ES2532083T3 - Uso de Hsp70 como regulador de la actividad enzimática - Google Patents

Abstract

Un agente bioactivo que es un derivado de hidroxilamina capaz de incrementar la concentración intracelular de Hsp70 amplificando la expresión génica de Hsp70, en el que dicho derivado de hidroxilamina es bimoclomol (BRLP- 42), o un análogo estructural del mismo, arimoclomol, BRX-220, BRX-345 o BGP-15, para su uso en el tratamiento de un trastorno de almacenamiento lisosómico.

Description

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organismo de un ser humano o un animal.

Los términos "tratar", "tratamiento" y "terapia" como se usan en el presente documento se refieren por igual al tratamiento profiláctico o preventivo y al tratamiento de mejora o paliativo. El término incluye un enfoque para obtener resultados fisiológicos beneficiosos o deseados, que pueden establecerse clínicamente. Para los propósitos 5 de esta invención, los resultado clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitarse a, alivio de síntomas, disminución del alcance de la enfermedad, afección estabilizada (es decir, que no empeora), retraso o ralentización de la progresión o el empeoramiento de la afección/los síntomas, mejora o paliación de la afección o los síntomas y remisión (sea parcial o total), sean detectables o indetectables. El término "paliación" y sus variaciones, como se usan en el presente documento, significa que el grado y/o las manifestaciones indeseables de una afección o

10 síntoma fisiológicos se reducen y/o el curso temporal de la progresión se ralentiza o se alarga, en comparación con no administrar composiciones de la presente invención.

Un "efecto de tratamiento" o "efecto terapéutico" se manifiesta si se produce un cambio en la afección que se está tratando, medido mediante los criterios que constituyen la definición de los términos "tratar" y "tratamiento". Se produce un "cambio" en la afección que se está tratando si existe al menos el 5 % de mejoría, preferentemente el

15 10 % de mejoría, más preferentemente al menos el 25 %, incluso más preferentemente al menos el 50 %, tal como al menos el 75 %, y más preferentemente al menos el 100 % de mejoría. El cambio puede basarse en la mejoras de la gravedad de la afección tratada en un individuo o en una diferencia en la frecuencia de afecciones mejoradas en las poblaciones de individuos con y sin tratamiento con el agente bioactivo o con el agente bioactivo en combinación con una composición farmacéutica de la presente invención.

20 "Cantidad farmacológicamente eficaz", "cantidad farmacéuticamente eficaz" o "cantidad fisiológicamente eficaz" de un "agente bioactivo" es la cantidad de un agente activo presente en una composición farmacéutica como se describe en el presente documento necesaria para proporcionar un nivel deseado de agente activo en el torrente circulatorio o en el sitio de acción en un individuo (p. ej., los pulmones, el aparato gástrico, el aparato colorrectal, la próstata, etc.) que se va a tratar para proporcionar una respuesta fisiológica anticipada cuando se administra dicha

25 composición. La cantidad precisa dependerá de numerosos factores, p. ej., el agente activo, la actividad de la composición, el dispositivo de administración empleado, las características físicas de la composición, el uso pretendido para el paciente (es decir, el número de dosis administradas al día), las consideraciones del paciente y similares, y puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica, basándose en la información proporcionada en el presente documento. Una "cantidad eficaz" de un agente bioactivo puede administrarse en una administración

30 o por medio de varias administraciones de una cantidad que sumen una cantidad eficaz, preferentemente en un periodo de 24 horas. Puede determinarse usando procedimientos clínicos estándar para determinar las cantidades y la pauta de administración adecuadas. Se entiende que la "cantidad eficaz" puede ser el resultado de la determinación empírica y/o individualizada (caso por caso) por parte del profesional sanitario encargado del tratamiento y/o del individuo.

35 Los términos "potenciar" y "mejorar" un efecto beneficioso y sus variaciones, como se usan en el presente documento, se refieren al efecto terapéutico del agente bioactivo frente a placebo o a un incremento del efecto terapéutico de un tratamiento médico del estado de la técnica superior al obtenido normalmente cuando se administra una composición farmacéutica sin el agente bioactivo de esta invención. "Un incremento de los efectos terapéuticos" se manifiesta cuando existe una aceleración y/o un incremento de la intensidad y/o el alcance de los

40 efectos terapéuticos obtenido como consecuencia de administrar el/los agente(s) bioactivo(s). También incluye la prolongación de la duración de los beneficios terapéuticos. También puede manifestarse cuando se necesita una cantidad menor de la composición farmacéutica para obtener los mismos beneficios y/o efectos cuando se coadministra con agente(s) bioactivo(s) proporcionados por la presente invención en comparación con la administración de una mayor cantidad de la composición farmacéutica en ausencia de agente bioactivo.

45 Preferentemente, aunque no necesariamente, el efecto potenciador da lugar al tratamiento de síntomas agudos para los que la composición farmacéutica sola no es terapéuticamente eficaz o es menos eficaz. La potenciación se logra cuando existe un incremento de al menos el 5 % de los efectos terapéuticos, tal como un incremento de al menos el 10 % de los efectos terapéuticos cuando un agente bioactivo de la presente invención se coadministra con una composición farmacéutica en comparación con la administración de la composición farmacéutica sola.

