ES2525573T3 - Trampas de SUMO de alta afinidad - Google Patents

Trampas de SUMO de alta afinidad Download PDF

Info

Publication number
ES2525573T3
ES2525573T3 ES12711589.7T ES12711589T ES2525573T3 ES 2525573 T3 ES2525573 T3 ES 2525573T3 ES 12711589 T ES12711589 T ES 12711589T ES 2525573 T3 ES2525573 T3 ES 2525573T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sumo
polypeptide
protein
sumoylated
proteins
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12711589.7T
Other languages
English (en)
Inventor
Manuel Salvador RODRÍGUEZ MEDINA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centro de Investigacion Cooperativa en Biociencias
Original Assignee
Centro de Investigacion Cooperativa en Biociencias
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centro de Investigacion Cooperativa en Biociencias filed Critical Centro de Investigacion Cooperativa en Biociencias
Application granted granted Critical
Publication of ES2525573T3 publication Critical patent/ES2525573T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02019—Ubiquitin-protein ligase (6.3.2.19), i.e. ubiquitin-conjugating enzyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Un polipéptido que comprende al menos ocho motivos de interacción con SUMO (SIM), en el que dichos motivos de interacción con SUMO se unen entre sí por una secuencia enlazadora de aminoácidos natural.

Description

Trampas de SUMO de alta afinidad
5 Campo de la invención
La invención se refiere al campo de la purificación de proteínas diana basándose en su afinidad frente a reactivos de unión específicos. En particular, la invención se refiere a métodos para la purificación por afinidad de unión de SUMO (modificador pequeño de ubiquitina) y proteínas conjugadas con SUMO mediante el uso de proteínas de fusión que comprenden la organización en tándem de motivos de interacción con SUMO.
Antecedentes de la invención
Las modificaciones post-traduccionales de proteínas con proteínas de la familia de la ubiquitina son procesos
15 altamente dinámicos que aumentan el potencial de la célula de adaptarse a múltiples situaciones fisiológicas o patológicas (Hayashi et al., 2002; Seufert et al., 1995). La modificación de proteínas por medio del modificador pequeño de ubiquitina (SUMO) da como resultado diversos desenlaces. Las primeras dianas de SUMO identificadas, la proteína oncogénica PML (leucemia promielocítica) y la proteína de transporte nucleocitoplasmático RanGAP1 (activadora de RanGTPasa1), permitieron conectar las funciones de SUMO con la localización nuclear (Matunis et al., 1996; Lapenta et al., 1997; Mahajan et al. 1997; Wilkinson y Henley, 2010). La identificación y caracterización de cientos de sustratos de SUMO sugiere el papel de SUMO como regulador de la actividad y estabilidad de las proteínas (Seeler y Dejean, 2003). Las consecuencias corriente abajo están mediadas, al menos en parte, por efectores que contienen motivos de interacción con SUMO o SIM.
25 Las proteínas SUMO solamente tienen un 20 % de identidad con ubiquitina, sin embargo, tienen una estructura tridimensional similar (Kerscher et al., 2006) (Figura 1). Tres formas de SUMO (SUMO-1, SUMO-2 y SUMO-3) se expresan de forma ubicua y migran con un peso molecular aparente de alrededor de 10 kDa en un gel desnaturalizante de poliacrilamida. SUMO-1 comparte solamente el 50 % de la identidad con SUMO-2 y SUMO-3, pero SUMO-2 y SUMO-3 son idénticas en el 97 %, y forman una subfamilia distinta conocida como SUMO 2/3 (Tatham et al., 2001).
Como ocurre con la ubiquitina, las moléculas de SUMO se generan a través del procesamiento de un precursor de alto peso molecular, cuya escisión expone la firma de doble glicina que está involucrada en su conjugación a sustratos proteicos. Una cascada tiol-éster de 3 reacciones media la conjugación de las moléculas de SUMO (Figura
35 2). Una única enzima activadora de SUMO (SAE) o E1, activa todas las moléculas de SUMO que se conjugan por E2 Ubc9 (Hay, 2005; Wilkinson y Henley, 2010).
Este proceso está facilitado por una ligasa E3 específica de SUMO. Las ligasas de SUMO E3, tales como los miembros de la familia de PIAS (inhibidor de la proteína de STAT activado) y RanBP3 (proteína de unión a Ran 3), contienen un motivo SP-RING (Nuevo Gen Realmente Interesante) que es esencial para su función (Kahyo et al., 2001 Schmidt y Muller, 2002). Un grupo distinto de ligasas de SUMO está compuesto por la proteína Polycom (Pc2) que está asociada al silenciamiento génico (Kagey et al., 2003). La SUMOilación es una modificación altamente reversible que está mediada por cisteína proteasas específicas de SUMO (SUSP o SEN). En mamíferos se notificaron inicialmente 6 SENP, de las que SENP-1-SENP3 y SENP5-SENP7 son específicas para las proteínas
45 SUMO. La localización de los SENP y la especificidad para las isoformas de SUMO determina su acción (Yeh, 2009). El mapeo inicial de la modificación en los restos de lisina de SUMO permitió la identificación de una secuencia consenso de SUMO compuesto por ψKxE, en el que ψ es un aminoácido hidrófobo grande y x cualquier aminoácido (Rodriguez et al., 2001; Xu et al., 2008). Dicho consenso se descubrió en RanGAP1, PML, p53 y IκBα, entre otras proteínas e interacciona directamente con Ubc9 (Sampson et al., 2001; Wilkinson y Henley, 2010,). La lisina diana entra en el bolsillo catalítico de Ubc9 mientras que los restos hidrófobos y acídicos interaccionan con la superficie de esta E2 (Bernier-Villamor et al., 2002). Sin embargo, no todos los sitios de SUMOilación se ajustan al consenso canónico, la modificación solamente ocurrirá si el consenso presenta una región desestructurada o una superficie de sustrato bien expuesta (Geiss-Friedlander y Melchior, 2007).
55 La estimulación de las proteínas SUMO por sus sustratos podría alcanzarse mediante estrés celular, tales como el choque térmico. Golebiowski y colegas (Golebiowski, 2009) describieron un cambio cuantitativo en los perfiles globales de SUMOilación durante el choque térmico, debido a que los experimentos anteriores demostraron un aumento rápido y reversible de los conjugados de SUMO-2 y SUMO-3 cuando las células se desplazaron de la temperatura normal de crecimiento a 37 ºC a la estresante de 43 ºC (Saitoh y Hinchey, 2000).
Las consecuencias de la SUMOilación de una nueva diana proteica son difíciles de predecir ya que los cambios de la conformación, creación o de enmascaramiento de las superficies de interacción pueden afectar a la actividad, estabilidad y localización de proteínas modificadas. Las proteínas SUMOiladas se reconocen por los motivos de interacción con SUMO (SIM) presentes en una gran diversidad de proteínas que incluyen la de leucemia 65 promielocítica (PML), proteína asociada al dominio de muerte (Daxx), enzima activadora de modificador similar a ubiquitina 2 (UBA2), inhibidores de las proteínas de STAT activado (PIAS) y las ligasas de la proteína de los dedos
de RING 4 (RNF4) (Geiss Friedlander y Melchior 2007). Los SIM contienen un núcleo hidrófobo flanqueado por restos acídicos (E/D) y uno de serina (Song et al., 2004; Hecker et al., 2006). Los motivos SIM forman una lámina β que se une en orientación paralela o antipararalela entre la hélice α y una hebra β de SUMO (Figura 3).
5 La afinidad de SIM y SUMO habitualmente es baja, alrededor del intervalo micromolar alto, lo que se debe normalmente a la superficie reducida de interacción. Para aumentar dicha afinidad, proteínas tales como la ligasa dependiente de SUMO RNF4 contiene 4 dominios SIM. Parece que SIM2 y SIM3 juegan un papel más importante en la captura de proteínas SUMOiladas (Tatham et al., 2008). De este modo la PML SUMOilada se dirige a la degradación por el sistema ubiquitina-proteosoma, proporcionando la primera prueba molecular sobre cómo pueden contribuir las moléculas de SUMO a regular la estabilidad proteica. Se han publicado columnas de afinidad que contienen 4 SIM derivados del fragmento de origen natural 32-133 de RNF4 (Bruderer R et al. 2011) y que están comercializadas por BIOMOL (Affinity research).
Descripción de la invención Breve descripción de la invención
Basándose en la observación de que la proteína natural RNF4 (GeneBank ID: 6047) contiene más de un SIM, la presente invención genera proteínas con motivos de afinidad con SUMO adicionales. Estas proteínas manipuladas genéticamente deberían aumentar la afinidad de los SIM individuales para interaccionar con dianas de SUMO modificadas, permitiendo el estudio de los mecanismos de post-modificación que conectan las cascadas de señalización con funciones efectoras. De acuerdo con las estructuras moleculares descritas y publicadas para SUMO y los dominios SIM (Figura 3), se esperaba una interacción cooperativa entre las moléculas de SUMO y estas trampas de SUMO diseñadas en la presente invención. Esta invención muestra los polipéptidos que se divulgan en
25 la presente invención, de aquí en adelante citados como motivos de interacción con SUMO en tándem (TSIM) o entidades de unión a SUMO (SUBE) indistintamente, que expresan más de cuatro SIM organizados en tándem, preferentemente, al menos, ocho SIM organizados en tándem. Estos SIM en tándem se pueden usar eficazmente para capturar y analizar proteínas SUMOiladas in vitro y/o ex vivo. Además, los TSIM de la presente invención muestran una capacidad mayor para purificar proteínas SUMOiladas.
De acuerdo con la invención, la expresión "in vitro" se refiere a procesos biológicos o reacciones que se realizan usando componentes de un organismo que se han aislado de sus contextos biológicos habituales a fin de permitir un análisis más detallado o más conveniente que los que se pueden realizar con organismos completos, en un ambiente artificial, es decir un laboratorio.
35 De acuerdo con la invención, la expresión "ex vivo" se refiere a un proceso que tiene lugar fuera de un organismo. Particularmente, este término se refiere a la experimentación o mediciones hechas en o sobre una muestra o tejido en un ambiente artificial fuera del organismo con la mínima alteración de las condiciones naturales. Las muestras o tejidos se pueden extraer por cualquier método conocido y usarse para el mismo fin en el estado de la técnica.
