ES2535412T3

ES2535412T3 - Vaccine for the prophylaxis or treatment of an airway pathology caused by an allergen

Info

Publication number: ES2535412T3
Application number: ES10715245.6T
Authority: ES
Inventors: Camille Locht; Bernard Mahon; Heather Kavanagh
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Pasteur; National University of Ireland Maynooth
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Pasteur; National University of Ireland Maynooth
Priority date: 2009-04-28
Filing date: 2010-04-26
Publication date: 2015-05-11
Anticipated expiration: 2030-04-26
Also published as: US8986709B2; EP2424564B1; US10420827B2; EP3590532A1; AU2010243708A1; US20200282041A1; US20190358309A1; US20120177688A1; US9839683B2; US20150182614A1; CA2759280A1; AU2010243708B2; US10653765B2; JP5678034B2; CA2759280C; EP2424564A1; CN102448490A; DK2424564T3; US20180085450A1; US20210361759A1

Abstract

Una vacuna viva atenuada contra Bordetella pertussis que carece de la citotoxina traqueal (TCT), la toxina pertussis (PTX) y la toxina dermonecrótica (DNT) para uso en la profilaxis o el tratamiento de una patología de las vías respiratorias originada por un alérgeno.A live attenuated vaccine against Bordetella pertussis that lacks tracheal cytotoxin (TCT), pertussis toxin (PTX) and dermonecrotic toxin (DNT) for use in the prophylaxis or treatment of an airway pathology caused by an allergen.

Description

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DESCRIPCIÓN DESCRIPTION

Vacuna para la profilaxis o el tratamiento de una patología de las vías respiratorias originada por un alérgeno Vaccine for the prophylaxis or treatment of an airway pathology caused by an allergen

Campo de la invención Field of the Invention

La presente invención se refiere a una vacuna para la profilaxis o el tratamiento de una patología de las vías respiratorias originada por un alérgeno. The present invention relates to a vaccine for the prophylaxis or treatment of an airway pathology caused by an allergen.

Antecedentes de la invención Background of the invention

La patogénesis del asma alérgica sigue sin estar clara, sin embargo, los conocimientos actuales implican la expansión de linfocitos Th2 CD4+, y un deterioro de la tolerancia a alérgenos ambientales que de otro modo son inocuos (Romagnani et al. J Allergy Clin Immunol 2004; 113(3):395-400). Una predisposición genética, junto con influencias ambientales parece que afectan a la supresión regular de respuestas mediadas por Th2. Se ha planteado la hipótesis de que anormalidades en la maduración del pulmón durante el desarrollo fetal y neonatal pueden hacer que las vías respiratorias sean más susceptibles a los alérgenos ambientales, favoreciendo una polarización hacia el fenotipo Th2 y, por lo tanto, predisponiendo al individuo a una atopía y asma. La producción de origen alérgico de IL-4, IL5 e IL-13 es típica de patologías alérgicas y la secreción de citocinas Th2 de este tipo inicia el cambio de clase de isotipo de linfocitos B a IgE, aumenta la producción de mucosidad y el reclutamiento de eosinófilos hacia las vías respiratorias. Ya que los linfocitos Th2 CD4+ representan un tipo celular de coordinación en algunas alergias, se sugirió que la inducción de respuestas neutralizantes podría impedir el desarrollo posterior de una enfermedad atópica. De acuerdo con esta modificación de la hipótesis de la higiene de Strachan (Romagnani et al. Int Arch Allergy Immunol 1992; 98(4): 279-85), una exposición microbiana puede activar las vías inmunitarias innatas que alteran las respuestas de Th1, Th2 y Treg. Esto da como resultado la supresión de la expansión de linfocitos T cooperadores Th2, y la consiguiente inhibición del cambio de isotipo a IgE. Sin embargo, varios estudios han sugerido que las infecciones víricas y bacterianas tienen un papel en el agravamiento de la enfermedad respiratoria. Por ejemplo, el virus sincitial respiratorio y la infección con Bordetella pertussis virulenta que induce Th1 (Ennis et al. Clin Exp Allergy 2004; 34(9): 1488-1497) agravan la inflamación alérgica en modelos animales. B. pertussis Gram negativa causa la tos ferina, una enfermedad respiratoria grave responsable de una morbilidad y mortalidad infantil significativas a nivel mundial. Aunque las inmunizaciones, ya sea con vacunas a base de células enteras muertas (Pe) o vacunas más recientes con subunidades acelulares (Pa) han tenido éxito, se ha informado de un resurgimiento de la enfermedad en adultos jóvenes (Das P. Lancet Infect Dis 2002; 2(6):322). Típicamente, B. pertussis no afecta de forma aguda a este grupo de edad; sin embargo, los adultos infectados pueden actuar como reservorio, y aumentar la probabilidad de que los infantes contraigan la enfermedad antes de la vacunación. La mayoría de los regímenes de vacunación actuales requieren tres dosis, comenzando a los 2 meses de edad, siendo necesarios 6 meses para tener una protección óptima. Por lo tanto, existe una necesidad de vacunas que induzcan una protección fuerte contra B. pertussis en los recién nacidos. The pathogenesis of allergic asthma remains unclear, however, current knowledge implies the expansion of Th2 CD4 + lymphocytes, and a deterioration of tolerance to environmental allergens that are otherwise harmless (Romagnani et al. J Allergy Clin Immunol 2004; 113 (3): 395-400). A genetic predisposition, together with environmental influences seems to affect the regular suppression of Th2-mediated responses. It has been hypothesized that abnormalities in the maturation of the lung during fetal and neonatal development can make the airways more susceptible to environmental allergens, favoring a polarization towards the Th2 phenotype and, therefore, predisposing the individual to Atopy and asthma. The production of allergic origin of IL-4, IL5 and IL-13 is typical of allergic pathologies and the secretion of Th2 cytokines of this type initiates the change of isotype class from B lymphocytes to IgE, increases mucus production and recruitment of eosinophils into the airways. Since Th2 CD4 + lymphocytes represent a cellular type of coordination in some allergies, it was suggested that the induction of neutralizing responses could impede the further development of atopic disease. According to this modification of the Strachan hygiene hypothesis (Romagnani et al. Int Arch Allergy Immunol 1992; 98 (4): 279-85), a microbial exposure can activate the innate immune pathways that alter Th1 responses, Th2 and Treg. This results in the suppression of the expansion of Th2 helper T lymphocytes, and the consequent inhibition of the change of isotype to IgE. However, several studies have suggested that viral and bacterial infections have a role in the aggravation of respiratory disease. For example, respiratory syncytial virus and infection with Bordetella pertussis virulent that induces Th1 (Ennis et al. Clin Exp Allergy 2004; 34 (9): 1488-1497) aggravate allergic inflammation in animal models. B. Gram negative pertussis causes pertussis, a serious respiratory disease responsible for significant infant morbidity and mortality worldwide. Although immunizations, either with vaccines based on dead whole cells (Pe) or more recent vaccines with acellular subunits (Pa) have been successful, a resurgence of the disease has been reported in young adults (Das P. Lancet Infect Dis 2002; 2 (6): 322). Typically, B. pertussis does not affect this age group acutely; however, infected adults can act as a reservoir, and increase the likelihood of infants contracting the disease before vaccination. Most current vaccination regimens require three doses, starting at 2 months of age, 6 months being necessary for optimal protection. Therefore, there is a need for vaccines that induce strong protection against B. pertussis in newborns.

Una infección con B. pertussis virulenta agrava la patología de las vías respiratorias en un modelo murino de inflamación originada por un alérgeno, a pesar de la inducción de inmunidad de tipo Th1 (Ennis et al. Clin Exp Allergy 2004; 34(9):1488-1497). Las vacunas Pa que inducen Th2 protegen contra un agravamiento del asma alérgica inducida por B. pertussis, pero inducen IL-13, tanto a nivel sistémico como local (Ennis et al. Clin Diagn Lab Immunol 2005; 12(3):409-17). Por el contrario, la inmunización sistémica con Pe que induce Th1 inhibe la capacidad de respuesta alérgica de las vías respiratorias (Mills et al. Dev Biol Stand. 1998; 95:31-41), lo que sugiere que la protección frente a una patología originada por un alérgeno no es simplemente una modulación de las respuestas Th1/Th2, sino que está asociada con el grado de lesión de las vías respiratorias en el momento del cebado, de manera que el cebado con el alérgeno a través de las vías del tracto respiratorio durante el deterioro de la unidad mesenquimática epitelial de las vías aéreas, puede ser un factor más significativo que la polarización Th1/Th2/Treg. An infection with virulent B. pertussis aggravates the pathology of the respiratory tract in a murine model of inflammation caused by an allergen, despite the induction of Th1 type immunity (Ennis et al. Clin Exp Allergy 2004; 34 (9): 1488-1497). Pa vaccines that induce Th2 protect against an aggravation of allergic asthma induced by B. pertussis, but induce IL-13, both systemically and locally (Ennis et al. Clin Diagn Lab Immunol 2005; 12 (3): 409-17 ). In contrast, systemic immunization with Pe that induces Th1 inhibits the allergic responsiveness of the respiratory tract (Mills et al. Dev Biol Stand. 1998; 95: 31-41), suggesting that protection against a pathology caused by an allergen is not simply a modulation of the Th1 / Th2 responses, but is associated with the degree of airway injury at the time of priming, so that priming with the allergen through the tract During the deterioration of the epithelial mesenchymal unit of the airways, it may be a more significant factor than Th1 / Th2 / Treg polarization.

