ES2535577A2

ES2535577A2 - METHOD FOR THE DIAGNOSIS OF VERTICILOSIS IN THE OLIVE TREE

Info

Publication number: ES2535577A2
Application number: ES201331633A
Authority: ES
Inventors: Francisco LUQUE VÁZQUEZ; Juan Bautista BARROSO ALBARRACÍN; Maria De La O LEYVA PÉREZ; Jesús MERCADO BLANCO
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad de Jaen
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad de Jaen
Priority date: 2013-11-08
Filing date: 2013-11-08
Publication date: 2015-05-12
Anticipated expiration: 2033-11-08
Also published as: ES2535577R1; ES2535577B1

Abstract

Método para el diagnóstico de verticilosis en el olivo. La presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos aislada del genoma del olivo que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 2, y que se sobreexpresa en respuesta a una infección por Verticillium spp. Por lo tanto, la invención se relaciona con un método para detectar la presencia de Verticillium spp. en un olivo que comprende determinar el nivel de expresión de dicha secuencia de nucleótidos o el nivel de proteína codificada por dicha secuencia en una muestra procedente de dicho olivo y, si dicha expresión es mayor que un valor de referencia, entonces se puede concluir que el olivo está infectado con Verticillosis spp., diagnosticando así verticilosis.Method for the diagnosis of verticilosis in the olive tree. The present invention relates to a nucleotide sequence isolated from the olive genome that encodes a protein that comprises an amino acid sequence with at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 2, and that is overexpressed in response to a Verticillium spp. infection Therefore, the invention relates to a method for detecting the presence of Verticillium spp. in an olive tree comprising determining the expression level of said nucleotide sequence or the level of protein encoded by said sequence in a sample from said olive tree and, if said expression is greater than a reference value, then it can be concluded that the olive tree is infected with Verticillosis spp., thus diagnosing verticilosis.

Description

5 La presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos del genoma del olivo y su uso en el diagnóstico de verticilosis. Por lo tanto, la presente invención se engloba dentro del campo fitosanitario. The present invention relates to a nucleotide sequence of the olive genome and its use in the diagnosis of verticillosis. Therefore, the present invention is It includes within the phytosanitary field.

ESTADO DE LA TÉCNICA STATE OF THE TECHNIQUE

10 El estado fitosanitario del olivar andaluz se enfrenta al reto del importante avance que la Verticilosis está teniendo en los últimos años. La pérdida de árboles por enfermedades producidas por patógenos del suelo, como la mencionada Verticilosis, causada por el hongo VerticilJium dahliae, o la denominada "seca" producida por 10 The phytosanitary state of the Andalusian olive grove faces the challenge of the important advance that Verticilosis is having in recent years. The loss of trees due to diseases caused by soil pathogens, such as the mentioned Verticilosis, caused by the fungus VerticilJium dahliae, or the so-called "dry" produced by

15 especies del género oomiceto Phytophthora, supone un coste importante para muchas explotaciones. No se dispone de métodos de detección precoz de estas enfermedades y, una vez producidas, determinar cuál ha sido el agente infeccioso es demasiado complejo como para que en la práctica se utilice de forma rutinaria. De esta forma lo más habitual es que cuando en una plantación se produce la pérdida de 15 species of the genus Phytophthora oomycete, represents an important cost for many farms. There are no methods for early detection of these diseases and, once they have been produced, determining which has been the infectious agent is too complex to be used routinely in practice. In this way, the most common is that when a plantation occurs the loss of

20 un olivo (si bien es más frecuente la afectación de varios) por alguna de estas patologías caracterizadas por síndromes parecidos y fácilmente confundibles, no se determine el agente causal de la enfermedad. 20 an olive tree (although the involvement of several is more frequent) due to any of these pathologies characterized by similar and easily confused syndromes, the causative agent of the disease is not determined.

Evidentemente, la ausencia de un diagnóstico exacto impide la correcta evaluación de Obviously, the absence of an exact diagnosis prevents the correct evaluation of

25 las causas y la toma adecuada de soluciones. Sin embargo, aun siendo importante determinar la causa por la que se secan los árboles en plantaciones afectadas, más importante aún es evitar la diseminación de material de plantación afectado aunque asintomático, ya que pueden estar introduciendo en nuevas plantaciones inóculos de los agentes etiológicos de estas enfermedades. Teniendo en cuenta la preocupante 25 causes and adequate solutions. However, although it is important to determine the cause for drying trees in affected plantations, more important is to avoid the spread of affected planting material although asymptomatic, since they may be introducing new inoculum plantations of the etiological agents of these diseases. Considering the worrying

30 expansión actual de la Verticilosis deberían extremarse las medidas para evitar la diseminación del patógeno a zonas no afectadas. En este sentido la calidad fitosanitaria de los plantones suministrados por los viveristas debería estar certificada mediante métodos diagnósticos fiables y lo suficientemente sencillos como para utilizarse de forma rutinaria en los árboles/plantones aparentemente sanos antes de The current expansion of Verticillosis should take measures to prevent the spread of the pathogen to unaffected areas. In this sense, the phytosanitary quality of seedlings supplied by nurseries should be certified by reliable diagnostic methods and simple enough to be routinely used in apparently healthy trees / seedlings before

35 ser vendidos a los agricultores. De hecho, esta necesidad se encuentra plasmada en el Real Decreto 1678/1999 , de 29 de octubre, por el que se modifica el Real Decreto 929/1995, de 9 de junio, por el que se aprueba el Reglamento técnico de control y certificación de plantas de vivero de frutales, Disposición Transitoria Única: Plantas madre de olivo, se determinan los patógenos para los que debe certificarse que las plantas de viveros están libres: Hongos: Verticillium dahliae; Bacterias: Pseudomonas 35 be sold to farmers. In fact, this need is embodied in Royal Decree 1678/1999, of October 29, which modifies Royal Decree 929/1995, of June 9, which approves the technical regulation of control and certification of fruit tree nursery plants, Single Transitory Provision: Olive mother plants, pathogens are determined for which it is necessary to certify that nursery plants are free: Fungi: Verticillium dahliae; Bacteria: Pseudomonas

5 savaslanoi (Tuberculosis); Virosis o similares: Mosaico del Arabis (ArMv), Enrollado del ciruelo (CLRV), Mosaico del pepino (CMV) y Virus latente de las manchas anulares de la fresa (SLRV). 5 savaslanoi (Tuberculosis); Virosis or similar: Arabis mosaic (ArMv), Plum curl (CLRV), Cucumber mosaic (CMV) and latent strawberry ring spot virus (SLRV).

No obstante, en la actualidad es difícil para los viveristas garantizar que las plantas However, it is currently difficult for nurseries to ensure that plants

10 que suministran están realmente libres de patógenos, especialmente en el caso de Verticillium dahliae. Esto se debe a que los métodos diagnósticos que existen necesitan de laboratorios muy especializados, son caros y no garantizan la detección precoz de la enfermedad, por lo que plantas aparentemente sanas, pero infectadas, pueden estar siendo distribuidas y contribuyendo a la dispersión de la enfermedad. 10 that they supply are really pathogen-free, especially in the case of Verticillium dahliae. This is because the diagnostic methods that exist need very specialized laboratories, they are expensive and do not guarantee the early detection of the disease, so apparently healthy, but infected plants may be distributed and contributing to the spread of the disease. .

15 Estos métodos están basados en la identificación del patógeno en medios de cultivo, o en procedimientos moleculares basados en distintos protocolos de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa ("polymerase chain reaction", PCR) (MercadoBlanco el al., 2001 .Plant Pathol. 50:609-619; Mercado-Blanco el al., 2002. European Journal of Plant Pathology 108: 1-13; Mercado-Blanco, J. el al. 2003. Plant Dis. 15 These methods are based on the identification of the pathogen in culture media, or on molecular procedures based on different protocols of the polymerase chain reaction (PCR) technique (MercadoBlanco el al., 2001 .Plant Pathol. 50: 609-619; Mercado-Blanco el al., 2002. European Journal of Plant Pathology 108: 1-13; Mercado-Blanco, J. el al. 2003. Plant Dis.

