ES2525448T3 - Péptidos derivados de FVIII y su uso en la inducción de tolerancia en pacientes hemofílicos - Google Patents

Abstract

Péptido que consiste en la secuencia EDNIMVTFRNQASR

Description

Péptidos derivados de FVIII y su uso en la inducción de tolerancia en pacientes hemofílicos

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a un péptido. En particular, se refiere a un péptido que puede derivarse del factor VIII (FVIII). Los péptidos pueden usarse para reducir o prevenir la formación de anticuerpos inhibidores contra el factor VIII, por ejemplo en el tratamiento de hemofilia A y hemofilia adquirida.

Antecedentes de la invención

Hemofilia

15 La hemofilia pertenece a un grupo de trastornos sanguíneos hereditarios que incluye hemofilia A, hemofilia B (enfermedad de Christmas) y enfermedad de Von Willebrand.

En la hemofilia, la capacidad de la sangre para coagularse se ve gravemente reducida debido a que falta parcial o completamente un factor de coagulación esencial, dando como resultado un aumento del tiempo de hemorragia. La hemofilia A es una deficiencia del factor de coagulación VIII, mientras que la hemofilia B es una deficiencia del factor de coagulación IX. En ambas enfermedades, el gen defectuoso se encuentra en el cromosoma X, de modo que los estados están ligados al cromosoma X. La hemofilia A es cinco veces más común que la hemofilia B.

La hemofilia es un estado genético hereditario que dura toda la vida, que afecta a mujeres como portadoras y a

25 hombres que heredan el estado. Aproximadamente una tercera parte de los nuevos diagnósticos son en casos en los que no hay una historia familiar previa. Aparece en todo el mundo y se produce en todos los grupos raciales. Aproximadamente 6.000 personas están afectadas con hemofilia en el R.U.

Los pacientes hemofílicos presentan hemorragia durante un periodo prolongado tras una lesión. Las lesiones externas tales como cortes y rasguños no plantean habitualmente problemas graves: a menudo es posible detener la hemorragia aplicando cierto grado de presión y cubriendo la zona afectada (por ejemplo, con un apósito).

El principal problema es la hemorragia interna en articulaciones, músculos y tejidos blandos, que puede producirse espontáneamente. La hemorragia interna, tales como hemorragias en el cerebro, es muy difícil de manejar y puede

35 ser mortal. La hemorragia repetida en las articulaciones produce dolor agudo y puede producir artritis y/o daño articular a largo plazo que conduce a incapacidad.

El tratamiento para la hemofilia es habitualmente mediante sustitución del factor de coagulación que falta. En hemofilia leve o moderada, pueden administrarse inyecciones en el momento en que se produce una hemorragia (terapia a demanda). Sin embargo, en hemofilia grave, se administran inyecciones profilácticas regulares para ayudar a que se coagule la sangre y minimizar la probabilidad de daño articular a largo plazo.

Una complicación potencialmente grave de la terapia de sustitución de factores de coagulación para la hemofilia A es el desarrollo de anticuerpos que neutralizan la función procoagulante del factor VIII. Los inhibidores del factor VIII

45 se producen en aproximadamente el 25% de los pacientes con hemofilia A grave. Puesto que los pacientes con hemofilia A congénita pueden ser genéticamente deficientes en FVIII, la síntesis de inhibidores es una respuesta aloinmunitaria frente a la proteína foránea administrada para prevenir o tratar episodios hemorrágicos.

Las células T CD4+ desempeñan un papel fundamental en la respuesta inmunitaria frente a FVIII. Tras captarse por células presentadoras de antígeno (CPA), FVIII experimenta degradación proteolítica para dar fragmentos peptídicos (Reding et al (2006) Haemophilia 12(sup. 6) 30-36). Estos péptidos se presentan entonces en la superficie de la CPA en asociación con moléculas de CMH de clase II. Este complejo lo reconoce entonces el receptor de células T de una célula CD4+ específica para FVIII. En presencia de las señales coestimuladoras apropiadas, este reconocimiento provoca en última instancia que la célula CD4+ dirija la síntesis de anticuerpos por células B.

55 La incidencia de formación de inhibidores aumenta inicialmente con el número de tratamientos con factor VIII, pero parece alcanzar una meseta tras 50-100 días de exposición. La formación de inhibidores es mucho más común en hemofilia grave que en la enfermedad moderada o leve y algunos defectos moleculares, lo más claramente grandes deleciones y mutaciones sin sentido en la cadena ligera del factor VIII, parecen predisponer a la formación de inhibidores. Parámetros tales como la concentración, el tipo (purificado o recombinante) del factor de sustitución, y el historial de tratamientos también pueden afectar a la probabilidad de producción de anticuerpos.

El manejo de pacientes con hemofilia con inhibidores es un reto continuo. La inducción de tolerancia inmunitaria (ITI) usando una técnica de desensibilización es satisfactoria en algunos pacientes con aloanticuerpos contra el factor

65 VIII. Este enfoque terapéutico requiere la exposición continua a la terapia de sustitución de factor, de modo que es una estrategia a largo plazo.

Aunque la ITI puede ser satisfactoria, una proporción significativa (aproximadamente el 30%) de los pacientes no responde a la ITI. Es mucho menos probable que los pacientes con altos títulos de inhibidor respondan al tratamiento. Otro factor contribuyente significativo es la edad al inicio cuando se comienza la ITI, con tasas de éxito

5 enormemente disminuidas cuando el paciente tiene más de 20 años (Hay et al (2005) Seminars in Thrombosis and Hemostasis 32:15-21).

Cuando la terapia con ITI es insatisfactoria, el inhibidor persiste generalmente durante toda la vida, y debido a que tales pacientes son habitualmente pacientes de alta respuesta, es necesario tratar episodios de hemorragia con productos de desvío de FVIII, tales como concentrados de complejo de protrombina activada (FEIBA™) y FVII activado recombinante. Sin embargo, el uso de tales agentes está asociado con acontecimientos adversos tales como coagulación intravascular diseminada, infarto agudo de miocardio, émbolo pulmonar y trombosis (Acharya y DiMichele (2006) Best Practice & Research Clinical Haematology 19:51-66).

15 A veces se usa la terapia inmunosupresora para pacientes que no responden a ITI. El tratamiento incluye la administración de fármacos inmunosupresores tales como ciclofosfamida, prednisona, azatioprina y ciclosporina que seleccionan como diana de manera inespecífica el sistema inmunitario. Estos tratamientos pueden tener efectos secundarios asociados con la inmunosupresión general.

Existe un interés renovado en la reducción selectiva de células B usando Rituximab™, un anticuerpo monoclonal humanizado frente al antígeno CD20 de células B. Sin embargo, se han producido reacciones a la infusión, enfermedad del suero e infecciones oportunistas en algunos niños tratados con este fármaco (DiMichele (2007) J Thromb Haemost 5:143-50).

25 Hemofilia adquirida

La hemofilia adquirida es un raro estado autoinmunitario que afecta a entre 1 y 4 personas por millón. En este estado, los sujetos que no han nacido con hemofilia desarrollan anticuerpos contra uno de los factores de coagulación tales como el factor VIII. Se cree que el embarazo y enfermedades autoinmunitarias tales como artritis reumatoide y cáncer pueden aumentar el riesgo de desarrollar hemofilia adquirida. Aunque existen diferencias en los mecanismos inmunitarios subyacentes que conducen a su producción, las manifestaciones clínicas de los inhibidores de FVIII producidos en respuesta a la terapia de sustitución de factores de coagulación y los producidos en hemofilia adquirida son similares.