50 Preferentemente, el incremento es de al menos el 25 %, más preferentemente de al menos el 50 %, incluso más preferentemente de al menos el 75 %, lo más preferentemente de al menos el 100 %.

"Coadministrar" o "coadministración" de agente(s) bioactivo(s) o de agentes bioactivos y medicamentos del estado de la técnica, como se usa en el presente documento, se refiere a la administración de uno o más agentes bioactivos de la presente invención o a la administración de uno o más agentes bioactivos de la presente invención y una

55 composición farmacéutica del estado de la técnica en un periodo de tiempo determinado. Preferentemente, el periodo de tiempo es de menos de 72 horas, tal como de 48 horas, por ejemplo, de menos de 24 horas, tal como de menos de 12 horas, por ejemplo, de menos de 6 horas, tal como de menos de 3 horas. Sin embargo, estos términos también significan que el agente bioactivo y una composición terapéutica pueden administrarse juntos.

El término "individuo" se refiere a vertebrados, en particular a un miembro de una especie de mamíferos,

60 preferentemente primates, incluidos seres humanos. En una realización preferida, un individuo como se usa en el presente documento es un ser humano, hombre o mujer, de cualquier edad.

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para el inicio de la transcripción inversa. Los expertos en la técnica también usan el término "ADNc" para referirse a una molécula de ADN bicatenario que consiste en una molécula de ADN monocatenario y su hebra de ADN complementaria. El término "ADNc" también se refiere a un clon de una molécula de ADNc que se sintetiza a partir de un molde de ARN.

5 "ADN heterólogo" se refiere a una molécula de ADN o una población de moléculas de ADN que no existen de forma natural en una célula huésped dada. Las moléculas de ADN heterólogas para una célula huésped determinada pueden contener ADN derivado de la especie de la célula huésped (es decir, ADN endógeno) siempre que el ADN del huésped se combine con ADN que no es del huésped (es decir, ADN exógeno). Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un segmento de ADN que no es del huésped que codifica un polipéptido unido de manera

10 funcional a un segmento de ADN del huésped que comprende un promotor de la transcripción se considera una molécula de ADN heterólogo. Por el contrario, una molécula de ADN heterólogo puede comprender un gen endógeno unido de forma funcional con un promotor exógeno. Como otro ejemplo, una molécula de ADN que comprende un gen derivado de una célula natural se considera ADN heterólogo si esa molécula de ADN se introduce en una célula mutante que carece del gen silvestre.

15 Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácido preferentemente unidos exclusivamente por enlaces peptídicos, ya sea producido de forma natural o sintéticamente. Un polipéptido producido mediante la expresión de una molécula de ADN que no es del huésped es un péptido o polipéptido "heterólogo". El término "polipéptido" como se usa en el presente documento abarca proteínas, péptidos y polipéptidos, en el que dichos polipéptidos, péptidos o proteínas pueden o no haber sufrido modificaciones postraduccionales. La modificación postraduccional puede ser,

20 por ejemplo, fosforilación, metilación y glucosilación.

El término "expresión" se refiere a la biosíntesis de un gen o un producto génico.

"Hibridar" significa alinear hebras de ácidos nucleicos de diferentes fuentes; esto es, formar pares de bases entre regiones complementarias de dos hebras de ADN que no estaban apareadas originalmente. El término "hibridación bajo condiciones rigurosas" se define de acuerdo con Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 25 Cold Spring Harbor, Laboratory Press (1989), 1.101-1.104. Preferentemente, la hibridación bajo condiciones rigurosas significa que, después de un lavado durante 1 h con SSC 1 vez y SDS al 0,1 % a 50 grados C, preferentemente a 55 grados C, más preferentemente a 62 grados C y lo más preferentemente a 68 grados C, en particular durante 1 h en SSC 0,2 veces y SDS al 0,1 % a 50 grados C, preferentemente a 55 grados C, más preferentemente a 62 grados C y lo más preferentemente a 68 grados C, se observa una señal de hibridación

30 positiva.

Un tramo de "homología total" se define como una coincidencia de nucleótidos apareados a lo largo de la secuencia de los nucleótidos que interaccionan; en ARN natural el apareamiento de A con U y de G con C.

Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos que dirige la transcripción de un gen estructural. Normalmente, un promotor se sitúa en la región no codificante de 5' de un gen, próximo al sitio de inicio de la transcripción de un gen

35 estructural. Los elementos de secuencia dentro de promotores que realizan su función en el inicio de la transcripción se caracterizan frecuentemente por secuencias de nucleótidos de consenso. Si un promotor es un promotor inducible, entonces la velocidad de transcripción se incrementa en respuesta a un agente de inducción. Por el contrario, si el promotor es un promotor constitutivo, la velocidad de transcripción no está regulada por un agente inductor. También se conocen promotores reprimibles.

