ES2527363T3

ES2527363T3 - Derivados de triciclopirazol

Info

Publication number: ES2527363T3
Application number: ES10782282.7T
Authority: ES
Inventors: Teresa Disingrini; Sergio Mantegani; Mario Varasi
Original assignee: Nerviano Medical Sciences SRL
Current assignee: Nerviano Medical Sciences SRL
Priority date: 2009-12-04
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2015-01-22
Anticipated expiration: 2030-11-24
Also published as: JP2013512868A; US9127015B2; EP2507244A1; WO2011067145A1; JP5730896B2; US9701686B2; EP2507244B1; US20150329552A1; US20120277214A1

Abstract

Compuesto de fórmula (I):**Fórmula** donde: n es 0 o 1; R1, R2 y R4, cada uno independientemente de los otros, se seleccionan del grupo consistente en -Ra, - CORa, -CONHRa, -SO2Ra y -COORa; R3 es un grupo -NRaRb o -ORa; donde Ra y Rb, diferentes o iguales, son independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C1-C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6 lineal o ramificado, alquinilo C2-C6 lineal o ramificado, cicloalquilo C3-C6, cicloalquil alquilo C1-C6, heterociclilo, heterociclil alquilo C1-C6, arilo, aril alquilo C1-C6, heteroarilo y heteroaril alquilo C1-C6, o tomados juntos con el átomo de nitrógeno al cual están unidos, tanto Ra como Rb, pueden formar un heterociclo de 3 a 8 miembros sustituido opcionalmente, conteniendo opcionalmente un heteroátomo adicional o grupo heteroatómico seleccionado de entre S, O, N o NH, y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Description

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Derivados de triciclopirazol

La presente invención se refiere a ciertos derivados sustituidos de compuestos de triciclopirazol que modulan la

5 actividad de proteína cinasas. Por consiguiente, los compuestos de esta invención son útiles en el tratamiento de enfermedades causadas por una actividad proteína cinasa desregulada. La presente invención se refiere también a métodos para la preparación de estos compuestos, bibliotecas combinatorias de los mismos, a composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos, y al uso de estos compuestos en métodos de tratamiento de enfermedades.

10 La disfunción de las proteína cinasas (PKs, del inglés protein kinases) es el rasgo distintivo de numerosas enfermedades. Una gran parte de los oncogenes y proto-oncogenes implicados en los cánceres humanos codifican para PKs. Las actividades mejoradas de las PKs también están involucradas en muchas enfermedades no malignas, como la hiperplasia benigna de próstata, la adenomatosis familiar, la poliposis, la neurofibromatosis, la psoriasis, la proliferación de células lisas vasculares asociada con aterosclerosis, la fibrosis pulmonar, la artritis, la

15 glomerulonefritis y la estenosis y reestenosis post-quirúrgica.

Las PKs también están implicadas en estados inflamatorios y en la multiplicación de virus y parásitos. Las PKs pueden jugar también un papel importante en la patogénesis y el desarrollo de trastornos neurodegenerativos.

Como referencia general sobre el mal funcionamiento o falta de regulación de las PKs, véase por ejemplo, Current Opinion in Chemical Biology 1999, 3, 459 – 465 y Carcinogenesis 2008, 29, 1087 – 191.

20 Los derivados sustituidos de hexahidroarilquinolizina útiles como antidiabéticos, antidepresivos, antihipertensivos e inhibidores de la agregación plaquetaria en sangre se describen en el documento EP154142 A en nombre de Merck and Co.

La síntesis de derivados de 1H-imidazo[1,2-a]pirazolo[3,4-c]piridina se describe en Chemical & Pharmaceutical Bulletin (1990), 38(9), 2352-6, sin informar de ninguna actividad biológica.

25 Derivados tricíclicos de 5,6-dihidro-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridina como inhibidores de fosfodiesterasa útiles en el tratamiento de estados inflamatorios, asma, artritis, bronquitis, enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias, psoriasis, rinitis alérgica, dermatitis, así como SIDA, shock séptico y otras enfermedades tales como caquexia se describen en el documento WO9639408 a nombre de Pfizer Inc.

Derivados de pirrolo[2,1-a]isoquinolinas, pirrolo[1,2-a]quinolinas, pirrolo[2,1-a]isobenzazepinas y pirrolo[1,2

30 a]benzazepinas dotados de actividad antineoplásica se describen en Journal of Medicinal Chemistry (1988), 31(11), 2097-102.

Pirrolo[2,1-a]isoquinolinas como inhibidores de fosfodiesterasa 10a útiles en el tratamiento del cáncer, se describen en el documento WO2002048144 a nombre de Bayer Aktiengesellschaft.

Los presentes inventores han descubierto ahora que los nuevos compuestos de fórmula (I), descritos abajo, son 35 inhibidores cinasa y por tanto son útiles en terapia como agentes antitumorales.

Correspondientemente, un primer objeto de la presente invención es proporcionar un compuesto tricíclico representado por la fórmula (I):

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40 donde: n es 0 o 1; R1, R2 y R4, cada uno independientemente de los otros, se seleccionan del grupo consistente en -Ra, -CORa, -

CONHRa, -SO2Ra y -COORa;

R3 es un grupo -NRaRb o -ORa;

45 donde Ra y Rb, diferentes o iguales, son independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C1-C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6 lineal o ramificado, alquinilo C2-C6 lineal o ramificado, cicloalquilo C3-C6, cicloalquil alquilo C1-C6, heterociclilo, heterociclil alquilo C1-C6, están unidos, tanto Ra como Rb, pueden formar un heterociclo de 3 a 8 miembros sustituido opcionalmente, conteniendo opcionalmente un heteroátomo adicional o grupo heteroatómico seleccionado de entre S, O, N o NH,

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y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

5 La presente invención proporciona también métodos de síntesis de los compuestos sustituidos representados por la fórmula (I), preparados mediante un proceso sintético comprendiendo reacciones bien conocidas y llevado a cabo de acuerdo a técnicas convencionales, así como mediante procesos en fase sólida y/o combinatorios extremadamente versátiles.

La presente invención también proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de enfermedades causadas por y/o asociadas con una actividad alterada de proteína cinasa, en particular ABL, ACK1, AKT1, ALK, AUR1, AUR2, BRK, BUB1, CDC7/DBF4, CDK2/CYCA, CHK1, CK2, EEF2K, EGFR1, EphA2, EphB4, ERK2, FAK, FGFR1, FLT3, GSK3beta, Haspin, IGFR1, IKK2, IR, JAK1, JAK2, JAK3, KIT, LCK, LYN, MAPKAPK2, MELK, MET, MNK2, MPS1, MST4, NEK6, NIM1, P38alpha, PAK4, PDGFR, PDK1, PERK, PIM1, PIM2, PKAalpha, PKCbeta, PLK1, RET, ROS1, SULU1, Syk, TLK2,

15 TRKA, TYK, VEGFR2, VEGFR3, ZAP70.

La presente invención da a conocer también el tratamiento de una enfermedad causada por y/o asociada con la actividad proteína cinasa desregulada, seleccionada del grupo consistente en cáncer, infección vírica, prevención del desarrollo del SIDA en individuos infectados con VIH, trastornos proliferativos celulares, trastornos autoinmunes y neurodegenerativos.

La presente invención también divulga el tratamiento de tipos específicos de cáncer, incluyendo pero sin limitarse

a: carcinoma, como el de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, esófago, vesícula, ovario, páncreas, estomago, cerviz, tiroides, próstata, y piel, incluyendo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de linaje linfático, incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin,

25 linfoma de células pilosas y linfoma de Burkitt; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluyendo las leucemias mielogénicas aguda y crónica, incluyendo síndrome mielodisplásico y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimal, incluyendo fibrosarcoma y rabdomiosarcoma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; otros tumores, que incluyen melanoma, seminoma, teratocarcinoma, osteosarcoma, xeroderma pigmentoso, queratoxantoma, cáncer folicular de tiroides y sarcoma de Kaposi.

La presente invención también divulga el tratamiento de los trastornos de proliferación celular específicos, como por ejemplo, la hiperplasia benigna de próstata, la adenomatosis familiar, la poliposis, la neurofibromatosis, la psoriasis, la proliferación de células lisas vasculares asociada con aterosclerosis, la fibrosis pulmonar, la artritis, la glomerulonefritis y la estenosis y reestenosis post-quirúrgica.

35 Los compuestos de esta invención pueden ser útiles en la inhibición de la angiogénesis y la metástasis tumoral, así como en el tratamiento del rechazo en el trasplante de órganos y la enfermedad injerto contra huésped.

La presente invención proporciona además un método de tratamiento que comprende un compuesto de fórmula (I) en combinación con terapia de radiación o régimen de quimioterapia para un uso simultáneo, separado o secuencial en terapia contra el cáncer. Además, la invención proporciona un método in vitro para la inhibición de la actividad proteína cinasa que comprende el contacto de dicha proteína cinasa con una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula (I).

La presente invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende uno o varios compuestos de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

45 La presente invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) en combinación con agentes citostáticos o citotóxicos conocidos, agentes tipo antibiótico, agentes de intercalado o perjudiciales para el ADN, agentes basados en platino, agentes alquilantes, agentes anti-metabolito, agentes hormonales, agentes anti-hormonales, como anti-estrógenos, anti-andrógenos e inhibidores de la aromatasa, agentes inmunológicos, agentes tipo interferona, inhibidores de la ciclooxigenasa (p. ej. inhibidores de COX-2), inhibidores de metaloproteasa matriz, inhibidores de tirosina cinasa, otros inhibidores cinasa, agentes receptores del factor anti-crecimiento, agentes anti-HER, agentes anti-EGFR, agentes anti-angiogénesis (p. ej. inhibidores de la angiogénesis), inhibidores de farnesil transferasa, inhibidores de la ruta de transducción de señal ras-raf, inhibidores del ciclo celular, otros inhibidores del cdks, agentes de unión a tubulina, inhibidores de la topoisomerasa I, inhibidores de la topoisomerasa II, inhibidores de cinesinas, anticuerpos monoclonales

55 terapéuticos, inhibidores de mTOR, inhibidores de la histona desacetilasa, inhibidores de la respuesta hipóxica y similares, para el uso simultáneo, separado o secuencial en terapia contra el cáncer. Adicionalmente, la invención proporciona un producto o kit que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define arriba, o composiciones farmacéuticas del mismo y uno o varios agentes quimioterapéuticos, como una preparación combinada para el uso simultáneo, separado o secuencial en la terapia contra el cáncer.

Incluso en otro aspecto, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tal y como se define arriba, para su uso como medicamento.

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mismo, como se define arriba, para el uso en un método de tratamiento contra el cáncer.

Tal y como se utiliza aquí, un compuesto de fórmula (I) donde n es 0 y R1, R2, R3 y R4 son como se define arriba, concretamente derivados de 4,5-dihidro-1H-pirazolo[4,3-g]indolizina, puede ser representado por la fórmula general 5 (I)A:

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y un compuesto de fórmula(I) donde n es 1 y R1, R2, R3 y R4 son como se define arriba, concretamente derivados de 1,4,5,6-tetrahidropirazolo[3,4-c]pirrolo[1,2-a]azepina, puede ser representado mediante la fórmula general (I)B:

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10 Si no se especifica lo contrario, al referirse a los compuestos de fórmula (I) per se así como a cualquier composición farmacéutica de los mismos o a cualquier método terapéutico de tratamiento que los comprenda, la presente invención incluye todos los hidratos, solvatos, complejos, metabolitos, profármacos, portadores, N-óxidos y sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención.

Un metabolito de un compuesto de fórmula (I) es cualquier compuesto en que es convertido in vivo este mismo

15 compuesto de fórmula (I), por ejemplo tras de la administración a un mamífero con necesidad del mismo. Típicamente, aunque sin que represente un ejemplo limitante, tras la administración de un compuesto de fórmula (I), este mismo derivado puede ser convertido en una variedad de compuestos, por ejemplo, incluyendo derivados más solubles como derivados hidroxilados que se excretan fácilmente. Por lo tanto, dependiendo de la ruta metabólica que esté ocurriendo, cualquiera de estos derivados hidroxilados puede ser considerado como

20 metabolito de los compuestos de fórmula (I).

Profármacos son cualesquier compuestos unidos de forma covalente, los cuales liberan el fármaco precursor activo in vivo de acuerdo con la fórmula (I).

Los N-óxidos son compuestos de fórmula (I) en los que el nitrógeno y el oxígeno están unidos a través de un enlace dativo.

25 Todas las fórmulas de isómeros quirales u otras formas de isómeros que incluyen enantiómeros y diastereómeros, están destinadas a cubrirse aquí. Los compuestos que contienen un centro quiral se pueden usar como mezcla racémica o como una mezcla enriquecida enantioméricamente, o la mezcla racémica se puede separar usando técnicas bien conocidas y se puede usar un enantiómero individual solo.

En los casos en los que los compuestos pueden existir en formas tautoméricas, como los tautómeros ceto-enol,

30 cada forma tautomérica se contempla como si se incluyera en esta invención, tanto si existe en equilibrio o está predominantemente en una forma.