20 87:1487-1494; Morera, B., Páez, JI. , Vega JM., and Montes F. 2005. Comparación de métodos de diagnóstico de VerticilJium dahliae en olivo: Aislamiento en medio de cultivo y PCR. Bol. San. Veg. Plagas, 31 :267-275; Collado-Romero et al., 2009. Plant Pathology 58:515-526; López-Escudero, F.J. y Mercado-Blanco, J. 2011 . Plant Soil, 20 87: 1487-1494; Morera, B., Páez, JI. , Vega JM., And Montes F. 2005. Comparison of diagnostic methods for VerticilJium dahliae in olive trees: Isolation in culture medium and PCR. Bol. San. Veg. Pests, 31: 267-275; Collado-Romero et al., 2009. Plant Pathology 58: 515-526; López-Escudero, F.J. and Mercado-Blanco, J. 2011. Plant Soil,

344: 1-50). Entre las limitaciones de la PCR está el hecho de que en las épocas en las 344: 1-50). Among the limitations of the PCR is the fact that at times in the

25 que el hongo no es activo, como son el verano y el invierno, suelen dar falsos negativos (Morera el al. 2005, citado ad supra ), además de que al tratarse de procedimientos de PCR-"NESTED" (PCR secuencial o anidada), altamente sensible pero también fácilmente contaminable, supone una complicación más para su uso generalizado ya que se requiere de laboratorios especializados y personal con 25 that the fungus is not active, such as summer and winter, often give false negatives (Morera el al. 2005, cited ad supra), in addition to being PCR procedures - "NESTED" (sequential or nested PCR ), highly sensitive but also easily contaminable, is a further complication for widespread use since it requires specialized laboratories and personnel with

30 experiencia. En cuanto al diagnóstico/detección por métodos tradicionales (aislamiento e identificación en medios de cultivo microbiológicos), a pesar de ser de más fácil implementación, es más lento, ocasionalmente inconsistente, y ofrece resultados menos sensibles que la PCR. Por lo tanto, podemos concluir que el requerimiento de laboratorios especializados y personal cualificado para realizar el 30 experience As for the diagnosis / detection by traditional methods (isolation and identification in microbiological culture media), despite being easier to implement, it is slower, occasionally inconsistent, and offers less sensitive results than PCR. Therefore, we can conclude that the requirement of specialized laboratories and qualified personnel to perform the

35 diagnóstico de la verticilosis hace que en la práctica no se esté utilizando de forma habitual ningún método diagnóstico. The diagnosis of verticillosis means that in practice no diagnostic method is being used routinely.

Por lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de desarrollar nuevos Therefore, there is a need in the state of the art to develop new

métodos de diagnóstico de verticilosis que solventen los inconvenientes anteriormente methods of diagnosis of verticilosis that solve the problems previously

mencionados. mentioned.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN DESCRIPTION OF THE INVENTION

Los inventores de la presente invención han descubierto que cuando un olivo es infectado por Verlicillium spp., el agente causal de la verticilosis, se produce una 10 alteración en el perfil de expresión génica del olivo, en particular, se produce la sobreexpresión de un gen no descrito previamente en el estado de la técnica y que ha sido identificado en la presente invención como contig_172143. Para ello, los inventores realizaron un estudio transcriptómico de plantas de olivo en condiciones de estrés e inoculadas con Verlicillium dahliae mediante la secuenciación del ARN total 15 del olivo de estudio, y seleccionaron un ARN mensajero (ARNm) cuya expresión solo se observa en plantas inoculadas con V. dahliae (Ejemplo 1). El ADN complementario (ADNc) correspondiente a dicho ARNm se denominó contig_172143 y presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEO ID NO: 1. Por otro lado, la traducción de dicha secuencia de ARNm corresponde con una proteína que presenta la The inventors of the present invention have discovered that when an olive tree is infected by Verlicillium spp., The causative agent of verticillosis, an alteration in the gene expression profile of the olive tree occurs, in particular, overexpression of a gene occurs not previously described in the state of the art and which has been identified in the present invention as contig_172143. To do this, the inventors conducted a transcriptomic study of olive plants under stress conditions and inoculated with Verlicillium dahliae by sequencing the total RNA 15 of the study olive tree, and selected a messenger RNA (mRNA) whose expression is only observed in inoculated plants with V. dahliae (Example 1). The complementary DNA (cDNA) corresponding to said mRNA was named contig_172143 and has the nucleotide sequence shown in SEO ID NO: 1. On the other hand, the translation of said mRNA sequence corresponds to a protein that has the

20 secuencia de aminoácidos mostrada en la SEO ID NO: 2. 20 amino acid sequence shown in SEO ID NO: 2.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un marcador genético que permite detectar una infección por Verlicillium spp. en el olivo, permitiendo a su vez el diagnóstico de la verticillosis mucho antes de que aparezcan los primeros síntomas 25 asociados a dicha infección o cuando dicha infección está latente. Basado en este descubrimiento, los inventores han desarrollado un método de diagnóstico de la verticilosis en el olivo que solventa todos los inconvenientes que existen en el estado de la técnica , pues dicho método es más sensible y más rápido que los métodos tradicionales de cultivo del microorganismo, permite una detección precoz de Therefore, the present invention provides a genetic marker that allows to detect an infection by Verlicillium spp. in the olive tree, allowing in turn the diagnosis of verticillosis long before the first symptoms appear associated with said infection or when said infection is latent. Based on this discovery, the inventors have developed a method of diagnosis of verticillosis in the olive tree that solves all the inconveniences that exist in the state of the art, since this method is more sensitive and faster than the traditional methods of microorganism culture , allows early detection of

30 Verlicillium spp. (es decir, permite su detección en plantas asintomáticas) evitando así la diseminación del material infectado y evita la aparición de falsos negativos debido a que es posible detectar la presencia de Verlicillium spp. e incluso cuando el hongo está inactivo. 30 Verlicillium spp. (that is, it allows its detection in asymptomatic plants) thus preventing the spread of infected material and prevents the appearance of false negatives because it is possible to detect the presence of Verlicillium spp. and even when the fungus is inactive.

35 A continuación, se describe en detalle el método de diagnóstico desarrollado, así como otros aspectos inventivos derivados del mismo. 35 Next, the diagnostic method developed is described in detail, as well as other inventive aspects derived from it.

Secuencia de nucleótidos de la invención y sus usos Nucleotide sequence of the invention and its uses

Tal como se ha explicado previamente, los inventores de la presente invención han As previously explained, the inventors of the present invention have

5 descubierto que cuando una planta es infectada por VerticilJium spp., se produce la sobreexpresión de un nuevo gen, cuyo cONA se ha denominado contig_172143 (SEQ ID NO: 1), y que codifica para una proteína que presenta la secuencia SEO ID NO: 2. 5 discovered that when a plant is infected by VerticilJium spp., Overexpression of a new gene occurs, whose cONA has been called contig_172143 (SEQ ID NO: 1), and which codes for a protein that has the SEO ID NO sequence: 2.

Así, en un primer aspecto, la presente invención se relaciona con una secuencia de Thus, in a first aspect, the present invention relates to a sequence of

10 nucleótidos aislada, de aquí en adelante, secuencia de nucleótidos de la invención, que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia SEO ID NO: 2. 10 isolated nucleotides, hereinafter, the nucleotide sequence of the invention, which encodes a protein comprising an amino acid sequence that has at least 90% identity with the SEO ID NO: 2 sequence.

SEO ID NO: 2 15 MGCQIRLLMLFGTLISFASVVLSKQGTSVYYARPYLPSACYGNRNQGIMIAGANPTLYNGGKVC GRRYKVRCLGGTNKTPHPCKRGEITVKIVDLCPGCGANEINLSQDAFSRIANLKAGRVRIDYIQ SEO ID NO: 2 15 MGCQIRLLMLFGTLISFASVVLSKQGTSVYYARPYLPSACYGNRNQGIMIAGANPTLYNGGKVC GRRYKVRCLGGTNKTPHPCKRGEITVKIVDLCPGCGANEINLSQDAFSRIANLKQRVRIDY

V V

En la presente invención se entiende por gidentidad" o "identidad de secuencia" al In the present invention, "identity" or "sequence identity" is understood as

20 grado de similitud entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos obtenido mediante el alineamiento de las dos secuencias. Dependiendo del número de residuos comunes entre las secuencias alineadas, se obtendrá un grado de identidad expresado en tanto por ciento. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante 20 degree of similarity between two nucleotide or amino acid sequences obtained by aligning the two sequences. Depending on the number of common residues between the aligned sequences, a degree of identity expressed as a percentage will be obtained. The degree of identity between two amino acid sequences can be determined by conventional methods, for example, by

25 algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo BLAST [Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3):403-10)_ Los programas BLAST (BLASTN, BLASTX, y TBLASTX, BLASTP y TBLASTN) son de dominio público en la página web del Centro Nacional para la Información sobre Biotecnología o NCBI (National Center 25 standard sequence alignment algorithms known in the state of the art, such as BLAST [Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215 (3): 403-10) _ The BLAST programs (BLASTN, BLASTX, and TBLASTX, BLASTP and TBLASTN) are in the public domain on the website of the National Center for Biotechnology Information or NCBI (National Center

30 tor Biotechonology Information). 30 tor Biotechonology Information).

El experto en la materia entiende que las mutaciones en la secuencia de nucleótidos de los genes que dan lugar a sustituciones conservativas de aminoácidos en posiciones no críticas para la funcionalidad de la proteína, son mutaciones 35 evolutivamente neutras que no afectan a su estructura global ni a su funcionalidad. Dichas variantes caen dentro del ámbito de la presente invención. Están incluidas The person skilled in the art understands that mutations in the nucleotide sequence of genes that give rise to conservative amino acid substitutions at positions not critical to protein functionality are evolutionarily neutral mutations that do not affect their overall structure or its functionality Such variants fall within the scope of the present invention. They are included

también dentro del ámbito de la invención aquellas variantes de la secuencia de aminoácidos que presenten inserciones, deleciones o modificaciones de uno o más aminoácidos respecto a dicha SEO ID NO: 2, y conserven, además, la misma característica que dicha secuencia SEO ID NO: 2, es decir, que su presencia en la also within the scope of the invention those variants of the amino acid sequence that present insertions, deletions or modifications of one or more amino acids with respect to said SEO ID NO: 2, and also retain the same characteristic as said SEO ID NO sequence: 2, that is, its presence in the

5 célula es el resultado de la sobreexpresión del gen que la codifica como respuesta a una infección por V. dahliae. 5 cell is the result of overexpression of the gene that encodes it in response to an infection with V. dahliae.