Recientemente, se ha desarrollado una vacuna viva atenuada de forma genética contra B. pertussis, BPZE1, como una vacuna neonatal candidata contra la tos ferina (Mielcarek et al. PLoS Pathog 2006; 2(7):e65). Esta cepa de B. pertussis viva recombinante induce fuertes respuestas inmunes locales y sistémicas después de una administración intranasal. La administración a través de la vía nasal imita una infección natural y se espera que promueva una inmunidad de larga duración en niños a partir de 1 mes de edad (Mascart et al. J Immunology 2003; 170(1):1504-9). Tres factores de virulencia han sido objeto de atenuación; la toxina pertussis, la citotoxina traqueal y la toxina dermonecrótica. Con el uso de intercambio alélico, los genes que codificaban estas toxinas se delecionaron o se reemplazaron con análogos inactivados genéticamente con el fin de inducir una protección, sin la patología grave asociada con la infección de tipo silvestre. Sin embargo, no se conoce cómo influye la administración de BPZE1 sobre el cebado con un alérgeno externo y la patología inducida con alérgenos. Recently, a genetically attenuated live vaccine against B. pertussis, BPZE1, has been developed as a candidate neonatal pertussis vaccine (Mielcarek et al. PLoS Pathog 2006; 2 (7): e65). This strain of recombinant live B. pertussis induces strong local and systemic immune responses after intranasal administration. Administration through the nasal route mimics a natural infection and is expected to promote long-lasting immunity in children from 1 month of age (Mascart et al. J Immunology 2003; 170 (1): 1504-9). Three virulence factors have been attenuated; pertussis toxin, tracheal cytotoxin and dermonecrotic toxin. With the use of allelic exchange, the genes encoding these toxins were deleted or replaced with genetically inactivated analogs in order to induce protection, without the serious pathology associated with wild-type infection. However, it is not known how BPZE1 administration influences priming with an external allergen and allergen-induced pathology.

Compendio de la invención Compendium of the invention

La presente invención se refiere a una vacuna viva atenuada contra Bordetella pertussis que carece de la citotoxina traqueal (TCT), la toxina pertussis (PTX) y la toxina dermonecrótica (DNT) para la profilaxis o el tratamiento de una patología de las vías respiratorias originada por un alérgeno. The present invention relates to a live attenuated vaccine against Bordetella pertussis lacking tracheal cytotoxin (TCT), pertussis toxin (PTX) and dermonecrotic toxin (DNT) for the prophylaxis or treatment of an airway pathology for an allergen

En esta memoria se describe un método para la profilaxis o el tratamiento de una patología de las vías respiratorias This report describes a method for the prophylaxis or treatment of a pathology of the respiratory tract

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originada por un alérgeno en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de una vacuna viva atenuada contra Bordetella pertussis, en donde dicha vacuna viva atenuada contra Bordetella pertussis carece de la citotoxina traqueal (TCT), la toxina pertussis (PTX) y la toxina dermonecrótica (DNT). caused by an allergen in a subject, comprising administering to said subject an effective amount of a live attenuated vaccine against Bordetella pertussis, wherein said live attenuated vaccine against Bordetella pertussis lacks tracheal cytotoxin (TCT), pertussis toxin (PTX) and dermonecrotic toxin (DNT).

La presente invención también se refiere al uso de una vacuna viva atenuada contra Bordetella pertussis, que carece de la citotoxina traqueal (TCT), la toxina pertussis (PTX) y la toxina dermonecrótica (DNT), en la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de una patología de las vías respiratorias originada por un alérgeno. The present invention also relates to the use of a live attenuated vaccine against Bordetella pertussis, which lacks tracheal cytotoxin (TCT), pertussis toxin (PTX) and dermonecrotic toxin (DNT), in the preparation of a prophylaxis medication. or the treatment of a pathology of the respiratory tract caused by an allergen.

Descripción detallada de la invención Detailed description of the invention

Ejemplos de una patología de las vías respiratorias originada por un alérgeno son el asma alérgica, la fiebre del heno, las enfermedades pulmonares intersticiales que incluyen la fibrosis pulmonar. Examples of an airway pathology caused by an allergen are allergic asthma, hay fever, interstitial lung diseases that include pulmonary fibrosis.

Las enfermedades pulmonares intersticiales que incluyen la fibrosis pulmonar, pueden estar causadas por exposiciones ocupacionales o ambientales. Sin desear estar ligado a la teoría, una vacuna viva atenuada contra Bordetella pertussis que carece de TCT, PTX y DNT reduciría el daño de las vías respiratorias y la remodelación durante un período de exposición ambiental (al agente desencadenante de las enfermedades pulmonares intersticiales), y también protegería contra el agravamiento de la fibrosis pulmonar debido a B. pertussis virulenta. Interstitial lung diseases that include pulmonary fibrosis may be caused by occupational or environmental exposures. Without wishing to be bound by theory, a live attenuated vaccine against Bordetella pertussis that lacks TCT, PTX and DNT would reduce airway damage and remodeling during a period of environmental exposure (to the triggering agent of interstitial lung diseases), and it would also protect against the worsening of pulmonary fibrosis due to virulent B. pertussis.

Por "sujeto" se entiende un ser humano. Normalmente, el sujeto es un recién nacido, un infante o un adulto. By "subject" is meant a human being. Normally, the subject is a newborn, an infant or an adult.

Las vacunas vivas atenuadas contra Bordetella pertussis que carecen de citotoxina traqueal (TCT), toxina pertussis (PTX) y toxina dermonecrótica (DNT) se han descrito en el documento WO2007/104451 y en Mielcarek et al. (PLoS Pathog 2006; 2(7):e65). Live attenuated vaccines against Bordetella pertussis that lack tracheal cytotoxin (TCT), pertussis toxin (PTX) and dermonecrotic toxin (DNT) have been described in WO2007 / 104451 and in Mielcarek et al. (PLoS Pathog 2006; 2 (7): e65).

Avances recientes en la comprensión de la virulencia de B. pertussis a nivel molecular han permitido diseñar de forma racional una estrategia para la atenuación, eliminando o alterando genes que están involucrados en la patogénesis de la tos ferina. Tres factores de virulencia se utilizaron como diana genética: la citotoxina traqueal (TCT), la toxina pertussis (PTX) y la toxina dermonecrótica (DNT). Recent advances in the understanding of the virulence of B. pertussis at the molecular level have allowed us to rationally design a strategy for attenuation, eliminating or altering genes that are involved in the pathogenesis of pertussis. Three virulence factors were used as a genetic target: tracheal cytotoxin (TCT), pertussis toxin (PTX) and dermonecrotic toxin (DNT).

La TCT es responsable de la destrucción de las células ciliadas en la tráquea de hospedadores infectados y por lo tanto puede estar implicada en el síndrome de la tos. La TCT es un producto de degradación de peptidoglicano en la pared celular de bacterias Gram negativas, que generalmente es internalizado en el citosol a través de la proteína transportadora de AmpG para ser utilizado de nuevo durante la biosíntesis de la pared celular. AmpG de B. pertussis no es capaz de internalizar los productos de degradación de peptidoglicano. El gen ampG de B. pertussis puede ser reemplazado por amps de E. coli. La cepa resultante expresaba menos de 1% de actividad residual de TCT. Cualquier gen ampG heterólogo procedente de bacterias Gram negativas que liberan cantidades muy pequeñas de fragmentos de peptidoglicano en el medio, se puede utilizar en la presente invención. Ejemplos de gen ampG heterólogo adecuado incluyen, pero no se limitan al gen ampG de Escherichia coli, Salmonella, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Legionella. TCT is responsible for the destruction of hair cells in the trachea of infected hosts and therefore may be involved in cough syndrome. TCT is a degradation product of peptidoglycan in the cell wall of Gram-negative bacteria, which is generally internalized in the cytosol through the AmpG transporter protein to be used again during cell wall biosynthesis. AmpG of B. pertussis is not able to internalize the degradation products of peptidoglycan. The ampG gene of B. pertussis can be replaced by amps of E. coli. The resulting strain expressed less than 1% residual TCT activity. Any heterologous ampG gene from Gram-negative bacteria that release very small amounts of peptidoglycan fragments in the medium can be used in the present invention. Examples of suitable heterologous ampG gene include, but are not limited to the ampG gene of Escherichia coli, Salmonella, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Legionella.