40 Un "elemento regulador" es una secuencia de nucleótidos que modula la actividad de un promotor. Por ejemplo, un elemento regulador puede contener una secuencia de nucleótidos que se une a factores celulares que permiten la transcripción exclusivamente o preferentemente en células, tejidos u orgánulos en particular. Estos tipos de elementos reguladores se asocian normalmente con genes que se expresan de una manera "específica de célula", "específica de tejido" o "específica de orgánulo".

45 Un "potenciador" es un tipo de elemento regulador que puede incrementar la eficacia de la transcripción, independientemente de la distancia o la orientación del potenciador con respecto al sitio de inicio de la transcripción.

Un "vector de clonación" es una molécula de ácido nucleico, tal como un plásmido, cósmido o bacteriófago, que tiene la capacidad de duplicarse de forma autónoma en una célula huésped. Normalmente, los vectores de clonación contienen uno o un número pequeño de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción que permiten la

50 inserción de una molécula de ácido nucleico de una forma determinada sin pérdida de la función biológica esencial del vector, así como de secuencias de nucleótidos que codifican un gen marcador que es adecuado para su uso en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores incluyen normalmente genes que proporcionan resistencia a la tetraciclina o a la ampicilina.

Un "vector de expresión" es una molécula de ácido nucleico que codifica un gen que se expresa en una célula

55 huésped. Normalmente, un vector de expresión comprende una promotor de la transcripción, un gen y un terminador de la transcripción. La expresión génica se sitúa habitualmente bajo el control de un promotor y se dice que dicho gen está "unido de manera funcional" al promotor. Del mismo modo, un elemento regulador y un promotor del núcleo están unidos de manera funcional si el elemento regulador modula la actividad del promotor del núcleo. Los vectores

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más sencillos llamados "vectores de transcripción" solo pueden transcribirse, pero no traducirse: pueden duplicarse en una célula objetivo pero no expresarse, a diferencia de los vectores de expresión. Los vectores de transcripción se usan para amplificar su inserto.

Un "huésped recombinante" es una célula que contiene una molécula de ácido nucleico heterólogo, tal como un 5 vector de clonación o un vector de expresión.

La transfección describe la introducción de material exógeno en células eucariotas. El término "transfección" para procedimientos no víricos se usa principalmente con referencia a células de mamíferos, mientras que se prefiere el término "transformación" para describir la transferencia de ADN no vírico en bacterias y células eucariotas no animales, tales como de hongos, algas y vegetales. Pueden emplearse procedimientos tanto químicos como físicos

10 para transfectar células.

Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácido preferentemente unidos exclusivamente por enlaces peptídicos, ya sea producido de forma natural o sintéticamente. Un polipéptido producido mediante la expresión de una molécula de ADN que no es del huésped es un péptido o polipéptido "heterólogo". El término "polipéptido" como se usa en el presente documento abarca proteínas, péptidos y polipéptidos, en el que dichos polipéptidos, péptidos o

15 proteínas pueden o no haber sufrido modificaciones postraduccionales. La modificación postraduccional puede ser, por ejemplo, fosforilación, metilación y glucosilación.

Un "residuo de aminoácido" puede ser un residuo de aminoácido natural o no natural enlazado con enlaces peptídicos o con enlaces distintos de los enlaces peptídicos. Los residuos de aminoácido pueden tener configuración D o configuración L. Un residuo de aminoácido comprende una parte aminoterminal (NH2) y una parte 20 carboxiterminal (COOH) separadas por una parte central que comprende un átomo de carbono o una cadena de átomos de carbono, de los que al menos uno comprende al menos una cadena o grupo funcional lateral. NH2 se refiere al grupo amino presente en el extremo amino terminal final de un aminoácido o péptido y COOH se refiere al grupo carboxi presente en el extremo carboxi terminal de un aminoácido o péptido. El término genérico aminoácido comprende aminoácidos tanto naturales como no naturales. Los aminoácidos naturales de nomenclatura estándar 25 como se enumeraron en J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) y se adoptaron en la sección 1.822(b)(2) del artículo 37 del C.F.R. pertenecen al grupo de aminoácidos enumerados en la tabla 1 que aparece a continuación en el presente documento. Los aminoácidos no naturales son aquellos que no se enumeran en la tabla 1. Los ejemplos de aminoácidos no naturales son los enumerados, p. ej., en la sección 1.822(b)(4) del artículo 37 del C.F.R., todos los cuales se incorporan en el presente documento por referencia. Asimismo, los residuos de aminoácido no naturales

30 incluyen, pero no se limitan a, residuos de aminoácido modificados, residuos de L-aminoácido y estereoisómeros de residuos de D-aminoácido.

