ES2526406T3

ES2526406T3 - Vacunas contra PRRSV basadas en proteínas GP5

Info

Publication number: ES2526406T3
Application number: ES08747143.9T
Authority: ES
Inventors: Byong-Kwan Kim
Original assignee: MJ Biologics Inc
Current assignee: MJ Biologics Inc
Priority date: 2007-04-30
Filing date: 2008-04-30
Publication date: 2015-01-12
Anticipated expiration: 2028-04-30
Also published as: US8142788B2; CA2685170A1; EP2152306B1; EP2152306A2; MX2009011638A; DK2152306T3; US20160256536A1; PL2152306T3; JP2010526086A; KR101673883B1; TW200914043A; US20120141978A1; CN101578112A; CA2685170C; TW201605471A; WO2008134697A2; US20090208520A1; HK1140969A1; KR20100017504A; EP2508203A1

Abstract

Un método para preparar una composición inmunogénica, comprendiendo dicho método: (a) identificar o seleccionar un primer aislado de virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), comprendiendo dicho primer aislado un primer polipéptido GP5 que contiene una primera región hipervariable HV-2 en el ectodominio GP5; (b) identificar o seleccionar un segundo aislado de PRRSV, comprendiendo dicho segundo aislado un segundo polipéptido GP5 que contiene una segunda región hipervariable HV-2 en el ectodominio GP5; (c) combinar partículas virales de dicho primer y segundo aislado para formar una composición inmunogénica; donde: - cada partícula viral comprende un polipéptido GP5 unido a membrana; - la primera y segunda regiones HV-2 son diferentes entre sí; y donde: - cada una de las etapas de identificación o selección (a) y (b) comprende secuenciación de aminoácidos, secuenciación de ácido nucleico o detección basada en PCR de la región hipervariable HV-2 del ectodominio GP5 de PRRSV del aislado PRRSV.

Description

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DESCRIPCIÓN

Vacunas contra PRRSV basadas en proteínas GP5

5 Campo de la descripción

Esta descripción incluye composiciones y métodos dirigidos al uso de virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS), o PRRSV, polipéptidos en la generación de una respuesta inmune contra el polipéptido, y por lo tanto PRRSV. La descripción se basa en parte en el reconocimiento de que el uso de más de un ectodominio GP5, que difiere en secuencia con una región hipervariable HV-2, permite la generación de una respuesta inmune más amplia contra PRRSV que con el uso de un único ectodominio. También se describe el uso de moléculas de ácido nucleico que codifican más de un ectodominio para producir una respuesta inmune más amplia. La descripción incluye composiciones que contienen polipéptidos con más de uno de los ectodominios, o una o más moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos. También se describen métodos para producir una respuesta inmune

15 usando polipéptidos, moléculas de ácido nucleico que los codifican, y/o una composición de la descripción.

Antecedentes de la descripción

PRRSV pertenece a la familia Ateriviridae, una de las familias de virus ARN animales. Las propiedades antigénicas de los virus PRRS, como otros virus ARN, cambian continuamente, lo que provoca una cuestión muy problemática en el desarrollo de una vacuna eficaz contra este agente que causa enfermedad. Sin embargo, existen fundamentos que no cambian en el sistema biológico de PRRSV. De forma importante, el virus infecta una célula hospedadora de un organismo multicelular para su replicación o crecimiento. Para infectar, el virus debe unirse a una célula hospedadora como parte de su ciclo vital. Para la unión, el virus debe tener una proteína de reconocimiento de

25 receptor viral (RRP) que reconoce uno o más receptores específicos en la célula hospedadora. Por último, el receptor de la proteína hospedadora generalmente no cambia porque habitualmente es necesario para una función particular y de este modo no está pretendida para el reconocimiento del virus.

Pero un virus utiliza el receptor de la célula para unirse o reconocer la célula hospedadora. En lugar de modificar la estructura del receptor, un organismo que contiene la célula hospedadora puede producir anticuerpos que reconocen el RRP del virus para bloquear la unión del virus a la célula hospedadora. Los anticuerpos se mencionan habitualmente como anticuerpos neutralizantes (NA). En respuesta, una población de virus a menudo contiene o produce modificaciones de su RRP que permite el escape del reconocimiento por NA. Sin embargo, las modificaciones al RRP están limitadas por el hecho de que el RRP modificado aún debe reconocer el receptor

35 celular para la unión del virus. Si una modificación provoca un RRP no funcional, el virus no puede unirse, y de este modo no puede replicarse o sobrevivir.

Yaeger (2000) National Pork Board Research Report NPBnº99-035 describe el efecto de la vacunación con combinaciones de vacunas comerciales contra PRRSV sobre el desarrollo de anticuerpos neutralizantes en suero para seis cepas antigénicamente diferentes de PRRSV.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un método para preparar una composición inmunogénica, comprendiendo dicho método: 45

(a): identificar o seleccionar un primer aislado de virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), comprendiendo dicho primer aislado un primer polipéptido GP5 que contiene una primera región hipervariable HV-2 en el ectodominio GP5;

(b): identificar o seleccionar un segundo aislado de PRRSV, comprendiendo dicho segundo aislado un segundo polipéptido GP5 que contiene una segunda región hipervariable HV-2 en el ectodominio GP5;

(c): combinar partículas virales de dicho primer y segundo aislado para formar una composición inmunogénica;

donde:

55 cada partícula viral comprende un polipéptido GP5 unido a membrana; la primera y segunda región HV-2 son diferentes entre sí;

y donde:

cada una de las etapas de identificación o selección (a) y (b) comprenden secuenciación de aminoácidos, secuenciación de ácido nucleico o detección basada en PCR de la región hipervariable HV-2 del ectodominio GP5 de PRRSV del aislado PRRSV.

La invención por tanto se refiere a un método para preparar composiciones inmunogénicas que comprenden

65 diferentes partículas virales PRRSV. La invención se basa en el descubrimiento inesperado de que materiales para generar una respuesta inmune contra PRRSV pueden obtenerse seleccionando ectodominios apropiados de la

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proteína GP5 de PRRSV que varían en secuencia dentro de una región hipervariable HV-2 previamente no apreciada.

La siguiente descripción muestra cuáles son dichas proteínas y partículas virales, y a qué se parecerán las 5 composiciones que pueden obtenerse por el método de la invención.

Breve sumario de la descripción

La descripción se refiere a una disposición tridimensional de restos de aminoácidos presentes en la proteína GP5 del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS), o PRRSV. La disposición de restos, o dominio polipeptídico, está presente en la parte N-terminal de la proteína GP5, y se ha mencionado como ectodominio de la proteína GP5. La descripción incluye el uso del dominio en el contexto de un péptido, un polipéptido, una partícula viral, u otra composición que contenga proteína. En algunas realizaciones, el dominio puede estar presente en forma de un péptido o polipéptido recombinante o de fusión. En otras realizaciones, el dominio puede estar presente en, o

15 con, una partícula viral o virus recombinante. En realizaciones adicionales, puede usarse una molécula de ácido nucleico que codifique un péptido o polipéptido que contenga el dominio para expresar el dominio para la práctica de la descripción.

La descripción se basa en parte en el descubrimiento inesperado de que ectodominios que varían en secuencia dentro de una región hipervariable HV-2 previamente no apreciada, pueden seleccionarse para su uso en la preparación y uso de materiales para general una respuesta inmune, incluyendo una respuesta protectora, en un animal contra PRRSV. En algunos casos, se preparan al menos dos aislados PRRSV, conteniendo cada uno una proteína GP5 diferente debido a al menos una diferencia de secuencia dentro de la región HV-2, y se usan para generar una respuesta inmune. En otros casos, se preparan al menos tres o cuatro aislados PRRSV, conteniendo

25 cada uno una proteína GP5 diferente debido a las diferencias de secuencia al menos dentro de la región HV-2, y se usan para producir una respuesta protectora.

La descripción incluye el reconocimiento de que después de una secuencia señal putativa, el ectodominio GP5 puede verse como una combinación de tres regiones que preceden a una región transmembrana putativa (o dominio que abarca membrana o MSD). En orden secuencial desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal de la proteína GP5, las regiones son la región hipervariable HV-I ("HV1"), la región conservada ("CR"), y la región hipervariable HV-2 ("HV2"), que después está seguida por una región transmembrana putativa ("TR" o MSD). La Figura 1 proporciona un ejemplo no limitante. Como la identificación del HV2 es importante para la generación de una respuesta inmune contra PRRSV, la descripción incluye combinaciones de al menos dos ectodominios GP5

35 donde difieren en secuencia del HV2. En algunos casos, los al menos dos ectodominios pueden estar presentes en al menos dos aislados PRRSV, que pueden administrarse para producir una respuesta inmune como se describe en este documento.

De modo que en un primer aspecto, la descripción incluye una combinación de al menos un primer dominio polipeptídico y un segundo dominio polipeptídico, donde cada domino contiene un motivo GP5 conservado unido de forma covalente a un HV2 y cada dominio es antigénico en un sujeto animal contra infección por PRRSV. En muchas realizaciones, la unión es un enlace peptídico, o enlace amida entre restos de aminoácidos en un polipéptido. El motivo GP5 y HV2 pueden ser contiguos de modo que el HV2 siga inmediatamente después del motivo en la misma molécula polipeptídica. En otras realizaciones, el motivo y HV2 pueden estar separados por un

45 enlazador, tal como uno o más restos de aminoácido. En realizaciones adicionales, el motivo y HV2 pueden estar unidos mediante un enlace químico diferente a un enlace peptídico.

Este aspecto de la descripción incluye realizaciones alternativas del primer y segundo dominio polipeptídicos donde al menos uno de los dominios es un dominio expandido que contiene adicionalmente un HV1 unido covalentemente al motivo GP5 conservado. Esto provoca al menos un dominio que contiene al menos tres regiones: el HV1, la región conservada (CR) que contiene el motivo GP5 conservado, y el HV2, en orden secuencial. Por supuesto, las realizaciones de la descripción incluyen combinaciones de dos, o más de dos dominios, tal como tres o cuatro dominios, donde al menos dos de los dominios son dominios expandidos como se describe en este documento. En algunos casos, cada uno de los dominios en una combinación es un dominio expandido.

55 En algunas realizaciones, una combinación de al menos dos dominios polipeptídicos es una combinación de al menos dos aislados PRRSV, cada uno de los cuales contiene al menos uno de los dominios. En muchos casos, cada uno de los dominios es un dominio expandido que contiene el HV1, la CR, y el HV2, donde cada dominio es diferente a causa de al menos una diferencia de secuencia dentro del HV2. Por supuesto, los dominios pueden contener opcionalmente otras diferencias de secuencia, tal como una o más diferencias en el HV1.

Una combinación de dominios puede estar presente en una combinación de polipéptidos GP5, cada uno de los cuales está presente en un aislado PRRSV. Por tanto, la descripción incluye una combinación de dos o más aislados, conteniendo cada uno una proteína GP5 con un dominio polipeptídico expandido que contiene una 65 secuencia HV2 diferente como se describe en este documento. Por ejemplo, y en una combinación no limitante de cuatro aislados, un primer dominio polipeptídico está presente en un primer aislado, un segundo dominio

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polipeptídico está presente en un segundo aislado, un tercer dominio polipeptídico está presente en un tercer aislado, y un cuarto dominio polipeptídico está presente en un cuarto aislado. Cada uno de los aislados diferiría de los otros al menos debido a una diferente secuencia HV2 en una proteína GP5 del aislado. Por supuesto, también pueden estar presentes otras diferencias de secuencia, tal como una o más diferencias en el HV1, en los aislados.

En realizaciones basadas en polipéptido más allá de la proteína GP5, el primer y segundo domino polipeptídico pueden estar localizados en la misma molécula o en dos moléculas polipeptídicas diferentes. El primer y segundo dominio contienen cada uno un motivo GP5 conservado, representado por la secuencia de aminoácidos C(E/S)LNG(T/A), SEC ID Nº 1. Realizaciones de la descripción incluyen combinaciones donde el motivo GP5 conservado en cada uno de los dos dominios es idéntico. Como alternativa, el primer y segundo dominio puede diferir en secuencia, y por tanto en estructura, mediante la variabilidad limitada (cuatro posibles secuencias) dentro del motivo conservado como se indica por la SEC ID Nº 1.

Como se describe en este documento, cada uno de los dominios en una combinación incluye un HV2, cuya secuencia difiere entre cada uno de los dominios. En casos de un dominio expandido, la secuencia HV1 puede también diferir opcionalmente entre cada uno de los dominios. Esto se basa en parte en la visión no limitante de que un dominio expandido que contiene el HV1, la CR, y el HV2 forma un "bolsillo" de reconocimiento que diferiría entre los diferentes dominios de una combinación para proporcionar diversidad aumentada cuando la combinación se usa para producir una respuesta inmune. De modo que a modo de ejemplo no limitante, una diferencia de secuencia en el HV2 puede provocar una alteración en la estructura de "bolsillo" mientras que cambios de secuencia tanto en HV2 como en HV1 pueden provocar una alteración diferente en la estructura de "bolsillo". Y aunque algunas realizaciones de la descripción incluyen cambios de secuencia solamente en el HV2 y el HV1, otras realizaciones pueden incluir cambios de secuencias en la CR.

