ES2524975T3 - Cepa del virus de la fiebre amarilla de alto rendimiento con mayor propagación en células - Google Patents
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Abstract
Una cepa del virus de la fiebre amarilla modificado, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de la envuelta, en la que la molécula de ácido nucleico de dicha cepa comprende una mutación en el codón para el aminoácido en la posición 160, en la que la mutación del ácido nucleico en el codón para el minoácido en la posición 160 de la proteína de la envuelta produce un cambio de codón de lisina a arginina
Description
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E10804909
26-11-2014
DESCRIPCIÓN
Cepa del virus de la fiebre amarilla de alto rendimiento con mayor propagación en células
Antecedentes de la invención
El virus de la fiebre amarilla es endémico, es decir, está presente continuamente con bajos niveles de infección en algunas áreas tropicales de África y las Américas, en donde cada cierto tiempo se expande para formar epidemias. Otras partes del mundo, que incluyen las regiones costeras de Sudamerica, las islas del Caribe, y America del Norte y Central, están infestadas por el mosquito vector capaz de transmitir el virus y, por tanto, se considera que están en riesgo de padecer epidemias de fiebre amarilla (World Health Organization Fact Sheet No. 100, revisado diciembre, 2001).
Por ejemplo, solo en África, están es riesgo treinta y tres países con una población reunida de 508 millones de personas (Id.). Cada año, la Organización Mundial de la Salud (OMS) calcula que se producen 200.000 casos se fiebre amarilla, con 30.000 muertes (Id.). También se cree que los viajes a estas regiones tropicales originan un pequeño número de casos importados en países en general libres de la fiebre amarilla. Aunque no se han indicado casos de fiebre amarilla en Asia, “esta región está en riesgo, porque están presentes los primates y los mosquitos apropiados” (Id.).
El virus de la fiebre amarilla (YF, “Yellow Fever”) pertenece al género Flavivirus, de la familia Flaviviridae. En el denominado “ciclo selvático” o “de la jungla”, el virus YF es enzoótico, mantenido y transmitido por mosquitos que se reproducen en el dosel a los monos en la selva. El “ciclo urbano” comienza cuando los seres humanos se infectan cuando entran en la selva y son picados por mosquitos infectados por YF. El “ciclo urbano” continúa con la transmisión peridoméstica desde los seres humanos a los mosquitos y, por tanto, a otros seres humanos, y puede provocar una epidemia de fiebre amarilla en pueblos y ciudades. La enfermedad varía en gravedad desde una enfermedad febril autolimitada a una hepatitis grave y enfermedad hemorrágica mortal.
Los seres humanos no vacunados, que incluyen los nativos y los que viajan a áreas endémicas de YF, están en riesgo significativo de infección por YF cuando sus actividades laborales y otro tipo de actividades les ponen en contacto con mosquitos infectados en el ciclo selvático o el ciclo urbano.
Los pacientes con fiebre amarilla pueden ser virémicos, es decir, tener el virus en la sangre, durante 3 a 6 días durante la fase temprana de la enfermedad. A esta fase le puede seguir un corto periodo de remisión de los síntomas.
La fase tóxica se desarrolla a medida que vuelve la fiebre, con unos síntomas clínicos que incluyen, por ejemplo, fiebre alta y náuseas, síntomas hemorrágicos, que incluyen hematemesis (vómito negro), epistaxis (sangrado de la nariz), sangrado de las encías, y hemorragias petequiales y purpúricas (hematomas). En los casos graves a menudo se produce un mayor ictericia y proteinuria.
En los estadios tardíos de la enfermedad, los pacientes pueden desarrollar hipotensión, choque, acidosis metabólica, necrosis tubular aguda, disfunción miocárdica, y arritmia cardíaca. También puede producirse confusión, ataques y coma, así como complicaciones, tales como infecciones bacterianas secundarias e insuficiencia renal.
No existe un tratamiento específico para la fiebre amarilla. Los pasos para evitar la fiebre amarilla incluyen el uso de repelentes de insectos, ropa protectora, y vacunación con la vacuna atenuada que está disponible, aunque presenta riesgos.
El documento US2007/269458 A1 describe un virus de la fiebre amarilla recombinante que tiene una mutación en uno o más aminoácidos de la región bisagra en la proteína E en las posiciones 48-61, 127-131, 196-283. El objetivo de este documento es proporcionar mejores rendimientos para fabricar vacunas.
Están disponibles vacunas vivas atenuadas producidas a partir de la subcepa 17D, pero ciertos acontecimientos adversos asociados con la vacuna atenuada pueden conducir a una grave infección con el virus 17D vivo y a acontecimientos neurotrópicos y viscerotrópicos graves y mortales, pareciéndose estos últimos a la infección grave por el virus YF de tipo salvaje. Por tanto, es necesaria una vacuna no replicante, inactivada y más segura que suscite una respuesta de anticuerpos neutralizantes, a la par que elimine el potencial para la aparición de aconticimientos neurotrópicos y viscerotrópicos adversos.
Por tanto, existe una necesidad no cubierta de una vacuna no replicante o “muerta”, inactivada y eficaz para evitar el potencial para la aparición de los acontecimientos neurotrópicos y viscerotrópicos adversos asociados con la vacuna de YF 17D atenuada disponible en la actualidad. Además, es necesaria una vacuna mejorada producida en células Vero sin proteínas derivadas de animales, una vacuna que pueda ser utilizada con seguridad por personas para las cuales la vacuna viva está contraindicada, o para las cuales aparecen advertencias en la etiqueta. Estos individuos incluyen personas inmunodeprimidas, personas con enfermedad tímica, personas alérgicas al huevo, niños pequeños y ancianos.
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Un problema con cualquier virus potencialmente inactivado es que necesita administrarse a una titulación mayor que las vacunas atenuadas vivas existentes, puesto que estas últimas pueden expandir la masa antigénica durante los ciclos de replicación en el hospedante, mientras que una vacuna inactivada contiene una dosis fija de antígeno. Por tanto, para desarrollar una vacuna inactivada suficientemente potente resulta deseable modificar el virus YF para producir un alto rendimiento del virus en el fluido sobrenadante de un cultivo celular. Resulta muy deseable emplear la cepa de la vacuna 17D atenuada para la fabricación de vacunas, puesto que la cepa 17D puede ser manipulada a un nivel de biocontención más bajo que el virus YF virulento de tipo salvaje, y la vacuna resultante sería más segura en el caso en que algunos virus vivos residuales estuviesen presentes en el producto final. Sin embargo, los rendimientos de la cepa de la vacuna 17D atenuada en cultivo celular son inherentemente menores que los rendimientos del virus de tipo salvaje. Por estas razones, serían útiles modificaciones de la cepa de la vacuna 17D para lograr mayores rendimientos en el cultivo celular empleado para la producción de vacunas.
Breve sumario de la invención
La invención proporciona una vacuna que comprende una cepa o cepas del virus de la fiebre amarilla que se han adaptado para propagarse en células Vero con rendimientos mayores que un virus inadaptado. Un “virus inadaptado” significa la vacuna del virus de la fiebre amarilla conocida como 17D. El análisis de la secuencia de ejemplos de este virus demuestra que un virus adaptado que posee una mutación en la proteína de la envuelta (E) que provoca una sustitución de lisina a arginina en el resto aminoácido 160 tiene propiedades mejoradas. La invención proporciona vacunas que comprenden un virus de la fiebre amarilla que contiene una o más mutaciones en la proteína E, que dan como resultado una mayor propagación en células Vero y unos rendimientos mayores que un virus inadaptado.
El virus de la fiebre amarilla es la especie prototípica del género Flavivirus, de la familia Flaviviridae. Los estudios estructurales y funcionales de la proteína E del virus de la encefalitis portado por garrapatas (TBE), un miembro virulento de crecimiento rápido del género Flavivirus, indican que los dominios I y II de la proteína E de TBE participan en un cambio conformacional dependiente de pH ácido que facilita la fusión de membrana del flavivirus con el hospedante y la posterior infectividad. El punto de unión de los dominios I y II actúa como “bisagra molecular” que provoca una importante redisposición de estos dominios desde la estructura dimérica normal de la proteína E a pH ácido a un estado homotrimérico. Rey, F.A. et al., The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution, Nature, 375:291-298 (1995); Heinz, F.X. et al., Structural changes and functional control of the tickborne encephalitis virus glycoprotein E by the heterodimeric association with protein prM, Virology, 198:109-117 (1994); Mandl, C.W. et al., Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tickborne encephalitis virus as a model, Journal of Virology, 63(2):564- 571 (1989); Harrison, S.C., Viral membrane fusion, Nature structural and molecular biology, 15(7):690-698 (2008); Stiasny, K. et al., Molecular mechanisms of flavivirus membrane fusion, Amino acids, DOI 10.1007/s00726-009-0370-4, publicado en línea el 01 de noviembre de 2009.