Símbolos Aminoácido 1 letra 3 letras

Y

Tyr tirosina

G

Gly glicina

F

Phe fenilalanina

M

Met metionina

A

Ala alanina

S

Ser serina

I

Ile isoleucina

L

Leu leucina

T

Thr treonina

V

Val valina

P

Pro prolina

K

Lys lisina

H

His histidina

Q

Gln glutamina

E

Glu ácido glutámico

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W Trp triptófano R Arg arginina D Asp ácido aspártico N Asn asparagina C Cys cisteína

Tabla 1. Aminoácidos naturales y sus códigos correspondientes. Un "residuo de aminoácido equivalente" se refiere a un residuo de aminoácido que puede reemplazar a otro residuo de aminoácido en un polipéptido sin modificar sustancialmente la estructura y/o la funcionalidad del polipéptido. Por tanto, los aminoácidos equivalentes tienen propiedades similares tales como la voluminosidad de la cadena lateral, la polaridad de la cadena lateral (polares o no polares), la hidrofobicidad (hidrófobos o hidrófilos), pH (ácidos, neutros

5 o básicos) y la organización de las moléculas de carbono de la cadena lateral (aromáticos/alifáticos). Como tal, "residuos de aminoácido equivalentes" puede considerarse como "sustituciones de aminoácidos conservadoras". La clasificación de aminoácidos equivalentes se refiere en una realización a las clases siguientes: 1) HRK, 2) DENQ,

3) C, 4) STPAG, 5) MILV y 6) FYW Dentro del significado del término "sustitución de aminoácidos equivalentes" como se aplica en el presente

10 documento, en una realización, puede sustituirse un aminoácido por otro perteneciente a los grupos de aminoácidos indicados a continuación en el presente documento: i) Aminoácidos que tienen cadenas laterales polares (Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr y Cys) ii) Aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro y Met) iii) Aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas (Gly, Ala Val, Leu, Ile)

15 iv) Aminoácidos que tienen cadenas laterales cíclicas (Phe, Tyr, Trp, His, Pro) v) Aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas (Phe, Tyr, Trp) vi) Aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas (Asp, Glu) vii) Aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas (Lys, Arg, His) viii) Aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida (Asn, Gln)

20 ix) Aminoácidos que tienen cadenas laterales hidroxiladas (Ser, Thr) x) Aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre (Cys, Met), xi) Aminoácidos neutros débilmente hidrófobos (Pro, Ala, Gly, Ser, Thr) xii) Aminoácidos ácidos hidrófilos (Gln, Asn, Glu, Asp) y xiii) Aminoácidos hidrófobos (Leu, Ile, Val)

25 La presente invención también se refiere a variantes de la Hsp70, o sus fragmentos, en las que las sustituciones se han diseñado por análisis por ordenador que usa homología de secuencia para predecir si una sustitución afecta a la función de la proteína (p. ej., Pauline C. Ng y Steven Henikoff, Genome Research, vol. 11, número 5, 863-874, mayo de 2001).

Debido a la falta de precisión de los procedimientos analíticos estándar, se entiende que los pesos moleculares y

30 longitudes de los polímeros son valores aproximados. Cuando un valor de este tipo se expresa como "alrededor de" X o "aproximadamente" X, se interpretará que el valor indicado de X es preciso +/-20 %, tal como +/-10 %, por ejemplo, +/-5 %.

Descripción de los dibujos

Figura 1

35 Los efectos de la Hsp70 sobre la aSMasa unida a BMP y los niveles de ceramida. (A) Unión de 0,2 µM de aSMasa a liposomas que contienen BMP a pH 4,5 como una función de Hsp70 pre-unida (experimento análogo al ejemplo 1, véanse los materiales y procedimientos del presente documento para más detalles). Se dejó disociar la Hsp70 durante 10 min, alcanzando de este modo una asíntota inferior para la disociación antes de la adición de aSMasa).

(B) Microscopía confocal y cuantificación de los niveles de ceramida en iMEF naturales (WT) y transgénicos para

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c, f y g).

Figura 7

La Hsp70 estimula la actividad ASM que, a su vez, estabiliza los lisosomas. (a) Medida Biacore de la unión de 200 nM de rASM a liposomas que contienen BMP a pH 4,5 como una función de rHsp70 pre-unida. Los experimentos se 5 realizaron como se describe en la leyenda para la fig. 6e, añadiendo rASM durante 180 s después de la fase de disociación de 10 min de la rHsp70 seguida por otra fase de disociación de 10 min. (b) Actividad ASM en los lisados de MEF naturales (WT) y transgénicos para Hsp70 (Hsp70) (panel izquierdo) y en MEF WT incubados con 300 nM de rHsp70 durante 24 o 48 h según se indique. (c y d) Viabilidad (reducción de MTT; c) y actividad de la catepsina citosólica (zFRasa; d) en iMEF WT y con Hsp70 tratados con las concentraciones indicadas de desipramina durante 10 3h. (e) Formación de imágenes dinámica de células solas de pérdida de integridad lisosómica (fotooxidación en MEF WT y con Hsp70, así como en MEF incubados durante 3h con desipramina 12,5 y 25 µM (paneles izquierdo y derecho, respectivamente). Se midió de forma continua la pérdida de fluorescencia roja (panel izquierdo) y el incremento de la verde (panel derecho) para proporcionar curvas cinéticas completas para la pérdida de integridad lisosómica. Se examinaron 25-60 células por experimento de zonas predefinidas), p<0,001 para Hsp70 frente a WT

15 y Hsp70 + desipramina frente a Hsp70. Todos los valores representan la media ± DE para un mínimo de 3 experimentos independientes.