Como tal, a menos que se disponga de otra forma, cuando en compuestos de fórmula (I) n, R1, R2 y R3 se definen como arriba, R4 es hidrógeno y sólo se indica una de las siguientes formas tautoméricas de fórmula (I)a o (I)b, la no mencionada se tiene que seguir considerando como comprendida dentro del alcance de la invención:

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En la presente descripción, a menos que se indique lo contrario, con el término “alquilo C1-C6 lineal o ramificado” se indica cualquier grupo como, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc

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butilo, n-pentilo, n-hexilo, y similares.

Con el término “alquenilo C2-C6 lineal o ramificado” o “alquinilo C2-C6 lineal o ramificado” se indica cualquiera de los grupos alquenilo o alquinilo insaturados con 2 a 6 átomos de carbono, por ejemplo incluyendo vinilo, alilo, 1propenilo, isopropenilo, 1-, 2-o 3-butenilo, pentenilo, hexenilo, etinilo, 1-o 2-propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo y similares.

Con el término “cicloalquilo C3-C6” se indica, a menos que se especifique lo contrario, un anillo todo de carbono monocíclico de 3 a 6 miembros, el cual puede contener uno o varios enlaces dobles pero no tiene un sistema electrónico completamente conjugado. Son ejemplos de grupos cicloalquilo, sin limitación, ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, ciclohexeno y ciclohexadieno.

Con el término “heterociclilo” se indica un anillo carbocíclico saturado o parcialmente insaturado, de 3 a 7 miembros, donde uno o varios átomos de carbono se sustituyen por heteroátomos como nitrógeno, oxígeno y azufre. Son ejemplos no limitantes de grupos heterociclilo, por ejemplo, pirano, pirrolidina, pirrolina, imidazolina, imidazolidina, pirazolidina, pirazolina, tiazolina, tiazolidina, dihidrofurano, tetrahidrofurano, 1,3-dioxolano, piperidina, piperazina, morfolina y similares.

Con el término “arilo” se indica un hidrocarburo mono-, bi-o policarbocíclico con sistemas de 1 a 4 anillos, opcionalmente también fundidos o unidos entre sí mediante enlaces sencillos, donde al menos uno de los anillos carbocíclicos es “aromático”, refiriéndose el término “aromático” a un sistema electrónico completamente conjugado. Son ejemplos no limitantes de dichos grupos arilo, los grupos fenilo, -o -naftilo o bifenilo.

Con el término “heteroarilo” se indican anillos heterocíclicos aromáticos, típicamente heterociclos de 5 a 7 miembros con 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O o S; el anillo heteroarilo opcionalmente también puede estar fundido o unido a anillos carbocíclicos y heterocíclicos aromáticos o no aromáticos. Son ejemplos no limitantes de dichos grupos heteroarilo, por ejemplo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, indolilo, imidazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, fenil-pirrolilo, furilo, fenil-furilo, oxazolilo, isoxazolilo, pirazolilo, tienilo, benzotienilo, isoindolinilo, benzoimidazolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, 1,2,3-triazolilo, 1-fenil-1,2,3-triazolilo, 2,3-dihidroindolilo, 2,3-dihidrobenzofuranilo, 2,3-dihidrobenzotiofenilo; benzopiranilo, 2,3-dihidrobenzoxazinilo, 2,3-dihidroquinoxalinilo y similares.

De acuerdo con los significados proporcionados a Ray Rb, cualquiera de los grupos anteriores puede estar sustituido opcionalmente también en cualquiera de sus posiciones libres por uno o varios grupos, por ejemplo 1 a 6 grupos, seleccionados entre: halógeno, nitro, grupos oxo (=O), carboxi, ciano, alquilo C1-C6, alquilo polifluorado, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, cicloalquilo C3-C6, heterociclilo, arilo, heteroarilo; grupos amino y derivados de los mismos, como por ejemplo, alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino, ureido, alquilureido o arilureido; grupos carbonilamino y derivados de los mismos, como por ejemplo, formilamino, alquilcarbonilamino, alquenilcarbonilamino, arilcarbonilamino, alcoxicarbonilamino; grupos hidroxi y derivados de los mismos, como por ejemplo, alcoxi, alcoxi polifluorado, ariloxi, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, cicloalqueniloxi o alquilidenaminoxi; grupos carbonilo y derivados de los mismos, como por ejemplo, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo, cicloalquiloxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo; derivados sulfurados, como por ejemplo, alquiltio, ariltio, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, alquilsulfinilo, arilsulfinilo, arilsulfoniloxi, aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo o dialquilaminosulfonilo.

A su vez, siempre que sea apropiado, cada uno de los sustituyentes anteriores puede estar sustituido también por uno o varios de los grupos mencionados anteriormente.

En la presente descripción, a menos que se indique lo contrario, con el término “ciano” se indica un residuo –CN.

Con el término “nitro” se indica un grupo –NO2.

Con el término “halógeno” se indica un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo.

Con el término “alquilo o alcoxi polifluorado” se indica un grupo alcoxi o alquilo C1-C6 lineal o ramificado, como se define arriba, donde más de un átomo de hidrógeno se sustituye por átomos de flúor, como por ejemplo, trifluorometilo, trifluorometoxi, 2,2,2-trifluoroetilo, 2,2,2-trifluoroetoxi, 1,2-difluoroetilo, 1,1,1,3,3,3-hexafluoropropil-2ilo, y similares.

A partir de todo lo anterior, resulta claro para un experto en la materia que cualquier grupo cuyo nombre se ha identificado como un nombre compuesto, como por ejemplo, cicloalquilalquilo, arilalquilo, heterociclilalquilo, alcoxi, alquiltio, ariloxi, arilalquiloxi, alquilcarboniloxi y similares, se tiene que entender como construido de forma convencional a partir de las partes de las que deriva. Por tanto, como ejemplo, los términos heterociclil-alquilo y cicloalquil-alquilo representan un grupo alquilo lineal o ramificado que está sustituido por un grupo heterocíclico o cicloalquilo, respectivamente, como se define arriba.

El término “sales farmacéuticamente aceptables” abarca sales usadas comúnmente para formar sales metálicas alcalinas y para formar sales de adición de ácidos libres o bases libres. La naturaleza de las sales no es crítica, en el supuesto de que es farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición ácida farmacéuticamente aceptables adecuadas de los compuestos de la presente invención se pueden preparar a partir de un ácido inorgánico o a partir de un ácido orgánico. Son ejemplos de dichos ácidos inorgánicos, el ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido nítrico, ácido carbónico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico. Los ácidos orgánicos apropiados se pueden seleccionar a partir de clases de ácidos orgánicos alifáticos, cicloalifáticos, aromáticos, aralifáticos, heterocíclicos, carboxílicos y sulfónicos, siendo ejemplos de los cuales, ácido fórmico, acético, trifluoroacético, orgánicas hechas de N,N’-dibenziletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina (Nmetil-glucamina) y procaína. Todas estas sales se pueden preparar por medios convencionales a partir de los compuestos correspondientes de la presente invención, por ejemplo por reacción con el ácido o la base

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10 apropiados. Una clase preferida de compuestos de fórmula (I) son los compuestos donde: R1 es un grupo -CONHRa donde Ra es hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo

C1-C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6 lineal o ramificado, arilo y aril alquilo C1-C6. Otra clase preferida de compuestos de fórmula (I) son los compuestos donde:

15 R1 es un grupo -CORa donde Ra es hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C1-C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6 lineal o ramificado, arilo y aril alquilo C1-C6. Otra clase preferida de compuestos de fórmula (I) son los compuestos donde: R1 es un grupo –SO2Ra donde Ra es hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C1-

C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6 lineal o ramificado, arilo y aril alquilo C1-C6.

20 Otra clase adicional de compuestos preferidos de fórmula (I) son los compuestos donde: R2 es hidrógeno. Una clase más preferida de compuestos de fórmula (I) son los compuestos donde: R3 es un grupo -NRaRb donde ambos Ra y Rb son hidrógenos o uno de ellos es un hidrógeno y el restante Ra o Rb

es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C1-C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6 lineal o 25 ramificado, arilo y aril alquilo C1-C6. La clase de compuestos de fórmula (I) más preferida son los compuestos donde:

R4 es un hidrógeno. Como referencia para cualquier compuesto específico de fórmula (I) de la invención, opcionalmente en la forma de sales farmacéuticamente aceptables, véase la sección experimental.

30 La presente invención proporciona también un proceso para la preparación de un compuesto de fórmula (I) como se define arriba, caracterizado por que el proceso comprende las etapas siguientes: a) reacción del compuesto de fórmula (II):

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con un alcohol de fórmula (III) 35 Ra-OH (III)

donde Ra es un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado;

b) acilación por reacción de Friedel-Craft del compuesto resultante de fórmula (IV):

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donde Ra' es como se define arriba; 40 c) reacción del compuesto resultante (V):

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donde Ra' es como se define arriba, con un alcohol adecuado de fórmula (III) como se define arriba; d) alquilación del compuesto resultante de fórmula (VI):

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donde ambos Ra' son independientemente como se define arriba, con un halocianoalcano adecuado de fórmula (XXI):

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donde n es 0 o 1; e) condensación intramolecular del compuesto resultante de fórmula (VII):

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donde n se define como arriba y ambos Ra' son independientemente como se define arriba; f) tratamiento con hidrazina o una sal de la misma, del compuesto resultante de fórmula (VIII):

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donde n y Ra' son como se define arriba, para dar un compuesto de fórmula (I):

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donde n es 0 o 1; R1, R2 y R4 son hidrógeno y R3 es –ORa', donde Ra ' es un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado; separando opcionalmente el compuesto resultante de fórmula (I) en los isómeros individuales; y/o convirtiendo el compuesto resultante de fórmula (I) en diferentes compuestos de fórmula (I) por sustitución del grupo -ORa' con un grupo diferente el cual representa R3, y/o introduciendo el grupo R4, y/o derivatizando la fracción amino; y/o eliminando el grupo R4, y/o convirtiéndolo en una sal farmacéuticamente aceptable si se desea.

Las conversiones opcionales mencionadas del compuesto de fórmula (I) se resumen a continuación en el esquema

A.

Esquema A

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donde n, R1, R2, R3 y R4 son como se define arriba y Ra' es un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado.

La presente invención proporciona adicionalmente un proceso para la preparación de un compuesto de fórmula (I) como se define arriba, caracterizado por que el compuesto de fórmula (I) donde n es como se define en la fórmula (I); R1, R2 y R4 son hidrógeno, y Ra' es un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado, se convierte opcionalmente en el

15 correspondiente compuesto de fórmula (I) por sustitución del grupo -ORa' con un grupo diferente el cual representa R3, llevándose a cabo dicha conversión en la etapa g) mediante una o varias de las reacciones siguientes:

g.1) hidrólisis en condiciones básicas para dar el correspondiente compuesto de fórmula (I) donde R3 es OH, seguida opcionalmente por el acoplamiento del compuesto resultante con una amina de fórmula (IX):

HNRaRb (IX)

20 donde Ra y Rb son como se define en la reivindicación 1, para dar el correspondiente compuesto de fórmula (I) donde R3 es -NRaRb y Ra y Rb son como se define en la reivindicación 1;

g.2) trans-esterificación mediante reacciones con un compuesto de fórmula (III) como se define arriba, para dar el correspondiente compuesto de fórmula (I) donde R3 es ORa' y Ra' es un alquilo C1-C6 diferente;

g.3) acoplamiento con una amina de fórmula (IX):

25 HNRaRb (IX)

donde Ra y Rb son como se defina en la fórmula (I), para dar el correspondiente compuesto de fórmula (I) donde R3 es NRaRb y Ra y Rb son como se define en la fórmula (I).

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h.1) acoplamiento con un equivalente de un haluro de fórmula (X):

RaZ (X)

donde Ra es como se define en la fórmula (I) pero no hidrógeno y Z es un halógeno, para dar el correspondiente compuesto de fórmula (I) donde R4 es Ra, y Ra es como se define en la fórmula (I) pero no hidrógeno; h.2) acoplamiento con un equivalente de un haluro de acilo de fórmula (XI):

RaCOZ (XI)

donde Ra y Z son como se define arriba, para dar el correspondiente compuesto de fórmula (I) donde R4 es -CORa y Ra es como se define arriba; h.3) acoplamiento con un equivalente de un haluro de alcoxicarbonilo de fórmula (XII):

RaOCOZ (XII)

donde Ra y Z son como se define arriba, para dar el correspondiente compuesto de fórmula (I) donde R4 es -OCORa y Ra es como se define arriba;

h.4) acoplamiento con un equivalente de un haluro de sulfonilo de fórmula (XIII):

RaSO2Z (XIII)

donde Ra y Z son como se define arriba, para dar el correspondiente compuesto de fórmula (I) donde R4 es -SO2Ra y Ra es como se define arriba; h.5) acoplamiento con un equivalente de un isocianato de fórmula (XIV):

RaNCO (XIV)

donde Ra es como se define arriba, para dar el correspondiente compuesto de fórmula (I) donde R4 es -CONHRa y Ra es como se define arriba.