La Lys 160 en la proteína E del virus de la fiebre amarilla está localizada en la región de la bisagra molecular entre los dominios I y II. Las mutaciones en esta región pueden alterar el cambio conformacional dependiente de pH ácido en la región del dominio I de la proteína E necesaria para la fusión y la internalización del virus hacia el citoplasma celular. Aunque no se pretenda limitación alguna por la teoría, los mayores rendimientos observados con el cambio de lisina a arginina en el aminoácido 160 en el dominio I de la proteína E de la cepa del virus de la fiebre amarilla adaptado pueden ser debidos a una mayor afinidad por los protones que proporciona la arginina, comparada con la lisina, que da como resultado una fusión de membrana potenciada con el hospedante y una infectividad más eficaz. Con respecto a la invención, es importante advertir que las cadenas laterales de la lisina y la arginina tienen unos valores de pKa de 10,53 y 12,48, respectivamente, lo cual indica una afinidad mayor en cien veces por los protones de la arginina con respecto a la lisina. La mayor afinidad por los protones que muestra la cadena lateral de la arginina con relación a la cadena lateral de la lisina puede aumentar la velocidad y la eficacia del cambio conformacional de la proteína E en la bisagra molecular, la fusión de membrana y la infectividad del flavivirus, lo cual da como resultado unos rendimientos mayores del virus en la cepa del virus adaptado.
Por tanto, en un primer aspecto, la invención proporciona una cepa del virus de la fiebre amarilla modificado, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de la envuelta, en la que la molécula de ácido nucleico de dicha cepa comprende una mutación en el codón para el aminoácido en la posición 160, en la que la mutación del ácido nucleico en el codón para el aminoácido en la posición 160 de la proteína de la envuelta produce un cambio del codón desde la lisina a la arginina. El virus de la fiebre amarilla modificado se inactiva con betapropiolactona.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a una vacuna que comprende una cepa del virus de la fiebre amarilla modificado inactivado como se indicó anteriormente, que comprende además opcionalmente un adyuvante, en la que el adyuvante es preferiblemente hidróxido de aluminio.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende la anterior vacuna o el virus de la fiebre amarilla como se indicó anteriormente, para su uso para inducir una respuesta inmunológica frente al virus de la fiebre amarilla en un sujeto. El sujeto puede estar en riesgo de desarrollar una infección por el virus de la fiebre amarilla, pero aún no la ha adquirido.
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En un cuarto aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico según se describió anteriormente, que comprende una secuencia que codifica una proteína de la envuelta del virus de la fiebre amarilla según se indicó anteriormente, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una mutación de nucleótidos en el codón para el aminoácido en la posición 160 de la proteína de la envuelta, en la que la mutación del ácido nucleico en el codón para el aminoácido en la posición 160 de la proteína de la envuelta preferiblemente produce un cambio de AAG a AGG, AGA, CGC, CGA, CGG o CGU. La molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia que codifica una proteína de la envuelta modificada del virus de la fiebre amarilla, en la que dicha molécula de ácido nucleico codifica la secuencia de proteína de SEQ ID NO:4 o 6.
En un quinto aspecto, la invención se refiere a un método para fabricar una vacuna, que comprende cultivar células infectadas con una cepa del virus de la fiebre amarilla modificado, según se describió anteriormente. Las células pueden ser células Vero. El método puede comprender también la etapa de tratar la cepa del virus de la fiebre amarilla modificado con un agente inactivante, en el que el agente inactivante es preferiblemente beta-propiolactona.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una representación esquemática de la historia de las transferencias de células Vero durante la fabricación de la vacuna de la fiebre amarilla descrita.
La figura 2 es una representación esquemática de la preparación de las semillas de virus.
La figura 3A es un esquema del proceso empleado para 10 transferencias en serie (P1 a P10) para modificar la secuencia de nucleótidos del genoma vírico del virus para desarrollar una semilla de virus con un crecimiento potenciado en células Vero para la preparación de un virus de la fiebre amarilla inactivado candidato.
La figura 3B es una representación gráfica de la replicación del virus para la transferencia 1 (P1) y la transferencia 11 (P11).
La figura 3C es una representación gráfica del estudio de transferencias repetidas del virus de la transferencia 1 (Ap1, Bp1, Cp1) y la transferencia 11 (A-p11, B-p11, C-p11) realizadas en una serie de experimentos, la serie A, B y
C.
La figura 4A-I muestra el alineamiento consenso de las secuencias de los ácidos nucleicos de P1 y P11. La secuencia de ácido nucleico de partida, P1, se identifica en la presente como SEQ ID NO:1. Una comparación de la transferencia P1 y la transferencia P11 reveló una mutación genética en el resto nucleótido n.º 211 de SEQ ID NO:1, y una segunda mutación en el resto nucleótido n.º 1452 de SEQ ID NO:1. Por tanto, “P1 consenso” se corresponde con SEQ ID NO:1, y “P11 consenso” se corresponde con SEQ ID NO:2 que tiene la mutación del codón en la posición del aminoácido 160 de la proteína de la envuelta.
La figura 5A-Q muestra la secuencia de aminoácidos de P1 y P11, con las secuencias de aminoácidos de la serie B-P1 y la serie B3-P11 del estudio de la transferencia repetida. La secuencia de aminoácidos de P1 se identifica en la presente como SEQ ID NO:3. Una comparación de la secuencia de aminoácidos de P1 y P11 (SEQ ID NO:4) revela una mutación en el resto aminoácido 160 de la proteína de la envuelta (E160) (aminoácido 445 de la figura 5C). La serie B-P1 y la serie B3-P11 presentan secuencias de aminoácidos parciales del estudio de transferencias repetidas. La secuencia de aminoácidos de B3-P1 se identifica en la presente como SEQ ID NO:5. Una comparación de la secuencia de aminoácidos de P1 y B3-P11 (SEQ ID NO:6) revela una mutación en el resto aminoácido 160 de la proteína de la envuelta (E160) en B3-P11 (aminoácido 445).
La figura 6 muestra las titulaciones del ensayo de neutralización de reducción de placas en 50% (PRNT50) comparativo entre los grupos de tratamiento de ratones de la raza BALB/c y CD-1 en un estudio preliminar en ratones (M-9003-002) de la eficacia de la vacuna de la fiebre amarilla inactivada.
La figura 7 es una representación gráfica de las titulaciones de anticuerpos PRNT50 para el estudio preliminar en ratones (M-9003-002).
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Resumen de la estrategia y beneficios
La invención se refiere a composiciones y su uso para prevenir la infección por el virus de la fiebre amarilla. En la presente se describe un método para producir un virus de la fiebre amarilla inactivado candidato, comprendiendo dicho método la transferencia en serie del virus YF 17D (es decir, un “virus inadaptado”) en células de riñón de mono verde africano certificadas (VERO) para aumentar la titulación para producir una masa antigénica suficiente para inducir una respuesta inmunológica protectora y/o para modificar la secuencia de nucleótidos del genoma vírico. Este método se ha repetido y ha demostrado ser reproducible.