De acuerdo con la invención, el término "tándem" se refiere a la existencia en el mismo ADN o secuencia proteica, de al menos dos o más fragmentos distintos (nucleótidos o aminoácidos), cercanos entre sí pero separados por enlazadores o espaciadores, en alternancia. Particularmente, en la presente invención, el término tándem se refiere a más de cuatro repeticiones de SIM, preferentemente al menos, ocho repeticiones de SIM, más preferentemente
45 cuatro repeticiones de SIM2 (SEC ID O: 10) y cuatro repeticiones de SIM3 (SEC ID O: 12), ambas secuencias de la proteína RNF4 (GeneBank ID: 6047), que están organizadas, de modo alternativo en SIM2-enlazador-SIM3enlazador-SIM2-enlazador-SIM3-enlazador-SIM2-enlazador-SIM3-enlazador-SIM2-enlazador-SIM3, donde los enlazadores son bien enlazadores naturales o artificiales.
Para el fin de la presente invención el término "comprende" o "comprender", a lo largo de la presente descripción de patente, incluye, específicamente, el término "consiste" o "consiste en", cuando se refiere, particularmente, a los motivos de interacción con SUMO (SIM) y a las secuencias biológicas. Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende más de cuatro motivos de interacción con SUMO (SIM), donde dichos motivos de interacción con SUMO se unen entre sí por una secuencia enlazadora de
55 aminoácidos artificial (no natural) o por una natural. Preferentemente, los motivos de interacción con SUMO se organizan en tándem y más preferentemente el polipéptido divulgado en la presente invención comprende al menos ocho motivos de interacción con SUMO (SIM) organizados en tándem.
Por lo tanto, se ordenaron ocho motivos SIM en tándem obtenidos mediante cuatro repeticiones de la secuencia de SIM2 (SEC ID NO: 10) y la secuencia de SIM3 (SEC ID NO: 12 de RNF4 (GeneBank ID: 6047), espaciados bien por el enlazador natural o un enlazador de poliglicina artificial (Figura 4). Estas construcciones denominadas TSIM1 o SUBE1 (SEC ID NO: 7) y TSIM2 o SUBE 2 (SEC ID NO: 9) respectivamente, se clonaron en un vector de expresión de proteína GST (pGEX6P1 SV5 His6) (SEC ID NO: 5). Esta proteína permite la purificación de los TSIM o SUBE a través de una columna de Glutatión-Sepharose (Figura 5). Además de los SIM, este vector permite la expresión de 65 un marcador de His6 N-terminal y epítopo C-terminal reconocidos por anticuerpos específicos (Figura 6). Estos marcadores son útiles para verificar la integridad de las trampas por análisis de transferencia de Western y para
considerar etapas adicionales de purificación por inmunoprecipitación, cuando fuera necesario. Las etiquetas también permiten los procedimientos de inmunodetección (ELISA) y el estudio de la distribución subcelular por inmunofluorescencia indirecta. Otra ventaja de esta construcción es la posibilidad de usar la escisión por proteasas de precisión que eliminan la GST después de la incubación con esta enzima específica. Además, las TSIM1 o 5 SUBE1 (SEC ID NO: 7) contienen un enlazador natural, presente en RNF4, entre las secuencias SIM y TSIM2 o SUBE2 (SEC ID NO: 9) contienen enlazadores de poliglicina sintéticos entre las secuencias SIM. Gracias a los enlazadores sintéticos de poliglicina las TSIM2 o SUBE2 pueden capturar un amplio espectro de proteínas SUMOiladas. Además, en las trampas que combinan TSIM1 (SUBE1) con TSIM2 (SUBE2), el espectro de proteínas SUMOiladas para detectar y/o aislar aumenta con respecto al uso de trampas basadas en TSIM1 (SUBE1) o TSIM2
10 (SUBE2), de manera independiente.
En un segundo aspecto, la invención se refiere al uso de un polipéptido de acuerdo con la invención para el aislamiento de proteínas SUMOiladas.
15 En un aspecto adicional, la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de acuerdo con la invención.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a una construcción génica que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención.
20 En un aspecto adicional, la invención se refiere a un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos o una construcción génica de acuerdo con la invención.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a una célula que comprende una secuencia de nucleótidos, o una 25 construcción génica, o un vector de acuerdo con la invención.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un animal no humano que comprende una secuencia de nucleótidos, o una construcción génica, o un vector, o una célula de acuerdo con la presente invención.
30 En un aspecto adicional, la invención se refiere a un proceso para obtener un polipéptido de acuerdo con la presente invención, que comprende cultivar una célula de acuerdo con la presente invención en condiciones que permitan producir dicho polipéptido y, si se desea, recuperar dicho polipéptido del medio de cultivo.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método in vitro para el aislamiento de una proteína SUMOilada 35 de una muestra que comprende
i) incubar un polipéptido divulgado en la presente invención con dicha muestra en condiciones que permitan que dicho polipéptido interaccione con dicha proteína SUMOilada presente en dicha muestra; y ii) recuperar dicha proteína SUMOilada que se une a dicho polipéptido.
40 En un último aspecto, la invención se refiere a un kit que incluye un kit de diagnóstico, que comprende un polipéptido de acuerdo con la presente invención, para la detección/aislamiento de proteínas sumoiladas.
Descripción de las figuras
45 Figura 1: Comparación de SUMO y ubiquitina. (a) Alineamiento estructural de los esqueletos de SUMO-1 (gris) y ubiquitina (negro) de la base de datos VAST (NCBI). (b) El alineamiento de secuencias de la ubiquitina (Ub), SUMO-1, SUMO-2 y SUMO-3 de H. sapiens y la proteína SUMO de S. cerevisiae Smt3 se hizo usando ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). Las posiciones que son idénticas en todas las secuencias
50 están sombreadas en color oscuro, y las posiciones conservadas se incluyen en recuadros. Las posiciones que son idénticas en al menos tres de las proteínas SUMO, pero no en Ub, están sombreadas en gris (Jonhson, 2004).
Figura 2: Ciclo de SUMO. La conjugación de SUMO está mediada por la enzima activadora de SUMO (SAE) o
55 E1 y la enzima conjugadora (E2) Ubc9. Las ligasas E3 de SUMO son distintas y específicas para cada reacción. La maduración y el reciclaje de las moléculas de SUMO están mediados por cisteína proteasas específicas de SUMO (SENP). Los sustratos modificados por SUMO conectan con múltiples funciones.
Figura 3: Modelo de la estructura de SUMO e interacción con los SIM. Estructura de lazo del SIM de PIASx 60 unido a la molécula de SUMO1 de acuerdo con la estructura publicada PDB: 2ASQ (Miteva et al., 2010).
Figura 4: Estructura, secuencias de ADN y aminoácidos de las trampas de SUMO (TSIM). Los dos tipos de trampas de SUMO contienen los dominios SIM 2 y 3 de la proteína RNF4 (subrayado) y están espaciadas bien por los enlazadores naturales (TSIM1 o SUBE1) o bien por los enlazadores artificiales (TSIM2 o SUBE2).
Figura 5: Esquema de la estrategia para la preparación, purificación y detección de las trampas de SUMO TSIM. La parte superior ilustra las etapas de la purificación de TSIM para usar como columnas de afinidad.
Figura 6: Detección de las trampas de SUMO TSIM. Detección de proteínas purificadas GST, TSIM1 (SUBE1) 5 y TSIM2 (SUBE2) detectadas por A) azul de Coomassie, B) por transferencia de Western con anticuerpos anti-GST y C) anti-SV5. Los números de la parte izquierda de las fotografías indican el marcador de peso molecular.
Figura 7: Representación esquemática del ensayo de interacción de proteínas usando TSIM. Después de la lisis celular, las TSIM son capaces de capturar proteínas SUMOiladas por la afinidad que existe entre los dominios SIM que constituyen las TSIM.
Figura 8: Captura de PML SUMOilada, y de las cadenas SUMO usando las TSIM. (A) Se puede purificar PML SUMOilada a partir de extractos de células MCF7 antes y después del tratamiento con 1 µM de Adriamicina (ADA), usando TSIM1 (SUBE 1) pero no TSIM 2 (SUBE2). (B) La asociación de las TSIM1 (SUBE1) con PML es
15 más fuerte que la que se observa con las TSIM2 (SUBE2) o el control de GST. (C) La cadenas de PoliSUMO se pueden purificar por TSIM1 (SUBE1) a partir de una reacción de SUMOilación in vitro usando solamente SUMO1, SUMO2, SUMO3 o una mezcla SUM02/SUM03. Se usó GST como control negativo. Los números de la parte izquierda de las fotografías indican el marcador de peso molecular. FT: flujo continuo, fracción sin retener en la columna de purificación (ensayo de interacción).
Figura 9: Análisis de las cadenas artificiales de SUMO usando TSIM. (A) La capacidad de las TSIM para interaccionar con una fusión SUMO-2 que contiene 4 restos se evaluó mediante un ensayo de interacción con GST. Se usó GST como control negativo. Los números de la parte izquierda de las fotografías indican el marcador de peso molecular. (B) La afinidad de ambas TSIM para la fusión de SUMO de estimó por resonancia
25 de plasmón superficial (RPS). Las afinidades estimadas para TSIM1 (SUBE1) y TSIM2 (SUBE2) fue de 42,5 μM y >300 μM respectivamente. EN: entrada; FT: flujo continuo, fracción sin retener en la columna de purificación (ensayo de interacción).
Figura 10: Acumulación de proteínas SUMOiladas después del choque térmico a 43 ºC e inhibición del proteosoma con el tratamiento con MG-132. Se estresaron las células HeLa a 43 °C (A, B) o se trataron con 20 μM del inhibidor del proteosoma MG132 (C, D) durante los tiempos indicados. Después de la lisis celular, los extractos celulares totales se analizaron por transferencia de Western con anticuerpos anti SUMO-1 (A, C) o anti SUMO-2/3 (B, D). Los números de la parte izquierda de las fotografías indican el marcador de peso molecular. Se usó Anti-GAPDH como control de carga.
35 Figura 11: Captura y análisis de proteínas SUMOiladas de extractos celulares. Las TSIM fueron capaces de efectuar la interacción con las proteínas SUMOiladas de los extractos Hela, después de 30 minutos de tratamiento con 20 μM de MG-132, seguidos de 60 minutos de choque térmico (43 °C) para aumentar el nivel de conjugados SUMOilados. Se usaron dos condiciones de tampón de extracción/unión. A) Tampón que contenía inhibidores de fosfatasas pero no NaCl. B) Tampón que contenía NaCl 75 mM. EN-entrada. Fracciones unidascapturadas. GST como control negativo. Los números de la parte izquierda de las fotografías indican el marcador de peso molecular.
