ES2532600T3 - Polipéptidos de hormona de crecimiento modificada - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico representada en el SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO:23, caracterizada por que dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad antagónica del receptor de la hormona de crecimiento.

Description

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DESCRIPCIÓN

Polipéptidos de hormona de crecimiento modificada

La invención se refiere a proteínas de fusión de hormona de crecimiento modificada y a dímeros que comprenden dichas proteínas de fusión; a moléculas de ácido nucleico que codifican dichas proteínas y a métodos de tratamiento 5 que utilizan dichas proteínas.

La hormona de crecimiento (GH) es una hormona anabólica de citoquina importante para el crecimiento lineal en la infancia y la composición corporal normal en adultos. La regulación de la actividad de la GH es compleja e implica numerosos agonistas y antagonistas polipeptídicos y peptídicos interaccionantes. La GH puede mediar sus efectos o bien directamente mediante la unión al receptor de la hormona de crecimiento o bien indirectamente estimulando la 10 producción de Factor de crecimiento de tipo insulínico 1 (IGF-1). Un papel principal de la GH es por lo tanto la estimulación del hígado para producir IGF-1. Además, la secreción de GH está controlada por dos hormonas peptídicas con actividades opuestas. La hormona liberadora de hormona de crecimiento (GHRH) es un péptido de 44 aminoácidos producido por el núcleo arcuato del hipotálamo. Funciona estimulando la producción de GH por la glándula pituitaria anterior. La somatostatina es una hormona peptídica que se opone a los efectos de GHRH y es

15 procesada a partir de un pre-propéptido más grande a una forma de 14 y 28 aminoácidos. La somatostatina es secretada por células neuroendocrinas del núcleo periventricular del hipotálamo al sistema portal hipotálamohipofisario que conecta con la glándula pituitaria anterior donde inhibe la secreción de GH.

La GH se une sucesivamente con dos receptores de hormona de crecimiento unidos a la membrana (GHR) a través de dos sitios separados sobre la GH referidos como sitio 1 y sitio 2. El sitio 1 es un sitio de unión de alta afinidad y el 20 sitio 2 es un sitio de baja afinidad. Una única molécula de GH se une a 1 GHR a través del sitio 1. Un segundo GHR es reclutado a continuación a través del sitio 2 para formar un complejo GHR:GH:GHR. El complejo es internalizado a continuación y activa una cascada de transducción de la señal que conduce a cambios en la expresión génica. El dominio extracelular de GHR existe en forma de dos dominios conectados cada uno de aproximadamente 100 aminoácidos (SD-100), siendo el dominio SD-100 C-terminal (b) el más próximo a la superficie celular y estando el

25 dominio SD-100 N-terminal (a) más alejado. Es un cambio conformacional en estos dos dominios el que se produce durante la unión de la hormona con la formación del complejo trimérico GHR-GH-GHR.

El exceso de GH está asociado con numerosos estados de enfermedad; por ejemplo la acromegalia y el gigantismo pituitario. La mayor parte de los casos de exceso de GH resulta de un tumor de la pituitaria en las células somatotrofas de la glándula pituitaria anterior. Estos tumores son benignos y aumentan gradualmente la secreción 30 de GH. Los síntomas de exceso de hormona de crecimiento incluyen el engrosamiento de los huesos de la mandíbula, los dedos de las manos y los dedos de los pies, la presión sobre los nervios/músculos y la resistencia a la insulina. El tratamiento original para el exceso de GH relacionado con un tumor es la eliminación quirúrgica del tumor de la pituitaria. Recientemente, el uso de antagonistas de GH para inhibir la señalización de GH se está volviendo el tratamiento preferido debido a su naturaleza no invasiva. Los antagonistas de GH pueden ser o bien

35 formas recombinantes de somatostatina o bien análogos de somatostatina (p. ej., octreótido, lanreotido) o bien GH modificada.