La PTX es un importante factor de virulencia responsable de los efectos sistémicos de las infecciones con B. pertussis y está compuesto por un resto enzimáticamente activo, llamado S1, y un resto responsable de la unión a receptores de células diana. También es uno de los principales antígenos protectores. Los genes ptx naturales pueden ser sustituidos por una versión mutada que codifica una toxina enzimáticamente inactiva. Esto se puede lograr mediante la sustitución de Arg-9 por Lys, y Glu-129 por Gly en S1, dos residuos clave implicados en la unión al sustrato y la catálisis, respectivamente. El intercambio alélico se puede utilizar para eliminar primero el operón de ptx, y luego para insertar la versión mutada. PTX is an important virulence factor responsible for the systemic effects of infections with B. pertussis and is composed of an enzymatically active moiety, called S1, and a moiety responsible for binding to target cell receptors. It is also one of the main protective antigens. Natural ptx genes can be replaced by a mutated version that encodes an enzymatically inactive toxin. This can be achieved by replacing Arg-9 with Lys, and Glu-129 with Gly in S1, two key residues involved in substrate binding and catalysis, respectively. Allelic exchange can be used to first remove the ptx operon, and then to insert the mutated version.

La presencia de la toxina relevante en el material sobrenadante de cultivos de B. pertussis se puede detectar por análisis de inmunotransferencia. The presence of the relevant toxin in the culture supernatant material of B. pertussis can be detected by immunoblot analysis.

También se pueden realizar otras mutaciones tales como las descritas en el documento de patente de EE.UU. 6.713.072, así como cualquier mutación conocida u otras mutaciones capaces de reducir la actividad de la toxina a niveles indetectables. Other mutations such as those described in US Pat. 6,713,072, as well as any known mutation or other mutations capable of reducing the activity of the toxin to undetectable levels.

El intercambio alélico también se puede utilizar para eliminar el gen dnt. Aunque el papel de la DNT en la virulencia de B. pertussis no está seguro, se ha identificado como una toxina importante en la especie estrechamente relacionada Bordetella bronchiseptica y muestra actividad letal después de la inyección de cantidades mínimas. Allelic exchange can also be used to eliminate the dnt gene. Although the role of DNT in the virulence of B. pertussis is not certain, it has been identified as an important toxin in the closely related species Bordetella bronchiseptica and shows lethal activity after the injection of minimal amounts.

En una realización preferida, la vacuna viva atenuada contra Bordetella pertussis es la cepa BPZE1. In a preferred embodiment, the live attenuated vaccine against Bordetella pertussis is strain BPZE1.

La cepa BPZE1 se ha depositado en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, Francia) el 9 de marzo de 2006 con el número CNCM I-3585. The BPZE1 strain was deposited in the National Microorganism Crops Collection (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, France) on March 9, 2006 with the number CNCM I-3585.

Por lo general, las vacunas vivas atenuadas contra Bordetella pertussis de la invención también pueden ser portadoras de antígenos heterólogos. Las vacunas vivas atenuadas contra Bordetella pertussis se pueden utilizar como vector, para ser portadoras de al menos una secuencia heteróloga adicional de ácido nucleico que codifica una proGenerally, live attenuated vaccines against Bordetella pertussis of the invention can also be carriers of heterologous antigens. Live attenuated vaccines against Bordetella pertussis can be used as a vector, to be carriers of at least one additional heterologous nucleic acid sequence encoding a pro

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teína de interés. Normalmente, la proteína codificada por al menos una secuencia heteróloga adicional de ácido nucleico es una proteína de la que se desea su expresión en el tracto respiratorio. Normalmente, la proteína de interés puede ser un antígeno, tal como un antígeno vírico o bacteriano, contra el que se desea una respuesta inmune. Ejemplos de vacunas vivas atenuadas contra Bordetella pertussis que son portadoras de antígenos heterólogos han sido descritos, por ejemplo, por Si Ying Ho et al. (Infection and Immunity, 2008, 76(1), 111-119). Theine of interest. Normally, the protein encoded by at least one additional heterologous nucleic acid sequence is a protein of which its expression in the respiratory tract is desired. Normally, the protein of interest may be an antigen, such as a viral or bacterial antigen, against which an immune response is desired. Examples of live attenuated vaccines against Bordetella pertussis that are carriers of heterologous antigens have been described, for example, by Si Ying Ho et al. (Infection and Immunity, 2008, 76 (1), 111-119).

La formulación de las vacunas de la presente invención se puede lograr usando métodos reconocidos en la técnica. La cantidad de vacunas de la invención que se van a administrar a un sujeto y el régimen de administración, se pueden determinar de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas por los expertos normales en la técnica farmacéutica y veterinaria, teniendo en cuenta factores tales como el adyuvante (si está presente), la edad, el sexo, el peso, la especie y el estado del sujeto particular y la vía de administración. La administración de la vacuna es por lo general en una sola dosis. Alternativamente, la administración de la vacuna de la invención se realiza una primera vez (vacunación inicial), seguida por al menos un refuerzo (administración posterior), con la vacuna. The formulation of the vaccines of the present invention can be achieved using methods recognized in the art. The amount of vaccines of the invention to be administered to a subject and the regimen of administration can be determined according to conventional techniques well known to those of ordinary skill in the pharmaceutical and veterinary art, taking into account factors such as the adjuvant (if present), age, sex, weight, species and condition of the particular subject and the route of administration. The administration of the vaccine is usually in a single dose. Alternatively, the administration of the vaccine of the invention is performed a first time (initial vaccination), followed by at least one booster (subsequent administration), with the vaccine.

Típicamente, las vacunas se pueden administrar mediante administración nasal o por inhalación. Este tipo de administración es de bajo coste y permite que la vacuna viva atenuada contra Bordetella pertussis de la invención colonice las vías respiratorias. La administración nasal se puede realizar con una vacuna viva atenuada contra Bordetella pertussis en forma de solución líquida, suspensión, emulsión. Las soluciones y suspensiones se administran en forma de gotas. Las soluciones también se pueden administrar como una niebla fina desde una botella de vaporización nasal o desde un inhalador nasal. Los geles se administran en pequeñas jeringas que contienen la dosificación requerida para una aplicación. La inhalación se puede realizar con una vacuna viva atenuada contra Bordetella pertussis en forma de soluciones, suspensiones y polvos; estas formulaciones se administran a través de un aerosol, gotas o un inhalador de polvo seco. Los polvos se pueden administrar con insufladores o inhaladores. Typically, vaccines can be administered by nasal administration or by inhalation. This type of administration is low cost and allows the live attenuated vaccine against Bordetella pertussis of the invention to colonize the airways. Nasal administration can be performed with a live attenuated vaccine against Bordetella pertussis in the form of a liquid solution, suspension, emulsion. The solutions and suspensions are administered in the form of drops. The solutions can also be administered as a fine mist from a nasal spray bottle or from a nasal inhaler. The gels are administered in small syringes that contain the dosage required for an application. Inhalation can be performed with a live attenuated vaccine against Bordetella pertussis in the form of solutions, suspensions and powders; These formulations are administered through an aerosol, drops or a dry powder inhaler. The powders can be administered with insufflators or inhalers.

A continuación, la invención se ilustrará por medio del siguiente ejemplo, así como las figuras. Next, the invention will be illustrated by means of the following example, as well as the figures.

Leyendas de las figuras Legends of the figures

Figura 1. B. pertussis BPZE1 atenuada reduce la gravedad de una patología de las vías respiratorias inducida a través de alérgenos sensibilizantes. Cambios morfológicos representativos a los 38 días en secciones transversales bronquiolares de los pulmones de ratones (A) no sensibilizados, (B) sensibilizados con OVA, (C) sensibilizados con OVA e infectados con B. pertussis, (D) sensibilizados con OVA e inmunizados con BPZE1. La inflamación de las vías aéreas se detectó utilizando una tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de secciones de pulmón fijadas. Aumento original A, C, E y G x100. B, D, F y H x400. Figure 1. B. pertussis attenuated BPZE1 reduces the severity of an airway pathology induced through sensitizing allergens. Representative morphological changes at 38 days in bronchiolar cross sections of the lungs of mice (A) not sensitized, (B) sensitized with OVA, (C) sensitized with OVA and infected with B. pertussis, (D) sensitized with OVA and immunized with BPZE1. Inflammation of the airways was detected using staining with hematoxylin and eosin (H&E) of fixed lung sections. Original magnification A, C, E and G x100. B, D, F and H x400.