Una realización de la invención es un virus de la fiebre amarilla (YF) modificado que crece en altas titulaciones en células Vero. Otra realización de la invención es una vacuna que comprende un virión completo, un virus de la fiebre
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amarilla (YF) químicamente inactivado preparado a partir del fluido sobrenadante sin suero procedente de células Vero infectadas con el virus 17D. En una realización de la invención, el virus se ha purificado a partir del ADN y proteínas de la célula hospedante mediante filtración en profundidad, ultrafiltración, diafiltración y separación cromatográfica. El método se describe en la solicitud de EEUU n.º de serie 61/228.026, presentada el 23 de julio, 2009, y su correspondiente solicitud internacional titulada “Drain Down and Re-Feed of Microcarrier Bioreactor”, presentada la misma fecha que la presente en nombre de Guertin y Crowell (n.º de expediente del abogado RF-116, solicitud internacional n.º ___). El virus purificado puede inactivarse empleando un método que asegure el mantenimiento de los epitopos neutralizantes críticos. Por ejemplo, el virus puede inactivarse empleando formaldehído, calor, UV, irradiación con rayos gamma y beta-propiolactona. Un virus inactivado y purificado puede formularse con un adyuvante, tal como adsorbido sobre un adyuvante de hidróxido de aluminio, y conservarse como un líquido a una temperatura de aproximadamente 2 ºC a aproximadamente 8 ºC.
Se cree que una vacuna que contenga el virus inactivado y purificado sería más segura que la vacuna del virus YF vivo atenuado, disponible en la actualidad, porque la vacuna del virus YF inactivado descrita no es replicante. Los inventores del presente contenido ahora han desarrollado una vacuna de YF no replicante, inactivada y más segura que induce una respuesta de anticuerpos neutralizantes, a la par que elimina el potencial para acontecimientos adversos neurotrópicos y viscerotrópicos. Además, la vacuna mejorada puede fabricarse por medio de métodos modernos en células Vero sin proteínas derivadas de animales y, por tanto, puede utilizarse con seguridad en personas (que incluyen personas alérgicas al huevo), para las cuales la vacuna viva (producida en huevos de gallina) está contraindicada, o para las cuales aparecen advertencias en la etiqueta. Estas advertencias incluyen, por ejemplo, advertencias para personas inmunodeprimidas, personas con enfermedad tímica, personas alérgicas al huevo, bebés menores de 9 meses, y ancianos.
Adaptación del virus de la fiebre amarilla para la producción robusta en células Vero
Las células Vero utilizadas en la fase del desarrollo del virus se obtuvieron del lote de semillas de la Organización Mundial de la Salud (OMS) del banco de células Vero 10-87 en la transferencia 134 de la OMS. El banco de células Vero 10-87 de la OMS fue preparado originariamente por el Institut Merieux empleanado la línea de células Vero ATCC CCL81 en la transferencia 129. Las células se descongelaron en medio OptiPRO SFM (“serum-free medium”, medio sin suero) suplementado con suero bovino fetal al 5% que se retiró 24 horas después y se reemplazó por medio OptiPRO SFM sin suero bovino fetal. El suero, certificado como originario de EEUU, se irradió con rayos gamma. Ya había sido ensayado para detectar agentes adventicios por el fabricante; en WuXi AppTec se realizaron más ensayos sobre este material para la esterilidad, la presencia de micoplasmas y virus adventicios. Todas las transferencias posteriores de células Vero para preparar los bancos de células, las semillas de virus y las vacunas se realizaron en OptiPRO SFM sin suero. No se emplearon otros materiales o productos derivados de animales para la producción de los bancos de células o la vacuna final según una realización de la invención.
Preparación de los bancos de células Vero
Se prepararon los bancos de células maestro y de trabajo según cGMP y se ensayaron y caracterizaron según los puntos a considerar de la FDA. Las células Vero tenían una procedencia establecida y no presentaban problemas legales con respecto a la encefalitis espongiforme bovina (BSE). Se empleó medio de crecimiento sin suero para la propagación de las células.
Historia de las transferencias de las células Vero durante la fabricación de las semillas de virus y los lotes de vacunas
La historia de las transferencias de las células Vero durante la fabricación de la vacuna de la fiebre amarilla descrita se muestra de modo esquemático en la figura 1. Las células de la OMS se recibieron en la transferencia 134, y se establecieron los bancos del banco de células maestro (“Master Cell Bank”, MCB) y el banco de células de trabajo (“Working Cell Bank”, MWCB) en las transferencias 139 y 143, respectivamente. Las células se volvieron a expandir un máximo de 11 transferencias hasta la transferencia 154 durante la expansión de las células en cultivos estacionarios antes de sembrarlas en el biorreactor utilizado para la producción de virus. Se calcula que el número de duplicaciones de la población en el biorreactor es de 1 a 3.
Preparación de las semillas de virus maestras y de trabajo
La figura 2 es una representación esquemática de la preparación de semillas de virus según una realización de la invención. Un factor de seguridad importante para la vacuna descrita es el uso de la vacuna YF 17D atenuada para la fabricación. El virus atenuado empleado como material de partida fue una vacuna del mercado, YF-VAX® (Sanofi Pasteur, Swiftwater, PA) que se había sometido a diversos ensayos para la detección de agentes adventicios. El material YF-VAX® original empleado para inocular a las células Vero se originó de huevos de gallina embrionados y contenía gelatina porcina hidrolizada como estabilizante. Sin embargo, la probabilidad de trasladar un agente adventicio desde los huevos se mitigó mediante el uso de una transfección de ARN para producir la semilla de virus premaestra.
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Las células se propagaron en medio OptiPro-SFM (Invitrogen, Grand Island, NY). Para desarrollar el virus de la fiebre amarilla (YF) modificado que crecerá en altas titulaciones en células Vero, se empleó inicialmente el virus YF17D a 0,01 de multiplicidad de infección (MOI) para infectar un matraz T-25 con una capa confluente de células Vero. El cultivo celular se incubó a 37 ºC y CO2 al 5%.
Cuando se observó un efecto citopático (CPE) en aproximadamente 2 + (50%) de las células, se prepararon partes alícuotas del cultivo, se marcaron como transferencia uno (P1) y se conservaron a -80 ºC para su uso como inóculo para continuar las transferencias en serie. En la figura 3A se muestra un esquema del procedimiento empleado para fabricar de P1 a P10.
Una parte alícuota del virus de la transferencia 1 (P1) se diluyó 10-1 a 10-8 y cada dilución se inoculó en monocapas confluentes de tres (3) cultivos de células Vero propagadas en placas de 12 pocillos estériles de las cuales se había retirado el medio de crecimiento.
Se prepararon diluciones de log10 transfiriendo 0,2 ml del virus a 1,8 ml de disolución salina tamponada con fosfato (PBS) para igualar a una dilución 10-1 . Los virus más PBS se mezclaron y se empleó una nueva pipeta para transferir 0,2 ml a 1,8 ml de PBS = 10-2, y después se repitió hasta la dilución 10-8. Se marcaron doce pocillos con monocapas confluentes de cultivo de células Vero y se prepararon diluciones de log10 del material de P1 (control negativo, 10-1 (3 pocillos), 10-2 (3 pocillos), 10-3 (3 pocillos), 10-4 (3 pocillos), 10-5 (3 pocillos), 10-6 (3 pocillos), 10-7 (3 pocillos) y 10-8 (3 pocillos)) y se inocularon en cultivos sin medio empleando una nueva pipeta para cada dilución del inóculo. Los cultivos de control negativo se inocularon con un volumen similar de PBS. Después de inocular los cultivos se incubaron a 37 ºC durante 1 hora con balanceo intermitente y después se añadió 1,0 ml de medio de mantenimiento por cultivo. Las células se observaron cada día para observar un efecto citopático (CPE) y se marcaron como 1+ (25% de la monocapa celular afectada), 2+ (50% de la monocapa celular afectada), 3+ (75% de la monocapa celular afectada), y 100% (toda la monocapa celular afectada). Los cálculos del CPE se basaron en la comparación con las células control. También se realizó el ensayo de placas con las mismas diluciones del inóculo para verificar que el CPE representaba la infectividad vírica.
Cuando se desarrolló un CPE (2+) en estos cultivos, se recolectaron cinco partes alícuotas de 0,5 ml del medio desde los cultivos que recibieron la mayor dilución o la siguiente mayor dilución del inóculo. Se prepararon las cinco partes alícuotas y se conservaron como la transferencia 2 (P2) a -80 ºC. La estrategía consistió en seleccionar la población de virus que se replicaba en la mayor dilución de log10, o una dilución cercana a esta, basándose en la aparición de CPE en las células. Como tal, la población de virus seleccionada sería la población que está mejor adaptada para replicarse en las células con posibles cambios genéticos que permitan un aumento en la titulación vírica.