Se proporciona una revisión de los antagonistas de GH modificada en Kopchick (2003) European Journal of Endocrinology 148; S21-25 que describe un antagonista de GH disponible en el mercado denominado pegvisomant que combina una modificación de GH humana en G120 con la adición de polietilenglicol para incrementar el peso 40 molecular de la GH modificada. Un problema asociado con la administración de hormona de crecimiento es su rápido aclaramiento mediante filtración renal y/o proteolisis. La adición de polietilenglicol reduce esta pérdida. Sin embargo, se sabe que el polietilenglicol reduce la afinidad de GH por GHR y por lo tanto para compensar esta reducción de la afinidad es necesario administrar cantidades elevadas de GH modificada. Esto puede dar como resultado efectos secundarios. Sería deseable proporcionar un antagonista de GH modificada que pueda ser 45 administrado a una dosificación reducida evitando de ese modo los problemas asociados con el pegvisomant. Esto puede ser una reducción o bien de la cantidad administrada o bien una reducción en la frecuencia de administración.

En la solicitud co-pendiente de los autores de la presente invención WO03/070765, los autores de la presente invención describen proteínas de fusión de GH modificada que incluyen modificaciones en el sitio 1 y el sitio 2 de GH. Estas moléculas de GH modificada se fusionan a un dominio extracelular de GHR. Los autores de la presente 50 invención describen en la presente memoria proteínas de fusión de GH modificada que tienen una vida media en suero considerablemente prolongada y forman dímeros que pueden estar relacionados con la farmacocinética mejorada de estas proteínas de fusión o bien reduciendo su aclaramiento renal o bien protegiendo la GH modificada de la proteolisis. Los perfiles farmacocinéticos mejorados de estas proteínas de fusión de hormona de crecimiento permitirán regímenes de tratamiento que no requieran administraciones múltiples y reduzcan los efectos secundarios

55 no deseados.

De acuerdo con un aspecto de la invención se proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico representada en el SEQ ID NO: 22 o una secuencia de ácido nucleico representada en el SEQ ID NO: 23 caracterizadas porque dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad antagónica del receptor de la hormona de crecimiento.

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De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre una secuencia de aminoácidos representada en el SEQ ID NO: 24 o una secuencia de aminoácidos representada en el SEQ ID NO: 32, en donde dicho polipéptido tiene actividad antagónica del receptor de la hormona de crecimiento.

5 De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona un homodímero que comprende dos polipéptidos que comprenden o consisten en el SEQ ID NO: 24.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona un homodímero que comprende dos polipéptidos que comprenden o consisten en el SEQ ID NO: 32.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona un vector que comprende una molécula de 10 ácido nucleico de acuerdo con la invención.

En una realización preferida de la invención dicho vector es un vector de expresión adaptado para expresar la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

No es necesario que un vector que incluye uno o varios ácidos nucleicos de acuerdo con la invención incluya un promotor u otra secuencia reguladora, concretamente si el vector se va a utilizar para introducir el ácido nucleico en 15 células para la recombinación en el genoma para su transfección estable. Preferiblemente, el ácido nucleico del vector está conectado operablemente a un promotor apropiado u otros elementos reguladores para la transcripción en una célula anfitriona. El vector puede ser un vector de expresión bifuncional que funciona en múltiples anfitriones. Por "promotor" se quiere significar una secuencia de nucleótidos aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción y que contiene todas las regiones reguladoras requeridas para la transcripción. Los promotores adecuados incluyen

20 promotores constitutivos, específicos de tejidos, inducibles, de desarrollo u otros para la expresión en células eucarióticas o procarióticas. "Conectado operablemente" significa unido como parte de la misma molécula de ácido nucleico, situado y orientado adecuadamente para el inicio de la transcripción a partir del promotor. Un ADN conectado operablemente a un promotor "está bajo la regulación del inicio de la transcripción" del promotor.

En una realización preferida el promotor es un promotor constitutivo, inducible o regulable.

25 De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona una célula transfectada o transformada con una molécula de ácido nucleico o vector de acuerdo con la invención.

Preferiblemente dicha célula es una célula eucariótica. Alternativamente dicha célula es una célula procariótica.