Figura 2. B. pertussis BPZE1 atenuada reduce la gravedad de la hiperplasia de la mucosidad frente a un alérgeno sensibilizante. Cambios morfológicos representativos a los 37 días en secciones transversales de bronquiolos de ratones (A) no sensibilizados, (B) sensibilizados con OVA, (C) sensibilizados con OVA e infectados con B pertussis, Figure 2. B. pertussis attenuated BPZE1 reduces the severity of mucosal hyperplasia versus a sensitizing allergen. Representative morphological changes at 37 days in cross sections of bronchioles of mice (A) not sensitized, (B) sensitized with OVA, (C) sensitized with OVA and infected with B pertussis,

(D) sensibilizados con OVA y vacunados con BPZE1. La inflamación de las vías aéreas se detectó empleando una tinción combinada con Discombes/azul Alcián/PAS en secciones de pulmón. Aumento original x400. (D) sensitized with OVA and vaccinated with BPZE1. Inflammation of the airways was detected using a staining combined with Discombes / Alcian blue / PAS in lung sections. Original magnification x400.

Figura 3. B. pertussis BPZE1 atenuada reduce el infiltrado de células de fluido LBA. Efecto de la infección con BPSM virulenta, estimulación con BPZE1 atenuada y/o sensibilización con OVA en una composición de LBA, 24 h después de la exposición final a OVA. Los controles negativos se infectaron/sensibilizaron de forma simulada con solución salina. El fluido BAL se examinó para el recuento del número total de células (A), o la presencia de neutrófilos (B), eosinófilos (C) o linfocitos (D). Los resultados se expresan como media ± E.E.M. del número de células. * P <0,05. Figure 3. B. pertussis attenuated BPZE1 reduces infiltration of LBA fluid cells. Effect of virulent BPSM infection, stimulation with attenuated BPZE1 and / or sensitization with OVA in an LBA composition, 24 h after the final exposure to OVA. Negative controls were infected / sensitized simulated with saline. BAL fluid was examined for counting the total number of cells (A), or the presence of neutrophils (B), eosinophils (C) or lymphocytes (D). The results are expressed as mean ± E.E.M. of the number of cells. * P <0.05.

Figura 4. B. pertussis BPZE1 atenuada reduce la IgE inducida por alérgeno. IgE específica de OVA en suero se obtuvo como respuesta a la sensibilización con OVA y/o a la estimulación con B. pertussis virulenta (BPSM) o atenuada (BPZE1). Los sueros se recogieron el día 38 y los niveles séricos de IgE específica de OVA se midieron con ELISA. Las concentraciones inferiores a 100 pg/ml se consideraron negativas. Los resultados se expresan como concentraciones medias de anticuerpos ± E.E.M. P <0,05. Figure 4. B. pertussis attenuated BPZE1 reduces allergen-induced IgE. Serum specific OVA IgE was obtained in response to sensitization with OVA and / or stimulation with virulent B. pertussis (BPSM) or attenuated (BPZE1). Serums were collected on day 38 and serum levels of OVA specific IgE were measured with ELISA. Concentrations below 100 pg / ml were considered negative. The results are expressed as mean antibody concentrations ± E.E.M. P <0.05.

Figura 5. Respuestas inmunes mediadas por células procedentes de esplenocitos frente a OVA, provocadas por sensibilización con OVA 10 días después de una exposición previa a una infección con B. pertussis atenuada (BPZE1) o virulenta (BPSM). Los símbolos negativos indican una sensibilización simulada o una estimulación con PBS. Las respuestas de citocinas procedentes de cultivos similares sometidos a ensayo, se muestran para (A) IL-5, Figure 5. Immune responses mediated by cells from splenocytes against OVA, caused by sensitization with OVA 10 days after previous exposure to an infection with attenuated B. pertussis (BPZE1) or virulent (BPSM). Negative symbols indicate simulated sensitization or stimulation with PBS. The cytokine responses from similar cultures tested are shown for (A) IL-5,

(B) IL-10, (C) IL-13 y (D) IFN-γ. La proliferación de linfocitos T (E) representa Δcpm de la proliferación en bazo frente a OVA a 200 μg/ml, después de la sustracción del ruido de fondo típicamente de 2000-4000 cpm. Los resultados se expresan como media ± E.E.M. (B) IL-10, (C) IL-13 and (D) IFN-γ. T (E) lymphocyte proliferation represents Δcpm of spleen proliferation versus OVA at 200 μg / ml, after subtraction of background noise typically from 2000-4000 cpm. The results are expressed as mean ± E.E.M.

Tabla I. Resumen de las características patológicas de la sensibilización con B. pertussis/alérgeno. Características de la inflamación de las vías respiratorias en ratones no sensibilizados (Control), sensibilizados con OVA (OVA), sensibilizados e inmunizados con BPZE1 (ZeOVA) o sensibilizados e infectados con BPSM (SmOVA). Table I. Summary of the pathological characteristics of sensitization with B. pertussis / allergen. Characteristics of airway inflammation in non-sensitized (Control) mice, sensitized with OVA (OVA), sensitized and immunized with BPZE1 (ZeOVA) or sensitized and infected with BPSM (SmOVA).

5 5

10 10

15 fifteen

20 twenty

25 25

30 30

35 35

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E10715245 E10715245

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Grupo Group: Inflamación del tejido Eosinófilos en BALF Metaplasia de células caliciformes Cultivo de esplenocitos OVA-IgE Tissue swelling Eosinophils in BALF Goblet cell metaplasia Splenocyte Culture OVA-IgE

--

IL-5 IL-5: IL-13 IL-10 IFN-γ IL-13 IL-10 IFN-γ

Control Control: - - - - - - - - - - - - - - - -

OVA OVA: ++ ++ ++ +++ +++ - - ++ ++ ++ ++ +++ +++ - - ++

ZeOVA ZeOVA: + + + - + - ++ + + + + - + - ++ +

SmOVA SmOVA: ++ +++ +++ + - - - +++ ++ +++ +++ + - - - +++

BPZE1 BPZE1: - - - - - - - - - - - - - - - -

BPSM Bpsm: - - - - - - - - - - - - - - - -

Ejemplo Example

RESUMEN SUMMARY

En este estudio preclínico se examinó si la vacuna candidata contra B. pertussis, BPZE1, influye en el cebado con un alérgeno externo y en la patología, utilizando modelos animales caracterizados previamente. A diferencia de las cepas virulentas de tipo silvestre, BPZE1 viva atenuada no agravaba sino que protegía frente a una patología originada por un alérgeno. This preclinical study examined whether the candidate vaccine against B. pertussis, BPZE1, influences priming with an external allergen and pathology, using previously characterized animal models. Unlike wild-type virulent strains, live attenuated BPZE1 did not aggravate but protect against a pathology caused by an allergen.

Abreviaturas utilizadas Abbreviations used

OVA: Ovoalbúmina; BAL: lavado broncoalveolar; BPZE1: Bordetella pertussis viva atenuada; Pa: vacuna acelular contra la tos ferina; Pe: vacuna de células enteras contra la tos ferina OVA: Ovalbumin; BAL: bronchoalveolar lavage; BPZE1: Bordetella pertussis live attenuated; Pa: acellular pertussis vaccine; Pe: Whooping cough whole cell vaccine

MATERIALES MATERIALS

Inmunización, sensibilización y administración de OVA y B. pertussis en las vías respiratorias Immunization, sensitization and administration of OVA and B. pertussis in the respiratory tract

Se utilizaron ratones Balb/c hembras de ocho a doce semanas de edad (Harlan, Oxon, Reino Unido) y se mantuvieron según las normas y directrices del Departamento de Salud de Irlanda y el Comité de Ética para la Investigación de la Universidad Nacional de Irlanda, Maynooth. Los ratones fueron expuestos a bacterias vivas virulentas o atenuadas, y fueron sensibilizados frente al alérgeno durante la infección. B. pertussis BPSM virulenta o BPZE1 atenuada se cultivaron como se ha descrito previamente (Mills et al. Dev Biol Stand 1998; 95:31-41). Las cepas atenuadas o virulentas en crecimiento semilogarítmico se administraron a ratones mediante un aerosol. En el pico de la infección (10d) y a los 24d, los ratones fueron sensibilizados mediante inyección intraperitoneal de 100 μg/ml de ovoalbúmina (OVA) en adyuvante (AlumImject®, Pierce, I11). Los ratones fueron estimulados por vía intranasal con OVA (50 μg/ml) los días 24, 35, 36 y 37. Varios grupos de control recibieron una administración simulada de PBS estéril en lugar del agente activo (Ennis et al. Clin Exp Allergy 2004; 34(9): 1488-1497). Female Balb / c mice aged eight to twelve weeks (Harlan, Oxon, United Kingdom) were used and maintained according to the standards and guidelines of the Irish Department of Health and the Research Ethics Committee of the National University of Ireland Maynooth Mice were exposed to virulent or attenuated live bacteria, and were sensitized to the allergen during infection. B. pertussis virulent BPSM or attenuated BPZE1 were cultured as previously described (Mills et al. Dev Biol Stand 1998; 95: 31-41). The attenuated or virulent strains in semilogarithmic growth were administered to mice by means of an aerosol. At the peak of the infection (10d) and at 24d, the mice were sensitized by intraperitoneal injection of 100 μg / ml of ovalbumin (OVA) in adjuvant (AlumImject®, Pierce, I11). The mice were stimulated intranasally with OVA (50 μg / ml) on days 24, 35, 36 and 37. Several control groups received a simulated administration of sterile PBS instead of the active agent (Ennis et al. Clin Exp Allergy 2004 ; 34 (9): 1488-1497).