Figura 12: La inhibición de las hidrolasas de SUMO favorece la captura mediada por TSIM de proteínas
45 SUMOiladas. Las células HeLa se trataron con 20 μM de MG-132, seguido de 60 minutos de choque térmico (43 °C). Diez minutos antes de la lisis, las células fueron tratadas (+) o no (-) con inhibidor de proteasas PR619 a 100 μM. Las fracciones de TSIM unida se incubaron frente al anticuerpo anti-SUMO 2/3. Los números de la parte izquierda de las fotografías indican el marcador de peso molecular.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere al papel de la SUMOilación de proteínas en el control de múltiples procesos vitales, particularmente al uso potencial de los SIM para aislar dianas SUMOiladas. La invención ha alcanzado un aumento de la afinidad para proteínas SUMOiladas mediante la organización artificial de los SIM en tándem (TSIM o SUBE). 55 La invención ha usado SIM2 (SEC ID NO: 10) y SIM3 (SEC ID NO: 12) de RNF4 ya que estos muestran una capacidad mayor para interaccionar con proteínas SUMOiladas (Tatham et al., 2008). Usando el tándem natural de SIM2 y SIM3 de la ligasa de ubiquitina dependiente de SUMO RNF4, se ha multiplicado hasta 4 veces esta secuencia para obtener ocho SIM organizados en tándem en cada trampa SUMO. Los ADN que codifican dichos motivos se clonaron uno después del otro con un modo de orientación 5’-3’. Una primera realización se refiere a una versión de TSIM (SUBE) denominada TSIM1 (SUBE1) (SEC ID NO: 6), que mantiene los enlazadores naturales presentes en RNF4 mientras que una segunda realización contiene un enlazador de poliglicina artificial y se denomina TSIM2 (SUBE2) (SEC ID NO: 8) (Figura 4). La flexibilidad de los enlazadores artificiales introducidos en la TSIM2 (SUBE2) aumenta su capacidad de capturar una mayor gama de proteínas SUMOiladas no relacionadas específicamente con RFN4. Además, la invención demuestra que las TSIM (SUBE) se pueden usar para estudiar 65 procesos regulados por SUMO bajo distintas situaciones de estrés celular. Por lo tanto, las TSIM (SUBE) de acuerdo con la presente invención son herramientas moleculares útiles para capturar e identificar proteínas poliSUMOiladas a
partir de los extractos celulares y a partir de ensayos in vitro.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende más de cuatro motivos de interacción con SUMO (SIM), en el que dichos motivos de interacción con SUMO se unen entre sí por una secuencia 5 enlazadora de aminoácidos artificial o por una natural. Preferentemente, los motivos de interacción con SUMO (SIM) se organizan en tándem.
En una realización particular de la presente invención, el polipéptido comprende al menos ocho motivos de interacción con SUMO (SIM) organizados en tándem, en el que dichos motivos de interacción con SUMO se unen entre sí por una secuencia enlazadora de aminoácidos artificial o por una natural.
Los motivos de interacción con SUMO se pueden definir como porciones segmentadas de una secuencia polipeptídica que reconoce e interacciona con proteínas SUMOiladas. En una realización particular de la invención, dicho motivo de interacción con SUMO se selecciona del grupo de proteínas que presentan dichos motivos que
15 comprenden, entre otras: PML (Proteína de leucemia promielocítica), Daxx (proteína asociada al dominio de muerte), UBA2 (enzima modificadora similar a ubiquitina 2), PIAS (inhibidor de la proteína de STAT activado), ligasa RNF4 (proteína de los dedos de Zn ring 4) y/o variantes de equivalentes funcionales de las mismas. En una realización preferente de la invención, dicho motivo de interacción con SUMO se selecciona del grupo que comprende un SIM1, SIM2, SIM3, SIM4 y/o combinaciones de los mismos. En una realización más preferente, los motivos de interacción con SUMO son SIM2 (SEC ID NO: 10) y/o SIM3 (SEC ID NO: 12) de la proteína ligasa RNF4 (GeneBank ID: 6047) o variantes funcionalmente equivalentes de la misma.
La expresión "funcionalmente equivalente" como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido de acuerdo con la invención que preferentemente conserva al menos una función biológica o actividad de la secuencia 25 de aminoácidos específica de un motivo de interacción con SUMO, preferentemente la capacidad de unirse a SUMO
o a una proteína SUMOilada.
En otra realización particular de la invención, el polipéptido de la invención comprende cuatro motivos SIM2 y cuatro motivos SIM3 y/o variantes de funcionalmente equivalentes de los mismos. En otra realización preferente de la invención, dicho polipéptido se selecciona del grupo que consiste en SEC ID NO: 7 y/o SEC ID NO: 9.
Tal como se menciona anteriormente, en una realización particular, el polipéptido de la invención comprende al menos ocho motivos de interacción con SUMO organizados en tándem que se unen entre sí por medio de una secuencia enlazadora de aminoácidos artificial o por una natural.
35 De acuerdo con la invención, la expresión "enlazador o espaciador" como se usa en el presente documento, se refiere a una región que proporciona espacio entre los motivos de interacción con SUMO. De este modo se asegura que la estructura secundaria de los motivos de interacción con SUMO no esté afectada por la presencia de motivos de interacción con SUMO próximos, de modo que se mantenga la función del motivo de interacción con SUMO. Preferentemente, el enlazador o espaciador es de naturaleza polipeptídica. De este modo la secuencia del ácido nucleico que codifica el enlazador se puede insertar entre las secuencias que codifican el motivo de interacción con SUMO y se puede producir la construcción completa al mismo tiempo. El péptido enlazador preferentemente comprende al menos dos aminoácidos, tal como como al menos tres aminoácidos, por ejemplo al menos cinco aminoácidos, tal como al menos diez aminoácidos, por ejemplo al menos 15 aminoácidos, tal como al menos 20
45 aminoácidos, por ejemplo al menos 30 aminoácidos, tal como al menos 40 aminoácidos, por ejemplo al menos 50 aminoácidos, tal como al menos 60 aminoácidos, por ejemplo al menos 70 aminoácidos, tal como al menos 80 aminoácidos, tal como al menos 90 aminoácidos tal como aproximadamente 100 aminoácidos. El enlazador o espaciador puede estar ligado al flanqueo del motivo de interacción con SUMO a través de enlaces covalentes y preferentemente el enlazador o espaciador es esencialmente no inmunogénico, y/o no es propenso a la escisión proteolítica, y/o no comprende ningún resto de cisteína. Los siguientes son ejemplos de secuencias enlazadoras, que se creen especialmente preferentes para la unión con un motivo de interacción con SUMO. Los ejemplos preferentes de péptidos enlazadores o espaciadores incluyen aquellos que se han usado para unir proteínas sin alterar sustancialmente la función de las proteínas unidas o al menos sin alterar sustancialmente la función de una de las proteínas unidas. Más preferentemente los enlazadores o espaciadores se han usado para unir proteínas que
55 comprenden estructuras superenrolladas.
De acuerdo con la invención, la expresión "enlazador o espaciador flexible" como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de región bisagra entre los motivos de interacción con SUMO, que les permite moverse independientemente unos de los otros mientras que se mantiene la forma tridimensional de los dominios individuales. En ese sentido, un enlazador de secuencia flexible de acuerdo con la invención podría ser una región bisagra caracterizada por una laxitud estructural que permite este movimiento.
De acuerdo con la invención, la expresión "enlazador o espaciador artificial (no natural)" como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido enlazador con una longitud de al menos 2 aminoácidos. En una realización más 65 preferente, el péptido enlazador artificial comprende 2 o más aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste en glicina, serina, alanina y treonina. En una realización preferente de la invención, dicho enlazador artificial
es un enlazador de poliglicina. En una realización más preferente de la invención, dicho enlazador artificial de poliglicina es un enlazador flexible.
De acuerdo con la invención, la expresión "enlazador natural o espaciador" como se usa en el presente documento,
5 se refiere a una secuencia natural presente en proteínas de origen natural que presentan el motivo de interacción con SUMO descrito en la presente invención, incluyendo PML, Daxx, UBA-2, PIAS y RNF4. En una realización preferente de la invención, el enlazador natural es el enlazador presente en la proteína RNF4.
En una realización particular de la invención, los polipéptidos de la invención además comprenden la secuencia de aminoácidos de una etiqueta. Dicha etiqueta incluye pero sin limitación: etiquetas de polihistidina (etiquetas-His) (por ejemplo H6 y H10, etc.) u otras etiquetas para el uso en sistemas de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC), por ejemplo, las columnas de afinidad Ni2+, etc., fusiones de Glutatión S-Transferasa (GST), fusiones de proteína de unión a maltosa (MBP), etiquetas de estreptavidina, la secuencia diana de biotinilización del péptido sustrato de BirA (BSP) de la enzima bacteriana BirA y las etiquetas de epítopos que están dirigidos por
15 anticuerpos (por ejemplo etiquetas c-myc, etiquetas FLAG, entre otras). Dichas etiquetas peptídicas se pueden usar para la purificación, inspección, selección y/o visualización de la proteína de fusión de la invención. En una realización particular de la invención, dicha etiqueta es una etiqueta de detección y/o una etiqueta de purificación. Los inventores han mostrado (ver Ejemplo) que cuando el polipéptido de la invención comprende una etiqueta His6x N-terminal y un epítopo c-terminal, estos pueden reconocerse por anticuerpos específicos que permiten la inmunoprecipitación, inmunodetección (ELISA y transferencia de Western) y distribución subcelular por inmunofluorescencia indirecta. Por lo tanto, en una realización preferente de la invención, dicha etiqueta de detección es la etiqueta de epítopo Sv5 y dicha etiqueta de purificación es una etiqueta de polihistidina.
La presente invención no solamente se refiere a las secuencias de aminoácidos específicas que se divulgan en el
25 presente documento, sino también a variantes de las mismas, específicamente a variantes funcionalmente equivalentes de las mismas, tales como fragmentos, análogos y/o derivados. Por lo tanto, una variante de una secuencia de aminoácidos específica preferentemente retiene al menos una función biológica o actividad de la secuencia de aminoácidos específica, preferentemente la capacidad de unirse a SUMO o a una proteína SUMOilada.