La presente invención proporciona adicionalmente un proceso para la preparación de un compuesto de fórmula (I) como se define arriba, caracterizado por que el compuesto de fórmula (I) donde n y R3 son como se define en la fórmula (I); R1 y R2 son hidrógeno y R4 es como se define en la fórmula (I) pero no hidrógeno, se convierte opcionalmente en el correspondiente compuesto de fórmula (I) mediante la derivatización de la fracción amino, llevándose a cabo dicha conversión en la etapa i) mediante una o varias de las reacciones siguientes:

i.1) acoplamiento con un equivalente de un haluro de acilo de fórmula (XI):

RaCOZ (XI)

donde Ra es como se define en la fórmula (I) pero no hidrógeno y Z es un halógeno, para dar el correspondiente compuesto de fórmula (I) donde uno de R1 o R2 es hidrógeno y el otro es -CORa y Ra es como se define arriba; i.2) acoplamiento con un equivalente de un haluro de alcoxicarbonilo de fórmula (XII):

RaOCOZ (XII)

donde Ra y Z son como se define arriba, para dar el correspondiente compuesto de fórmula (I) donde uno de R1 o R2 es hidrógeno y el otro es -OCORa y Ra es como se define arriba; i.3) acoplamiento con un equivalente de un haluro de sulfonilo de fórmula (XIII):

RaSO2Z (XIII)

donde Ra y Z son como se define arriba, para dar el correspondiente compuesto de fórmula (I) donde uno de R1 o R2 es hidrógeno y el otro es -SO2Ra y Ra es como se define arriba; i.4) acoplamiento con un equivalente de un isocianato de fórmula (XIV):

RaNCO (XIV) donde Ra es como se define arriba, para dar el correspondiente compuesto de fórmula (I) dondeuno de R1 o R2 es hidrógeno y el otro es -CONHRa y Ra es como se define arriba;

i.5) acoplamiento con un equivalente de un compuesto carbonilo de fórmula (XV):

RaCORbe (XV)

donde Ra y Rb son como se define en la fórmula (I), para dar el correspondiente compuesto de fórmula (I) donde R1 o R2 es hidrógeno y el otro es -CORa y Ra es como se define arriba.

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como se define arriba, caracterizado por que el compuesto de fórmula (I) donde n y R3 son como se define en la fórmula (I); uno de R1 y R2 es hidrógeno y el otro es como se define en la fórmula (I) pero no hidrógeno, y R4 es como se define en la fórmula (I) pero no hidrógeno, es convertido opcionalmente en el correspondiente compuesto de fórmula (I) por derivatización adicional de la fracción amino, llevándose a cabo dicha conversión en la etapa j) mediante una o varias de las reacciones descritas en las etapas i.1)-i.5) descritas arriba.

La presente invención proporciona adicionalmente un proceso para la preparación de un compuesto de fórmula (I) como se define arriba, caracterizado por que el compuesto de fórmula (I) donde n, R1, R2 y R3 son como se define en la fórmula (I) y R4 es como se define en la fórmula (I) pero no hidrógeno, es convertido opcionalmente en el correspondiente compuesto de fórmula (I) por eliminación del grupo R4 mediante tratamiento con una solución básica para dar el correspondiente compuesto de fórmula Idonde R4 es hidrógeno, dicha conversión se lleva a cabo en la etapa k).

El proceso anterior es análogo al proceso se que puede llevar a cabo de acuerdo con métodos bien conocidos.

Los productos de partida del proceso objeto de la presente invención, comprendiendo cualquier posible variante, así como cualquier reactivo del mismo, son compuestos conocidos y si no se encuentran disponibles comercialmente se pueden preparar mediante métodos bien conocidos.

Por ejemplo, el compuesto de fórmula (II) y (XXI) están disponibles comercialmente.

Los compuestos de fórmula (III), (IX), (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XXI) están disponibles comercialmente, o bien son conocidos y se pueden obtener fácilmente mediante métodos conocidos, véase como referencia general: Smith, Michael -March's Advanced Organic Chemistry: reactions mechanisms and structure – 5ª edición, Michael

B. Smith y Jerry March, John Wiley & Sons Inc., New York (NY), 2001.

De acuerdo con la etapa a) del proceso se hace reaccionar 2,2,2-tricloro-1-(1H-pirrol-2-il)etanona con etanol para obtener el 1H-pirrol-2-carboxilato de etilo. Esta reacción se puede llevar a cabo de diversas maneras y en diferentes condiciones experimentales, que son ampliamente conocidas en la técnica de las reacciones de condensación. Véase, como referencia general para las condiciones de operación: Nishiwaki, E. y col, Heterocycles [HTCYAM] 1988, 27, 1945; Freedlander, R.S. y col, J Org Chem [JOCEAH] 1981, 46, 3519; Harbuck, J. W. y col, J Org Chem [JOCEAH] 1972, 37, 3618; y Booth, C y col, Tetrahedron Lett [TELEAY] 1992, 33(3), 413. Preferentemente, la reacción se lleva a cabo en presencia de una base como trialquilamina, carbonatos sódicos o potásicos, hidróxidos alcalinos o hidruros alcalinos. El disolvente, en caso de no ser el mismo etanol, puede ser un solvente adecuado como THF, ACN, dioxano o mezcla de los mismos y a una temperatura en elintervalo desde temperatura ambiente hasta reflujo.

De acuerdo con la etapa b) del proceso, se hace reaccionar el compuesto de fórmula (IV) con cloruro de tricloroacetilo en presencia de ácidos de Lewis fuertes como AlCl3, ZnCl2, piridina, FeCl3 o Sm(OTf)3 en un disolvente seco como eter, DCM, THF. Preferentemente, se lleva a cabo la reacción a temperatura de reflujo.

De acuerdo con la etapa c) del proceso, se hace reaccionar el compuesto de fórmula (V) con etanol y la reacción se lleva a cabo como se describe en la etapa a).

De acuerdo con la etapa d) del proceso, la reacción del compuesto de fórmula (VI) con el halo-cianoalcano se puede llevar a cabo de diversas formas y en diferentes condiciones experimentales, que son ampliamente conocidas en la técnica de las reacciones de condensación. Véase, como referencia general para las condiciones de operación: Stevens, C.V. y col, Tetrahedron Lett [TELEAY] 2007, 48(40), 7108-7111 y Dumas, D. J., J Org Chem [JOCEAH]1988, 53, 4650. Preferentemente, la reacción se lleva a cabo en presencia de bases como carbonatos alcalinos o hidruros alcalinos en un disolvente adecuado como puede ser tetrahidrofurano, diclorometano, acetonitrilo, 1,4-dioxano o dimetilamida.

De acuerdo con la etapa e) del proceso, la condensación intramolecular del compuesto de formula (VII) se puede llevar a cabo de diversas formas y en diferentes condiciones experimentales, que son ampliamente conocidas en la ténica. Véase, como referencia general: Crowley, J.I. y col, J Am Chem Soc [JACSAT]1970, 92, 6363-6365. Preferentemente, la reacción se lleva a cabo de acuerdo con las condiciones de la reacción de Dieckmann con potasio o alcóxido de sodio en acetonitrilo, tetrahidrofurano, tolueno o un disolvente alcohólico.

De acuerdo con la etapa f) del proceso, la reacción entre el compuesto de fórmula (VIII) e hidrazina o una sal de hidrazina puede llevarse a cabo de diversas formas y en diferentes condiciones experimentales, que son ampliamente conocidas en la técnica. Preferentemente, la reacción se lleva a cabo en presencia de cantidades catalíticas de ácido, por ejemplo, ácido clorhídrico, acético o sulfúrico; en un disolvente adecuado, como por ejemplo, tetrahidrofurano, 1,4-dioxano, acetonitrilo, metanol o etanol; a una temperatura en el intervalo desde temperatura ambiente hasta temperatura de reflujo, durante un tiempo que puede variar entre 30 minutos hasta 8 horas.

De acuerdo con cualquiera de las etapas g.1) a g.3) del proceso, la conversión del derivado de alcoxicarbonilo de fórmula (I) obtenido en la etapa e) en un compuesto diferente de fórmula (I) por sustitución del grupo -ORa con un grupo diferente el cual representa R3, se puede llevar a cabo de diversas maneras, de acuerdo con métodos convencionales.

De acuerdo con la etapa g.1) del proceso, la hidrólisis en condiciones básicas o ácidas del derivado alcoxicarbonilo para la conversión en el correspondiente derivado de ácido carboxílico, se lleva a cabo de acuerdo con De acuerdo con la etapa g.2) del proceso, la trans-esterificación del derivado de alcoxicarbonilo se lleva a cabo de acuerdo con procedimientos estándar como se informa en The Chemistry of Carboxylic Acids and Esters, Saul Patai, Interscience Publisher (John Wiley&Sons 1969).

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De acuerdo con la etapa g.3) del proceso, el acoplamiento delalcoxicarbonilo o el correspondiente derivado de ácido carboxílico con una amina, se lleva a cabo de acuerdo con procedimientos estándar como se informa en The Chemistry of Amides, Saul Patai, Interscience Publisher (John Wiley&Sons 1970). Preferentemente, la reacción se lleva a cabo en presencia de un agente de condensación adecuado, por ejemplo, diciclohexilcarbodiimida (DCC), 1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (HBTOH), Obenzotriazoliltetrametilisouronio tetrafluoroborato (TBTU), o benzotriazol-1-iloxitripirrolidinofosfonio hexafluorofosfato (PyBOP), en un disolvente apropiado como diclorometano o dimetilformamida, en un dispositivo bien conocido por un experto.

De acuerdo con cualquiera de las etapas h.1) a h.5) del proceso, la introducción del grupo R4 se puede llevar a cabo de diversas formas, de acuerdo con métodos convencionales.

La introducción selectiva del grupo R4 en el nitrógeno del pirazol en posición 1 o 2, debido al equilibrio tautomérico, se puede obtener trabajando con una cantidad estequiométrica de agente alquilante, acilante, carbonilante, sulforilante o isocianato de fórmula (X), (XI), (XII), (XIII), (XIV) respectivamente, para prevenir de esta forma la multiderivación incluso en elgrupo amino en posición 3. La reacción se lleva a cabo en un disolvente adecuado como diclorometano, dimetilformamida, tetrahidrofurano o dioxano sin utilizar una base que podría hidrolizar in situ el sustituyente R4 recién insertado.

De acuerdo con cualquiera de las etapas i.1) a i.5) del proceso, la derivatización de la fracción amino, se puede llevar a cabo de diversas formas, de acuerdo con métodos convencionales. Véase como referencia: The Chemistry of Amino Group, Saul Patai, Interscience Publisher (John Wiley&Sons 1968), o J. Am. Chem o J. Am. Chem. Soc., 1971, 93, 2897, o Comprensive Organic Synthesis, Trost B.N., Fleming L. (Eds. Pergamon Press: New York, 1991; Vol. 8).

Preferentemente, de acuerdo con cualquiera de las etapasi.1) a i.4) del proceso, el compuesto de fórmula (I) se disuelve en un disolvente adecuado como diclorometano, dimetilformamida, tetrahidrofurano, 1,4-dioxano o similar, y se le añade una base adecuada como piridina, trietilamina, diisopropilamina o carbonato sódico. Se añade el compuesto de fórmula (XI), (XII), (XIII) respectivamente, y se agita la mezcla durante aproximadamente desde 2 horas hasta 15 horas, a una temperatura en un intervalo desde aproximadamente 20ºC hasta aproximadamente 80ºC. En el caso del isocianato de fórmula (XIV) el uso de la base es opcional.

Preferentemente, de acuerdo con la etapa i.5) del proceso, el compuesto de fórmula (I) se hace reaccionar con un derivado de aldehído o cetona de fórmula (XV) en condiciones reductoras. Tal como se describe arriba, resulta evidente para el experto que empleando un derivado de aldehído de fórmula (XV) dondeuno de Ra o Rb es hidrógeno, se obtiene el correspondiente derivado donde R1 es -CH2Ra. Análogamente, mediante el empleo de un derivado de cetona, se obtiene el correspondiente derivado donde R1 es -CHRaRb, donde Ra y Rb son como se define arriba pero diferentes de hidrógeno.

De acuerdo con cualquiera de las etapas j.1) a j.5) del proceso, la derivatización adicional de la fracción amino, se puede llevar a cabo de diversas formas, de acuerdo con métodos convencionales. Resulta evidente para el experto en la técnica que la derivatización adicional de la fracción amino se lleva a cabo en las mismas condiciones que las descritas en la etapa i) descrita arriba, para así obtener la bis-sustitución del nitrógeno en la posición 3.

De acuerdo con la etapa k) del proceso, la eliminación del grupo R4 se puede llevar a cabo de diversas formas, de acuerdo con métodos convencionales. Preferentemente, la eliminación se puede llevar a cabo haciendo reaccionar un compuesto de fórmula (I) con una solución básica como hidrazina, amoniaco, hidróxido metálico y así sucesivamente. En la condición más fuertemente básica puede ocurrir que las imidas eventualmente presentes en posición 3 también sean hidrolizadas.