En una realización particular, la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95%, 10 en particular al menos un 98%, más en particular, al menos un 99% de identidad con la secuencia SEO ID NO: 2. In a particular embodiment, the protein encoded by the nucleotide sequence of the invention comprises an amino acid sequence having at least 95%, in particular at least 98%, more particularly, at least 99% identity with the SEO ID sequence NO: 2.

En otra realización todavía más particular, la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 15 100% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 2. In another even more particular embodiment, the protein encoded by the nucleotide sequence of the invention comprises an amino acid sequence that has a 100% identity with the sequence SEQ ID NO: 2.

Por otro lado, en otra realización particular, la secuencia de nucleótidos de la invención puede ser ARN o ADNc On the other hand, in another particular embodiment, the nucleotide sequence of the invention can be RNA or cDNA.

20 Como sabe el experto en la materia, el ADNc es el resultado de la retrotranscripción del ARNm. En la presente invención, el ADNc resultante de la transcripción de la secuencia SEO ID NO: 2, comprende la secuencia de nucleótidos SEO ID NO: 1. 20 As the person skilled in the art knows, cDNA is the result of the retrotranscription of mRNA. In the present invention, the cDNA resulting from the transcription of the SEO ID NO: 2 sequence, comprises the SEO ID NO: 1 nucleotide sequence.

Por lo tanto, en una realización particular, la secuencia de nucleótidos de la invención Therefore, in a particular embodiment, the nucleotide sequence of the invention

25 es ADNc que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95% de identidad con la secuencia SEO ID NO: 1, siendo dicha secuencia SEO ID NO: la secuencia de nucleótidos denominada contig_172143. 25 is cDNA comprising a nucleotide sequence with at least 90%, preferably at least 95% identity with the SEO ID NO: 1 sequence, said SEO sequence being NO: the nucleotide sequence called contig_172143.

30 SEO ID NO: 1:

ATGGGCTGTCAAATTCGACTTCTTATGTTGTTTGGCACGTTGATAAGTTTTGCCTCAGTTGTAC TTTCTAAGCAGGGAACTTCTGTTTACTATGCTCGACCTTATCTTCCCTCGGCATGCTATGGCAA CCGAAACCAAGGCATCATGATAGCAGG TGC TAATCCTACATTG TACAATGG TGGAAAAG TATG T GGAAGAAGGTATAAAGTTAGGTGCTTGGGAGGCACCAACAAAACACCACATCCTTGCAAAAGGG 35 GTGAAATAAC TGTAAAAATTGTAGATCTTTGCCCAGGCTGTGGAGCAAACGAGATTAATCTATC ATGGGCTGTCAAATTCGACTTCTTATGTTGTTTGGCACGTTGATAAGTTTTGCCTCAGTTGTAC TTTCTAAGCAGGGAACTTCTGTTTACTATGCTCGACCTTATCTTCCCTCGGCATGCTATGGCAA CCGAAACCAAGGCATCATGATAGCAGG TGC TAATCCTACATTG TACAATGG TGGAAAAG TATG T GGAAGAAGGTATAAAGTTAGGTGCTTGGGAGGCACCAACAAAACACCACATCCTTGCAAAAGGG 35 GTGAAATAAC TGTAAAAATTGTAGATCTTTGCCCAGGCTGTGGAGCAAACGAGATTAATCTATC

TCAAGATGCCTTCTCGAGGATTGCTAATCTTAAGGCTGGAAGAGTCCGCATCGACTATATCCAG GTTTGA TCAAGATGCCTTCTCGAGGATTGCTAATCTTAAGGCTGGAAGAGTCCGCATCGACTATATCCAG GTTTGA

El significado del término "identidad" o "identidad de secuencia" ha sido definido en 5 párrafos anteriores. The meaning of the term "identity" or "sequence identity" has been defined in 5 previous paragraphs.

Así, en una realización particular, la secuencia de nucleótidos de la invención es un Thus, in a particular embodiment, the nucleotide sequence of the invention is a

ADNc que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 96, 97 o 98%, CDNA comprising a nucleotide sequence with at least 96, 97 or 98%,

en particular, al menos un 99% de identidad con la secuencia SEO ID NO: 1. En otra in particular, at least 99% identity with the SEO ID sequence NO: 1. In another

10 realización todavía más particular, la secuencia de nucleótidos de la invención es un ADNc que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 100% de identidad con la secuencia SEO ID NO: 1. Even more particularly, the nucleotide sequence of the invention is a cDNA comprising a nucleotide sequence with at least 100% identity with the SEO ID NO: 1 sequence.

Como entiende el experto en la materia, la secuencia de nucleótidos de la invención As the person skilled in the art understands, the nucleotide sequence of the invention

15 puede presentar a ambos lados otras secuencias de nucleótidos que pueden corresponder a regiones o zonas no codificantes de la proteína (regiones/zonas UTR). Así, en otra realización particular, la secuencia de nucleótidos de la invención comprende covalentemente unida a su extremo 5' la secuencia SEO ID NO: 3 y/o operativamente unida a su extremo 3' la secuencia SEO ID NO: 4. 15 may present on both sides other nucleotide sequences that may correspond to regions or non-coding regions of the protein (UTR regions / regions). Thus, in another particular embodiment, the nucleotide sequence of the invention comprises covalently linked to its 5 'end the SEO ID NO: 3 sequence and / or operably linked to its 3' end the SEO ID NO: 4 sequence.

SEO ID NO: 3: SEO ID NO: 3:

GGCCACTAGTACTTCAAACATACAGAGA GGCCACTAGTACTTCAAACATACAGAGA

SEO ID NO: 4: SEO ID NO: 4:

GGCAATTTARTATGRGAAAGTAAAAAAATTTCGATGCTATTCTAAATAAGCTTTTTATAGTATG GGCAATTTARTATGRGAAAGTAAAAAAATTTCGATGCTATTCTAAATAAGCTTTTTATAGTATG

25 GCTCATGCAAAATATATAATCTAGCACTAGTTGAATAAGAAATTAGACAGAAATCTATTTTAGA TGTTAGT 25 GCTCATGCAAAATATATAATCTAGCACTAGTTGAATAAGAAATTAGACAGAAATCTATTTTAGA TGTTAGT

En otra realización particular, la secuencia de nucleótidos de la invención comprende una secuencia de nucleótidos SEO ID NO: 5, que corresponde a la secuencia de In another particular embodiment, the nucleotide sequence of the invention comprises a nucleotide sequence SEO ID NO: 5, which corresponds to the sequence of

30 nucleótidos que comprende tanto la región codificante como las no codificantes de la proteína. 30 nucleotides comprising both the coding and non-coding regions of the protein.

La secuencia de nucleótidos de la invención puede estar contenida dentro de una construcción génica. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con una The nucleotide sequence of the invention may be contained within a gene construct. Thus, in another aspect, the invention relates to a

35 construcción génica, de aquí en adelante, construcción génica de la invención, que comprende la secuencia de nucleótidos de la invención operativa mente unida a una secuencia reguladora de la expresión. Gene construct, hereinafter, gene construct of the invention, comprising the nucleotide sequence of the invention operatively linked to an expression regulatory sequence.

La secuencia reguladora de la expresión está operativamente unida a la secuencia de The regulatory sequence of the expression is operatively linked to the sequence of

5 nucleótidos de la invención, es decir, que dicha secuencia está dentro del marco de lectura correcto para su expresión bajo el control de dichas secuencias reguladoras. Las secuencias reguladoras útiles para la presente invención pueden ser secuencias promotoras nucleares o, alternativamente, secuencias potenciadoras y/u otras secuencias reguladoras que ayudan a la expresión de la secuencia de nucleótidos de 5 nucleotides of the invention, that is, said sequence is within the correct reading frame for expression under the control of said regulatory sequences. The regulatory sequences useful for the present invention may be nuclear promoter sequences or, alternatively, enhancer sequences and / or other regulatory sequences that aid in the expression of the nucleotide sequence of

10 la invención. Asimismo, la secuencia promotora puede proceder del mismo organismo que la secuencia de nucleótidos de la invención, es decir, de Olea europaea, o puede proceder de un organismo distinto, en cuyo caso se trata de una secuencia reguladora de la expresión heteróloga. Así, en una realización particular, dicha secuencia reguladora de la expresión es heteróloga respecto a la secuencia de nucleótidos de la 10 the invention. Likewise, the promoter sequence can come from the same organism as the nucleotide sequence of the invention, that is, from Olea europaea, or it can come from a different organism, in which case it is a regulatory sequence of heterologous expression. Thus, in a particular embodiment, said expression regulatory sequence is heterologous with respect to the nucleotide sequence of the

15 invención. 15 invention.