Lavado broncoalveolar (BAL) e histología del tracto respiratorio Bronchoalveolar lavage (BAL) and respiratory tract histology

El día 37d, los ratones fueron sacrificados mediante inyección letal de pentobarbital sódico y se recogió el líquido BAL (Ennis et al. Clin Exp Allergy 2004; 34(9):1488-1497). Se realizaron recuentos de los leucocitos totales y de células diferenciales según lo descrito, utilizando Diff Quik/Rapi-Diff II® (Triangle Biomedical Sciences, NC, EE.UU.). Los pulmones de ratones no sometidos a lavado se extirparon y se fijaron en 10% (v/v) de formalina/PBS, se embebieron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina/eosina (H&E), azul alcián (identificación de moco), Discombes (identificación de eosinófilos) o ácido periódico de Schiff (para la evaluación del espesor de la membrana basal). Los cambios histopatológicos se clasificaron de acuerdo con un sistema establecido de puntuación semicuantitativa, en leves, moderados o graves. La puntuación de la patología fue realizada por dos observadores independientes, sin un conocimiento previo del grupo de tratamiento, como se ha descrito anteriormente (Ennis et al. Clin Diagn Lab Immunol 2005; 12(3):409-17). On day 37d, the mice were sacrificed by lethal injection of sodium pentobarbital and the BAL liquid was collected (Ennis et al. Clin Exp Allergy 2004; 34 (9): 1488-1497). Total leukocyte and differential cell counts were performed as described, using Diff Quik / Rapi-Diff II® (Triangle Biomedical Sciences, NC, USA). The lungs of non-washed mice were excised and fixed in 10% (v / v) formalin / PBS, embedded in paraffin, sectioned and stained with hematoxylin / eosin (H&E), alcian blue (mucus identification ), Discombes (identification of eosinophils) or periodic Schiff acid (for the evaluation of the basement membrane thickness). Histopathological changes were classified according to an established semiquantitative scoring system, mild, moderate or severe. The pathology score was performed by two independent observers, without prior knowledge of the treatment group, as previously described (Ennis et al. Clin Diagn Lab Immunol 2005; 12 (3): 409-17).

Ensayo de proliferación de linfocitos T T lymphocyte proliferation assay

Los esplenocitos procedentes de ratones se prepararon como se ha descrito previamente (Mahon et al. J Exp Med 1997; 186(11):1843-1851) y se incubaron durante 72 h, con medio (control negativo), OVA (200 μg/ml) o concanavalina A (5 μg/ml). El material sobrenadante se retiró a las 48 horas para un análisis de las citocinas, y los cultivos recibieron medio de nuevo aporte. Las células se incubaron durante las 6 h finales con [3H]-timidina y la proliferación se midió por la radioactividad incorporada mediante un contador de centelleo líquido. Splenocytes from mice were prepared as previously described (Mahon et al. J Exp Med 1997; 186 (11): 1843-1851) and incubated for 72 h, with medium (negative control), OVA (200 μg / ml) or concanavalin A (5 μg / ml). The supernatant material was removed at 48 hours for an analysis of the cytokines, and the cultures received medium again. The cells were incubated during the final 6 h with [3 H] -thymidine and proliferation was measured by the radioactivity incorporated by a liquid scintillation counter.

Medición de citocinas y respuestas de anticuerpos Cytokine measurement and antibody responses

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25 25

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El análisis de IL-5, IL-10, IL-13 e IFN-γ a partir del fluido BAL y del material sobrenadante de esplenocitos se llevó a cabo utilizando un equipo Flex de matriz citométrica de microesferas (del inglés, “Cytometric Bead Array Flex Sets”) (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) según las instrucciones del fabricante, y se analizó por citometría de flujo (Becton-Dickinson, NJ, EE.UU.). Las curvas de calibración y los datos brutos se generaron para cada citocina utilizando el programa informático FCAP Array v1.0.1 (BD Biosciences). La IgE sérica específica de OVA se midió por ELISA como se ha descrito previamente (Morokata Tet al. Immunology 1999; 98(3): 345-351) utilizando un anticuerpo monoclonal de rata anti-IgE de ratón (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.). La concentración de IgE se expresó como µg/ml después de la comparación con patrones de IgE murina (BD, Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.). The analysis of IL-5, IL-10, IL-13 and IFN-γ from the BAL fluid and the splenocyte supernatant material was carried out using a Flex equipment of cytometric matrix of microspheres (from English, “Cytometric Bead Array Flex Sets ”) (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) according to the manufacturer's instructions, and analyzed by flow cytometry (Becton-Dickinson, NJ, USA). Calibration curves and raw data were generated for each cytokine using the FCAP Array v1.0.1 (BD Biosciences) software. OVA specific serum IgE was measured by ELISA as previously described (Morokata Tet al. Immunology 1999; 98 (3): 345-351) using a mouse anti-mouse IgE monoclonal antibody (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA). The IgE concentration was expressed as µg / ml after comparison with murine IgE standards (BD, Pharmingen, San Diego, CA, USA).

Análisis estadístico Statistic analysis

Los valores para todas las mediciones se expresaron como la media ± error estándar de la media (EEM). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa informático GraphPad Prism® (GraphPad, San Diego, CA). La comparación se realizó mediante la prueba de Kruskal Wallis o la prueba de Mann Whitney, según fuera adecuado. El nivel de significación se especificó con un valor de P <0,05. Values for all measurements were expressed as the mean ± standard error of the mean (SEM). Statistical analyzes were performed using the GraphPad Prism® software (GraphPad, San Diego, CA). The comparison was made using the Kruskal Wallis test or the Mann Whitney test, as appropriate. The level of significance was specified with a value of P <0.05.

RESULTADOS RESULTS

B. pertussis BPZE1 atenuada impide una patología alérgica agravada de las vías respiratorias originada por OVA B. pertussis attenuated BPZE1 prevents an aggravated allergic pathology of the respiratory tract caused by OVA

B. pertussis virulenta puede agravar el cebado con un alérgeno externo en modelos animales (Ennis et al. Clin Exp Allergy 2004; 34(9):1488-1497) y se ha asociado con una agravación de la alergia en los seres humanos (Harju et al. Thorax 2006; 61(7):579-584). Para evaluar la influencia de B. pertussis atenuada sobre el cebado con un alérgeno externo, los ratones fueron cebados con cepas virulentas o atenuadas de B. pertussis, y se sensibilizaron frente a OVA en el pico de portador de bacterias (un modelo mostrado previamente por revelar la influencia de una infección sobre la inflamación originada por un alérgeno). En ausencia de infección, los ratones sensibilizados frente a OVA mostraron inflamación peribronquial y perivascular típica el día 38, lo que no se observó en ratones control no tratados (Fig. 1A y B). En ese momento, la patología debida solo a una infección bacteriana virulenta remitió. El cebado en el pico de una infección con B. pertussis virulenta incrementa la patología de las vías respiratorias cuando se compara con la sensibilización solo con OVA, en donde los ratones muestran hiperplasia epitelial y metaplasia mucosa moderada (Fig. 1C). Por el contrario, se observó una patología mínima en ratones sensibilizados, infectados con BPZE1 atenuada, en comparación con los sensibilizados solo con OVA (Fig. 1D). Un examen de las células caliciformes que contenían moco mostró que la inmunización previa con BPZE1 en ratones sensibilizados con OVA, reducía la secreción de moco y la hiperplasia, en comparación con los sensibilizados solo con OVA (Fig. 2). De este modo, a diferencia de la infección con B. pertussis virulenta, la inmunización con la vacuna viva atenuada contra B. pertussis candidata, BPZE1, no incrementó sino que redujo la patología asociada con la sensibilización a alérgenos. B. virulent pertussis may aggravate priming with an external allergen in animal models (Ennis et al. Clin Exp Allergy 2004; 34 (9): 1488-1497) and has been associated with an aggravation of allergy in humans (Harju et al. Thorax 2006; 61 (7): 579-584). To assess the influence of attenuated B. pertussis on priming with an external allergen, the mice were primed with virulent or attenuated strains of B. pertussis, and were sensitized against OVA in the bacterial carrier peak (a model previously shown by reveal the influence of an infection on the inflammation caused by an allergen). In the absence of infection, mice sensitized to OVA showed typical peribronchial and perivascular inflammation on day 38, which was not observed in untreated control mice (Fig. 1A and B). At that time, the pathology due only to a virulent bacterial infection remitted. Priming at the peak of an infection with virulent B. pertussis increases the pathology of the respiratory tract when compared to sensitization only with OVA, where mice show epithelial hyperplasia and moderate mucous metaplasia (Fig. 1C). On the contrary, minimal pathology was observed in mice sensitized, infected with attenuated BPZE1, compared to those sensitized only with OVA (Fig. 1D). An examination of goblet cells containing mucus showed that prior immunization with BPZE1 in mice sensitized with OVA reduced mucus secretion and hyperplasia, compared to those sensitized only with OVA (Fig. 2). Thus, unlike infection with virulent B. pertussis, immunization with live attenuated vaccine against B. pertussis candidate, BPZE1, did not increase but reduced the pathology associated with allergen sensitization.

