ES2525423T3 - Nuevos derivados de poliquinolinas y su utilización terapéutica - Google Patents

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Abstract

Compuesto de fórmula (I):**Fórmula** tales como en la fórmula (I) **Fórmula** X representa un grupo -NRR', y Y representa un 10 grupo de fórmula: en la que X' representa un grupo -NRR', y**Fórmula** Z representa un grupo -NR''- donde R'' >= alquilo eventualmente sustituido por uno o varios grupos seleccionados de entre OR, NRR'; y R representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo; R' >= H o alquilo; R1, R2, R3, R4, R5, R1', R2', R3', R4', R5', idénticos o diferentes, representan independientemente un átomo seleccionado de entre H o halógeno, k representa 1; así como sus esteroisómeros o sus mezclas, sus formas tautómeras, sus hidratos, solvatos, sus sales, formas libres y ésteres farmacéuticamente aceptables.

Description

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03-12-2014
DESCRIPCIÓN
Nuevos derivados de poliquinolinas y su utilización terapéutica.
La presente invención se refiere a nuevos derivados de poliquinolinas, a su procedimiento de preparación y a su utilización como agentes terapéuticos.
Más precisamente, los compuestos según la presente invención presentan la propiedad de ser unos ligandos de metales y/o de disolver los agregados amiloides, y son particularmente útiles en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
Diferentes revistas resumen un conjunto de datos que ponen en evidencia que muchos trastornos neurodegenerativos progresivos y lentos están asociados a: (i) un estrés oxidativo, (ii) un mal plegamiento de proteínas, que conduce a la formación de agregados, de fibrillas, de profibrillas o de placas, (iii) una acumulación de estas proteínas, (iv) una pérdida de sinapsis, (v) una homeostasis de los iones metálicos alterada, (vi) unos defectos en los axones y el transporte dendrítico, (vii) una muerte neuronal. (E. Bossy-Wetzel et al., Nature Medecine, 2004, S2-S9; K. J. Barnham et al., Nature Rev. Drug Discov., 2004, 3, 205-214; M. P. Mattson, Nature, 2004, 430, 631-639;
P. M. Doraiswamy et al., The Lancet Neurol., 2004, 3, 431-434).
En efecto, numerosos estudios han puesto en evidencia recientemente el papel determinante de los iones metálicos (cobre, zinc, hierro, aluminio, manganeso, etc.) en la modificación del plegamiento o de la agregación de proteínas, que conduce así a patologías graves. Este papel nefasto de interacciones anormales de iones metálicos con proteínas se ha puesto de relieve en numerosas enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo: la enfermedad de Alzheimer, encefalopatías espongiformes, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica, etc.) o durante la evolución nefasta de algunas discapacidades, como en el caso de la trisomía
21. Una o más proteínas específicas están asociadas a cada enfermedad y se ha puesto en evidencia que los quelantes de iones metálicos pueden ser activos para limitar sus malos plegamientos inducidos por los metales.
En algunas encefalopatías, como la enfermedad de Kreutzefeld-Jacob y su nueva variante, se admite ahora que estas enfermedades están relacionadas con la transformación de una proteína de tipo prión (PrP) en su forma patológica e infecciosa denominada "scrapie" (PrPSC). Los iones cúpricos están implicados en esta modificación conformacional (formación de láminas beta) de los priones que se vuelven resistentes a las proteasas e insolubles en los detergentes no desnaturalizantes. Unos trabajos recientes han demostrado que un ligando tal como el disulfato de la batocuproína puede restaurar in vitro la sensibilidad de la proteína "scrapie" PrPSC a las proteasas y su solubilidad (E. Quaglio et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 11432-11438).
En el caso de la enfermedad de Pakinson, la α-sinucleína interactúa con los iones férricos. Se ha propuesto que estos iones faciliten la formación de radicales hidroxilo, particularmente oxidativos y unos estudios post mortem por IRM han puesto en evidencia fuertes concentraciones de iones férricos en la substancia nigra de los pacientes (una zona del cerebro en la que las neuronas dopaminérgicas están afectadas más selectivamente en esta enfermedad). El empleo de quelantes como el Clioquinol reduce la toxicidad de la 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrapiridina, una toxina que causa el parkinsonismo, en los ratones (D. Kaur et al., Neuron 2003, 37, 899-909).
En el caso de la enfermedad de Alzheimer (M. P. Mattson, Nature, 2004, 430, 631-639; M. Citron, Nature Rev. Neurosci., 2004, 5, 677-685), la patología está relacionada con la agregación en el cerebro de péptidos β-amiloides que conducen a la formación de placas amiloides. Esta agregación puede ser inducida por los iones Cu(II) y Zn(II) pero también, en menor medida, Fe(III). La acumulación dentro de estas placas de iones metálicos con actividad redox es probablemente el origen de estrés oxidativo significativo (a través de la producción de H2O2), él mismo el origen de los daños creados sobre las neuronas del cerebro, que conduce a una pérdida irreversible de las facultades intelectuales (M. P. Cuajungco et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 2000, 920, 292-304; C. S. Atwood et al., Met. Ions Biol. Syst., 1999, 36, 309-364). El hecho de que los primeros ensayos efectuados con un ligando de iones metálicos como el Clioquinol conduzcan a mejoras en la enfermedad de Alzheimer (R. A. Cherny et al., Neuron, 2001, 30, 665-676) indica que unos enfoques terapéuticos son posibles con la ayuda de quelantes de iones metálicos.
Sin embargo, estos quelantes deben poseer las propiedades siguientes para ser susceptibles de ser utilizados como medicamentos en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas:
-(a) ser de baja masa molecular y no estar cargados demasiado fuerte, a fin de poder pasar las diferentes barreras (en primer lugar, intestinal en el caso de una molécula utilizada por vía oral y después, y de manera reversible, la barrera hemato-meníngea para quelar los iones metálicos en exceso en las proteínas patógenas),
-(b) presentar una estructura modificable a fin de ajustar la selectividad de quelación en ciertos iones metálicos (una fuerte quelación no específica llevaría a una depleción generalizada de los iones metálicos, incluyendo los de las metaloenzimas esenciales para el funcionalmente del organismo) o permitir modular su
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biodistribución en el organismo.
Los quelantes que comprenden una unidad quinolina sustituida en la posición 8 por un heteroátomo (como los derivados de 8-hidroxiquinolina, por ejemplo) son candidatos para quelar los excesos de iones metálicos implicados
5 en las enfermedades neurodegenerativas. Se puede esperar que este tipo de ligando forme frecuentemente unos complejos de cobre, de zinc o de hierro (unos iones metálicos asociados a las agregaciones proteicas e incluso al estrés oxidativo para el cobre y el hierro) que comprende dos (e incluso tres para el hierro) ligandos alrededor del ión metálico (Sillen, L. G. et al., Stability Constants of Metal-Ion Complexes, The Chemical Society London Publication, 1971).
10 Se han descrito unos derivados de bis-quinolinas, pero raramente como agentes para el tratamiento de enfermedades potenciales del sistema nervioso. Es el caso del documento WO 2004/007461, que describe la propiedad quelante metálica. Sin embargo, este documento describe esencialmente unos compuestos monoquinolina. Por otra parte, el documento EP 0 443 862 describe unos derivados agonistas del receptor NMDA y no
15 sugiere de ningún modo la actividad quelante metálica de los compuestos descritos. Finalmente, Stockwell et al. en
J. Am. Chem. Soc. 1999, 10662-10663 describen la actividad biológica de los compuestos 2,2'-(imino)bis(8quinolinol) y sus derivados 2,2'-(metilimino)-y 2,2'-(n-butilimino)-bis(8-quinolinol).
Se ha descubierto ahora, de manera totalmente inesperada, que los compuestos 2,2' o 8,8'-poliquinolinas según la
20 invención presentaban una fuerte actividad quelante para los metales y/o una capacidad para disolver los agregados amiloides.
Por "agregados amiloídes" se entiende aquí una estructura polimérica de péptidos Aβ generada por interacción secundaria, terciaria o cuaternaria (de lámina β, por ejemplo) o por coordinación biometálica sobre el péptido (E.
25 Scarpini et al., The Lancet Neurology, 2003, 2, 539-547; E. Gaggeli et al., Chem. Rev., 2006, 106, 1995-2044; A. B. Clippingdale et al., J. Peptide Sc., 2001, 7, 227-249).
Estos compuestos son útiles como medicamentos destinados al tratamiento y/o a la prevención de enfermedades neurodegenerativas, en particular de la enfermedad de Alzheimer, de Parkinson, unas encefalopatías
30 espongiformes, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica o la trisomía 21.
Los presentes inventores han desarrollado así unos quelantes que comprenden varias unidades de quinolina sustituidas (en la posición 2 u 8) de pequeño tamaño y suficientemente hidrófobos para poder pasar las barreras. Así, han demostrado que estas estructuras favorecían la interacción de los heterociclos de la molécula sobre el
35 mismo ión metálico y que las sustituciones sobre estos ligandos, introducidas de manera controlada, podían modular su acción frente a proteínas implicadas en las enfermedades neurodegenerativas: las propiedades de quelación en particular de los iones Cu(II), Zn(II) y Fe(III) implicados en estas enfermedades, de hidrofobicidad, de la capacidad para disgregar las proteínas implicadas en las enfermedades neurodegenerativas, ya sea o no en presencia de ión metálico, o disminuir el estrés oxidativo que pueden inducir.
40 La presente invención se refiere a los compuestos de la fórmula (I)
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tal que, en la fórmula (I)
X representa un grupo -NRR', e
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Y representa un grupo de la fórmula:
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en la que X' representa un grupo -NRR', Z representa un grupo -NR''-en el que R'' representa un alquilo eventualmente sustituido con uno o varios sustituyentes seleccionados entre OR, NRR';
R y R' idénticos o diferentes, representan independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo.
R1, R2, R3, R4, R5, R1', R2', R3', R4', R5', idénticos o diferentes, representan independientemente un átomo seleccionado de entre H, o halógeno, k representa 1;
así como sus esteroisómeros o sus mezclas, sus formas tautómeras, sus hidratos, solvatos, sus sales, formas libres y ésteres farmacéuticamente aceptables.
Más preferentemente, los compuestos según la invención se seleccionan de entre: N-butil-2,2'-imino-bis(8quinolinamina), así como sus esteroisómeros o sus mezclas, sus formas tautómeras, sus hidratos, solvatos, sus sales, formas libres y ésteres farmacéuticamente aceptables.
Según la presente invención, los radicales alquilo representan unos radicales hidrocarbonados saturados, de cadena lineal o ramificada, de 1 a 20 átomos de carbono, preferentemente de 1 a 5 átomos de carbono.
Se pueden citar en particular, cuando son lineales, los radicales metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, octilo, nonilo, decilo, dodecilo, hexadecilo, y octadecilo.
Se pueden citar en particular, cuando son ramificados o sustituidos con uno o varios radicales alquilo, los radicales isopropilo, terc-butilo, 2-etilhexilo, 2-metilbutilo, 2-metilpentilo, 1-metilpentilo y 3-metilheptilo.
Entre los átomos de halógeno, se citan más particularmente los átomos de flúor, de cloro, de bromo y de yodo.
Entre los radicales -alquilarilo, se puede citar en particular el radical bencilo.