Las secuencias promotoras nucleares o promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Si se desea la expresión constante de la secuencia de nucleótidos, entonces se usa un promotor constitutivo. Ejemplos de promotores constitutivos muy conocidos 20 incluyen, sin limitar a, los derivados de los genomas de virus eucariotas tales como el virus del polioma, adenovirus, SV40, CMV, virus del sarcoma aviar, virus de la hepatitis 8, el promotor del gen de la metalotioneina, el promotor del gen de la timidina kinasa del virus del herpes simplex, regiones LTR de los retrovirus, el promotor del gen de la inmunoglobuina, el promotor del gen de la actina y el promotor del gen EF-1alfa. Nuclear promoter sequences or promoters can be constitutive or inducible. If constant expression of the nucleotide sequence is desired, then a constitutive promoter is used. Examples of well-known constitutive promoters 20 include, but are not limited to, those derived from eukaryotic virus genomes such as polyoma virus, adenovirus, SV40, CMV, avian sarcoma virus, hepatitis 8 virus, the gene promoter metallothionein, the herpes simplex virus thymidine kinase gene promoter, LTR regions of retroviruses, the immunoglobuin gene promoter, the actin gene promoter and the EF-1alfa gene promoter.

25 Ejemplos de promotores inducibles en los que la expresión de la proteína depende de la adición de una molécula o de una señal exógena, incluyen, sin limitar a, el sistema tetraciclina, el sistema NFkappa8/luz UV, el sistema Cre/Lox y el promotor de los genes de choque térmico. Examples of inducible promoters in which protein expression depends on the addition of a molecule or an exogenous signal, include, but is not limited to, the tetracycline system, the NFkappa8 / UV light system, the Cre / Lox system and the promoter of heat shock genes.

30 Por otro lado, la construcción génica de la invención puede comprender secuencias que codifiquen marcadores de selección, orígenes de replicación, etc. Los marcadores de selección son ampliamente conocidos en el estado de la técnica. Estos marcadores de selección o genes de selección pueden ser genes de resistencia a antibióticos, genes reporteros, como el gen que codifica la beta-Galactosidasa del operón lactosa, On the other hand, the gene construct of the invention may comprise sequences encoding selection markers, origins of replication, etc. Selection markers are widely known in the state of the art. These selection markers or selection genes may be antibiotic resistance genes, reporter genes, such as the gene that encodes the lactose operon beta-Galactosidase,

35 etc. Ejemplos de genes de resistencia a antibióticos son, por ejemplo, genes de resistencia a beta-Iactámicos (penicilinas, cefalosporinas, etc), a eritromicina, a kanamicina, a neomicina, a gentamicina etc. Entre las penicilinas podemos encontrar, entre otros, bencilpenicilina, ampicilina, amoxicilina, etc. 35 etc. Examples of antibiotic resistance genes are, for example, beta-lactam resistance genes (penicillins, cephalosporins, etc.), erythromycin, kanamycin, neomycin, gentamicin etc. Among the penicillins we can find, among others, benzylpenicillin, ampicillin, amoxicillin, etc.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector, de aquí en adelante vector In another aspect, the invention relates to a vector, hereafter vector

5 de la invención, que comprende una secuencia de nucleótidos o una construcción génica según la presente invención. La obtención de dicho vector puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia. 5 of the invention, comprising a nucleotide sequence or a construct gene according to the present invention. Obtaining said vector can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art.

En general, un vector de expresión comprende, además de la secuencia de In general, an expression vector comprises, in addition to the sequence of

10 nucleótidos de la invención, un promotor que dirige su transcripción (por ejemplo, pT7, plac, ptrc, plac, pBAD, ret, etc.) al que está operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas que controlan y regulan dicha transcripción y, en su caso, la traducción del producto de interés, por ejemplo, señales de inicio y terminación de transcripción (tIt2, etc.), señal de poliadenilación, origen de replicación, 10 nucleotides of the invention, a promoter that directs its transcription (eg, pT7, plac, ptrc, plac, pBAD, ret, etc.) to which it is operatively linked, and other necessary or appropriate sequences that control and regulate said transcription and , where appropriate, the translation of the product of interest, for example, transcription initiation and termination signals (tIt2, etc.), polyadenylation signal, origin of replication,

15 secuencias de unión a ribosomas (RBS), secuencias codificantes de reguladores transcripcionales, (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), represores, etc. Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso. La elección del vector dependerá de la célula huésped y del tipo de uso que se quiera realizar. Por ejemplo, dicho vector 15 ribosome binding sequences (RBS), coding sequences of transcriptional regulators, (enhancers), transcriptional silencers (silencers), repressors, etc. Examples of appropriate expression vectors can be selected according to the conditions and needs of each case. The choice of the vector will depend on the host cell and the type of use to be performed. For example, said vector

20 puede ser un vector viral (adenovirus, virus asociados a los adenovirus así como retrovirus y, en particular, lentivirus) o no viral (pcONA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFI/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6N5-His, pVAXI, pZeoSV2, pCI, pSVL and pKSV-10, pBPV-1 , pML2d Y pTDTI). 20 can be a viral vector (adenovirus, adenovirus-associated viruses as well as retroviruses and, in particular, lentiviruses) or non-viral (pcONA3, pHCMV / Zeo, pCR3.1, pEFI / His, pIND / GS, pRc / HCMV2, pSV40 / Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6N5-His, pVAXI, pZeoSV2, pCI, pSVL and pKSV-10, pBPV-1, pML2d and pTDTI).

25 En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula que comprende la secuencia de nucleótidos, la construcción génica o el vector de la invención. Prácticamente cualquier célula huésped (tanto eucariota como procariota) puede usarse en el contexto de la presente invención (por ejemplo células animales, levaduras, células vegetales, etc.) y obtenerse mediante procedimientos convencionales conocidos por In another aspect, the invention relates to a cell comprising the nucleotide sequence, the gene construct or the vector of the invention. Virtually any host cell (both eukaryotic and prokaryotic) can be used in the context of the present invention (for example animal cells, yeasts, plant cells, etc.) and obtained by conventional methods known by

30 expertos en la materia. 30 experts in the field.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una planta que comprende una In another aspect, the invention relates to a plant comprising a

secuencia de nucleótidos, una construcción génica, un vector o una célula según la nucleotide sequence, a gene construct, a vector or a cell according to the

presente invención. Preferiblemente, dicha planta pertenece al género Olea spp., más present invention Preferably, said plant belongs to the genus Olea spp., More

35 preferiblemente, Olea europaea. 35 preferably, Olea europaea.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una secuencia de aminoácidos, de aquí en adelante, secuencia de aminoácidos de la invención, codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención. En una realización particular, la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos SEO ID NO: 2. In another aspect, the invention relates to an amino acid sequence, hereinafter, the amino acid sequence of the invention, encoded by the nucleotide sequence of the invention. In a particular embodiment, the amino acid sequence comprises the amino acid sequence SEO ID NO: 2.

SEO ID NO: 2 SEO ID NO: 2

MGCQIRLLMLFGTLISFASVVLSKQGTSVYYARPYLPSACYGNRNQGIMIAGANPTLYNGGKVC GRRYKVRCLGGTNKTPHPCKRGEITVKIVDLCPGCGANEINLSQDAFSRIANLKAGRVRIDYIQ MGCQIRLLMLFGTLISFASVVLSKQGTSVYYARPYLPSACYGNRNQGIMIAGANPTLYNGGKVC GRRYKVRCLGGTNKTPHPCKRGEITVKIVDLCPGCGANEINLSQDAFSRIANLKAGRVRIDYIQ

Como se ha explicado previamente, la presente invención se basa en que cuando un olivo es infectado por Verlicillium spp. , se produce una alteración en el perfil de expresión génica del olivo, en particular, se produce la sobreexpresión de la secuencia de nucleótidos de la invención, pudiendo emplear dicha secuencia como un marcador genético que permite detectar una infección por Verficillium spp. en el olivo o, lo que es lo mismo, diagnosticar verticilosis en el olivo. As explained previously, the present invention is based on the fact that when an olive tree is infected by Verlicillium spp. , there is an alteration in the gene expression profile of the olive tree, in particular, overexpression of the nucleotide sequence of the invention occurs, said sequence being able to be used as a genetic marker that allows to detect an infection by Verficillium spp. in the olive tree or, what is the same, diagnose verticillosis in the olive tree.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso in vitro de la secuencia de nucleótidos, la construcción génica, el vector, o la secuencia de aminoácidos de la invención como marcador de diagnóstico para la verticilosis del olivo. Therefore, in another aspect, the invention relates to the in vitro use of the nucleotide sequence, the gene construct, the vector, or the amino acid sequence of the invention as a diagnostic marker for olive verticillosis.

En una realización particular, la verticilosis del olivo es causada por una infección de Verficilium spp., en particular, por una infección de Verlicillium dahliae. In a particular embodiment, the verticillosis of the olive tree is caused by an infection of Verficilium spp., In particular, by an infection of Verlicillium dahliae.