Las variantes de los polipéptidos de acuerdo con la presente invención pueden ser (i) una en la que uno o más de los restos de aminoácidos se sustituyen con un resto de aminoácido conservado o no conservado (preferentemente un resto de aminoácido conservado) y dicho resto de aminoácido sustituido puede ser o no uno codificado por el código genético, (ii) una en la que hay uno o más restos de aminoácidos modificados, por ejemplo, restos que se
35 modifican por la adhesión de grupos sustituyentes, (iii) una en la que el polipéptido es una variante alternativa de corte y empalme del polipéptido de la presente invención, (iv) fragmentos de los polipéptidos y/o (iv) una en la que el polipéptido se fusiona con otro polipéptido, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplee para la purificación (por ejemplo, etiqueta His) o para la detección (por ejemplo, etiqueta de epítopo Sv5). Los fragmentos incluyen polipéptidos generados por medio de escisión proteolítica (incluyendo proteólisis multi-sitio) de una secuencia original. Las variantes pueden modificarse post-traduccionalmente, o químicamente. Se considera que dichas variantes están dentro del alcance de los expertos en la materia a partir de la enseñanza del presente documento.
Como se conoce en la técnica la "similitud" entre dos polipéptidos se determina mediante la comparación de la
45 secuencia de aminoácidos y sus aminoácidos conservados sustitutos de un polipéptido respecto a una secuencia de un segundo polipéptido. Las variantes se definen por incluir secuencias polipeptídicas distintas de la secuencia original, preferentemente distintas de la secuencia original en menos del 40 % de los restos por cada segmento de interés, más preferentemente distintas de la secuencia original en menos del 25 % de los restos por cada segmento de interés, más preferentemente distintas en menos del 10 % de los restos por cada segmento de interés, más preferentemente distintas de la secuencia proteica original en solamente unos pocos restos por cada segmento de interés y al mismo tiempo con suficiente homología con la secuencia original para conservar la funcionalidad de la secuencia original y/o la capacidad para unirse a SUMO o a una proteína SUMOilada. La presente invención incluye secuencias de aminoácidos que son al menos el 60 %, 65 %, 70 %, 72 %, 74 %, 76 %, 78 %, 80 %, 90 % o 95 % similares o idénticas a la secuencia de aminoácidos original. El grado de identidad entre dos polipéptidos se
55 determina usando algoritmos computarizados y métodos bastante conocidos por las personas expertas en la materia. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferentemente usando el algoritmo BLASTP (Manual BLAST, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., 1990).
Los polipéptidos de la invención se pueden modificar post-traduccionalmente. Por ejemplo, las modificaciones posttraduccionales que están dentro del alcance de la presente invención incluyen la escisión del péptido señal, glucosilación, acetilación, isoprenilación, miristoilación proteolítica, plegamiento proteico y procesamiento proteolítico, etc. Algunas modificaciones o acontecimientos de procesamiento requieren la introducción de maquinaria biológica adicional. Por ejemplo, acontecimientos de procesamiento, tales como la escisión del péptido señal y la glucosilación del núcleo, se examinan añadiendo membranas microsómicas caninas o extractos de
65 huevos de Xenopus (Patente de EE.UU. Nº 610348) a una reacción de traducción convencional.
Los polipéptidos de la invención pueden incluir aminoácidos artificiales formados por modificación post-traduccional
o introduciendo aminoácidos artificiales durante la traducción. Está disponible una diversidad de enfoques para introducir aminoácidos artificiales durante la traducción proteica. A modo de ejemplo, los ARNt especiales, tales como los ARNt que tienen propiedades supresoras, ARNt supresores, se han usado en el proceso de
5 reemplazamiento de aminoácidos no nativos de sitio dirigido (RAANS). En el RAANS, se requiere un único codón en el ARNm y el ARNt supresor, que actúan para dirigir un aminoácido no nativo a un único sitio durante la síntesis proteica (WO90/05785). Sin embargo, el ARNt supresor no debe ser reconocible por las aminoacil ARNt sintetasas presentes en el sistema de traducción proteica. En ciertos casos, se puede formar un aminoácido no nativo después de que la molécula de ARNt se aminoacile usando reacciones químicas que modifican específicamente el aminoácido nativo y que no alteran significativamente la actividad funcional del ARNt aminoacilado. Estas reacciones se citan como modificaciones post-aminoacilación. Por ejemplo, el grupo amino épsilon de la lisina unida a su ARNt afín (tARNLYS), se podría modificar con una etiqueta aminoespecífica de fotoafinidad.
Como se explica anteriormente, los polipéptidos de la invención se pueden fusionar con otro polipéptido o etiqueta,
15 tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para la purificación o para la detección. En una realización particular, el polipéptido de la invención comprende la etiqueta de proteína glutatión-S-transferasa que proporciona la base para la purificación rápida por alta afinidad del polipéptido de la invención. Sin duda, esta proteína de fusión GST se puede purificar después a partir de las células por medio de su alta afinidad por el glutatión. Las esferas de agarosa se pueden acoplar a glutatión, y dichas esferas de agarosa con glutatión se unen con proteínas GST. Por lo tanto, en una realización particular de la invención, el polipéptido de la invención se une a un soporte sólido. En una realización preferente, si el polipéptido de la invención comprende un resto GST, el polipéptido se acopla a un soporte modificado con glutatión. En un caso particular, dicho soporte modificado con glutatión es una esfera de agarosa con glutatión. Adicionalmente, se puede incluir una secuencia que codifique un sitio de escisión por proteasas entre dicha etiqueta de afinidad y la secuencia polipeptídica, permitiendo de este
25 modo la eliminación de la etiqueta de unión después de la incubación con esta enzima específica y facilitando por lo tanto la purificación de la proteína de interés correspondiente.
En una realización particular, el polipéptido de la invención comprende ocho motivos de interacción con SUMO adheridos a través de su N-terminal a un resto de GST y a través de su C-terminal a una etiqueta de detección, en particular, la etiqueta Sv5 y comprende, adicionalmente, un sitio de escisión por proteasas entre el resto GST y el primer dominio SUMOilado y una etiqueta de polihistidina entre el sitio de escisión por proteasas y el primer motivo de interacción con SUMO. Se puede ver una representación esquemática de dicha una construcción en la Figura 5. En realizaciones preferentes, el polipéptido de fusión comprende cuatro motivos de interacción con SUMO, preferentemente motivos SIM2 derivados de RNF4 y cuatro motivos de interacción con SUMO, preferentemente
35 motivos SIM3 derivados de RNF4 (Figura 5), que están organizados, de modo alternativo SIM2-enlazador-SIM3enlazador-SIM2-enlazador-SIM3-enlazador-SIM2-enlazador-SIM3-enlazador-SIM2-enlazador-SIM3, en el que los enlazadores son bien enlazadores naturales o artificiales.
Como se ha mencionado anteriormente, los inventores han mostrado que los polipéptidos de la invención se pueden unir a proteínas SUMOiladas. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere al uso de los polipéptidos de la invención para el aislamiento de proteínas SUMOiladas. En una realización particular, el aislamiento de dichas proteínas SUMOiladas se lleva a cabo in vitro y/o ex vivo, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 1 adjunto a la presente invención.
45 En otro aspecto, la invención se refiere al uso del polipéptido de la invención para la identificación de los sustratos de SUMO. En una realización particular, la identificación de los sustratos de SUMO se selecciona del grupo de proteínas que consisten en el supresor tumoral p53 y el inhibidor de NF-κB IκBα.
En otro aspecto, la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la invención. En una realización particular, dicha secuencia se selecciona del grupo que comprende SEC ID NO: 6 y/o SEC ID NO: 8.
Las secuencias de nucleótidos de la invención como alternativa pueden tener variaciones de secuencia con respecto a las secuencias de nucleótidos originales (SEC ID NO: 6 y SEC ID NO: 8), por ejemplo, sustituciones, inserciones
55 y/o deleciones de uno o más nucleótidos, con la condición de que el polinucleótido resultante codifique un polipéptido de acuerdo con la invención. Por lo tanto, el alcance de la presente invención incluye secuencias de nucleótidos que son sustancialmente homólogas a las secuencias de nucleótidos de la invención y codifican un polipéptido de la invención.
En el sentido usado en esta descripción, una secuencia de nucleótidos es "sustancialmente homóloga" a cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas anteriormente cuando su secuencia de nucleótidos tiene un grado de identidad con respecto a la secuencia de nucleótidos de la invención de al menos el 60 %, ventajosamente de al menos el 70 %, preferentemente de al menos el 85 %, y más preferentemente de al menos el 95 %. Una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente homóloga a la secuencia de nucleótidos de la invención puede aislarse 65 típicamente de un organismo productor del polipéptido de la invención basándose en la información contenida en dicha secuencia de nucleótidos, o se constituye basándose en la secuencia de ADN que se muestra en SEC ID NO:
6 y SEC ID NO: 8, por medio de la introducción de sustituciones conservativas o no conservativas, por ejemplo. Otros ejemplos de posibles modificaciones incluyen la inserción de uno o más nucleótidos en la secuencia, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la secuencia, o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos o dentro de la secuencia. El grado de identidad entre dos polinucleótidos se determina
5 usando algoritmos computarizados y métodos bastante conocidos por las personas expertas en la materia. La identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina preferentemente usando el algoritmo BLASTN (Manual BLAST, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., 1990).
En otro aspecto, la invención se refiere a una construcción génica, de aquí en adelante construcción génica de la invención, que comprende dichas secuencias de nucleótidos de la invención, En una realización particular, dicha construcción génica se une operativamente a elementos de control de la transcripción, y opcionalmente de la traducción.
La construcción génica de la invención puede incorporar una secuencia reguladora unida operativamente a la
15 secuencia reguladora de la expresión de la secuencia de nucleótidos de la invención, formando de este modo un casete de expresión. Como se usa en esta descripción, la expresión "unida operativamente" significa que el polipéptido de la invención, codificado por la secuencia de nucleótidos de la invención, se expresa en la fase de lectura correcta bajo el control de secuencias de control de la expresión o reguladoras.
Las secuencias control son secuencias que controlan y regulan la transcripción y cuando es apropiado, la traducción del polipéptido de la invención, e incluyen secuencias promotoras, secuencias que codifican reguladores transcripcionales, secuencias de unión a ribosomas (RBS) y/o secuencias de terminación de la transcripción. En una realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en organismos y células procariotas, por ejemplo, bacterias, etc., mientras que en otra realización particular, dicha secuencia de control de expresión es 25 funcional en organismos y células eucariotas, por ejemplo, células de insecto, células vegetales, células de mamíferos, etc. Los ejemplos de promotores bien conocidos adecuados para llevar a cabo la invención incluyen promotores constitutivos tales como los que se encuentran en algunos virus eucarióticos (poliomavirus, adenovirus, SV40, CMV, virus del sarcoma aviar, virus de la hepatitis B, promotor del gen de la metalotioneína, promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simple, regiones LTR retrovirales, promotor de la inmunoglobulina, promotor de la actina, promotor de EF-1 alfa así como también promotores inducibles en los que la expresión del gen corriente abajo requiere de la adición de una sustancia de una señal exógena al cultivo tal como el promotor de tetraciclina, NFKappaB/luz ultravioleta, Cre/lox, promotores de choque térmico, promotores regulables por ARN polimerasa II descritos en el documento WO/2006/135436 así como promotores específicos de tejido, tales como el promotor PSA descrito en el documento WO2006012221. Ventajosamente, la construcción de la invención además comprende un
35 marcador o gen que codifica un motivo o un fenotipo que permite explorar la célula hospedadora transformada con dicha construcción. En una realización particular, la expresión de dicha construcción génica se controla externamente. En una realización más particular, la expresión se controla externamente usando el sistema de doxiciclina Tet-On.