Después se prepararon diluciones de log10 de una parte alícuota del virus de P2 y se emplearon para infectar cultivos de células Vero propagados en placas de 12 pocillos, según se describió para los virus YF de la transferencia uno. Se emplearon métodos similares para completar las 10 transferencias en serie del virus.
P10 y P11
En cada transferencia en serie, cada una de las partes alícuotas empleadas como inóculo también se ensayó para determinar las titulaciones de infectividad mediante el ensayo de las placas en células Vero. En la transferencia 10, se seleccionaron cinco placas individuales y bien aisladas, que representan cada una la progenie de una única partícula de virus infecciosa, a la dilución más alta que produce placas. Cada placa se suspendió en 0,3 ml de medio que contenía albúmina de suero humana (HAS) para proteger la infectividad del virus durante la congelación, y se conservaron a -80 ºC.
Se realizaron las series de transferencias (P1 a P10) del virus YF 17D en cultivos estáticos de Vero a las diluciones de 10-1 a 10-8 en the University of Texas Medical Branch (Galveston, Texas). La estrategia consistió en seleccionar la población de virus que se replica en la mayor dilución de log10, o una dilución cercana a esta, basándose en la aparición microscópica de CPE en las células Vero. La población de virus que muestra efectos citopáticos a la mayor dilución, la recolección P10, se seleccionó como el virus optimizado “de alto rendimiento”. Se secuenció la población de virus de alto rendimiento que mostraba CPE en la mayor dilución.
El virus de alto rendimiento
El virus “de alto rendimiento” está adaptado para una mayor replicación en células Vero por 10 transferencias en serie del virus a la dilución terminal en células Vero. En la transferencia del virus 10, se seleccionó una única unidad formadora de placas y se transfirió en fluido de cultivo para producir una cepa de minisemillas en la transferencia del virus 11. La gráfica en la figura 3B muestra las curvas de crecimiento comparativas de los virus de P1 y P11, que se habían inoculado con una MOI alta; los datos indican que el virus de P11 tiene una titulación pico mayor que el virus de P1. Este virus (P11) muestra una capacidad de replicación mayor en 3-7 veces en células Vero, comparado con YF 17D en la transferencia del virus 1. La cepa del virus de la transferencia del virus 11 se empleó para la extracción de ARN, y el ARN se utilizó para producir semillas de virus de calidad cGMP.
Secuencia de ARN del virus 17D adaptado a Vero (P11) 6
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Se determinaron las secuencias consenso genómicas completas de los virus a P1 y P11 a partir del YF-VAX® original. Se descubrieron dos mutaciones genéticas o diferencias en nucleótidos, tal como se muestra en la siguiente tabla 1. Una diferencia en un nucleótido se encuentra en el gen de la cápsida (C) y otra en el gen de la envuelta (E). El término “cápsida”, tal como se emplea en la presente, se refiere a la cubierta de proteína que rodea y protege el ácido nucleico de un virus. El cambio en el gen C era silencioso (no cambia el aminoácido), mientras que la mutación del gen E produce una mutación de un aminoácido (Lys Arg).
Tabla 1. Secuencia de ARN y mutaciones en el virus YF17D adaptado a células Vero
- n.º resto
- Cambio del nucleótido Cambio del aminoácido Codón
- NT
- P1 P11 P1 P11 Localización P1 P11
- 211
- A G treonina treonina C31 ACA ACG
- 1452
- A G lisina arginina E160 AAG AGG
La primera mutación fue una conversión de A a G en el n.º de resto nucleótido 211, según SEQ ID NO:1, que produce un cambio en el codón para el aminoácido en la posición 31 de la proteína de la cápsida (C31) de ACA a ACG. Sin embargo, esta mutación no cambia el resto aminoácido en esta posición. La segunda mutación fue una conversión de A a G en el n.º de resto nucleótido 1452, según SEQ ID NO:1, que produce un cambio en el codón para el aminoácido en la posición 160 de la proteína de la envuelta (E160) de AAG a AGG. Esta mutación produce una sustitución de lisina a arginina en esta posición. En las figuras 4 y 5 se muestra un alineamiento consenso de las secuencias de los ácidos nucleicos y de aminoácidos para P1 y P11.
Purificación de placas de la recolección P10
Tal como se describió anteriormente, el virus de P10 se purificó mediante formación de placas. El virus aislado de una placa se inoculó en un matraz T 150. El fluido sobrenadante de este matraz se recolectó cuando 50% de las células mostraron CPE. Se formaron partes alícuotas de 1 ml de este material y se denominó P11. El virus de P11 entonces se empleó como fuente de ARN para la transfección de células Vero. Se determinó que la titulación de P11 de unidades formadoras de placa era de 8,5 x 107 unidades formadoras de placa (PFU). El ARN aislado de los virus de P11 se empleó para transfectar células para producir semillas premaestras. El virus de las semillas premaestras se transfirió en otros cultivos de células Vero para producir una cepa de semillas de virus maestras y de trabajo.
Fabricación de las semillas de virus maestras
Las semillas de virus maestras (MVS) se produjeron en células Vero en condiciones sin suero empleando un único vial de las semillas premaestras como inóculo de virus, tal como se muestra esquemáticamente en la figura 2. Las células del banco de células de trabajo del fabricante (MWCB) de células Vero en la transferencia 143 se expandieron en once (11) matraces T de 225 cm3. Cuando las células se hicieron confluentes, un matraz se tripsinizó y se empleó para determinar el número de células y también para sembrar otros matraces empleados para producir las semillas de virus de trabajo. Se retiró el medio OptiPRO SFM del resto de los 10 matraces T, y las células se inocularon con semillas de virus premaestras a una multiplicidad de infección (MOI) de aproximadamente 0,01 PFU/célula. Se dejó que el virus se adsorbiera durante 60 (5) minutos a 37 ºC 2 ºC, tras lo cual se añadió medio OptiPRO SFM precalentado a los matraces. El cultivo infectado después se incubó a 37 ºC 2 ºC con CO2 a aproximadamente 5%.
Después de 3 días, cuando se observó CPE en 80% de la población de células, se terminó el proceso de propagación del virus recolectando el fluido del cultivo celular. El fluido del cultivo que contiene los virus se reunió de todos los matraces, se centrifugó para eliminar los restos celulares, y se mezcló con sorbitol al 100% estéril hasta una concentración final de sorbitol del 10%. Esta mezcla se filtró (0,22 mM), y se introdujo en crioviales de 4 ml a 2 ml por vial y se congeló a -60 ºC. La cepa del virus congelada constituye la YF 17D MVS. Tal como se muestra en la figura 2, el mayor nivel de transferencia de células Vero utilizado para la producción de las MVS es de 147.
Fabricación de las semillas de virus de trabajo
Se produjeron las semillas de virus de trabajo (WVS) como se muestra en la figura 2, a partir de un único vial de MVS bajo condiciones de cGMP. Comenzando con las células en el 11º matraz T225 utilizado para determinar la densidad celular en la producción de MVS, cuatro matraces T225 se sembraron a una densidad celular de 1 x 106 células viables por matraz, transferencia 147. Las células se transfirieron a 4 nuevos matraces T225 para dejar tiempo para la producción de la cepa de semillas maestras. Las células de la transferencia 148 después se sembraron en once matraces T225 para la producción de WVS.
Cuando las células fueron más del 80% confluentes, se determinó la densidad celular en un matraz. Esta densidad celular se empleó para calcular la densidad celular en los diez matraces restantes, y las células en los 10 matraces
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se infectaron con el virus de MVS a una MOI de 0,01 PFU/célula. Para realizar la infección, el medio se retiró de los matraces y después se añadió el virus diluido en disolución salina tamponada con fosfato. Después de una hora se añadió medio fresco a cada matraz y las células se devolvieron al incubador. Las células se observaron al microscopio para CPE. Cuando el CPE fue mayor que 80% se recolectaron los virus. El medio de los 10 matraces se centrifugó para eliminar los restos celulares y el sobrenadante aclarado se reunió en un recipiente. Se añadió sorbitol (concentración final al 10%) al sobrenadante que contiene los virus como crioconservante. El virus reunido después se filtró mediante esterilización y se formaron partes alícuotas en crioviales de 4 ml, 2 ml por vial. Los viales rellenos se conservaron a -60 ºC. Tras haber sido congelados, un vial del final del banco se ensayó en un ensayo de placas en células Vero para determinar la titulación del virus.