Un compuesto de fórmula (I) también se puede transformar en una sal farmacéuticamente aceptable de acuerdo con procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica. Alternativamente, un compuesto de fórmula

(I) que se obtiene como una sal, puede ser transformado en la base libre o el ácido libre de acuerdo con procedimientos estándar conocidos por el experto.

Adicionalmente a lo anterior, los compuestos de fórmula (I) pueden ser preparados de forma ventajosa de acuerdo con técnicas de química combinatoria ampliamente conocidas en la técnica, consiguiendo las reacciones previamente mencionadas entre los intermedios de una manera secuencial y trabajando en condiciones de síntesis de fase sólida (SPS del inglés solid-phase-synthesis).

La presente invención también proporciona un proceso para la preparación de un compuesto de fórmula (I) como se define arriba, caracterizado por que el proceso comprende las etapas siguientes:

l) acilación del derivado de alcoxicarbonilo de fórmula (I) obtenido en la etapa f) descrito arriba, con anhídrido trifluoroacético;

m) eliminación en el compuesto resultante del grupo trifluoroacetilo en posición 1 o 2 del anillo de pirazol;

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5 o) hidrólisis en condiciones básicas o ácidas del grupo alcoxicarbonilo y del grupo trifluoroacetilo del compuesto resultante de fórmula (XVI);

p) acoplamiento del grupo carboxilo del compuesto resultante de fórmula (XVII) con una amina de fórmula (IX) descrita arriba;

q) derivatización del grupo funcional amino en posición 3 del compuesto resultante de fórmula (XVIII);

10 r) separación de la resina del compuesto resultante de fórmula (XIX), para obtener de este modo los compuestos deseados de fórmula I, convirtiendo opcionalmente el compuesto resultante de fórmula (I) en un compuesto diferente de fórmula (I) y/o convirtiéndolo en una sal farmacéuticamente aceptable si se desea.

Dicha síntesis en fase sólida (SPS) se resume en el esquema B a continuación.

15 Esquema B

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donde la resina es una resina poliestirénica comercialmente disponible como por ejemplo, resina de Br-Wang, resina de tritilo, resina de Cl-tritilo, resina de Merrifield, resina MAMP o resina de isocianato y derivados de las mismas; n, R1, R2 y R3 son como se define en la fórmula (I) y Ra' es un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado.

20 Cualquiera de las reacciones anteriores se lleva a cabo de acuerdo con métodos conocidos, trabajando tal como ya se ha descrito anteriormente, y permite la obtención de compuestos de fórmula (I) como se establece arriba.

La etapa l) se lleva a cabo como se describe en la etapa i.1).

La etapa m) se lleva a cabo como se describe en la etapa k).

De acuerdo con la etapa n), el compuesto de fórmula (I) se carga en una resina de cloruro de tritilo (copoliestireno

25 1%DVB) para obtener el compuesto de fórmula XVI. La reacción de carga se puede llevar a cabo en un disolvente adecuado como diclorometano o tetrahidrofurano y en la presencia de una base como trietilamina, piridina, diisopropilamina y así sucesivamente. La reacción se agita durante un tiempo que oscila entre 18 y 24h a temperatura ambiente. Véase como referencia: M.A. Youngman, y col. Tetrahedron Lett., 1997, 38, 6347; K. Barlos, y col. Póster P316, 24th European Peptide Symposium, Edinburgh, 1996.

30 La etapa o) se lleva a cabo como se describe en la etapa g.1).

La etapa p) se lleva a cabo como se describe en la etapa g.3).

La etapa q) se lleva a cabo como se describe en las etapas i) y j).

De acuerdo con la etapa r), la separación de la resina se ejecuta en condiciones ácidas, en presencia de ácidos adecuados, como por ejemplo, ácido clorhídrico, trifluoroacético, metanosulfónico o p-toluenosulfónico. La reacción

35 se lleva a cabo, preferentemente, utilizando ácido trifluoroacético en diclorometano como disolvente.

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Por tanto, es un objeto adicional de la presente invención, una biblioteca de dos o más compuestos de fórmula (I), de acuerdo con la realización preferida de la invención,

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5

donde

n es 0 o 1;

R1, R2 y R4, cada uno independientemente del otro, son seleccionados del grupo consistente en -Ra, -CORa, -CONHRa, -SO2Ra y -COORa;

10 R3 es un grupo -NRaRb o -ORa;

donde Ra y Rb, diferentes o iguales, son independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C1-C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, cicloalquilo C3-C6, cicloalquil alquilo C1-C6, heterociclilo, heterociclil alquilo C1-C6, arilo, aril alquilo C1-C6, heteroarilo y heteroaril alquilo C1-C6, o tomados juntos con el átomo de nitrógeno al cual están unidos, tanto Ra

15 como Rb, pueden formar un heterociclo de 3 a 8 miembros sustituido opcionalmente, conteniendo opcionalmente un heteroátomo adicional o grupo heteroatómico seleccionado de entre S, O, N o NH,

y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Véase la sección experimental como referencia general para las bibliotecas anteriores de compuestos de fórmula (I).

20 De todo lo expuesto anteriormente, resulta evidente para el experto que una vez se prepara una biblioteca de dichos derivados, por ejemplo, consistente en alrededor de un millar de compuestos de fórmula (I), dicha bibliotecase puede usar de forma muy ventajosapara el cribaje frente a determinadas cinasas, como se describe anteriormente.

Véase como referencia general para bibliotecas de compuestos y usos de los mismos como herramientas para el 25 cribaje de actividades biológicas, J. Med. Chem. 1999, 42, 2373-2382; y Bioorg. Med. Chem. Lett. 10(2000), 223

226.

FARMACOLOGÍA

La actividad inhibidora de inhibidores putativos de cinasa y la potencia de los compuestos seleccionados se determina mediante un método de valoración basado en el uso de Kinase-Glo® Luminiscent Kinase Assay

30 (disponible comercialmente en Promega Corporation y descrito en Koresawa, M y Okabe. T. (2004) Highthroughput screening with quantitation of ATP consumption: A universal non-radioisotope, homogeneous assay for protein kinase.Assay Drug Dev. Technol. 2, 153-60).

La reducción de ATP como resultado de la actividad cinasa se puede monitorizar de forma altamente sensible mediante el uso de Kinase-Glo® y Kinase-Glo® Plus Reagent, los cuales usan luciferina, oxígeno y ATP como

35 sustratos en una reacción que produce oxiluciferina y luz.

Las formas cortas y abreviaturas usadas aquí tienen el significado siguiente:

ACN acetonitrilo

BSA albúmina de suero bovino

40 Tris 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol

Hepes ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N’-(2-etanosulfónico)

DTT treo-1,4-dimercapto-2,3-butanodiol

THF tetrahidrofurano Las condiciones de reacción de cinasa dependen de la diana (enzima) y por tanto sufre adaptaciones individuales. La Kinase-Glo® Luminiscent Kinase Assay se puede usar virtualmente con cualquier combinación de cinasa y sustrato.

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MTBE: éter metil terciario butílico

DIPEA: diisopropiletilamina

PyBOP: hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(pirrolidin)fosfonio

EDC: 1-etil-3-(3´-dimetilaminopropil)carbodiimida

DHBTOH: 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina

TEA: trietilamina

TFA: ácido trifluoroacético

TFAA: anhídrido trifluoroacético

TMOF: trimetil orto formiato

DCE: dicloroetano

DCM: diclorometano

DMF: dimetilformamida

DMSO: dimetilsulfóxido

HOBT: hidroxibenzotriazol

KD: akiloDalton

mg: miligramo

μg: microgramo

ng: nanogramo

L: litro

mL: mililitro

μl: microlitro

M: molar

mM: milimolar

μM: micromolar

nM: nanomolar

Las condiciones tampón también pueden variar dependiendo de la cinasa de interés (p. ej. para PKA se usa una composición de Tris pH 7,5 40 mM, MgCl220 mM, BSA 0,1 mg/ml, en 50 μl de volumen final). Típicamente el intervalo de titulación del ATP es 0,1 μM a 10 μM.

El sustrato cinasa óptimo da como resultado el mayor cambio en la luminiscencia, al comparar los pocillos de reacción con cinasa con los pocillos sin cinasa.

La cantidad óptima de cinasa se determina haciendo dos diluciones en serie a través de placas usando la cantidad óptima de ATP y el sustrato cinasa óptimo. La cantidad óptima de cinasa que se debe usar en los posteriores cribajes de compuestos y determinaciones de IC50 es la cantidad necesaria para que la luminiscencia se encuentre en el intervalo lineal de la curva de titulación de cinasa (respuesta sigmoidal según la dosis).

Ensayo Kinase-Glo® robotizado

Este ensayo se estableció para la medición de la actividad y/o la inhibición de cinasa. Es homogéneo, rápido, exento de radioctividad y es adecuado para todo tipo de proteína cinasas, como la familia PLK, ABL, ACK1, AKT1, ALK, AUR1, AUR2, BRK, CDC7/DBF4, CDK2/CYCA, CHK1, CK2 EE2FK, EGFR1, ERK2, FAK, FGFR1, FLT3, GSK3beta, IFGR1, IKK2, IR, JAK2, JAK3, KIT, LCK, LYN, MAPKAPK2, MELK, MET, MPS1, MST4, NEK3, NIM1, P38alpha, PAK4, PDGFR, PDK1, PERK, PIM1, PIM2, PIM3, PKAalpha, PKCbeta, PLK1, RET, SULU1, SYK, TRKA, VEGFR2, VEGFR3 o ZAP70.

Se estableció el ensayo en placas de 384 pocillos: la mezcla de ensayo consistió en:

1) 3x mezcla de enzimas (realizado en tampón cinasa 3X), 5 μl/pocillo

2) 3x mezcla de sustrato y ATP (realizado en ddH2O), 5 μl/pocillo

3) 3x compuesto de fórmula (I) (diluido en ddH2O – DMSO al 3%), 5 μl/pocillo Los compuestos de ensayo se introdujeron en placas de 96 pocillos como una solución 1 mM en DMSO 100%. Las placas se diluyeron hasta 30 μM en ddH2O, DMSO 3%; 4 placas se reorganizaron en placas de 384 pocillos dispersando 5 μl de capa placa de 96 pocillos en los cuatro cuadrantes de una placa de 384 pocillos. En el pocillo P23 y P24 se añadió el estándar interno inhibidor estaurosporina.

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Esquema del ensayo

Las placas de ensayo se llenaron primero con 5 μl de dilución del compuesto (30 μM, correspondiente a dilución 3X) y después se cargaron sobre una estación robotizada junto con un depósito para la mezcla de enzima (3X) y uno para la mezcla de ATP (3X), específico para cada diana estudiada.

Para iniciar el ensayo, el robot aspiró 5 μl de mezcla ATP/sustrato, creó un espacio de aire dentro de las puntas (5 μl) y aspiró 5 μl de la mezcla de enzima. El posterior dispensado en las placas de ensayo permitió el inicio de la reacción cinasa tras 3 ciclos de mezclado, realizado por el propio robot pipeteando arriba y abajo. En este punto, se restauró la concentración correcta para todos los reactivos.

El robot incubó las placas durante 90 minutos a temperatura ambiente y después paró la reacción mediante pipeteado de 15 μl de reactivo Kinase-Glo® en la mezcla de reacción. Se realizaron tres ciclos de mezclado inmediatamente después de la adición del reactivo.

El principio de la técnica Kinase-Glo® es la presencia en la mezcla de reactivo de oxígeno, luciferina y enzima luciferasa: en presencia del ATP que queda de la reacción de cinasa, se produce oxi-luciferina con la emisión de luz, que depende directamente de la cantidad de ATP. Para obtener rendimientos óptimos de esta técnica, la reacción de cinasa debería utilizar al menos un 15-20% del ATP disponible.

Tras otros 60 minutos de incubación para estabilizar la señal luminiscente, las placas se leyeron en un instrumento ViewLux®. Los datos se analizaron usando el paquete de software Assay Explorer® que proporciona datos de porcentajes de inhibición.

Como ejemplo, aquí se presentan las condiciones de ensayo usadas para probar los compuestos de fórmula (I) frente a ALKtide YFF APCo cinasa;

Concentración de ATP: 1 μM

Concentración de enzima: 100 nM

Tampón de reacción: Hepes 50 mM pH 7,5, MgCl25 mM, MnCl21 mM, DTT 1 mM, Na3VO4 uM, BSA 0,2 mg/ml

Procedimiento de ensayo: añadir 5 ul de compuesto de fórmula (I) (3x), añadir 5 μl de mezcla (3x) ATP/S en tampón 1x; añadir 5 μl de enzima en tampón 2x+3X BSA; para el blanco, añadir 5 μl de tampón 2x+3x BSA sin enzima. Después de 90 minutos de incubación, añadir 15 μl/pocillo de reactivo Kinase-Glo. Tras 60-90 minutos de incubación para estabilizar la señal de luminiscencia, se leen las placas en un instrumento ViuwLux.

La actividad inhibidora de los inhibidores cinasa putativos y la potencia de los compuestos seleccionados se determinan también usando un ensayo de trans-fosforilación.