La construcción génica de la invención puede obtenerse por medio del uso de técnicas bastante conocidas en el estado de la técnica (Sambrook et al., 1989).
La construcción génica de la invención se puede insertar en un vector adecuado. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un vector, de aquí en adelante vector de la invención, que comprende la secuencia de 45 nucleótidos de la invención o construcción génica de la invención. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se introducirá posteriormente. En una realización particular, el vector de la invención es un vector de expresión. Los vectores adecuados para la inserción de la secuencia de nucleótidos de la invención o la construcción génica de la invención son vectores derivados de vectores procarióticos de expresión tales como pUC18, pUC19, pGEX-6P-1, Bluescript y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, CoIE1, PCR1, RP4, vectores fágicos y "lanzadera" tales como pSA3 y pAT28, vectores plasmídicos de expresión en levaduras tales como el plásmido de 2 micrómetros de levadura, plásmido de integración, vectores plasmídicos episómicos en levaduras (YEp), plásmidos similares y centroméricos, vectores de expresión en células de insectos tales como vectores de la serie pAC y de la serie pVL, vectores de expresión en plantas tales como vectores de las series pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE y similares y vectores de expresión en células eucariotas en
55 lugar de basados en vectores virales (adenovirus, virus asociados a adenovirus y retrovirus, y particularmente, lentivirus) y vectores no virales tales como el pSilencer 4.1-CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFI/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, PTRACE-HCMV, pUB6N5-His, pVAX1, pZeoSV2, pCI, pSVL y pKSV-10, pBPV-1, pML2d y pTDT1. A modo ilustrativo, el vector en el que se introduce dicha secuencia de ácido nucleico puede ser un plásmido que esté o no integrado en el genoma de una célula hospedadora cuando se introduce en dicha célula. Los ejemplos ilustrativos no limitantes de vectores en los que se puede insertar la secuencia de nucleótidos de la invención o la construcción génica de la invención incluyen un vector Tet-On inducible para la expresión en células eucariotas.
El vector de la invención se puede obtener por métodos convencionales conocidos por personas expertas en la
65 materia (Sambrook et al., 1989). En una realización particular, dicho vector es un vector útil para transformar células animales.
El vector de la invención se puede usar para transformar, transfectar o infectar células que se pueden transformar, transfectar o infectar con dicho vector. En este sentido, la presente invención también se refiere a una célula que comprende y/o expresa las secuencias de nucleótidos de la invención o una construcción génica de la invención, o un vector de la invención. Dichas células pueden ser procariotas o eucariotas. El vector de la invención se puede
5 usar para transformar células eucariotas tales como células de la levadura Saccharomyces cerevisiae o células de mamíferos, por ejemplo, células epiteliales de riñón 293 o células U2OS, o células HeLa o células procariotas tales como las bacterias Escherichia coli o Bacillus subtilis, por ejemplo.
Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un animal no humano, de aquí en adelante animal no humano de la invención, que comprende y expresa una secuencia de nucleótidos de la invención, o una construcción génica de la invención, o un vector de la invención, o una célula de la invención. En una realización particular de la invención, el animal no humano de la invención es un mamífero, preferentemente un roedor, más preferentemente un ratón o una rata.
15 En otro aspecto, la invención se refiere a un proceso para obtener un polipéptido de la presente invención, que comprende cultivar una célula de la invención en condiciones que permitan producir dicho polipéptido y, si se desea, recuperar dicho polipéptido del medio de cultivo. Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha célula dependerán de las células usadas y son bien conocidas por la persona experta en la materia. El proceso para producir el polipéptido de la invención opcionalmente incluye aislar y purificar dicho péptido de la invención. El polipéptido de la invención se puede purificar a partir del medio de cultivo o de extractos celulares (ver Ejemplo 1). El polipéptido de la invención se captura convenientemente usando una matriz de purificación adecuada, concentrándose, una vez eluido, usando un filtro concentrador de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, Amicon o Millipore Pellicon, como se conoce en el estado de la técnica.
25 En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para el aislamiento de la proteína SUMOilada a partir de una muestra que comprende
i) incubar un polipéptido de la invención con dicha muestra en condiciones que permitan que dicho polipéptido interaccione con al menos una proteína SUMOilada presente en dicha muestra; y ii) recuperar cualquier proteína SUMOilada que se una a dicho polipéptido.
En una realización particular, la etapa de recuperación se lleva a cabo por medio del uso de una columna de afinidad.
35 En una realización particular, dicha muestra es un extracto celular. Como se describe en el Ejemplo 1 adjunto a la presente invención, a fin de purificar la proteína SUMOilada a partir de extractos celulares, las células se pre-tratan primero con un inhibidor del proteosoma. El motivo para esto es que numerosas proteínas ubiquitinadas y SUMOiladas se recambian rápidamente por los proteosomas, haciendo difícil de detectar este acontecimiento transitorio. Por lo tanto en una realización particular de la invención, cuando dicha muestra es un extracto celular, las células se pre-tratan primero con un inhibidor del proteosoma antes de obtener dicho extracto celular. En un caso particular, dicho inhibidor del proteosoma es MG132 o lactacistina.
Un factor adicional a considerar es la presencia de enzimas desubiquitinadoras y desumoilizadoras (isopeptidasas) en el extracto celular, que pueden eliminar las moléculas de ubiquitina y de SUMO de la proteína de interés, 45 previniendo de este modo la detección de las especies ubiquitinadas y SUMOiladas. Estos problemas se pueden evitar, por ejemplo, preparando el tampón de extracción con compuestos nocivos tales como la yodoacetamina (IAA)
o N-etilmaleimida (NEM), que bloquean el resto crítico de cisteína presente en el sito activo de la mayoría de las enzimas de este tipo. Otro aspecto importante a considerar son las condiciones en las que una proteína se ubiquitina, se SUMOila y se degrada, que son críticas para establecer las condiciones que promueven la degradación del sustrato si se detectan las formas ubiquitinadas y SUMOiladas. Otro factor a considerar es la abundancia de la proteína de interés. En algunos casos, se puede evaluar la modificación por ubiquitina y SUMO de una proteína endógena, mientras que en otros, se requiere la sobreexpresión de la proteína diana. Adicionalmente, es necesario desnaturalizar el extracto antes de la purificación de la proteína diana para demostrar que la proteína de interés está ubiquitinada/SUMOilada en sí misma y no simplemente unida a proteínas co-purificadas adicionales
55 que estén ubiquitinadas/SUMOiladas.
Después de recuperar dicha proteína SUMOilada unida a dicho polipéptido, se puede llevar a cabo la elución de dicha proteína de interés por medio de, por ejemplo, la incubación con una enzima específica, tal como una proteasa, cuando el polipéptido de la invención comprende un sitio diana específico para dichas enzimas, facilitando la purificación de la proteína correspondiente, o desubiquitinando/desumoilando la proteína recuperada usando enzimas de desubiquitinación/desumoilación como se describe, por ejemplo, en el documento WO0406514, o como alternativa, usando condiciones desnaturalizantes o por métodos de centrifugación.
En otro aspecto, la invención se refiere a un kit, de aquí en adelante kit de la invención, que comprende el
65 polipéptido de la invención. En la presente invención, un "kit" se entiende como un producto que contiene distintos reactivos para llevar a cabo los métodos de acuerdo con la presente invención. Los kits de la invención pueden
comprender un envase que permita mantener los reactivos dentro de determinados límites. Los materiales adecuados para preparar dichos envases incluyen vidrio, plástico (polietileno, polipropileno, policarbonato y similares), botellas, viales, papel, bolsitas y similares. El kit de la invención puede contener adicionalmente instrucciones para usar los reactivos en el método de la invención. Dichas instrucciones se pueden encontrar en la
5 forma de material impreso o en la forma de un soporte electrónico que puede almacenar instrucciones de modo que puedan leerse por un sujeto, tales como medios de almacenamiento electrónico (discos magnéticos, cintas y similares), medios ópticos (CD-ROM, DVD) y similares. Los medios pueden contener adicionalmente o como alternativa sitios web de Internet que proporcionen dichas instrucciones. En una realización particular, dicho kit además comprende un soporte sólido. En una realización más particular, dicho soporte sólido es agarosa. En otra realización particular, el kit de la invención además comprende todos los elementos necesarios para llevar a cabo el método que se divulga en la presente invención.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deberían considerarse en un sentido limitante, sino más bien en un sentido ilustrativo de la invención.
EJEMPLO 1
Métodos.
Clonaje Molecular de oligonucleótidos sintéticos que codifican SIM2 y SIM3 de RNF4.
Los oligonucleótidos sintéticos que codifican los SIM2 y SIM3 de la proteína RNF4 (GenBank ID: 6047) se clonaron en el vector PGEX-6Pl (Amersham) usando cebadores específicos tal como sigue: para TSIM1 (SUBE1) se usaron
25 cebadores con SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2 y para TSIM2 (SUBE2) cebadores con SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4. Este vector se modificó introduciendo un enlazador, en fase, con una etiqueta His6 y un epítopo SV5 cadena arriba y cadena abajo del sitio de clonación múltiple, respectivamente, conduciendo al vector PGEX-6P1 modificado (SEC ID NO: 5). Dichas modificaciones permiten el reconocimiento de la proteína por anticuerpos específicos. Los fragmentos que codifican los SIM2 (SEC ID NO: 10) y SIM3 (SEC ID NO: 12) de la proteína RNF4 se introdujeron en estas construcciones, separados bien por las secuencias naturales de RNF 4 (TSIM1 o TUBE1) o por un enlazador de poliglicina (TSIM2 o SUBE2) (Figura 4).
Ensayo de interacción de proteínas.