La cepa BPZE1 de la vacuna atenuada contra B. pertussis evita la inflamación alérgica de las vías respiratorias originada por OVA The BPZE1 strain of the attenuated vaccine against B. pertussis prevents allergic inflammation of the respiratory tract caused by OVA

La inmunización con BPZE1 viva atenuada de B. pertussis moderaba la propiedad de afluencia inflamatoria en el tracto respiratorio inducida por OVA. Los ratones control mostraron una celularidad mínima en el lavado broncoalveolar (Fig. 3), mientras que la sensibilización/estímulo con OVA dio como resultado una infiltración significativa con células inflamatorias (>3 x 106 células, Fig. 3A, p <0,05). Había pocas diferencias notables en el número de linfocitos Immunization with live attenuated BPZE1 from B. pertussis moderated the property of inflammatory influx into the respiratory tract induced by OVA. Control mice showed minimal cellularity in bronchoalveolar lavage (Fig. 3), while sensitization / stimulation with OVA resulted in significant infiltration with inflammatory cells (> 3 x 106 cells, Fig. 3A, p <0.05 ). There were few notable differences in the number of lymphocytes

: o neutrófilos. La inmunización solo con BPZE1 no fomentó una infiltración de neutrófilos el día 38d y la infiltración de neutrófilos en ratones sensibilizados de forma combinada con BPZE1/OVA era típicamente menor que solo con OVA or neutrophils. Immunization with BPZE1 alone did not promote neutrophil infiltration on day 38d and neutrophil infiltration in mice sensitized in combination with BPZE1 / OVA was typically less than only with OVA.

: o en combinación con bacterias virulentas, sin embargo esto no alcanzó un nivel de significación estadística en este estudio. Las observaciones más importantes eran que una infección previa con B. pertussis virulenta aumentaba la infiltración celular en comparación con una sensibilización solo con OVA, acompañada por un aumento de la eosinofilia (Fig. 3C) como se ha observado anteriormente (Ennis et al. Clin Exp Allergy 2004; 34(9):1488-1497). Sin embargo, en un claro contraste, la inmunización con BPZE1 viva atenuada antes de la sensibilización con OVA, dio como resultado una infiltración de eosinófilos en las vías aéreas, originada por OVA, significativamente reducida (Fig. 3C, p <0,05). Por lo tanto, la vacuna candidata viva atenuada contra B. pertussis, BPZE1, evita la eosinofilia alérgica de las vías respiratorias originada por OVA, una característica clave de la inflamación en este modelo. or in combination with virulent bacteria, however this did not reach a level of statistical significance in this study. The most important observations were that a previous infection with virulent B. pertussis increased cell infiltration compared with sensitization only with OVA, accompanied by an increase in eosinophilia (Fig. 3C) as previously observed (Ennis et al. Clin Exp Allergy 2004; 34 (9): 1488-1497). However, in a clear contrast, immunization with live attenuated BPZE1 before sensitization with OVA, resulted in an infiltration of eosinophils in the airways, caused by OVA, significantly reduced (Fig. 3C, p <0.05) . Therefore, the live attenuated candidate vaccine against B. pertussis, BPZE1, prevents allergic airway eosinophilia caused by OVA, a key feature of inflammation in this model.

La vacuna candidata viva atenuada contra B. pertussis, BPZE1, no potencia las respuestas de IgE sérica frente a un alérgeno sensibilizante The live attenuated candidate vaccine against B. pertussis, BPZE1, does not enhance serum IgE responses against a sensitizing allergen

Se conoce que la sensibilización con OVA en ratones induce IgE y una respuesta potente específica de Th2, mientras que una infección con B. pertussis induce una fuerte respuesta de Th1. Sin embargo, la toxina pertussis por sí sola puede elevar las concentraciones de IgE. Por lo tanto, era importante investigar si BPZE1 atenuada tenía un efecto adyuvante o potenciaba la IgE específica de alérgeno. La influencia de BPZE1 sobre la sensibilización alérgica se examinó midiendo la concentración de IgE específica de OVA en el suero de ratones sensibilizados frente a OVA, infectados con BPSM, inmunizados con BPZE1 o que habían recibido combinaciones de estos tratamientos (Fig. 4). Como es bien sabido, la sensibilización con OVA inducía niveles significativos de IgE. Anteriormente, un aumento significativo de IgE específica de OVA después de una infección con B. pertussis W28 virulenta se había It is known that sensitization with OVA in mice induces IgE and a potent Th2-specific response, while an infection with B. pertussis induces a strong Th1 response. However, pertussis toxin alone can raise IgE concentrations. Therefore, it was important to investigate whether attenuated BPZE1 had an adjuvant effect or enhanced allergen-specific IgE. The influence of BPZE1 on allergic sensitization was examined by measuring the concentration of OVA specific IgE in the serum of mice sensitized against OVA, infected with BPSM, immunized with BPZE1 or who had received combinations of these treatments (Fig. 4). As is well known, sensitization with OVA induced significant levels of IgE. Previously, a significant increase in OVA specific IgE after an infection with virulent B. pertussis W28 had been

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observado en ratones sensibilizados con OVA (Ennis et al. Clin Exp Allergy 2004; 34(9):1488-1497). Las respuestas de IgE en ratones expuestos a BPZE1 atenuada antes de la sensibilización con OVA, no difirieron significativamente de los que recibieron solo OVA. Sin embargo, en claro contraste, la inmunización con BPZE1 atenuada daba como resultado una inducción significativamente reducida (p <0,05) de IgE inducida con OVA, en comparación con ratones infectados con BPSM virulenta en combinación con sensibilización con OVA (Fig. 4). Por lo tanto, la vacuna candidata viva atenuada contra B. pertussis, BPZE1, administrada antes del cebado con un alérgeno, no mostraba una respuesta incrementada de IgE, como se observó con B. pertussis W2811 y BPSM. observed in mice sensitized with OVA (Ennis et al. Clin Exp Allergy 2004; 34 (9): 1488-1497). IgE responses in mice exposed to attenuated BPZE1 before sensitization with OVA did not differ significantly from those receiving only OVA. However, in clear contrast, immunization with attenuated BPZE1 resulted in a significantly reduced induction (p <0.05) of OVA-induced IgE, compared to mice infected with virulent BPSM in combination with OVA sensitization (Fig. 4 ). Therefore, the live attenuated candidate vaccine against B. pertussis, BPZE1, administered before priming with an allergen, did not show an increased IgE response, as observed with B. pertussis W2811 and BPSM.

La vacuna viva atenuada contra B. pertussis BPZE1 modula las respuestas de memoria de citocinas frente a un alérgeno sensibilizante Live attenuated vaccine against B. pertussis BPZE1 modulates cytokine memory responses to a sensitizing allergen