La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a las sales de adición ácida relativamente no tóxicas, inorgánicas y orgánicas, y las sales de adición de base, de los compuestos de la presente invención. Estas sales pueden ser preparadas in situ durante el aislamiento final y la purificación de los compuestos. En particular, las sales de adición ácida pueden ser preparadas haciendo reaccionar separadamente el compuesto purificado en su forma depurada con un ácido orgánico o inorgánico y aislando la sal así formada. Entre los ejemplos de sales de adición ácida se encuentran las sales bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, oxalato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptanato, lactobionato, sulfamatos, malonatos, salicilatos, propionatos, metilen-bisbeta-hidroxinaftoatos, ácidos gentísico, isetionatos, di-p-toluoiltartratos, metanosulfonatos, etanosulfonatos, bencenosulfonatos, p-toluenosulfonatos, ciclohexilsulfamatos y quinatoslaurilsulfonatos, y análogos. (Véase por ejemplo S.M. Berge et al. Pharmaceutical Salts, J. Pharm. Sci, 66: p.1-19 (1977) incorporado aquí como referencia). Las sales de adición ácida pueden también ser preparadas haciendo reaccionar separadamente el compuesto purificado en su forma ácida con una base orgánica o inorgánica y aislando la sal así formada. Las sales de adición ácida comprenden las sales y metálicas. Las sales metálicas adaptadas comprenden las sales de sodio, potasio, calcio, bario, zinc, magnesio y aluminio. Se prefieren las sales de sodio y de potasio. Las sales de adición inorgánicas de base adaptadas son preparadas a partir de bases metálicas que comprenden hidruro de sodio, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, hidróxido de aluminio, hidróxido de litio, hidróxido de magnesio, hidróxido de zinc. Las sales de adición aminadas de base adaptadas son preparadas a partir de aminas que tienen una alcalinidad suficiente para formar una sal estable, y preferentemente comprenden las aminas que son frecuentemente utilizadas en química medicinal debido a su baja toxicidad y a su aceptabilidad para el uso médico: amoniaco, etilendiamina, N-metil-glucamina, lisina, arginina, ornitina, colina, N,N'-dibencil-etilendiamina, cloroprocaína, dietanolamina, procaína, N-bencil-fenetilamina, dietilamina, piperazina, tris(hidroximetil)aminometano, hidróxido de tetrametilamonio, trietilamina, dibencilamina, efenamina, deshidroabietilamina, N-etilpiperidina, bencilamina, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, etilamina, aminoácidos básicos, por ejemplo lisina y arginina, y diciclohexilamina, y análogos.
La invención se refiere también a los esteroisómeros o a sus mezclas, sus formas tautómeras, los hidratos, solvatos, sales y ésteres farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la fórmula (I).
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Los compuestos de la invención de la fórmula (I) definidos tales como anteriormente, que poseen una función suficientemente ácida o una función suficientemente básica, o las dos, pueden incluir las sales correspondientes de ácido orgánico o mineral o de base orgánica o mineral farmacéuticamente aceptables.
5 Según otro objeto, la presente invención se refiere también al procedimiento de preparación de los compuestos de la fórmula (I).
En los modos de realización y los ejemplos siguientes, el grupo R6 representa el grupo Y. 10 Los compuestos de fórmula (I) son preparados por acoplamiento de los compuestos de las fórmulas (VVII) y (VVII'):
imagen3
15 en las que Hal y Hal' son unos átomos de halógeno en presencia de un grupo de fórmula -RNH2 eventualmente seguida de derivatización(es) del producto de la fórmula (I) obtenido para obtener el producto de la fórmula (I) deseado.
Generalmente, esta reacción se efectúa por reacción de (VVII) con RNH2 seguido del acoplamiento con (VVII') en
20 presencia de un catalizador tal como el tris(dibencilidenacetona)dipaladio (0) y el rac-2,2'-bis(difenilfosfino)1,1',binaftilo.
Este procedimiento se ilustra de manera representativa mediante el esquema 16.
25 Por "derivatización" se entiende cualquier reacción que permite modificar o introducir unos grupos sobre las moléculas de partida. Puede tratarse de halogenación, de alquilación, de alcoxilación, de adición, de sustitución, de protección, desprotección, reducción, etc. Estas reacciones son generalmente conocidas en sí mismas. En el procedimiento según la invención, estas reacciones pueden ser efectuadas por aplicación o adaptación de estos métodos.
30 Unos ejemplos representativos de estas reacciones de derivatización son ilustrados mediante los esquemas 1, 3, 4, 9, 10, 13, 14, 15 y 16, siendo este último el único esquema que ilustra la invención.
Así, los compuestos de fórmula general (I) se pueden preparar mediante aplicación o adaptación de cualquier
35 método conocido en sí mismo de y/o al alcance del experto en la materia, en particular los descritos por Larock en Comprehensive Organic Transformations, VCH Pub., 1989, o por aplicación o adaptación de los procedimientos descritos en los ejemplos siguientes.
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Esquema 1: Síntesis de 1,1'' y de sus derivados: 3, 5, 6, y análogos E06794293
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Esquema 2: Síntesis de 2,2'-(1,2-etanodiil)-bis[8-(metiloxi)quinolina] y de 2,2'-(1,4-butanodiil)-bis[-(metiloxi)quinolina] (7'), (10') y sus análogos
imagen6
Esquema 3: Hidrólisis de los grupos protectores metiloxi para la síntesis de 7, 10, 11, y sus análogos
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10 Esquema 4: Reacción de halogenación para la preparación de 2, 4, 8, 9, y sus análogos E06794293
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Esquema 5: Síntesis de 2,2',2''-(1,2,3-propanotriil)-tris[8-(metiloxi)quinolina] (11') y sus análogos.
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Esquema 6: síntesis de 13 y sus análogos. E06794293
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Esquema 7: síntesis de 14 y sus análogos.
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Esquema 8: síntesis de 15 y sus análogos.
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Esquema 9: síntesis de 16', 16 y sus análogos. E06794293
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Esquema 13: síntesis de 20', 20 y sus análogos.
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Esquema 16: síntesis de 23', 23 y sus análogos.
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Los intermedios de reacción están disponibles comercialmente o pueden ser preparados por el experto en la materia 15 mediante aplicación de métodos en sí conocidos.
El procedimiento según la invención puede también comprender la etapa ulterior de aislamiento de los productos de la fórmula (I) obtenidos.
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En las reacciones descritas aquí, puede ser necesario proteger los grupos funcionales reactivos, por ejemplo los grupos hidroxi, amino, imino, tio, carboxi, cuando se desean en el producto final, para evitar su participación indeseable en las reacciones. Los grupos de protección tradicionales pueden ser utilizados conforme a la práctica estándar, para ejemplos, véase T.W. Greene y P.G.M. Wuts dans Protective Groups in Organic Chemistry, John Wiley and Sons, 1991; J.F.W. McOmie in Protective Groups in Organic Chemistry, Plénum Press, 1973.
El compuesto así preparado puede ser recuperado a partir de la mezcla de reacción mediante los medios tradicionales. Por ejemplo, los compuestos pueden ser recuperados destilando el disolvente de la mezcla de la reacción o, si es necesario, después de la destilación del disolvente de la mezcla de la solución, vertiendo el resto en agua seguido por una extracción con un disolvente orgánico inmiscible en agua, y destilando el disolvente del extracto. Además, el producto puede, si se desea, también ser purificado mediante diversas técnicas, tales como la recristalización, la reprecipitación o las diversas técnicas de cromatografía, en particular la cromatografía sobre columna o la cromatografía en capa fina preparativa.
Se apreciará que los compuestos útiles según la presente invención pueden contener unos centros asimétricos. Estos centros asimétricos pueden estar independientemente en configuración R o S. Para el experto en la materia parecerá que ciertos compuestos útiles según la invención pueden también presentar una isomería geométrica. Se debe de entender que la presente invención comprende unos isómeros geométricos individuales y unos esteroisómeros y unas mezclas de estos, incluyendo unas mezclas racémicas, de compuestos de la fórmula (I) anterior. Este tipo de isómeros pueden ser separados de sus mezclas, por la aplicación o la adaptación de procedimientos conocidos, por ejemplo unas técnicas de cromatografía o unas técnicas de recristalización, o son preparadas separadamente a partir de los isómeros apropiados de sus intermedios.
Para los fines de esta memoria, se entiende que las formas tautoméricas están comprendidas en la citación de un grupo dado, por ejemplo tio/mercapto u oxo/hidroxi.
Las sales de adiciones ácidas están formadas con los compuestos útiles según la invención, en las que está presente una función de base tal como un grupo amino, alquilamino o dialquilamino, o también piridina, fenol. Se prefieren las sales de adición ácida farmacéuticamente aceptables, es decir no tóxicas. Las sales seleccionadas se seleccionan de manera óptima para ser compatibles con los vehículos farmacéuticos habituales y adaptadas para la administración oral o parenteral. Las sales de adición ácida de los compuestos útiles según esta invención pueden ser preparadas por reacción de la base libre con el ácido apropiado, por la aplicación o la adaptación de procedimientos conocidos. Por ejemplo, las sales de adición ácida de los compuestos útiles según esta invención se pueden preparar bien disolviendo la base libre en agua o en una solución acuosa alcoholizada o unos disolventes adaptados que contienen el ácido apropiado y aislando la sal evaporando la disolución, o haciendo reaccionar la base libre y el ácido en un disolvente orgánico, en tal caso la sal se separa directamente o puede ser obtenida por concentración de la solución. Entre los ácidos adaptados para el uso en la preparación de estas sales, se encuentra el ácido clorhídrico, el ácido bromhídrico, el ácido fosfórico, el ácido sulfúrico, diversos ácidos carboxílicos y sulfónicos orgánicos, tales como el ácido acético, ácido cítrico, ácido propiónico, ácido succínico, ácido benzoico, ácido tártrico, ácido fumárico, ácido mandélico, ácido ascórbico, ácido málico, ácido metanosulfónico, ácido toluenosulfónico, ácidos graso, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, benceno-sulfonato, benzoato, propionato de ciclopentano, digluconato, dodecilsulfato, bisulfato, butirato, lactato, laurato, sulfato de laurilo, malato, hidroyoduro, 2hidroxietanosulfonato, glicero-fosfato, picrato, pivalato, palmoato, pectinato, persulfato, 3-fenil-propionato, tiocianato, 2-naftaleno-sulfonato, undecanoato, nicotinato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, alcanforato, alcanforsulfonato, y otros.
Las sales de adición ácida de los compuestos útiles según esta invención pueden ser regeneradas a partir de las sales por la aplicación o la adaptación de procedimientos conocidos. Por ejemplo, los compuestos parentales útiles según la invención pueden ser regenerados a partir de sus sales de adición ácida mediante tratamiento con un álcali, por ejemplo una solución de bicarbonato de sodio acuosa o una solución de amoniaco acuosa.
Los compuestos útiles según esta invención pueden ser regenerados a partir de sus sales de adición de base por la aplicación o la adaptación de procedimientos conocidos. Por ejemplo, los compuestos parentales útiles según la invención pueden ser regenerados a partir de sus sales de adición de base mediante el tratamiento con un ácido, por ejemplo un ácido clorhídrico.
Las sales de adición de base pueden estar formadas cuando el compuesto útil según la invención contiene un grupo carboxilo, o también piridina o fenol, o un bioisostero suficientemente ácido. Las bases que pueden ser utilizadas para preparar las sales de adición de base comprenden preferentemente la que producen, cuando están asociadas a un ácido libre, unas sales farmacéuticamente aceptables, es decir sales cuyos cationes no son tóxicos para el paciente en las dosis farmacéuticas de las sales, de manera que los efectos inhibidores inherentes beneficiosos para la base libre no sean anulados por los efectos secundarios atribuibles a los cationes. Las sales farmacéuticamente aceptables, que comprenden las derivadas de las sales de metal alcalinotérreo, al alcance de la invención, comprenden las derivadas de las bases siguientes: hidruro de sodio, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, hidróxido de aluminio, hidróxido de litio, hidróxido de magnesio, hidróxido de zinc, amoniaco,
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etilendiamina, N-metil-glucamina, lisina, arginina, ornitina, colina, N,N'-dibencil-etilendiamina, cloroprocaína, dietanolamina, procaína, N-bencilfenetilamina, dietilamina, piperazina, tris(hidroxi-metil)aminometano, hidróxido de tetrametilamonio y análogos.
Los compuestos útiles según la presente invención pueden ser fácilmente preparados, o formados durante el proceso de la invención, en forma de solvatos (por ejemplo hidratos). Los hidratos de los compuestos útiles según la presente invención pueden ser fácilmente preparados mediante la recristalizacion de una mezcla de disolvente acuoso/orgánico, utilizando unos disolventes orgánicos tales como dioxano, tetrahidrofurano o metanol.
Los productos de base o los reactivos utilizados están disponibles comercialmente y/o pueden ser preparados por la aplicación o la adaptación de procedimientos conocidos, por ejemplo unos procedimientos tales como se describen en los ejemplos de referencia o sus equivalentes químicos evidentes.
Según la presente invención, los compuestos de la fórmula (I) presentan una actividad biológica de quelante de metales y/o de disolución de agregados amiloides.
La presente invención tiene también por objeto las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto según la invención con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Preferentemente, dicha composición contiene una cantidad eficaz del compuesto según la invención.