Los péptidos específicos o sustratos de proteína se trans-fosforilan mediante su cinasa específica ser-thr o tyr en presencia de ATP marcado con 33P-γ-ATP, y en presencia de su propio tampón y cofactores óptimos. Al final de la reacción de fosforilación, más del 98% del ATP no marcado y el ATP radioactivo se captura mediante un exceso de resina dowex de intercambio iónico; después, la resina se asienta por gravedad en el fondo de la placa de reacción. Posteriormente se retira el sobrenadante y se transfiere a una placa de conteo, y se evalúa por conteo β. Las condiciones de reacción dependen de la diana (enzima) y por tanto sufren adaptaciones individuales. Las condiciones tampón también pueden variar dependiendo de la cinasa de interés. El ensayo se puede usar con virtualmente cualquier cinasa y combinación de sustrato y es adecuado para cualquier tipo de proteína cinasas, como ABL, ACK1, AKT1, ALK, AUR1, AUR2, BRK, BUB1, CDC7/DBF4, CDK2/CYCA, CHK1, CK2, EEF2K, EGFR1, EphA2, EphB4, ERK2, FAK, FGFR1, FLT3, GSK3beta, Haspin, IGFR1, IKK2, IR, JAK1, JAK2, JAK3, KIT, LCK, LYN, MAPKAPK2, MELK, MET, MNK2, MPS1, MST4, NEK6, NIM1, P38alpha, PAK4, PDGFR, PDK1, PERK, PIM1, PIM2, PKAalpha, PKCbeta, PLK1, RET, ROS1, SULU1, Syk, TLK2, TRKA, TYK, VEGFR2, VEGFR3, ZAP70.

Como ejemplo, aquí se indican las condiciones de ensayo usadas para el análisis de los compuestos de fórmula (I) frente a cinasas cdc7 y cdk2.

Ensayo de inhibición de la actividad Cdc7

La actividad inhibidora de inhibidores putativos de Cdc7 y la potencia de los compuestos seleccionados se determinaron mediante un método de ensayo basado en el uso de tecnología de captura de resina Dowex.

El ensayo consiste en la transferencia de grupos fosfatos marcados radioactivamente mediante la cinasa a un sustrato aceptor. El producto resultante marcado con 33P se separa del trazador sin reaccionar, se transfiere a un cocktail de escintilación y se mide la luz emitida mediante un contador de escintilación.

El ensayo de inhibición de actividad de Cdc7/Dbf4 se ejecuta de acuerdo con el siguiente protocolo.

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reacción se detiene mediante la adición de resina Dowex en presencia de ácido fórmico. Las partículas de resina Dowex capturan el 33-ATP que no ha reaccionado, arrastrándolo al fondo del pocillo, mientras que el sustrato MCM2 fosforilado con 33P se mantiene en solución. Se recoge el sobrenadante y se transfiere a placas Optiplate y se evalúa la extensión de la fosforilación del sustrato mediante conteo β.

El ensayo de inhibición de actividad de Cdc7/Dbf4 se llevó a cabo en placas de 96 pocillos de acuerdo con el siguiente protocolo.

A cada uno de los pocillos se añadió:

-10 μl del compuesto de prueba (10 incrementos de concentración en el rango de nM a μM para generar una curva de respuesta a la dosis). El disolvente para los compuestos de prueba contenía un 3% de DMSO. (Concentración final de 1%)

-10 μl del sustrato MCM2 (concentración final 6 M), una mezcla de ATP frío (concentración final 2 M) y ATP radioactivo (1/5000 de relación molar con respecto al ATP frío).

-10 μl de enzima (Cdc7/Dbf4, concentración final de 2 nM)que empieza la reacción. El tampón de la reacción consistió en HEPES 50 mMpH 7,9 conteniendo MgCl2 15 mM, DTT 2 mM, NaVO3 3 μM, glicerofosfato 2mM y BSA 0,2 mg/mL.

-Tras la incubación durante 60 minutos a temperatura ambiente, se detuvo la reacción mediante la adición en cada pocillo de 150 μl de resina Dowex en presencia de ácido fórmico 150 mM. Después de otros 60 minutos de incubación, se extrajeron 50 μl de suspensión y se transfirieron a una placa OPTIPLATE de 96 pocillos conteniendo 150 μl de Microscint 40 (Packard); después de 5-10 minutos agitando las placas se leyeron durante 1 min con un lector de radioactividad por conteo Packard TOP.

Determinación IC50: se probaron inhibidores a diferentes concentraciones en el intervalo de 0,0005 a10 M. Los datos experimentales se analizaron mediante el programa informático Assay Explorer utilizando los cuatro parámetros de la ecuación logística:

y = fondo+(cima-fondo)/(1+10^((logIC50-x)*pendiente))

donde x es el logaritmo de la concentración de inhibidor, y es la respuesta; y empieza en el fondo y llega a la cima con una forma sigmoide.

Ensayo de inhibición de la actividad Cdk2/ciclina A

Reacción cinasa: sustrato histona H1 1,5 μM, 25 μATP (P33-ATP 0,2 μCi), 30 ng de Cdk2/ciclina A co-expresada en baculovirus, inhibidor 10 μM en un volumen final de 100 μl de tampón (TRIS HCl 10 mM pH 7,5, MgCl210 mM, DTT 7,5 mM) se añadieron a cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en U. Tras una incubación de 10 min a 37ºC se paró la reacción mediante 20 μl de EDTA 120 mM.

Captura: 100 μl se transfirieron desde cada pocillo a una placa MultiScreen, para permitir la unión del sustrato al filtro de fosfocelulosa. Las placas se lavaron entonces 3 veces con 150 μl/pocillo de PBS Ca++/Mg++ libre y se filtraron mediante un sistema de filtración MultiScreen.

Detección: se dejaron secar los filtros a 37ºC, después se añadieron 100 μl/pocillo de escintilante y se detectó histona H1 marcada con 33P mediante conteo de radioactividad en el instrumento Top-Count.

Resultados: Los datos se analizaron mediante una versión personalizada internamente del paquete SW “Assay Explorer” que proporciona, bien el % de inhibición para los ensayos primarios, o los ajustes sigmoidales de las diez curvas de dilución para la determinación de IC50 en los ensayos secundarios/rutinas de confirmación de aciertos.

Como ejemplo, en la Tabla A se presentan datos de varios compuestos de la presente invención, los cuales mostraron IC50 inferiores a 10 μM ensayados frente a cinasas diferentes.

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Los compuestos de la presente invención se pueden administrar de forma individual o, alternativamente, en combinación con tratamientos contra el cáncer conocidos, como terapia de radiación o régimen de quimioterapia en 5 combinación con agentes citostáticos o citotóxicos, agentes tipo antibiótico, agentes alquilantes, agentes antimetabolito, agentes hormonales, agentes inmunológicos, agentes tipo interferona, inhibidores de la ciclooxigenasa (p. ej. inhibidores de COX-2), inhibidores de metaloproteasa matriz, inhibidores de la telomerasa, inhibidores de tirosina cinasa, agentes receptores del factor anti-crecimiento, agentes anti-HER, agentes anti-EGFR, agentes anti-angiogénesis (p. ej. inhibidores de la angiogénesis), inhibidores de farnesil transferasa,

10 inhibidores de la ruta de transducción de señal ras-raf, inhibidores del ciclo celular, otros inhibidores del cdks, agentes de unión a tubulina, inhibidores de la topoisomerasa I, inhibidores de la topoisomerasa II, y similares.

Si se formulan como una dosis fija, dichos productos combinados emplean los compuestos de esta invención dentro del intervalo de dosificación descrito abajo y emplean el otro agente farmacéuticamente activo dentro del intervalo de dosificación aprobado.

15 Los compuestos de fórmula (I) se pueden usar secuencialmente con agentes anticancerígenos conocidos cuando una formulación combinada es inapropiada.

Los compuestos de fórmula (I) de la presente invención, adecuados para la administración a un mamífero, p. ej., a humanos, se pueden administrar mediante las rutas usuales y el nivel de dosificación depende de la edad, el peso, la condición del paciente y la vía de administración.

20 Por ejemplo, una dosificación adecuada adoptada para la administración oral de un compuesto de fórmula (I) puede estar en el intervalo de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 500 mg por dosis, de 1 a 5 veces al día. Los compuestos de la invención se pueden administrar en una variedad de formas de dosificación, p. ej., oralmente, en forma de comprimidos, cápsulas, comprimidos grajeados o recubiertos con película, soluciones líquidas o suspensiones; rectalmente en forma de supositorios; parenteralmente, p. ej., intramuscularmente, o

25 mediante inyección o infusión intravenosa y/o intratecal y/o intraespinal.

La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (I)

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en asociación con un excipiente farmacéuticamente aceptable, el cual puede ser un portador o un diluyente.

Las composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos de la invención se preparan usualmente

30 siguiendo métodos convencionales y se administran en una forma farmacéuticamente adecuada. Por ejemplo, las formas orales sólidas pueden contener, junto con el principio activo, diluyentes, p. ej., lactosa, dextrosa, sacarosa, sucrosa, celulosa, almidón de maíz o almidón de patata; lubricantes, p. ej., sílice, talco, ácido esteárico, estearato magnésico o cálcico, y/o polietilenglicoles; agentes aglutinantes, p. ej., almidones, goma arábiga, gelatina metilcelulosa, carboximetilcelulosa o polivinil pirrolidona; agentes desintegrantes, p. ej., almidón, ácido algínico, humectantes como lecitina, polisorbatos, laurilsulfatos; y, en general, sustancias no tóxicas y farmacológicamente inactivas usadas en formulaciones farmacéuticas. Estas preparaciones farmacéuticas se pueden preparar de forma conocida, por ejemplo, mediante procedimientos de mezcla, granulación, compresión, grajeado, o recubrimiento

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5 con película.

Las dispersiones líquidas para administración oral pueden ser, p. ej., jarabes, emulsiones y suspensiones. Como ejemplo, los jarabes pueden contener, como portador, sacarosa o sacarosa con glicerina y/o manitol y sorbitol.

Las suspensiones y las emulsiones pueden contener, como ejemplos de portadores, goma natural, agar, alginato sódico, pectina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, o alcohol polivinílico. La suspensión o soluciones para

10 inyecciones intramusculares pueden contener, junto con el principio activo, un portador farmacéuticamente aceptable, p. ej., agua estéril, aceite de oliva, etil oleato, glicoles, p. ej., propilenglicol y, si se desea, una cantidad adecuada de clorhidrato de lidocaína. Las soluciones para inyecciones o infusiones intravenosas pueden contener, como portador, agua estéril o preferentemente deben encontrarse en forma de soluciones estériles, acuosos, isotónicas, salinas, o pueden contener propilenglicol como portador.

15 Los supositorios pueden contener, juntos con el principio activo, un portador farmacéuticamente aceptable, p. ej., manteca de cacao, polietilenglicol, un detergente éster de ácido graso sorbitán polioxietileno o lecitina.

Con la intención de ilustrar mejor la presente invención, sin poner ninguna limitación a la misma, ahora se indican los ejemplos siguientes.

SECCIÓN EXPERIMENTAL

20 Métodos generales

La cromatografía flash se realizó en gel de sílice (Merck grado 9395, 60A). Los tiempos de retención de la cromatografía líquida de alta presión (HPLC: valores de t.r.) se determinaron mediante:

HPLC Método 1A y 1B:

En esta aplicación se usó un equipo Waters Alliance LC mod. 2795 equipado con un detector de UV variable mod.

25 2487, un detector de nitrógeno por quimioluminiscencia (CLND, Antek 8060) y un detector de masas ZQ2000 (interfaz ESI). El flujo total se separó y se distribuyó en los tres detectores con una relación fija (64:15:21 UV:MS:CLND). La cromatografía líquida se equipó con una columna de 30 x 3,0 mm I.D. (Waters xBridge C18, partículas de 3,5 um), termostatizada a 50ºC. Se usaron dos fases móviles: la fase A fue ácido fórmico 0,05% p/v (1 ml/L de ácido fórmico al 50% Fluka 09676 en agua desionizada) y la fase B fue MeOH/iPrOH/H2O 70/25/5

30 (v/v/v) conteniendo ácido fórmico al 0,035% p/v (700 uL/L de ácido fórmico al 50% Fluka 09676).

Un volumen de 5 µl de solución de muestra nominal 1 mM en DMSO se inyectó (secuencial, modo “partial loop” sin espacios de aire) y se realizó un análisis genérico en gradiente de fase reversa a 0,8 mL/min, bien en una variante rápida (método 1A), o bien en una lenta (método 1B), como se indica en la siguiente tabla:

Método 1A: Método 1B

tR (min): Fase B (%) tR (min) Fase B (%)

0,00: 0 0,00 0

5,00: 100 8,00 100

5,70: 100 9,00 100

5,71: 0 9,01 0

6,3: Tiempo parada 9,6 Tiempo parada

7,9: Tiempo de análisis 11,2 Tiempo de análisis

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El detector de UV operó a 220 nm, velocidad de muestreo 5 Hz. El dispositivo MS operó a un voltaje capilar de 3,2 kV, cono 30 V, extractor 2 V, lente 0,5 V RF, flujo de desolvatación 400 Uh, flujo de cono 100 L/h, temperatura de la fuente 100ºC, temperatura de desolvatación 150 ºC, adquisición ESI(+) full scan 120 – 1200 amu, a una velocidad

5 de muestreo de 1,7 Hz. El detector CLND operó a una temperatura de horno de 1050ºC, flujo de oxígeno de entrada 280 ml/min, entrada de argón 80 ml/min, salida de argón 25 ml/min, ozono 30 ml/min, vacío 28 torr, voltaje PMT 750 V, cámara PMT a +10ºC, sensibilidad alta, selección 5, velocidad de muestreo 4 Hz.