35 Los pacientes con hemofilia adquirida tienen una tasa de mortalidad que se aproxima al 25%, debido en parte a la asociación de inhibidores adquiridos con complicaciones de hemorragia graves. La terapia de inhibidores de autoanticuerpos adquiridos se basa principalmente en la necesidad de controlar o prevenir las complicaciones hemorrágicas agudas, que con frecuencia son potencialmente mortales y que ponen en peligro una extremidad y de manera secundaria erradicar el autoanticuerpo para restablecer la coagulación normal.

Algunas hemorragias asociadas con inhibidores de autoanticuerpo de bajo título (< 5 unidades Bethesda) pueden tratarse eficazmente con concentrados de FVIII administrados a altas dosis. El concentrado de FVIII porcino se consideró anteriormente como una terapia de primera línea crítica para la hemorragia relacionada con hemofilia adquirida puesto que era la única terapia de sustitución que proporcionaba una oportunidad para medir realmente

45 los niveles de actividad de coagulación de FVIII tras la infusión en el laboratorio. Se retiró el producto del mercado en 2004 debido a contaminación de los bancos de plasma porcino por parvovirus porcino. En la actualidad, los agentes de “desvío” son los usados más comúnmente, pero existen posibles riesgos de trombogenicidad y sólo existe una eficacia de aproximadamente el 80% para cada producto. El intercambio de plasma mediante plasmaféresis e inmunoadsorción extracorpórea puede ser necesario para reducir temporalmente el título de inhibidor lo suficiente como para que los agentes de desvío o la sustitución de FVIII proporcionen una hemostasia adecuada.

La erradicación de los inhibidores de autoanticuerpo depende de medidas inmunosupresoras, tales como: (1) administración de corticosteroides con una eficacia del 30%-50% en 3-6 semanas; (2) el uso de agentes

55 quimioterápicos citotóxicos y mielosupresores, por ejemplo, ciclofosfamida, ciclosporina, 2-clorodesoxiadenosina; (3) inmunomodulación con inmunoglobulina por vía intravenosa; y (4) reducción selectiva de linfocitos B con rituximab. Los pacientes que responden a Rituximab™ pueden requerir el uso concurrente de esteroides y las recaídas pueden responder al nuevo tratamiento.

El documento WO 02/060917 se refiere a péptidos del factor VIII aislados y purificados y a variantes de los mismos, así como a ADN que codifica para esos péptidos.

Por tanto, todos los métodos disponibles actualmente para reducir la producción de aloanticuerpos asociada con el tratamiento de la hemofilia A, y la producción de autoanticuerpos en la hemofilia adquirida, tienen inconvenientes.

65 Por tanto, existe la necesidad de métodos mejorados para abordar el asunto de los anticuerpos anti-FVIII en hemofilia A y hemofilia adquirida.

Los presentes inventores han encontrado que es posible prevenir la formación de anticuerpos inhibidores contra FVIII mediante la inducción previa de tolerancia en el paciente con péptidos derivados de FVIII.

5 Sumario de aspectos de la invención

El péptido del primer aspecto de la presente invención consiste en la secuencia:

EDNIMVTFRNQASR

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición, tal como una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de péptidos incluyendo un péptido del primer aspecto de la invención. La composición puede comprender una pluralidad de péptidos que pueden derivarse total o parcialmente de FVIII que pueden inducir o restaurar la tolerancia a FVIII.

15 La composición puede estar en forma de un kit, en el que la pluralidad de péptidos se proporcionan por separado para la administración separada, posterior, secuencial o simultánea.

El péptido o una composición de la invención puede ser para su uso en la supresión, la reducción o la prevención del desarrollo de anticuerpos inhibidores contra el factor VIII.

En el presente documento se describe el uso de un péptido o una composición de este tipo en la fabricación de un medicamento para suprimir, reducir o prevenir el desarrollo de anticuerpos inhibidores contra el factor VIII. En el presente documento también se describe un método para suprimir, prevenir o reducir el desarrollo de

25 anticuerpos inhibidores contra el factor VIII en un sujeto, que comprende la etapa de administración de un péptido o una composición de este tipo al sujeto.

El sujeto puede ser deficiente en FVIII. En particular, el sujeto puede tener hemofilia A, y puede estar sometiéndose,

o estar a punto de someterse, a terapia de sustitución de factor VIII.

Alternativamente el sujeto puede tener, o correr el riesgo de contraer, hemofilia adquirida.

Los inhibidores del factor VIII se encuentran más frecuentemente en individuos que expresan HLA-DR2. Por tanto el sujeto tratado mediante el método de la invención puede ser positivo para HLA-DR2.

35 Descripción de las figuras

Figura 1: Respuestas de memoria para células de ganglios linfáticos (CGL) de ratones FVIII+DR2+ a los que se les administró una dosis de refuerzo de rhFVIII/CFA

a) proliferación de CGL frente a péptidos de FVIII 1-6

b) proliferación de CGL frente a péptidos de FVIII 7-12

45 c) proliferación de CGL frente a péptidos de FVIII 1, 3 y 11

Figura 2: Ejemplos representativos de clones de hibridoma de células T FVIII+DR2+ específicos para péptidos derivados de FVIII

Figura 3: Respuestas de memoria para CGL de ratones FVIII-DR2+ a los que se les administró una dosis de refuerzo de rhFVIII/CFA

Figura 4: Ejemplos representativos de clones de hibridoma de células T FVIII-DR2+ específicos para péptidos derivados de FVIII

55 Figura 5: Clones FVIII-/-específicos para a) DNIMV y b) PRCLT

Figura 6: Respuestas de memoria para CGL frente a FVIII para ratones FVIII+DR2+ tratados 3 veces por vía i.p. con péptido antes de la administración de la dosis de refuerzo de rhFVIII/CFA.

Figura 7: Determinación de la gama de epítopos peptídicos que pueden funcionar como apítopos usando clones de hibridoma de células T FVIII-DR2+ específicos para péptidos solapantes derivados de FVIII. El péptido original se denomina 0. Un desplazamiento de un aminoácido hacia el extremo N-terminal es -1, desplazamientos de dos aminoácidos hacia el extremo N-terminal es -2 etc. Un desplazamiento hacia el extremo C-terminal es +1 etc.

65 Figura 8: Producción de IFN-gamma por células de ganglios linfáticos en respuesta a FVIII para ratones FVIII-DR2+

tratados con los péptidos derivados de FVIII PRCLT, DNIMV o una mezcla de ambos de estos dos.

Figura 9: Respuestas de ratones no tratados previamente o con tolerancia inducida estimulados con o bien EDNIMVTFRNQASR (EDNIMV) o bien un péptido de control (DNIMV). 5

Descripción detallada

Péptido

La presente invención se refiere a un péptido.

El término “péptido” se usa en el sentido normal para significar una serie de residuos, normalmente L-aminoácidos, conectados entre sí normalmente mediante enlaces peptídicos entre los grupos α-amino y carboxilo de aminoácidos adyacentes. El término incluye péptidos modificados y análogos peptídicos sintéticos.

15 El péptido de la presente invención puede prepararse usando métodos químicos (Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlín.). Por ejemplo, pueden sintetizarse péptidos mediante técnicas de fase sólida (Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204), escindirse de la resina y purificarse mediante cromatografía de líquidos de alta resolución preparativa (por ejemplo, Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, Nueva York NY). Puede lograrse la síntesis automatizada, por ejemplo, usando el sintetizador de péptidos ABI 43 1 A (Perkin Elmer) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

El péptido puede prepararse alternativamente mediante medios recombinantes o mediante escisión de péptido ta del

25 factor VIII seguido por la modificación de uno o de ambos extremos. La composición de un péptido puede confirmarse mediante análisis de aminoácidos o secuenciación (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman).