Según otro objeto, la presente invención se refiere también a la utilización de compuestos de la fórmula general (I) para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas a quelar los iones metálicos, más preferentemente los de zinc, cobre, hierro, aluminio o manganeso, más preferentemente los iones del zinc de grado de oxidación II, del cobre de grado de oxidación I, II, del hierro de grado de oxidación II, III, IV o V.
La invención se refiere también a la utilización de compuestos de la fórmula general (I) para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas a disolver los agregados amiloides.
Según otro objeto, la presente invención se refiere también a la utilización de compuestos de la fórmula general (I) para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas a prevenir y/o tratar enfermedades neurodegenerativas tales como las que afectan al sistema nervioso central. Más particularmente, las enfermedades neurodegenerativas se seleccionan de entre la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica o la trisomía 21, las encefalopatías espongiformes, tales como la enfermedad de Kreitzfeld-Jacob.
Preferentemente, dicha composición se administra a un paciente que lo necesita.
Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden presentarse en formas destinadas a la administración por vía parenteral, oral, rectal, intravenosa, permucosa o percutánea.
Se presentarán por lo tanto en forma de solutos o de suspensiones inyectables, o frascos multidosis, en forma de comprimidos sin recubrir o recubiertos, de grageas, de cápsula, cápsulas de gel, de píldoras, de tabletas, de polvos, de supositorios o de cápsulas réctales, de soluciones o de suspensiones, para uso percutáneo en un disolvente polar, o para el uso permucoso.
Los excipientes convenientes para tales administraciones son los derivados de la celulosa o de la celulosa microcristalina, los carbonatos alcalinotérreos, el fosfato de magnesio, los almidones, los almidones modificados, y la lactosa para las formas sólidas.
Para el uso rectal, los excipientes preferidos son la manteca de cacao o los estearatos de polietilenglicol.
Para el uso parenteral, los vehículos más cómodamente utilizados son el agua, los solutos acuosos, el suero fisiológico y los solutos isotónicos.
La posología puede variar dentro de límites importantes (0,5 mg a 1000 mg) en función de la indicación terapéutica y de la vía de administración, así como de la edad y del peso del sujeto.
Leyendas de las figuras:
Figura 1: derivados de quinolina ensayados sobre Aβ.
Figura 2: Geometrías cis y trans para la complejación de iones metálicos por los derivados de 8-hidroxiquinolina.
Figura 3: Estructura cristalina de [2,2'-(2,2-propanodiil)-bis[-8-quinolinolato]níquel (II); se omitieron los átomos de hidrógeno. Se hace notar que el complejo es de configuración cis (figura 2) y que las dos entidades quinolina del
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ligando quelan el mismo átomo metálico.
Figura 4: Estructura cristalina de bis{7-(metiloxi)-8-[fenilmetil)oxi]-2-quinoleinil}propanodioato, se omitieron los átomos de hidrógeno.
Figura 5: Estructura cristalina de 2-cloro-8-nitroquinolina.
Figura 6: Espectros UV-visibles obtenidos durante la valoración de Cu(II) por el ligando 3. Los espectros de valoración se obtienen con 15 µM de ligando (L) en la mezcla tampón Tris▪HCl 20 mM; NaCl 150 mM (pH = 7,4)/CH3OH (1/1, v/v) y diferentes relaciones de CuCl2. La dirección de las flechas indica las variaciones observadas sobre los espectros cuando la relación Cu(II)/L aumenta.
Figura 7: Espectros UV-visibles de 3; Cu(II)-3; EDTA y (EDTA)Cu(Il) en la mezcla tampón Tris·HCl 20 mM; NaCl 150 mM (pH = 7,4)/CH3OH (1/1, v/v). La concentración de los ligandos y los complejos metálicos es de 15 µM. Se hace notar que una absorbencia a λ = 379 nm se observa sólo para el complejo Cu(II)-3.
Figura 8: Reacción de competición para la complejación de CuCl2 por el ligando 3 (Ls) y EDTA (Lc). Los espectros se obtienen con 15 µM de 3 y de CuCl2 y diferentes relaciones de EDTA en la mezcla 20 mM tampón Tris·HCl/150 mM NaCl (pH = 7,4)/CH3OH (1/1, v/v). La dirección de las flechas indica las variaciones de absorbencia observadas cuando la relación Lc/Ls aumenta.
Figura 9: Variación del porcentaje de péptido Aβ1-42 soluble en función de la estequiometría Aβ/Cu(II). El péptido Aβ1-42 (5 µM) se incuba durante dos horas a 37°C en un ta mpón Tris·HCl 20 mM (pH = 7,4); NaCl 150 mM en presencia de diferentes estequiometrías de Cu(II) y después se centrifuga la mezcla de reacción. El porcentaje de péptido en el sobrenadante (Aβ1-42 soluble) y en el precipitado (Aβ1-42 agregado) son entonces cuantificados con la ayuda de un kit Micro BCA Protein Assays. Valor 1 y Valor 2 proceden de dos experimentos independientes, cuando el número de mediciones es ≥ 3, se presentan la media y la desviación estándar de los valores obtenidos.
Figura 10: Variación del porcentaje de péptido AB1-42 soluble en presencia de diferentes estequiometrías de CuCl2 y de ligandos. El péptido Aβ1-42 (5 µM) se incuba durante una hora a 37°C en un tam pón Tris·HCl 20 mM (pH = 7,4); NaCl 150 mM en presencia de CuCl2 12,5 o 20 µM y después se añade el ligando [12,5 µM (salvo para los monómeros quinolina como 8-hydroxiquinolina, Clioquinol, 8-hidroxiquinaldina y 8-aminoquinolina en los que esta valor es de 25 µM) o 200 µM]. Después de una hora suplementaria de incubación, la mezcla de reacción se centrifuga. El porcentaje de péptido en el sobrenadante (AP1-42 soluble) y en el precipitado (AP1-42 agregado) son entonces cuantificados con la ayuda de un kit Micro BCA Protein Assays. Para cada compuesto, los valores de la izquierda (en gris oscuro) y de la derecha (en gris claro) representan los resultados obtenidos para, respectivamente, las relaciones 200 µM de ligando/20 µM CuCl2 y 12,5 µM (en el caso de los dímeros de quinolina o 25 µM en el caso de los monómeros) de ligando/12,5 µM CuCl2. Se indican también los porcentajes de péptido Aβ1-42 soluble en presencia de diferentes concentraciones de CuCl2 en ausencia de ligando.
Figura 11: Variación de la producción de H2O2 por los complejos de cobre del péptido Aβ1-42 en función de la estequiometría Cu(II)/Aβ. Los experimentos se realizan durante 5 minutos en un tampón fosfato de sodio (pH = 7,4) en presencia de 0,4 µM de CuCl2, 10 µM de ascorbato y de aire con o sin 0,4 µM de 3 o de 7. El H2O2 liberado se cuantifica con la ayuda de un kit Amplex-Red H2O2/HRP Assay.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención, sin por ello limitarla. Los productos de partida utilizados son unos productos conocidos o preparados según unos modos de realización conocidos.
Las siguientes abreviaturas se han utilizado aquí anteriormente o en lo sucesivo:
Aβ: péptido β-amiloide; BSA: Albúmina de suero bovino; biPy: 2,2'-bipiridina; BnCl: cloruro de bencilo; BOP: (benzotriazol-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfonio hexafluorofosfato; CTDA: ácido trans-1,2-diaminociclohexanoN,N,N,N'-tetraacético; d: doblete; dd: doblete duplicado; DIC: detección por ionización química; Dien: dietilentriamina; DMF: dimetilformamida; DMSO: dimetilsulfóxido; DTPA: ácido dietilen-triaminopentaacético; EDA: etilendiamina; EDDA: ácido etilendiamina-N,N'-diacético; EDTA: ácido etilendiaminatetraacético; EGTA: ácido etilenbis(oxietilenenitrilo)-tetraacético; eq: equivalente; Ec.: ecuación; HOBT: 1-hidroxibenzotriazol monohidrato; HRP: peroxidasa de rábano picante (Horse Radish Peroxidase); HIDA: ácido N-(2-hidroetil)iminodiacético; LDA: diisopropilamina de litio; m: masivo; mCPBA: ácido m-cloroperbenzoico; NBS: N-bromosuccinimida; NTA: ácido nitrilotriacético; Pd2(dba)2: tris(dibenciliden-acetona)-dipaladio(0); PM: peso molecular; rac-BINAP: rac-2,2'bis(difenilfosfino)-1,1',binaftilo; s: singlete; SM: espectrometría de masa; t: triplete; Tetren: tetraetilenpentamina; THF: tetrahidrofurano; Trien: trietilentetramina; rpm: revolución por minuto
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Ejemplos
Descripción de los ejemplos:
Síntesis:
Observaciones generales referentes a la síntesis orgánica:
Se sintetizó 8-metiloxiquinaldina según un método descrito en la bibliografía. (C. Kitamura et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 2000, 781-785). Se sintetizó N-butil-2,2'-imino-bis(8-nitroquinolina) según las referencias: H. Jiang et al. Tetrahedron 2003, 59, 8365-8374; G. Xue et al., Tetrahedron 2001, 57, 7623-7628 y P. Belser et al. Tetrahedron 1996, 52, 2937-2944. 7-bromo-8-hidroxiquinolina (preparada según el método de Pearson: D.E. Pearson et al. J. Org. Chem. 1967, 32, 2358-2360; G. E. Collis et al. Acta Cryst. 2003, C59, o443-o444). Se sintetizó 1,1-dimetil(2formil-8-quinoleinil)carbamato según G. Xue et al., Tetrahedron 2001, 57, 7623-7628. Se sintetizó 2-cloro-8nitroquinolina según M. C. Kimber et al., Aust. J. Chem. 2003, 56, 39-44.
Se secó el acetonitrilo sobre un tamiz molecular 4 Å. Se destiló el tetrahidrofurano (THF) sobre la benzofenona en presencia de sodio. Se obtuvo CuCl2 seco mediante calentamiento al vacío a 50°C. Se sec ó el diclorometano sobre alúmina básica. Los otros reactivos y disolventes utilizados provienen de proveedores estándares en productos químicos y se utilizaron sin purificación ulterior.
Los espectros RMN se registraron en unos aparatos Bruker 200, 250 o 500 MHz. El espectrómetro de masas en ionización electrospray (IES-SM) era un aparato Perkin-Elmer SCIEX API 365, las muestras se han introducido en la fuente electrospray con una bomba de jeringa Havard Apparatus. Los espectros UV-visibles se registraron sobre un espectrofotómetro de matriz de diodos Hewlett Packard 8452A o un espectrofotómetro Perkin-Elmer Lamda 35.
Las cromatografías de capa fina se realizan sobre placa de sílice.
2-Cloro-8-nitroquinolina:
Se realizó la síntesis según el protocolo de: M. C. Kimber et al., Aust. J. Chem 2003, 56, 39-44. Se añaden a continuación unos datos de RMN más precisos que los previamente publicados. RMN-1H (250 MHz, CDCl3) d, ppm: 8,21 (d, 3J (H, H) = 8,5 Hz, 1 H); 8,10 (dd, 3J (H, H) = 7,5 Hz, 4J (H, H) = 1,5 Hz, 1 H); 8,05 (dd, 3J (H,H)=8,0Hz, 4J (H, H) = 1,5 Hz, 1 H); 7,65 (m, 1 H); 7,55 (d, 3J (H, H) = 8,5 Hz, 1 H). RMN-13C (63 MHz, CDCl3) δ, ppm: 153,5 (Cq); 147,1 (Cq); 138,9 (Cq); 138,8 (CH); 131,9 (CH); 127,6 (Cq); 125,8 (CH); 125,0 (CH); 124,5 (CH). SM (DIC, NH3): m/z = 209 (MH+), 226 (MNH4+), 243 (MN2H7+). Análisis (%) para C9H5N2O2Cl: calculado C 51,82; H 2,42; N 13,43; encontrado C 51,76; H 2,37; N 13,24. La estructura de la molécula se confirmó por análisis por difracción de rayos X sobre unos monocristales obtenidos por cristalización del producto en cloroformo deuterado. La estructura se presenta en la figura 5. Los parámetros del análisis cristalino son los siguientes: sistema cristalino ortorrómbico; P c a 21; a = 18,090 (4) Å, b = 3,7781 (7) Å, c = 12,581 (2) Å, α = 90°, β = 90°, γ= 90°.