HPLC Método 2:

Los análisis HPLC-MS se realizaron en un espectrómetro de masas de trampa de iones Finnigan MAT mod. LCQ,

10 equipado con una fuente de iones ESI (electroespray), el espectrómetro de masas se conecta directamente a un HPLC SSP4000 (Thermo Separation) equipado con un muestreador automático Lc Pal (CTC Analytics) y un detector PDA UV6000LP.

Condiciones de HPLC:

Columna: Phenomenex Gemini C18, 3 μm, 50 x 4,6 mm (por defecto)

15 Temperatura: 40ºC

Fase móvil A: Tampón acetato 5 mM pH 4,5 : acetonitrilo 95:5 (v:v)

Fase móvil B: Tampón acetato 5 mM pH 4,5 : acetonitrilo 5:95 (v:v)

Gradiente de elución:

Tiempo (min): % Fase móvil A

0: 100

7: 0

9: 0

11: 100

13: 100

20 Flujo: 1 ml/min Volumen de inyección: 10 μl Temperatura de columna: 40ºC Condiciones MS: El espectrómetro de masas LCQ opera con una interfaz ionización por electroespray (ESI) en modo ión positivo y

25 negativo siguiendo los parámetros de operación indicados en la Tabla 1. Los experimentos MS/MS se realizan en el ión más intenso de cada scan automáticamente con software Xcalibur. Se usó un 45% de energía de colisión para la fragmentación de los iones precursores.

Tabla 1. Parámetros del instrumento espectrómetro de masas

30

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HPLC Método 3: Los análisis HPLC-MS se realizaron en un espectrómetro de masas de trampa de iones Finnigan MAT mod. LCQ, equipado con una fuente de iones ESI (electroespray), el espectrómetro de masas se conecta directamente a un

5 HPLC SSP4000 (Thermo Separation) equipado con un muestreador automático Lc Pal (CTC Analytics) y un detector PDA UV6000LP. Condiciones de HPLC: Columna: Phenomenex Gemini C18, 3 μm, 50 x 4,6 mm (por defecto) Temperatura: 40ºC

10 Fase móvil A: Tampón acetato 5 mM pH 4,5 : acetonitrilo 95:5 (v:v) Flujo: 1 ml/min

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Tiempo (min): % Fase móvil A

0: 100

2: 80

9: 60

10: 0

12: 0

12,10: 100

5 Volumen de inyección: 10 μl

Temperatura de columna: 40ºC

Condiciones MS:

El espectrómetro de masas LCQ opera con una interfaz ionización por electroespray (ESI) en modo ión positivo y

negativo siguiendo los parámetros de operación indicados en la Tabla 1. Los experimentos MS/MS se realizan en 10 el ión más intenso de cada scan automáticamente con software Xcalibur. Se usó un 45% de energía de colisión

para la fragmentación de los iones precursores.

Tabla 1. Parámetros del instrumento espectrómetro de masas Tiempos de retención (t.r. HPLC) se indican en minutos a 220 nm o a 254 nm. La masa se indica en relación m/z.

Parámetro: Valor

Temperatura del capilar (ºC): 255

Fuente de voltaje (kV): 4,00

Voltaje del capilar (V): 21,0

Offset de la lente del tubo (V): -5,0

Amplificador multipolo RF (Vp-p): 400,0

Offset Multipolo 1 (V): -3,00

Offset Multipolo 2 (V): -6,50

Voltaje de lente intermultipolo (V): -16,00

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En caso necesario, los compuestos se purificaron mediante HPLC preparativo en una columna Waters X-Bridge Prep Shield RP18 (19 x 100 mm, 5 μm) o una columna Phenomenex Gemini C18 (21,2 x 250 mm, 10 μm), usando

5 un Sistema de autopurificación Waters FractionLynx equipado con un detector PDA Waters 996 y un espectrómetro de masas de cuadrupolo simple Micromass mod. ZQ, ionización por electroespray, modo positivo. La fase móvil A fue agua 0,05% NH3/acetonitrilo 95:5, y la fase móvil B fue acetonitrilo. Gradiente de 10 a 90% de B en 8 min o 15 min. Flujo de 20 ml/min.

La espectrometría 1H-RMN se llevó a cabo en un instrumento single bay Bruker AVANCE 400MHz con gradientes.

10 Se equipó con una muestra QNP (muestra intercambiable de 4 núcleos -1H, 13C, 19F y 31P) (método 1 de RMN) o en un Mercury VX 400 operando a 400,45 MHz equipado con una muestra de doble resonancia de 5 mm [1H (15N-31P)ID_PFG Varian](método 2 de RMN).

Los compuestos de fórmula (I), con un átomo de carbono asimétrico, y obtenidos como mezcla racémica, se resolvieron por separación HPLC en columnas quirales. En particular, por ejemplo, se pueden usar columnas

15 preparativas CHIRALPACK® AD, CHIRALPACK® AS, CHIRALCELL® OJ.

Como se ha indicado anteriormente, varios compuestos de fórmula (I) de la invención se han sintetizado de acuerdo con técnicas de química combinatoria.

A este respecto, varios compuestos preparados de este modo se han identificado de forma conveniente e inequívoca, mediante el sistema de codificación de las tablas III junto con el tiempo de retención de HPLC

20 (métodos 1A, 1B, 2 y 3) y la masa.

Cada código, que identifica un compuesto específico individual de fórmula (I), consiste en tres unidades A-M-B.

A representa cualquier sustituyente R1 y R2 -[véase fórmula (I)] y está unido a la M del núcleo central mediante el nitrógeno en posición 3; cada sustituyente A se representa en la siguiente tabla I.

B representa cualquier sustituyente R3 -[véase fórmula (I)] y está unido a la M del núcleo central mediante el 25 átomo de carbono del grupo carbonilo; cada sustituyente B se representa en la siguiente tabla II.

M se refiere al núcleo central, más concretamente, M1 representa el núcleo 4,5-dihidro-1H-pirazolo[4,3-g]indolizina [véase fórmula (I)A] mientras M2 representa el núcleo 1,4,5,6-tetrahidropirazolo[3,4-c]pirrolo[1,2-a]azepina [véase fórmula (I)B]; cada núcleo se sustituye en posición 3 por los grupos A y en el grupo carbonilo por los grupos B, esencialmente como sigue:

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Para simplificar la referencia, cada grupo A o B de las tablas I y II se ha identificado con la fórmula química adecuada, indicando también el punto de unión con el resto de la molécula M1 o M2.

Sólo como ejemplo, el compuesto A1-M1-B1 (entrada 1 de la tabla III) representa una4,5-dihidro-1H-pirazolo[4,3g]indolizina (núcleo central M1), estando sustituida en la posición 3 del nitrógeno por el grupo A1 y por el grupo B1 en el grupo carbonilo; asimismo, el compuesto A44-M2-B28 (entrada 1116 de la tabla III) representa una 1,4,5,6tetrahidropirazolo[3,4-c]pirrolo[1,2-a]azepina (núcleo central M2), estando sustituida en la posición 3 del nitrógeno por el grupo A44 y por el grupo B28 en el grupo carbonilo.

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Tabla II -grupos B

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5

Preparación 1

Preparación de 1H-pirrol-2-carboxilato de etilo (IV, donde Ra' es -CH2-CH3)

Una solución de 2,2,2-tricloro-1-(1H-pirrolo-2-il)-etanona (25g, 0,12 mol) en etanol (200 mL) se trató con carbonato potásico (5g). La mezcla se calentó a reflujo durante 1 hora. Después de este tiempo se filtró el residuo sólido y se

10 concentró la disolución bajo presión reducida. Se añadió acetato de etilo (200 mL) y se lavó 2 veces con agua. La fase orgánica se secó con sulfato sódico anhidro para obtener un sólido amarillo pálido (18 g).

HPLC (Método 2): m/z 140,12 [M+H]+ @ Rt = 4,01 min 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)  ppm 1,29 (t, J=7,07 Hz, 3H) 4,23 (q, J=7,07 Hz, 2H) 6,04-6,25 (m, 1H) 6,65-6,86 (m, 1H) 7,00-7,06 (m, 1H) 11,83 (br. s., 1H)

Preparación 2

15 Preparación de 4-(tricloroacetil)-1H-pirrol-2-carboxilato de etilo (V, donde Ra' es -CH2-CH3)

A una disolución de 1H-pirrol-2-carboxilato (18g, 0,12 mol) en DCM (200 mL)se le añadió AlCl3 anhidro (40 g). Después de 10 minutos de agitación vigorosa se añadió por goteo una solución de cloruro de tricloro-acetilo (20 mL) en DCM (100 mL). La reacción se calentó a reflujo durante 3 horas. Se permitió a la mezcla alcanzar la temperatura ambiente y se vertió en un vaso de 2L con HCl 6N helado dejándola con agitación durante 2 horas. Se 20 extrajo el DCM y se lavó 2 veces con NaHCO3 y agua. Se obtuvo un sólido oscuro que no se purificó.HPLC

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(Método 2): m/z 282,45 [M-H] @ Rt = 6,55 min 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)  ppm 1,32 (s, J=7,07 Hz, 3H) 4,30 (s, J=7,07 Hz, 2H) 7,26-7,40 (m, 1H) 7,85-8,09 (m, 1H) 13,06 (br. s., 1H)

Preparación 3

Preparación de 1H-pirrol-2,4-dicarboxilato de dietilo (VI, donde ambos Ra' son -CH2-CH3)

5 A una disolución de 4-(tricloroacetil)-1H-pirrol-2-carboxilato de etilo (30 g, 0,12 mol) en etanol (250 mL) se añadió carbonato potásico (7 g). La mezcla se calentó a reflujo durante 1 hora. Después de este tiempo se filtró el residuo sólido y se concentró la solución bajo vacío. Se añadió acetato de etilo (200 mL) y se lavó 2 veces con agua. La fase orgánica se secó con sulfato sódico anhidro para obtener un sólido marrón (28 g).

HPLC (Método 2): m/z 212,34 [M+H]+ @ Rt = 4,79 min 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)  ppm 1,26 (t, J=7,07 Hz,

10 3H) 1,28 (t, J=7,07 Hz, 3H) 4,19 (q, J=7,11, 2H) 4,25 (q, J=7,07 Hz, 2H) 7,06 (dd, J=2,50, 1,65Hz, 1H) 7,54 (dd, J=3,35, 1,65 Hz, 1H) 12,50 (br. s., 1H)

Preparación 4

Preparación de 1-(3-cianopropil)-1H-pirrol-2,4-dicarboxilato de dietilo (VII, dondeambos Ra' son -CH2-CH3)

30 g de carbonato potásico (0,21 mol) y 17 mL de 4-bromo-butironitrilo (0,14 mol, d=1,3) se añadieron a 1H-pirrol

15 2,4-dicarboxilato (28g, 0,13 mol) disuelto en ACN. La reacción se dejó a reflujo durante una noche. Se evaporó el disolvente bajo presión reducida y se disolvió el residuo en acetato de etilo lavándolo 2 veces con agua. El crudo se purificó en columna de gel de sílice (10p sílica) eluyente ciclohexano/acetato de etilo 7:3. Se obtuvieron 20 g de un sólido blanco.