Figura 8

La rHsp70 estimula la actividad ASM, estabiliza los lisosomas y reduce el volumen lisosómico en fibroblastos de NPDA. (a) Formación de imágenes dinámica de células solas de la estabilidad lisosómica de fibroblastos primarios 20 de un paciente con NPDA analizadas como en la fig. 3e, p<0,001. (b) Actividad ASM de fibroblastos de NPDA dejados sin tratar o tratados con 300 nM de rHsp70 durante 48 h (panel izquierdo) o con 150 nM de rASM sola o en combinación con 300 nM de rHsp70 durante 24h (panel derecho). Los valores de p se calcularon a partir de la velocidad enzimática obtenida (DA500/mg de proteína/min). La fotografía de la derecha demuestra la incorporación endocítica de la rASM (verde) y su localización en el compartimento lisosómico visualizada mediante co-tinción con 25 rojo de Lysotracker. (c) La estabilidad lisosómica de los fibroblastos de NPDA dejados sin tratar o tratados durante 24 h con 300 nM de rHsp70, 150 nM de aSMasa o una combinación de rHsp70 y aSMasa se analizó como en la fig 3e. p<0,001 para todos los tratamientos en comparación con células no tratadas. (d) Cuantificación del área lisosómica de secciones transversales confocales de lulas en fibroblastos de NPDA dejados sin tratar o tratados durante 24 h con 300 nM de BSA, 300 nM de rHsp70, 150 nM de rASM (150 nM) o una combinación de rHsp70 y

30 rASM. La fotografía de la derecha demuestra el efecto de la rHsp70 (verde) sobre el volumen del compartimento lisosómico (rojo) en fibroblastos de NPDA. La flechas blancas indican células con rHsp70 endocitada y compartimento lisosómico reducido. Los valores representan la media ± DE para 3 experimentos independientes. Barras de escala = 20 μm. NT = no tratadas.

Figura 9

35 Localización conjunta de rHsp70-AF488 endocitada con lisosomas. Imágenes confocales representativas de células U-2-OS incubadas con 300 nM de rHsp70-AF488 (verde) durante 24 h, fijadas y teñidas para detectar los siguientes marcadores de orgánulos (rojo): proteína de membrana asociada a lisosomas 1 (LAMP-1; lisosomas), LAMP-2 (lisosomas), LBPA/BMP (6C4; compartimento endolisosómico), cyt c (mitocondrias), SERCA (RE) y golgina-97 (Golgi). Barras de escala: 20 μm (LAMP-1, LAMP-2 y BMP) o 10 μm (Cyt c, SERCA y Golgina-97).

40 Figura 10

Interacción de rASM (aSMasa recombinante) y BMP en presencia de rHsp70. (a) Interacción de rASM con liposomas aniónicos inmovilizados (el diámetro promedio es de 100 nm, la concentración total de lípidos es de 0,1 mM y la composición: 10 % en moles de esfingomielina, 50 % en moles de fosfatidilcolina, 20 % en moles de colesterol y 20 % en moles de BMP) a pH 4,5. Las señales de respuesta medidas después de la unión a los liposomas se

45 definieron como cero. (b) El efecto de la rHsp70 pre-unida sobre la unión posterior de rASM. Las cantidades indicadas de rHsp70 se incubaron con liposomas aniónicos inmovilizados de forma idéntica a la de (a). Después de una fase de disociación de la rHsp70 de 10 min, se añadió rASM 200 nM durante 180 s seguido por 10 min de disociación.

Figura 11

50 Efecto del inductor de Hsp70 de moléculas pequeñas; Alcohol bencílico sobre fibroblastos de pacientes con Niemann-Pick de tipo A (NPDA). (A) Inducción de la Hsp70 en NPDA de Götz por alcohol bencílico de manera dependiente de la dosis (expresión de proteína). (B) Estabilidad incrementada de lisosomas de NPDA de Götz después del tratamiento de las células de NPDA de Götz con alcohol bencílico 40 mM. (C) Patología reducida en células de NPDA de Götz después del tratamiento con alcohol bencílico 40 mM, medida por área de sección

55 transversal lisosómica (procedimiento más detallado en el ejemplo 2).

Figura 12

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quinasas induce la acumulación de p53, que puede actuar después como un factor de transcripción, dando lugar a una transcripción potenciada de genes pro-apoptósicos tales como Bax, Noxa y PUMA, todos los cuales pueden inducir la MOMP. A nivel mitocondrial, el p53 induce la expresión de enzimas mitocondriales que generan ROS localmente, así como una proteína de la matriz mitocondrial (p53AIP1), cuya sobreexpresión provoca la pérdida de

5 potencial de la membrana mitocondrial y la apoptosis.

La inducción de la MOMP por p53 o por la acción de los estímulos intrínsecos descritos anteriormente es el punto en el que convergen las rutas intrínseca y extrínseca, siguiendo la vía de la ruta intrínseca a la ya descrita para la extrínseca con la liberación del citocromo c, constituyendo la formación del apoptosoma y la activación de la caspasa 3 las etapas finales hacia la muerte de la célula no deseada.