Para fines prácticos, existen otras diversas características que el péptido puede mostrar. Por ejemplo, es importante que el péptido sea lo suficientemente estable in vivo como para ser útil terapéuticamente. La semivida del péptido in vivo puede ser de al menos 10 minutos, 30 minutos, 4 horas o 24 horas.

El péptido también puede demostrar buena biodisponibilidad in vivo. El péptido puede mantener una conformación in vivo que le permita unirse a una molécula de CMH en la superficie celular sin excesivo impedimento.

35 Epítopos peptídicos

En una respuesta inmunitaria adaptativa, los linfocitos T pueden reconocer epítopos internos de un antígeno proteico. Las células presentadoras de antígeno (CPA) captan antígenos proteicos y los degradan en fragmentos peptídicos cortos. Un péptido puede unirse a una molécula de complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase I o II en el interior de la célula y transportarse hasta la superficie celular. Cuando se presenta en la superficie celular junto con una molécula de CMH, el péptido puede reconocerse por una célula T (mediante el receptor de células T (RCT)), en cuyo caso el péptido es un epítopo de células T.

45 Por tanto un epítopo es un péptido que puede derivarse de un antígeno que puede unirse al surco de unión a péptidos de una molécula de CMH de clase I o II y reconocerse por una célula T.

El epítopo mínimo es el fragmento más corto que puede derivarse de un epítopo, que puede unirse al surco de unión a péptidos de una molécula de CMH de clase I o II y reconocerse por una célula T. Para una región inmunogénica dada, normalmente es posible generar un “conjunto anidado” de péptidos solapantes que actúan como epítopos, que contienen todos ellos el epítopo mínimo pero difieren en sus regiones flanqueantes.

Del mismo modo, es posible identificar el epítopo mínimo para una combinación molécula de CMH:célula T particular midiendo la respuesta frente a péptidos truncados. Por ejemplo si se obtiene una respuesta frente al péptido que

55 comprende los residuos 1-15 en la biblioteca solapante, pueden usarse conjuntos que están truncados en ambos extremos (es decir 1-14, 1-13, 1-12, etc. y 2-15, 3-15, 4-15, etc.) para identificar el epítopo mínimo.

Apítopos

Los presentes inventores han determinado previamente que existe un vínculo entre la capacidad de un péptido para unirse a una molécula de CMH de clase I o II y presentarse a una célula T sin procesamiento antigénico adicional, y la capacidad del péptido para inducir tolerancia in vivo (documento WO 02/16410). Si un péptido es demasiado largo para unirse al surco de unión a péptidos de una molécula de CMH sin procesamiento adicional (por ejemplo corte), o se une en una conformación inapropiada, entonces no será tolerogénico in vivo. Si, por otro lado, el péptido es de un

65 tamaño y una conformación adecuados para unirse directamente al surco de unión a péptidos de CMH y presentarse a una célula T, entonces puede predecirse que este péptido será útil para la inducción de tolerancia.

Por tanto, es posible investigar la capacidad tolerogénica de un péptido investigando si puede unirse a una molécula de CMH de clase I o II y presentarse a una célula T sin procesamiento antigénico adicional in vitro.

5 El péptido de la presente invención es un apítopo (apitopes, Antigen Processing-Indepent epiTOPES, epítopos independientes del procesamiento antigénico) porque puede unirse a una molécula de CMH de clase II y estimular una respuesta a partir de células T específicas de factor VIII sin procesamiento antigénico adicional. Puede predecirse que tales apítopos provocan tolerancia a FVIII, siguiendo el método basado en normas descrito en el documento WO 02/16410.

Los péptidos que se unen a moléculas de CMH de clase I son normalmente de 7 a 13, más habitualmente de 8 a 10 aminoácidos de longitud. La unión del péptido se estabiliza en sus dos extremos mediante contactos entre átomos en la cadena principal del péptido y sitios invariantes en el surco de unión a péptidos de todas las moléculas de CMH de clase I. Existen sitios invariantes en ambos extremos del surco que se unen a los extremos amino y carboxilo

15 terminal del péptido. Se adaptan variaciones en la longitud del péptido mediante un retorcimiento en la estructura principal del péptido, a menudo en los residuos de prolina o glicina que permiten la flexibilidad requerida.

Los péptidos que se unen a moléculas de CMH de clase II son normalmente de entre 8 y 20 aminoácidos de longitud, más habitualmente de entre 10 y 17 aminoácidos de longitud, y pueden ser más largos (por ejemplo de hasta 40 aminoácidos). Estos péptidos se encuentran en una conformación extendida a lo largo del surco de unión a péptidos de CMH II que (a diferencia del surco de unión a péptidos de CMH de clase I) está abierto en ambos extremos. El péptido se mantiene en su lugar principalmente mediante contactos de átomos de la cadena principal con residuos conservados que recubren el surco de unión a péptidos.

25 SPIPA

Se conocen diversos sistemas de presentación independientes del procesamiento antigénico (SPIPA), incluyendo:

a) CPA fijada (con o sin anticuerpos frente a CD28);

b) membranas lipídicas que contienen moléculas de CMH de clase I o II (con o sin anticuerpos frente a CD28); y

c) CHM purificado natural o recombinante en forma unida a placas (con o sin anticuerpos frente a CD28).

35 Todos estos sistemas pueden presentar antígeno junto con una molécula de CMH, pero no pueden procesar antígeno. En todos estos sistemas, la función de procesamiento está o bien ausente o bien deshabilitada. Esto hace posible investigar si un péptido puede unirse a una molécula de CMH de clase I o II y presentarse a una célula T sin procesamiento antigénico adicional.

El uso de CPA fijada para investigar respuestas de células T se conoce bien en la técnica, por ejemplo en estudios para investigar el epítopo mínimo dentro de un polipéptido, midiendo la respuesta frente a péptidos truncados (Fairchild et al (1996) Int. Immunol. 8:1035-1043). CPA puede fijarse usando, por ejemplo formaldehído (habitualmente paraformaldehído) o glutaraldehído.

45 Pueden prepararse membranas lipídicas (que pueden ser membranas planas o liposomas) usando lípidos artificiales

o pueden ser fracciones de membrana plasmática/microsómicas de CPA.

En uso, el SPIPA puede aplicarse a los pocillos de una placa de cultivo tisular. Entonces se añaden antígenos peptídicos y se detecta la unión del péptido a la parte de CMH del SPIPA mediante la adición de clones o líneas de células T seleccionados. Puede medirse la activación del clon o la línea de células T mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante incorporación de 3H-timidina o secreción de citocinas.

Factor VIII

55 El péptido de la invención es derivable del factor VIII.

El factor VIII participa en la ruta intrínseca de la coagulación sanguínea; el factor VIII es un cofactor para el factor IXa que, en presencia de Ca+2 y fosfolípidos, convierte el factor X en la forma activada Xa.

El gen del factor VIII produce dos transcritos sometidos a corte y empalme alternativamente. La variante de transcrito 1 codifica para una glicoproteína grande, la isoforma a, que circula en plasma y se asocia con el factor de von Willebrand en un complejo no covalente. Esta proteína experimenta múltiples acontecimientos de escisión. La variante de transcrito 2 codifica para una supuesta proteína pequeña, la isoforma b, que consiste principalmente en el dominio de unión a fosfolípidos del factor VIIIc. Este dominio de unión es esencial para la actividad coagulante.