Aumento en la titulación logrado en P11 comparado con P1
El virus YF original y el virus YF de la recolección de P11 se titularon mediante un ensayo de placas en células Vero para determinar las titulaciones de infectividad expresadas como unidades formadoras de placas (PFU) (tabla 1). La vacuna YF-VAX 17D original contenía 103,7 log10 por ml en células Vero. La titulación pico para la transferencia uno es de 6,68 log10 por ml y siguió presentando aproximadamente la misma titulación hasta P6, y después aumentó significativamente hasta 7,67 log10 en P10. Por tanto, en este experimento, se produce un aumento de 1,0 log10 (en 10 veces) en la titulación de la transferencia 10 (7,67 log10) frente a la titulación (6,68 log10) del virus de P1 (véase la tabla 2).
También se confeccionaron las curvas de crecimiento del virus al mismo tiempo para los virus de P1 y P11. Las curvas de crecimiento se realizaron infectando matraces de 75 cm2 por duplicado de células Vero a una alta MOI de 1,0, y se realizó una segunda curva de crecimiento empleando una baja MOI de 0,001. En la MOI alta, se espera que todas las células se infecten al principio del cultivo, mientras a la MOI baja, el virus liberado por un pequeño número de células inicialmente infectadas infectará al resto de las células del cultivo; por tanto, se espera que los virus en una curva de crecimiento a baja MOI estén de alguna manera retrasados, comparado con el cultivo a alta MOI. En los momentos del tiempo de 0, 6, 18, 24, 30, 48, 54 y 72 hr después de la inoculación, se retira sobrenadante (2 ml) de los cultivos, se estabiliza con HSA al 2% y se congela (muestras por duplicado de 1 ml) a -80 ºC. Las diluciones de log10 de cada muestra se ensayan en células Vero para determinar la titulación de infectividad y se representan las curvas de crecimiento a lo largo del tiempo.
Tabla 2. Titulación del pico de infectividad para cada transferencia secuencial del virus YF
- Transferencias de YF-VAX en células Vero
- Dilución mayor que produce placas n.º medio de placas Titulación del pico de infectividad (PFU/ml) Conversión de unidades formadoras de placas para igualar la titulación de infectividad en log10 PFU por ml
- 0
- 10-3 1 5 x 103 3,7
- 1
- 10-5 9,67 4,83 x 106 6,68
- 2
- 10-5 12,67 6,33 x 106 6,80
- 3
- 10-4 21,67 1,08 x 106 6,03
- 4
- 10-5 12,67 6,33 x 106 6,80
- 6
- 10-6 1,00 5,00 x 106 6,70
- 8
- 10-6 3,00 1,50 x 107 7,18
- 9
- 10-6 5,67 2,83 x 107 7,45
- 10
- 10-6 9,33 4,67 x 107 7,67
Los resultados de la curva de crecimiento empleando una MOI de 1,0 indican que el virus YF de P1 aumenta desde una titulación de 4,09 log10 a las 0 horas, o en el momento de la inoculación, hasta una titulación máxima de 6,28 log10 a las 48 horas después de la inoculación (post-inoculación, PI), y las titulaciones mostraron una ligera disminución de 6,21 y 6,18 log10 a las 60 y 72 horas PI, respectivamente. Los resultados para la transferencia 11 (P11) mostraron un aumento en las titulaciones frente al virus de la transferencia uno (P1). En el momento de la inoculación, la titulación era de 41,5 log10 y alcanzó una titulación máxima de 6,83 log10 a las 48 horas PI, y disminuyó hasta una titulación de 6,54 log10 a las 72 horas PI (véase la tabla 3). El pico de la titulación del virus aproximadamente 48 horas para el virus de P11 era de 0,55 log10 o 3,5 veces mayor que para el virus de P1.
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Tabla 3. Curva de crecimiento del virus de la transferencia 1 y transferencia 11 de la fiebre amarilla 17D a MOI alta (1,0)
- Momentos del tiempo (hr)
- 0 6 18 24 30 48 54 72
- Transferencia 1
- 4,15 4,11 5,63 6,09 6,05 6,28 6,21 6,18
- Transferencia 11
- 4,09 4,22 5,60 6,27 6,63 6,83 6,68 6,54
- P1 STDEV
- 0,11 0,02 0,17 0,08 0,05 0,03 0,05 0,04
- P11 STDEV
- 0,04 0,08 0,21 0,02 0,10 0,14 0,18 0,10
Comparado con la curva de crecimiento empleando una alta MOI, el patrón de la curva de crecimiento empleando una MOI de 0,001 mostró un retraso en la replicación, pero las titulaciones máximas fueron mayores. En el momento de la inoculación, las titulaciones fueron de 1,7 y 0,57 log10 para la transferencia 1 y 11, respectivamente. Se produce un aumento lineal en las titulaciones y, a las 72 horas PI, se lograron unas titulaciones máximas de 7,35 y 8,17 log10 para P1 y P11, respectivamente. El pico de la titulación del virus a aproximadamente 72 horas para el virus de P11 fue de 0,82 log10 o 6,6 veces mayor que para el virus de P1. Estos resultados indican que la transferencia en serie de YF-VAX produce un aumento sustancial en la titulación, y que esta estrategia parece ser prometedora para desarrollar una vacuna de YF inactivada (véase la tabla 4).
Tabla 4. Curva de crecimiento del virus de la transferencia 1 y transferencia 11 de la fiebre amarilla 17D a MOI baja (0,001)
- Momentos del tiempo (hr)
- 0 6 18 24 30 48 54 72
- Transferencia 1
- 1,70 2,00 2,57 4,14 4,72 6,44 7,19 7,35
- Transferencia 11
- 0,57 0,67 3,01 4,44 5,18 7,04 7,38 8,17
- P1 STDEV
- 0,00 0,30 0,19 0,07 0,06 0,04 0,02 0,03
- P11 STDEV
- 0,98 1,15 0,14 0,05 0,05 0,02 0,10 0,10
Estos resultados indican que la transferencia en serie del virus YF produce un aumento sustancial en la titulación. Después, tal como se describió anteriormente, se realizó el análisis de la secuencia de P1 y P11, cuyos resultados comparativos demuestran que las transferencias en serie han podido producir dos mutaciones genéticas en el virus YF, una de las cuales produce un cambio de aminoácidos.
El virus YF modificado descrito producido mediante la transferencia en serie de la vacuna del virus YF 17D atenuado en células de riñón de mono verde africano certificadas (Vero) mostró una mayor productividad en las células. Los métodos de la invención implican la vacunación de sujetos con el virus YF modificado inactivado para producir inmunidad frente a la fiebre amarilla.
Producción de vacunas en biorreactores
Biorreactores que contenían aproximadamente 5 g/l de microvehículos Cytodex 1 se sembraron con aproximadamente 5 x 105 células Vero/ml en medio OptiPRO SFM. Se dejó que las células se propagasen durante 3-4 días hasta que las células unidas a los microvehículos alcanzaron una densidad de 7 x 105 núcleos por ml. Para la inoculación del virus, se desconectaron los controles de la agitación y de los parámetros y se dejó que los microvehículos y las células sedimentasen. Se retiró aproximadamente 75% del volumen del medio a través de un tubo de tamiz de 90 m que está diseñado para retener los microvehículos en el reactor. Se introduce virus WVS a una MOI de aproximadamente 0,01 PFU/células. Se aplica una agitación suave a este volumen bajo durante aproximadamente 1 hora para dejar que los virus se adsorban sobre las células y las infecten. Se añade medio fresco al volumen entero antes de volver a conectar los controles de la agitación y de los parámetros a sus ajustes originales. En los días 3-4 después de la infección se retiró 75% del sobrenadante, y el reactor se volvió a alimentar con medio fresco. Se dejó que el cultivo se desarrollase durante 2-3 días más, y el día 5-7 después de la infección se recolectó el sobrenadante. Para asegurar la bioseguridad, las muestras de recolección se extrajeron del biorreactor inmediatamente antes de la retirada de los microvehículos, y se ensayaron para la esterilidad, la presencia de micoplasmas, retrovirus y virus adventicios (ensayo in vitro).
