/mol, en donde el anticuerpo comprende una región VH que comprende:
    SNYMS (CDR1); VTYSGGSTSYADSVKG (CDR2); y GGRYCSSISCYARSGCDY (CDR3),
    y una región VL que comprende:
    RASQSISNYLN (CDR1); AASSLQS (CDR2); y QQSYSSPSTT (CDR3).
  2. 2.
    Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 9 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 7 y la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 10 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 8.
  3. 3.
    Un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 que tiene una afinidad de unión por el TSHR de longitud completa humano de aproximadamente 1010 l/mol.
  4. 4.
    Un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 o 3 que inhibe la actividad constitutiva de TSHR.
  5. 5.
    Un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2, 3 o 4 que es un antagonista de anticuerpos estimulantes del tiroides.
  6. 6.
    Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5 que es un antagonista de la TSH y es un antagonista de anticuerpos estimulantes del tiroides.
  7. 7.
    Un anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que es un inhibidor de la unión con TSHR o una parte del mismo por TSH, por anticuerpos con actividad estimulante o anticuerpos con actividad de bloqueo para el TSHR.
  8. 8.
    Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la parte de TSHR incluye el Dominio Rico en Leucina (LRD) de TSHR o una parte sustancial del mismo.
  9. 9.
    Un nucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  10. 10.
    Un vector que comprende un nucleótido de acuerdo con la reivindicación 9.
  11. 11.
    Una célula aislada que incluye un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  12. 12.
    Una composición que comprende una concentración definida de autoanticuerpos de TSHR y que incluye un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  13. 13.
    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  14. 14.
    Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, incluyendo la composición uno o más antagonistas del receptor de la hormona estimulante del tiroides adicionales.
  15. 15.
    Un método para producir un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo el método cultivar una célula de acuerdo con la reivindicación 11 por lo que el anticuerpo es expresado por la célula.
  16. 16.
    Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para uso en terapia médica.
  17. 17.
    Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para uso en el tratamiento de una afección relacionada con el tiroides.
  18. 18.
    Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 17 en el que la afección relacionada con el tiroides se selecciona de hiperactividad del tiroides, enfermedad ocular de Graves, hipertiroidismo neonatal, hipertiroidismo inducido por
    gonadotropina coriónica humana, mixoedema pretibial, cáncer de tiroides y tiroiditis.
  19. 19.
    Un método para caracterizar anticuerpos de TSHR, comprendiendo el método determinar la unión de un anticuerpo de TSHR que se ensaya con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos relacionada con TSHR en donde el método implica una etapa de método que incluye el uso de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  20. 20.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 18, comprendiendo el método determinar los efectos de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la unión de un anticuerpo de TSHR con ese polipéptido.
  21. 21.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 20 en el que el polipéptido relacionado con TSHR comprende TSHR humano de longitud completa.
  22. 22.
    Un método para caracterizar la TSH y moléculas relacionadas, que comprende determinar la unión de la TSH o de una molécula relacionada que se ensaya con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos relacionada con TSHR, en donde el método implica una etapa de método que incluye el uso de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  23. 23.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 22 en un formato de ELISA.
  24. 24.
    Un método para determinar los aminoácidos de TSHR implicados en la unión de autoanticuerpos de TSHR que actúan como antagonistas, comprendiendo el método proporcionar un polipéptido que tiene una primera secuencia de aminoácidos relacionada con TSHR a la que se une un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, modificar al menos un aminoácido en la secuencia de aminoácidos relacionada con TSHR y determinar el efecto de dicha modificación en la unión del anticuerpo.
  25. 25.
    Un método para modificar un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo el método modificar al menos un aminoácido del anticuerpo y determinar un efecto de dicha modificación en la unión con una secuencia relacionada con TSHR.
  26. 26.
    Un método para identificar moléculas que inhiben anticuerpos estimulantes del tiroides que se unen con el TSHR, comprendiendo el método proporcionar al menos un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 como referencia.
  27. 27.
    Un método para identificar moléculas que inhiben anticuerpos de bloqueo del tiroides que se unen con el TSHR, comprendiendo el método proporcionar al menos un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 como referencia.
  28. 28.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 27 en el que se seleccionan moléculas que impiden la unión de anticuerpos de bloqueo del tiroides con TSHR.
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