HPLC (Método 2): m/z 296,51 [M+NH4+]+ @ Rt = 5,88 min. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)  ppm 1,24 (t, J=7,07

20 Hz, 3H) 1,27 (t, J=7,07 Hz, 3H) 2,03 (m, 2H) 2,48 (t, J=7,19 Hz, 2H) 4,19 (q, J=7,07 Hz, 2H) 4,24 (q, J=7,07 Hz, 2H) 4,38 (q, J=7,19 Hz, 2H) 7,16 (d, J=1,95 Hz, 1H) 7,80 (d, J=1,83 Hz, 1H)

Preparación 5

Preparación de 7-ciano-8-oxo-5,6,7,8-tetrahidroindolizina-2-carboxilato de etilo (VIII, donden es 0 y Ra' es -CH2-CH3)

25 A 1-(3-cianopropil)-1H-pirrolo-2,4-dicarboxilato de dietilo (7 g) disuelto en THF anhidro (150 mL)se le añadió por goteo una solución de tertBuOK 1N en THF (50 mL) bajo atmósfera de nitrógeno. Se dejó la reacción agitando. Después de 15 min se añadieron agua y ácido cítrico (pH  5), después de 30 minutos de agitación vigorosa se extrajo la solución con 100 mL de acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y NaHCO3 (pH  10) y se secó en Na2SO4 anhidro. Se obtuvieron 5 g de un sólido blanco (rendimiento 87%).HPLC (Método 2): m/z 250,31

30 [M+NH4+]+ @ Rt = 4,23 min. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)(mezcla de tautómeros de formas ceto/enólicaen relación 56:44) ppm 1,26 (t, J=7,07 Hz, 3H 56%) 1,28 (t, J=7,07 Hz, 3H 44%) 2,62 (m, 2H9 4,06 (t, J=6,83 Hz, 2H 44%) 4,17 (q, J=7,07 Hz, 2H 56%) 4,20 (q, J=7,07 Hz, 2H 44%) 4,38 (dt, J=12,19 J=4,02 Hz, 2H 56%) 4,51 (dd, J=11,24 J=5,08 Hz, 1H 56%) 7,00 (d, J=1,59 Hz, 1H 44%) 7,23 (d, J=1,71, 1H 56%) 7,65 (d, J=1,59, 1H 44%) 7,85 (d, J=1,59, 1H 56%) 10,96 (s, 1H 44% OH enólico)

35 Ejemplo 1

Preparación de 3-amino-4,5-dihidro-1H-pirazolo[4,3-g]indolizin-8-carboxilato de etilo (I, donde n es 0, R1, R2 y R4 son hidrógeno y R3 es -O-CH2-CH3)

Se añadió una solución de hidrazina monohidrato (6,5 g, 130 mmol) y ácido acético (9g, 150 mmol) a 7-ciano-8oxo-5,6,7,8-tetrahidroindolizin-2-carboxilato de etilo (12 g, 52 mmol) en etanol. La reacción se llevó a reflujo durante

40 62 horas y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó con agua y NH3. La fase orgánica se secó en Na2SO4. Se obtuvieron 10 g de un sólido amarillo pálido (rendimiento 78%).

HPLC (Método 2): m/z 247,25 [M+H]+ @ Rt = 3,17 min. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)  ppm 1,25 (t, J=7,13 Hz, 3H) 2,69 (t, J=6,71 Hz, 2H) 4,05 (t, J=6,71 Hz, 2H) 4,05 (t, J=6,71 Hz, 2H) 4,17 (q, J=7,07, 2H) 4,40-5,13 (m, 2H) 6,48 (br. s., 2H) 7,49 (s, 1H) 11,49 (br. s., 1H)

45 Ejemplo 2

Preparación del compuesto3-[(trifluoroacetil)amino]-4,5-dihidro-1H-pirazolo[4,3-g]indolizin-8-carboxilato de etilo (I, donde n es 0, R1 es -COCF3, R2 y R4 son hidrógeno y R3 es -O-CH2-CH3)

Se añadió TEA (11 g, 110 mmol) y TFAA (21 g, 100 mmol) al compuesto 3-amino-4,5-dihidro-1H-pirazolo[4,3g]indolizin-8-carboxilato de etilo (5 g, 20,3 mmol) en DCM. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente

50 durante 3 horas y se concentró bajo vacío. Se añadió NH3 diluido y MeOH al residuo y se agitó durante 1 hora. La solución se concentró, se añadieron 100 mL de agua y se extrajo con acetato de etilo (3 × 100 mL). La fase orgánica se secó con sulfato sódico anhidro para obtener un sólido amarillo pálido (6,5 g, 92%).

LCMS (Método 2): m/z 343 [M+H]+ @ Rt = 4,75 min (100% según detección ELS).

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)  ppm 13,13 (s, 1H) 11,61 (s, 1H) 7,62 (s, 1H) 6,68 (s, 1H) 4,21 (q, J=7,07 Hz, 2H) 55 4,13 (t, J=6,83 Hz, 2H) 2,81 (t, J=6,77 Hz, 2H) 1,28 (t, J=7,13 Hz, 3H)

Preparación 6 Se añadió una solución de 3-[(trifluoroacetil)amino]-4,5-dihidro-1H-pirazolo[4,3-g]indolizin-8-carboxilato (1,5 eq) y TEA (2 eq) en DCM (10 mL/g) a una resina de cloruro de tritilo poliestireno (Aldrich, carga 1,73 mmol/g) expandida en DCM. La mezcla se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente. Se filtró la resina, se lavó con DMF (3×), DCM (3×), MeOH (3×), DCM, MeOH, DCM, MeOH, DCM (3×) y los cloruros no reaccionados se eliminaron lavando la resina con una solución de TEA/MeOH/DCM (1:2:7) (2×). Después se lavó la resina con DCM (3×), MeOH (3×), DCM (3×) y se secó bajo vacío. Habitualmente la carga está por encima del 90%: la carga calculada con el incremento de peso fue 1,00 mmol/g. La resina se utilizó entonces en la etapa siguiente.

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La resina obtenida de la primera etapa se trató con una solución de NaOH (40 eq), H2O (1 ml/12 mmol NaOH), THF (2 ml/12 mmol NaOH) y una cantidad mínima de MeOH para dar una solución homogénea.

Se dejó agitando la reacción durante 72 horas a 50 ºC. Entonces, se filtró y se lavó secuencialmente con DMF (3×), MeOH (3×), agua, MeOH, DCM, MeOH, DCM (3×).

Después de una hidrólisis de comprobación (40% TFA en DCM r.t. 30 min) por LCMS (HPLC Método 2) m/z 219 [M+H]+ @ Rt 1,02 min (100% por detección ELS), se obtuvo el compuesto del título.

Preparación 7

Preparación de 1-(4-cianobutil)-1H-pirrolo-2,4-dicarboxilato de dietilo (VII, donde n es 1 y ambos Ra' son -CH2-CH3)

Se añadieron30 g de carbonato potásico (0,21 mol) y 16,5 mL de 5-bromo-pentanonitrilo (0,14 mol, d=1,377) a 1Hpirrolo-2,4-dicarboxilato de dietilo (28 g, 0,13 mol) disuelto en ACN. La reacción se llevó a reflujo durante la noche. Entonces, se evaporó el disolvente bajo presión reducida, el residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó 2 veces con agua. El crudo se purificó en columna de gel de sílica (10 p sílica) eluyente ciclohexano/acetato de etilo

7:3. Se obtuvieron 20 g de un sólido blanco. HPLC (Método 2): m/z 293.51 [M+H+] @ Rt = 5,61 min. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)  ppm 1,23-1,34 (m, 6H) 1,42-1,56 (m, 2H) 1,73-1,85 (m, 2H) 3,27-3,28 (m, 2H) 4,16-4,30 (m, 4H) 4,36 (t, J=7,0 Hz, 2H) 7,17 (d, J=2,0 Hz, 1H) 7,83 (d, J=2,0 Hz, 1H).

Preparación 8

Preparación de 8-ciano-9-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-5H-pirrolo[1,2-a]azepina-2-carboxilato de etilo (VIII, donde n es 1 y Ra' es -CH2-CH3)

Se añadió, bajo atmósfera de nitrógeno, mediante goteo una solución de tertBuOK en THF (50 mL) a 1-(4cianobutil)-1H-pirrolo-2,4-dicarboxilato de dietilo (7 g) disuelto en THF (150 mL). La reacción se dejó agitando y después de 15 minutos se añadieron agua y ácido cítrico (pH  5), después de 30 minutos de agitación vigorosa, se extrajo la solución con 100 mL de acetato de etilo. Después, la fase orgánica se lavó con agua y NaHCO3 (pH  10) y se secó con Na2SO4 anhidro. Se obtuvieron 5 g de un sólido blanco (rendimiento 87%).

HPLC (Método 2): m/z 264 [M+NH4+]+ @ Rt = 4,6 min. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)(mezcla de tautómeros de formas ceto/enólica en relación 55:45) ppm 1,35 (t, J=7,07 Hz, 2H 45%) 4,51 (dt, J=12,19 J=4,02 Hz, 2H 55%) 4,57 (m, 1H 55%) 7,12 (d, J=1,59 Hz, 1H 45%) 7,17 (d, J=1,71, 1H 55%) 7,31 (d, J=1,59, 1H 45%) 7,70 (d, J=1,59, 1H 55%) 10,82 (s, 1H 45% OH enólico)

Ejemplo 3

Preparación de 3-amino-1,4,5,6-tetrahidropirazolo[3,4-c]pirrolo[1,2-a]azepin-9-carboxilato de etilo (I, donde n es 1, R1, R2 y R4 son hidrógeno, y R3 es -O-CH2-CH3)

Se añadió una solución de hidrazina monohidrato (6,5 g, 130 mmol) y ácido acético (9 g, 150 mmol) a 8-ciano-9oxo-6,7,8,9-tetrahidro-5H-pirrolo[1,2-a]azepin-2-carboxilato de etilo (12 g, 49 mmol) en etanol. La reacción se llevó a reflujo durante 62 horas y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó con agua y NH3. La fase orgánica se secó con Na2SO4. Se obtuvieron 10 g de un sólido amarillo pálido (rendimiento 78%).

HPLC (Método 2): m/z 261,3 [M+H]+ @ Rt = 3,13 min. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)  ppm 1,25 (t, J=7,1 Hz, 3H) 2,54 (t, J=6,3 Hz, 2H) 4,17 (q, J=7,2 Hz, 2H) 4,10-4,23 (m, 2H) 4,44 (br. s., 1H) 6,82 (d, J=1,8 Hz, 1H) 7,43 (d, J=2,0 Hz, 1H) 11,70 (br. s., 1H)

Ejemplo 4

Preparación de 3-[(trifluoroacetil)amino]-1,4,5,6-tetrahidropirazolo[3,4-c]pirrolo[1,2-a]azepin-9-carboxilato de etilo (I, donde n es 1, R1 es -COCF3, R2 y R4 son hidrógeno, y R3 es -O-CH2-CH3)

Se añadió TEA (11 g, 110 mmol) y TFAA (21 g, 100 mmol) al compuesto 3-amino-1,4,5,6-tetrahidropirazolo[3,4c]pirrolo[1,2-a]azepin-9-carboxilato de etilo (5 g, 19,2 mmol) en DCM. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y se concentró bajo vacío. Se añadió NH3 diluido y MeOH al residuo y se agitó durante 1 hora. Entonces, se concentró la solución. Se añadió 100 mL de agua y se extrajo con acetato de etilo (3 × 100 mL). La fase orgánica se secó con sulfato sódico anhidro para obtener un sólido amarillo pálido (6,5 g, 92%).

LCMS (HPLC Método 2): m/z 357 [M+H]+ @ Rt = 4,76 min (100% mediante detección ELS).

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)  ppm 1,26 (t, J=7,1 Hz, 3H) 1,94-2,05 (m, 2H) 2,54-2,60(m, 2H) 4,16-4,21 (m, 2H) Preparación 9

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Preparación de ácido 3-amino-1,4,5,6-tetrahidropirazolo[3,4-c]pirrolo[1,2-a]azepin-9-carboxílico (XVII, donde n es 1)

Se añadió una solución de 3-[(trifluoroacetil)amino]-1,4,5,6-tetrahidropirazolo[3,4-c]pirrolo-[1,2-a]azepin-9

5 carboxilato de etilo (1,5 eq) y TEA (2 eq) en DCM (10 mL/g) a una resina de cloruro de tritilo poliestireno (Aldrich, carga 1,73 mmol/g) expandida en DCM. La mezcla se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente. Se filtró la resina, se lavó con DMF (3×), DCM (3×), MeOH (3×), DCM, MeOH, DCM, MeOH, DCM (3×) y los cloruros no reaccionados se eliminaron lavando la resina con una solución de TEA/MeOH/DCM (1:2:7) (2×). Se lavó, entonces, la resina con DCM (3×), MeOH (3×), DCM (3×) y se secó bajo vacío. Habitualmente la carga está por encima del 90%: la carga calculada con el incremento de peso fue 1,00 mmol/g. La resina se utilizó, entonces, en la etapa siguiente.

Se dejó agitando la reacción durante 72 horas a 50 ºC. Entonces, se filtró y se lavó secuencialmente con DMF (3×), 15 MeOH (3×), agua, MeOH, DCM, MeOH, DCM (3×).

Después de una hidrólisis de comprobación (40% TFA en DCM r.t. 30 min) por LCMS (HPLC Método 2) m/z 233 [M+H]+ @ Rt 1,15 min (100% por detección ELS), se obtuvo el compuesto del título.

Ejemplo 6

Preparación de A5-M1-B36 (entrada 443, tabla III)

Se añadieron 1,5 eq de EDC, 1,5 eq de HOBT, 5 eq de TEA y 5 eq de alilamina al ácido 3-amino-4,5-dihidro-1Hpirazolo[4,3-g]indolizin-8-carboxílico ligado a resina (XVII, preparado como se describe en la preparación 6), suspendido en una solución de DCM/DMF 1:1 v/v. Se dejó agitando la suspensión durante 24 horas a temperatura ambiente. Se filtró la resina y se lavó con DMF (3×), DCM (3×), MeOH (3×), DCM, MeOH, DCM, MeOH, DCM (3×). Después de la hidrólisis (TFA/DCM 40%) se encontró el producto puro al 90% en LCMS.