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Se detuvo el mezclado del reactor para dejar que los vehículos sedimentasen. El cultivo se traslada desde el biorreactor a través de un tubo de tamiz de 90 m hacia una bolsa de bioprocesado. El tamiz de 90 m reduce la cantidad de microvehículos y partículas grandes que se transfieren a la recolección. Esta es la recolección del virus. La recolección del virus se muestreó y se ensayó para la infectividad, la potencia, la identidad, las endotoxinas, la esterilidad, el ADN de células Vero residual, y las proteínas de células Vero residuales.
Purificación e inactivación del virus
Se recolectó el sobrenadante del cultivo, se aclaró en dos etapas, se digirió con BENZONASE, se purificó mediante ultrafiltración y dialfiltración, y después se esterilizó mediante filtración para generar el virus vivo a granel. El virus vivo a granel después se inactivó mediante un tratamiento con -propiolactona (BPL), que permea la envuelta del virus y altera el ARN vírico alquilando los restos purina, haciendo que el virus sea inactivo. El virus inactivado después se purifica mediante una cromatografía en columna de sulfato de celufina y se diluye hasta la concentración vírica deseada para formar la sustancia fármaco de vacuna a granel.
Repetición del estudio de transferencia de YFV 17D
Se realizaron experimentos para repetir la transferencia del virus YF a partir de la cepa del virus no transferida hasta P11 utilizando técnicas similares a la serie de transferencias original.
Preparación de las cepas del virus
Se mantuvieron a células Vero en condiciones sin suero a lo largo del estudio, empleando OptiPRO SFM.
La fuente inicial del virus YFV 17D procede de un único vial de YF-VAX (Sanofi Pasteur, Swiftwater, PA). El vial originariamente se reconstituyó y se dispensó en partes alícuotas. Una de estas partes alícuotas se empleó para los experimentos repetidos. La repetición de la transferencia en serie se realizó por triplicado, de modo que se realizaron tres ejecuciones del estudio, llevadas a cabo en paralelo, indicadas en la presente como serie A, B y C.
En cada transferencia del virus, la muestra del virus se diluyó en diluciones en serie en diluciones en 10 veces, y el virus diluido se empleó para inocular células Vero sembradas en placas de 12 pocillos. Las diluciones en serie realizadas en cada transferencia se inocularon por duplicado, de modo que se empleó un conjunto de placas para preparar la siguiente transferencia del virus, inoculando 4 pocillos por dilución, y el otro conjunto de placas se empleó para determinar la titulación del virus transferido, inoculando 2 pocillos por dilución.
Para las transferencias en serie del virus, la dilución seleccionada para transferir el virus fue la última dilución en la que se observa un efecto citopático (CPE) generalizado, de tres a cuatro días después de la infección. El medio de los cuatro pocillos se reunió para la siguiente transferencia. Se determinó la titulación del virus mediante un ensayo de placas empleando un inmunotinte para visualizar y contar las placas. El método del inmunotinte permite determinar la titulación después de 3 días de infección.
Para la transferencia inicial del virus, se diluyeron 0,3 ml de la parte alícuota de YF-VAX en 3 ml finales, empleando OptiPRO SFM, para una dilución 10-1. El virus diluido se dividió a partes iguales en tres partes alícuotas. A partir de cada una de estas partes alícuotas se realizaron diluciones en serie en 10 veces hata 10-5, preparando tres series de diluciones (A, B y C). Esto se indica en la presente como transferencia P0 P1. A partir del ensayo de placas inoculado empleado la serie de diluciones se determinó el virus de P0, y a partir de las placas inoculadas para la transferencia se generó el virus P1. Cada ronda de transferencia se resume en la tabla 5.
Tabla 5. Transferencias en serie de YFV 17D (los mismos resultados para la serie A, B y C). 5
- Transferencia
- Diluciones cultivadas en placa Dilución recolectada para la siguiente transferencia
- P0 (vial inicial)
- N/A N/A
- P0 P1
- 10-1 a 10-5 10-3
- P1 P2
- 10-2 a 10-7 10-5
- P2 P3
- 10-3 a 10-8 10-5
- P3 P4
- 10-3 a 10-9 10-5
- P4 P5
- 10-3 a 10-9 10-5
- P5 P6
- 10-3 a 10-9 10-4
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- Transferencia
- Diluciones cultivadas en placa Dilución recolectada para la siguiente transferencia
- P6 P7
- 10-3 a 10-9 10-5
- P7 P8
- 10-3 a 10-7 10-4
- P8 P9
- 10-3 a 10-7 10-5
- P9 P10
- 10-3 a 10-7 10-5
La transferencia se repitió para 10 transferencias en serie del virus. Cuando el virus se recolectó de la última transferencia, se generaron las titulaciones para el virus de P10 de cada serie. Los virus de P10 después se diluyeron para inocular células, de modo que solo una placa por pocillo se desarrolla después de la inoculación. Entonces pueden escogerse placas bien aisladas de los pocillos. De la serie A se escogieron cuatro placas bien aisladas, de la serie B se escogieron seis, y de la serie C se escogieron dos. Las placas escogidas se emplearon para inocular matraces T25 para generar cepas de virus de P11 para los estudios de la curva de crecimiento.
Análisis de la curva de crecimiento
Para los estudios de la curva de crecimiento, se compararon las cepas de virus de P1 de cada serie con las cepas de P11 para cada serie. Puesto que el volumen de las cepas de P1 puede ser limitante para poner en práctica este estudio, una parte alícuota del virus de P1 de cada serie se diluyó en tres veces, después se prepararon partes alícuotas a partir del virus diluido para generar cepas de P1 para la curva de crecimiento. Para las capas de P11, se analizaron las cuatro cepas de la serie A, tres de la serie B, y las dos de la serie C. Antes de los estudios de la curva de crecimiento se ensayaron partes alícuotas de las cepas de los virus para confirmar el nivel de infectividad.
El análisis de la curva de crecimiento se realizó infectando células Vero en matraces T25, a una baja MOI de 0,001 PFU/célula. El estudio se realizó en condiciones sin suero empleando OptiPRO SFM como medio de cultivo. Después de diluir las cepas de virus para lograr la MOI 0,001 diana, se reservó una muestra para confirmar la titulación del inóculo. Se dejó que los inóculos de virus se adsorbieran sobre las células durante aproximadamente una hora. Después de la adsorción, las monocapas se lavaron tres veces, y después se añadió a los cultivos 8 ml de medio. En cada momento del tiempo se retiró 1 ml de cada cultivo y se volvió a añadir 1 ml de medio fresco. Dicho 1 ml de medio reservado se aclaró mediante centrifugación y se conservó a -80 ºC en presencia de sorbitol, hasta que estuvo listo el ensayo. Los momentos del tiempo en que se tomaron muestras fueron 0, 24, 30, 48, 54, 72 y 81 horas después de la infección. Se realizó un ensayo de placas en todas las muestras. Los resultados del estudio se detallan en la figura 3C.
Para la serie B y C, apareció una cepa de virus de P11 que se demostró que se replicaba a titulaciones mayores que la cepa de virus de P1 de la serie. Las cepas de P1 para B y C, y la cepa p11 B3 y la cepa p11 C1 se seleccionaron para el análisis de la secuencia. El análisis de la secuencia indica que la cepa B3 porta la misma mutación Lys Arg en E160 que la observada en la serie de transferencias original. Sin embargo, la cepa C1 no porta la misma mutación en el gen E; se están llevando a cabo más estudios del genoma de la cepa C1.
Aspectos no limitantes de la invención
Se ha producido una cepa del virus de la fiebre amarilla para desarrollar una vacuna inactivada no replicante, más segura, que suscitará una respuesta de anticuerpos neutralizantes, a la par que elimina el potencial para la aparición de acontecimientos neurotrópicos y viscerotrópicos adversos para la prevención de la enfermedad en seres humanos. Se han producido otras cepas del virus de la fiebre amarilla para desarrollar vacunas inactivadas no replicantes, más seguras, que suscitarán una respuesta de anticuerpos neutralizantes, a la par que eliminan el potencial para la aparición de acontecimientos neurotrópicos y viscerotrópicos adversos para la prevención de la enfermedad en seres humanos. Estas realizaciones de la invención se han indicado anteriormente en el sumario.