10 Las alternativas a la apoptosis

Durante la última década, se ha cuestionado el papel exclusivo de las caspasas como ejecutoras de la PCD y cada vez más pruebas indican que la vida (y especialmente la muerte) de una célula depende de más factores de los que pueden atribuirse a las caspasas solas.

Dado que los nuevos inhibidores farmacológicos específicos de caspasa de reciente desarrollo, así como la

15 inactivación de las rutas de caspasas por factores tales como la disminución de energía, el estrés nitrativo/oxidativo y miembros de la familia de la proteína inhibidora de la apoptosis (IAP) no siempre detenían la progresión hacia la muerte, revelaron, o incluso potenciaron, un subconjunto de programas de muerte independientes de caspasa subyacentes. Estos programas incluyen rutas iniciadas por receptor de muerte, así como rutas activadas por fármacos contra el cáncer, privación de factores de crecimiento, estauroesporina, proteínas relacionadas con Bax y

20 disminución de Hsp70. Frecuentemente, las características morfológicas de estos programas de muerte independientes de caspasa son reminiscentes de las observadas para la apoptosis clásica, y el respaldo experimental de un papel para otras proteasas tales como las catepsinas, las calpaínas y las serina proteasas como cofactores esenciales anteriores o posteriores a las caspasas creció rápidamente. El argumento se ve reforzado por los hallazgos de que muchas proteasas no caspasas pueden escindir al menos parte de los sustratos de caspasas

25 clásicos, lo que podría explicar algunas de las similitudes observadas entre los programas de muerte dependientes de caspasa e independientes de caspasa.

Aunque podría discutirse la importancia de tales programas de muerte, ya que están enmascarados por la eficacia de las caspasas, se están reuniendo pruebas de un papel conservado evolutivamente para las proteasas catepsinas lisosómicas en los programas de muerte celular iniciados como respuesta frente a diversos estímulos tales como

30 receptores de muerte de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral, hipoxia, estrés oxidativo, estrés osmótico, calor y fármacos anticancerosos.

Implicación lisosómica en la muerte celular programada

Aunque el papel de los lisosomas y sus hidrolasas en fase de limpieza de la PCD, es decir, que las células vecinas o fagocitos engullan las células y cuerpos apoptósicos, está bien establecido, ha llevado mucho tiempo reconocer la 35 importancia de los lisosomas y las hidrolasas lisosómicas en los acontecimientos más inmediatos de la PCD. Uno de los motivos para este retraso puede ser el hecho de que los inhibidores peptídicos de metilcetona usados comúnmente para evaluar el papel de las caspasas en la PCD (p. ej., zVAD-fmk, Ac-DEVD-fmk, Boc-D-fmk, etc.) también inhiben otras cisteína proteasas, incluidas varias cisteína catepsinas. Incluso nueve años después del reconocimiento de esta reacción cruzada, los efectos protectores con estos inhibidores a concentraciones capaces 40 de inhibir proteasas no caspasas todavía se interpretan frecuentemente como una prueba de las rutas de muerte mediadas por caspasas y, por tanto, el papel de otras rutas cisteína proteasas en la PCD continúa infravalorado. El descubrimiento de la PCD lisosómica puede haberse retrasado adicionalmente, porque la ultraestructura lisosómica aparece intacta en células apoptósicas analizadas por microscopía electrónica. Por tanto, la ruptura lisosómica se ha considerado hasta hace poco como un cambio de todo o nada durante etapas tardías de la muerte celular necrótica

45 incontrolada y la autolisis tisular. Sin embargo, nuevas técnicas que permiten una evaluación más precisa de la integridad de la membrana lisosómica han revelado que los lisosomas con ultraestructura normal pueden haber perdido parte de sus enzimas, y que esa permeabilización parcial de la membrana lisosómica (LMP) no solo se produce temprano en muchos paradigmas de muerte, sino que, de hecho, puede desencadenar la apoptosis y la PCD de tipo apoptosis.

50 Permeabilización de la membrana lisosómica (LPM) y sus consecuencias

Estudios con diversos componentes que se dirigen directamente a la integridad de las membranas lisosómicas, tales como H2O2, L-leucil-L-leucina metil éster, estrés osmótico, esfingosina, los antibióticos lisosomotrópicos norfloxacino y ciprofloxacino y el daño lisosómico fotooxidativo (fotólisis), han demostrado de forma convincente que la permeabilización lisosómica moderada puede dar como resultado la PCD. Se ha apuntado a una relación 55 cuantitativa entre la cantidad de ruptura lisosómica y la modalidad de muerte celular para explicar las consecuencias morfológicas ampliamente diferentes posteriores a la LMP. De acuerdo con este modelo, intensidades de estrés bajas desencadenan una liberación limitada de contenido lisosómico al citoplasma seguida de apoptosis o muerte celular de tipo apoptosis, mientras que estreses más altos conducen a una rotura lisosómica generalizada y una