En otra realización particular, la secuencia de nucleótidos está sobreexpresada respecto a un valor de referencia, o la secuencia de aminoácidos está en una alta concentración respecto a un valor de referencia. In another particular embodiment, the nucleotide sequence is overexpressed with respect to a reference value, or the amino acid sequence is in a high concentration with respect to a reference value.

Los detalles sobre cómo usar la secuencia de nucleótidos de la invención para detectar la infección por Verlicillium sp. en el olivo se describirán a continuación en el método de la invención. Details on how to use the nucleotide sequence of the invention to detect infection by Verlicillium sp. in the olive tree they will be described below in the method of the invention.

Método de la invención Invention Method

Tal como se ha descrito en el apartado anterior, la presente invención se basa en el hecho de que el olivo, en respuesta a una infección por Verticillium spp., cambia su As described in the previous section, the present invention is based on the fact that the olive tree, in response to a Verticillium spp. Infection, changes its

5 patrón de expresión génica produciéndose la sobreexpresión de un nuevo gen que codifica la proteína que comprende la secuencia SEO ID NO: 2 y cuyo AONc ha sido aqui identificado como contig_172143 (SEO ID NO: 1). Por lo tanto, dicha sobreexpresión es indicativa de que el olivo ha sido infectado por Verlicillium spp., 5 gene expression pattern resulting in the overexpression of a new gene that encodes the protein that comprises the SEO ID NO: 2 sequence and whose AONc has been identified here as contig_172143 (SEO ID NO: 1). Therefore, said overexpression is indicative that the olive tree has been infected by Verlicillium spp.,

pudiendo emplear dicho gen como un marcador de la infección. The gene can be used as a marker of infection.

10 Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para detectar la presencia de Verlicillium spp. en un olivo, de aquí en adelante, método de la invención, que comprende: a) determinar el nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos de la invención o el Therefore, in another aspect, the invention relates to an in vitro method for detecting the presence of Verlicillium spp. in an olive tree, hereinafter, method of the invention, comprising: a) determining the level of expression of the nucleotide sequence of the invention or the

15 nivel de la secuencia de aminoácidos de la invención en una muestra biológica procedente de dicho olivo; y b) comparar el nivel de expresión obtenida en el apartado a) con un valor de referencia. 15 level of the amino acid sequence of the invention in a biological sample from said olive tree; and b) compare the level of expression obtained in section a) with a reference value.

20 En una primera etapa (etapa a)], el método de la invención comprende determinar el nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos de la invención o el nivel de la secuencia de aminoácidos de la invención (proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención) en una muestra biológica procedente de un olivo. In a first stage (step a)], the method of the invention comprises determining the level of expression of the nucleotide sequence of the invention or the level of the amino acid sequence of the invention (protein encoded by the nucleotide sequence of the invention) in a biological sample from an olive tree.

25 En la presente invención, se entiende por "muestra biológica" a cualquier muestra que sea susceptible de contener AON. Así, muestras biológicas procedentes de un olivo incluyen, pero no se limitan a, muestras de raíces, hojas, corteza, ramas, yemas y brotes. Así, en una realización particular del método de la invención, la muestra biológica procede de una hoja, del tronco, de la corteza o de la raíz del olivo. In the present invention, "biological sample" means any sample that is capable of containing AON. Thus, biological samples from an olive tree include, but are not limited to, samples of roots, leaves, bark, branches, buds and buds. Thus, in a particular embodiment of the method of the invention, the biological sample comes from a leaf, the trunk, the bark or the root of the olive tree.

El olivo (Olea europaea) es un árbol perennifolio, longevo, que puede alcanzar hasta 15 m de altura, con copa ancha y tronco grueso, retorcido y a menudo muy corto, que limita su área de distribución preferentemente a zonas de clima mediterráneo. El método de la invención puede llevarse a cabo sobre cualquier subespecie de olivo, The olive tree (Olea europaea) is a long-lived evergreen tree, which can reach up to 15 m high, with a broad crown and thick trunk, twisted and often very short, which limits its range preferably to Mediterranean climate areas. The method of the invention can be carried out on any olive subspecies,

35 tales como Olea europaea subsp. europaea, Olea europaea subsp. europaea var. Sylvestris, O. europaea subsp. cuspidata , O. europaea subsp. guanchica, O. europaea 35 such as Olea europaea subsp. europaea, Olea europaea subsp. Europaea var. Sylvestris, O. europaea subsp. cuspidata, O. europaea subsp. Guanchica, O. Europaea

subsp. cerasiformis, O. europaea subsp. maroccana, O. europaea subsp. laperrinei, etc., o sobre cualquier variedad del olivo. Ejemplos de variedades de olivo incluyen, sin limitar a, Picual o Marteña o Lopereña o Nevadillo blanco, Picudo, Hojiblanca, Verdial, Arbequina, Empeltre, Cornicabra, Lechín, Manzanilla, Gordal, Morona o subsp. cerasiformis, O. europaea subsp. maroccana, O. europaea subsp. laperrinei, etc., or on any variety of the olive tree. Examples of olive varieties include, without limitation, Picual or Marteña or Lopereña or Nevadillo blanco, Picudo, Hojiblanca, Verdial, Arbequina, Empeltre, Cornicabra, Lechín, Chamomile, Gordal, Morona or

5 Dulzal, Budiega o Morcaleña y Cornezuelo. 5 Dulzal, Budiega or Morcaleña and Cornezuelo.

Asimismo, el olivo objeto del método de diagnóstico de la invención puede encontrarse en cualquier estadío de desarrollo, es decir, puede ser un plantón o un olivo adulto. Likewise, the olive tree object of the diagnostic method of the invention can be found at any stage of development, that is, it can be a seedling or an adult olive tree.

10 El nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos de la invención puede determinarse midiendo el ARNm resultante de la transcripción de la secuencia de la invención o, alternativamente, a partir del ADNc obtenido a partir del ARNm. Para ello, es necesario extraer el ácido nucleico de la muestra biológica del olivo. The expression level of the nucleotide sequence of the invention can be determined by measuring the mRNA resulting from the transcription of the sequence of the invention or, alternatively, from the cDNA obtained from the mRNA. For this, it is necessary to extract the nucleic acid from the biological sample of the olive tree.

15 La extracción del ácido nucleico puede llevarse a cabo por técnicas estándar ampliamente conocidas por el experto en la materia. La muestra biológica se puede tratar para disgregar de forma física o mecánica la estructura del tejido o la célula, liberando los componentes intracelulares en una solución acuosa u orgánica. En The nucleic acid extraction can be carried out by standard techniques widely known to those skilled in the art. The biological sample can be treated to physically or mechanically disintegrate the structure of the tissue or cell, releasing the intracellular components in an aqueous or organic solution. In

20 general, la extracción del ácido nucleico consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido, y otra de purificación, que implica la retirada de la solución final de los elementos contaminantes, es decir, aquellos que no son ácido nucleico. In general, the extraction of the nucleic acid consists of a lysis stage, which consists in breaking the structures that confine the cytoplasm and releasing its contents to the environment, and another one of purification, which implies the withdrawal of the final solution of the contaminating elements, that is, those that are not nucleic acid.

25 La extracción de ARN es más compleja que la del ADN debido a la alta estabilidad y actividad de las ribonucleasas, enzimas que degradan el ARN. Por tanto, es muy importante trabajar con materiales y productos libres de ribonucleasas. El primer paso para el aislamiento del ARN comprende, por ejemplo, en la lisis de las células en un medio químico que destruya las ribonucleasas, como el tiocianato de guanidinio. 25 RNA extraction is more complex than that of DNA due to the high stability and activity of ribonucleases, enzymes that degrade RNA. Therefore, it is very important to work with ribonuclease-free materials and products. The first step for RNA isolation comprises, for example, in the lysis of cells in a chemical medium that destroys ribonucleases, such as guanidinium thiocyanate.

30 Posteriormente, el ARN es separado de las demás macromoléculas en un gradiente, por ejemplo, de cloruro de cesio, precipitado con isopropanol, lavado con etanol al 75% y resuspendido en una solución acuosa. Subsequently, the RNA is separated from the other macromolecules in a gradient, for example, of cesium chloride, precipitated with isopropanol, washed with 75% ethanol and resuspended in an aqueous solution.

Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de 35 la invención para detectar y cuantificar los niveles de ARNm codificado por la secuencia de nucleótidos de la invención o de su ADNc correspondiente. A modo Virtually any conventional method can be used within the framework of the invention to detect and quantify mRNA levels encoded by the nucleotide sequence of the invention or its corresponding cDNA. By way

ilustrativo, no limitativo, los niveles de ARNm pueden ser cuantificados mediante el empleo de métodos convencionales, por ejemplo, métodos que comprenden la amplificación del ARNm y la cuantificación del producto de la amplificación de dicho ARNm, tales como electroforesis y tinción, o alternativamente, northern blot y empleo 5 de sondas específicas del ARNm de la secuencia de interés o de su ADNc correspondiente, mapeo con la nucleasa S1 , RT-LCR, hibridación, microarrays, etc. Análogamente, los niveles del ADNc correspondiente a dichos ARNm codificados por la secuencia de nucleótidos de la invención también pueden ser cuantificados mediante el empleo de técnicas convencionales; en este caso, el método de la Illustrative, not limiting, mRNA levels can be quantified by use of conventional methods, for example, methods comprising the mRNA amplification and quantification of the amplification product of said MRNA, such as electrophoresis and staining, or alternatively, northern blot and use 5 of specific probes of the mRNA of the sequence of interest or its cDNA corresponding, mapping with nuclease S1, RT-LCR, hybridization, microarrays, etc. Similarly, the cDNA levels corresponding to said mRNAs encoded by The nucleotide sequence of the invention can also be quantified through the use of conventional techniques; in this case, the method of

10 invención incluye una etapa de síntesis del correspondiente ADNc mediante transcripción inversa (RT) del ARNm correspondiente seguida de amplificación y cuantificación del producto de la amplificación de dicho ADNc. The invention includes a step of synthesis of the corresponding cDNA by reverse transcription (RT) of the corresponding mRNA followed by amplification and quantification of the amplification product of said cDNA.

Alternativamente al ARNm, en la puesta en práctica del método de la invención, Alternatively to mRNA, in the practice of the method of the invention,

15 también puede determinarse el nivel de la secuencia de aminoacidos de la invención, es decir, de la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención, para detectar la presencia de Verlicillium spp. en un olivo. The level of the amino acid sequence of the invention, that is, of the protein encoded by the nucleotide sequence of the invention, can also be determined to detect the presence of Verlicillium spp. In an olive tree

Para ello, primero es necesario extraer las proteínas de las células, lo que puede To do this, it is first necessary to extract the proteins from the cells, which can

20 realizarse mediante técnicas convencionales ampliamente conocidas por el experto en la materia, como rotura de las células para liberar las componentes celulares [macerado en mortero y pistilo, congelación, sonicación, lisis por métodos químicos (detergentes) o enzimáticos (Iisozima)] y la posterior centrifugación. 20 be carried out by conventional techniques widely known to the person skilled in the art, such as breaking the cells to release the cellular components [macerated in mortar and pistil, freezing, sonication, lysis by chemical (detergent) or enzymatic (Iisozyme)] methods and the subsequent centrifugation.

25 En la presente invención se entiende por "el nivel de la secuencia de aminoacidos de la invención" a la concentración o cantidad de la secuencia de aminoacidos (o proteína) codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención que esta presente una muestra biológica. The present invention means "the level of the amino acid sequence of the invention" at the concentration or amount of the amino acid sequence (or protein) encoded by the nucleotide sequence of the invention that a biological sample is present.

30 El nivel de la secuencia de aminoácidos de la invención puede ser cuantificado mediante cualquier método convencional que permita detectar y cuantificar dichas proteínas en una muestra . A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de dichas proteínas pueden cuantificarse, por ejemplo, mediante el empleo de anticuerpos con capacidad de unirse a dichas proteínas (o a fragmentos de las mismas que contenga The level of the amino acid sequence of the invention can be quantified by any conventional method that allows detecting and quantifying said proteins in a sample. By way of illustration, not limitation, the levels of said proteins can be quantified, for example, by the use of antibodies capable of binding to said proteins (or fragments thereof containing

35 un determinante antigénico) y la posterior cuantificación de los complejos formados. Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no. 35 an antigenic determinant) and the subsequent quantification of the complexes formed. The antibodies used in these assays may or may not be labeled.

Ejemplos ilustrativos de marcadores que se pueden utilizar incluyen isótopos radiactivos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos Illustrative examples of markers that can be used include radioactive isotopes, enzymes, fluorophores, chemiluminescent reagents, enzyme substrates

o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes, etc. Existe una amplia variedad de ensayos conocidos que se pueden utilizar en la presente invención, que 5 utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados {anticuerpo secundario); entre estas técnicas se incluyen el Western-blot o transferencia Western, ELlSA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), RIA {radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo enzimático competitivo), DASELlSA (ELlSA sandwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e or cofactors, enzyme inhibitors, particles, dyes, etc. There is a wide variety of known assays that can be used in the present invention, which use unlabeled antibodies (primary antibody) and labeled antibodies {secondary antibody); These techniques include Western blotting or Western blotting, ELlSA (enzyme-linked immunosorbent assay), RIA {radioimmunoassay), competitive EIA (competitive enzyme immunoassay), DASELlSA (ELlSA sandwich with double antibody), immunocytochemical techniques and

10 inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar dicha proteína, incluyen técnicas de cromatografia de afinidad, ensayos de unión a ligando, etc. 10 immunohistochemicals, techniques based on the use of biochips or microarrays of proteins that include specific antibodies or tests based on colloidal precipitation in formats such as dipsticks. Other ways to detect and quantify said protein, include affinity chromatography techniques, ligand binding assays, etc.

15 Por lo tanto, en una realización particular, el que el nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos se lleva a cabo mediante northern blotting o PCR cuantitativa, yel nivel del proteína codificada por la secuencia de la invención el mediante Western blotting. Therefore, in a particular embodiment, the level of expression of the nucleotide sequence is carried out by northern blotting or quantitative PCR, and the level of the protein encoded by the sequence of the invention is by Western blotting.

20 Una vez que se ha determinado el nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos de la invención o el nivel de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención, se procede a llevar a cabo la etapa b) del método, que comprende comparar el nivel obtenido en la etapa a) del método con una valor de referencia. Once the level of expression of the nucleotide sequence of the invention or the level of the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence of the invention has been determined, step b) of the method is carried out, which comprises comparing the level obtained in step a) of the method with a reference value.

25 En la presente invención, se entiende por "valor de referencia" al nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos de la invención o al nivel de proteína (secuencia de aminoácidos) codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención en un olivo sano, es decir, un olivo no infectado por Verlicillium spp. In the present invention, "reference value" is understood as the level of expression of the nucleotide sequence of the invention or the level of protein (amino acid sequence) encoded by the nucleotide sequence of the invention in a healthy olive tree, that is, an olive tree not infected by Verlicillium spp.

30 Tras comparar ambos niveles de expresión o niveles de proteína, se puede concluir que si el nivel de expresión obtenido en el apartado a) es mayor que el valor de referencia, entonces el olivo está infectado por VerticiJ/ium spp., en particular, VerticiIJium dahliae. 30 After comparing both levels of expression or protein levels, it can be concluded that if the level of expression obtained in section a) is greater than the reference value, then the olive tree is infected by VerticiJ / ium spp., In particular, VerticiIJium dahliae.

Kit de la invención Invention kit

Adicionalmente, la invención se relaciona con un kit para la puesta en práctica del método de la invención, es decir, que comprende los reactivos útiles para detectar los 5 niveles de expresión de la secuencia de nucleótidos de la invención o los niveles de proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención. Additionally, the invention relates to a kit for the implementation of the method of the invention, that is, comprising the reagents useful for detecting the 5 levels of expression of the nucleotide sequence of the invention or the levels of protein encoded by the nucleotide sequence of the invention.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un kit, de aquí en adelante, kit de la invención, que comprende Therefore, in another aspect, the invention relates to a kit, hereinafter, kit of the invention, comprising

10 Una pareja de cebadores específicos de la secuencia de nucleótidos de la invención, Una sonda de ácido nucleico diseñada de forma específica para hibridar con la secuencia de nucleótidos de la invención, y/o Un anticuerpo específico del péptido o proteína codificada por la secuencia de A pair of specific primers of the nucleotide sequence of the invention, a nucleic acid probe specifically designed to hybridize with the nucleotide sequence of the invention, and / or a specific antibody of the peptide or protein encoded by the sequence of

15 nucleótidos de la invención. 15 nucleotides of the invention.

Por "kit" se entiende, en el contexto de la presente invención, un producto que "Kit" means, in the context of the present invention, a product that

contiene los diferentes reactivos para poner en práctica el método de la invención, it contains the different reagents to practice the method of the invention,

empaquetados para permitir su transporte y almacenamiento. Materiales adecuados packaged to allow transport and storage. Suitable materials

20 para el empaquetamiento de los componentes del kit incluyen, sin limitar a, cristal, plástico (polietileno, polipropileno, policarbonato y similares), botellas, viales, papel, sobres y similares. 20 for the packaging of the kit components include, without limitation, glass, plastic (polyethylene, polypropylene, polycarbonate and the like), bottles, vials, paper, envelopes and the like.

En la presente invención se entiende por "cebador" o "primer" u "oligonucleótido" In the present invention, "primer" or "first" or "oligonucleotide" is understood

25 ("oligo") a la secuencia de nucleótidos a partir de la cual la ADN polimerasa inicia la síntesis de una molécula nueva de ADN. Los cebadores son secuencias nucleotídicas cortas, frecuentemente entre 15-35 nucleótidos de longitud que se pueden alinear con una hebra de ADN diana gracias a la complementariedad de bases para formar un híbrido entre el cebador y la hebra diana de ADN . Después, la enzima ADN 25 ("oligo") to the nucleotide sequence from which DNA polymerase begins the synthesis of a new DNA molecule. The primers are short nucleotide sequences, often between 15-35 nucleotides in length that can be aligned with a strand of target DNA thanks to the complementarity of bases to form a hybrid between the primer and the target strand of DNA. Next, the enzyme DNA

30 polimerasa puede extender el cebador a lo largo de la hebra diana de ADN. The polymerase can extend the primer along the DNA strand.