En muchas realizaciones, el HV2 contiene aproximadamente 8 restos de aminoácido y/o una parte conservada representada por la secuencia tripeptídica X0WL, donde X0 es uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural. Esta secuencia tripeptídica puede estar localizada en el inicio, o el extremo N-terminal, del HV2. En algunas realizaciones, la secuencia tripeptídica conservada comprende la secuencia DWL, donde X0 es ácido aspártico (D). en otras realizaciones, X0 es asparagina (N) o cualquier otro resto de aminoácido excepto ácido aspártico (D). en realizaciones adicionales X0 es un resto de aminoácido ácido, tal como ácido glutámico (E) o glutamina (Q); un resto de aminoácido básico, tal como arginina (R), lisina (K), o histidina (H); un resto de aminoácido con una cadena lateral alifática, tal como alanina (A) o isoleucina (I) o glicina (G) o leucina (L) o valina (V); un resto de aminoácido con una cadena lateral que contiene hidroxilo, tal como treonina (T) o serina (S); o un resto de aminoácido con una cadena lateral aromática, tal como tirosina (Y).

En un segundo aspecto, la descripción se basa en la antigenicidad y/o inmunogenicidad del motivo GP5 conservado y HV2 en cada uno de los dominios en una combinación de dos o más dominios. En algunas realizaciones, la presencia de un motivo GP5 conservado y un HV2, y opcionalmente un HV1 para formar un "bolsillo" de reconocimiento, en cada uno de los al menos dos dominios produce antigenicidad y/o inmunogenicidad, y por tanto la descripción incluye composiciones antigénicas e inmunogénicas que contiene los dominios. En realizaciones adicionales, cada uno de los dominios está presente en una molécula polipeptídica diferente que está unida o asociada con una membrana celular u otra bicapa lipídica. En algunos casos, la molécula polipeptídica contiene una TR, tal como un dominio transmembrana GP5, que facilita la asociación con una membrana o bicapa lipídica. En algunas realizaciones, la membrana puede ser una membrana libre de células o un fragmento o parte de una membrana celular, tal como una envuelta o cubierta que rodea una partícula viral producida por una célula.

Composiciones adicionales incluyen don o más moléculas polipeptídicas que están unidas a membrana, o asociadas a membrana, tal como a una partícula viral única o a diferentes partículas virales. La partícula o partículas virales pueden ser infecciosas o no infecciosas, e independientemente pueden ser competentes o incompetentes en replicación. Una partícula viral puede ser una partícula PRRSV o la de otro virus tal como una partícula viral recombinante que contiene las moléculas polipeptídicas. Ejemplos no limitantes de partículas virales recombinantes que pueden usarse para expresar un polipéptido de la descripción incluyen adenovirus y poxvirus porcinos.

Una partícula viral que es tanto infecciosa como competente en replicación puede mencionarse como virión. De modo que en algunas realizaciones, la composición puede contener dos o más moléculas polipeptídicas que están unidas a membrana, o asociadas a membrana, tal como un único virión o a diferentes viriones. En realizaciones de composiciones que contienen dos o más viriones, tales como dos o más partículas PRRSV, uno o más pueden ser una partícula o aislado PRRSV de origen natural que contiene un primer o segundo dominio polipeptídico como se describe en este documento. En algunas realizaciones, más de una, hasta todas, las partículas son aislados de origen natural.

Por supuesto, realizaciones adicionales de la descripción incluyen combinaciones de más de dos dominios polipeptídicos o partículas virales, cada una de las cuales contiene un motivo GP5 conservado y un HV2, opcionalmente con un HV1, como se describe en este documento. De modo que composiciones que comprenden dominios polipeptídicos adicionales más allá de un primer y segundo dominio polipeptídico están expresamente dentro del alcance de la descripción. Por supuesto, en dichas realizaciones, el HV2, y opcionalmente el HV1, en cada dominio polipeptídico de una combinación difiere en secuencia, y por tanto en estructura, del HV2, y opcionalmente el HV1, en cada uno de los oros dominios en la combinación.

En un aspecto adicional, la descripción incluye un método para preparar una composición descrita en este documento. En algunas realizaciones, un método puede comprender identificar o seleccionar al menos un primer dominio polipeptídico y un segundo dominio polipeptídico, cada dominio como se describe en este documento, y

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combinar los dominios para formar una composición. En muchos casos, un método puede comprender identificar o seleccionar al menos una primera molécula polipeptídica que contiene el primer dominio y una segunda molécula polipeptídica que contiene el segundo dominio, y combinar los polipéptidos para formar una composición. En algunos casos, la combinación puede comprender la adición de uno o más excipientes y/o vehículos

5 farmacéuticamente aceptables en la formación de una composición.

En otras realizaciones, la identificación o selección puede ser entre aislados PRRSV basados en la secuencia del HV2 en cada aislado. En algunos casos, la identificación o selección puede ser por detección de la secuencia HV2 junto con una o más partes diferentes de la molécula GP5, tal como el motivo conservado o el HV1. Un ejemplo no limitante de un método de detección incluye el uso de un anticuerpo que reconoce una secuencia HV2 dada, opcionalmente en combinación con, o en el contexto de, otra parte de la molécula GP5. Otros métodos no limitantes de detección incluyen secuenciación de aminoácidos del HV2 o secuenciación de ácido nucleico de la secuencia que codifica el HV2.

15 En algunas realizaciones, la detección puede ser de PRRSV en una muestra de un fluido biológico de un sujeto animal, tal como un individuo infectado con PRRSV. El método puede comprender el contacto de la muestra, o una forma diluido de la misma, con un agente de unión que se une a al menos una parte del HV2 en una proteína GP5. La muestra puede ser de un sujeto porcino, pero puede usarse cualquier sujeto infectado por PRRSV, o un vehículo PRRSV. El fluido biológico puede ser cualquier fluido en el cual pueda estar presente de forma detectable la proteína GP5 y/o partículas PRRSV. Ejemplos no limitantes incluyen las secreciones corporales de un sujeto, tales como saliva, lágrimas, mocos, descarga nasal, y secreciones vaginales así como otros fluidos corporales tales como sangre, suero, plasma, semen, fluido seminal, y orina así como cualquier componente de fluido de heces o un extracto fluido de heces.

25 En realizaciones adicionales, la identificación, selección, o detección puede ser de, o para, un nuevo aislado PRRSV que no tiene un HV2 con una secuencia descrita en este documento. Un nuevo aislado puede usarse de forma ventajosa en una combinación de la descripción, tal como con uno, dos, tres, cuatro, o más aislados PRRSV que contienen dominio descritos en este documento. Se esperaría que una combinación con un nuevo aislado fuera ventajosa porque tendría una probabilidad mayor de producir un anticuerpo o respuesta inmune que sea nuevo en comparación con la respuesta a una combinación que carece del nuevo aislado.

Como se ha indicado anteriormente, un aspecto adicional de la descripción es un método para producir una respuesta de anticuerpo (respuesta inmune humoral) o una respuesta inmune. En algunas realizaciones, un método puede comprender administrar una combinación de dominios polipéptidos, como se describe en este documento, a

35 un sujeto animal con un sistema inmune capaz de producir la respuesta. Aunque una respuesta dada puede verse como incluyendo una respuesta dirigida a los dominios o a polipéptidos que contienen los dominios, la descripción incluye la generación de una respuesta que también reconoce GP5 en uno o más aislados PRRSV. En algunas realizaciones, la respuesta de anticuerpos incluye la producción de uno o más anticuerpos neutralizantes. En otras realizaciones, la respuesta inmune incluye la producción de una o más respuestas inmunes celulares, tal como una respuesta mediada por células T. en algunos casos, la respuesta de anticuerpos o respuesta inmune es una respuesta protectora contra una partícula PRRSV, tal como una que expresa una proteína GP5 que contiene un dominio polipeptídico de la descripción.

En algunos casos, la respuesta de anticuerpos o respuesta inmune es contra al menos dos variedades, o cepas, de

45 PRRSV que difieren en el HV2, tal como aquellas que están probablemente presentes dentro de una región geográfica particular. De modo que realizaciones de la descripción incluyen una respuesta contra una o más variedades de un aislado Lelystad prevalente en Europa, una o más variedades de un serotipo Norteamericano o Coreano de PRRSV, o una o más variedades de PRRSV encontradas en Asia o América del Sur.

En realizaciones adicionales, un método para producir una respuesta de anticuerpos o inmune en un sujeto puede comprender identificar o seleccionar, como se describe en este documento, al menos un primer dominio polipeptídico y un segundo dominio polipeptídico, seguido por administración de los dominios seleccionados a un sujeto para producir la respuesta de anticuerpos o inmune. En algunas realizaciones, la identificación o selección puede ser de al menos un primer polipéptido que comprende el primer dominio polipeptídico y un segundo

55 polipéptido que comprende el segundo dominio polipeptídico, seguido por administración de los polipéptidos seleccionados al sujeto. En muchos casos, al menos uno del primer y segundo polipéptido pueden estar presentes en un aislado PRRSV. En algunos casos, cada uno de los polipéptidos está presente en un aislado PRRSV.

En realizaciones alternativas, la identificación o selección puede ser de al menos un primer aislado PRRSV que comprende el primer dominio polipeptídico y un segundo aislado PRRSV que comprende el segundo dominio polipeptídico, seguido por administración de los aislados seleccionados al sujeto. En algunas realizaciones, la identificación o selección es de al menos tres o al menos cuatro, o más, aislados. En muchos casos, la selección se basa en la secuencia de HV2 en una proteína GP5 del aislado PRRSV. La identificación o selección basada en la secuencia de HV2 puede realizarse por cualquier método adecuado, incluyendo, aunque sin ,imitación, análisis de

65 secuencia de aminoácidos del HV2, detección basada en PCR o basada en anticuerpos del HV2; o conocimiento de la secuencia HV2 en un aislado PRRSV caracterizado previamente.

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Los detalles de una o más realizaciones de la descripción se exponen en los dibujos adjuntos y la siguiente descripción. Otras características, objetos y ventajas de la descripción serán evidentes a partir de los dibujos y descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.

5 Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de una cepa PRRSV representativa de tipo Americano (VR-2332) y una cepa PRRSV de tipo Europeo (cepa Lelystad, LV). Las secuencias señal putativas de cada una se identifican junto con el HV 1, "Región Conservada" o CR (que contiene el motivo GP5 conservado), y el HV2 (subrayado). También se indica una posición de inicio representativa y no limitante para el HV1. La Figura 2 es una representación esquemática de grupos de aislados PRRSV descritos en este documento. La Figura 3 muestra una alineación de una parte de la secuencia del ectodominio GP5, incluyendo el motivo GP5 conservado y el HV2, de las secuencias accesibles al público de PRRSV. Los números de acceso al NCBI

15 (National Center for Biotechnology Information) correspondientes a las secuencias se indican junto con los aislados. Los aislados incluyen cepas tanto de América del Norte como Europeas así como otros tipos. La Figura 4 ilustra las interacciones mediadas por la proteína GP5 entre PRRSV y una célula hospedadora de cerdo. La Figura 5 es un diagrama de hidrofobicidad de Kyte-Doolittle de la secuencia de aminoácidos de la proteína GP5. La numeración indicada es de un aislado Americano. Existe un rápido desplazamiento a restos hidrófobos en aproximadamente el resto de aminoácido 62, correspondiente al inicio de una región transmembrana putativa. La Figura 6 proporciona los números de acceso a GenBank y GI para secuencias representativas que codifican la proteína GP5 de PRRSV.

25 Definiciones

Como se usa en este documento, los términos virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS), o PRRSV, se refieren a un virus que se ha informado que causa PRRS; enfermedad misteriosa del cerdo (MSD); síndrome de infertilidad y respiratoria del cerdo (SIRS), que se conocía previamente como "síndrome de la oreja azul"; síndrome de aborto epidémico y respiratorio porcino (PEARS); síndrome de Wabash; enfermedad porcina misteriosa (MPD); peste porcina; enfermedad azul de aborto o enfermedad de la oreja azul en el Reino Unido; abortus blau en los Países Bajos; seuchenhafter spatabort der schweine en Alemania; y enfermedad Heko-Heko (Shimizu et al., 1994). Los nombres alternativo adicionales de la afección de causa vírica incluyen enfermedad de la oreja azul, enfermedad porcina de la oreja azul, enfermedad misteriosa del cerdo, Epidemisch spätabort der sauen,

35 Lane r bing (China), Maladie blue du porc, Maladie mystérieuse du porc, enfermedad porcina misteriosa, nueva enfermedad porcina, peste de 1988 -1989, Rätselhafte schweinekrankheit, síndrome disgenésico y respiratorio del cerdo, síndrome misterioso del cerdo, Syndrom reproductive et respiratoire du porc, Syndrome dysgénésique et respiratoire du porc, y síndrome HAAT (Hyperthermie-Anorexie-Avortement de la Truie).