N-Butil-8-nitro-2-quinolinamina:
Se pone en suspensión 2-cloro-8-nitroquinolina (0,20 g; 0,96 mmol) en 9,5 ml de 1-butilamina y se calienta el medio a reflujo (78 °C) durante 15 horas. La solución ama rilla obtenida se concentra después al vacío. El producto bruto de reacción se recoge en un volumen mínimo de CH3OH y se vierte sobre 3 ml de dietiéter. Después de la centrifugación, se eliminan unos cristales de cloruro de butilamonio y se concentra el sobrenadante bajo presión reducida para dar N-butil-8-nitro-2-quinolinamina en forma de un aceite amarillo (0,21 g; 0,86 mmol, rendimiento = 90%). RMN-1H (250 MHz, CDCl3) δ, ppm: 7,83 (dd, 3J (H, H) = 7,5 Hz, 4J (H, H) = 1,5 Hz, 1 H); 7,77 (d, 3J (H, H) = 9,0 Hz, 1 H); 7,69 (dd, 3J (H, H) = 8,0 Hz, 4J (H, H) = 1,5 Hz, 1 H); 7,14 (m, 1 H), 6,67 (d, 3J (H, H) = 9,0 Hz, 1 H); 5,07 (s large, 1 H); 3,47 (m, 2 H); 1,60 (m, 2 H); 1,39 (m, 2 H); 0,93 (t, 3J (H, H) = 7,5 Hz, 3 H). RMN-13C (63 MHz, CDCl3) δ, ppm: 157,8 (Cq); 145,6 (Cq); 140,2 (Cq); 136,7 (CH); 131,5 (CH); 124,7 (CH); 124,1 (CH); 119,7 (CH); 113,3 (Cq); 41,3 (CH2); 31,5 (CH2); 20,2 (CH2); 13,8 (CH3). SM (DIC, NH3): m/z = 246 (MH+). Análisis (%) para C13H15N3O2: calculado C 63,66; H 6,16; N 17,13; encontrado C 63,33; H 6,21; N 16,64.
N-Butil-2,2'-imino-bis(8-nitroquinolina) (compuesto 23'):
A una suspensión violeta de N-butil-8-nitro-2-quinolinamina (0,17 g; 0,69 mmoles), de tris(dibenciliden-acetona)dipaladio(0) (13 mg; 0,014 mmoles) y de rac-2,2'-bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftilo (17 mg; 0,027 mmoles) en 5 ml de tolueno bajo argón, se añade 2-cloro-8-nitroquinolina (122 mg; 0,59 mmoles) y NaOtBu (77,5 mg; 0,81 mmol). El medio se calienta a reflujo durante 3 horas, y después se añade de nuevo 2-cloro-8-nitroquinolina (22 mg; 0,11 mmoles). Se continúa el calentamiento durante 2 horas 30 minutos y después se añaden 10 ml de una solución saturada de cloruro de amonio. Se extrae el producto con 3 × 30 ml de CH2Cl2 y se evapora el disolvente bajo presión reducida. El producto se purifica por cromatografía sobre gel de sílice, se eluye con CH2Cl2/hexano (80/20, v/v) para dar N-butil-2,2'-imino-bis(8-nitroquinolina) en forma de un polvo amarillo (0,11 g; 0,26 mmol, rendimiento = 38 %). RMN-1H (250 MHz, CDCl3) δ, ppm: 8,14 (d, 3J (H, H) = 9,0 Hz, 2 H); 7,99 (dd, 3J (H, H) = 7,5 Hz, 4J (H, H) =
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1,5 Hz, 2 H); 7,93 (dd, 3J (H, H) = 8,0 Hz, 4J (H, H) = 1,5 Hz, 2 H); 7,73 (d, 3J (H, H) = 9,0 Hz ,2 H); 7,43 (m, 2 H); 4,45 (t, 3J (H, H) = 7,5 Hz, 2 H); 1,83 (m, 2 H); 1,47 (m, 2 H); 0,98 (t, 3J (H, H) = 7,5 Hz, 3 H). RMN-13C (63 MHz, CDCl3) δ, ppm: 156,2 (Cq); 146,4 (Cq); 138,7 (Cq); 137,0 (CH); 131,5 (CH); 126,2 (Cq); 124,2 (CH); 122,8 (CH); 117,3 (CH); 48,9 (CH2); 30,4 (CH2); 20,3 (CH2); 13,9 (CH3). SM (DIC, NH3): m/z = 418 (MH+). Análisis (%) para C22H19N5O4: calculado C 63,30; H 4,59; N 16,78; encontrado C 63,18; H 4,49; N 16,39. UV/vis [CH3OH/Tris▪HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 210 (91 400), 226 (53 500, inflexión), 270 (42 100), 294 (26 700, inflexión), 383 (28 400).
N-Butil-2,2'-imino-bis(8-quinolinamina) (compuesto 23)
A una solución de N-butil-2,2'-imino-bis(8-nitroquinolina) (230 mg; 0,55 mmoles) en 35 ml de acetato de etilo, se añade paladio sobre carbón al 10% en masa (50 mg). La mezcla se coloca bajo atmósfera de dihidrógeno (1 bar) y se agita durante 4 horas a temperatura ambiente. Después de la eliminación del paladio por filtración sobre celita, la fase orgánica se concentra a presión reducida. El producto bruto de reacción se recoge en el mínimo de CH2Cl2 y se precipita mediante 4 volúmenes de hexano. Después de la filtración, el sobrenadante se concentra a presión reducida y el producto se seca al vacío para dar 23 en forma de un polvo marrón (197 mg; 0,55 mmol, rendimiento cuantitativo). RMN-1H (250 MHz, CDCl3) δ, ppm: 7,90 (d, 3J (H, H) = 9,0 Hz, 2 H); 7,32 (d, 3J (H, H) = 9,0 Hz, 2 H); 7,20 (m, 2 H); 7,10 (dd, 3J (H, H) = 8,0 Hz, 4J (H, H) = 1,0 Hz, 2 H); 6,93 (dd, 3J (H, H) = 7,5 Hz, 4J (H, H) = 1,0 Hz, 2 H); 4,60 (s, 4H); 4,48 (t, 3J (H, H) = 7,5 Hz, 2 H); 1,88 (m, 2 H); 1,47 (m, 2 H); 0,97 (t, 3J (H, H) = 7,5 Hz, 3 H). RMN13C (63 MHz, CDCl3) δ, ppm: 154,1 (Cq); 142,1 (Cq); 137,2 (CH); 137,0 (Cq); 125,3 (Cq); 125,0 (CH); 116,3 (CH); 116,1 (CH); 111,3 (CH); 48,9 (CH2); 30,6 (CH2); 20,7 (CH2); 14,1 (CH3). SM (DIC, NH3): m/z = 358 (MH+). UV/vis [CH3OH/Tris▪HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 211 (53 400, inflexión), 302 (40 300), 367 (20 000), 382 (14 600, inflexión).
Resultados:
Capacidad de los compuestos para quelar los metales: (estos resultados se refieren no sólo al compuesto 23 de la invención, sino también a unos compuestos similares que no responden a la fórmula (I))
Determinación de la estequiometría metal/ligando:
Los espectros de absorción UV-visible y las valoraciones espectrofotométricas UV-visible, se realizaron en presencia de tampón Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM, ya que es el disolvente utilizado durante los ensayos de resolubilización de Aβ1-42. Un disolvente orgánico (CH3OH, dioxano o DMSO) se añadió a fin de obtener una buena solubilidad de los ligandos y de los complejos metálicos a las concentraciones utilizadas en estos experimentos. Las proporciones exactas de la mezcla disolvente orgánico/tampón se precisan a nivel de cada caracterización UVvisible de los diferentes ligandos o complejos metálicos.
A una solución de 15 µM de ligando se añaden unas alícuotas de soluciones concentradas de CuCl2 o de ZnCl2 (M) a fin de inducir sólo unas variaciones insignificantes de volumen. Después de cada adición, se observan inmediatamente unos cambios de los espectros de absorción y son estables entre dos adiciones, lo que corresponde con un proceso rápido de complejación. Los valores exactos de absorción relativos a cada ligando y sus complejos de cobre(II) o de zinc(II) son detallados a continuación en la parte experimental (en la parte de síntesis para los ligandos y en lo sucesivo para los complejos metálicos).
La estequiometría de los diferentes ligandos (L) para Cu(II) o Zn(II) se determinó así espectrofotométricamente por valoración del ión metálico. Un ejemplo típico, obtenido en el caso de la valoración de CuCl2 por el ligando 3 se presenta en la figura 6. En este ejemplo, para una relación M/L que aumenta de 0 a 1, la transición π→π*, centrada a 251 nm para el ligando libre, se desplaza hacia una energía más baja con la aparición concomitante de una banda de absorción en la región visible del espectro (λmax a 383 nm) que se debe probablemente a una transición MLCT. Para unas relaciones M/L superiores, no se observa ningún cambio suplementario en los espectros de absorción UV-visible. Estos resultados se corresponden con una capacidad del ligando 3 para formar un sólo tipo de complejo de Cu(II) con una estequiometría M/L (1/1).
Se han obtenido unos resultados análogos con otros ligandos en presencia de Cu(II) o de Zn(II), estos se recogen en la tabla 3.
Preparación de los complejos metálicos para la caracterización en espectrometría de masas:
Los ligandos, disueltos en metanol o dioxano, se metalizaron en presencia de un equivalente de ión metálico durante una hora a temperatura ambiente, y después se evaporó el disolvente. Se han utilizado Du Cu(AcO)2 o Zn(AcO)2 para los ligandos 1 a 11 y CuCl2 o ZnCl2 para los otros ligandos. Unos análisis de control, realizados después de la redisolución de los complejos en la mezcla tampón/disolvente orgánico adecuado, han mostrado que los espectros UV-visible de los diferentes complejos así obtenidos son los mismos que los obtenidos durante los experimentos de valoración para una estequiometría idéntica de ligando y de ión metálico.
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Cu(II)-1: SM (DIC, NH3) m/z: 364 (LCu(II) -1 H), 381 (LCu(II)NH4 -2 H). UV/vis [dioxano/Tris▪HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 256 (41 900), 272 (32 200, inflexión), 304 (8 800), 338 (5 100), 376 (3 100).
Cu(II)-2: SM (DIC, NH3) m/z: 434 (LCu(II) -1 H), 451 (LCu(II)NH4 -2 H). Análisis (%) para C19H10N2O2Cl2Cu: calculado C 52,73; H 2,33; N 6,47; encontrado C 52,52; H 1,64; N 6,48. UV/vis [dioxano/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 256 (38 300), 278 (35 900), 310 (10 300), 342 (7 300), 398 (4 000).
Cu(II)-3: SM (DIC, NH3) m/z: 392 (LCu(II) -1 H), 409 (LCu(II)NH4 -2 H). Análisis (%) para C21H16N2O2Cu·0,3 C2H4O2: calculado C 63,33; H 4,16; N 6,84; encontrado C 63,30; H 3,50; N 6,82. UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 202 (70 800), 254 (58 900), 268 (42 400, inflexión), 383 (4 300).
Cu(II)-4: SM (DIC, NH3) m/z: 462 (LCu(II) -1 H), 479 (LCu(II)NH4 -2 H). Análisis (%) para C21H14N2O2Cl2Cu: calculado C 54,74; H 3,06; N 6,08; encontrado C 54,50; H 2,84; N 5,92. UV/vis [dioxano/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 261 (59 500), 274 (46 900, inflexión), 347 (4 700), 409 (5 800).
Cu(II)-5: SM (DIC, NH3) m/z: 400 (LCu(II) -1 H), 417 (LCu(II)NH4 -2 H). UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 205 (64 000), 255 (47 600), 276 (34 400), 415 (2 900).
Cu(II)-6: SM (DIC, NH3) m/z: 378 (LCu(II) -1 H), 395 (LCu(II)NH4 -2 H). UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 245 (41 100), 306 (27 900), 348 (12 100, inflexión), 485 (2 500).
Cu(II)-7: SM (DIC, NH3) m/z: 378 (LCu(II) -1 H)395 (LCu(II)NH4 -2 H). Análisis (%) para C20H14N2O2Cu·0,3 H2O: calculado C 62,67; H 3,84; N 7,31; encontrado C 62,68; H 2,91; N 7,21. UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 202 (57 700), 259 (68 000), 268 (46 200, inflexión), 392 (4 900).