65 Se elucidó la secuencia completa de 186.000 pares de bases del gen del factor VIII humano a mediados de los años

1980 (Gitschier et al (1984) Nature 312 326-330). Al mismo tiempo, se usaron clones de ADN que codifican para la secuencia completa de 2351 aminoácidos para producir factor VIII biológicamente activo en células de mamífero cultivadas (Wood et al (1984) Nature 312:330-337). La secuencia completa de 2.351 aminoácidos para el factor VIII humano se facilita en SEQ ID No. 1.

5 Tolerancia

Los epítopos de células T desempeñan un papel fundamental en la respuesta inmunitaria adaptativa frente a cualquier antígeno, ya sea propio o foráneo. El papel fundamental desempeñado por los epítopos de células T en enfermedades por hipersensibilidad (que incluyen alergia, enfermedades autoinmunitarias y rechazo de trasplantes) se ha demostrado a través del uso de modelos experimentales. Es posible inducir enfermedades inflamatorias o alérgicas mediante la inyección de péptidos sintéticos (basados en la estructura de los epítopos de células T) en combinación con adyuvante.

15 En cambio, se ha mostrado que es posible inducir tolerancia inmunológica hacia antígenos particulares mediante la administración de epítopos peptídicos en forma soluble. La administración de antígenos peptídicos solubles ha demostrado ser un medio eficaz de inhibición de la enfermedad en encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE – a model for multiple sclerosis (MS)) (Metzler y Wraith (1993) Int. Immunol. 5:1159-1165; Liu y Wraith (1995) Int. Immunol. 7:1255-1263; Anderton y Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251-1261); y modelos experimentales de artritis, diabetes y uveorretinitis (revisado en Anderton y Wraith (1998) como anteriormente). Esto también se ha demostrado como medio de tratamiento de una enfermedad en curso en EAE (Anderton y Wraith (1998) como anteriormente).

La tolerancia es la ausencia de respuesta frente a un antígeno. La tolerancia a antígenos propios es una

25 característica esencial del sistema inmunitario, cuando esto se pierde, puede resultar una enfermedad autoinmunitaria. El sistema inmunitario adaptativo debe mantener la capacidad para responder a una enorme variedad de agentes infecciosos a la vez que evitar el ataque autoinmunitario de los antígenos propios contenidos dentro de sus propios tejidos. Esto se controla en gran medida por la sensibilidad de los linfocitos T inmaduros a la muerte celular apoptótica en el timo (tolerancia central). Sin embargo, no todos los antígenos propios se detectan en el timo, de modo que la muerte de timocitos autorreactivos sigue siendo incompleta. Por tanto, también existen mecanismos mediante los que puede adquirirse tolerancia por linfocitos T autorreactivos maduros en los tejidos periféricos (tolerancia periférica). Se facilita una revisión de los mecanismos de tolerancia central y periférica en Anderton et al (1999) (Immunological Reviews 169:123-137).

35 En la hemofilia A, los pacientes tienen un defecto en el gen del factor VIII. Esto significa que el factor VIII no se reconoce como un antígeno “propio” por el sistema inmunitario. Por tanto cuando se administra factor VIII durante la terapia de sustitución de factores de coagulación, se genera una respuesta aloinmunitaria frente a la proteína foránea, que conduce a la producción de anticuerpos inhibidores contra FVIII.

El péptido de la presente invención puede inducir tolerancia al factor VIII de manera que cuando se administra FVIII terapéuticamente, no induce una respuesta inmunitaria y no se desarrollan inhibidores de FVIII.

La hemofilia adquirida es una enfermedad autoinmunitaria en la que falla la tolerancia al factor VIII. En este caso, puede administrarse el péptido de la presente invención para reinstaurar la tolerancia a esta proteína propia y reducir

45 la respuesta inmunitaria patógena.

La tolerancia puede resultar de o caracterizarse por la inducción de anergia en al menos una parte de las células T CD4+. Para activar una célula T, un péptido debe asociarse con una CPA “profesional” que puede suministrar dos señales a las células T. La primera señal (señal 1) se suministra por el complejo CMH-péptido en la superficie celular de la CPA y se recibe por la célula T mediante el RCT. La segunda señal (señal 2) se suministra por moléculas coestimuladoras en la superficie de la CPA, tales como CD80 y CD86, y se recibe por CD28 en la superficie de la célula T. Se cree que cuando una célula T recibe la señal 1 en ausencia de la señal 2, no se activa y, de hecho, se vuelve anérgica. Las células T anérgicas no responden a una exposición antigénica posterior, y pueden llegar a suprimir otras respuestas inmunitarias. Se cree que las células T anérgicas están implicadas en la mediación de la

55 tolerancia de células T.

Sin querer restringirse por la teoría, los presentes inventores predicen que los péptidos que requieren procesamiento antes de que puedan presentarse junto con moléculas de CMH no inducen tolerancia porque tienen que manejarse por células presentadoras de antígeno maduras. Las células presentadoras de antígeno maduras (tales como macrófagos, células B y células dendríticas) pueden producir procesamiento antigénico, pero también suministrar ambas señales 1 y 2 a una célula T, lo que conduce a la activación de células T. Los apítopos, por otro lado, podrán unirse a CMH de clase II en CPA inmaduras. Por tanto se presentarán a células T sin coestimulación, lo que conduce a tolerancia y anergia de células T.

65 Naturalmente, los apítopos también pueden unirse a moléculas de CMH en la superficie celular de CPA maduras. Sin embargo, el sistema inmunitario contiene una mayor abundancia de CPA inmaduras que maduras (se ha

sugerido que menos del 10% de las células dendríticas se activan, Summers et al. (2001) Am. J. Pathol. 159: 285295). Por tanto la posición por defecto para un apítopo será de anergia/tolerancia, más que de activación.

La inducción de tolerancia a FVIII puede monitorizarse in vivo examinando una reducción en el nivel de: 5

(i)

anticuerpos inhibidores contra FVIII:

(ii)

células T CD4+ específicas para FVIII

(iii) células B que pueden secretar anticuerpos inhibidores contra FVIII

mediante técnicas conocidas en la técnica.

Se ha mostrado que, cuando se induce tolerancia mediante la administración de péptidos, se reduce la capacidad

15 para proliferar de células T CD4+ específicas de antígeno. Además, la producción de IL-2, IFN-γ y la producción de IL-4 por estas células está regulada por disminución, pero la producción de IL-10 aumenta. Se ha mostrado que la neutralización de IL-10 en ratones en un estado de tolerancia inducida por péptidos restablece completamente la propensión a la enfermedad. Se ha propuesto que una población de células reguladoras persiste en el estado tolerante que produce IL-10 y media en la regulación inmunitaria (Burkhart et al (1999) Int. Immunol. 11:1625-1634).

Por tanto la inducción de tolerancia también puede monitorizarse mediante diversas técnicas, incluyendo:

(a) la inducción de anergia en células T CD4+ (que puede detectarse mediante exposición posterior a FVIII in vitro); 25 (b) cambios en la población de células T CD4+, incluyendo:

(i)

reducción en la proliferación;

(ii)

regulación por disminución en la producción de IL-2, IFN-γ e IL-4; y

(iii) aumento en la producción de IL-10.

Tal como se usa en el presente documento, el término “tolerogénico” significa que puede inducir tolerancia.

35 Composición

La presente invención también se refiere a una composición, tal como una composición farmacéutica que comprende un péptido según la invención.

La composición puede comprender una pluralidad de péptidos, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis péptidos.

La composición de la presente invención puede ser para uso profiláctico o terapéutico.