Las expresiones "proteína GP5" y "glucoproteína principal de envuelta" de PRRSV como se usan en este documento se refieren al polipéptido codificado por ORF5 de un genoma PRRSV como se comprende en la técnica. Secuencias que codifican secuencias representativas y no limitantes de GP5 incluyen aquellas identificadas por los números de acceso y GI proporcionados en la Figura 6. Sin limitarse a teoría alguna, y ofreciéndose para mejorar la comprensión de la descripción, se cree que la proteína GP5 codificada por ORF5 del genoma PRRSV es una proteína de

45 reconocimiento de receptor (RRP) en PRRSV. El ectodominio de la proteína GP5 empieza a partir de aproximadamente el aminoácido N30 hasta aproximadamente D61 para la cepa americana y a partir de aproximadamente D33 hasta G63 para las cepas europeas (véase la Figura 1). Las diferencias típicas entre las cepas de tipo americano y las cepas europeas son (1) los aminoácidos totales para las proteína GP5 son 200 y 201, respectivamente, (2) las cepas europeas tienen una secuencia señal más larga en comparación con las cepas americanas, y (3) las cepas europeas muestran menos variaciones en comparación con las cepas americanas. La descripción se basa en parte en el análisis, y la identificación del HV2 en cada una de aproximadamente 1740 secuencias de GP5 y sus respectivos ectodominios. Las secuencias representativas se muestran en la Figura 3. Aunque la descripción puede ponerse en práctica con el uso de esas secuencias representativas, la descripción no se limita a ellas.

55 La expresión "región HV-1" o "HV1" se refiere a una secuencia polipeptídica presente en el extremo N-terminal de la región conservada de GP5 como se describe en este documento. La región está opcionalmente presente en un dominio polipeptídico de la descripción. Pero cuando está presente, la secuencia puede ser de hasta aproximadamente 14 o más restos de aminoácido de longitud, contemplándose específicamente longitudes de 11, 12, 13 y 14. En otras realizaciones, también pueden usarse longitudes de aproximadamente 11, aproximadamente 9, aproximadamente 7, aproximadamente 5, o aproximadamente 3 o menos restos. La descripción incluye realizaciones donde esta región varía considerablemente en secuencia. Ejemplos no limitantes de secuencias HV1 incluyen aquellas presentes en la Figura 3.

65 Los restos de aminoácido en las secuencias descritas pueden sustituirse de forma conservativa, o remplazarse, por otro resto con características y propiedades similares. Como se usa en este documento, se muestran sustituciones

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conservativas de aminoácidos de la descripción en la siguiente Tabla 1. Tabla 1

Definición: Aminoácido Símbolo

Aminoácidos con grupos R alifáticos: Glicina Gly -G

Alanina: Ala -A

Valina: Val -V

Leucina: Leu -L

Isoleucina: Ile -I

Aminoácidos con grupos R hidroxilo: Serina Ser -S

Treonina: Thr -T

Aminoácidos con grupos R que contienen azufre: Cisteína Cys -C

Metionina: Met -M

Aminoácidos ácidos: Ácido aspártico Asp -D

Asparagina: Asn -N

Ácido glutámico: Glu -E

Glutamina: Gln -Q

Aminoácidos básicos: Arginina Arg -R

Lisina: Lys -K

Histidina: His -H

Aminoácidos con anillos aromáticos: Fenilalanina Phe -F

Tirosina: Tyr -Y

Triptófano: Trp -W

Iminoácidos: Prolina Pro -P

5 Descripción detallada de modos de practicar la descripción

General

La descripción se basa en parte en el análisis de la actual información genética de PRRSV, tal como las secuencias

10 de ADN de la proteína GP5. También se analizaron las secuencias de PRRSV aislado de cerdos que muestran síntomas clínicos de PRRS. El análisis condujo a la identificación de dos regiones hipervariables, HV-1 y HV-2, donde la región HV-2 empieza con un motivo tripeptídico X0WL donde X0 es uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural como se describe en este documento. El análisis también condujo a la identificación de una región conservada en las posiciones 142 a T53 en una cepa americana, y las posiciones 144 a T55 en una cepa europea

15 (véase la Figura 1).

La existencia de una región conservada en los ectodominios entre las cepas americanas y las cepas europeas de PRRSV indica que la región conservada participa en el contacto directo entre la proteína GP5, como una proteína de reconocimiento de receptor, y un receptor en una célula hospedadora a infectar por PRRSV. En base a esta idea, y 20 sin limitarse a teoría alguna, se cree que las dos regiones HV en cada lado de la región conservada sirven como "puertas" (motivos estructurales 6r) que mantienen las propiedades hidrófobas de la región conservada. Los comentarios previos sobre la región HV-1 y la región conservada no promovieron los estudios de la inmunogenicidad de la proteína GP5 porque había demasiadas variaciones en el área HV-1. Pero a la luz de la hipervariabilidad en HV-2, fue ilógico esperar que HV-2 participara en las interacciones entre GP5 y un receptor de la célula

25 hospedadora.

La presente descripción también se basa en parte en el reconocimiento de que variaciones en la región HV-1 pueden considerarse en combinación con secuencias HV-2 que presentan menos variación. Por lo tanto, la presente descripción incluye (1) clasificar aislados de PRRSV en base a las variaciones de secuencia de HV2 para agruparlos 30 en base a similitudes inmunológicas; y (2) seleccionar combinaciones de cepas de PRRSV en diferentes grupos para preparar vacunas de amplio espectro que proporcionen una protección heteróloga más amplia tras la administración. La clasificación y selección pueden incluir opcionalmente la consideración de la región HV-1. Además, los aislados primero se atenúan o inactivan opcionalmente antes de su administración como una vacuna o composición inmunogénica. Ejemplos no limitantes de atenuación incluyen métodos conocidos para los especialistas

35 en la técnica, tales como pase en serie en cultivo, tal como en células o tejido, o pase en animales. Por supuesto, el pase puede realizarse in vitro. Ejemplos no limitantes de inactivación incluyen aquellos conocidos para los especialistas en la técnica, tales como calentamiento, irradiación, tratamientos de inactivación química.

La descripción incluye la división opcional de todas las cepas americanas en dos grupos en base a la posición del

40 aminoácido 61. Se ha informado de que más del 85% de los aislados de tipo americano incluyen D (Asp) o S (Ser) en la posición 61. Las excepciones (menos del 15%) habitualmente tienen restos de aminoácido en la posición 61

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diferentes a C (Cys), F (Phe), M (Met), W (Trp), y P (Pro). Por lo tanto, la descripción incluye realizaciones donde el primer resto HV2, correspondiente a la posición 61, es un resto de aminoácido diferente a C, F, M, W, y P. En algunas realizaciones, ese resto se selecciona entre A (Ala), G (Gly), V (Val), L (Leu), I (Ile), S (Ser), T (Thr), N (Asn), E (Glu), Q (Gln), R (Arg), K (Lys), H (His), o Y (Tyr). En realizaciones alternativas, sin embargo, ese resto se

5 selecciona entre C, F, M, W, o P.

La descripción incluye la clasificación opcional en dos grupos para las cepas americanas; grupo D y grupo S, con ocho sub-grupos cada uno (D-1 a D-8 y S-1 a S-8, respectivamente) en base a la información de secuencia observada. La descripción incluye adicionalmente la división de todas las cepas europeas en ocho (8) subgrupos (E1 a E-8) en base a la información de secuencia observada. Estas agrupaciones se ilustran en la Figura 2.

Los grupos y subgrupos son la base para algunas realizaciones de la descripción, donde puede seleccionarse una combinación de al menos un primer y segundo dominio polipeptídico (conteniendo cada uno un motivo GP5 conservado unido covalentemente a un HV2 como se describe en este documento) de diferentes grupos o

15 subgrupos, y usarse para producir una composición o vacuna que produzca una respuesta más amplia de anticuerpos o inmune que con el uso de los dominios polipeptídicos por separado (o individualmente). En algunas realizaciones, se usa una combinación de dos a cuatro, o más, dominios polipeptídicos en la práctica de la descripción. En otras realizaciones, el uso de un dominio de un grupo o subgrupo puede provocar la producción de una respuesta de anticuerpos o inmune contra más de un dominio del mismo grupo o subgrupo.

Ejemplos no limitantes de la descripción incluyen combinaciones de al menos cuatro dominios, donde cada uno de los cuatro se selecciona, sin duplicación, entre uno de los 24 subgrupos descritos en este documento como D-1 a D8, S-1 a S-8, y E-1 a E-8. Se proporciona una aproximación básica de la cantidad de combinaciones posibles por la fórmula matemática (24 x 23 x 22 x 21) / (4 x 3 x 2 x 1), o aproximadamente 10.600. Pero en algunas realizaciones,

25 la cantidad de posibles combinaciones se reduce significativamente donde cada combinación contiene al menos un dominio de cada uno de los subgrupos del grupo D y grupo S así como de E-1 a E-8. Se proporciona una aproximación básica de dicho ejemplo por la fórmula (8 x 8 x 8 x 21) / (4 x 3 x 2 x 1), o aproximadamente 448. En otras realizaciones donde se usan solamente subgrupos del grupo D y grupo S, la cantidad de posibles combinaciones también está reducida. Asimismo, realizaciones donde se usan cuatro dominios de E-1 a E-8, la cantidad de posibles combinaciones está adicionalmente reducida.

Más generalmente, una composición o vacuna de la descripción puede incluir al menos un dominio polipeptídico de cada uno de los grupos D y S como se describe en este documento. De modo que una combinación de dos dominios puede tener uno de cada uno de los grupos D y S. En otras realizaciones, una composición o vacuna

35 puede incluir cualquier combinación de un dominio del subgrupo D y/o cualquier combinación de un dominio del subgrupo S. De modo que una combinación de dos dominios puede tener ambos del grupo D o ambos del grupo S o uno de cada grupo. En muchas realizaciones, los dominios polipeptídicos usados en una combinación están presentes en la proteína GP5 de un aislado de PRRSV que se usa como composición o vacuna de la descripción. Por lo tanto, la descripción también incluye la identificación y clasificación de aislados de PRRSV en los mismos grupos y subgrupos descritos en este documento en base a la secuencia de HV-2 en la proteína GP5. Los aislados clasificados después pueden seleccionarse como se describe.

Como ejemplos no limitantes adicionales, una composición o vacuna de la descripción puede contener

45 un aislado o dominio del subgrupo D-1 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo D o cualquier subgrupo S o E; un aislado o dominio del subgrupo D-2 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo D o cualquier subgrupo S o E; un aislado o dominio del subgrupo D-3 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo D o cualquier subgrupo S o E; un aislado o dominio del subgrupo D-4 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo D o cualquier subgrupo S o E; un aislado o dominio del subgrupo D-5 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo D o cualquier subgrupo S o E;

55 un aislado o dominio del subgrupo D-6 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo D o cualquier subgrupo S o E; un aislado o dominio del subgrupo D-7 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo D o cualquier subgrupo S o E; o un aislado o dominio del subgrupo D-8 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo D o cualquier subgrupo S o E.

Como alternativa, una composición o vacuna de la descripción puede contener

un aislado o dominio del subgrupo S-1 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de

65 cualquier otro subgrupo S o cualquier subgrupo D o E; un aislado o dominio del subgrupo S-2 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de

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cualquier otro subgrupo S o cualquier subgrupo D o E; un aislado o dominio del subgrupo S-3 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo S o cualquier subgrupo D o E; un aislado o dominio del subgrupo S-4 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de

5 cualquier otro subgrupo S o cualquier subgrupo D o E; un aislado o dominio del subgrupo S-5 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo S o cualquier subgrupo D o E; un aislado o dominio del subgrupo S-6 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo S o cualquier subgrupo D o E; un aislado o dominio del subgrupo S-7 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo S o cualquier subgrupo D o E; o un aislado o dominio del subgrupo S-8 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo S o cualquier subgrupo D o E.

15 Asimismo, realizaciones de la descripción incluyen una composición o vacuna de la descripción que puede contener

un aislado o dominio del subgrupo E-1 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo E, D, o S; un aislado o dominio del subgrupo E-2 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo E, D, o S; un aislado o dominio del subgrupo E-3 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo E, D, o S; un aislado o dominio del subgrupo E-4 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo E, D, o S;

25 un aislado o dominio del subgrupo E-5 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo E, D, o S; un aislado o dominio del subgrupo E-6 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo E, D, o S; un aislado o dominio del subgrupo E-7 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo E, D, o S; o un aislado o dominio del subgrupo E-8 y al menos uno o más (tal como dos o tres o más) aislados o dominios de cualquier otro subgrupo E, D, o S.