Cu(II)-8: SM (DIC, NH3) m/z: 448 (LCu(II) -1 H), 465 (LCu(II)NH4 -2 H). Análisis (%) para C20H12N2O2Cl2Cu·0,3 H2O: calculado C 53,12; H 2,81; N 6,20; encontrado C 53,09; H 2,37; N 6,08. UV/vis [dioxano/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 264 (64 700), 276 (46 700), 413 (5 300).
Cu(II)-9: SM (DIC, NH3) m/z: 700 (LCu(II) -1 H), 717 (LCu(II)NH4 -2 H). Anal. para C20H10N2O2Cl2I2Cu·2(C2H4O2): calculado C 35,30; H 1,97; N 3,43; encontrado C 35,46; H 1,20; N 3,83. UV/vis [DMSO/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (8/2, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = (56 000), 340 (55 000), 392 (6 200), 420 (5 000).
Cu(II)-10: SM (DIC, NH3) m/z: 406 (LCu(II) -1 H), 423 (LCu(II)NH4 -2 H). UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 204 (56 000), 260 (71 800), 374 (4 800).
Cu(II)-12-Cl: SM (DIC, NH3) m/z: 369 (LCu(II)Cl). UV/vis [DMSO/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (8/2, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 287 (40 700), 368 (3 300), 486 (14 100).
Cu(II)-13: SM (electrospray, > 0) m/z: 390 (LCu(II) -1 H). UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λnm (ε M-1 cm -1) = 230 (55 700); 303 (11 800), 315 (10 400), 360 (1 100, inflexión).
Cu(II)-14: SM (electrospray, > 0) m/z: 405 [LCu(II)].
Cu(II)-16: SM (electrospray, > 0) m/z: 423 (LCu(II) -2 H). UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 254 (34 400), 278 (35 900), 316 (9 700, respaldo), 380 (3 100).
Cu(II)-17: SM (electrospray, > 0) m/z: 438 (LCu(II) -1 H). UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 212 (50 300), 263 (65 300), 275 (47 300, inflexión), 319 (4 500), 421 (5 900).
Cu(II)-23: SM (electrospray, > 0) m/z: 419 (LCu(II) -1 H). UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM
-1)
(1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm = 211 (65 400); 235 (33 800, inflexión), 275 (37 000), 302 (5 900, inflexión), 329 (17 900), 352 (19 000), 366 (20 900). Cu(II)-24: SM (electrospray, > 0) m/z: 361 (LCu(II) -1 H). Zn(II)-1: SM (DIC, NH3) m/z: 365 (LZn(II) -1 H), 382 (LZn(II)NH4 -2 H).
Zn(II)-2: SM (DIC, NH3) m/z: 433 (LZn(II) -1 H), 454 (LZn(II)NH4 -2 H). Zn(II)-3: SM (DIC, NH3) m/z: 393 (LZn(II) -1 H), 410 (LZn(II)NH4 -2 H). UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 202 (78 700), 258 (74 100), 268 (46 700), 378 (4 600).
Zn(II)-4: SM (DIC, NH3) m/z: 463 (LZn(II) -1 H), 482 (LZn(II)NH4 -2 H). UV/vis [dioxano/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 265 (69 200), 275 (45 700), 346 (5 800), 405 (6 100).
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Zn(II)-5: SM (DIC, NH3) m/z: 401 (LZn(II) -1 H),. UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 205 (43 300), 258 (50 500), 274 (30 900), 404 (3 000).
5 Zn(II)-6: SM (DIC, NH3) m/z: 379 (LZn(II) -1 H), 396 (LZn(II)NH4 -2 H). UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 238 (31 100), 298 (26 200), 346 (10 500, inflexión), 473 (3 000).
Zn(II)-7: SM (DIC, NH3) m/z: 379 (LZn(II) -1 H), 396 (LZn(II)NH4 -2 H). UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 202 (55 500), 258 (63 600), 268 (43 400, inflexión), 374 (4 000).
10 Zn(II)-8: SM (DIC, NH3) m/z: 449 (LZn(II) -1 H), 466 (LZn(II)NH4 -2 H). UV/vis [dioxano/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 264 (57 800), 272 (43 600, inflexión), 390 (5 400).
Zn(II)-9: SM (ES-SM, < 0) m/z: 735 (LZn(II)HCl). UV/vis [DMSO/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (8/2, v/v)]: λ 15 nm(ε M-1 cm -1) = 276 (54 200), 340 (5 800), 352 (7 700), 397 (5 100).
Zn(Il)-10: SM (DIC, NH3) m/z: 407 (LZn(II) -1 H), 424 (LZn(II)NH4 -2 H). UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 202 (63 600), 260 (65 600), 368 (4 400).
20 Zn(II)-12-Cl: SM (DIC, NH3) m/z: 370 (LZn(II)Cl). UV/vis (CH3OH): λ nm (ε M-1 cm -1) = 288 (31 800), 299 (27 900), 369 (3 400), 490 (13 200).
Zn(II)-13: UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 232 (55 400); 300 (9 600), 314 (9 200), 364 (700, inflexión).
25 Zn(II)-14: UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 236 (43 900), 304 (8 700), 316 (8 000).
Zn(II)-16: SM (electrospray, > 0) m/z: 425 (LZn(II) -1 H). UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM 30 (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 262 (44 700), 276 (22 300, inflexión), 308 (5 900), 390 (2 000).
Zn(II)-17: SM (electrospray, > 0) m/z: 439 (LZn(II) -1 H). UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 202 (66 900); 264 (92 500), 276 (47 100, inflexión), 318 (5 500), 398 (6 700).
35 Zn(II)-18: SM (electrospray, > 0) m/z: 394 (LZn(II) -1 H). UV/vis [DMSO/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (8/2, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 273 (27 400); 309 (23 800), 332 (22 000); 4307 (3 800).
Zn(II)-23: UV/vis [CH3OH/Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM (1/1, v/v)]: λ nm (ε M-1 cm -1) = 213 (47 000); 234 (24 800), 274 (25 600), 303 (10 900, inflexión), 330 (11 600), 348 (12 300), 363 (13 100). 40 Estimación de las constantes de afinidad de los ligandos para los iones metálicos:
Unas soluciones de ligando a estudiar Ls, de quelante en competición Lc y de ión metálico M en la relación 1/1/1 son analizadas por espectrofotometría UV-visible a 20ºC. La concentración de cada componente es de 15 µM. Los 45 espectros de absorción UV-visible de las especies Ls, MLs, Lc o MLc y los análisis espetrofotométricos de las competiciones se realizan en presencia de tampón Tris·HCl 20 mM; NaCl 150 mM (pH = 7,4) ya que es el disolvente utilizado durante los ensayos de resolubilización de Aβ1-42 descritos a continuación. Un disolvente orgánico (CH3OH, dioxano o DMSO) se añadió a fin de obtener una buena solubilidad de todos los ligandos y de todos los complejos metálicos a las concentraciones utilizadas en estos experimentos. Unos controles han mostrado que todos los
50 ligandos y todos los complejos metálicos estudiados dan unos resultados que corresponden con la ley de Beer-Lambert en las condiciones experimentales utilizadas.
Los quelantes de iones metálicos (Lc) utilizados durante los experimentos de competición se seleccionaron a partir de "The National Institute of Standards and Technology Standard Reference Data base 46" NIST (Critically Selected 55 Stability Constants of Metal Complexes Database, version 4,0, U. S. Department of Commerce) y L. G. Sillen, A. E. Martell Stability Constants of Metal-Ion complexes, The Chemical Society London Publication, 1971.
Los quelantes competidores Lc se seleccionaron a fin de disponer de una gama de constante de estabilidad para el ión metálico M que presenta unos intervalos de más o menos uno o dos log, y también a fin de tener la posibilidad 60 para cada experimento de competición de cuantificar una de las especies Ls, MLs, Lc o MLc a una longitud de onda del espectro UV-vis sin contaminación de las otras tres especies (figura 7). Las constantes de estabilidad K = [ML]/([M][L]) seleccionadas para los quelantes competidores son dadas para 25ºC, una fuerza iónica de 0,1-0,2 ν y una relación molar ión metálico/quelante de 1/1 en las tablas 1 y 2. Cuando más de un complejo metálico puede formarse entre el ión metálico y el quelante, el quelante de competición se selecciona si el log K de su complejo
65 metálico con respecto a un ión metálico/quelante de 1/1 es superior a los de todos los otros complejos posibles.
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El log K de un quelante para un ión metálico varía con el pH de la solución, como se determina por las ecuaciones siguientes (C. S. Atwood et al., J. Neurochem. 2000, 75, 1219-1233; A. Ringblom, Complexation in Analytical Chemistry, 1963, Interscience, New York; G. Schwarznbach et al., Complexometric Titrations, 1969, Meuthuen, New York):
imagen22
en la que:
imagen23
Ka = 10x, en el que x = -pKa del quelante (los valores Ka se describen en un orden decreciente de los valores de pKa), y n = nº del valor de pKa. Los valores de log K app para los quelantes competidores utilizados a pH = 7,4 se presentan en las tablas 1 y 2.
Cuando Ls, Lc y M se utilizan en una relación 1/1/1, y Ls forma con el ión metálico un complejo MLs y Lc forma con el ión metálico un complejo MLc
imagen24
Kc es el valor de Kapp para el quelante en competición Lc, determinado con las ecuaciones 1 y 2. 25 Se puede deducir de ello que en el equilibrio:
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y
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30
La concentración inicial C es la misma para Ls, Lc y M. Si los complejos MLs y MLc se observan al mismo tiempo en los espectros UV-vis para log Kc > 6 se puede considerar que cualquier ión metálico está complejado en las formas MLs o MLc y en el equilibrio:
35
imagen27
La concentración [MLs] = estando x % de C medido sobre los espectros UV-visibles, por lo tanto se deducen las concentraciones [Ls] = (1-x) % de C,[MLc] = (1 -x) % de C et [Lc]= x% de C y:
imagen28
Se llevaron a cabo también algunos experimentos, en los mismos disolventes, con Ls y M en una relación 1/1 (15 µM de cada uno) pero con diferentes estequiometrías de Lc. Para una concentración inicial C = Ls = M, la concentración
45 de ligando competidor [Lc] = y % de C que, en el equilibrio, permite obtener la relación de concentración [MLs]/[Ls] = 1 y por lo tanto para la cual las concentraciones [MLs] = [Ls] = 50 % de C se deducen de gráficos como los obtenidos en la figura 8. En estas condiciones [MLs] = [MLc]; [MLc] + [Lc]= Y, y ≥ 50 y:
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Cuando log Ks ≤ 6, estas ecuaciones no se utilizan ya que los porcentajes de ión metálico libre en solución o quelado por el disolvente o el tampón no son insignificantes.
5 Así, en el caso de 12 en presencia de Zn(II), sólo se ha determinado, en el disolvente estudiado, el número de equivalente de ZnCl2 para que 15 µM de ligando esté totalmente en forma de complejo de Zn(II) en el disolvente estudiado, estando el ligando en competición con el tampón Tris y el DMSO para la complejación del ión metálico. Por comparación con otros quelantes en las mismas condiciones: 2,2'-bipiridina (log Kapp ≈ 5; 250 ec. ZnCl2) < 12
10 (100 ec. ZnCl2)< 1,10-fenantrolina (log Kapp = 6,3; 50 ec. ZnCl2). De ahí una estimación de log Ks ≈ 6.
De la misma manera, en el tampón Tris/CH3OH (1/1, v/v), el número de equivalente de Zn(II) está comprendido entre 100 y 200 ec. para 13, entre 500 y 1000 ec. para 14, entre 7,5 y 10 ec. para 18 y entre 100 y 200 ec. para 23.
15 Las tablas 1 y 2 resumen los valores observados durante competiciones y la tabla 3 presenta los valores de las constantes de afinidad deducidas de ello.
La tabla 4 pone en evidencia que log Ks varía poco según la composición de los diferentes medios estudiados.
20 Tabla 1: Reacción de competición entre los ligandos (Ls), CuCl2 (M) y un ligando competidor (Lc) en una relación 1/1/1 de 15 µM. para cada ligando Ls, los disolventes utilizados son los descritos en la tabla 3. Se da el porcentaje de la especie CuLs en el equilibrio. Los valores entre paréntesis corresponden al número de equivalentes de Lc que permiten la formación del 50% de CuLs a partir de una mezcla de Ls (15 µM, 1 equivalente) y CuCl2 (1/1, mol/mol). K1 es la constante de estabilidad para la especie MLc. K2 es la constante de estabilidad para la especie M(Lc)2.
