ES2532117T3 - Preparación de ácidos nucleicos - Google Patents

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Abstract

Método de preparación de ácidos nucleicos a partir de un ácido nucleico molde en el que se somete una muestra a ciclos térmicos, que comprende las etapas: a) someter una primera cantidad de dicha muestra en una primera cámara de amplificación a un primer número de ciclos térmicos para prepara una primera cantidad e una primera mezclad e reacción, y b) someter una cantidad parcial de dicha primera mezcla de reacción en una segunda cámara de amplificación a un segundo número de ciclos térmicos para preparar una segunda cantidad de una segunda mezcla de reacción, en el que el volumen de dicha segunda cámara de amplificación es inferior al volumen de dicha primera cámara de amplificación.

Description

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E05024993
05-03-2015
Debido a que sólo se utiliza una cantidad parcial de la primera mezcla de reacción para preparar la segunda mezcla de reacción, en principio pueden derivarse múltiples segundas mezclas de reacción a partir de la primera mezcla de reacción. Ello permite someter más que una cantidad parcial de la primera mezcla de reacción a un segundo númerode ciclos térmicos y por lo tanto permite un protocolo de reacción múltiplex. Éste puede ser, en el caso más simple, una reacción paralela de la misma mezcla que satisfaga los resultados obtenidos en el presente método. En el caso de que se añadan diferentes cebadores y/o sondas a la cantidad parcial de la primera mezcla de reacción, resulta posible un método de detección múltiplex real, por ejemplo para detectar diferentes alelos de una diana.
Un posible dispositivo para los métodos de la presente invención se describe en el Ejemplo 3. Tal como ya se ha comentado anteriormente, el método de la presente invención no se encuentra limitado a determinados dispositivos. Puede llevarse a cabo manualmente utilizando termocicladores disponibles comercialmente, tales como el sistema Applied Biosystems 9700 y el LightCycler (Roche Diagnostics). Sin embargo, el presente método resulta especialmente adecuado para dispositivos funcionalmente integrados basados en tecnologías tales como las descritas en, por ejemplo, Micro Total Analysis Systems, Proceedings u TAS'94, A van den Berg, P. Berveld, 1994; Integrated Microfabricated Biodevices, M.J. Heller, A. Guttman, 2002; Microsystem Engineering of Lab-on-a-Chip devices, O. Geschke, H. Klank, P. Tellemann, 2004; y los documentos nº US2003/0152492 y nº US 5.639.423. Dichos dispositivos habitualmente presentan un transporte de líquidos automatizado, que permite el transporte de una muestra entre cámaras de reacción, medios para el termociclado, reactivos que se precargan en el dispositivo o que pueden añadirse automáticamente, y medios para detectar el producto de reacción. La reacción está controlada por medios informáticos y un programa informático de control.
Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención es un dispositivo diagnóstico para preparar ácidos nucleicos a partir de un molde, que comprende:
-
una primera cámara de amplificación, y
-
una segunda cámara de amplificación,
-
medios para calentar y enfriar las cámaras,
-
medios para controlar la temperatura de los ciclos de amplificación durante los ciclos térmicos, en el que el volumen de dicha segunda cámara de amplificación es inferior al volumen de dicha primera cámara de amplificación. La velocidad de calentamiento y enfriamiento integral preferentemente es de por lo menos 2 Kelvin/segundo (K/s) en la etapa a) y superior en la etapa b), preferentemente de por lo menos 5 K/s.
El menor volumen de la segunda cámara de amplificación permite reducir el tiempo necesario para cada ciclo térmico. En los termocicladores convencionales como el PCR System 9700 (Applied Biosystems), el volumen de las cámaras de amplificación no se modificada y, además, con frecuencia se utilizan bloques metálicos para el termociclado, lo que no permite reducir el tiempo necesario para un ciclo térmico a menos de unos cuantos minutos. Por lo tanto, extraer una alícuota de una reacción de amplificación y utilizar un termociclador más rápido como el LightCycler durante una segunda reacción de amplificación permite reducir el tiempo de reacción total sin reducir la sensibilidad del ensayo.
Las cámaras de amplificación adecuadas para un dispositivo diagnóstico de la presente invención son básicamente conocidas de la técnica anterior. Estas cámaras proporcionan espacio para contener la mezcla de reacción. Esta cámara puede ser, por ejemplo, un tubo de plástico de paredes delgadas que se inserta en un orificio perforado en el bloque metálico de un termociclador tal como el instrumento 9700er de Perkin Elmer o el volumen interior del capilar de vidrio que puede introducirse en el instrumento LightCycler. El volumen de la cámara de amplificación está definido por el volumen máximo de una mezcla de reacción que puede utilizarse en la reacción.
Las mezclas de reacción pueden calentarse mediante la utilización de, por ejemplo, elementos calefactores como los elementos calefactores Peltier o de resistencia. Para el enfriamiento pueden utilizarse elementos refrigeradores activos o elementos refrigeradores pasivos tales como sumideros de calor. Para conducir el calor y frío a la mezcla de reacción contenida en la cámara de amplificación se conocen varios medios. En muchos termocicladores convencionales se utilizan bloques metálicos que contienen las cámaras de amplificación para proporcionar calor y frío a la mezcla de reacción. En el formato LightCycler, un flujo de aire caliente que flota en torno al capilar de vidrio proporciona esta función.
El dispositivo diagnóstico de la presente invención presenta por lo menos dos cámaras de amplificación tal como se ha indicado anteriormente. Estas cámaras pueden situarse en un instrumento o separarse en dos instrumentos diferentes, de manera que la transferencia de una alícuota de la primera mezcla de reacción a la segunda cámara de amplificación puede llevarse a cabo mediante pipeteado manual o, preferentemente, automatizarse. El aparato según la invención presenta un receptáculo para contener el dispositivo. Comprende además medios que calientan y enfrían las cámaras y además para controlar la temperatura de los ciclos de amplificación durante los ciclos térmicos, preferentemente una unidad de control con un programa informático cargado tal como se indica posteriormente.
Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención es un programa informático para controlar un método para la preparación de ácidos nucleicos a partir de un ácido nucleico molde utilizando ciclos térmicos, caracterizado 7
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Claims (1)

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