En una realización preferida de la invención dicha célula se selecciona del grupo que consiste en; una célula fúngica

(p. ej. Pichia spp, Saccharomyces spp, Neurospora spp); una célula de insecto (p. ej. Spodoptera spp); una célula de 30 mamífero (p. ej. célula COS, célula CHO); una célula vegetal.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con la invención que incluye un excipiente o portador.

En una realización preferida de la invención dicha composición farmacéutica se combina con un agente terapéutico adicional.

35 Cuando se administra la composición farmacéutica de la presente invención, se administra en preparaciones farmacéuticamente aceptables. Tales preparaciones pueden contener rutinariamente concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes tamponadores, conservantes, portadores compatibles, y opcionalmente otros agentes terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar mediante cualquier ruta convencional,

40 incluyendo inyección. La administración y la aplicación pueden ser, por ejemplo, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavitaria, intra-articular, subcutánea, tópica (ojos), dérmica (p. ej. un inserto soluble lipídico en crema en la piel o la membrana mucosa), transdérmica, o intranasal.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se administran en cantidades eficaces. Una "cantidad eficaz" es aquella cantidad de fármacos/composiciones que sola, o junto con dosis adicionales o fármacos sinérgicos, produce

45 la respuesta deseada. Esto puede implicar solamente ralentizar el progreso de la enfermedad temporalmente, aunque más preferiblemente, implica detener el progreso de la enfermedad de manera permanente. Esto se puede controlar mediante métodos rutinarios o se puede controlar de acuerdo con métodos de diagnóstico.

Las dosis de las composiciones farmacéuticas administradas a un sujeto se pueden seleccionar de acuerdo con diferentes parámetros, en particular de acuerdo con el modo de administración utilizado y el estado del sujeto (esto 50 es, edad, sexo). Cuando se administran, las composiciones farmacéuticas de la invención se aplican en cantidades farmacéuticamente aceptables y en composiciones farmacéuticamente aceptables. Cuando se utilizan en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente aceptables, pero se pueden utilizar convenientemente sales no farmacéuticamente aceptables para preparar sales farmacéuticamente aceptables de las mismas y no se excluyen del alcance de la invención. Tales sales farmacológicamente y farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se

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limitan a, aquellas preparadas a partir de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico, y similares. Asimismo, se pueden preparar sales farmacéuticamente aceptables en forma de sales de metales alcalinos o alcalinotérreos, tales como sales de sodio, potasio o calcio.

5 Las composiciones farmacéuticas se pueden combinar, si se desea, con un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador farmacéuticamente aceptable" según se utiliza en la presente memoria representa una o más cargas, diluyentes o sustancias de encapsulación sólidos o líquidos compatibles, que son adecuados para la administración a un ser humano. El término "portador" indica un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el cual se combina el ingrediente activo para facilitar su aplicación. Los componentes de las

10 composiciones farmacéuticas también son susceptibles de ser mezclados con las moléculas de la presente invención, y entre sí, de manera que no haya interacción que pueda deteriorar sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes tamponadores adecuados, incluyendo: ácido acético en una sal; ácido cítrico en una sal; ácido bórico en una sal; y ácido fosfórico en una sal.

15 Las composiciones farmacéuticas también puede contener, opcionalmente, conservantes adecuados, tales como: cloruro de benzalconio; clorobutanol; parabenos y timerosal.

Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar convenientemente en una forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Todos los métodos incluyen la etapa de asociar el agente activo con un portador que constituye uno o más ingredientes accesorios. En

20 general, las composiciones se preparan asociando uniformemente e íntimamente el compuesto activo con un portador líquido, un portador sólido finamente dividido, o ambos, y a continuación, si fuera necesario, conformando el producto.

Las composiciones adecuadas para la administración oral se pueden presentar en forma de unidades discretas, tales como cápsulas, comprimidos, grageas, conteniendo cada uno una cantidad previamente determinada del

25 compuesto activo. Otras composiciones incluyen suspensiones en líquidos acuosos o líquidos no acuosos tales como jarabe, elixir o una emulsión.