25
log K1 log K1 app log K2
EDA 10,5 7,8 9,1 biPy 8,1 8,1 5,5 HIDA 11,8 10,5 4,0 Dien 15,9 11,8 5,0 EDDA 16,2 13,9 EDTA 18,8 15,9 Trien 20,1 16,0 CTDA 22,0 17,1 Tetren 22,8 17,9
3
100 100 100 - 100 50 (1 ec) 30 15 0
4
- - 100 - 90 40 (0,65 ec) - - -
5
- - - - - 45 - - -
6
- - - - - 75 - - -
7
- - - - - 55 (1,1 ec) - - -
8
- - - - - 40 (0,65 ec) - - -
9
- - - 100 - 60 45 (0,75 ec) - 0
10
- - - - - 45 - - -
12
- - - - - 55 - - -
13
- - - - 65 25 - - -
17
- - - - - 55 - - -
23
- - - - - 30 - - -
Tabla 2: Reacción de competición entre los ligandos (Ls), ZnCl2 (M) y un ligando competidor (Lc) en una relación 1/1/1 a 15 µM
Log K1 log K1 app log K2
Trien 11,9 7,8 NTA 10,5 8,0 3,8 EGTA 12,6 9,4 EDTA 16,5 13,7 DTPA 18,2 13,9
3
100 100 100 30 (0,7 ec) 20
4
- - - 20 -
5
- - - 55 -
6
- - - 75 -
7
- - - 55 -
8
- - - 30 -
9
100 100 - 65 -
10
- - - 45 -
17
- - - 35 -
Para cada ligando Ls, los disolventes son los descritos en la tabla 3. Se da el porcentaje de la especie ZnLs en el equilibrio. Los valores entre paréntesis corresponden al número de equivalentes de Lc que permiten la formación del 50% de ZnLs a partir de una mezcla de Ls (15 µM, 1 equivalente) y ZnCl2 (1/1, mol/mol). K1 es la constante de estabilidad para la especie MLc. K2 es la constante de estabilidad para la especie M(Lc)2.
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Tabla 3: Especies formadas durante las reacciones de valoración con CuCl2 o ZnCl2 y constantes de afinidad de diferentes ligandos para los iones Cu(II) o Zn(II) a pH = 7,4.
Ligando
Complejo observado por valoración con CuII (estequiometría L/Cu(II) observada) log KCuII Complejo observado por valoración con ZnII (estequiometría L/Zn(II) observada) Log KZnII Disolvente
3
LCuII (1/1) 15,9 ± 1a LZnII (1/1) 13,3 ± 1 a Tampón/CH3OH (1/1)
4
LCuII (1/1) 15,4 ± 1 a LZnII (1/1) 12,5 ± 1 b Tampón/dioxano c
5
LCuII (1/1) 15,7 ± 1 b LZnII (1/1) 13,9 ± 1 b Tampón/CH3OH (1/1)
6
LCuII (1/1) 16,6 + 1 b LZnII (1/1) 14,4 ± 1 b Tampón/CH3OH (1/1)
7
LCuII (1/1) 16,0 ± 1 a LZnII (1/1) 13,9 ± 1 b Tampón/CH3OH (1/1)
8
LCuII (1/1) 15,4 ± 1 a LZnII (1/1) 13,0 ± 1 b Tampón/dioxano c
9
LCuII (1/1) 15,7 ± 1 a LZnII (1/1) 14,2 ± 1 b Tampón/DMSO (2/8)
10
LCuII (1/1) 15,7 ± 1 b LZnII (1/1) 13,5 ± 1 b Tampón/CH3OH (1/1)
12
LCuII (1/1) 16,0 ± 1 b LZnII (1/1) ≈ 6 Tampón/DMSO (2/8)
13
LCuII (1/1) 14,7 ± 1 b - - Tampón/CH3OH (1/1)
17
LCuII (1/1) 16,0 ± 1 b LZnII (1/1) 13,2 ± 1 b Tampón/CH3OH (1/1)
23
LCuII (1/1) 15,2 ± 1 b - - Tampón/CH3OH (1/1)
5 a) según la ecuación 8.
b) según la ecuación 7.
10 c) Dioxano/tampón Tris·HCl 20 mM pH = 7,4; NaCl 150 mM = 1/1 y 8/2 para los experimentos con CuCl2 y ZnCl2, respectivamente.
Tabla 4: Comparación de las reacciones de competición entre el ligando 3 (Ls), CuCl2 o ZnCl2 (M) y el ligando competidor EDTA (Lc) en una relación 1/1/1 de 15 µM en los diferentes disolventes utilizados para la determinación 15 de las constantes de afinidad aparentes para los iones metálicos (Ks).
Ión metálico
disolvente % MLs Ks a
Tampón/CH3OH (1/1)
50 15,9
Cu(II)
Tampón/dioxano (1/1) 45 15,7
Tampón/DMSO (2/8)
55 16,1
Tampón/CH3OH (1/1)
30 13,0
Zn(II)
Tampón/dioxano (2/8) 33 13,1
Tampón/DMSO (2/8)
35 13,1
CH3OH
40 13,3
Se indica el porcentaje de la especie CuLs en el equilibrio.
20 a) según la ecuación 7.
Capacidad de los compuestos para aumentar la solubilidad de las proteínas implicadas en las enfermedades neurodegenerativas:
25 En el cerebro de personas que padecen la enfermedad de Alzheimer, las placas amiloides contienen principalmente un péptido (Aβ) que comprende 39-43 aminoácidos. Está producido por la digestión de la proteína precursora amiloide (APP) por las β-y γ-secretasas. Los péptidos Aβ1-40 y Aβ1-42 son los más numerosos. La patogénesis está relacionada con su acumulación y más particularmente con la de Aβ1-42, que es la más amiloidogénica y cuya producción está amplificada por las mutaciones que inducen la enfermedad de Alzheimer o por los factores de riesgo
30 de esta enfermedad (M. P. Mattson, Nature, 2004, 430, 631-639; M. Citron, Nature Rev. Neurosci. 2004, 5, 677-685).
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Reactivos para los experimentos realizados en presencia del péptido amiloide Aβ1-42:
Antes de la utilización, el agua [calidad MilliQ (Millipore] y todas las soluciones tampones se trataron sobre resina Chelex-100 (Biorad) (5 mg/ml) y se filtraron a través de los filtros 0,2 µm (Whatman) para quitar eventuales trazas de iones metálicos o de partículas.
CuCl2, ZnCl2 o FeCl3, de calidad puriss p.a. provienen de Fluka.
El péptido β-amiloide Aβ1-42 (Aβ1-42) se sintetizó, purificó (hasta una pureza superior al 95%) y se caracterizó por análisis sobre HPLC y por espectrometría de masa MALDI-TOF. Las soluciones de trabajo del péptido se prepararon solubilizando 1 mg de péptido liofilizado en 500 µl de agua y 500 µl de una solución acuosa de NaOH pH = 12,0; bajo agitación en un Thermomixer Comfort (Eppendorf). Las preparaciones de péptido se centrifugan después durante 10 minutos a 9000 rpm y el sobrenadante se utiliza como solución "stock de Aβ". La concentración en péptido del "stock de Aβ" se determina inmediatamente por ensayo colorimétrico con un kit Micro BCA Protein Assays (Pierce) a partir de series estándares realizadas con unas cantidades conocidas de albúmina de suero bovino (BSA) y después se divide en alícuotas la solución de péptido Aβ1-42 y se congela rápidamente en el nitrógeno líquido antes de ser conservada a -20 °C hasta su utilización.
Los ligandos se utilizan en forma de clorhidratos, salvo en el caso de 1 y 16, que son utilizados en su forma clorhidrato obtenida durante la síntesis, respectivamente 2,2'-metanodiil-bis(8-hidroxi-2-quinoleinio) dicloruro dihidrato y 2,2'-(metanodiil)-bis(7-metiloxi-8-hidroxi-2-quinoleinio) dicloruro. Las sales son generadas por adición de un equivalente de ácido clorhídrico por equivalente de función nitrogenada del ligando disuelto en DMSO. Después de la evaporación del disolvente, estas sales son disueltas a la concentración deseada con DMSO y conservadas a 20°C hasta su utilización.
Análisis de la precipitación de Aβ1-42 en función de la relación Cu(II)/péptido: El protocolo se estableció a partir de los trabajos de: C. S. Atwood et al., J. Neurochem. 2000, 75, 1219-1233. Se indican las concentraciones finales. Se fija Aβ1-42 (5 µM, 500 µl) para ser agregado en un tampón Tris·HCl 20 mM; NaCl 150 mM (pH = 7,4) durante 2 horas a 37°C bajo agitación a 1400 rpm en presencia de dife rentes estequiometrías de CuCl2 disuelto en DMSO (50 µl). Las muestras (volumen final = 550 µl) se centrifugan después durante 20 minutos a 9000 rpm y se extraen 500 µl de sobrenadante. El tubo que contiene el residuo de precipitación recibe entonces 450 µl de mezcla tampón del experimento/DMSO (91/9, v/v). Después, se determina la concentración en proteína sobre el sobrenadante y el residuo mediante Micro BCA Protein Assays (Pierce): cada muestra recibe un volumen de revelador y se incuba durante 1 hora a 60ºC bajo agitación a 1400 rpm, y después se mide la absorbencia a 562 nm. Las cuantificaciones se realizan a partir de series estándares de BSA. Las cantidades de Aβ1-42 realmente contenidas en el residuo y el sobrenadante se obtienen después de una corrección debido a la presencia de una parte residual de sobrenadante (50/550 µl) en la fracción que contiene el residuo. Para todos los experimentos, el resultado de la adición del porcentaje de Aβ1-42 en el sobrenadante con el porcentaje de Aβ1-42 en el residuo, da unos valores próximos del 100%.
El ión Cu(II) se conoce por inducir el máximo de péptido-Aβ agregado insoluble (C. S. Atwood et al., J. Biol. Chem. 1998, 273, 12817-12826). Se determinó en primer lugar la relación Cu(II)/péptido que induce el máximo de agregación en las condiciones experimentales utilizadas. La figura 9 resume los resultados obtenidos. Sin adición de Cu(II), se precipita el 47% de Aβ1-42. La agregación aumenta cuando la relación Cu(II)/Aβ1-42 aumenta hasta 2,5 Cu(II) por Aβ1-42 y después se estabiliza (82% de péptido agregado).
Inhibición de la precipitación de Aβ1-42 por adición de ligando:
Se estableció el protocolo a partir de los trabajos de: C. S. Atwood et al., J. Neurochem. 2000, 75, 1219-1233. Se indican las concentraciones finales. Se fijan 500 µl de Aβ1-42(5 µM) para ser agregados en un tampón Tris·HCl 20 mM; NaCl 150 mM (pH = 7,4) durante 1 hora a 37°C ba jo agitación a 1400 rpm en ausencia o en presencia de iones metálicos: CuCl2, ZnCl2 o FeCl3 (20 µM). Se añaden entonces 50 µl del ligando a ensayar (200 µM) disuelto en DMSO, y las muestras se incuban durante 1 hora más a 37°C bajo agitación a 1400 rpm. Las muestras sin l igando reciben también 50 µl de DMSO. Las muestras (volumen final = 550 µl) se centrifugan después durante 20 minutos a 9000 rpm y se extraen 500 µl de sobrenadante. El tubo que contiene el residuo de precipitación recibe entonces 450 µL de mezcla tampón de experimento/DMSO (91/9, v/v). Después, se determina la concentración en proteína sobre el sobrenadante y el residuo por Micro BCA Protein Assays (Pierce): cada muestra recibe un volumen de revelador y se incuba durante 1 hora a 60°C bajo agitación a 14 00 rpm y después se mide la absorbencia a 562 nm. Las cuantificaciones son realizadas a partir de series estándares de BSA. Las cantidades de Aβ1-42 realmente contenidas en el residuo y el sobrenadante se obtienen después de una corrección debido a la presencia de una parte residual del sobrenadante en la fracción que contiene el residuo. En el caso de 1, 2, 6, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 23, de 8hidroxiquinaldina y 8-aminoquinolina, que presentan una absorción a 562 nm en las condiciones de ensayo, se realizan unos blancos en presencia del ligando ensayado y del ión metálico estudiado. Para todos los experimentos, el resultado de la adición del porcentaje de Aβ1-42 en el sobrenadante con el porcentaje de Aβ1-42 en el residuo da unos valores próximos al 100%.