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cisteína catepsinas median la micronucleación y la muerte celular de una manera dependiente de caspasa. En líneas celulares humanas de carcinoma tratadas con TNF, la LMP se produce después de la permeabilización de la membrana mitocondrial externa. Sin embargo, la inhibición de la actividad o la expresión de la cisteína catepsina confiere una protección significativa frente a la muerte celular inducida por TNF sin inhibir significativamente la 5 activación de la caspasa efectora. Además, la caspasa B es responsable de los cambios de tipo apoptosis, tales como la condensación de la cromatina, la exposición de la fosfatidilserina y la aparición de burbujas en la membrana plasmática, en ausencia de actividad caspasa en células de fibrosarcoma WEHI-S murinas tratadas con TNF. Además, la disminución de la proteína de choque térmico 70 (Hsp70) en diversas líneas celulares de cáncer humanas, así como la activación supraóptima de los linfocitos T, desencadena la LMP y la PCD de tipo apoptosis mediada por catepsinas sin la activación de la ruta apoptósica intrínseca. En consonancia con estos datos, la catepsina B puede inducir la apoptosis nuclear en núcleos aislados. Por tanto, parece que las catepsinas tienen la capacidad de actuar como iniciadores y también como proteasas efectoras de muerte celular programada, dependiendo del estímulo y del contexto celular. Especialmente su capacidad para mediar la PCD en células cancerosas, donde la ruta de muerte mitocondrial está bloqueada, por ejemplo, debido a la sobreexpresión de Bcl-2,

15 aumenta las esperanzas de que los tratamientos que inducen la LMP puedan resultar eficaces para el tratamiento de cánceres que son resistentes a inductores de la apoptosis clásica. Esta idea queda respaldada adicionalmente por datos que muestran que la inmortalización y la transformación pueden sensibilizar a las células frente a la muerte celular lisosómica.

Señalización para la LMP

Como se describe anteriormente, la LMP seguida de la liberación del contenido lisosómico, especialmente catepsinas, al citosol se considera la etapa de activación clave de la ruta de muerte lisosómica. Sin embargo, las rutas de señalización que dan lugar a la LMP todavía están empezando a emerger. Uno de los mecanismos mejor estudiados es la señalización del receptor del factor de necrosis tumoral 1, aunque la elucidación de esta ruta de señalización para la LMP se ha complicado en gran medida por respuestas ampliamente diferentes en diferentes

25 células objetivo.

En resumen, el TNF puede inducir LMP dependiente o independiente de caspasa, en función del contexto celular. Además, los ligandos relacionados con TNF FasL, TRAIL y TWEAK también se han asociado con la PCD independiente de caspasa con morfología apoptósica o necrótica. Estudios farmacológicos y genéticos indican que la ruta mediada por caspasas que conduce desde el TNF hasta la LMP depende de las caspasas 8 y 9, aunque la activación de la caspasa 9 difiere ampliamente entre células humanas y murinas. El vínculo entre las caspasas y la LMP se desconoce aún y, aunque se ha sugerido que la escisión de Bid mediada por la caspasa 8 inducida por TNF podría contribuir a las LMP, estos hallazgos no pudieron comprobarse por LMP inducida por TNF en MEF deficientes en Bid. Además, se ha sugerido que Bid es un objetivo de las catepsinas en rutas de muerte lisosómicas que implican a Bid después, en lugar de antes, de la LMP.

35 El TNF también estimula la disociación de la esfingomielina en fosforilcolina y ceramida mediante la activación de la esfingomielinasa neutra (SMasa) en la membrana plasmática o de la SMasa ácida o acídica (aSMasa) en el compartimento lisosómico. Ambos acontecimientos se han implicado en las rutas de muerte celular inducida por TNF, pero hasta ahora solo se ha relacionado la SMasa neutra con la LMP a través del factor asociado a SMasa neutra (FAN). Estudios basados en iMEF deficientes en FAN, así como en fibroblastos humanos que expresan una forma negativa dominante de FAN, han mostrado que FAN no solo media la producción de ceramida mediada por TNF, sino que también contribuye al procesamiento de la caspasa 8 y a la muerte celular. Dado que la LMP inducida por TNF en hepatocitos murinos depende de la caspasa 8, su procesamiento reducido puede explicar la LMP reducida en hepatocitos tratados con TNF que expresan FAN negativo dominante. Sin embargo, el papel de la ceramida y sus metabolitos no puede descartarse. Su papel en la señalización de muerte inducida por TNF está

45 respaldado por la hepatotocixidad reducida inducida por TNF y Fas en ratones deficientes en aSMasa, que se activa después de la caspasa 8. Especialmente, la esfingosina que se genera a partir de ceramida en una reacción catalizada por la enzima lisosómica ceramidasa ácida es un candidato tentador, ya que, al contrario que la ceramida, puede actuar como detergente, desestabilizando directamente la membrana lisosómica. Además de incrementar la generación del precursor de la esfingosina, la ceramida, mediante la activación de las SMasas, el TNF también regula los niveles de esfingosina mediante regulación por disminución mediada por la catepsina B de la esfingosina quinasa 1, una enzima que convierte la esfingosina proapoptósica en una esfingosina-1-fosfato antiapoptósica. Esta actividad de la catepsina B podría dar como resultado la acumulación de esfingosina en los lisosomas y, por tanto, puede explicar, al menos parcialmente, la necesidad de catepsina B para una LMP eficaz en hepatocitos tratados con TNF.