Cuando se administra para uso profiláctico, la composición puede reducir o prevenir la generación de una respuesta

45 inmunitaria frente a FVIII. El nivel de respuesta inmunitaria es menor del que se habría obtenido en el paciente si no se hubiera tratado con la composición. El término “reducir” indica que se observa una reducción parcial en la respuesta inmunitaria, tal como una reducción del 50%, 70%, 80% o el 90% en la respuesta que se habría observado en el paciente si no se hubiera tratado con la composición (o en la respuesta observada en un paciente no tratado a lo largo del mismo periodo de tiempo). El término “prevenir” indica que no se observa una respuesta inmunitaria apreciable frente a FVIII.

Cuando se administra para uso terapéutico, la composición puede suprimir una respuesta inmunitaria frente a FVIII ya en curso. El término “suprimir” indica una reducción en el nivel de una respuesta inmunitaria en curso, en comparación con el nivel antes del tratamiento con el péptido, o el nivel que se habría observado en el mismo punto

55 de tiempo si no se hubiera administrado el tratamiento.

El tratamiento con la composición de la presente invención puede producir una reducción en los niveles de cualquiera o de todos de los siguientes:

(i)

anticuerpos inhibidores contra FVIII:

(ii)

células T CD4+ específicas para FVIII

(iii) células B que secretan anticuerpos inhibidores contra FVIII.

65 La detección de todos estos factores puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas en la técnica, tales como

ELISA, FACS, etc.

El tratamiento con la composición de la presente invención puede producir también o alternativamente anergia en células T CD4+ específicas para FVIII. La anergia puede detectarse, por ejemplo, mediante exposición posterior a 5 FVIII in vitro.

Es importante tener en cuenta que no todas las respuestas inmunitarias frente a FVIII son patógenas. Pueden encontrarse anticuerpos anti-FVIII no inhibidores en pacientes con hemofilia sin inhibidores (Moreau et al (2000) Blood 95:3435-41) y aproximadamente el 15% de los donantes de sangre sanos (Algiman et al (1992) 89:3795-9).

Pueden detectarse los inhibidores de FVIII mediante la modificación de Nijmegen del ensayo de Bethesda de coagulación, en el que se somete a prueba la capacidad del plasma del paciente para inactivar FVIII en plasma normal. Una unidad Bethesda se define como la cantidad de anticuerpo que neutraliza el 50% de la actividad de FVIII en plasma, y títulos de 0,6 UB o superiores sugieren la presencia de anticuerpo.

15 Los inhibidores se clasifican generalmente como de bajo título si el nivel es <5 UB y de alto título si ≥ 5 UB.

El nivel de anticuerpos inhibidores contra FVIII circulantes puede reducirse hasta el 90%, 75%, 50%, 20%, 10%, 5% del nivel de anticuerpos que se habría observado si el paciente no hubiera recibido tratamiento.

El nivel de anticuerpos inhibidores contra FVIII circulantes puede reducirse hasta 5, 4, 3, 2, 1 ó 0,5 UB.

Los péptidos y la composición de la invención pueden aumentar la cantidad o proporción de FVIII administrado terapéuticamente que está disponible para ayudar en la coagulación en un paciente. Esto se debe a la reducción en

25 los inhibidores de FVIII que pueden evitar eficazmente que una proporción de FVIII ejerza su función terapéutica. El péptido o la composición de la invención pueden aumentar la cantidad de FVIII disponible en, por ejemplo, el 10%, 25%, 50%, 75% o el 100%.

Por tanto los péptidos y la composición de la invención pueden reducir la cantidad de FVIII que es necesario administrar para ayudar en la coagulación en un paciente.

Formulación

La composición puede prepararse como un inyectable, o bien como una suspensión o bien como una disolución

35 líquida; también puede prepararse una forma sólida adecuada para la disolución en, o suspensión en, un líquido antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse, o los péptidos encapsularse en liposomas. Los principios activos pueden mezclarse con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), dextrosa, glicerol, etanol, o similar y combinaciones de los mismos.

Además, si se desea, la composición puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes y/o agentes tamponantes del pH. Las sales tamponantes incluyen fosfato, citrato, acetato. Puede usarse ácido clorhídrico y/o hidróxido de sodio para el ajuste del pH. Para la estabilización, pueden usarse disacáridos tales como sacarosa o trehalosa.

45 Si la composición comprende una pluralidad de péptidos, la razón relativa de los péptidos puede ser aproximadamente igual. Alternativamente, las razones relativas de cada péptido pueden alterarse, por ejemplo, para centrar la respuesta tolerogénica en un subconjunto particular de células T autorreactivas o si se encuentra que un péptido funciona mejor que los otros en tipos de HLA particulares.

Tras la formulación, la composición puede incorporarse en un recipiente estéril que luego se sella y se almacena a baja temperatura, por ejemplo 4ºC, o puede secarse por congelación.

De manera conveniente, se prepara la composición como un polvo liofilizado (secado por congelación). La

55 liofilización permite el almacenamiento a largo plazo en forma estabilizada. Se conocen bien procedimientos de liofilización en la técnica, véase por ejemplo http://www.devicelink.com/ivdt/archive/97/01/006.html. Se usan comúnmente agentes de carga antes del secado por congelación, tales como manitol, dextrano o glicina.

La composición puede administrarse de manera conveniente tal como por las vías oral, intravenosa (cuando es soluble en agua), intramuscular, subcutánea, sublingual, intranasal, intradérmica o con supositorio o mediante implantes (por ejemplo usando moléculas de liberación lenta).

La composición puede administrarse ventajosamente por las vías intranasal, subcutánea o intradérmica.

65 El péptido y la composición de la invención pueden usarse para tratar un sujeto humano. El sujeto puede tener hemofilia A, en particular hemofilia A grave. El sujeto puede ser genéticamente deficiente en FVIII. El sujeto puede

tener hemofilia adquirida. El sujeto puede tener anticuerpos anti-FVIII inhibidores.

El sujeto puede estar sometiéndose o estar a punto de someterse a terapia de sustitución coagulante con FVIII.

5 El sujeto puede estar sometiéndose o estar a punto de someterse a terapia génica con el gen de FVIII.

El sujeto puede tener un haplotipo HLA que se asocia con una predisposición a desarrollar aloanticuerpos o autoanticuerpos anti-FVIII inhibidores. El sujeto puede expresar HLA-DR2. Se conocen en la técnica métodos para determinar el haplotipo HLA de un individuo.

Normalmente, un médico determinará la dosificación exacta que será la más adecuada para un sujeto individual y variará con la edad, el peso y la respuesta del paciente particular.

En una realización preferida, puede seguirse un protocolo de “ajuste de la dosis”, en el que se administra al paciente

15 una pluralidad de dosis en concentraciones ascendentes. Se ha usado un enfoque de este tipo, por ejemplo, para péptidos de la fosfolipasa A2 en aplicaciones inmunoterapéuticas contra la alergia al veneno de abejas (Müller et al (1998) J. Allergy Clin Immunol. 101:747-754 y Akdis et al (1998) J. Clin. Invest. 102:98-106).

Kits

De manera conveniente, si la composición comprende una pluralidad de péptidos, pueden administrarse juntos, en forma de una composición mezclada o cóctel. Sin embargo, puede haber circunstancias en las que es preferible proporcionar los péptidos por separado en forma de un kit, para la administración simultánea, separada, secuencial

o combinada.

25 El kit también puede comprender medios de mezclado y/o administración (por ejemplo, un vaporizador para la administración intranasal; o una jeringuilla y aguja para la dosificación subcutánea/intradérmica). El kit también puede comprender instrucciones para su uso.

La composición farmacéutica o el kit descritos en el presente documento pueden usarse para tratar y/o prevenir una enfermedad.