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Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 5. Muestran la capacidad de los compuestos estudiados para aumentar la solubilidad de Aβ1-42 en presencia de iones metálicos e incluso, en particular, para 1, 2, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 23 y 24, en ausencia de estos iones.
5 Un ensayo suplementario (no representado) ha puesto en evidencia que en presencia de CuCl2 el porcentaje de precipitación máximo del péptido se alcanzaba después de una hora de incubación. Por lo tanto, se puede proponer que al menos en el caso de la agregación del péptido en presencia de CuCl2, los ligandos (que son añadidos sólo después de 1 hora de incubación) no sólo impiden la agregación del péptido, sino que pueden probablemente actuar sobre unos agregados previamente formados.
10 Tabla 5: análisis de la solubilización por los diferentes ligandos de Aβ1-42 agregado en ausencia o en presencia de iones metálicos.
Sin metal % soluble Aβ
CuCl2 % Aβ soluble ZnCl2 % Aβ soluble FeCl3 % Aβ soluble
Aβ solo
55 ± 4 18 ± 2 29 ± 3 47
1
63 ± 4 60 ± 5 63 61
2
66 45 ± 5 57 58
3
56 47 ± 3 59 60
4
55 30 49 45
5
60 51 ±1 50 52
6
56 58 ± 3 54 51
7
59 35 60 40
8
59 36 58 41
9
36 19 47 38
10
52 42 43 43
11
48 48 45 43
12
69 69 ± 2 52 59
13
71 ± 2 55 ± 3 57 66
14
79 ± 3 45 ± 3 57 51
15
72 35 23 42
16
53 48 ± 3 50 44 ± 6
17
63 ± 3 38 ± 4 42 ± 4 38
18
66 46 ± 3 62 ± 5 49
23
73 60 ± 4 58 ± 4 62
24
64 21 21 38
8-hidroxiquinolina
85 70 ± 3 88 80
8-hidroxiquinaldina
69 52 62 51
Clioquinol
63 55 ± 3 37 51
8-aminoquinolina
66 ± 3 40 67 58
EDTA
41 65 - -
15 Se incuba Aβ1-42 (5 µM) durante 1 hora a 37°C en un tampón 20 mMTri s·HCl (pH = 7,4), 150 mM NaCl en presencia
o en ausencia de 20 µM de sal metálica (CuCl2, ZnCl2 o FeCl3) después 1 hora más en presencia de 200 µM de ligando y después se centrifugan las mezclas de reacciones. Las cantidades de Aβ1-42 soluble y precipitado se determinan en el sobrenadante y el precipitado, respectivamente con la ayuda de un kit Micro BCA Protein Assays.
20 Se han realizado también unos experimentos para Aβ1-42 (5 µM), CuCl2 (12,5 µM) y el ligando (12,5 µM) a fin de analizar el efecto, sobre la reacción de agregación, de una estequiometría mínima (1/1) en ligando con respecto al ión metálico para una concentración en este ión que conlleva un máximo de precipitación del péptido Aβ1-42. Para todos los experimentos, el resultado de la adición del porcentaje de Aβ1-42 en el sobrenadante con el porcentaje de Aβ1-42 en el residuo da unos valores próximos al 100%.
25 Los resultados obtenidos se resumen en la figura 10.
Se seleccionó una estequiometría de 2,5 equivalentes de Cu(II) por péptido, ya que es el valor mínimo que induce el máximo de agregación en las condiciones experimentales empleadas (figura 9). Para los experimentos de control
30 con unos derivados que comprenden un solo residuo quinolina, se han añadido 5 equivalentes de ligando, ya que los complejos de tipo L2Cu son clásicamente invocados en estos casos.
La figura 10 resume los resultados observados comparándolos con los de los experimentos anteriores. Se hace destacar que la actividad de 1, 3, 5, 6, 11 y 18 es estadísticamente idéntica si se consideran los valores con una 35 desviación típica ≤ 5%, sean cuales sean las condiciones empleadas, mientas que la de sus análogos, que
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comprenden un solo residuo de quinolina (8-hidroxiquinolina, clioquinol y 8-hidroxiquinaldina), disminuye cuando el exceso con respecto al péptido o a Cu(II) disminuye. Para estas dos condiciones experimentales, los valores están también cerca de 13 y 14. En estas dos condiciones experimentales, 23 es tambén más activo que su análogo, que comprende un solo residuo de quinolina (8-aminoquinolina).
Capacidad de los compuestos para disminuir el estrés oxidativo:
Se ha propuesto que las interacciones de Aβ con los iones Fe y Cu puedan contribuir a la creación de las lesiones observadas en los cerebros que padecen la enfermedad de Alzheimer. Los péptidos Aβ sintéticos ejercen una toxicidad que correlaciona con una producción de peróxido de hidrógeno (H2O2) a partir de O2 por medio de un mecanismo de oxidorreducción a nivel del ión metálico (M. P. Mattson, Nature 2004, 430, 631-639).
Ensayo del peróxido de hidrógeno producido por Aβ1-42 en presencia de CuCl2, de reductor, de aire y de ligando: El protocolo se ha establecido a partir de los trabajos de: X. Huang et al., J. Biol. Chem. 1999, 274, 37111-37116; X. Huang et al., Biochemistry 1999, 38, 7609-7616; C. Opazo et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 40302-40308; K. J. Barnham et al., J. Biol. Chem. 2003, 278, 42959-42965; G. D. Ciccotosto et al., J. Biol. Chem. 2004, 279, 4252842534.
Se indican las concentraciones finales. Las reacciones se han realizado en la oscuridad en un tampón fosfato de sodio, 50 mM (pH = 7,4). Aβ1-42 (0,2 µM) y CuCl2 (0,4 µM) son preincubados durante 1 hora a 37°C ba jo agitación a 1400 rpm en 375 µl de tampón. Después, se añaden 2 µl de una solución del ligando a estudiar (0,2; 0,4 o 0,8 µM) en DMSO. Después de la incubación durante una hora suplementaria, se añaden 2 µl de una solución de ascorbato de sodio (10 µM) y la incubación se continúa durante 5 minutos, aún bajo agitación. La cantidad de H2O2 producida se cuantifica entonces con la ayuda de un kit Amplex Red H2O2/HRP Assay Kit (Molecular Probes) añadiendo un volumen de reactivo de ensayo sobre las muestras, y después incubándolas durante 1 hora a 37°C bajo a gitación a 500 rpm. Las detecciones de H2O2 se realizan entonces espectro-fotométricamente a 563 nm. Las cuantificaciones se realizan a partir de curvas estándares obtenidas con cantidades conocidas de H2O2. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 6 y en la figura 11.
Se realizaron tambkén unos experimentos en presencia de una cantidad conocida de H2O2, añadida justo antes o justo después de la adición de ascorbato de sodio, a fin de estudiar la estabilidad de H2O2 en las condiciones experimentales utilizadas. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 7.
Se han realizado otros experimentos en presencia de diferentes concentraciones de péptido Aβ1-42 (0,2 a 0,53 µM) y CuCl2 (0,4 µM), con o sin adición de ligando (0,4 µM) y de cantidades conocidas de H2O2, a fin de estudiar la influencia de la estequiometría Aβ1-42/Cu sobre la producción de H2O2 por los sistemas estudiados. Los resultados obtenidos se resumen en la figura 11.
El péptido Aβ puede quelar diferentes estequiometrías de Cu(II) y formar así diferentes tipos de complejos. Todas estas especies pueden tener diferentes capacidades para producir H2O2 en presencia de dioxígeno y de reductor. La valoración de la cantidad de H2O2 producida por 0,4 µM de Cu(II) en función de la concentración de Aβ1-42 hace aparecer este fenómeno (figura 11). La cantidad de H2O2 producido aumenta cuando la relación Cu/Aβ1-42 aumenta. Se han realizado los mismos experimentos en presencia de 1 equivalente de ligando 3 o 7 por Cu(II). Los dos compuestos inhiben prácticamente toda la producción de H2O2, sea cual sea la relación Cu/ Aβ1-42 ensayada.
La tabla 6 muestra que los diferentes derivados de quinolina ensayados inhiben la producción de H2O2, sean cuales sean las condiciones experimentales utilizadas.
Tabla 6: Comparación de la inhibición por los diferentes ligandos (0,4 µM) de la producción de H2O2 realizada por Aβ1-42 (0,2 y 0,5 µM) en presencia de CuCl2 (0,4 µM), de ascorbato (10 µM) y de aire.
Ligando 1 eq/Cu(II) (cuando no se precisa)
Sin Aβ1-42 0,2 µM Aβ1-42 Cu/Aβ = 2 0,5 µM Aβ1-42 Cu/Aβ = 0,75
Sin ligando
2,91 ± 0,22 2,83 ± 0,19 1,08
1
0,54 0,75 ± 0,11 0,76
2
0,56 0,80 ± 0,23 0,61
3 0,5 eq/Cu(II) 1 eq/Cu(II) 1,5 eq/Cu(II)
2,12 0,84 - 0,94 0,71 ± 0,02 0,49 -0,55 -
4
0,12 0,37 ± 0,09 0,35
5
0,39 0,55 ± 0,08 -
6
0,82 0,86 ± 0,11 -
7
0,75 0,89 ± 0,07 0,68
8
0,66 0,89 ± 0,09 0,64
9
0,66 0,82 ± 0,08 0,82
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Ligando 1 eq/Cu(II) (cuando no se precisa)
Sin Aβ1-42 0,2 µM Aβ1-42 Cu/Aβ = 2 0,5 µM Aβ1-42 Cu/Aβ = 0,75
12
0,40 0,47 ± 0,09 -
13
0,89 2,10 0,70
14
0,74 1,99 0,78
15
- 1,02 -
16
- 0,70 -
17
- 0,69 -
18
0,47 0,47 0,45
23
0,65 0,69 0,49
24
0,49 0,62 0,47
8-hidroxiquinolina 1 ec/Cu(II) 2 ec/Cu(II)
2,02 0,62 0,69 0,71 ± 0,05 0,75 0,62
Clioquinol 1 ec/Cu(II) 2 ec/Cu(II)
2,07 0,54 0,89 ± 0,08 0,78 ± 0,06 0,64 0,57
Sin ligando y sin Cu(II)
0,49 ± 0,19 0,69 0,51
Sin ligando, sin ascorbato y sin Cu(II)
0 0,06 -
Las cifras de la tabla corresponden a la cantidad de H2O2 (expresada en nanomoles) añadida con la ayuda de un kit Amplex Red H2O2/HRP Assay.
5 En un experimento de control, realizado únicamente con el ligando sin péptido amiloide β1-42 y sin Cu, la determinación de la producción de H2O2 debida a las trazas metálicas presentes en el medio de estudio es aún inferior a 0,49 ± 19 nanomoles de H2O2.
La tabla 7 muestra que, en las condiciones experimentales utilizadas, los ligandos pueden ser divididos en dos
10 categorías: (i) los que inhiben la producción de H2O2 pero que no lo degradan (se vuelve a encontrar toda la cantidad de H2O2 añadida); (ii) aquellos para los cuales la disminución de H2O2 está asociada a su degradación (como en el caso de 12, en el que no se encuentra toda la cantidad de H2O2 añadida).
Tabla 7: Análisis de la estabilidad de H2O2 durante los experimentos de inhibición por los ligandos de la producción 15 de H2O2 realizada por Aβ1-42 (0,2 o 0,4 µM) en presencia de CuCl2 (0,4 µM), de ascorbato (10 µM) y de aire.