En algunas realizaciones, sin embargo, una combinación de la descripción no es una combinación de los

35 ectodominios GP5 de VR2332 y LV como se describe en este documento. En otras realizaciones, una combinación de la descripción no es una combinación de solamente ectodominios GP5 con las siguientes secuencias uniendo el límite entre HV2 y la región transmembrana putativa de GP5:

ANKFDWAVET (SEC ID Nº 7) ANKFDWAVEP (SEC ID Nº 8) AGEFDWAVET (SEC ID Nº 9) ADKFDWAVEP (SEC ID Nº 10) ADRFDWAVEP (SEC ID Nº 11) o SSHFGWAVET (SEC ID Nº 12).

45 Pero realizaciones específicamente contempladas de la invención incluyen combinaciones de dominios donde tanto el resto X0 en X0WL como al menos un resto adicional en la secuencia HV2 difieren ambos entre los dominios de una combinación.

Como se describe en este documento, cada dominio polipeptídico (y por tanto cada aislado) contiene el motivo GP5 conservado representado por la secuencia de aminoácidos C(E/S)LNG(T/A), SEC ID Nº 1. De modo que realizaciones de la descripción incluyen dominios donde el motivo GP5 está representado por la secuencia de aminoácidos CELNGT (SEC ID Nº 2), CELNGA (SEC ID Nº 3), CSLNGT (SEC ID Nº 4), o CSLNGA (SEC ID Nº 5). En otras realizaciones, el motivo GP5 conservado es más grande y está representado por la secuencia de

55 aminoácidos I(Y/F)(N/D/S/K)(L/S/F/M)(T/P/M)(L/I)C(E/S)LNG(T/A), SEC ID Nº 6, que corresponde a la "región conservada" mostrada en la Figura 1,

Composiciones basadas en virus

La descripción se basa en la antigenicidad y/o inmunogenicidad del motivo GP5 conservado y HV2 en un dominio polipeptídico, usados en combinación, como se describe en este documento. Por tanto la descripción incluye combinaciones de aislados virales como se ha descrito anteriormente. Ejemplos no limitantes incluyen combinaciones de los aislados virales enumerados en la Figura 3 (basados en su información depositada de secuencia) que pueden clasificarse en los grupos y subgrupos descritos en este documento. En algunas

65 realizaciones, se contemplan combinaciones de al menos dos o más, tal como tres o cuatro o más, de esos aislados para su uso en la práctica de la descripción.

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Además, la descripción incluye una combinación de un aislado viral y una partícula de virus donde cada uno contiene un polipéptido de una combinación descrita en este documento. En otras realizaciones, se usan dos o más partículas de virus. Ejemplos no limitantes de un dominio polipeptídico que contiene partícula de virus de la descripción incluyen una partícula de virus infecciosa o no infecciosa, que es independientemente competente o

5 incompetente en replicación. Ejemplos no limitantes adicionales incluyen una partícula de virus cultivada o pasada in vitro; un virus atenuado; y una partícula viral recombinante.

En muchas realizaciones, una partícula viral es una partícula PRRSV con una membrana externa que contiene una proteína GP5 con un dominio polipeptídico de la descripción. En otras realizaciones, la partícula viral puede ser virus PRRS con una membrana externa que contiene un dominio polipeptídico, opcionalmente como parte de una proteína GP5, como se describe en este documento. Realizaciones adicionales incluyen una partícula viral PRRSV o no PRRSV con una membrana externa que contiene dos o más de los dominios polipeptídicos descritos, tal como mediante dos o más proteínas GP5 con diferentes ectodominios como se describe en este documento. En algunos casos, una partícula viral es un PRRSV con un genoma que contiene múltiples copias de secuencias ORF5 que

15 codifican proteína GP5. Dichos aislados de virus se han presentado previamente y se mencionan como PRRSV "mutante de sobreproducción" o de "fenotipo de elevada replicación". La presente descripción incluye dicho PRRSV que se ha modificado de forma recombinante para que contenga y exprese más de una proteína GP5, conteniendo cada una un dominio polipeptídico con una diferente región HV2 como se describe en este documento. En otras realizaciones, un virus recombinante puede ser un virus de insecto, tal como Baculovirus, que se ha presentando previamente como capaz de expresar la proteína GP5 de PRRSV, un adenovirus porcino, o un poxvirus.

En otras realizaciones, un aislado de virus o partícula viral es una que es infecciosa y competente en replicación, tal como un aislado o partícula infecciosa de PRRSV. En la mayoría de los casos, la partícula contiene un genoma que codifica y es capaz de expresar proteína GP5 después de infección in vivo para producir GP5. Una partícula que es

25 tanto infecciosa como competente en replicación puede mencionarse como virión. En realizaciones alternativas, una partícula de la descripción es infecciosa e incompetente en replicación, pero opcionalmente capaz de expresar de forma intracelular proteínas GP5.

En realizaciones que comprenden el uso de un aislado PRRSV, el aislado puede identificarse o seleccionarse en base a la secuencia del HV2 en un aislado. En algunos casos, tal como aquel de un aislado representado en la Figura 3 en este documento, la identificación o selección puede basarse en la revisión de la información de secuencia o puede basarse en el conocimiento de la secuencia HV2 en un aislado caracterizado. En otros casos, tal como cuando el aislado no se ha caracterizado previamente, la selección puede ser por detección de la secuencia HV2, tal como mediante el uso de un anticuerpo que reconoce una secuencia HV2 dada; secuenciación de la

35 secuencia codificante de GP5 (ORF5) del aislado; o purificación y secuenciación de aminoácidos de la proteína GP5 per se. Ejemplos no limitantes de detección basada en anticuerpos incluyen inmunoprecipitación y ensayos tales como ELISA, RIA, y transferencia de Western. Ejemplos no limitantes de secuenciación incluyen secuenciación basada en didesoxinucleótidos de moléculas de ADN y secuenciación basada en PCR, incluyendo métodos basados en transcripción inversa de una molécula de ARN que codifica GP5 seguidos de PCR. En algunas realizaciones, la selección de un aislado incluye la detección de la secuencia de una o más partes de la proteína GP5 más allá del HV2, tal como el motivo conservado y/o el HV1.

En muchas realizaciones de un método de detección basado en anticuerpos, el anticuerpo no se une a la proteína GP5 encontrada en múltiples cepas y aislados PRRSV. En su lugar, el anticuerpo debe ser suficientemente

45 específico para el HV2 de modo que sea capaz de detectar un aislado particular basado en la totalidad o en parte de la secuencia HV2 o estructura. Además del uso de un anticuerpo, tal como un anticuerpo marcado para facilitar su detección, también puede usarse un fragmento de anticuerpo que se une al HV2 de una proteína GP5 de PRRSV. El fragmento de anticuerpo puede ser la región Fv o Fab de un anticuerpo de unión a HV2; otros ejemplos no limitantes incluyen un anticuerpo de cadena sencilla, incluyendo una región Fv de cadena sencilla y una región Fab de cadena sencilla. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo son preferiblemente monoclonales pero pueden ser policlonales en algunos casos.

En otras realizaciones, la detección de un aislado PRRSV es mediante el uso de una muestra de un fluido biológico de un sujeto porcino, tal como individuo infectado con PRRSV. El método puede comprender poner en contacto la

55 muestra, o una forma diluida de la misma, con un agente de unión que se une al HV2 de la proteína GP5, preferiblemente para la exclusión de otras moléculas presentes en el fluido biológico. En muchas realizaciones, el sujeto es un cerdo, y la muestra puede ser de un fluido corporal o secreción de un cerdo. Ejemplos no limitantes de cerdos de los cuales pueden obtenerse muestras para su uso con la presente descripción incluyen verracos, cerdas jóvenes, de engorde, y cerdas. Los cerdos pueden variar en edad de 1 a aproximadamente 30, 31 a aproximadamente 40, 41 a aproximadamente 50, o 51 a aproximadamente 60 días o de más edad.

Por supuesto, el fluido biológico debe ser un fluido en que proteína GP5 y/o las partículas PRRSV estén presentes de forma detectable. Ejemplos no limitantes incluyen secreciones corporales tales como saliva, lágrimas, muco, descarga nasal, y secreciones vaginales así como otros fluidos corporales tales como sangre, suero, plasma,

65 semen, fluido seminal, y orina así como cualquier componente fluido de heces o un extracto fluido de heces.

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Cuando el fluido biológico contiene partículas PRRSV, la detección puede ser mediante el uso de un método basado en PCR para detectar una molécula de ácido nucleico que codifica proteína GP5, tal como una molécula de ADN o ARN que contiene una proteína GP5 o una parte de la molécula que codifica al menos el HV2.

5 En realizaciones adicionales, la selección y detección puede ser de, o para, un aislado PRRSV que tenga una proteína GP5 con una secuencia HV2 que difiere de cualquiera descrita en este documento o caracterizada previamente. Dicho nuevo aislado aún puede ser clasificable en uno de los grupos o subgrupos descritos en este documento. Como alternativa, dicho aislado puede no ser clasificable en uno de los grupos o subgrupos descritos y por tanto puede usarse ventajosamente como parte de una combinación descrita porque el nuevo aislado tendría una mayor probabilidad de producir una nueva respuesta de anticuerpos o inmune.

La descripción por tanto incluye un método para producir una respuesta de anticuerpos o inmune en un sujeto mediante el uso de un aislado PRRSV que comprende una proteína GP5 con una secuencia HV2 que difiere de cualquier secuencia HV2 descrita en este documento. El HV2 del aislado puede por tanto no ser ninguno descrito en

15 este documento o abarcado por cualquiera de los grupos o subgrupos descritos. El método puede comprender identificar un aislado PRRSV que comprenda una molécula de polipéptido GP5 que contenga una región HV2 distinta de cualquier secuencia HV2 de la Figura 3, o cualquier subgrupo D, S, o E, y administrar dicho aislado a dicho sujeto para producir una respuesta de anticuerpos o inmune en dicho sujeto. La identificación o determinación de una secuencia HV2 distinta puede ser mediante cualquier medio descrito en este documento, incluyendo un método basado en anticuerpo o ácido nucleico como ejemplos no limitantes, seguido de comparación con la presente descripción. En algunas realizaciones, el aislado se atenúa o inactiva como se describe en este documento.

Polipéptidos y composiciones

25 La descripción se basa en la antigenicidad y/o inmunogenicidad de un dominio polipeptídico que contiene el motivo GP5 conservado y HV2 como se describe en este documento. La parte HV2 contribuye a la antigenicidad y/o inmunogenicidad del dominio de modo que el uso, en combinación, de moléculas polipeptídicas que contienen dos dominios diferentes, provoca la generación de una respuesta de anticuerpos o inmune más amplia en comparación con el uso de solamente uno de los dominios. Por consiguiente, la descripción incluye combinaciones de dos o más dominios polipeptídicos, tal como en una composición o vacuna, así como su uso en un método para inmunizar a un sujeto.

La naturaleza de un dominio polipeptídico se ha descrito en este documento. Generalmente, el dominio contiene un 35 motivo GP5 conservado unido covalentemente a una región HV2. Muchas realizaciones tienen un enlace peptídico,

o enlace amida, que une el motivo GP5 y el HV2 de modo que son contiguos cuando se considera la secuencia desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal. Otras realizaciones incluyen el uso de un motivo enlazador. Ejemplos no limitantes de un motivo enlazador incluyen una secuencia peptídica corta, tal como de aproximadamente 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos de longitud, y un enlazador no peptídico, tal como una cadena corta de átomos con al menos un átomo de carbono en la cadena u otro enlazador sintético. En casos de una secuencia peptídica corta, los aminoácidos pueden ser cualquier aminoácido de origen natural, tal como los 20 aminoácidos de la Tabla 1 de este documento. En algunas realizaciones alternativas, el motivo y HV2 pueden unirse covalentemente mediante una unión no de enlace peptídico, tal como un enlace carbono-carbono.

45 Con el uso del primer y segundo dominios polipeptídicos, los dominios pueden localizarse en la misma molécula polipeptídica o dos moléculas diferentes. En muchas realizaciones, los dominios están localizados en moléculas polipeptídicas diferentes, incluyendo cada una de las cuales un dominio transmembrana u otro dominio proteico que permita la asociación con una bicapa lipídica. Un dominio transmembrana también puede estar presente en una única single molécula polipeptídica que contenga ambos dominios. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana es la región transmembrana putativa de una proteína GP5 de PRRSV como saben los especialistas en la técnica y como se describe en este documento.

En muchas realizaciones, los dominios están localizados en proteínas GP5 diferentes. En otras numerosas realizaciones, los dominios tienen secuencias idénticas en el motivo GP5 conservado, tal como aquella representada

55 por CELNGT (SEC ID Nº 2). Pero incluso even con un motivo GP5 conservado idéntico, el primer y segundo dominios polipeptídicos difieren en la secuencia HV2, que explica la diferencia deseada en la antigenicidad y/o inmunogenicidad entre los dominios.