La descripción proporciona una cepa del virus de la fiebre amarilla modificado, en la que la molécula de ácido nucleico de dicha cepa comprende una mutación de un aminoácido en una o más posiciones 134, 137, 144, 148, 157, 160, 175, 177 de la proteína de la envuelta. En una realización de este aspecto, la mutación o mutaciones de aminoácidos en la posición 157 es lisina a arginina; en la posición 148 es lisina a arginina; en la posición 144 es histidina a arginina, tirosina o lisina; en la posición 137 es tirosina a arginina o lisina, en la posición 175 es tirosina a arginina o lisina; y/o en la posición 177 es lisina a arginina.
En realizaciones según ciertos aspectos de la invención, las células se seleccionan de células Vero. Pueden utilizarse otras células adecuadas para la propagación del virus de la fiebre amarilla.
En la invención, la mutación de nucleótidos en el codón para el aminoácido en la posición 160 de la proteína de la envuelta produce un cambio de AAG a AGG, AGA, CGC, CGA, CGG o CGU. La mutación del aminoácido en la
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posición 160 es de lisina a arginina.
En la invención, el virus de la fiebre amarilla o las vacunas de la invención pueden administrarse en cantidades y empleando métodos que pueden ser determinados con facilidad por los expertos en la técnica. Las vacunas víricas químicamente inactivadas pueden administrarse y formularse, por ejemplo, como una disolución acuosa estéril que contenga entre 102 y 108, por ejemplo, o entre 106 y 107 equivalentes inactivados de unidades infecciosas (por ejemplo, unidades formadoras de placas (PFU) o dosis infecciosas de cultivo de tejidos) en un volumen de dosis de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0 ml, o aproximadamente 0,5 ml, para ser administrado, por ejemplo, por vía subcutánea, intramuscular o intradérmica. Además, puede seleccionarse una vía mucósica, tal como la vía oral intranasal, en una formulación apropiada.
La selección de una cantidad apropiada de virus para administrar puede ser determinada por los expertos en la técnica, y esta cantidad puede variar debido a numerosos factores, por ejemplo, el tamaño y la salud general del sujeto al cual se va a administrar el virus. El sujeto puede vacunarse una sola vez o, si es necesario, puede realizarse una inmunización de seguimiento.
Tal como se indicó anteriormente, las vacunas pueden administrarse como agentes profilácticos primarios a un sujeto que esté en riesgo de contraer una infección por el virus de la fiebre amarilla. Además, aunque no sea necesario, pueden emplearse adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de las vacunas del virus de la fiebre amarilla. Los expertos en la técnica pueden seleccionar los adyuvantes apropiados con facilidad.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar más a fondo ciertas realizaciones preferidas de la invención, y no pretenden limitar el alcance de la invención.
Respuestas de anticuerpos en ratones
Se evaluaron las respuestas de anticuerpos neutralizantes en ratones hembra exogámicos BALB/c y CD-1 después de una inmunización con la vacuna de la fiebre amarilla inactivada comparada con virus vivos. El virus de la fiebre amarilla (YF) se inactivó con beta-propiolactona (BPL), formulada con adyuvante de alumbre e inyectada por vía intramuscular como dos o tres dosis, cada una separada por 14 días. Se ensayaron dos niveles de dosis del virus en ratones BALB/c, y en ratones CD1 solo se ensayó el nivel de dosis más alto. Los sueros se ensayaron para la actividad de anticuerpos neutralizantes 14 días después de la última inmunización.
Procedimientos de preinmunización
Ratones hembra de la raza BALB/c y CD-1 (6 semanas de edad) se aclimataron en aislantes diseñados en unas instalaciones para animales restringidas a virus. Se recogieron muestras de suero en el día del estudio 28 o 42 después del sacrificio. Los ratones se alojaron a 5 ratones por jaula, y cada animal se identificó de forma exclusiva en las tarjetas adjuntas a las jaulas y mediante una muesca en la oreja. Los ratones se aclimataron durante una semana antes del inicio de cualquiera de los tratamientos. Los ratones recibieron agua y comida esterilizada, y se alojaron en jaulas de policarbonato esterilizadas con un lecho esterilizado con un ciclo de luz de 12 horas (encendido a las 6 a.m. y apagado a las 6 p.m.). Su salud general fue evaluada por el equipo técnica a diario y por un veterinario una vez a la semana y según fuera necesarios por cuestiones de salud. Se registraron los pesos corporales en el día 0 antes de la inmunización y en el día 28 y 42.
Procedimiento de inmunización
Se determinó el peso corporal en el día 0 antes de la inmunización. La inmunización se administró por vía intramuscular (formulaciones de alumbre) o subcutánea (virus vivo o vacuna inactivada con adyuvante de Freund). Las inyecciones se realizaron con los ratones bajo una ligera anestesia con una dosis subóptima de una mezcla de quetamina/xilazina. Para la vía subcutánea con virus vivos se inyecta un volumen de 100 l de vacuna en una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de calibre 27 entre la piel y las capas subyacentes de tejido en la región escapular en la espalda de los ratones. Para la administración intramuscular se inyecta un volumen de 100 l de vacuna en una jeringa de insulina de 0,5 ml en los haces musculares de la parte superior de las 2 patas traseras de los ratones (50 l/pata).
Sacrificio
Los ratones se sacrificaron 28 o 42 días después de la primera vacunación. Se determinó el peso corporal de todos los ratones en el día de estudio 28 y antes del sacrificio. Se recogió sangre para el ensayo de anticuerpos neutralizantes. Se recogió sangre (0,7-1,0 ml) mediante punción cardíaca de ratones anestesiados con un ligero tratamiento de quetamina/xilazina antes de ser sacrificados compasivamente con una sobredosis de quetamina/xilazina.
Diseño experimental
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La vacuna formulada en alumbre preparada el día anterior a la inmunización como una suspensión y la vacuna se mezclan muy bien antes de rellenar cada jeringa. Las preparaciones formuladas en alumbre se administraron por vía intramuscular, inyectándose un volumen de 100 l de vacuna en una jeringa de insulina de 0,5 ml en los haces musculares de la parte superior de las 2 patas traseras de los ratones (50 l/pata).
La vacuna de la fiebre amarilla (YF) viva se reconstituyó con 0,6 ml de disolución salina hasta una concentración de virus de aproximadamente 1,1 x 105 PFU/ml. Se administró una dosis de 1 x 104 PFU (es decir, 1/10 de la dosis humana) en un volumen de 100 l de disolución salina estéril administrada en el día 0 por vía subcutánea.
La vacuna en adyuvante de Freund se formuló el día de la vacunación colocando 2 ml de la disolución del antígeno en una jeringa de vidrio y 2 ml del adyuvante en otra jeringa de vidrio. Las jeringas se conectaron a través de un conector luer a la válvula de 3 vías. Primero se presionó cuidadosamente el émbolo de la disolución del antígeno, empujando el antígeno hacia el aceite del adyuvante. Los émbolos fueron presionados de modo alterno para mezclar el adyuvante y la disolución del antígeno en una emulsión (aproximadamente 8 a 10 minutos). Se administró un volumen de 0,5 ml por vía subcutánea entre la piel y las capas subyacentes de tejido en la región escapular en la espalda de los ratones (formulación con adyuvante de Freund).
La vacuna de la fiebre amarilla viva (YF Vax) se reconstituyó con 0,6 ml de disolución salina suministrada a una concentración de virus de aproximadamente 1,1 x 105 PFU/ml.
El virus de la fiebre amarilla (YF) 17D reconstituido se inactivó o “mató” empleando beta-propiolactona (BPL), y la vacuna de viriones completos inactivados se adsorbió sobre un adyuvante de hidróxido de aluminio (“alumbre”) al 0,2% no más de 2 semanas antes del día de la dosificación.
Estudios preliminares en ratones
Grupos de 5 ratones cada uno se dosificaron como se indica en la tabla 6. Se recogieron muestras de suero mediante punción cardíaca 14 o 28 días después de la última vacunación.
Tabla 6
- Grupo
- n.º de ratones Raza Vacuna (volumen = 0,1 ml) Vía Programa de vacunación Ab. neutral.