En particular, la composición/el kit pueden usarse para tratar y/o prevenir hemofilia A o hemofilia adquirida.

35 Hemofilia A

La hemofilia A (hemofilia clásica) está provocada por la deficiencia del factor VIII.

La hemofilia A tiene una incidencia estimada de 1 por cada 10.000 hombres, mientras que se estima que la hemofilia B se produce en uno de cada 40.000 hombres. Aproximadamente 1 mujer de cada 5.000 es portadora de hemofilia A, y 1 de cada 20.000 es portadora de hemofilia B.

La hemofilia se divide normalmente en tres clases: grave, moderada y leve, basándose en el nivel del factor de coagulación en la sangre. En la hemofilia grave, existe menos del 1 por ciento de factor de coagulación normal. El

45 grado de gravedad tiende a ser constante de una generación a otra.

En contra de la creencia popular, cortes y heridas menores no representan habitualmente una amenaza para los pacientes hemofílicos. Más bien, el mayor peligro procede de hemorragia espontánea que puede producirse en articulaciones y músculos. Se es más propenso a que se produzca esto durante los años de crecimiento rápido, normalmente entre las edades de los 5 y los 15 años.

La hemorragia espontánea repetida en articulaciones puede producir artritis, y se debilitan los músculos adyacentes. La presión sobre los nervios producida por la acumulación de sangre puede dar como resultado dolor, entumecimiento e incapacidad temporal para mover la zona afectada.

55 La hemofilia A se diagnostica habitualmente con un análisis de sangre para determinar la eficacia de la coagulación y para investigar si los niveles de factores de coagulación son anómalos.

El desarrollo de factores de coagulación purificados en los años 1970, aislados de sangre de donantes, mejoró significativamente las perspectivas a largo plazo para los pacientes hemofílicos. Los pacientes con hemofilia de leve a moderada pueden usar el tratamiento con FVIII según las necesidades, mientras que los pacientes con hemofilia grave pueden requerir tratamiento regular, indefinido.

Previamente, a los pacientes se les administraban concentrados de factor VIII reunidos a partir de miles de

65 donaciones de plasma. Esto conduce a problemas significativos de contaminación con patógenos virales, particularmente el virus de la inmunodeficiencia humana y los virus de la hepatitis. Las técnicas de purificación de

anticuerpos monoclonales, inactivación por calor y tratamiento con detergentes virucidas han hecho que los concentrados derivados de plasma sean relativamente seguros.

La tecnología de ADN recombinante ha proporcionado ahora una serie de productos sintéticos, tales como

5 Recombinate™ y Kogenate™. Kogenate se prepara usando células de riñón de hámster recién nacido que expresan el factor VIII humano. El factor resultante está altamente purificado, eliminando cualquier posibilidad de transmisión de virus desde el plasma.

El péptido o la composición de la presente invención pueden administrarse antes y/o durante la terapia de 10 sustitución de factor VIII.

La hemofilia A es una diana de enfermedad ideal para la terapia génica puesto que i) está producida por mutaciones en un único gen identificado, ii) un ligero aumento en los niveles de factor de coagulación in vivo puede convertir una hemofilia grave en una enfermedad más leve, y iii) las terapias de sustitución actuales se consideran inferiores a lo

15 óptimo. Además, existe un amplio intervalo de seguridad si existe una “superación” del nivel deseado de actividad de coagulación.

Desafortunadamente, hasta la fecha no se ha hecho realidad la promesa de la terapia génica como cura para la hemofilia, principalmente debido a dificultades para encontrar un sistema de administración de genes que sea lo 20 suficientemente no inmunogénico para permitir la expresión a largo plazo del factor de coagulación.

Los péptidos de la presente invención también serán adecuados para inducir tolerancia en un sujeto antes de la terapia génica con factor VIII y/o manejar la formación de inhibidores de FVIII en un paciente tras la terapia génica.

25 Hemofilia adquirida

La hemofilia adquirida se caracteriza por la presencia de inhibidores de autoanticuerpo contra FVIII en individuos con coagulación normal previamente. Es un estado raro, con una incidencia estimada de 1-3 por población de 1 millón de personas al año. La tasa de mortalidad asociada con los inhibidores de autoanticuerpo adquiridos se aproxima al

30 25% frente al riesgo de muerte sustancialmente menor en aquéllos con aloanticuerpos.

En comparación con los pacientes con inhibidores de aloanticuerpo, la hemofilia adquirida se caracteriza por: (1) un patrón de hemorragia más grave; (2) mayor incidencia en la población anciana; (3) aparición junto con enfermedades autoinmunitarias subyacentes identificables, cánceres linfoproliferativos o por tumores sólidos,

35 embarazo y uso de determinados antibióticos tales como penicilina y sulfonamidas en aproximadamente el 50% de los casos; y (4) actividad inhibidora in vitro que sigue un patrón farmacocinético de tipo II con neutralización incompleta de la actividad del factor de coagulación seleccionado como diana por el autoanticuerpo, dando como resultado normalmente niveles residuales de factor VIII que oscilan entre el 2%-18% en el plasma del paciente.

40 El péptido o la composición de la presente invención pueden administrarse a un paciente con hemofilia adquirida, o a un paciente que se cree que corre el riesgo de desarrollar hemofilia adquirida debido a, por ejemplo:

i) tratamiento inminente con, por ejemplo penicilina o una sulfonamida

45 ii) progresión de un tumor u otro cáncer

iii) embarazo inminente o en los primeros meses.

La invención se describirá ahora adicionalmente a modo de ejemplos, que pretenden servir para ayudar a un experto 50 habitual en la técnica al llevar a cabo la invención y no pretenden en modo alguno limitar el alcance de la invención.

Ejemplos (los ejemplos 1 a 10 son sólo para referencia).

Ejemplo 1: Selección de péptidos de factor VIII con HLA-DR2 55 Se comparó una serie de péptidos de 15 meros de FDVIII usando tres algoritmos de unión a HLA-DR:

SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/home.htm),

60 ProPred (http://www.imtech.res.in/raghava/propred/), e

IEDB (http://www.immuneepitope.org/home.do).

Se seleccionaron los péptidos que se predijo que se unían a HLA-DR2 mediante más de uno de los programas y se 65 diseñaron secuencias flanqueantes para los residuos centrales predichos (tabla 2).

TABLA 2

N.º de péptido

Primeros AA de FVIII Secuencia en código de un solo aminoácido También denominado en el presente documento:

1

2140 GTLMVFFGNVDSSGI GTLMV

2

0208 TQTLHKFILLFAVFD TQTLH

3

2114 SLYISQFIIMYSLDG SLYIS

4

2161 PPIIARYIRLHPTHY PPIIA

5

2318 PPLLTRYLRIHPQSW PPLLT

6

250 MHTVNGYVNRSLPGL MHTVN

7

322 LGQFLLFCHISSHQH LGQFL

8

478 DTLLIIFKNQASRPY DTLLI

9

545 PRCLTRYYSSFVNME PRCLT

10

607 TENIQRFLPNPAGVQ TENIQ

11

1788 DNIMVTFRNQASRPY DNIMV

12

2322 RYLRIHPQSWVHQIA RYLRI

Ejemplo 2: Investigación de la respuesta de células restringidas por HLA-DR2 de ratones inmunizados con factor VIII frente a péptidos

5 Se inmunizaron ratones transgénicos para HLA-DR2 con factor VIII humano en adyuvante. Se recogieron células de ganglios linfáticos drenantes y se volvieron a estimular in vitro con diferentes concentraciones de los 12 péptidos de la tabla 2. Se muestran los resultados en la figura 1.