En muchas realizaciones de proteínas GP5 diferentes que contienen el primer y segundo dominios polipeptídicos, cada proteína GP5 puede comprender, desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal, una secuencia señal putativa, una región hipervariable HV-1, una región conservada (CR) que contiene el motivo GP5 conservado, la región hipervariable HV-2, una región transmembrana putativa, y el resto de la proteína GP5. En otras realizaciones, una proteína GP5 puede carecer de todo o parte de la secuencia señal putativa. Por supuesto, también pueden usarse moléculas polipeptídicas que retienen las propiedades antigénicas y/o inmunogénicas de los 65 dominios polipeptídicos descritos, pero con menos componentes GP5. Ejemplos no limitantes incluyen una molécula polipeptídica que comprende la región hipervariable HV-1, una región conservada (CR) que contiene el motivo GP5

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conservado, y la región hipervariable HV-2, opcionalmente con un dominio transmembrana como se ha descrito anteriormente.

Generalmente, una región HV2 descrita es de aproximadamente 8 restos de aminoácido de longitud. En

5 realizaciones alternativas, la longitud puede ser de 6, 7, 8, 9, ó 10 restos de longitud. La cantidad exacta de restos no es importante siembre que el dominio resultante retenga la actividad antigénica y/o inmunogénica deseada. En algunas realizaciones, el HV2 empieza con la secuencia tripeptídica X0 WL donde X0 es como se define en este documento. De modo que en algunas realizaciones, el HV2 está representado por la secuencia X0WLX1X2X3X4X5, donde cada uno de X0, X1, X2, X3, y X4 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural mostrados en la Tabla 1, y X5 se selecciona entre cualquier resto de aminoácido, con excepción opcional de C (Cys), F (Phe), M (Met), W (Trp), y P (Pro).

En otras realizaciones, el HV2 es una secuencia del grupo D representada por X0WLX1X2X3X4D, donde el resto de ácido aspártico (D) (al final de X0WLX1X2X3X4D) puede remplazarse por cualquier resto de aminoácido excepto C, F, 15 M, P, W, S, T, e Y (tal como remplazo por A, G, V, L, I, N, E, Q, R, K, o H) y donde X0 es como se ha descrito anteriormente, y uno de los subgrupos D-1 a D-8, que están representados por los siguientes

D-1: donde X1 es un resto de aminoácido alifático, X2 es un resto de aminoácido ácido (o donde X1 es un resto de aminoácido ácido y X2 es un resto de aminoácido alifático), X3 es un resto de aminoácido básico, y X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F); D-2: donde X1 es un resto de aminoácido alifático, X2 es Ser, Thr, Tyr o un resto de aminoácido básico (o donde X1 es Ser, Thr, Tyr o un resto de aminoácido básico y X2 es un resto de aminoácido alifático), X3 es un resto de aminoácido básico, y X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F); D-3: donde cada uno de X1 y X2 es independientemente un resto de aminoácido alifático, X3 es un resto de

25 aminoácido básico, y X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F); D-4: donde X1 es un resto de aminoácido ácido, X2 es Ser, Thr, Tyr o un resto de aminoácido básico (o donde X1 es Ser, Thr, Tyr o un resto de aminoácido básico y X2 es un resto de aminoácido ácido), X3 es un resto de aminoácido básico, y X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F); D-5: donde cada uno de X1 y X2 es independientemente un resto de aminoácido ácido, X3 es un resto de aminoácido básico, y X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F); D-6: donde cada uno de X1 y X2 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, X3 es un resto de aminoácido ácido, y X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F); D-7: donde cada uno de X1 y X2 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, X3

35 es un resto de aminoácido no aromático con un grupo R que contiene hidroxilo (tal como Ser o Thr), y X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F); o D-8: donde cada uno de X1 y X2 es independientemente un resto de aminoácido básico o un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como tirosina (Y), serina (S), treonina (T), o fenilalanina (F), X3 es un resto de aminoácido básico, y X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F). En realizaciones adicionales, el HV2 es una secuencia del grupo S representada por X0WLX1X2X3X4X5 (donde X0 es como se ha descrito anteriormente) y uno de los subgrupos S-1 a S-8, que están representados por los siguientes S-1: donde X1 es un resto de aminoácido ácido, X2 es asparagina (N), X3 es un resto de aminoácido básico, X4

45 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F), y X5 es S; S-2: donde cada uno de X1 y X2 es independientemente un resto de aminoácido ácido excepto que X2 no es asparagina (N), X3 es un resto de aminoácido básico, X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F), y X5 es S; S-3: donde X1 es un resto de aminoácido alifático, X2 es un resto de aminoácido ácido (o donde X1 es un resto de aminoácido ácido y X2 es un resto de aminoácido alifático), X3 es un resto de aminoácido básico, X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F), y X5 es S; S-4: donde X1 es un resto de aminoácido alifático, X2 es Ser, Thr, Tyr o un resto de aminoácido básico (o donde X1 es Ser, Thr, Tyr o un resto de aminoácido básico y X2 es un resto de aminoácido alifático; o donde cada uno de X1 y X2 es independientemente Ser, Thr, Tyr o un resto de aminoácido básico; o donde cada uno de X1 y X2

55 es independientemente un resto de aminoácido alifático), X3 es un resto de aminoácido básico, X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F), y X5 es S; S-5: donde X1 es un resto de aminoácido ácido, X2 es Ser, Thr, Tyr o un resto de aminoácido básico (o donde X1 es Ser, Thr, Tyr o es un resto de aminoácido básico y X2 es un resto de aminoácido ácido excepto N (Asn)), X3 es un resto de aminoácido básico, X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F), y X5 es S; S-6: donde X1 es un resto de aminoácido básico, X2 es una asparagina (N), X3 es un resto de aminoácido básico, X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F), y X5 es S; S-7: donde cada uno de X1 y X2 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, X3 es un resto de aminoácido básico, X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como

65 fenilalanina (F), y X5 es T o Y; o

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S-8: donde X1 es un resto de aminoácido ácido, X2 es un resto de aminoácido ácido (o donde X1 es un resto de aminoácido ácido y X2 es un resto de aminoácido alifático, o como alternativa donde X1 es un resto de aminoácido alifático y X2 es un resto de aminoácido ácido), X3 es un resto de aminoácido ácido, X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F), y X5 es S.

5 En otras realizaciones adicionales, el HV2 es una secuencia del grupo E representada por uno de los subgrupos E-1 a E-8 siguientes:

la secuencia NWLSX1X3X4X5 (representada por E-1), donde cada uno de X2, X3, y X4 es independientemente uno de los 20 aminoácidos de origen natural, y X5 es un resto de aminoácido ácido o alifático; la secuencia X0WLX1X2X3X4X5 (representada por E-2), donde X0 es un resto de aminoácido ácido excepto asparagina (N); cada uno de X1, X2, X3, y X4 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, y X5 es un resto de aminoácido ácido o alifático; la secuencia X0WLX1X2X3X4X5 (representada por E-3), donde X0 es un resto de aminoácido básico, cada uno de

15 X1, X2, X3, y X4 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, y X5 es un resto de aminoácido ácido o alifático; la secuencia X0WLX1X2X3X4X5 (representada por E-4), donde X0 es cualquier resto de aminoácido no ácido y no básico, cada uno de X1, X2, X3, y X4 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, y X5 es un resto de aminoácido ácido o alifático; la secuencia NWLSX2X3X4X5 (representada por E-5), donde cada uno de X2, X3 y X4 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, y X5 es serina (S) o treonina (T); la secuencia X0WLX1NX3X4X5 (representada por E-6), donde X0 es cualquier resto de aminoácido excepto asparagina (N), cada uno de X1, X3, y X4 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, y X5 es serina (S) o treonina (T);

25 la secuencia X0WLX1X2X3X4X5 (representada por E-7), donde X0 es un resto de aminoácido ácido excepto asparagina (N), cada uno de X1, X2, X3, y X4 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural excepto que X2 no es asparagina (N), y X5 es cualquier resto de aminoácido no ácido; o la secuencia X0WLX1X2X3X4X5 (representada por E-8), donde X0 es cualquier resto de aminoácido no ácido, cada uno de X1, X2, X3, y X4 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, y X5 es cualquier resto de aminoácido no ácido. El término "no ácido" se refiere a un resto de aminoácido diferente a un aminoácido ácido; y el término "no básico" se refiere a un resto de aminoácido diferente a un aminoácido básico.

En realizaciones de moléculas polipeptídicas diferentes que contienen el primer y segundo dominios polipeptídicos,

35 las moléculas polipeptídicas pueden administrarse juntas o por separado en los métodos descritos en este documento. Cuando se administran juntas, pueden formularse como una composición. Opcionalmente, la composición comprende uno o más vehículos o excipientes o adyuvantes aceptables según deseen los especialistas en la técnica.

Métodos de preparación

La descripción incluye un método para preparar dominios polipeptídicos y moléculas polipeptídicas como se describe en este documento. En algunas realizaciones, un péptido o polipéptido corto puede prepararse mediante el uso de síntesis de novo, tal como por métodos químicos automatizados conocidos para los especialistas en la técnica.

45 Como alternativa, la preparación puede ser mediante el uso de métodos de ADN recombinante basados en la disponibilidad de moléculas de ácido nucleico que codifican los dominios polipeptídicos y moléculas polipeptídicas de la descripción. Las secuencias de las moléculas de ácido nucleico pueden modificarse mediante técnicas conocidas, tales como, aunque sin limitación, mutagénesis basada en PCR y síntesis de novo de moléculas de ácido nucleico, tal como por métodos químicos automatizados conocidos para los especialistas en la técnica.

Puede usarse un método basado en el uso de técnicas de ADN recombinante para producir un polipéptido descrito. Dicho método puede comprender la expresión de una molécula de ácido nucleico en un sistema de expresión adecuado, tal como un sistema de cultivo celular in vitro o en un animal productor, y el aislamiento del polipéptido expresado a partir del sistema de expresión. El sistema de expresión puede comprender una secuencia de ácido

55 nucleico que codifica un polipéptido descrito y unido de forma funcional a una secuencia reguladora o promotora adecuada. Ejemplos no limitantes de una célula o línea celular adecuada incluyen macrófagos alveolares porcinos, CRL 11171, MA-104, MARC-145, PSP-36, y PSP-36-SAH. Un ejemplo no limitante de un animal productor es un cerdo, tal como verracos, cerdas jóvenes, de engorde, o cerdas.

Después de producir un dominio polipeptídico descrito, el método puede comprender la selección y/o combinación del mismo como un primer dominio polipeptídico con un segundo dominio polipeptídico como se describe en este documento para formar una composición. La combinación puede comprender la adición de uno o más vehículos, excipientes y/o adyuvantes aceptables para formar una composición.

65 En algunas realizaciones, tal como con una molécula de ácido nucleico basada en PRRSV, el sistema de expresión produce partículas virales que incorporan un polipéptido descrito dentro de la membrana externa de la partícula. La

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molécula de ácido nucleico basada en PRRSV puede ser un genoma viral que se ha modificado para expresar una proteína GP5 que contiene una región HV2 como se describe en este documento. En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico contiene más de una copia de una secuencia que codifica proteína GP5, donde cada copia codifica una región HV2 diferente como se describe en este documento. En otras realizaciones, el sistema de

5 expresión está libre de células, tal como en el caso de un sistema de reticulocitos de conejo.

También se proporcionan otros métodos para producir partículas PRRSV. En algunas realizaciones, la producción comprende la selección y/o aislamiento de aislados PRRSV como se describe en este documento. La selección y/o aislamiento puede comprender el cultivo o pase de un aislado como saben los especialistas en la técnica o como se describe en este documento. En realizaciones alternativas, la selección puede ser de un aislado de un sujeto infectado, tal como un cerdo, y comprende adicionalmente la obtención de fluido y/o tejido infeccioso del sujeto para su uso como fuente de una región HV2 como se describe en este documento. Ejemplos no limitantes de un fluido y/o tejido infeccioso incluyen sangre, suero, plasma, secreción nasal, semen, fluido seminal, y orina así como tejido pulmonar, tejido de amígdala, tejido de ganglio linfático, un componente fluido de heces o un extracto fluido de

15 heces. En algunas realizaciones, el fluido y/o tejido infeccioso puede usarse como parte de una combinación descrita. Ejemplos no limitantes incluyen el uso de un fluido o tejido como un inóculo en combinación con una segunda región HV2, opcionalmente en una molécula polipeptídica o una partícula viral como se describe en este documento.