- 1
- 5 BALB/c 108 inactivado con BPL en alumbre al 0,2% IM Día 0, 14 Día 28
- 2
- 5 BALB/c 108 inactivado con BPL en alumbre al 0,2% IM Día 0, 14, 28 Día 42
- 3
- 5 BALB/c 107 inactivado con BPL en alumbre al 0,2% IM Día 0, 14 Día 28
- 4
- 5 BALB/c 107 inactivado con BPL en alumbre al 0,2% IM Día 0, 14, 28 Día 42
- 5
- 5
- BALB/c 108 inactivado con BPL en Freund completo/incompleto SC Día 0, 14, 28 Día 42
- 6
- 5 BALB/c 107 inactivado con BPL en Freund completo/incompleto SC Día 0, 14, 28 Día 42
- 7
- 5 BALB/c 108 inactivado con BPL sin adyuvante IM Día 0, 14, 28 Día 42
- 8
- 5 BALB/c YF Vax viva SC Día 0 Día 28
- 9
- 5 CD1 108 inactivado con BPL en alumbre al 0,2% IM Día 0, 14 Día 28
- 10
- 5 CD1 108 inactivado con BPL en alumbre al 0,2% IM Día 0, 14, 28 Día 42
- 11
- 5 BALB/c alumbre al 0,2% IM Día 0, 14, 28 Día 42
Actividad de neutralización de la reducción de placas en suero de ratón
Se realizó un ensayo de neutralización de la reducción de placas utilizando una dilución de virus 17D que, en ausencia de neutralización, produce 10-40 unidades formadoras de placas por pocillo en placas de 12 pocillos. Se incubó un volumen igual de suero de ratón diluido en serie con virus durante 16-20 h a 4 ºC y después se inoculó en pocillos por duplicado de células Vero en placas de 12 pocillos. Después de la absorción del virus durante 60 minutos a 37 ºC se vertió sobre los pocillos un medio que contenía metilcelulosa al 0,75%, se incubó durante 4 días a 37 ºC, se fijó y se tiñó con violeta cristal y se contaron las placas empleando un estereomicroscopio sobre una caja de luz. La titulación de la reducción de placas del 50% representa la dilución final de suero de ratón que produce
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menos del 50% de la media de recuentos de placas cuando no se añade suero.
Las respuestas y las titulaciones del ensayo de neutralización de la reducción de placas (PRNT) se muestran en la tabla 7 y en las figuras 6 y 7. El ensayo PRNT es el estándar generalmente aceptado en la actualidad para anticuerpos contra el virus de la fiebre amarilla. Todos los ratones, independientemente de la raza, que recibieron 2 5 o 3 dosis de la vacuna inactivada administrada sin adyuvante (grupo 7), con alumbre (grupos 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11), o con adyuvante de Freund (grupos 5, 6), desarrollaron respuestas de anticuerpos neutralizantes. Se encontraron titulaciones mayores que 4096 en 5 de 5 ratones BALB/c inmunizados con 3 dosis de virus inactivados unidos a alumbre a 107 EU/dosis. Estas titulaciones fueron mayores que los ratones BALB/c inmunizados con 3 dosis del virus inactivado administrado con adyuvante de Freund (grupo 6, titulaciones 16-128). Los ratones CD1 inmunizados
10 con 2 dosis del virus inactivado unido a alumbre al nivel de 108 EU/dosis lograron unas titulaciones mayores (grupo 9; titulaciones 512-1024) que los ratones BALB/c inmunizados de forma similar (grupo 3; titulaciones 32-64). Solo 1 de 5 ratones que recibieron YF Vax viva (grupo 8) organizó una respuesta de anticuerpos neutralizantes que estaba por encima de los niveles de la línea de base en los ratones que solo recibieron alumbre (grupo 11).
En la figura 7, cada símbolo representa un ratón individual. Los grupos de tratamiento se muestran en las tablas 6 y
15 7. Para el grupo 6 (*), la mayor dilución del suero ensayada fue de 1:128. Para el grupo 9 (**), la mayor dilución del suero ensayada fue de 1:2048.
Este estudio demuestra que pueden lograrse unas titulaciones de anticuerpos neutralizantes robustas en ratones inmunizados con 2 o más inoculaciones del virus YF inactivado descrito administrado con alumbre. Los ratones CD1 exogámicos presentaban unas respuestas de anticuerpos mayores que la raza endogámica (BALB/c). El alumbre es
20 mejor adyuvante que Freund, pero esto resultado también puede relacionarse con la vía de inmunización (SC para Freund frente a IM para alumbre). Se realizarán otros estudios para determinar si se puede lograr inmunogenicidad con una sola dosis de vacuna.
Tabla 7. Ratones con actividad neutralizante de reducción de placas
- Grupo
- Raza de ratones Vacuna Programa % positivos (+/total)
- Vacunación
- Sacrificio
- 1
- BALB/c 108 inactivado con BPL en alumbre al 0,2% Día 0, 14 Día 28 100% (5/5)
- 2
- BALB/c 108 inactivado con BPL en alumbre al 0,2% Día 0, 14, 28 Día 42 100% (5/5)
- 3
- BALB/c 107 inactivado con BPL en alumbre al 0,2% Día 0, 14 Día 28 100% (5/5)
- 4
- BALB/c 107 inactivado con BPL en alumbre al 0,2% Día 0, 14, 28 Día 42 100% (5/5)
- 5
- BALB/c 108 inactivado con BPL en Freund completo/incompleto Día 0, 14, 28 Día 42 100% (5/5)
- 6
- BALB/c 107 inactivado con BPL en Freund completo/incompleto Día 0, 14, 28 Día 42 100% (5/5)
- 7
- BALB/c 108 inactivado con BPL sin adyuvante Día 0, 14, 28 Día 42 100% (5/5)
- 8
- BALB/c YF Vax viva Día 0 Día 28 20% (1/5)
- 9
- CD1 108 inactivado con BPL en alumbre al 0,2% Día 0, 14 Día 28 100% (5/5)
- 10
- CD1 108 inactivado con BPL en alumbre al 0,2% Día 0, 14, 28 Día 42 100% (5/5)
- 11
- BALB/c alumbre al 0,2% Día 0, 14, 28 Día 42 0% (0/5)
Claims (10)
- E1080490926-11-2014REIVINDICACIONES1.- Una cepa del virus de la fiebre amarilla modificado, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de la envuelta, en la que la molécula de ácido nucleico de dicha cepa comprende una mutación en el codón para el aminoácido en la posición 160, en la que la mutación del ácido nucleico en el codón para el5 aminoácido en la posición 160 de la proteína de la envuelta produce un cambio de codón de lisina a arginina.
- 2.- La cepa del virus de la fiebre amarilla modificado según la reivindicación 1, en la que el virus de la fiebre amarilla modificado se inactiva con beta-propiolactona.
- 3.- Una vacuna que comprende una cepa del virus de la fiebre amarilla modificado inactivado según la reivindicación 2, que comprende además opcionalmente un adyuvante, en la que el adyuvante es preferiblemente hidróxido de10 aluminio.
- 4.- Una composición que comprende la vacuna según la reivindicación 3 o el virus de la fiebre amarilla según la reivindicación 1, para su uso para inducir una respuesta inmunológica contra el virus de la fiebre amarilla en un sujeto.
- 5.- Una composición para su uso según la reivindicación 4, en la que el sujeto está en riesgo de desarrollar, pero 15 aún no padece, una infección por el virus de la fiebre amarilla.
- 6.- Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende una secuencia que codifica una proteína de la envuelta del virus de la fiebre amarilla según la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una mutación de nucleótidos en el codón para el aminoácido en la posición 160 de la proteína de la envuelta, en la que la mutación del ácido nucleico en el codón para el aminoácido en la posición 160 de la20 proteína de la envuelta preferiblemente produce un cambio de AAG a AGG, AGA, CGC, CGA, CGG o CGU.
- 7.- Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6, que comprende un secuencia que codifica una proteína de la envuelta modificada del virus de la fiebre amarilla, en la que dicha molécula de ácido nucleico codifica la secuencia de proteína de SEQ ID NO:4 o 6.
- 8.- Un método para fabricar una vacuna, que comprende cultivar células infectadas con una cepa del virus de la 25 fiebre amarilla modificado según la reivindicación 1.
- 9.- El método según la reivindicación 8, en el que las células son células Vero.
- 10.- El método según la reivindicación 9, que comprende además la etapa de tratar la cepa del virus de la fiebre amarilla modificado con un agente inactivante, en el que el agente inactivante es preferiblemente beta-propiolactona.15
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