35 A fin de usar las TSIM como columnas de afinidad para realizar el ensayo de interacción de las proteínas SUMOiladas, se cultivaron las células HeLa en medio DMEM (Gibco) complementado con FBS 10 % y el 1 % de antibióticos a 37 °C. Treinta minutos antes de recogerlas, se trató a las células con 20 μM de MG-132 a 37°C y se las estresó durante 60 minutos por choque térmico a 43 °C para inducir los conjugados SUMOilados. Después se realizó la lisis celular bien en fluoruro de sodio 50 μM, pirofosfato de tetrasodio 5 mM, beta-gliceropirofosfato 10 mM, Igepal CA-630 1 %, EDTA 2 mM, Na2HPO4 20 mM/NaH2PO4 20mM pH 7,5, o fluoruro de sodio 25 mM, pirofosfato de tetrasodio 2,5 mM, beta-gliceropirofosfato 5 mM, Igepal CA-630 1 %, EDTA 1mM, Na2HPO4 10mM/NaH2PO4 10mM pH 7,5, Tris 25 mM pH 8,5, NaCl 75 mM, EDTA 2,5 mM, complementado con PMSF 1 mM y cóctel de inhibidor de proteasas completo 1,2 mg/ml (Roche).
45 Se incluyeron o no doscientos microgramos de TSIM1 (SUBE1), TSIM2 (SUBE2) o GST (como control) en el tampón de lisis antes de la sonicación, como se indica en las leyendas de las figuras. La etapa de unión se realizó usando esferas con GST (Biontex) con lavados posteriores con Tris 50 mM pH 8,5; NaCl 50 mM, EDTA 5 mM e Igepal 1 % y se realizó la elución con tampón de Laemmli (Figura 7).
Para la captura de la PML SUMOilada, se estimularon 3 millones de células de cáncer de mama de la línea MCF-7 con UV (25 J/m2) y se incubaron a 37 ºC durante 4 horas. Las células se resuspendieron en 1 ml de tampón de lisis que contenía 50 μM de PR619 (inhibidor de proteasas) y un cóctel de inhibidores de proteasas (Roche). Después se sonicaron las células dos veces durante 15 segundos. Las células lisadas se centrifugaron después durante 10 min a 13000 rpm, 4 ºC. Se guardó una alícuota de sobrenadante (Entrada) y el resto se mezcló con 200 µg de control
55 GST (GST), TSIM1 (SUBE1), TSIM2 (SUBE2) o no TSIM (SUBE) y no estimulación (NE), junto con las esferas con GST rotando 4 h a 4 °C. Las esferas de GST se lavaron después 3 veces con 1 ml de tampón de lavado (tampón de lisis que contenía solamente NaCl 50 mM) y las esferas con GST se resuspendieron en tampón de Laemmli. Para el análisis de transferencia de western, las muestras de entrada y de esferas se separaron en un gel de poliacrilamida al 10 % y las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF a 400 mA durante 2 horas. Se incubó la membrana con anticuerpo anti-PML (Bethyl Laboratories Inc, Tejas, EE.UU.).
Ensayo in vitro de cadenas de SUMO
Para este ensayo, se usó un tampón que contenía un sistema de regeneración de ATP, Tris 50 mM pH 7,5, MgCl2
65 10 mM, ATP 2 mM, fosfato de creatina 10 mM (Sigma), 3,5 U/ml de cretina quinasa (Sigma), y 0,6 U/ml de pirofosfatasa inorgánica (Sigma). Las reacciones de realizaron como se cita: 10 μg de SUMO-1, 2 o 3 o 5 μg (si se
usan en combinación con SUMO-2 y SUMO-3), 0,325 μg de Ubc9 (ligasa de SUMO E2) y 0,08 μg de SAE1/2 purificada (ligasa de Sumo E1) (Biomol). Las reacciones se incubaron a 30 ºC durante 2 horas y se pararon mediante la adición de tampón de carga de la muestra con SDS. Los ensayos de interacción se llevaron a cabo guardando 1/10 de la entrada y uniendo el resto de la reacción con 100 μl de esferas de agarosa con GST y 50 μg 5 de TSIM1 (SUBE1) durante 4 h y/o durante toda la noche a 4 ºC en rotación, con 1 mM de DTT (Ditiotreitol). Después de la unión, se centrifugaron las muestras a 1200 rpm, 5 min a 4 °C. Una pequeña fracción se unió para analizar la fracción no unida, y después las esferas se lavaron 5 veces con 2 ml de PBS 1X con el 0,05 % de Tween
20. Después se eluyeron las muestras en 100 μl (50 μl de BBX3+ 50 μl de PBS/0,05 % de Tween20). Los productos de reacción se resolvieron por SDS-PAGE (10 %).
RESULTADOS
Expresión y purificación de las TSIM.
15 Las proteínas TSIM se expresaron en la cepa BL-21 de Escherichia coli, de acuerdo con procedimientos convencionales. Después de eso, se cosechó el sedimento bacteriano por centrifugación y se realizó la lisis celular en PBS/NaCl 0,5 M por sonicación. Se mantuvo la misma concentración de sal a lo largo del procedimiento incluyendo las condiciones de almacenamiento. Los residuos resultantes se separaron también por centrifugación y el sobrenadante resultante se incubó con esferas de agarosa con GST (Glutatión-S-transferasa). Las TSIM se obtuvieron después por elución usando glutatión reducido. Las proteínas recombinantes se mantuvieron en PBS/NaCl 0,5 M y el 10 % de glicerol, a -80 ºC hasta su uso.
TSIM1 (SUBE1) interacciona con cadenas de poliSUMO.
25 Para verificar la funcionalidad de estas construcciones recombinantes de interacción TSIM, se analizó su capacidad para interaccionar con el sustrato natural de RNF4, PML SUMOilada. Se descubrió que la TSIM1 (SUBE1) modificada genéticamente pero no la TSIM2 (SUBE2) interacciona con la PML SUMOilada purificada a partir de células MCF7 (línea celular de cáncer de mama) estimuladas o no con un estímulo nocivo genotóxico con 1 μM de Adriamicina (ADA) (Figura 8A). En las condiciones que se usan la PML SUMOilada muestra poca o ninguna interacción con TSIM2 (SUBE2) o control GST (Figura 8B). Sin embargo la forma no modificada de PML interacciona con estas proteínas y con el control no específico (NE) hecho solamente con esferas de agarosa (Figuras 8B). Así como los SIM de RNF4 interaccionan con PML solamente cuando está SUMOilada, la capacidad de TSIM1 (SUBE1) para interaccionar con cadenas de poliSUMO se ensayó usando un ensayo de SUMOilación in vitro. En este sistema
35 no se añadió ni sustrato ni la enzima de SUMO E3, dando como resultado la producción modesta de cadenas de poliSUMO. Las cadenas que contenían hasta 2 moléculas de SUMO-1 o 3 moléculas de SUMO-2 o SUMO-3 solo pudieron verse en la entrada (Figura 8C alta exposición). Sin embargo, las cadenas que contenían más de 4 cadenas de SUMO se pudieron recuperar en la fracción unida a TSIM1, siendo el más eficaz, el ensayo de interacción realizado con una mezcla de SUMO-2 y SUMO-3 (Figura 8C alta exposición). En estas condiciones TSIM1 (SUBE1) no se une al SUMO-1 libre pero muestra una unión modesta al SUMO-3 libre y, más importante, a SUMO-2 y SUMO-3 libre, lo que sugiere las preferencias naturales de los SIM2 y SIM3 de RNF4 (Figura 8C baja exposición). Además, no se observaron uniones a GST de las cadenas de poliSUMO libres. El conjunto de todos estos resultados indica que las TSIM1 (SUBE1) se unen a proteínas poliSUMOiladas tales como PML o a cadenas de SUMO que contienen más de cuatro restos de SUMO.
Las TSIM muestran mayor afinidad por cadenas de poliSUMO.
Para investigar la afinidad que tienen los TSIM frente a las cadenas poliSUMOiladas, los inventores usaron una fusión de SUMO que contenía 4 moléculas (Taham MH et al, 2008). Dos enfoques distintos, el ensayo de interacción con GST y la resonancia de plasmón superficial (RPS), muestran que TSIM1 (SUBE1) tiene mayor afinidad por esta fusión de SUMO recombinante tetramérica. Un ensayo de interacción con GST muestra diferencias significativas en la afinidad entre TSIM1 (SUBE1) o TSIM2 (SUBE2) y la fusión de SUMO (Figura 9A). Usando RPS, se estimaron esas afinidades para 43,6 μM y > 400 μM para TSIM1 (SUBE1) y TSIM2 (SUBE2) respectivamente (Figura 9B). Los experimentos de RPS se realizaron en un sistema Biacore 3000, equilibrado a 25 ºC en tampón HBS-EP (HEPES
55 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 0,005 %) (Biacore), usando un chip sensor CM5 con un anticuerpo anti-GST (Biacore) inmovilizado covalentemente con una densidad de aproximadamente 9000 unidades de resonancia (UR ≈ μg/mm2). Se capturaron dominios SIM fusionados con GST en tándem en el chip sensor con unas densidades medias (200-250 UR). Las moléculas de monoubiquitina (Sigma Aldrich) y similares a ubiquitina SUMO-1, -2, y SUMO-3 (producidas como se ha descrito anteriormente (Rodriguez et al, 1999)) se inyectaron después durante 30 s a un caudal de 30 μl/min, y tetra-SUMO2 (Bruderer et al., 2011) durante 50 s a 30 μl/min. Todas las inyecciones se hicieron aleatoriamente.
Los datos obtenidos por RPS confirmaron que TSIM1 (SUBE1) reconoce cadenas de poliSUMO mientras que TSIM2 (SUBE2) no lo hace. Además los resultados mostrados en la presente invención subrayan la importancia de los
65 aminoácidos acídicos de los SIM y la región enlazadora entre los SIM en el proceso de reconocimiento.
Purificación de las proteínas poliSUMOiladas totales inducidas después del estrés celular.
Para investigar si las TSIM pueden interaccionar con las proteínas SUMOiladas totales se usaron extractos celulares purificados para ajustar las condiciones de acumulación de proteínas SUMOiladas usando tratamiento de estrés por 5 choque térmico (43 °C) en células HeLa (Figura 10A y B). Los análisis por transferencia de Western llevados a cabo en estas células HeLa mostraron que las proteínas SUMOiladas aumentaban después de 15 a 30 minutos de choque térmico con una acumulación prominente después de 60 minutos (Figura 10A y B). También se observó que mientras que SUMO-2/SUMO-3 se acumulaba 15 minutos después de estos tratamientos, la acumulación de SUMO1 fue más obvia después de 60 minutos de tratamiento. Resulta interesante que tanto SUMO-1 como SUMO
10 2/SUMO-3 se acumulaban en tiempos similares lo que sugiere una activación simultánea de la conjugación de ambos tipos de modificadores (Figura 10A y B).