Métodos de uso

La descripción incluye un método para generar una respuesta de anticuerpos o inmune en un sujeto mediante la administración de una combinación descrita de primer y segundo dominios polipeptídicos. En algunas realizaciones, el método comprende la administración de una composición descrita en una cantidad eficaz para producir una 25 respuesta de anticuerpos y/o inmune. En muchos casos, la cantidad administrada es eficaz para producir un estado protegido en un sujeto tratado contra una posterior exposición por uno o más aislados PRRSV, tal como infección por PRRSV. En algunos casos, un método puede incluir además una administración adicional de una composición descrita como "refuerzo". Ejemplos no limitantes del sujeto incluyen a cerdas jóvenes, cerdas, cerdas jóvenes preñadas, o cerdas preñadas. En algunas realizaciones, el sujeto es un cerdo de aproximadamente 1 a 12 semanas de edad, tal como de aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, o aproximadamente 11 semanas. En otras realizaciones, el cerdo es de aproximadamente 12 a aproximadamente 56 semanas o de edad mayor, tal como de aproximadamente 14, aproximadamente 16, aproximadamente 18, aproximadamente 20, aproximadamente 22, aproximadamente 24, aproximadamente 26, aproximadamente 28,

35 aproximadamente 30, aproximadamente 32, aproximadamente 34, aproximadamente 36, aproximadamente 38, aproximadamente 40, aproximadamente 42, aproximadamente 44, aproximadamente 46, aproximadamente 48, aproximadamente 50, aproximadamente 52, o aproximadamente 54 semanas. En realizaciones adicionales, el cerdo se ha destetado y/o ha pasado la fase en la que los anticuerpos maternos proporcionan protección adecuada.

Una cantidad eficaz de una combinación o composición descrita, como una vacuna, para producir un estado protegido en un sujeto, tal como un cerdo, también puede determinarse mediante administración de la vacuna a un cerdo no afectado, seguido de exposición con aislado PRRSV. En algunos casos, el aislado puede estar purificado o aislado en que sus partículas de virus tienen el mismo genoma o la misma proteína GP5 o el mismo ectodominio GP5. Ejemplos no limitantes de aislados para su uso en una exposición incluyen aquellos enumerados en la Figura 3

45 así como un fluido corporal o tejido infeccioso de un animal infectado con el aislado. En algunas realizaciones, la exposición puede ser después de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 semanas después de una vacunación de refuerzo, y puede ser con una cantidad grande o en exceso de PRRSV.

La vacuna o cantidad de la misma es eficaz si reduce la gravedad de cualquier síntoma de infección por PRRSV y/o cualquier cambio grande o histopatológico cuando se compara con los resultados de exponer un cerdo no vacunado (no tratado con la vacuna) con el mismo aislado. Por supuesto, el cerdo debe estar libre de PRRSV, tal como un cerdo que no se ha expuesto previamente al virus o que se ha expuesto pero está libre de síntomas durante un periodo suficiente de tiempo para identificarlo como no infectado. Como alternativa, el cerdo puede identificarse como no infectado mediante el uso de un ensayo para detectar la presencia de PRRSV o anticuerpos anti-PRRSV

55 en una muestra de fluido corporal o tejido del cerdo.

Ejemplos no limitantes de síntomas de infección por PRRSV incluyen fiebre, dificultad respiratoria, cianosis, neumonía, letargia, estornudos, tos, edema ocular, orejas azules, y lesiones cardiacas y/o cerebrales. Además, la presencia del aislado usado en la exposición puede determinarse mediante otros métodos cuantitativos o cualitativos. Ejemplos no limitantes incluyen detección de lesiones pulmonares, o virus en una muestra de sangre o suero, en un cerdo expuesto, con o sin vacunación, después de aproximadamente 2 días a aproximadamente 2 semanas. Una disminución en las lesiones en un cerdo vacunado, en comparación con un cerdo no tratado, proporciona un medio cuantitativo para detectar infección. Como alternativa, la detección de virus en la sangre o suero de un cerdo vacunado indica que la vacunación puede no haber sido eficaz mientras que una detección

65 negativa de virus indica que la vacunación puede haber sido eficaz.

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La estimulación eficaz de inmunoprotección en un sujeto puede mediarse mediante la generación de una respuesta de anticuerpos y/o inmune después de exposición a una combinación o composición de la descripción. Ejemplos no limitantes del sujeto pueden ser un cerdo que no se ha expuesto previamente a PRRSV o un cerdo que se ha expuesto a PRRSV o que padece los efectos de infección por PRRSV. En muchas realizaciones, la producción de

5 una respuesta de anticuerpos incluye la producción de anticuerpos neutralizantes contra la proteína GP5, incluyendo todo o parte del HV2 en la misma. La confirmación de la generación de dichos anticuerpos puede realizarse ensayando sangre o suero de un animal tratado para la presencia de dichos anticuerpos. Ejemplos no limitantes de dichos ensayos de detección de anticuerpos incluyen ELISA, RIA, y transferencia de Western.

La descripción incluye un método para producir una respuesta de anticuerpos y/o inmune en un sujeto como se describe en este documento. En algunas realizaciones, el método comprende al menos i) identificar o seleccionar un primer aislado PRRSV que comprende una molécula polipeptídica que contiene una primera región hipervariable HV-2; ii) identificar o seleccionar un segundo aislado PRRSV que comprende una molécula polipeptídica que contiene una segunda región hipervariable HV-2 diferente de dicha primera región hipervariable; y iii) administrar el

15 primer y segundo aislados a un sujeto para producir una respuesta de anticuerpos y/o inmune en dicho sujeto. En algunas realizaciones, el método puede incluir selección de uno o más aislados adicionales con diferentes regiones HV-2 adicionales seguida de su administración con el primer y segundo aislados. En otras realizaciones, el método puede incluir la administración de uno o más aislados no seleccionados con el primer y segundo aislados.

La cantidad del primer y segundo aislados a administrar debe, por supuesto, ser suficiente para producir una respuesta de anticuerpos y/o inmune deseada. En algunas realizaciones, la cantidad administrada es suficiente para producir un estado vacunado o protegido en el sujeto contra posterior infección por PRRSV por uno o más aislados.

En algunos casos, la identificación o selección puede comprender i) análisis de secuencia de aminoácidos de la

25 región hipervariable HV-2 del ectodominio GP5 de PRRSV; ii) detección basada en PCR o basada en anticuerpos de la región hipervariable HV-2 del ectodominio GP5 de PRRSV; o iii) conocimiento de la secuencia de la región hipervariable HV-2 del ectodominio GP5 de PRRSV respecto a otro aislado.

En otras realizaciones, un método para producir una respuesta de anticuerpos y/o inmune comprende la administración de un primer dominio polipeptídico (antigénico) que comprende una región HV-2 seleccionada entre D-1, D-2, D-3, D-4, D-5, D-6, D-7, o D-8, y un segundo dominio polipeptídico (antigénico) que comprende una región HV-2 seleccionada entre S-1, S-2, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, o S-8. En muchos casos, la combinación con dos o más dominios polipeptídicos (antigénicos) diferentes seleccionados entre D-1, D-2, D-3, D-4, D-5, D-6, D-7, D-8, S-1, S-2, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7 y S-8 se usa ventajosamente en América del norte.

35 En otras realizaciones, la administración comprende dos o más dominios polipeptídicos (antigénicos) seleccionados entre E-1, E-2, E-3, E-4, E-5, E-6, E-7, y E-8. En muchos casos, esta combinación se usa ventajosamente en Europa. En realizaciones adicionales, una combinación de dos o más dominios polipeptídicos (antigénicos) diferentes puede seleccionarse entre los 24 subgrupos dependiendo de los aislados PRRSV encontrados en una región geográfica particular. Ejemplos no limitantes incluyen los aislados encontrados en Corea del sur, China, Japón, sudeste asiático, o América del sur. En realizaciones adicionales, una combinación usada en Corea del sur, China, o Japón puede ser igual que una usada en América del norte. En otras realizaciones, un dominio de cualquiera de E-1, E-2, E-3, E-4, E-5, E-6, E-7, y E-8 puede excluirse de una combinación de dominios para su uso en América del norte o una localización asiática.

45 En otras realizaciones, una combinación de dos o más dominios polipeptídicos (antigénicos), o moléculas polipeptídicas o aislados que los contienen, que comprenden al menos uno de cada uno de los subgrupos detectados en una región geográfica puede administrarse en la práctica de la descripción. La administración de los dominios polipeptídicos (antigénicos), o moléculas polipeptídicas o aislados que los contienen, puede ser por cualquier medio adecuado conocido para los especialistas en la técnica. Ejemplos no limitantes incluyen inyección, administración intranasal, o administración oral, de uno o más aislados descritos o de una o más muestras de células y/o tejido de un sujeto infectado por PRRSV.

Si se administran o aplican por separado, los dominios, o moléculas polipeptídicas o aislados que los contienen,

55 pueden administrarse secuencialmente, con un intervalo de tiempo opcional entre administraciones. Ejemplos no limitantes del intervalo de tiempo incluyen aproximadamente 1 a aproximadamente 2 días; aproximadamente 1, aproximadamente 3, o aproximadamente 5 semanas; aproximadamente 1, aproximadamente 3, aproximadamente 4

o aproximadamente 6 meses, o más tiempo. Pueden usarse los mismos intervalos de tiempo entre un evento de administración primaria y uno o más eventos posteriores de "refuerzo".

Se administren juntas o por separado, la molécula o moléculas polipeptídicas pueden estar unidas a membrana o asociadas a membrana, tal como pos asociación con una bicapa lipídica. En algunos casos, la membrana es de una célula, tal como un fragmento de una membrana celular. En otras realizaciones, la membrana es la de una vesícula, tal como un liposoma, suspensión de aceite-en-agua o agua-en-aceite. Ejemplos no limitantes de una membrana

65 derivada de célula incluyen la membrana externa de una partícula PRRSV u otra partícula viral como se describe en este documento.

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Kits

Los dominios polipeptídicos, moléculas polipeptídicas, y aislados, así como combinaciones y composiciones que los comprenden y sus métodos de uso pueden incorporarse en uno o más kits producidos de acuerdo con 5 procedimientos bien conocidos. La descripción por tanto incluye un kit con uno o más reactivos que comprenden uno

o más dominios polipeptídicos, moléculas polipeptídicas, o aislados, como se describe en este documento, o una combinación o composición que los comprenden, para su uso en uno o más métodos como se describe en este documento. Dicho kit opcionalmente comprende además una descripción identificadora o etiqueta o instrucciones para su uso en uno o más métodos de la presente descripción. Dicho kit puede comprender recipientes, cada uno con uno o más de los diversos reactivos (típicamente en forma concentrada) utilizados en los métodos. También se incluirá típicamente un conjunto de instrucciones.

Habiendo descrito ahora en líneas generales la invención, la misma se entenderá más fácilmente a través de referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo de ilustración, y no pretenden ser limitantes de la 15 presente descripción, salvo que se especifique.

Ejemplos

Ejemplo 1: Fracaso de la secuencia GP5 conservada en generar un estado protegido

La descripción se basa en parte en el reconocimiento de que cerdos previamente infectados con un primer aislado de PRRSV pueden recuperarse pero son susceptibles a un segundo aislado donde ambos aislados contienen una proteína GP5 con la misma secuencia en la región conservada. Ejemplos no limitantes de dichos incidentes se muestran en la siguiente Tabla 2, donde cada incidente implicaba cerdos que se recuperaron de infección con uno

25 de los aislados identificados (el primero de cada serie de incidentes en la tabla) y después se encontraron infectados con al menos un aislado diferente (el segundo de cada uno de los incidentes 1-3 y 5-7) como se indica. Una parte de la secuencia GP5 que incluye el ectodominio en cada uno de los aislados se indica, con la región conservada identificada en la Figura 1 subrayada y las diferentes en la región HV2 indicadas en negrita.