En el contexto de la presente invención se entiende por "pareja de cebadores" o In the context of the present invention, "primer pair" is understood as

"primer pair", al conjunto de dos cebadores que, empleados en una misma reacción de "first pair", to the set of two primers that, used in the same reaction of

amplificación o PCR, permiten obtener múltiples copias de una secuencia diana de amplification or PCR, allow multiple copies of a target sequence of

35 ADN. Cada uno de los cebadores hibrida con la secuencia diana, de manera que se amplifica la secuencia de nucleótidos acotada mediante cada pareja de cebadores. 35 DNA Each of the primers hybridizes with the target sequence, so that the bounded nucleotide sequence is amplified by each pair of primers.

En una realización particular, las parejas de cebadores específicos de la secuencia de In a particular embodiment, the pairs of primers specific to the sequence of

nucleótidos de la invención está formada por un cebador directo que comprende la nucleotides of the invention is formed by a direct primer comprising the

secuencia de nueleólidos AAT cn AAG GCT GGA AGA GTC CGC ATC (SEO ID sequence of nueleolids AAT cn AAG GCT GGA AGA GTC CGC ATC (SEO ID

5 NO: 6) y un cebador inverso que comprende la secuencia de nucleótidos GCC ATA CTA TAAAAA GCTTATnA GAA TAG CAT CG (SEO ID NO: 7). 5 NO: 6) and a reverse primer comprising the nucleotide sequence GCC ATA CTA TAAAAA GCTTATnA GAA TAG CAT CG (SEO ID NO: 7).

El kit de la invención además de comprender al menos una de las parejas de cebadores antes indicadas, puede incluir, opcionalmente, los reactivos necesarios 10 para llevar a cabo la reacción de amplificación multiplex, entre los que se incluyen, sin limitar a, desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), iones divalentes y/o monovalentes, una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa, ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas, etc. No obstante, si el kit de la invención no comprende los reactivos necesarios para poner 15 en práctica el método de la invención, éstos están disponibles comercialmente y pueden encontrarse formando parte de un kit. Cualquier kit de los disponibles comercialmente que contenga los reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación, como por ejemplo Qiagen Multiplex PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA), puede emplearse con éxito en la puesta en práctica del método de la The kit of the invention, in addition to comprising at least one of the pairs of primers indicated above, may optionally include the reagents necessary to carry out the multiplex amplification reaction, including, but not limited to, deoxynucleotide triphosphate (dNTPs), divalent and / or monovalent ions, a buffer solution (buffer) that maintains the proper pH for the functioning of DNA polymerase, DNA polymerase or mixture of different polymerases, etc. However, if the kit of the invention does not comprise the reagents necessary to implement the method of the invention, these are commercially available and can be found as part of a kit. Any commercially available kit containing the reagents necessary to carry out an amplification reaction, such as, for example, Qiagen Multiplex PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA), can be used successfully in the implementation of the method of

20 invención. Asimismo, otros de los reactivos empleados en la puesta en práctica del método de la invención y que pueden formar parte del kit son el material necesario para obtener la muestra biológica del olivo y los reactivos empleados en el aislamiento del ácido nucleico o proteínas a partir de la muestra biológica obtenida, como por ejemplo, alcoholes, detergentes, etc. 20 invention. Likewise, other reagents used in the implementation of the method of the invention and which may be part of the kit are the material necessary to obtain the biological sample of the olive tree and the reagents used in the isolation of nucleic acid or proteins from the biological sample obtained, such as alcohols, detergents, etc.

25 Por otro lado, el kit de la invención también puede contener una sonda de ácido nucleico diseñada de forma específica para hibridar con la secuencia de nucleótidos de la invención. Una sonda específica de secuencia puede dirigirse para hibridizar el ADN, ARN, o ADNc. Una "sonda de ácido nucleico", tal como se utiliza en la presente On the other hand, the kit of the invention may also contain a nucleic acid probe specifically designed to hybridize with the nucleotide sequence of the invention. A sequence specific probe can be directed to hybridize the DNA, RNA, or cDNA. A "nucleic acid probe", as used herein

30 invención, puede ser una sonda de ADN o una sonda de ARN que hibrida con una secuencia complementaria. La sonda de ácido nucleico puede ser de cualquier tamaño adecuado, siempre y cuando suficiente para hibridar específicamente bajo condiciones severas el ARN apropiado o ADN . La sonda puede ser de entre 5-100 nucleótidos, preferiblemente, entre 10-50 nucleótidos de longitud, más The invention may be a DNA probe or an RNA probe that hybridizes with a complementary sequence. The nucleic acid probe can be of any suitable size, as long as it is sufficient to specifically hybridize under appropriate conditions the appropriate RNA or DNA. The probe can be between 5-100 nucleotides, preferably, between 10-50 nucleotides in length, plus

35 preferiblemente, entre 12-30 nucleótidos de longitud. Como sabe el experto en la materia, la sonda puede comprender una fracción fluorescente o un grupo en su extremo 3' y un extintor en su extremo 5'. 35 preferably, between 12-30 nucleotides in length. As the person skilled in the art knows, the probe can comprise a fluorescent fraction or a group at its 3 'end and an extinguisher at its 5' end.

El kit de la invención también puede contener un anticuerpo específico del péptido o 5 proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención. The kit of the invention may also contain a peptide specific antibody or 5 protein encoded by the nucleotide sequence of the invention.

El término "anticuerpo" ha de ser interpretado de forma amplia e incluye, sin limitarse The term "antibody" must be interpreted broadly and includes, without limitation

a, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, quiméricos, a, polyclonal, monoclonal, multispecific, chimeric antibodies,

recombinantes, humanizados y fragmentos de los mismos [F(ab')2, Fab, scFv, etc.], recombinants, humanized and fragments thereof [F (ab ') 2, Fab, scFv, etc.],

10 siempre que sean capaces de reconocer al antígeno de interés, es decir, que sean capaces de unirse específicamente a la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención. 10 provided that they are capable of recognizing the antigen of interest, that is, that they are capable of specifically binding to the protein encoded by the nucleotide sequence of the invention.

Adicionalmente, los kits pueden contener instrucciones para el empleo de los distintos 15 componentes que se encuentran en el kit. Additionally, the kits may contain instructions for using the various components found in the kit.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de del kit de la invención para detectar la presencia de Verticillium spp. en un olivo, en particular, Verticillium dahliae. In another aspect, the invention relates to the use of the kit of the invention to detect the presence of Verticillium spp. in an olive tree, in particular, Verticillium dahliae.

20 A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention. The following examples and figures are provided by way of illustration, and

25 no se pretende que sean limitativos de la presente invención. 25 are not intended to be limiting of the present invention.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Figura 1. Representación gráfica de la expresión del contig_172143 a lo largo del 30 tiempo a partir de la infección con el patógeno. Figure 1. Graphical representation of the expression of contig_172143 over 30 time after infection with the pathogen.

Figura 2, Representación gráfica donde se muestra como el contig_172143 responde Figure 2, Graphical representation showing how contig_172143 responds

a la infección tanto de Picual (susceptible) cómo de Frantoio (tolerante-resistente) a V. to the infection of both Picual (susceptible) and Frantoio (tolerant-resistant) to V.

dahliae. Pic= Picual; Fr= Frantoio; ctrl= control; H= heridas en las raíces; inf= infectado dahliae Pic = Picual; Fr = Frantoio; ctrl = control; H = root wounds; inf = infected

35 por V. dahliae; 15d= 15 días desde la inoculación o la herida. 35 by V. dahliae; 15d = 15 days from inoculation or wound.

Figura 3. Gel de electroforesis donde se muestra que el contig_172143 se expresa en árboles de campo infectados por V. dah{iae. Los números identifican a cada árbol. S= rama sana o ausencia de sintomas. R= rama con síntomas. S3noRT es un control negativo para comprobar la ausencia de contaminación con AON. Figure 3. Electrophoresis gel showing that contig_172143 is expressed in field trees infected by V. dah {iae. The numbers identify each tree. S = healthy branch or absence of symptoms. R = branch with symptoms. S3noRT is a negative control to verify the absence of contamination with AON.

EJEMPLOS EXAMPLES

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención. 10 Ejemplo 1 Detección de Verticillium sp. en olivo The invention will now be illustrated by tests carried out by the inventors, which demonstrates the effectiveness of the product of the invention. 10 Example 1 Detection of Verticillium sp. in olive

MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL AND METHODS

1.-Análisis Transcriptómico: 1.-Transcriptomic Analysis:

1a.-Obtención de muestras. 1st-Obtain samples.