Recientemente, se ha asociado la SUMOilación con la ubiquitinación y se sabe que la inhibición de la actividad del proteosoma acumula proteínas SUMOiladas. Para evaluar el papel del proteosoma en el metabolismo de proteínas 15 conjugadas con SUMO y explorar adicionalmente las condiciones de acumulación de proteínas SUMOiladas, se realizó la cinética de los inhibidores del proteosoma en células HeLa (Figura 10C y D). Las células se trataron con 20 μM del inhibidor del proteosoma MG132 durante los tiempos indicados. Se pudo observar fácilmente que las proteínas SUMOiladas aumentaban después de 30 minutos de tratamiento con MG132. Por este motivo, se seleccionaron las condiciones anteriormente mencionadas, 30 minutos de tratamiento con MG132 y 60 minutos de
20 choque térmico, para acumular/preservar las proteínas SUMOiladas.
Las TSIM como columnas de afinidad
A fin de verificar el uso de las TSIM como columnas de afinidad para realizar la captura de las proteínas
25 SUMOiladas, la invención usó los ensayos de interacción con GST para capturar las proteínas SUMOiladas de los extractos de las células HeLa. Para enriquecer las proteínas SUMOiladas en las células, se han notificado diversos estímulos. Aquí, en la presente invención, se usó un pre-tratamiento durante 30 minutos con inhibidores del proteosoma seguido de estimulación por choque térmico a 43 ºC durante 60 minutos. Se ensayaron varias condiciones de extracción para aumentar una extracción eficaz y captura óptima de las proteínas SUMOiladas.
30 Debido a la arquitectura y a las propiedades de cada una de las TSIM, ambas trampas de SUMO mostraron condiciones óptimas de captura en distintos tampones La ausencia de NaCl en el tampón favorecía la captura de proteínas SUMOiladas por TSIM1 (SUBE1) (Figura 11A). Por el contrario la eficiencia de captura de TSIM2 (SUBE2) mejoró en la presencia de NaCl 75 mM (Figura 11B), en condiciones en las que la entrada fue comparable tanto para las condiciones de extracción como para las de unión.
35 Resulta interesante que la capacidad de TSIM1 (SUBE1) para capturar dianas SUMOiladas puede aumentar añadiendo PR619 (Life-Sensors), el primer inhibidor de las enzimas desubiquitinadoras/desumoiladoras permeable a las células (Figura 12).
Bibliografía
• Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215(3):403-10.
5 • Bernier-Villamor V., Sampson D. A., Matunis M. J. y Lima C. D. 2002.Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell 108, 345
356.
• Bruderer R, Tatham MH, Plechanovova A, Matic I, Garg AK, Hay RT. 2011. Purification and identification of endogenous polySUMO conjugates. EMBO Rep. Febrero; 12(2):142-8.
10 • Geiss-Friedlander R. y Melchior F. 2007. Concepts in SUMOylation: a decade on Nature reviews molecular cell biology 8; 947-956.
• Golebiowski F., Matic I., Tatham M., H., Cole V., Yin Y., Nakamura A., Cox J., Barton G., J., Mann M., y Hay R.T. 2009. System-Wide Changes to SUMO Modifications in Response to Heat Shock. Sci. Signal., 2 (72) 24.
•
Hecker C. M., Rabiller M., Haglund K., Bayer P. y Dikic I. 2006. Specification of SUMO1-and SUMO2-interacting 15 motifs. J. Biol. Chem. 281, 16117-16127.
•
Hay R. 2005. SUMO: A History of Modification. Molecular Cell, 18 1-12.
•
Hayashi T., Seki M., Maeda D., Wang W., Kawabe Y., Seki T. J. 2002. Ubc9 is essential for viability of higher eukaryotic cells. Exp. Cell Res. 280, 212-221.
•
Johnson E. S. 2004. Protein modification by SUMO. Annu. Rev. Biochem 73:355-382. 20 • Kagey M.H., Melhuish T.A., y Wotton D. 2003. The polycomb protein Pc2 is a SUMO E3. Cell 113, 127-137.
•
Kahyo T., Nishida T., Yasuda H. 2001. Involvement of PIAS1 in the sumoylation of tumor suppressor p53. Mol. Cell. 8 (3): 713-8.
•
Kerscher O., Felberbaum R., Hochstrasser M. 2006. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 159-180.
25 • Lapenta, V., Chiurazzi, P., van der Spek, P., Pizzuti, A., Hanaoka, F. y Brahe, C. 1997. SMT3A, a human homologue of the S. cerevisiae SMT3 gene, maps to chromosome 21qter and defines a novel gene family. Genomics 40, 362-366.
• Matunis, M. J., Coutavas, E. y Blobel, G. 1996. A novel ubiquitin-like modification modulates the partitioning of the
Ran-GTPase-activating protein RanGAP1 between the cytosol and the nuclear pore complex. J. Cell Biol. 135, 30 1457-1470.
•
Mahajan, R., Delphin, C, Guan, T., Gerace, L. y Melchior, F. (1997) A small ubiquitin-related polypeptide involved in targeting RanGAP1 to nuclear pore complex protein RanBP2. Cell 88, 97-107.
•
Miteva M., Keusekotten K., Hofmann K., Praefcke G., y Jürgen Dohmen R. Sumoylation as a Signal for Polyu
biquitylation and Proteasomal Degradation. 2010. Capítulo 16. Páginas 195-214. Bookshelf ID: NBK25447 35 Conjugation and Deconjugation of Ubiquitin Family Modifiers editado por Marcus Groettrup.
•
Rodriguez MS, Desterro JM, Lain S, Midgley CA, Lane DP, Hay RT. SUMO-1 modification activates the transcriptional response of p53. 1999. EMBO J. 15 de noviembre; 18(22):6455-61.
•
Rodriguez M. S., Dargemont C. y Hay R. T. 2001. SUMO-1 conjugation ex vivo requires both a consensus modification motif and nuclear targeting. J. Biol. Chem. 276, 12654-12659.
40 • Sambrook J., MacCallum P. Molecular cloning, a Laboratory Manual. 1989. 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol 1-3.
• Saitoh H, Hinchey J. 2000. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem; 275:6252-6258.
•
Sampson DA, Wang M, Matunis MJ. 2001. The small ubiquitin-like modifier-1 (SUMO-1) consensus sequence 45 mediates Ubc9 binding and is essential for SUMO-1 modification. J Biol Chem. 276(24):21664-9.
•
Seufert, W., Futcher, B., y Jentsch, S. 1995. Role of ubiquitin-conjugating enzyme in degradation of S-and Mphase cyclins. Nature 373, 78-81.
•
Seeler, J., S. y Dejean, A. 2003. Nuclear and unclear functions of SUMO. Nat Rev Mol Cell Biol. 9:690-9.
•
Schmidt, D. y Muller, S. 2002. Members of the PIAS family act as SUMO ligases for c-Jun and p53 and repress 50 p53 activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 2872-2877.
•
Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G. y Chen, Y. 2004. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 101, 14373-14378.
•
Tatham M.H., Jaffray E., Vaughan O.A., Desterro J.M., Botting C.H, Naismith J.H., Hay R.T. 2001. Polymeric
chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J. Biol. Chem. 55 276, 35368-35374.
• Tatham, M.H., Geoffroy, M., C, Shen, L., Plechanovova, A., Hattersley, N., Jaffray, E., G., Palvimo, J., J., Hay R.,
T. 2008. RNF4 is a poly-SUMO-specific E3 ubiquitin ligase required for arsenic-induced PML degradation. Nat Cell Biol.10(5):538-46.
• Yeh, E. T. 2009. SUMOylation and De-SUMOylation: wrestling with life’s processes. J. Biol. Chem. 284, 822360 8227.
•
Wilkinson K., A. y Henley. J., M. 2010. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem. J. 428, 133-145.