Tabla 2

Incidente/ Número de posición relativa en la proteína GP5 Aislados 21_______31 __________ 41___________51 __________61 nº 1 Q-05-30318 VPFCFVALVN ASNNSSSHLQ LIYNLTICEL___NGTDWLNKSF D (Grupo D-7)

35 Q-06-15248 VPFCFVALVN ASNNSSSHLQ LIYNLTICEL___NGTDWLNKNF D (Grupo D-6)

nº 2 1-03-28077 VPFCFVALVN ASNNSSSHLQ LIYNLTICEL___NGTDWLNKSF D (Grupo D-7) 1-04-32332 VPFCFVALVN ASNNSSSHLQ LIYNLTICEL___NGTDWLDKTF D (Grupo D-7)

nº 3 S-06-20709 VPFCLAALVN ADSNSSSHLQ LIYNLTICEL___NGTDWLNNHF S (Grupo S-1) S-06-20720 VPFCLAALVN ADSNSSSHLQ LIYNLTICEL___NGTDWLNNRF G (Grupo D-5)

45 nº 4 M-05-2912 VPFCFAVLAN ASNNSSSHLQ LIYNLTLCEL __NGTDWLANKF D (Grupo D-1) M-06-13702 VPFCLVALVN ANSNNSSHLQ LIYNLTICEL___NGTDWLNRHF S (Grupo S-5) M-06-18282 VPFCLVALVN ANSNNSSHLQ LIYNLTICEL___NGTDWLNEHF S (Grupo S-2)

nº 5 H-04-10314 VPFCFAALVN ASNNSSSHLQ LIYNLTICEL___NGTDWLNEHF S (Grupo S-2) H-06-14421 VPFCFVALVN ASNNSSSHLQ LIYNLTICEL___NGTDWLNKNF D (Grupo D-6)

nº 6 55 A-00-19757 VPFXFAVIVN ANNNSSSHFQ LIYNLTLCEL __NGTEWLNKKF D (Grupo D-4) A-00-53953 VPFWFAVLVD ANSNSSSHFQLIYNLTICEL___NGTDWLNNKF D (Grupo D-5)

nº 7 G-00-3628 VPSCFVAPVN ANDNNSSKLQLIYNLTLCEL__NGTDWLAGKF D(GrupoD-3) G-05-6157 VPFCFAVIVN ASNNSSSHFQ LIYNLTLCEL __NGTDWLAEHF N (Grupo D-1)

En base a un estudio de dichos incidentes, se hizo un descubrimiento de que anticuerpos dirigidos contra la región conservada en una proteína GP5 de un aislado son insuficientes para proporcionar protección contra un posterior PRRSV. Además, la secuencias de la región HV-1 no proporcionar una explicación adecuada para los incidentes. 65 Una mayoría de los incidentes mostrados incluyen ausencia de cambio en la secuencia HV1. Esto condujo al descubrimiento de que la variación de secuencia en la región HV-2 participa en la evasión de la vigilancia inmune de

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un animal previamente expuesto a un PRRSV con una secuencia diferente en la región HV-2. Indicado de forma diferente, la secuencia conservada en el ectodominio GP5 como se ha mostrado anteriormente es incapaz de producir una respuesta de anticuerpos o inmune que sea protectora contra otro PRRSV con una región HV-2 diferente en la proteína GP5.

5 Este descubrimiento condujo, en parte, a las combinaciones, composiciones y métodos descritos.

Ejemplo 2: Propagación de aislados PRRSV

Se han presentado previamente métodos para la propagación y mantenimiento de aislados PRRSV (véase por ejemplo Meng et al., 1994, J. Gen. Virol. 75:1795-1801 y Meng et al., 1996, J. of Vet. Diag. Invest. 8:374-381). Ejemplos no limitantes incluyen el uso de la línea celular ATCC CRL 11171, que puede cultivarse en monocapas adecuadas para inoculación con un aislado viral. Células y líneas celulares alternativas incluyen MA-104, PSP-36, PSP-36-SAH, MARC-145 y macrófagos alveolares porcinos.

15 Como ejemplo no limitante, puede usarse una multiplicidad de infección (moi) de aproximadamente 0,1, 0,5, o 1 seguido de incubación durante aproximadamente 48 horas antes de la confirmación de infección y replicación viral. La confirmación puede ser por retirada del sobrenadante (medio de cultivo) y fijación de las células seguido de detección con un anticuerpo anti-PRRSV marcado, tal como un anticuerpo monoclonal específico para la proteína N (codificada por ORF 7) o un anticuerpo contra una región HV2 particular de una proteína GP5 como se describe en este documento.

Ejemplo 3: Combinaciones de aislado de virus

25 Como se describe en este documento, los aislados PRRSV pueden clasificarse (identificarse) y seleccionarse para su uso en una combinación de la descripción al menos sobre la base de la secuencia HV2. Los siguientes datos muestran una parte de la secuencia GP5 (incluyendo el ectodominio) en cada uno de los numerosos aislados PRRSV representativos, algunos de los cuales difieren en regiones fuera del ectodominio. Las localizaciones del HV 1, la región conservada (CR), y el HV2 como se describen en este documento se indican en la parte inferior de los datos, siendo la indicación del inicio del HV1 un ejemplo representativo no limitante.

La clasificación de la secuencias en los grupos descritos se incluyen, y pueden usarse combinaciones de aislados de diferentes subgrupos en la práctica de la descripción. De modo que como un ejemplo no limitante, puede usarse una combinación de un aislado D-4 (Ingelvac-ATP), un aislado D-1 (Ingelvac-MLV o uno de MJ-3 a MJ-14), un

35 aislado S-1 (MJ-1 o MJ-2), y un aislado D-3 (MJ-15 o MJ-16) para producir una respuesta inmune en un sujeto como se describe en este documento.

Otro ejemplo no limitante es una combinación de un aislado D-1 (uno de MJ-17 a MJ-27), un aislado D-6 (uno de MJ-28 a MJ-30), un aislado D-2 (MJ-34 o MJ-35), y un aislado D-3 (tal como MJ-36). Todas las demás combinaciones de aislados representadas por los siguientes datos, y de acuerdo con la descripción, se contemplan específicamente para la preparación y uso como se describe en este documento.

Todas las cepas incluyendo la cepa europea (LV)

45 Ingelvac-ATP LVNANSNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLKDKFD (Grupo D-4) VR-2332 LANASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1) Ingelvac-MLV LANASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1) Prime-Pac LVNASYSSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1) MJ-1 LANASSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNNHFS (Grupo S-1) MJ-2 LANANSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNNHFS (Grupo S-1) MJ-3 LANASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1) MJ-4 LANASNGSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1) MJ-5 LANASNHSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1) MJ-6 LANASNNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1)

55 MJ-7 LASASNSSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1) MJ-8 LATPSPSSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1) MJ-9 LANASNANSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1) MJ-11 LANASNVNSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1) MJ-12 LANASNDNSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1) MJ-13 LANASNSNSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1) MJ-14 LANASNSNSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLADKFD (Grupo D-1) MJ-15 LANASNGNSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLAGKFD (Grupo D-3) MJ-16 LANASNSSNSHLQLIYNLTLCELNGTDWLAGKFD (Grupo D-3) MJ-17 LANASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLADKFD (Grupo D-1)

65 MJ-18 LANASNTSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLADKFD (Grupo D-1) MJ-19 LANASNNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLADKFD (Grupo D-1)

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MJ-20: LANANNTSSSHLQLIYNLTLCELNGTDXLAEKFD (Grupo D-1)

MJ-21: LANANNSSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1)

MJ-22: LANASNNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANQFD (Grupo D-6)

MJ-23: LANASSNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1)

5: MJ-24 LANASANSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1)

MJ-25: LANASHNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1)

MJ-26: LANASQNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1)

MJ-27: LANASSNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANRFD (Grupo D-1)

MJ-28: LANASSDNSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANNFD (Grupo D-6)

MJ-29: LANASSDNSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANNFD (Grupo D-6)

MJ-30: LASANSINSPHLQLIYNLTLCELNGTDWLAGEFD (Grupo D-6)

MJ-31: LASASNNSSSRLQLIYNLTLCELNGTDWLADRFN (Grupo D-1)

MJ-32: LADAHSSSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLADRFD (Grupo D-1)

MJ-33: LANAGNNSSSHLQLIYNLTLCELNGTEWLAERFD (Grupo D-1)

15: MJ-34 LGSASSNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLASRFD (Grupo D-2)

MJ-35: LVDANNSSSSHFQLIYNLTICELNGTDWLKARFD (Grupo D-2)

MJ-36: LVDANNSSSSHFQLIYNLTICELNGTDWLAARFD (Grupo D-3)

MJ-37: LVDANGNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANRFD (Grupo D-1)

MJ-38: LVNANSTSSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLGDKFD (Grupo D-1)

MJ-39: LVNANSSSSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLTNKFD (Grupo D-4)

MJ-40: LVNANSSSSSHLQSIYNLTLCELNGTDWLGNKFD (Grupo D-1)

MJ-41: LVDANSSSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLNDKFD (Grupo D-5)

MJ-42: LVDANSSSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLNEKFD (Grupo D-5)

MJ-43: LVNANSSSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLNEKFD (Grupo D-5)

25: MJ-44 LVNANSSSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLADKFD (Grupo D-1)

MJ-45: LVNANSSSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLGNKFD (Grupo D-1)

MJ-46: LANANSSSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLDKKFD (Grupo D-4)

MJ-47: LVNANSASSSHSQLIYNLTLCELNGTDWLDGKFE (Grupo D-1)

MJ-48: LVNANSASSSHSQLIYNLTLCELNGTDWLAGKFE (Grupo D-3)

MJ-49: LVNANSTSSSPFQLIYNLTLCELNGTDWLQGKFN (Grupo D-1)

MJ-50: IANASSNSSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAGKFD (Grupo D-3)

MJ-51: IVNANSNSSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLADKFD (Grupo D-1)

MJ-52: IVNANSNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD (Grupo D-1)

MJ-53: VVNANSNSSSHFQSIYNLTLCELNGTKWLATKFD (Grupo D-2)

35: MJ-54 LDNANSTSSSHFQSIYNLTLCELNGTEWLAENFD (Grupo D-6)

MJ-55: LDNANSTSSSHFQSIYNLTLCELNGTKWLAEHFD (Grupo D-1)

MJ-56: LVNANSTSSSHFQSIYNLTLCELNGTDWLKEKFD (Grupo D-4)

MJ-57: LVDANSSSSSHFQSIYNLTLCELNGTDWLTERFD (Grupo D-4)

MJ-58: LVNANSNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLAQKFD (Grupo D-1)

MJ-59: LVNANSNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLAKKFD (Grupo D-2)

MJ-60: LVDANSNSSSHFQLIYNLTLCELNGPDWLKKNFD (Grupo D-6)

MJ-61: LVNANSNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLKEKFD (Grupo D-4)

MJ-62: LVGANGNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLDEKFD (Grupo D-5)

MJ-63: LVNASSNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLKNKFD (Grupo D-4)

45: MJ-64 LVNAHSNSSSHFQSIYNLTLCELNGTDWLDKKFD (Grupo D-4)

MJ-65: LVNAHDNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLNKKFD (Grupo D-4)

MJ-66: LVNASNTSSSYFQSIYNLTLCELNGTDWLKDKFD (Grupo D-4)

MJ-67: LVNASNSSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLQGKFD (Grupo D-1)

MJ-68: IVNASNSNSSHLQSIYSLTLCELNGTEWLGKNFD (Grupo D-6)

MJ-69: LVNANNSSSSHFQSIYNLTLCELNGTEWLAKNFN (Grupo D-6)

MJ-70: LVNASSNNSSHFQLIYNLTLCELNGTEWLAKNFI (Grupo D-6)

MJ-71: LVNANSSSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLKDKFD (Grupo D-4)

MJ-72: LVNANSNSSSHLQLIYNLTLCELNGADWLKDKFA (Grupo D-4)

MJ-73: LVNASNSNSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLGNKFN (Grupo D-1)

55: MJ-74 LVNANSNNSSHLQLIYNLTLCSLNGTDWLANKFD (Grupo D-1)

MJ-75: LASANNNHSSHLQSIYNLTLCELNGTDWLSDKFD (Grupo D-4)

MJ-76: LASANGNHSSHLQSIYNLTLCELNGTDWLRSRFS (Grupo S-4)

MJ-77: LVGASNTSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLNNHFY (Grupo S-7)

MJ-78: IVDANSNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLNNHFN (Grupo D-5)

MJ-79: LVDANSNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLNNHFT (Grupo S-7)

MJ-80: PVNANNGSSSYSQLIYNLTICELNGTDWLNSKFD (Grupo D-4)

MJ-81: PVNANNGTSSYSQLIYNLTICELNGTEWLGSKFD (Grupo D-2)

MJ-82: LVNAANTSSSYSQLIYNLTLCELNGTDWLVNRFD (Grupo D-1)

MJ-83: LANANNTSSSYSQLIYNLTLCELNGTDWLVGKFE (Grupo D-3)

65: MJ-84 LANANSTSSSYSQLIYNLTICELNGTDWLDDNFD (Grupo D-6)

MJ-85: LVNANSSSSSYSQLIYNLTLCELNGTDWLDKKFY (Grupo S-7)

10-12-2014 E08747143

MJ-86: LVNANNTSSSYSQLIYNLTLCELNGADWLKEHFS (Grupo S-5)

MJ-87: LVNANNTNSSYSQLIYNLTLCELNGTDWLKGHFS (Grupo S-4)

MJ-88: LVNANSTSSSYSQLIYNLTLCELNGTEWLGNSFN (Grupo D-7)

MJ-89: LVNANSTSSSYSQLIYNLTLCELNGTEWLGTKFS (Grupo S-4)

5: MJ-90 LVNANSTSSSYSQLIYNLTLCELNGTEWLGEKFS (Grupo S-3)

MJ-91: LVNANSTNSSYSQLIYNLTLCELNGTEWLGKNFS (Grupo S-8)

MJ-92: LVNANSTNSSYSQLIYKLTLCELNGTEWLGKKFS (Grupo S-4)

MJ-93: LVNANSTSSSYSQLIYNLTLCELNGTDWLNEKFS (Grupo S-2)

MJ-94: LVNANSTSSSYSQLIYNLTLCELNGTDWLNDKFS (Grupo S-2)