Está claro que BPZE1 atenuada tiene un efecto radicalmente diferente sobre una patología de las vías respiratorias originada por un alérgeno, que en comparación con B. pertussis virulenta. Con el fin de descubrir la base de los mecanismos de acción de este efecto, se caracterizó la influencia de la exposición a bacterias sobre el patrón de respuestas inmunes inducidas por alérgenos. La inducción de citocinas específicas de alérgeno a través de preparaciones de células de bazo, se evaluó después de la inmunización con BPZE1 y la sensibilización/estimulación con OVA, con el fin de evaluar la influencia de BPZE1 sobre el cebado inducido por alérgeno. Como era de esperar, la sensibilización solo con OVA inducía niveles elevados de las citocinas de Th2 IL-5 e IL-13 (Fig. 5) en la respuesta de memoria frente a OVA. Ni BPSM virulenta ni BPZE1 atenuada solas inducían una respuesta de memoria frente a OVA (Fig. 5E), pero producían fuertes respuestas de Th1 frente a antígenos de B. pertussis. La estimulación con BPSM no modulaba la respuesta inmune frente a un alérgeno sensibilizante, con una reducción no significativa de IL-5, IL-13 específicas de OVA o de las respuestas proliferativas observadas en ratones cosensibilizados frente a OVA, y un incremento no significativo de IFN-γ (Fig 5). Por el contrario, BPZE1 atenuada alteraba el patrón de las citocinas inducidas mediante sensibilización con alérgenos. BPZE1 reducía significativamente los niveles de IL-5 (p <0,005) e IL-13 (p <0,05) inducidas con OVA, así como las respuestas proliferativas específicas de OVA (p <0,001), pero inducía de forma significativa una IFN-γ incrementada como respuesta a OVA (p <0,05). Resumiendo, BPZE1 no favorecía la inducción de citocinas Th2 frente a un antígeno externo sino que más bien las modulaba hacia una respuesta de tipo Th1. It is clear that attenuated BPZE1 has a radically different effect on an airway pathology caused by an allergen, than in comparison with virulent B. pertussis. In order to discover the basis of the mechanisms of action of this effect, the influence of exposure to bacteria on the pattern of allergen-induced immune responses was characterized. Induction of allergen-specific cytokines through spleen cell preparations was evaluated after immunization with BPZE1 and sensitization / stimulation with OVA, in order to assess the influence of BPZE1 on allergen-induced priming. As expected, sensitization with OVA alone induced elevated levels of the Th2 cytokines IL-5 and IL-13 (Fig. 5) in the memory response to OVA. Neither virulent BPSM nor attenuated BPZE1 alone induced a memory response against OVA (Fig. 5E), but produced strong Th1 responses to B. pertussis antigens. Stimulation with BPSM did not modulate the immune response against a sensitizing allergen, with a non-significant reduction of IL-5, OVA-specific IL-13 or proliferative responses observed in mice that are sensitized against OVA, and a non-significant increase in IFN-γ (Fig 5). In contrast, attenuated BPZE1 altered the pattern of cytokines induced by allergen sensitization. BPZE1 significantly reduced the levels of IL-5 (p <0.005) and IL-13 (p <0.05) induced with OVA, as well as OVA-specific proliferative responses (p <0.001), but significantly induced an IFN -γ increased in response to OVA (p <0.05). In summary, BPZE1 did not favor the induction of Th2 cytokines against an external antigen but rather modulated them towards a Th1 type response.

DISCUSIÓN DISCUSSION

El presente estudio empleaba modelos de infección/sensibilización combinados para demostrar que una cepa atenuada de B. pertussis, BPZE1, no potenciaba sino que reducía una patología de las vías respiratorias originada por un alérgeno. B. pertussis atenuada reducía la eosinofilia pulmonar originada por un alérgeno y disminuía la gravedad de una inflamación de las vías respiratorias. Además, BPZE1 evitaba un aumento de IL-5 e IL-13 inducidas por OVA y modulaba respuestas de memoria frente a alérgenos hacia una respuesta de tipo Th1. BPZE1 mostraba una disminución de las respuestas de IgE sérica inducida por alérgenos, cuando se comparaba con ratones infectados con The present study used combined infection / sensitization models to demonstrate that an attenuated strain of B. pertussis, BPZE1, did not potentiate but reduced a pathology of the respiratory tract caused by an allergen. Attenuated B. pertussis reduced pulmonary eosinophilia caused by an allergen and decreased the severity of an inflammation of the respiratory tract. In addition, BPZE1 avoided an increase in IL-5 and IL-13 induced by OVA and modulated memory responses against allergens towards a Th1 response. BPZE1 showed a decrease in allergen-induced serum IgE responses, when compared to mice infected with

B. pertussis virulenta antes de la sensibilización con OVA (véase la Tabla I). Tomados en conjunto, estos datos demuestran que BPZE1 atenuada no agrava una patología de las vías respiratorias inducida por alérgenos en un modelo murino y apoyan el uso de esta vacuna candidata en poblaciones en donde la atopía es prevalente. B. virulent pertussis before sensitization with OVA (see Table I). Taken together, these data demonstrate that attenuated BPZE1 does not aggravate an allergen-induced airway pathology in a murine model and support the use of this candidate vaccine in populations where atopy is prevalent.

La hipótesis de la higiene sugiere que infecciones que inducen Th1 pueden tener un efecto inhibidor sobre el desarrollo de la atopía. Sin embargo, estudios previos han demostrado que B. pertussis virulenta incrementa la gravedad de una patología de las vías respiratorias (Ennis et al. Clin Exp Allergy 2004; 34(9):1488-1497) a pesar de la inducción de la inmunidad de tipo Th1. Por el contrario, una inmunización sistémica con una vacuna Pe que inducía Th1 inhibía la capacidad de respuesta alérgica de las vías respiratorias, lo que sugiere que la protección frente a una patología originada por un alérgeno está ligada no solo a un perfil de linfocitos T CD4+, sino también con el grado de lesión de las vías respiratorias en el momento del cebado. The hygiene hypothesis suggests that infections that induce Th1 may have an inhibitory effect on the development of atopy. However, previous studies have shown that virulent B. pertussis increases the severity of a pathology of the respiratory tract (Ennis et al. Clin Exp Allergy 2004; 34 (9): 1488-1497) despite the induction of immunity from type Th1. On the contrary, a systemic immunization with a Pe vaccine that induced Th1 inhibited the allergic response capacity of the respiratory tract, suggesting that protection against an allergen pathology is linked not only to a CD4 + T lymphocyte profile , but also with the degree of airway injury at the time of priming.

El propósito de este estudio era investigar si una inmunización con una cepa atenuada genéticamente de B. pertussis podría proteger contra una inflamación de las vías respiratorias inducida por OVA. Anteriormente, se había investigado el potencial de otras vacunas para moderar el riesgo de una atopía, y en una variedad de estudios se ha encontrado una relación inversa entre la inmunización y un riesgo incrementado de enfermedad alérgica. Ennis et al. encontraron que una vacuna Pe protegida contra un agravamiento, debido a B. pertussis, de la hiperreactividad de las vías respiratorias inducida por OVA en un modelo murino de inflamación alérgica de las vías respiratorias (Mills et al. Dev Biol Stand 1998; 95:31-41). Del mismo modo, Grüber et al. no encontraron ningún efecto que favoreciera la alergia como respuesta a vacunas infantiles comunes, incluidas las vacunas contra la tos ferina (Grüber et al. Allergy 2008; 63(11):1464-1472). La relación entre la vacunación infantil y el desarrollo de enfermedades atópicas en una muestra poblacional de 718 adolescentes mostró que las vacunas vivas atenuadas inhibían el desarrollo del asma y de enfermedades alérgicas (Martignon et al. Pediatr Allergy Immunol 2005; 16(3):193-200). El estudio actual demuestra que la vacuna candidata BPZE1 inhibe una patología originada por alérgeno a través de un mecanismo que modula las respuestas mediadas por células contra OVA, tanto a nivel de la mucosa como sistémico. The purpose of this study was to investigate whether an immunization with a genetically attenuated strain of B. pertussis could protect against an airway inflammation induced by OVA. Previously, the potential of other vaccines to moderate the risk of an atopy had been investigated, and a variety of studies have found an inverse relationship between immunization and an increased risk of allergic disease. Ennis et al. They found that a Pe vaccine protected against aggravation, due to B. pertussis, of OVA-induced airway hyperreactivity in a murine model of allergic airway inflammation (Mills et al. Dev Biol Stand 1998; 95:31 -41). Similarly, Grüber et al. they found no effect that favored allergy in response to common childhood vaccines, including pertussis vaccines (Grüber et al. Allergy 2008; 63 (11): 1464-1472). The relationship between childhood vaccination and the development of atopic diseases in a population sample of 718 adolescents showed that live attenuated vaccines inhibited the development of asthma and allergic diseases (Martignon et al. Pediatr Allergy Immunol 2005; 16 (3): 193 -200). The current study demonstrates that the BPZE1 candidate vaccine inhibits an allergen-caused pathology through a mechanism that modulates cell-mediated responses against OVA, both at the mucosal and systemic levels.