25 A la resina resultante unidaa 3-amino-N-prop-2-en-1-il-4,5-dihidro-1H-pirazolo[4,3-g]indolizin-8-carboxamida (carga 1 mmol/g)(XVIII) y suspendida en DCM, se le añadieron 5 eq. de cloruro de 2-cloro-benzoilo y 5,1 eq. de piridina. Se dejó agitando la suspensión durante la noche. Se filtró la resina y se lavó con DMF (3×), DCM (3×), MeOH (3×), DCM, MeOH, DCM, MeOH, DCM (3×). La 3-{bis[(2-clorofenil)carbonil]amino}-N-prop-2-en-1-il-4,5-dihidro-1Hpirazolo[4,3-g]indolizin-8-carboxamida resultante obtenida pero no aislada (XIX) se suspendió en una solución de NaOH 1N en DMF (1:4 v/v) y se dejó agitando durante la noche a temperatura ambiente. Entonces, se lavó con DMF (3×), MeOH (3×), agua, MeOH, DCM, MeOH, DCM (3×). Después de la hidrólisis (TFA/DCM 40%) se recuperó y analizó el producto del título.

LCMS (HPLC Método 1A): m/z 392 [M+H]+ @ Rt 2,72 min (100% mediante detección UV:MS:CLND).

Ejemplo 7

35 Preparación de A42-M2-B42 (entrada 1187, tabla III)

Se añadieron 1,5 eq de EDC, 1,5 eq de HOBT, 5 eq de TEA y 5 eq de piperidina al ácido 3-amino-1,4,5,6tetrahidropirazolo[3,4-c]pirrolo[1,2-a]azepin-9-carboxílicoligado a resina (XVII, preparado como se describe en la preparación 9), suspendido en una solución de DCM/DMF 1:1 v/v. Se dejó la suspensión agitando durante 24 horas a temperatura ambiente. Se filtró la resina y se lavó con DMF (3×), DCM (3×), MeOH (3×), DCM, MeOH, DCM, MeOH, DCM (3×). Después de la hidrólisis de comprobación (TFA/DCM 40%) se encontró el producto puro al 90% en LCMS.

A laresina resultante ligada a (3-amino-1,4,5,6-tetrahidropirazolo[3,4-c]pirrolo[1,2-a]azepin-9-il)(piperidin-1il)metanona (carga 1 mmol/g)(XVIII) y suspendida en DCM, se le añadieron 5 eq. de cloruro de etanosulfonilo y 5,1 eq. de piridina. Se dejó agitando la suspensión durante 24 horas a temperatura ambiente. Se filtró la resina y se

45 lavó con DMF (3×), DCM (3×), MeOH (3×), DCM, MeOH, DCM, MeOH, DCM (3×). Se detectó una mezcla del compuesto deseado y el derivado bis-sulfonilo.

A la mezcla de compuestos en resina (carga 1 mmol/g) se añadió una solución de 0,1 M TBAF en THF y se agitó durante 35 horas a temperatura ambiente. Después de ese tiempo se lavó la resina con DMF (3×), MeOH, DMF, MeOH, DCM, MeOH, DCM (3×). Después de la hidrólisis (TFA/DCM 40%) se recuperó y analizó el producto del título.

LCMS (HPLC Método 1A) m/z 396 [M+H]+ @ Rt 2,68 min (100% mediante detección UV:MS:CLND)

Ejemplo 8

Preparación de A47-M2-B27 (entrada 1526, tabla III)

Se añadieron 1,5 eq de EDC, 1,5 eq de HOBT, 5 eq de TEA y 5 eq de butan-2-amina racémica al ácido 3-amino

55 1,4,5,6-tetrahidropirazolo[3,4-c]pirrolo[1,2-a]azepina-9-carboxílico ligado a resina (XVII, preparado como se describe en la preparación 9), suspendido en una solución de DCM/DMF 1:1 v/v. Se dejó la suspensión agitando durante 24 horas a temperatura ambiente. Se filtró la resina y se lavó con DMF (3×), DCM (3×), MeOH (3×), DCM, A la resina resultante unida a3-amino-N-(butan-2-il)-1,4,5,6-tetrahidropirazolo[3,4-c]pirrolo[1,2-a]azepin-9carboxamida (carga 1 mmol/g)(XVIII) expandida en DCM, se le añadió TEA (10 eq) y 1-isocianato-2-metoxibenceno (10 eq) y se dejó agitando durante una noche a temperatura ambiente. Se filtró la resina y se lavó con DMF (3×), DCM (3×), MeOH (3×), DCM, MeOH, DCM, MeOH, DCM (3×). Después de la hidrólisis (TFA/DCM 40%) se recuperó y analizó el producto del título.

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LCMS (HPLC Método 1A) m/z 437 [M+H]+ @ Rt 3,42 min (100% mediante detección UV:MS:CLND)

Ejemplo 9

Preparación de A1-M1-B1 (entrada 1, tabla III)

A una solución de 3-amino-4,5-dihidro-1H-pirazolo[4,3-g]indolizin-8-carboxilato de etilo (preparado como se describe en el Ejemplo 1)en THF se añadieron 5 eq de TEA y más tarde 2,5 eq de cloruro de benzoilo. Se dejó agitando la suspensión durante 6 horas a temperatura ambiente. Un ensayo de LCMS reveló poli-acetilación. Se evaporó el disolvente y el residuo se diluyó con agua y se extrajo con EtOAc (2×). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4, se evaporó el disolvente y no se aisló el producto. A la mezcla poli-acetilada obtenida en la primera etapase le añadió una solución de NaOH 2N. Se calentó la suspensión a 60ºC hasta obtener una solución clara. Entonces, se añadió éter etílico y se separó la fase. Se añadió HCl 2N a la solución acuosa hasta alcanzar neutralidad. Se separó el precipitado formado y se secó bajo vacío. Se recuperó el ácido 3[(fenilcarbonil)amino]-4,5-dihidro-1H-pirazolo[4,3-g]indolizin-8-carboxílico.

LCMS (HPLC Método 2) m/z 323 [M+H]+ @ Rt 1,35 min (100% mediante detección ELS). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)  ppm : 2,62 (t, J=6,7 Hz, 2H) 4,13 (t, J=6,7 Hz, 2H) 6,65 (d, J=1,2 Hz, 1H) 7,31 (d, J=8,2 Hz, 2H) 7,43 (d, J=1,7 Hz, 1H) 7,59 (t, J=7,19, 1H) 8,01 (d, J=8,6 Hz, 2H) 10,51 (s, 1H) 11,81 (br. s., 1H).

Se disolvieron 2 eq de EDC y 3 eq de HOBT·NH4 en DMF con el derivado de ácido carboxílico resultante y se dejó agitando durante una noche a temperatura ambiente. Entonces, se añadió agua y acetato de etilo, se separaron las fases y el agua se extrajo una segunda vez con acetato de etilo. Se combinaron las fases orgánicas, se secaron y evaporaron bajo vacío. El compuesto del título se purificó mediante HPLC preparativo.

LCMS m/z 339 [M+NH ]+ @ Rt 2,87 min. 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz)  ppm : 2,86 (t, J=6,8 Hz, 2H) 4,08 (t, J=6,7 Hz, 2H) 6,69 (d, J=1,6 Hz, 1H) 6,77 (br. S, 1H) 7,45 (d, J=1,5 Hz, 1H) 7,51-7,57 (m, 2H) 7,62 (t, J=7,3 Hz, 2H) 10,54 (s, 1H).

Siguiendo el procedimiento descrito en los ejemplos 1 a 9 y utilizando los reactivos adecuados según el proceso de la invención, se prepararon también los siguientes compuestos de la tabla III.

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5

Ejemplo 10

Preparación de 2,4-dimetil-N-[1-metil-8-(pirrolidin-1-ilcarbonil)-4,5-dihidro-1H-pirazolo[4,3-g]indolizin-3-il]benzamida (I).

Después de disolver en diclorometano el compuesto 2,4-dimetil-N-[8-(pirrolidin-1-ilcarbonil)-4,5-dihidro-1H

10 pirazolo[4,3-g]indolizin-3-il]benzamida (A35-M1-B8, entrada 200, Tabla III), obtenido tal y como se describe en el ejemplo 9, se añadieron 2 equivalente de yoduro de metilo. Después de cuatro horas de agitación a temperatura ambiente, se añadió agua y se separaron las fases. La fase orgánica se secó con Na2SO4 y el crudo se purificó mediante HPLC preparativa.LCMS m/z 418 [M+H]+ @ Rt 2,87 min.

1H RMN (DMSO-d6, 401 MHz)  ppm : 1,76-1,96 (m, 4H) 2,32 (s, 3H) 2,39 (s, 3H) 2,86 (t, J=6,6 Hz, 2H) 3,40-3,72

15 (m, 4H) 4,09 (t, J=6,4 Hz, 2H) 4,19 (s, 3H) 6,65 (br. s., 1H) 7,04-7,14 (m, 2H) 7,39 (br. s., 1H) 7,40 (br. s., 1H) 10,54 (br. s., 1H).

No se aislaron los dos tautómeros posibles.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Compuesto de fórmula (I):

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5 donde: n es 0 o 1; R1, R2 y R4, cada uno independientemente de los otros, se seleccionan del grupo consistente en -Ra, -CORa, -CONHRa, -SO2Ra y -COORa;

10 R3 es un grupo -NRaRb o -ORa;

donde Ra y Rb, diferentes o iguales, son independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C1-C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6 lineal o ramificado, alquinilo C2-C6 lineal o ramificado, cicloalquilo C3-C6, cicloalquil alquilo C1-C6, heterociclilo, heterociclil alquilo C1-C6, arilo, aril alquilo C1-C6, heteroarilo y heteroaril alquilo C1-C6, o tomados juntos

15 con el átomo de nitrógeno al cual están unidos, tanto Ra como Rb, pueden formar un heterociclo de 3 a 8 miembros sustituido opcionalmente, conteniendo opcionalmente un heteroátomo adicional o grupo heteroatómico seleccionado de entre S, O, N o NH,

y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.
2. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 1 donde:

20 R1 es un grupo -CONHRa donde Ra es hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C1-C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6 lineal o ramificado,arilo y aril alquilo C1-C6.
3. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 1 donde:

R1 es un grupo -CORa donde Ra es hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C1-C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6 lineal o ramificado, arilo y aril alquilo C1-C6.

25 4. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 1 donde:

R1 es un grupo –SO2Ra donde Ra es hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C1-C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6 lineal o ramificado, arilo y aril alquilo C1-C6.
5. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4 donde: R2 es hidrógeno.

30 6. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5 donde: R3 es un grupo -NRaRb donde ambos Ra y Rb son hidrógenos o uno de ellos es un hidrógeno y el restante

Rb

Ra o es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C1-C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6 lineal o ramificado, arilo y aril alquilo C1-C6.
7. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6 donde: R4 35 es hidrógeno.
8.

Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7donde R1 y R2, cada uno independientemente de los otros, son un sustituyente descrito mediante cualquiera de los códigos A1-A54 y R3 es un sustituyente descrito mediante los códigos B1-B43:
9.

Una biblioteca de dos o más compuestosde fórmula (I):

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n es 0 o 1;

R1, R2 y R4, cada uno independientemente del otro, son seleccionados del grupo consistente en -Ra, -CORa, -CONHRa, -SO2Ra y -COORa;

5 R3 es un grupo -NRaRb o -ORa;

donde Ra y Rb, diferentes o iguales, son independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C1-C6 lineal o ramificado, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, cicloalquilo C3-C6, cicloalquil alquilo C1-C6, heterociclilo, heterociclil alquilo C1-C6, arilo, aril alquilo C1-C6, heteroarilo y heteroaril alquilo C1-C6, o tomados juntos con el átomo de nitrógeno al cual están unidos,

10 tanto Ra como Rb, pueden formar un heterociclo de 3 a 8 miembros sustituido opcionalmente, conteniendo opcionalmente un heteroátomo adicional o grupo heteroatómico seleccionado de entre S, O, N o NH,

y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
10. Una biblioteca de acuerdo con la reivindicación 9 donde los compuestos tienen la fórmula:

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15 donde los sustituyentes A y B son como se define en la reivindicación 8, y donde los compuestos se encuentran entre los listados aquí debajo:

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5 11. Un método in vitro para la inhibición de la actividad de proteína cinasa el cual comprende la puesta en contacto de la cinasa con una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula (I) como se define en la reivindicación 1.
12. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un

compuesto de fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 y, al menos, un excipiente, portador y/o 10 diluyente farmacéuticamente aceptable.
13. Un producto o kit que comprende un compuesto de fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 o una composición farmacéutica del mismo como se define en la reivindicación 12 y uno o varios agentes quimioterapéuticos, como una preparación combinada para el uso simultáneo, separado o secuencial en terapia contra el cáncer.

15 14. Un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en la reivindicación 1, para el uso como un medicamento.
15. Un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en la reivindicación 1, para el uso en un método para el tratamiento de enfermedades causadas por y/o asociadas con una actividad de proteína cinasa alterada.