55 El TNF también puede desencadenar la LMP y la muerte celular en presencia de inhibidores de caspasa. Esta ruta es independiente de la caspasa 9, pero requiere la proteína de interacción con el receptor 1 (RIP-1) que contiene un dominio de muerte e implica la generación de especies reactivas de oxígeno. El estrés oxidativo, junto con el hierro intralisosómico, puede generar radicales de oxígeno a través de una química de tipo Fenton y, de este modo, puede provocar la oxidación de los lípidos de la membrana lisosómica, dando como resultado la desestabilización de la membrana y la liberación del contenido lisosómico. Sin embargo, siguen sin conocerse los vínculos moleculares entre RIP-1, el estrés oxidativo y la LMP.

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siendo la proteína de 641 aminoácidos (aa) homóloga al 90 % con HspA1A. El gen hspA2 se aisló por primera vez a partir de una colección genómica de ratón y después se ha demostrado que se expresa de forma constitutiva, aunque en niveles bajos, en diversos tejidos del cuerpo humano, incluidos músculo esquelético, ovario, intestino delgado, colon, cerebro, placenta y riñones, pero se expresa altamente en testículos. Su expresión, o más bien la

5 falta de ella, se ha relacionado con la espermatogénesis humana anómala y los ratones macho hspA2(-/-) son estériles. El gen se sitúa en el cromosoma 14, dando lugar a una proteína de 639 aa con una homología del 84 % con Hspa1 A, aunque la situación exacta es objeto de debate, ya que dos artículos han presentado diferentes posiciones de locus: 14q24.1 frente a 14q22.

HspA6 y HspA7

10 Los genes hspA6 y hspA7 son miembros de la familia Hsp70 inducibles por calor sin homólogos aparentes en ratones. Contienen HSE en sus sitios de promotor y los genes no tienen intrones. Si sitúan juntos en el cromosoma 1 y son un 94 % homólogos entre sí en la secuencia de nucleótidos. Sin embargo, solo la HspA6 es funcional, ya que el gen hspA7 alberga una inserción de nucleótido individual que genera un codón de detención prematuro en +1324. La proteína HspA6 tiene 643 aa de largo y muestra una homología del 77 % con Hspa1 A y HspA1 B.

15 HspA5 y HspA9

Los genes hspA5 y hspA9 son los dos miembros de la familia Hsp70 específicos de compartimento. La proteína Hspa5 de 655 aa se sitúa en el retículo endoplásmico (RE) y facilita el plegamiento y el transporte de proteínas recién sintetizadas en este compartimento. La proteína en un 64 % homóloga a la Hspa1 A, situándose el gen en 9q34. La proteína HspA9 de 679 aa se sitúa en la mitocondria, donde ayuda al plegamiento de las proteínas

20 después de su transporte a través de la membrana mitocondrial. HspA9 se sitúa en 5q31.1, siendo la proteína a un 52 % homóloga a HspA1 A.

HspA8

El miembro análogo de Hsp70 conocido como Hsc70 está codificado por un gen llamado hspA8 en 11q24, dando lugar a una proteína de 646 aa con una homología del 86 % con HspA1A, y se expresa de forma constitutiva en

25 todos los tejidos y líneas celulares. La proteína es análoga a Hsp70 en sus funciones celulares, proporcionando el acompañamiento necesario en circunstancias normales, pero también se le ha atribuido un papel en la retirada del recubrimiento en vesículas recubiertas de clatrina, así como en la autofagia mediada por chaperonas.

HspA3 y HspA4

Estos no se analizarán aquí, ya que existen dudas sobre si HSPA3 existe realmente y dado que lo más probable es

30 que HSP4 sea un miembro de la familia Hsp110 y no se sabe nada sobre ello hasta el momento, excepto su situación en el cromosoma, en 5q31.1-2.

Locus

Nombre usado en el presente documento, Gen/Proteína Posición % de homología de aa con HSPA1A Nombres alternativos

HSPA1A

hspA1A/HspA1A (Hsp70) 6p23.1 100 Hsp70; Hsp72; Hsp70-1

HSPA1B

hspA1B/HspA1B (Hsp70) 6p23.1 99 Hsp70; Hsp72; Hsp70-2

HSPA1L

hspA1L/HspA1L 6p23.1 90 Hsp70-Hom; Hsp70t

HSPA2

hspA2/HspA2 14q24.1 84 Hsp70-3

HSPA4

hspA4/HspA4 5q31.1 31 Hsp70RY; APG-2

HSPA5

hspA5/HspA5 9q34 64 BiP; GRP78

HSPA6

hspA6/HspA6 1q 84 Hsp70-6; Hsp70B'

HSPA7

hspA7/HspA7 1q - Hsp70-7; Hsp70B

HSPA8

hspA8/HspA8 (Hcs70) 11q24 86 Hsc70; Hsp73

HSPA9

hspA9/HspA9 5q31.1 52 GRP75; PBP74; mtHsp75; mortalina; mot-2

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