Aβ1-42 0,2 µM a 0,075 nanomoles
Cu(II) 0,4 µM 0,15 nanomoles ascorbato 10 µM 3,8 nanomoles Ligando 0,4 µM a 0,15 nanomoles H2O2 añadido nanomoles H2O2 ensayado nanomoles
--
--
+ + -- -3,0 0,49 ± 0,19 3,2 (3,5)
---
+ + + + + + --- -1,5 1,5 b 2,91 ± 0,22 4,0 (4,4) 3,6 (4,4)
+ + +
+ + +
+ + +
--- -1,5 1,5 b 2,83 ± 0,19 4,2 (4,3) 4,2 (4,3)
0,4 µM 0,4 µM 0,4 µM
+ + + + + + --- -1,5 1,5 b 1,6 3,0 (3,1) 3,0 (3,1)
-
+ - 3 3,0 3,1
--
+ + + + 3 3 -3,0 0,84 3,8 (3,8)
+ + +
+ + +
+ + +
3 3 3 -3,0 3,0 b 0,71 ± 0,02 3,7 (3,7) 3,8 (3,7)
+ +
+ +
+ +
4 4 -3,0 0,37 ± 0,09 3,3 (3,4)
+ +
+ +
+ +
5 5 -3,0 0,55 ± 0,08 3,4 (3,5)
+ +
+ +
+ +
6 6 -3,0 0,87 ± 0,11 3,6 (3,9)
+ +
+ +
+ +
12 12 -3,0 0,47 ± 0,09 1,7(3,4)
E06794293
03-12-2014
Aβ1-42 0,2 µM a 0,075 nanomoles
Cu(II) 0,4 µM 0,15 nanomoles ascorbato 10 µM 3,8 nanomoles Ligando 0,4 µM a 0,15 nanomoles H2O2 añadido nanomoles H2O2 ensayado nanomoles
+ +
+ +
+ +
14 14 -3,0 b 1,99 ± 0,11 4,9 (5,0)
--
+ + + + 18 18 -3,0 b 0,47 3,5 (3,5)
El análisis se obtiene comparando los resultados obtenidos con o sin adición de una cantidad conocida de H2O2 en el medio de reacción justo después de la adición de ascorbato si no se precisa por b). El valor teórico en H2O2, si no hay degradación, se indica entre paréntesis. Corresponde a la adición del número de nanomoles de H2O2 añadidos a
5 los producidos en una reacción realizada en las mismas condiciones experimentales pero sin adición de H2O2. El H2O2 se ensaya con la ayuda de un kit AmplexRed H2O2/HRP Assay.
a) Cuando no se precisa
10 b) H2O2 añadido justo antes del ascorbato.
Modulación de la hidrofobicidad:
Determinación de los log D7,4: El método se adapta de Z.-P Zhuang et al., J. Med. Chem., 2001, 44, 1905-1914. El
15 ligando (2,0 mg) se disuelve en 2 ml de 1-octanol y después se añaden 2 ml de tampón Tris·HCl 20 mM, pH = 7,4; NaCl 150 mM. Después de mezclar en vórtex durante 3 minutos a temperatura ambiente seguido de una centrifugación durante 5 minutos a 9000 rpm, la concentración del ligando en cada fase se determina por espectrofotometría UV-visible. Las fracciones 1-octanol se distribuyen así hasta que se obtengan unos valores reproducibles de coeficiente de partición. Este coeficiente se expresa como el logaritmo decimal de [(la
20 concentración de ligando contenido en la fase 1-octanol)/(la concentración de ligando contenido en la fase acuosa tamponada)] = log D7,4. Se realizaron las mediciones tres veces.
La tabla 8 resume los resultados obtenidos.
25 El valor de log D7,4 refleja la hidrofobicidad y por lo tanto la lipofilicidad de los compuestos, que es uno de los parámetros empleados (con otros, tales como el peso molecular) para estimar las posibilidades de biodistribución de las moléculas (H. van de Waterbeemd et al.,Nature Rev. Drug Discovery 2003, 2, 192-204).
Para unas sustituciones idénticas de macrociclos aromáticos, los derivados que comprenden un solo residuo
30 quinolina son más hidrófilos que los que comprenden varios. La hidrofobicidad puede ser modulada por la longitud del brazo de unión entre los residuos quinolina (comparar 7 y 10), por la naturaleza de dicho brazo (comparar 7 y 18) y por la sustitución de los hidrógenos de los anillos (comparar respectivamente: 1 y 2; 3 y 4; 7, 8, 9 y 17) o unos brazos de unión (comparar 1, 3, 5 y 6) por diferentes grupos.
35 Tabla 8: Valor del logaritmo decimal del coeficiente de partición de los ligandos entre un 1-octanol (fase hidrófoba) y un tampón Tris·HCl 20 mM; NaCl 150 mM (pH = 7,4) (fase hidrófila) (1/1, v/v).
Ligando
PM log D 7,4
1
301 3,3 ± 0,1
2
370 3,5 ± 0,1
3
330 4,4 ± 0,1
4
398 4,9 ± 0,1
5
338 3,8 ± 0,1
6
316 3,9 ± 0,1
7
316 3,5 ± 0,1
8
384 4,2 ± 0,1
9
636 5,6 ± 0,5
10
344 3,8 ± 0,1
11
474 3,7 ± 0,1
12
271 3,5 ± 0,1
13
328 2,7 ± 0,1
14
342 1,8 ± 0,1
15
272 2,0 ± 0,1
17
376 3,5 ± 0,1
18
331 3,0 ± 0,1
23
357 2,5 ± 0,1
24
299 2,6 ± 0,1
8-hidroxiquinolina
145 2,1 ± 0,1
5
10
15
20
25
30
35
40
45 E06794293
03-12-2014
8-hidroxiquinaldina
159 2,4 ± 0,1
Clioquinol
305 3,8 ± 0,1
8-aminoquinolina
144 1,9 ± 0,1
Análisis de la genotoxicidad potencial:
Ensayo de AMES: El método se adapta de D.M. Maron y B. N. Ames, Mutat. Res. 1983, 113, 173-215; D. E. Levin et al., Mutat. Res. 1982, 94, 315-330; D. E. Levin et al. Proc. Natl. USA 1982, 79, 7445-7449.
Se han utilizado dos líneas de ensayo (TA98 y TA100) de Salmonella tiphimurium mutante (His) por su deficiencia para sintetizar la histidina y la confirmación de las características de estas líneas por unos ensayos de marcadores genéticos. El ensayo consiste en la evaluación del potencial de las moléculas ensayadas para inducir una mutación inversa en el locus histidina de estas líneas. Estas dos líneas han sido proporcionadas por el Dr. Bruce N. Ames (University of California, Berkeley, USA). Son resistentes a la Ampicillina y sensibles a la Tetraciclina. No son mutantes para rfa, UvyB y UvyA. La línea TA98 (his D3052) contiene una mutación de la fase de lectura (GC) mientras que la línea TA100 (his G46) contiene una sustitución de par de base (GC). El número de reversión espontánea es de 37 ± 6 et 166 ± 15 colonias por placas para TA98 y TA100, respectivamente.
Los compuestos a ensayar se disolvieron en el 100% de DMSO (el disolvente) y se diluyeron logarítmicamente (de un factor 10) para obtener 4 concentraciones de ensayo de 30 000; 3 000; 300 y 30 µg/ml. Cada serie de 0,1 ml de solución stock a ensayar, 0,1 ml de línea ensayo y de medio de cultivo con o sin 0,5 ml de homogeneizado enzimático (S9) de microsoma de hígado de rata se han mezclado con 2 ml de agarosa fundida (que contiene 0,5 mM de histidina y 0,5 mM de biotina). Esta mezcla se ha depositado en la superficie de una placa de medio agarosa glucosa mínima (30 ml para cada caja de Petri) a fin de obtener unas concentraciones finales en compuesto a ensayar de 3 000; 300; 30 y 3 µg/placa. Las placas se incubaron entonces a 37°C durante 48 horas. Los cultivos se trataron o no en presencia de una activación metabólica exógena por la adición de 0,5 ml de mezcla S9 que contiene 8 mM MgCl2, 33 mM KCI, 4 mM NADP, 5 mM glucosa-6-fosfato, 100 mM NaH2PO4 (pH = 7,4) y 4% (v/v) de homogeneizado enzimático de microsoma de hígado de rata inducido por Acrolor 1254 (S9). Las colonias revertientes de las líneas ensayo se contaron con un contador de colonias (Sigma). Los resultados se consideraron como significativos únicamente si los valores obtenidos para el disolvente solo y unos compuestos de referencia estaban en un intervalo anteriormente establecido. Un número de colonias ≥ 3 veces al número de colonias observado para el disolvente solo se considera como mutágeno de manera significativa. Un compuesto que induce un número de colonia < 50% que las obtenidas para el disolvente solo se ha considerado como tóxico para las bacterias ensayadas. Todos los ensayos se han realizado en triplicado.
La obtención de resultados esperados con estas líneas para 4-NPD, la azida de sodio, 2-Antramina y 2-Aminofluoreno ha permitido confirmar la buena calidad del estudio.
Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 9.
Tabla 9: Resultados del ensayo de Ames de mutagenicidad de Salmonella sobre las cepas TA98 y TA100 de salmonella en ausencia o en presencia de homogeneizado enzimático (S9) de microsoma de hígado de rata.
Compuesto (Valor por placa)
Adición de S9 TA98 TA100
Efecto mutágeno
Citotoxicidad Efecto mutágeno Citotoxicidad
DMSO (disolvente)
No > 100 µl > 100 µl > 100 µl > 100 µl
sí
> 100 µl > 100 µl > 100 µl > 100 µl
Clioquinol
No - 300 µg - 30 µg
sí
- 300 µg - 30 µg
3
No > 3000 µg > 3000 µg > 3000 µg > 3000 µg
sí
> 3000 µg > 3000 µg > 3000 µg > 3000 µg
5
No > 3000 µg > 3000 µg - 300 µg
sí
> 3000 µg > 3000 µg > 3000 µg > 3000 µg
12
No > 3000 µg > 3000 µg > 3000 µg > 3000 µg
sí
> 3000 µg > 3000 µg > 3000 µg > 3000 µg
Se observa un efecto bactericida del Clioquinol sobre las dos líneas. No se ha observado ningún efecto mutágeno para los compuestos poliquinolina ensayados, incluso para las dosis más altas estudiadas. No se ha observado ningún efecto bactericida para estos compuestos, incluso para las dosis más fuertes ensayadas, con la excepción del compuesto 5 a partir de 300 µg/placa, sobre la línea TA100 en ausencia de S9.

Claims (7)

  1. E06794293
    03-12-2014
    REIVINDICACIONES
    1. Compuesto de fórmula (I):
    imagen1
    5
    tales como en la fórmula (I)
    X representa un grupo -NRR', y
    10
    Y representa un grupo de fórmula:
    imagen2
    en la que X' representa un grupo -NRR', y 15 Z representa un grupo -NR''
    donde R'' = alquilo eventualmente sustituido por uno o varios grupos seleccionados de entre OR, NRR';
    20 y
    R representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo;
    R' = H o alquilo;
    25 R1, R2, R3, R4, R5, R1', R2', R3', R4', R5', idénticos o diferentes, representan independientemente un átomo seleccionado de entre H o halógeno,
    k representa 1;
    30 así como sus esteroisómeros o sus mezclas, sus formas tautómeras, sus hidratos, solvatos, sus sales, formas libres y ésteres farmacéuticamente aceptables.
  2. 2. Compuesto según la reivindicación 1, seleccionado de entre:
    35 N-Butil-2,2'-imino-bis(8-quinolinamina)
    así como sus esteroisómeros o sus mezclas, sus formas tautómeras, sus hidratos, solvatos, sus sales, formas libres y ésteres farmacéuticamente aceptables. 40
  3. 3. Composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I)
    imagen3
    29 E06794293
    03-12-2014
    tal como se define en la reivindicación 1 o 2.
  4. 4. Utilización de un compuesto de fórmula (I) tal como se define en la reivindicación 1 o 2, para la preparación de un
    5 medicamento destinado a prevenir y/o a tratar enfermedades que afectan al sistema nervioso central, tales como enfermedades neurodegenerativas.
  5. 5. Utilización según la reivindicación 4, tal que las enfermedades neurodegenerativas se seleccionan de entre la
    enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral 10 amiotrófica o la trisomía 21, las encefalopatías espongiformes, tal como la enfermedad de Kreutzfeld-Jacob.
  6. 6. Utilización de un compuesto tal como se define según la reivindicación 1 o 2, para la preparación de un medicamento destinado a quelar los iones metálicos y/o a disolver los agregados amiloides.
    15 7. Utilización según la reivindicación 6, tal que dichos metales se seleccionan de entre el cobre y/o el hierro.
  7. 8. Procedimiento de preparación de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende la etapa de acoplamiento de los compuestos de fórmula (VVII) y (VVII'):
    imagen4
    en las que Hal y Hal' son unos átomos de halógeno en presencia de un grupo de fórmula -RNH2 eventualmente seguido de derivatización(es) del producto de fórmula (I) obtenido para obtener el producto de fórmula (I) deseado y/o de la etapa de aislamiento del producto final obtenido.
    30
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