10 Las células restringidas por HLA-DR2 de ratones inmunizados con factor VIII responden claramente de forma intensa frente al péptido DNIMV (1er aminoácido 1788). También existen respuestas frente a los péptidos PRCLT

(545) y PPIIA (2161).

Ejemplo 3: Investigación de la respuesta de células T de ratones HLA-DR2 frente a péptidos

15 Se inmunizaron en primer lugar ratones HLA-DR2 con factor VIII en adyuvante. Se volvieron a estimular células de bazo de ratones inmunes in vitro con factor VIII y se fusionaron los linfoblastos resultantes con el timoma BW5147 usando polietilenglicol.

20 Se seleccionaron hibridomas de células T en medio HAT y se clonaron los hibridomas y se sometieron a prueba para determinar su respuesta frente al factor VIII. Entonces se examinaron los hibridomas para determinar su respuesta frente a los 12 péptidos predichos. De los 27 hibridomas examinados, 11 respondieron frente a DNIMV, 3 frente a PRCLT y 3 frente a PPIIA, aunque la respuesta frente a PPIIA fue más débil y menos específica. La respuesta de dos hibridomas específicos para DNIMV y PRCLT se muestra en la figura 2.

25 Ejemplo 4 -Investigación de la respuesta de células de ganglios linfáticos de ratones FVIII-DR2+ frente a péptidos

Se cruzaron ratones transgénicos HLA-DR2 con ratones deficientes en factor VIII para crear un modelo de hemofilia que expresa la molécula de CMH de clase II de HLA humana.

30 Se inmunizaron estos animales FVIII-DR2+ con factor VIII en adyuvante. Se aislaron los ganglios linfáticos drenantes y se sometieron a prueba para determinar su respuesta frente al panel de péptidos. Tal como se muestra en la figura 3, estas células respondieron bien frente a PRCLT y DNIMV. Hubo una respuesta débil frente a GTLMV y una respuesta significativa frente a RYLRI.

35 Ejemplo 5 -Investigación de la respuesta de células T de ratones HLA-DR2 frente a péptidos

Se inmunizaron ratones deficientes en factor VIII que expresaban HLA-DR2 con factor VIII en adyuvante. Se volvieron a estimular células de bazo de los ratones inmunizados in vitro con factor VIII y se fusionaron los

40 linfoblastos resultantes con BW5147, tal como se describió anteriormente. Se examinaron los hibridomas de células T para determinar su respuesta frente a los 12 péptidos predichos. De nuevo aún, la mayoría de los hibridomas respondió frente a los péptidos DNIMV y PRCLT. De 19 hibridomas específicos para el factor VIII, 10 respondieron frente a DNIMV, 6 frente a PRCLT, 1 frente a PPIIA, 1 frente a SLYIS y 1 frente a DTLLI. Se muestran ejemplos de respuestas por estos hibridomas en la figura 4.

Basándose en estos experimentos, queda claro que dos péptidos DNIMV (primer número de aminoácido 1788) y PRCLT (primer aminoácido 545) constituyen los epítopos inmunodominantes de células T en la respuesta de células T restringidas por HLA-DR2 frente al factor VIII humano.

5 Ejemplo 6 -DNIMV y PRCLT se comportan como apítopos

Para ser un apítopo, un péptido debe poder unirse a una molécula de CMH de clase I o II sin procesamiento antigénico adicional (es decir, corte) y presentarse a una célula T. En el presente caso, se investigó la capacidad de los péptidos para presentarse por CPA fijada.

Las células Mgar o bien eran frescas o bien se fijaron con paraformaldehído al 1%. Se sometieron a prueba clones para determinar la especificidad antigénica cultivando 100 µl de células de hibridoma con 5x104 células Mgar en presencia y ausencia de epítopos peptídicos o rhFVIII 20 µg/ml durante la noche. Entonces se recogieron los

15 sobrenadantes y se evaluaron para determinar la producción de IL-2 mediante ELISA. El hecho de que rhFVIII debe presentarse por células Mgar vivas demuestra que la proteína intacta requiere procesamiento antigénico para presentarse. Los péptidos DNIMV y PRCLT, por otro lado, se presentan por células Mgar tanto vivas como fijadas, indicando que estos péptidos funcionan como apítopos (figura 5).

Ejemplo 7 -Determinación de la gama de epítopos peptídicos que pueden funcionar como apítopos

Se identificó la gama de epítopos peptídicos que pueden funcionar como apítopos en las secuencias que rodean a DNIMV, PRCLT y los demás péptidos preparando paneles de péptidos solapantes (mostrados en las páginas 36-37) y examinando éstos usando los hibridomas de células T, usando el mismo método que en el ejemplo 5 (figura 7).

25 Ejemplo 8 -DNIMV y PRCLT inducen tolerancia a la proteína de factor VIII completa

Se trataron ratones transgénicos HLA-DR2 con cualquiera de los dos péptidos solubles, o PBS como control, antes de la inmunización con factor VIII en adyuvante. Se aislaron los ganglios linfáticos drenantes y se volvieron a estimular las células in vitro con proteína de factor VIII para evaluar el estado inmunitario de los ratones. Tal como se muestra en la figura 6, el tratamiento de los ratones con o bien DNIMV o bien PRCLT condujo a una supresión sustancial de la respuesta inmunitaria frente al factor VIII.

Ejemplo 9 -Investigación de si DNIMV y PRCLT pueden inducir tolerancia en el ratón deficiente en factor VIII

35 Se sabe a partir del ejemplo 8 que estos dos péptidos pueden prevenir la respuesta inmunitaria frente al factor VIII en ratones que expresan factor VIII endógeno. Se repitió el experimento con animales FVIII-DR2+ para determinar si estos péptidos también previenen la respuesta inmunitaria frente al factor VIII en ratones deficientes en factor VIII.

Ejemplo 10 -Investigación de si DNIMV y PRCLT en combinación pueden inducir tolerancia en el ratón deficiente en factor VIII

Se combinaron los dos péptidos que se mostró que reducían individualmente la respuesta inmunitaria frente al factor VIII en ratones deficientes en factor VIII en el ejemplo 9. Tal como se muestra en la figura 8, el tratamiento de

45 ratones tanto con DNIMV como con PRCLT condujo a una supresión sustancial de la respuesta inmunitaria frente al factor VIII, tal como se muestra mediante la disminución en la producción de IFN-gamma. IFN-gamma es la principal linfocina de cambio de clase requerida para neutralizar anticuerpos en el ratón. El efecto demostrado fue mayor que el observado usando cualquier péptido solo.

Ejemplo 11: La inducción de tolerancia usando un péptido modificado. El péptido DNIMV es parcial, pero no completamente, soluble. Para mejorar la solubilidad del péptido, se diseñó una versión modificada con la siguiente secuencia: EDNIMVTFRNQASR. Esta se extiende en el extremo N-terminal para añadir un residuo hidrófilo cargado. También está truncada en el extremo C-terminal para eliminar los residuos de prolina y tirosina. Además, situando aminoácidos cargados positiva

55 y negativamente en cualquier extremo del péptido, se crea un dipolo de carga que se notifica que aumenta la solubilidad. El péptido modificado es más soluble que DNIMV y lo suficientemente soluble como para permitir la administración intranasal del péptido. Para evaluar la inducción de tolerancia usando este epítopo peptídico, se tomaron ratones deficientes en FVIII y se trató la mitad con el péptido EDNIMV modificado (denominados “con tolerancia inducida” en la figura 9). Entonces se inmunizaron los ratones con DNIMV en CFA y 10 días después se recogieron los ganglios linfáticos drenantes y se estimularon in vitro con o bien DNIMV o bien EDNIMV. La figura 9 muestra los resultados para respuestas de ratones o bien no tratados previamente o bien con tolerancia inducida estimulados con o bien DNIMV o bien EDNIMV in vitro. Los resultados demuestran que EDNIMV puede recordar una respuesta inmunitaria de ratones inmunizados con

65 DNIMV. Además, demuestran muy claramente que los ratones con tolerancia inducida con EDNIMV no pueden

producir una respuesta inmunitaria frente a DNIMV in vivo tal como se reveló por la falta de respuesta a o bien

DNIMV o bien EDNIMV in vitro tras la administración de dosis de refuerzo con DNIMV en CFA.