10: MJ-95 LVNANSTSSSYSQLIYNLTLCELNGTDWLDGHFS (Grupo S-3)

MJ-96: LVNANSTSSSYSQLIYNLTICELNGTDWLNGQFS (Grupo S-3)

MJ-97: LVNANNTSSSYSQLIYNLTICELNGTDWLNGRFS (Grupo S-8)

MJ-98: LVNANNTSSSYSQLIYNLTICELNGTDWLNGKFS (Grupo S-3)

MJ-99: LVNANSTSSSYSQLIYNLTICELNGTDWLNEHFS (Grupo S-2)

15: MJ-100 LVNASNNSSSYSQLIYNLTLCELNGTDWLNKKFS (Grupo S-5)

MJ-101: LVNASNNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLDKTFD (Grupo D-7)

MJ-102: LVNASNNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLDKSFD (Grupo D-7)

MJ-103: LVNASNNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNKTFD (Grupo D-7)

MJ-104: LVNASNNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNKSFD (Grupo D-7)

20: MJ-105 LVNASNNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNRSFD (Grupo D-7)

MJ-106: LVNASNNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNESFD (Grupo D-7)

MJ-107: LVNASNNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLSNNFD (Grupo D-6)

MJ-108: LVNASNNGSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNNTFD (Grupo D-7)

MJ-109: LVNANSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNDHFS (Grupo S-2)

25: MJ-110 LVNANSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNEHFS (Grupo S-2)

MJ-111: LVNANSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNSHFS (Grupo S-5)

MJ-112: LVNAHSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNKHFS (Grupo S-5)

MJ-113: LVNANSSNSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNNHFS (Grupo S-1)

MJ-114: LVNASNDSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNGHFS (Grupo S-3)

30: MJ-115 LVNASNSSSSNLQLIYNLTICELNGTDWLKNHFS (Grupo S-5)

MJ-116: LVNASSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLENHFS (Grupo S-1)

MJ-117: LVNANSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLKNHFS (Grupo S-5)

MJ-118: LVNANSNSSSNLQLIYNLTICELNGTEWLGSHFS (Grupo S-4)

MJ-119: LVNADSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNNHFG (Grupo D-5)

35: MJ-120 LVNANNSSSSHTQLIYNLTLCELNGTEWLSHKFD (Grupo D-8)

MJ-121: LVNAANSSSSHFQSIYNLTLCELNGTDWLSKKFD (Grupo D-8)

MJ-122: LVNANNTSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLKYKFE (Grupo D-8)

MJ-123: LVDANSNSSSHFQLIYNLTICELNGTDWLYKHFD (Grupo D-8)

MJ-124: FADGNGNNSTY-QYIYNLTICELNGTNWLSGHFE (Grupo E-1)

40: MJ-125 FADGNGNNSTY-QYIYNLTICELNGTNWLSDHFE (Grupo E-1)

MJ-126: FADGNDNNSTY-QYIYNLTICELNGTNWLSAHFE (Grupo E-1)

MJ-127: FADGNGNNSTY-QYIYNLTICELNGTDWLSAHFE (Grupo E-2)

MJ-128: FADGNGNDSTY-QYIYDLTICELNGTHWLSNHFV (Grupo E-8)

MJ-129: FADGNGNDSTY-QYIYNLTICELNGTSWLSDHFE (Grupo E-4)

45: MJ-130 FADGSGNNSTY-QYIYNLTICELNGTDWLSGHFN (Grupo E-2)

MJ-131: FADGSGNNSTY-QYIYNLTICELNGTKWLSGHFD (Grupo E-3)

MJ-132: FADGNGNSSTY-QYIYNLTICELNGTTWLSGHFN (Grupo E-4)

MJ-133: FADGNGNSSTY-QYIYNLTICELNGTNWLSGHFN (Grupo E-1)

MJ-134: FADGNGNNSTY-QYIYNLTICELNGTDWLSNHFS (Grupo E-6)

50: MJ-135 FADGNDNNSTY-QYIYNLTICELNGTNWLSNHFS (Grupo E-5)

MJ-136: FADGNGDSSTY-QYIYNLTICELNGTDWLSSHFG (Grupo E-7)

LV: FADGNGDSSTY-QYIYNLTICELNGTDWLSSHFG (Grupo E-7)

| HV1  |  Región C.  |  HV2  |

55: TABLA 3

Secuencia consenso global para el grupo D = X0WLX1X2X3X4D; donde X0 es uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural mostrados en la Tabla 1; y D puede remplazarse por cualquier resto de aminoácido excepto C, F, M, P, W, S, T, e Y (tal como remplazo por A, G, V, L, I, N, E, Q, R, K, o H).

Secuencias específicas de subgrupo en el grupo D tienen X0 y D como anteriormente y se caracterizan también por lo siguiente:

D-1: X1 es un resto de aminoácido alifático, X2 es un resto de aminoácido ácido (o donde X1 es un resto de aminoácido ácido y X2 es un resto de aminoácido alifático), X3 es un resto de aminoácido básico, y X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F);

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D-2: X1 es un resto de aminoácido alifático, X2 es Ser, Thr, Tyr o un resto de aminoácido básico (o donde X1 es Ser, Thr, Tyr o un resto de aminoácido básico y X2 es un resto de aminoácido alifático), X3 es un resto de aminoácido básico, y X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F)

D-3: cada uno de X1 y X2 es independientemente un resto de aminoácido alifático, X3 es un resto de aminoácido básico, y X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F);

D-4: X1 es un resto de aminoácido ácido, X2 es Ser, Thr, Tyr o un resto de aminoácido básico (o donde X1 es Ser, Thr, Tyr o un resto de aminoácido básico y X2 es un resto de aminoácido ácido), X3 es un resto de aminoácido básico, y X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F)

D-5: cada uno de X1 y X2 es independientemente un resto de aminoácido ácido, X3 es un resto de aminoácido básico, y X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F)

D-6: cada uno de X1 y X2 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, X3 es un resto de aminoácido ácido, y X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F);

D-7: cada uno de X1 y X2 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, X3 es un resto de aminoácido no aromático con un grupo R que contiene hidroxilo (tal como Ser o Thr), y X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F);

D-8: cada uno de X1 y X2 es independientemente un resto de aminoácido básico o un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como tirosina (Y), serina (S), treonina (T), o fenilalanina (F), X3 es un resto de aminoácido básico, y X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F)

Secuencia consenso global para el grupo S = X0WLX1X2X3X4X5; donde X0 es uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural mostrados en la Tabla 1

Secuencias específicas de subgrupo en el grupo S tienen X0 como anteriormente y se caracterizan también por lo siguiente:

S-1: X1 es un resto de aminoácido ácido, X2 es asparagina (N), X3 es un resto de aminoácido básico, X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F), y X5 es S;

S-2: cada uno de X1 y X2 es independientemente un resto de aminoácido ácido excepto que X2 no es asparagina (N), X3 es un resto de aminoácido básico, X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F), y X5 es S

S-3: X1 es un resto de aminoácido alifático, X2 es un resto de aminoácido ácido (o donde X1 es un resto de aminoácido ácido y X2 es un resto de aminoácido alifático), X3 es un resto de aminoácido básico, X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F), y X5 es S;

10-12-2014 E08747143

S-4: X1 es un resto de aminoácido alifático, X2 es Ser, Thr, Tyr o un resto de aminoácido básico (o donde X1 es Ser, Thr, Tyr o un resto de aminoácido básico y X2 es un resto de aminoácido alifático; o donde cada uno de X1 y X2 es independientemente Ser, Thr, Tyr o un resto de aminoácido básico; o donde cada uno de X1 y X2 es independientemente un resto de aminoácido alifático), X3 es un resto de aminoácido básico, X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F), y X5 es S

S-5: X1 es un resto de aminoácido ácido, X2 es Ser, Thr, Tyr o un resto de aminoácido básico (o donde X1 es Ser, Thr, Tyr o es un resto de aminoácido básico y X2 es un resto de aminoácido ácido excepto N (Asn)), X3 es un resto de aminoácido básico, X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F), y X5 es S;

S-6: X1 es un resto de aminoácido básico, X2 es una asparagina (N), X3 es un resto de aminoácido básico, X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F), y X5 es S;

S-7: cada uno de X1 y X2 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, X3 es un resto de aminoácido básico, X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F), y X5 es T o Y; o

S-8: X1 es un resto de aminoácido ácido, X2 es un resto de aminoácido ácido (o donde X1 es un resto de aminoácido ácido y X2 es un resto de aminoácido alifático, o como alternativa donde X1 es un resto de aminoácido alifático y X2 es un resto de aminoácido ácido), X3 es un resto de aminoácido ácido, X4 es un resto de aminoácido que comprende un anillo aromático, tal como fenilalanina (F), y X5 es S

Secuencias específicas de subgrupo en el grupo E se caracterizan por lo siguiente:

E-1

NWLSX2X3X4X5: cada uno de X2, X3, y X4 es independientemente uno de los 20 aminoácidos de origen natural, y X5 es un resto de aminoácido ácido o alifático

E-2

X0WLX1X2X3X4X5: X0 es un resto de aminoácido ácido excepto por asparagina (N), cada uno de X1 X2, X3, y X4 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, y X5 es un resto de aminoácido ácido o alifático

E-3

X0WLX1X2X3X4X5: X0 es un resto de aminoácido básico, cada uno de X1, X2, X3, y X4 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, y X5 es un resto de aminoácido ácido o alifático

E-4

X0WLX1X2X3X4X5: X0 es cualquier resto de aminoácido no ácido y no básico, cada uno de X1, X2, X3, y X4 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, y X5 es un resto de aminoácido ácido o alifático;

E-5

NWLSX2X3X4X5: cada uno de X2, X3 y X4 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, y X5 es serina (S) o treonina (T)

E-6

X0WLX1NX3X4X5: X0 es cualquier resto de aminoácido excepto asparagina (N), cada uno de X1, X3, y X4 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, y X5 es serina (S) o treonina (T)

10-12-2014

E-7

X0WLX1X2X3X4X5: X0 es un resto de aminoácido ácido excepto asparagina (N), cada uno de X1, X2, X3, y X4 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural excepto que X2 no es asparagina (N), y X5 es cualquier resto de aminoácido no ácido

E-8

X0WLX1X2X3X4X5: X0 es cualquier resto de aminoácido no ácido, cada uno de X1, X2, X3, y X4 es independientemente uno de los 20 restos de aminoácido de origen natural, y X5 es cualquier resto de aminoácido no ácido

Claims

E08747143

10-12-2014

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar una composición inmunogénica, comprendiendo dicho método:

5 (a) identificar o seleccionar un primer aislado de virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), comprendiendo dicho primer aislado un primer polipéptido GP5 que contiene una primera región hipervariable HV-2 en el ectodominio GP5;

(b) identificar o seleccionar un segundo aislado de PRRSV, comprendiendo dicho segundo aislado un segundo

polipéptido GP5 que contiene una segunda región hipervariable HV-2 en el ectodominio GP5; 10 (c) combinar partículas virales de dicho primer y segundo aislado para formar una composición inmunogénica;

donde:

-cada partícula viral comprende un polipéptido GP5 unido a membrana; 15 -la primera y segunda regiones HV-2 son diferentes entre sí;

y donde:

-cada una de las etapas de identificación o selección (a) y (b) comprende secuenciación de aminoácidos, 20 secuenciación de ácido nucleico o detección basada en PCR de la región hipervariable HV-2 del ectodominio GP5 de PRRSV del aislado PRRSV.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente identificar o seleccionar al menos un aislado

PRRSV adicional con una región HV-2 diferente al primer y segundo aislados, y combinar partículas virales del al 25 menos un aislado PRRSV adicional con las partículas virales de dicho primer y segundo aislado.
3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde los aislados están atenuados o inactivados.

30 4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha etapa de combinación (c) comprende adicionalmente la adición de uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha primera y dicha segunda regiones HV-2 son cada una de una secuencia diferente seleccionada entre E-1, E-2, E-3, E-4, E-5, E-6, E-7, E-8, D-1, D-2,

35 D-3, D-4, D-5, D-6, D-7, D-8, S-1, S-2, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7 y S-8; donde la secuencias de E-1 a E-8, D-1 a D-8 y S-1 a S-8 son como se muestran en la Tabla 3.
6. El método de la reivindicación 5, donde:

40 dicha primera y dicha segunda regiones HV-2 son cada una de una secuencia diferente seleccionada entre E-1, E-2, E-3, E-4, E-5, E-6, E-7 y E-8; o dicha primera región HV-2 es de la secuencia de uno de E-1, E-2, E-3, E-4, E-5, E-6, E-7 y E-8 y dicha segunda región HV-2 es de la secuencia de uno de D-1, D-2, D-3, D-4, D-5, D-6, D-7, D-8, S-1, S-2, S-3, S-4, S-5, S-6, S7 y S-8.

45

23