Las composiciones adecuadas para la administración parenteral comprenden convenientemente una preparación acuosa o no acuosa estéril que es preferiblemente isotónica con la sangre del receptor. Esta preparación se puede formular de acuerdo con métodos conocidos utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de 30 suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, en forma de solución en 1,3butanodiol. Entre los disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran agua, solución de Ringer, y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, se emplean convencionalmente aceites fijados estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin se puede emplear cualquier aceite fijado blando incluyendo mono-o

35 di-glicéridos sintéticos. Además, se pueden utilizar ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de inyectables. La formulación adecuada de portadores para administraciones oral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, etc. se puede encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona un polipéptido de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de exceso de hormona de crecimiento.

40 En un método preferido de la invención dicho polipéptido se adapta para ser administrado intravenosamente.

En un método preferido alternativo de la invención dicho polipéptido se adapta para ser administrado subcutáneamente.

En una realización preferida de la invención dicho polipéptido se administra diariamente o a intervalos de dos días; preferiblemente dicho polipéptido se administra a intervalos semanales, bisemanales o mensuales.

45 En una realización preferida de la invención dicho exceso de hormona de crecimiento da como resultado acromegalia.

En una realización preferida de la invención dicho exceso de hormona de crecimiento da como resultado gigantismo.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona un polipéptido u homodímero de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento del cáncer.

50 Según se utiliza en la presente memoria, el término "cáncer" hace referencia a células que tienen capacidad de crecimiento autónomo, esto es, un estado o afección anormales caracterizados por el crecimiento de células que proliferan rápidamente. Se pretende que el término incluya todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos transformados malignamente, con independencia del tipo histopatológico o la fase de invasividad. El término "cáncer" incluye malignidades de los diferentes sistemas de órganos, tales como aquellas que afectan, por ejemplo, al pulmón, mama, tiroides, tejido linfoide, tracto gastrointestinal, y genito-urinario, así como adenocarcinomas que incluyen malignidades tales como la mayor parte de los cánceres de colon, carcinoma de células renales, cáncer de próstata y/o tumores testiculares, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer de intestino delgado y cáncer de esófago. El término "carcinoma" es

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5 reconocido en la técnica y hace referencia a malignidades de tejidos epiteliales o endocrinos incluyendo carcinomas del sistema respiratorio, carcinomas del sistema gastrointestinal, carcinomas del sistema genitourinario, carcinomas testiculares, carcinomas de mama, carcinomas prostáticos, carcinomas del sistema endocrino, y melanomas. Los carcinomas ilustrativos incluyen aquellos que se forman a partir de tejido del cuello uterino, pulmón, próstata, mama, cabeza y cuello, colon y ovario. El término "carcinoma" también incluye carcinosarcomas, p. ej., que incluyen tumores malignos compuestos por tejidos carcinomatosos y sarcomatosos. Un "adenocarcinoma" hace referencia a un carcinoma derivado de tejido glandular o en el que las células tumorales forman estructuras glandulares reconocibles. El término "sarcoma" es reconocido en la técnica y hace referencia a tumores malignos de derivación mesenquimal.

En una realización preferida de la invención dicho cáncer es cáncer de próstata.

15 En toda la descripción y en las reivindicaciones de esta memoria descriptiva, las palabras "comprenden" y "contienen" y las variaciones de las palabras, por ejemplo "que comprende" y "comprende", representan "incluyendo pero no limitado a", y no se pretende que excluya (y no excluye) otros radicales, aditivos, componentes, números enteros o etapas.

En toda la descripción y en las reivindicaciones de esta memoria descriptiva, el singular incluye el plural a menos que el contexto lo requiera de otro modo. En particular, cuando se utiliza el artículo indefinido, se debe entender que la especificación contempla la pluralidad así como la singularidad, a menos que el contexto lo requiera de otro modo.