Ejemplo 12: EDNIMV induce tolerancia a la proteína de factor VIII completa 5 Se repite el experimento descrito en el ejemplo 8 para el péptido modificado EDNIMV para demostrar que EDNIMV puede suprimir la respuesta inmunitaria frente a la proteína de factor VIII completa.

MÉTODOS

(i) Respuestas de memoria para ratones DR2+ a los que se les administró una dosis de refuerzo de rhFVIII

Se inmunizaron ratones carentes de CMH de clase II murino HLA-DR2+ con 40 µg de rhFVIII emulsionado en adyuvante completo de Freund complementado con 400 µg de M. tuberculosis H37Ra inactivado por calor, por vía subcutánea en la base de la cola. 10 días después se sacrificaron los ratones y se extirparon los ganglios linfáticos

15 drenantes. Se prepararon suspensiones de células individuales y se incubaron los linfocitos a 4-5x105 células por pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos durante 72 horas con las concentraciones indicadas de péptido o antígenos control antes de pulsarse con 0,5 µCi/pocillo de timidina tritiada durante 16 horas adicionales. Entonces se congelaron las placas antes de que se recogieran las células sobre esteras de filtro de vidrio y se midió la incorporación radiactiva usando un contador β de centelleo líquido.

(ii) Especificidad para péptidos de FVIII de hibridomas de células T generados a partir de ratones DR2+

Se inmunizaron ratones carentes de CMH de clase II murino HLA-DR2+ como anteriormente. El día 10, se extirparon los ganglios linfáticos drenantes y se cultivaron linfocitos a 2,5x106 células/ml, 1 ml/pocillo en placas de 24 pocillos 25 en presencia de rhFVIII 20 µg/ml durante 3 días. Tras esta estimulación, se recuperaron los linfocitos, se lavaron y se fusionaron con células de pareja de fusión de BW TCRα -β -a una razón de 4 células BW con respecto a 1 linfocito, usando polietilenglicol tal como describieron Nelson et al (1980) PNAS 77 (5):2866. Se lavaron cuidadosamente las células fusionadas y luego se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo plano durante 2 días antes de la adición de medio HAT para seleccionar hibridomas de células T. Se monitorizaron las células para determinar su crecimiento y aproximadamente 10 días después de que se realizaran las fusiones, se seleccionaron clones individuales y se transfirieron a placas de 24 pocillos en medio HAT. Se mantuvieron los clones en medio HAT durante al menos 2 semanas antes de liberarse a medio HT y luego medio completo. Se sometieron a prueba los clones para determinar la especificidad antigénica cultivando 100 µl de células de hibridoma con 5x104 células Mgar en presencia y ausencia de rhFVIII 20 µg/ml durante la noche. Se recogieron los sobrenadantes y se evaluaron

35 para determinar la producción de IL-2 mediante ELISA, considerándose positivos para la especificidad para FVIII los clones que producían IL-2 en respuesta a rhFVIII. Para investigar el repertorio de péptidos de FVIII predichos, se sometieron a prueba de nuevo clones específicos de FVIII para determinar la producción de IL-2, tras incubación durante la noche con 20 µg/ml de cada uno de los 12 péptidos.

(iii) Respuestas de memoria para ratones FVIII-/-a los que se les administró una dosis de refuerzo de rhFVIII

Se siguió el mismo método que para (i), excepto en que los ratones eran deficientes en FVIII, HLA-DR2+ y carecían de CMH de clase II murino.

45 (iv) Especificidad para péptidos de FVIII de hibridomas de células T generados a partir de ratones FVIII-/-

Se siguió el mismo método que para (ii), excepto en que los ratones eran deficientes en FVIII y HLA-DR2+.

(v) Inducción de tolerancia de respuestas específicas de FVIII en ratones DR2+ mediante pretratamiento con péptidos de FVIII inmunodominantes

Se trataron ratones carentes de CMH de clase II murino HLA-DR2+ 3 veces con 100 µg de DNIMV, PRCLT o PPIIA disueltos en PBS, o el volumen equivalente de PBS solo. Se administraron los péptidos por vía intraperitoneal, con 3-4 días entre cada dosis. Tras la administración final, se les administró a los ratones una dosis de refuerzo de

55 rhFVIII emulsionado en adyuvante completo de Freund como para (i). 10 días después, se extirparon los ganglios linfáticos drenantes y se cultivaron posteriormente linfocitos in vitro con rhFVIII, o cada uno de los péptidos de inducción de tolerancia así como antígenos control, durante 72 horas antes de la adición de timidina tritiada como para (i).

(vi) Inducción de tolerancia de respuestas específicas de FVIII en ratones DR2+ mediante pretratamiento con una combinación de péptidos de FVIII inmunodominantes

Se trataron ratones carentes de CMH de clase II murino HLA-DR2+ 3 veces con DNIMV, PRCLT o una combinación tanto de DNIMV como de PRCLT disueltos en PBS, o el volumen equivalente de PBS solo. Se administraron los 65 péptidos por vía intraperitoneal, a lo largo de 8 días. Tras la administración final, se les administró a los ratones una

dosis de refuerzo de rhFVIII emulsionado en adyuvante completo de Freund como para (i). 10 días después se extirparon los ganglios linfáticos drenantes y se volvieron a estimular posteriormente linfocitos in vitro con rhFVIII. Entonces se recogieron los sobrenadantes y se midió IFN-gamma.

Paneles de péptidos solapantes preparados en el ejemplo 7 10 Conjunto solapante para DTLLIIFKNQASRPY

Conjunto solapante para PRCLTRYYSSFVNME

Conjunto solapante para DNIMVTFRNQASRPY

Conjunto solapante para SLYISQFIIMYSLDG

Conjunto solapante para PPIIARYIRLHPTHY

Conjunto solapante para RYLRIHPQSWVHQIA

Lista de secuencias

<110> Apitope Technology (Bristol) Limited

<120> PÉPTIDOS

<130> P036475EPA

<150> GB 0908515.0 15 <151>

<160> 83

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 2351 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1. Péptido que consiste en la secuencia EDNIMVTFRNQASR.

   5 2. Composición que comprende una pluralidad de péptidos, incluyendo un péptido según la reivindicación 1.

2. 3. Péptido según la reivindicación 1, o composición según la reivindicación 2, para su uso en el tratamiento de hemofilia en un sujeto.

   10 4. Péptido según la reivindicación 1, o composición según la reivindicación 2, para su uso en el tratamiento de hemofilia en un sujeto según la reivindicación 3, en el que el sujeto

   (a)

   tiene hemofilia A, y está sometiéndose, o está a punto de someterse, a terapia de sustitución de factor VIII; o

   (b)

   tiene, o corre el riesgo de contraer, hemofilia adquirida

   15 5. A Péptido según la reivindicación 1, o composición según la reivindicación 2, para su uso en el tratamiento de hemofilia en un sujeto según la reivindicación 3, en el que el sujeto es HLA-DR2.