El reclutamiento de eosinófilos hacia el pulmón mediado por IL-5 contribuye a una patología de las vías respiratorias inducida por alérgenos mediante la generación de productos citotóxicos potentes, que incluyen la proteína básica principal (MBP) y la peroxidasa de eosinófilos, que conjuntamente contribuyen al daño tisular (Gleich G. J Allergy Clin Immunol 2000; 105(4):651-63). La infección con B. pertussis virulenta agrava el grado de afluencia inflamatoria The recruitment of eosinophils into the lung mediated by IL-5 contributes to an allergen-induced pathology of the airways by generating potent cytotoxic products, including the main basic protein (MBP) and eosinophil peroxidase, which together contribute to tissue damage (Gleich G. J Allergy Clin Immunol 2000; 105 (4): 651-63). Infection with virulent B. pertussis aggravates the degree of inflammatory influx

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inducida por OVA en el tracto respiratorio, con un aumento de los eosinófilos (Fig. 3C), acompañado por un incremento marcado de la gravedad de la patología de las vías respiratorias (Fig. 1G). Por el contrario, la administración de BPZE1 atenuada antes de la sensibilización con el alérgeno dio como resultado una reducción significativa de la infiltración de eosinófilos. Este estudio demuestra que BPZE1 evita el incremento de IL-5 inducida por OVA asociado con un adyuvante (Fig. 1A), observado cuando los animales están infectados con cepas virulentas de B. pertussis. IL-13 también contribuye a la patogénesis del asma favoreciendo respuestas de tipo Th2, aumentando el reclutamiento de eosinófilos y contribuyendo a la inflamación mediada por IgE (Humbert et al. J Allergy Clin Immunol 1997; 99(5):657-65; Temann et al. Am J Respir Cell Mol Biol 1997; 16(4):471-8). BPZE1 atenuada disminuía significativamente la IL-13 inducida por OVA en ratones sensibilizados (Fig. 5C). La hipersecreción de moco en las vías respiratorias también está relacionada con IL-13 y es una característica fisiopatológica principal tanto del asma alérgica como de la tos ferina. No es de extrañar, por tanto, que la producción de moco refleje los niveles de IL-13 en este estudio y se haya reducido significativamente en los ratones sensibilizados expuestos previamente a BPZE1 (Fig 5C). OVA-induced in the respiratory tract, with an increase in eosinophils (Fig. 3C), accompanied by a marked increase in the severity of the pathology of the respiratory tract (Fig. 1G). In contrast, administration of attenuated BPZE1 before sensitization with the allergen resulted in a significant reduction in eosinophil infiltration. This study demonstrates that BPZE1 prevents the increase in OVA-induced IL-5 associated with an adjuvant (Fig. 1A), observed when animals are infected with virulent strains of B. pertussis. IL-13 also contributes to the pathogenesis of asthma by promoting Th2 type responses, increasing eosinophil recruitment and contributing to IgE-mediated inflammation (Humbert et al. J Allergy Clin Immunol 1997; 99 (5): 657-65; Temann et al. Am J Respir Cell Mol Biol 1997; 16 (4): 471-8). Attenuated BPZE1 significantly decreased OVA-induced IL-13 in sensitized mice (Fig. 5C). Hypersecretion of mucus in the respiratory tract is also related to IL-13 and is a major pathophysiological feature of both allergic asthma and whooping cough. It is not surprising, therefore, that mucus production reflects IL-13 levels in this study and has been significantly reduced in sensitized mice previously exposed to BPZE1 (Fig 5C).

Este estudio sugiere que uno, o una combinación, de los factores de virulencia atenuados en BPZE1 (la toxina pertussis, la citotoxina traqueal y la toxina dermonecrótica) tienen una función en el efecto adyuvante observado con cepas virulentas de B. pertussis, a través de la inducción de IL-5 o IL-13, o de ambas. This study suggests that one, or a combination, of the attenuated virulence factors in BPZE1 (pertussis toxin, tracheal cytotoxin and dermonecrotic toxin) have a role in the adjuvant effect observed with virulent strains of B. pertussis, through the induction of IL-5 or IL-13, or both.

La protección contra una patología originada por un alérgeno observada en esta memoria, está asociada con tres modificaciones genéticas contenidas dentro de BPZE1 y la modulación de la respuesta inmune alérgica es compatible con algunas versiones de la hipótesis de la higiene. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la influencia beneficiosa de BPZE1 atenuada sobre una patología originada por un alérgeno, pueden ser múltiples y estar relacionados entre sí. Estudios anteriores han demostrado un aumento significativo de la IgE total en suero como un resultado de la sensibilización frente a OVA en modelos animales (Holgate et al. J Allergy Clin Immunol 2005; 115(3):459-465; Hamelmann et al. Allergy 1999; 54(4):297-305). En esta memoria, las respuestas de IgE específicas del alérgeno, inducidas por una sensibilización respiratoria, se redujeron significativamente en los ratones que recibieron B. pertussis atenuada en comparación con B. pertussis virulenta. Esto es compatible con la regulación de respuestas inmunes sistémicas frente a OVA inducidas por BPZE1 atenuada, reduciendo IL-5 e IL-13, incrementando IFN-γ, una respuesta que se asocia con una reducción de IgE (Lack et al. J Immunol 1994; 152(5):2546-54). Sin embargo la inflamación alérgica de las vías respiratorias no es simplemente un equilibrio entre las respuestas de tipo Th1 y Th2. Hansen et al. han mostrado que la modulación de las respuestas de tipo Th CD4+ en las vías respiratorias no reduce necesariamente la patología de las vías respiratorias (Hansen et al. J Clin Invest 1999; 103(2):175183). Puede ser que la característica clave beneficiosa de BPZE1 sea la combinación de una respuesta de tipo Th1 sesgada, combinada con la ausencia de patología inducida de las vías respiratorias. Esto es consistente con informes previos en los que el agravamiento de una patología de las vías aéreas frente a un alérgeno se asociaba con el cebado con un alérgeno durante un período de lesión o de remodelación de las vías respiratorias (Marsland et al. Clin Exp Allergy 2004; 34(8):1299-306; Gern. J Allergy Clin Immunol 2000: 105(2 Pt 2):S497-502). The protection against a pathology caused by an allergen observed in this report is associated with three genetic modifications contained within BPZE1 and the modulation of the allergic immune response is compatible with some versions of the hygiene hypothesis. However, the mechanisms underlying the beneficial influence of attenuated BPZE1 on a pathology caused by an allergen can be multiple and interrelated. Previous studies have shown a significant increase in total serum IgE as a result of sensitization against OVA in animal models (Holgate et al. J Allergy Clin Immunol 2005; 115 (3): 459-465; Hamelmann et al. Allergy 1999; 54 (4): 297-305). Here, allergen-specific IgE responses, induced by respiratory sensitization, were significantly reduced in mice that received attenuated B. pertussis compared to virulent B. pertussis. This is compatible with the regulation of systemic immune responses against OVA induced by attenuated BPZE1, reducing IL-5 and IL-13, increasing IFN-γ, a response that is associated with a reduction in IgE (Lack et al. J Immunol 1994 ; 152 (5): 2546-54). However, allergic airway inflammation is not simply a balance between Th1 and Th2 type responses. Hansen et al. have shown that modulation of Th-type CD4 + responses in the respiratory tract does not necessarily reduce the pathology of the respiratory tract (Hansen et al. J Clin Invest 1999; 103 (2): 175183). It may be that the beneficial key feature of BPZE1 is the combination of a biased Th1 type response, combined with the absence of induced airway pathology. This is consistent with previous reports in which the aggravation of an airway pathology against an allergen was associated with priming with an allergen during a period of injury or remodeling of the airways (Marsland et al. Clin Exp Allergy 2004; 34 (8): 1299-306; Gern. J Allergy Clin Immunol 2000: 105 (2 Pt 2): S497-502).

Este beneficio combinado hace que la vacuna viva atenuada contra Bordetella pertussis que carece de TCT, PTX y DNT sea un candidato atractivo como agente protector contra la atopía. This combined benefit makes the live vaccine attenuated against Bordetella pertussis that lacks TCT, PTX and DNT being an attractive candidate as a protective agent against atopy.

Referencias References

A lo largo de toda esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la técnica a la que pertenece esta invención. Throughout this application, various references describe the state of the art to which this invention pertains.

Claims

1. A live attenuated vaccine against Bordetella pertussis that lacks tracheal cytotoxin (TCT), pertussis toxin (PTX) and dermonecrotic toxin (DNT) for use in the prophylaxis or treatment of a respiratory pathology caused by allergen

: 5 2. Una vacuna viva atenuada contra Bordetella pertussis según la reivindicación 1 para el uso definido en la reivindicación 1, en donde la patología de las vías respiratorias originada por un alérgeno se selecciona a partir del grupo que consiste en asma alérgica, fiebre del heno y enfermedades pulmonares intersticiales. A live attenuated vaccine against Bordetella pertussis according to claim 1 for the use defined in claim 1, wherein the pathology of the respiratory tract caused by an allergen is selected from the group consisting of allergic asthma, hay fever and interstitial lung diseases.

3. A live attenuated vaccine against Bordetella pertussis according to claim 1 or 2 for the use defined in said claims, wherein the subject is a newborn or an infant.

: 10 4. Una vacuna viva atenuada contra Bordetella pertussis según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el uso definido en dichas reivindicaciones, en donde la vacuna viva atenuada contra Bordetella pertussis es la cepa de Bordetella pertussis depositada con el número de orden CNCM I-3585. A live attenuated vaccine against Bordetella pertussis according to any one of claims 1 to 3 for the use defined in said claims, wherein the live attenuated vaccine against Bordetella pertussis is the Bordetella pertussis strain deposited with the order number CNCM I -3585.

5. A live attenuated vaccine against Bordetella pertussis according to any one of claims 1 to 4

for the use defined in said claims, wherein the live attenuated vaccine against Bordetella pertussis is a carrier of a heterologous antigen.

6. A live attenuated vaccine against Bordetella pertussis according to any one of claims 1 to 5 for the use defined in said claims, wherein the live attenuated vaccine against Bordetella pertussis is administered by nasal administration or by inhalation.

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