Se debe entender que los rasgos, números enteros, características, compuestos, radicales o grupos químicos descritos en conjunto con un aspecto, realización o ejemplo concreto de la invención son aplicables a cualquier otro aspecto, realización o ejemplo descrito en la presente memoria a menos que sea incompatible con el mismo.

25 A continuación se describirá una realización de la invención solo como ejemplo y con referencia a las siguientes figuras:

La Tabla 1 ilustra un Análisis de Bradford de Fracciones 1B8v2;

Figura 1a 1B8v0: Consiste en GH (contiene una mutación en el sitio 1) unida a GHR extracelular (dominios 1 y 2) a través de un conector G4Sx4: este constructo contiene sitios para enzimas de restricción en torno a la región conectora y en el extremo 3'; la Figura 1b es la secuencia de aminoácidos codificada;

Figura 2a 1B8v1: Esta molécula deriva de 1B8v0 pero no contiene una secuencia extraña en los extremos 5' y 3' y contiene un conector G4Sx4; la Figura 2b es la secuencia de aminoácidos codificada;

Figura 3a 1B8v2: Esta molécula deriva de 1B8v0 pero no contiene una secuencia extraña y contiene un conector G4Sx5; la Figura 3b es la secuencia de aminoácidos codificada;

35 Figura 4a 1B8v3: Esta molécula deriva de 1B8v0 pero no contiene una secuencia extraña y no contiene conector; la Figura 4b es la secuencia de aminoácidos codificada;

Figura 5a 1B9v0: Consiste en GH (contiene mutaciones en el sitio 1 y el sitio 2) unida a GHR (dominios 1 y 2) a través de un conector G4Sx4: este constructo contiene sitios para enzimas de restricción en torno a la región conectora y en el extremo 3'; la Figura 5b es la secuencia de aminoácidos codificada;

Figura 6a 1B9v1: Esta molécula deriva de 1B9v0 pero no contiene una secuencia extraña en los extremos 5' y 3' y contiene un conector G4Sx4; la Figura 6b es la secuencia de aminoácidos codificada;

Figura 7a 1B9v2: Esta molécula deriva de 1B9v0 pero no contiene una secuencia extraña y contiene un conector G4Sx5; la Figura 7b es la secuencia de aminoácidos codificada;

Figura 8a 1B9v3: Esta molécula deriva de 1B9v0 pero no contiene una secuencia extraña y no contiene conector; la 45 Figura 8b es la secuencia de aminoácidos codificada;

La Figura 9 ilustra la estrategia de ligación básica para la subclonación de la molécula de G120R en un plásmido de expresión de mamífero;

La Figura 10 ilustra la construcción de IB9v0;

La Figura 11 ilustra un fragmento 1B8 v2: Nar1-AvrII (524 pb). La nueva región conectora se muestra en negrita, con el sitio para la enzima de restricción subrayado. Este fragmento se ligó al plásmido pGHsecTag-1B8v1 para producir el plásmido, pGHsecTag-1B8v2;

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La Figura 13 muestra una transferencia Western utilizando un anticuerpo específico para GH para detectar la

5 expresión tanto de 1B8v2 (calles 1 y 2) como de 1B9v2 (calle 3) a partir del medio de cultivo celular de una línea celular CHO Flp-In. Las muestras son del tamaño correcto esperado para cada proteína (∼75 kDa) y no muestran signos de degradación;

La Figura 14 ilustra que en presencia (+) de rhGH 0,5 nM, las muestras de medio de líneas celulares estables tanto 1B8v2 como 1B9v2 son capaces de ejercer antagonismo sobre las acciones de rhGH. En ausencia (-) de GH 0,5 nM

10 ninguna de las molécula muestra bioactividad. Se muestra la curva patrón para GH (0 -5 nM);

La Figura 15a muestra el análisis SDS-PAGE de fracciones de proteína purificada por medio de tinción de Coomassie. La imagen demuestra que la proteína purificada (IB8v2) tiene el tamaño correcto esperado (∼75 kDa) y que no son visibles productos degradados de peso molecular inferior; la Figura 15b muestra el análisis SDS-PAGE de IB9v2;