•
Xu J., He Y., Qiang B., Yuan J., Peng, X. y Pan, X. M. 2008. A novel method for high accuracy sumoylation site
prediction from protein sequences. BMC Bioinformatics 9,8. 65
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Biociencias-CIC BIOGUNE 5 <120>Trampas de SUMO de alta afinidad
<130> PCT-05236
<160> 13 10
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 72 15 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador directo de TSIM1 o SUBE1 20
<400> 1
25 <210> 2
<211> 75
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> Cebador inverso de TSIM1 o SUBE1
<400> 2
<210> 3
<211> 72
<212> ADN 40 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo de TSIM1 o SUBE1
45 <400> 3
<210> 4 50 <211> 72
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 55 <223> Cebador inverso de TSIM2 o SUBE2
<400> 4
<210> 5
<211> 5058 5 <212> ADN
<213> vector modificado PGEX-6P1
<220>
<221>
misc_feature 10 <222> (258)..(918)
<223> Glutatión-S-transferasa (GST)
<220>
<221>
misc_feature 15 <222> (951)..(968)
<223> cola His6
<220>
<221>
exón 20 <222> (1002)..(1043)
<223> epítopo Sv5
<220>
<221>
misc_feature 25 <222> (1456)..(2314)
<223> Resistencia a ampicilina
<220>
<221>
misc_feature 30 <222> (3407)..(4487)
<223> lacl\q
<400> 5
<210> 6
<211> 288 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221>
CDS 10 <222> (1)..(288)
<223> TSIM1 o SUBE1
<220>
<221>
misc_feature 15 <222> (7)..(24)
<223> enlazador natural de RNF4
<220>
<221>
misc_feature 20 <222> (25)..(36)
<223> dominio SIM2
<220>
<221>
misc_feature 25 <222> (37)..(60)
<223> enlazador natural de RNF4
<220>
<221>
misc_feature 30 <222> (61)..(72)
<223> dominio SIM3
<220>
<221>
misc_feature 35 <222> (79)..(96)
<223> enlazador natural de RNF4
<220>
<221>
misc_feature 40 <222> (97)..(108)
<223> dominio SIM2
<220>
<221> misc_feature
<222> (109)..(132)
<223> enlazador natural de RNF4
5 <220>
<221> misc_feature
<222> (133)..(144)
<223> dominio SIM3
10 <220>
<221> misc_feature
<222> (151)..(168)
<223> enlazador natural de RNF4
15 <220>
<221> misc_feature
<222> (169)..(180)
<223> dominio SIM2
20 <220>
<221> misc_feature
<222> (181)..(204)
<223> enlazador natural de RNF4
25 <220>
<221> misc_feature
<222> (205)..(216)
<223> dominio SIM3
30 <220>
<221> misc_feature
<222> (223)..(240)
<223> enlazador natural de RNF4
35 <220>
<221> misc_feature
<222> (241)..(253)
<223> Dominio SIM2
40 <220>
<221> misc_feature
<222> (253)..(276)
<223> enlazador natural RNF4
45 <220>
<221> misc_feature
<222> (277)..(288)
<223> dominio SIM3
50 <400> 6
<210> 7
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
<210> 8
<211> 288
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(288)
<223> TSIM2 o SUBE2
<220>
5 <221> misc_feature
<222> (7)..(27)
<223> Enlazador artificial de poliglicina
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(29)
<223> dominio SIM2
<220>
15 <221> misc_feature
<222> (40)..(57)
<223> Enlazador artificial de poliglicina
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(72)
<223> dominio SIM3
25 <220>
<221> misc_feature
<222> (79)..(99)
<223> Enlazador artificial de poliglicina
<220>
<221> misc_feature
<222> (100)..(111)
<223> dominio SIM2
35 <220>
<221> misc_feature
<222> (112)..(129)
<223> Enlazador artificial de poliglicina
<220>
<221> misc_feature
<222> (130)..(144)
<223> dominio SIM3
45 <220>
<221> misc_feature
<222> (151)..(171)
<223> Enlazador artificial de poliglicina
<220>
<221> misc_feature
<222> (172)..(183)
<223> dominio SIM2
55 <220>
<221> misc_feature
<222> (184)..(204)
<223> Enlazador artificial de poliglicina
<220>
<221> misc_feature
<222> (205)..(216)
<223> dominio SIM3
65 <220>
<221> misc_feature
<222> (216).. (236)
<223> Enlazador artificial de poliglicina
<220>
5 <221> misc_feature
<222> (223).. (243)
<223> Enlazador artificial de poliglicina
<220>
10 <221> misc_feature
<222> (237)..(248)
<223> dominio SIM3
<220>
15 <221> misc_feature
<222> (244)..(255)
<223> dominio SIM2
<400> 8 20
<210> 9
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
<210> 10
<211> 12 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(12)
<223> dominio SIM2
<400> 10
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
<210> 12
<211> 12
<212> ADN
<213> Homo sapiens 30
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(12)
<223> dominio SIM3 35
<400> 12
<210> 13
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un polipéptido que comprende al menos ocho motivos de interacción con SUMO (SIM), en el que dichos motivos
    de interacción con SUMO se unen entre sí por una secuencia enlazadora de aminoácidos natural. 5
  2. 2. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 en el que los motivos de interacción con SUMO se organizan en tándem y se eligen de los presentes en una proteína seleccionada de: PML, Daxx, UBA2, PIAS, ligasa RNF4 y/o variantes funcionalmente equivalentes de las mismas.
    10 3. Polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en el que los motivos de interacción con SUMO se seleccionan del grupo que comprende: SIM1, SIM2, SIM3, SIM4 y/o combinaciones de los mismos.
  3. 4. Polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el polipéptido comprende cuatro
    motivos SIM3 y cuatro SIM3 y/o variantes funcionalmente equivalentes de los mismos. 15
  4. 5.
    Polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 representado por SEC ID NO: 7.
  5. 6.
    Uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para el aislamiento in vitro y/o ex vivo
    de proteínas SUMOiladas y/o para la identificación de los sustratos de SUMO. 20
  6. 7.
    Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
  7. 8.
    Secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 7, representada por SEC ID NO: 6.
    25 9. Una construcción génica que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8.
  8. 10. Vector que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, o
    una construcción génica de acuerdo con la reivindicación 9. 30
  9. 11.
    Una célula que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, o una construcción génica de acuerdo con la reivindicación 9, o un vector de acuerdo con la reivindicación 10.
  10. 12.
    Un animal no humano que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las
    35 reivindicaciones 7 u 8, o una construcción génica de acuerdo con la reivindicación 9, o un vector de acuerdo con la reivindicación 10, o una célula de acuerdo con la reivindicación 11.
  11. 13. Un proceso para obtener un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones de 1 a 5, que comprende cultivar
    una célula de acuerdo con la reivindicación 11 en condiciones que permitan producir dicho polipéptido y, si se desea, 40 recuperar dicho polipéptido del medio de cultivo.
  12. 14. Un método in vitro para el aislamiento de una proteína SUMOilada de una muestra que comprende
    i) incubar un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5 con dicha muestra en
    45 condiciones que permitan que dicho polipéptido interaccione con al menos una proteína SUMOilada presente en dicha muestra; y ii) recuperar cualquier proteína SUMOilada que se una a dicho polipéptido.
  13. 15. Un kit que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5. 50
    REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN
    La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.
    Documentos de patente citados en la descripción
    Literatura no patente citada en la descripción
ES12711589.7T 2011-05-24 2012-03-08 Trampas de SUMO de alta afinidad Active ES2525573T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161489490P 2011-05-24 2011-05-24
US201161489490P 2011-05-24
PCT/EP2012/054039 WO2012159782A1 (en) 2011-05-24 2012-03-08 High affinity sumo traps

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2525573T3 true ES2525573T3 (es) 2014-12-26

Family

ID=45926526

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12711589.7T Active ES2525573T3 (es) 2011-05-24 2012-03-08 Trampas de SUMO de alta afinidad

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9434765B2 (es)
EP (1) EP2714727B1 (es)
ES (1) ES2525573T3 (es)
WO (1) WO2012159782A1 (es)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2017135552A (ru) * 2015-03-31 2019-04-30 Иеда Рисеч Энд Девелопмент Ко. Лтд. Глутамат оксалоацетат трансаминаза 1 (got1), препараты и способы их получения и применения
IT201700106405A1 (it) * 2017-09-22 2019-03-22 Plico Biotech Inc Formulazione per la somministrazione di SUMO2
CN112384219A (zh) 2018-07-09 2021-02-19 千禧制药公司 Sumo-激活酶抑制剂和抗cd20抗体的施用
JP7539896B2 (ja) 2019-02-27 2024-08-26 武田薬品工業株式会社 Ｓｕｍｏ活性化酵素阻害剤及びチェックポイント阻害剤の投与
WO2020192754A1 (en) * 2019-03-28 2020-10-01 The Chinese University Of Hong Kong Sumo peptides for treating neurodegenerative diseases
CN112980908B (zh) * 2019-12-02 2022-08-09 中国科学院大连化学物理研究所 基于去sumo化酶和sax的sumo化肽段富集方法
WO2023073645A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Therapy comprising anti-cd19 antibody and sumo-activating enzyme inhibitor
EP4474390A1 (en) * 2023-06-05 2024-12-11 Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Biociencias - CIC bioGUNE High affinity sumo traps

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU649217B2 (en) 1988-11-18 1994-05-19 Regents Of The University Of California, The Method for site-specifically incorporating unnatural amino acids into proteins
US6103489A (en) 1997-03-21 2000-08-15 University Of Hawaii Cell-free protein synthesis system with protein translocation and processing
US7525907B2 (en) 2002-07-05 2009-04-28 Nortel Networks Limited Method, device and software for establishing protection paths on demand and revertive protection switching in a communications network
US20080131940A1 (en) 2004-06-25 2008-06-05 Robert Chiu Target Cell-Specific Short Interfering Rna and Methods of Use Thereof
WO2006135436A2 (en) 2004-10-22 2006-12-21 University Of Florida Research Foundation, Inc. Inhibition of gene expression and therapeutic uses thereof
EP2096174A1 (en) * 2008-02-28 2009-09-02 Centro De Investigación Cooperativa En Biociencias CiC bioGune Ubiquitin binding polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
EP2714727A1 (en) 2014-04-09
EP2714727B1 (en) 2014-10-22
US20140165222A1 (en) 2014-06-12
WO2012159782A1 (en) 2012-11-29
US9434765B2 (en) 2016-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2525573T3 (es) Trampas de SUMO de alta afinidad
Mahajan et al. Molecular characterization of the SUMO-1 modification of RanGAP1 and its role in nuclear envelope association
Henrichs et al. Regulation of ABCB1/PGP1-catalysed auxin transport by linker phosphorylation
Siebel et al. Soma-specific expression and cloning of PSI, a negative regulator of P element pre-mRNA splicing.
Kroupova et al. Molecular architecture of the human tRNA ligase complex
Torii et al. The RING finger motif of photomorphogenic repressor COP1 specifically interacts with the RING-H2 motif of a novelArabidopsis protein
EP2096174A1 (en) Ubiquitin binding polypeptides
US8859237B2 (en) Diguanylate cyclase method of producing the same and its use in the manufacture of cyclic-di-GMP and analogues thereof
Baijal et al. The promises of lysine polyphosphorylation as a regulatory modification in mammals are tempered by conceptual and technical challenges
Mirski et al. Identification of functional nuclear export sequences in human topoisomerase IIα and β
WO2008111063A2 (en) Regulation of neurotransmitters sequestration and release through manipulation of the vesicular functions
AU2005263988B2 (en) Cell cycle phase markers
JP5675345B2 (ja) Ｐｐ１リガンド
US9981005B2 (en) Methods for increasing DISC1 in a subject with schizophrenia or bipolar disorder by an antagonist inhibiting DISC1 binding to FBXW7
JP7526399B2 (ja) 凝集の少ないｐｐｒタンパク質及びその利用
US8715678B2 (en) Method for inhibiting the formation of SET1 family core complexes
Srivastava et al. Fas-activated serine/threonine kinase: Structure and function
Park et al. Tripodal lipoprotein variants with C-terminal hydrophobic residues allosterically modulate activity of the DegP protease
Mivelaz Dynamic Chromatin Invasion and Remodeling by the Transcription Factor Rap1
ES3034207T3 (en) Single immunoglobulin interleukin-1 receptor related (sigirr) variants and uses thereof
Schafer Extending the HECT Domain of HERC4 Improves Solubility and Catalysis
Schock et al. Novel Cytoskeleton-Associated Proteins in Trypanosoma brucei Are Essential for Cell Morphogenesis and Cytokinesis. Microorganisms 2021, 9, 2234
Benedict Transcriptional Regulation by TAF1 Kinase
WO2024019642A1 (ru) ГИБРИДНАЯ БЕЛКОВАЯ КОНСТРУКЦИЯ НА ОСНОВЕ РЕЦЕПТОР-СПЕЦИФИЧНОГО ВАРИАНТА TRAIL С ПЕПТИДОМ, СПЕЦИФИЧНЫМ К αVβ3-ИНТЕГРИНУ
HK40070059A (en) Ppr protein with less aggregation and use thereof