15 Figura 16a Después de la administración SC de 1B8 los niveles de proteína en suero alcanzan el máximo a las 24 hrs de la inyección. 1B8 todavía se puede detectar a los 10 días de la administración; Figura 16b Después de la administración IV los niveles de proteína en suero de 1B8 alcanzan un máximo 1 hora después de la inyección y después caen drásticamente;

Figura 17a Transferencia Western de muestras de PAGE-Nativa: 1; fusión GH nativa 1B7v0, 2: GH nativa 1B7v1, 3:

20 GH nativa 1B7v2, 4: GH nativa 1B7v3, 5: fusión GH modificada 1B8. Todas las muestras muestran una doble banda distinta, característica de una formación de monómero y dímero; Figura 17b el gel teñido con Coomassie equivalente que ilustra la formación de dímero;

La Figura 18 ilustra el % de ganancia de peso en conejos blancos NZ a lo largo de 12 días comparando 5 dosis de pegvisomant administradas con dosis individuales de IB8 e IB9; y

25 La Figura 19 ilustra PK de IB8 en conejos blancos NZ a lo largo de 250 horas.

Materiales y Métodos

Construcción de la molécula antagonista 1B8

La molécula ha sido construida para mutar el aminoácido glicina 120 a arginina en el sitio 2 (sitio de baja afinidad) de la molécula de GH (G120R). La unión de la molécula de GH al receptor de GH a través del sitio 1 de alta afinidad no

30 resulta afectada, sin embargo la unión al receptor a través del sitio 2 de GH resulta inhibida por el grupo lateral voluminoso de la molécula de arginina.

Previamente se había empleado una estrategia de PCR para generar una molécula de GH que contuviera la mutación G120R y mediante el uso de sitios de restricción adecuados permitiera la clonación de esta molécula en el plásmido de expresión pTrc-His para producir el clon pTrc-His-1A7 (G120R conectado al dominio B extracelular de

35 GHR).

A continuación se separó por corte de este vector un fragmento Bsu36I-Not 1 de 300 pb y se ligó en el plásmido de expresión de mamífero pGHsecTag-1B7 (GH unida a los dominios extracelulares A y B de GHR) para producir pGHsecTag-1B8 (la expresión secretada es dirigida por la señal de secreción de GH). Véase la Figura 9

Construcción de la molécula antagonista 1B9v0

40 La molécula ha sido construida para mutar los aminoácidos tanto en el sitio 1 como en el 2 de la molécula de GH. La unión de la molécula de GH al receptor de GH a través del sitio de afinidad elevada 1 es potenciada por estas mutaciones, mientras la unión al receptor a través del sitio 2 de GH es inhibida por un único cambio de glicina a arginina.

Se empleó una estrategia de mutación dirigida al sitio de ADN de hebra sencilla para generar una molécula de GH

45 que contuviera mutaciones tanto en el sitio 1 como en el sitio 2. El uso de sitios de restricción adecuados permitió la clonación de esta molécula en los plásmidos de expresión pTrc-His y pET21a (+). Utilizando la PCR, se generó un clon que contenía la secuencia señal de GH (GHss) con sitios Nhe1 y Not1 limítrofes. Este se ligó en el plásmido de expresión de mamífero pGHsecTag-1B8v0 (GH unida a los dominios extracelulares A y B de GHR) para producir pGHsecTag-1B9v0 (la expresión secretada es dirigida por la señal de secreción de GH). Véase la Figura 10.

50 Construcción de los clones variantes tanto de 1B8v0 como de 1B9v0

El plásmido pGHsecTag-1B7v3 se digirió utilizando las enzimas de restricción Hindlll-EcoRV y el fragmento ligado en los plásmidos pGHsecTag-1B8v0 y 1B9v0 para construir los plásmidos pGHsecTag-1B8v1 y 1B9v1 (estas moléculas no contienen ninguna secuencia errónea en el extremo 3 prima). La siguiente fase fue separar los sitios de restricción en torno a la región conectora para producir los plásmidos pGHseTag-1B8v2 y 1B9v2. Esto se completó utilizando la síntesis génica en la que el conector original se remplazó por un conector G4Sx5.

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Los siguientes fragmentos se construyeron mediante síntesis Génica con sitios de restricción limítrofes, Narl y AvrII y 5 se ligaron a pGHsecTag-1B8v1 o 1B9v1; véanse las Figuras 11 y 12.

Bioactividad in vitro de moléculas variantes antagonistas

La bioactividad in vitro de cada quimera se sometió a ensayo utilizando un análisis con informador luciferasa específico para GH. Esencialmente se transfectó establemente una línea celular derivada de ser humano con el receptor de GH humano y a continuación se transfectó transitoriamente con un informador de señalización de

10 luciferasa. Este análisis detecta niveles fisiológicos de GH, véase la Figura 14.

Purificación de moléculas antagonistas

Se hicieron crecer líneas celulares CHO FIp-In que expresaban tanto 1B8v2 como 1B9v2 como producto secretado en medio libre de proteína. El medio se recogió, se concentró y se clarificó antes de la purificación por afinidad. Para la purificación, se prepararon 20 ml de resina Sepharose 4 Fast Flow activada con NHS acoplada a anticuerpo

15 monoclonal 5E1 para hGH. Típicamente la muestra de medio se concentró diez veces y se diluyó 1:1 con Tampón de Unión (Tris HCl 25 mM/NaCl 150 mM, pH 7,4) antes de la purificación.

El material se cargó en la columna a una velocidad de flujo de 2 ml/min. Después del lavado, la proteína unida se hizo eluir a 1 ml/min con Glicina 200 mM, pH 2,7 seguido de neutralización con Tris HCl 1 M, pH 9,0. Las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE (véanse las Figuras 15a y 15b). Las Figuras 17a y 17b ilustran la formación de

20 dímeros de IB9 en comparación con las quimeras de hormona de crecimiento nativa.

Estudios Farmacocinéticos de IB8

A 6 ratas sanas normales se les administró una inyección de una única dosis de proteína 1 nMol (75 µg), o bien subcutánea (SC, Figura 16a) o bien intravenosa (IV, Figura 16b). A las ratas de control se les administró vehículo solamente. Las muestras se tomaron a intervalos de tiempo a lo largo del transcurso de un período de 10 días y se

25 analizaron para determinar la presencia de 1B8 utilizando un análisis Elisa para GH de la empresa.

Claims (10)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico representada en el SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO:23, caracterizada por que dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad antagónica del receptor de la hormona de crecimiento.

   5 2. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: una secuencia de aminoácidos representada en el SEQ ID NO: 24 o una secuencia de aminoácidos representada en el SEQ ID NO: 32, en donde dicho polipéptido tiene actividad antagónica del receptor de la hormona de crecimiento.

2. 3. Un homodímero que comprende dos polipéptidos que comprenden o consisten en el SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 32.

   10 4. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

3. 5.

   Una célula transfectada o transformada con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o un vector de acuerdo con la reivindicación 4.

4. 6.

   Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2, o un homodímero de acuerdo con la reivindicación 3, que incluye un excipiente o portador.

   15 7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha composición se combina con un agente terapéutico adicional.

5. 8. Un polipéptido u homodímero de acuerdo con la reivindicación 2 o 3 para su uso en el tratamiento del exceso de hormona de crecimiento.
6. 9. El polipéptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho polipéptido se administra a 20 intervalos semanales.

7. 10.

   El polipéptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho polipéptido se administra a intervalos de dos semanas.

8. 11.

   El polipéptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho polipéptido se administra a intervalos mensuales.

   25 12. El polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en donde el exceso de hormona de crecimiento es gigantismo o acromegalia.
9. 13. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 o un homodímero de acuerdo con la reivindicación 3 para su uso en el tratamiento del cáncer.
10. 14. El polipéptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el cáncer es cáncer de próstata. 30

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