20 Para hacer el análisis transcriptómico se utilizaron plantas cultivadas en condiciones controladas del cultivar Picual, con un grado de susceptibilidad elevado a la verticilosis y a la infección por Phytophthora spp. Estas plantas se sometieron a diferentes tipos de estrés, cómo heridas en las raíces, inoculación con V. dahliae o P. megasperma en plantas con heridas inducidas en las raíces, temperatura baja, estrés 20 For the transcriptomic analysis, plants grown under controlled conditions of the Picual cultivar were used, with a high degree of susceptibility to verticillosis and Phytophthora spp. These plants underwent different types of stress, such as root wounds, inoculation with V. dahliae or P. megasperma in plants with induced root wounds, low temperature, stress

25 salino, encharcamiento de las raíces en tierra de viveros con presencia de diversos patógenos del suelo o sin tratamiento como control. Las inoculaciones con V. dahliae se efectuaron utilizando un aislado representativo del patotipo defoliante, que es el de mayor virulencia y el más amenazador para el olivar, además de ser el que más se está extendiendo, según los últimos trabajos e informes epidemiológicos, en diversos 25 saline, pooling of roots in nursery soil with the presence of various soil pathogens or without treatment as a control. Inoculations with V. dahliae were carried out using a representative isolate of the defoliant pathotype, which is the most virulent and the most threatening for the olive grove, in addition to being the one that is spreading the most, according to the latest work and epidemiological reports, in various

30 paises donde el olivar es relevante y, particularmente, en el área mediterránea (por ejemplo, en España y en Turquia). Se tomaron muestras de partes aéreas y de raices de plantas sometidas a los diferentes estreses antes mencionados y con diferentes tiempos de incubación. Las muestras fueron congeladas en nitrógeno líquido y conservadas a -80°C hasta su utilización. 30 countries where the olive grove is relevant and, particularly, in the Mediterranean area (for example, in Spain and Turkey). Samples were taken from aerial parts and roots of plants subjected to the different stresses mentioned above and with different incubation times. The samples were frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C until use.

Para su análisis se extrajo ARN total y se realizó una secuenciación masiva mediante RNAseq de los mismos con el equipo "lIIumina Hiseq 1000". La elección de la variedad Picual para realizar el estudio transcriptómico masivo inicial se debe a que es una variedad susceptible a la verticilosis. For its analysis, total RNA was extracted and a massive sequencing was performed by RNAseq thereof with the "Hiseq 1000 Illumina" equipment. The choice of the Picual variety to carry out the initial massive transcriptomic study is because it is a variety susceptible to verticillosis.

También se obtuvieron muestras de plantas del cultivar Frantoio, tolerante a la verticilosis, para comparar los resultados entre resistente y sensible a la verticilosis. Plant samples were also obtained from the cultivar Frantoio, tolerant of verticilosis, to compare the results between resistant and sensitive to verticilosis.

1 b.-Análisis bioinformático. 1 b.-Bioinformatic analysis.

Trece muestras de tejidos de Olea europea L. varo Picual fueron secuenciadas por duplicado en un secuenciador lIIumina HighSeq 1000, mediante paired-end sequencing y 101 pared de bases de longitud. Los 26 ficheros de secuencias fueron "trimeados" seleccionándose secuencias con una calidad media (Phred) superior a 30. El total de secuencias paired-end fue de 741 .674.755 (149,77 Gigabases). Cada uno de los 26 ficheros de secuencias fueron ensamblados mediante el programa informático ABySS (Ensamblaje paired-end, usando un k-mer=64). Por último, se reensamblaron todos los scaffolds obtenidos en el primer ensamblaje usando ABySS (Ensamblaje single-end, usando un k-mer=63). Al final se obtuvo un transcriptoma del olivo con 174.965 contigs y un valor de N50 para el ensamblaje de 761pb. Finalmente, el análisis transcriptómico se realizó usando el programa DNAStar QSeq. Entre estos contigs se encontró el contig_172143. Thirteen samples of Olea European L. varo Picual tissues were sequenced in duplicate on a HighSeq 1000 luminum sequencer, using paired-end sequencing and 101 base wall length. The 26 sequence files were "trimeados" selecting sequences with an average quality (Phred) greater than 30. The total paired-end sequences was 741,674,755 (149.77 Gigabases). Each of the 26 sequence files were assembled using the ABySS software (Paired-end assembly, using a k-mer = 64). Finally, all scaffolds obtained in the first assembly were reassembled using ABySS (single-end assembly, using a k-mer = 63). In the end, an olive transcriptome was obtained with 174,965 contigs and a value of N50 for the assembly of 761 bp. Finally, the transcriptomic analysis was performed using the DNAStar QSeq program. Among these contigs was contig_172143.

1c.-Análisis de la expresión génica mediante RT-PCR cuantitativa. 1c.-Analysis of gene expression by quantitative RT-PCR.

Purificación de ARN RNA purification

Las hojas congeladas en nitrógeno líquido se homogenizaron en un molino MM 400 (Resch). Se extrajo ARN total con Spectrum Plant Total RNA (SIGMA-ALDRICH, SI. Louis, MO) y se trataron con DNase I RNase free (Roche, Basel, Switzerland). Finalmente, se purificó el ARN total con RNeasy Mini Kit® (Quiagen), se cuantificó mediante espectrometría con Take3 Synergy HT spectrophotometer (Bio-Tek) y se guardó a -80°C hasta su uso. The leaves frozen in liquid nitrogen were homogenized in a mill MM 400 (Resch). Total RNA was extracted with Spectrum Plant Total RNA (SIGMA-ALDRICH, SI. Louis, MO) and treated with DNase I RNase free (Roche, Basel, Switzerland). Finally, the total RNA was purified with RNeasy Mini Kit® (Quiagen), quantified by spectrometry with Take3 Synergy HT spectrophotometer (Bio-Tek) and stored at -80 ° C until use.

P20133 1633

Síntesis de cDNA y RT-PCR cuantitativa Synthesis of cDNA and quantitative RT-PCR

"First-strand" cONA se sintetizó a partir de 1 !Jg de ARN total cebado con 60 !JM de random hexamer primer y Transcriptor Reverse Transcriptase, usando el Transcriptor "First-strand" cONA was synthesized from 1! Jg of total RNA primed with 60! JM of random hexamer primer and Transcriptor Reverse Transcriptase, using the Transcriptor

5 First Strand cONA Synthesis Kit (Roche, Basel, 8witzerland).

Las RT-PCR cuantitativas se realizaron en un termociclador Bio-Rad CFX96 PCR system y el master mix SsoFastTM EvaGreen® Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), en un volumen de reacción de 10 !JI, conteniendo 10 ng de 10 cONA. Las amplificaciones se realizaron según las siguientes condiciones: Activación inicial de la polimerasa a 98°C durante 30 s; seguido de 40 ciclos cada uno de 98°C durante 5 s (desnaturalización) y de 60°C durante 10 s (hibridación/elongación), con Quantitative RT-PCRs were performed in a Bio-Rad CFX96 PCR system thermal cycler and the SsoFastTM EvaGreen® Supermix master mix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), in a reaction volume of 10! JI, containing 10 ng of 10 CONA. The amplifications were performed according to the following conditions: Initial activation of the polymerase at 98 ° C for 30 s; followed by 40 cycles each of 98 ° C for 5 s (denaturation) and 60 ° C for 10 s (hybridization / elongation), with

una etapa final de desnaturalización entre 65°C y 95°C para detener la reacción y obtener una curva de "melting". a final stage of denaturation between 65 ° C and 95 ° C to stop the reaction and obtain a melting curve.

Se utilizó un control interno con un gen de actina constitutivo en el olivo con el que se An internal control was used with a constitutive actin gene in the olive tree with which

They normalized the results. The primers for the PCRs were the following:

eonti9_172143: cebador directo (172143DIS2F) AAT CTI AAG GCT GGA AGA GTC 20 CGC ATC (SEO ID NO: 6) y cebador inverso (172143DIS2R) GCC ATA CTA TAA AAA GCT TAT TIA GAA TAG CAT CG (SEO ID NO: 7). eonti9_172143: direct primer (172143DIS2F) AAT CTI AAG GCT GGA AGA GTC 20 CGC ATC (SEO ID NO: 6) and reverse primer (172143DIS2R) GCC ATA CTA TAA AAA GCT TAT TIA GAA TAG CAT CG (SEO ID NO: 7).

Gen aetina: Cebador directo (Aetin40370F) CCC TIG ACT ATG AGC AGG AGC TIG AGA C (SEO ID NO: 8) y Cebador inverso (Aetin40370R) GAT CAT TGA AGG CTG 25 GTA AAG AAC CTC AG (SEO ID NO: 9 ). Aetine gene: Direct primer (Aetin40370F) CCC TIG ACT ATG AGC AGG AGC TIG AGA C (SEO ID NO: 8) and Reverse primer (Aetin40370R) GAT CAT TGA AGG CTG 25 GTA AAG AAC CTC AG (SEO ID NO: 9).

Each reaction was repeated three times to achieve a representative result.

RESULTADOS 30 RESULTS 30

Contig_172143 is expressed in response to infection with V. dahliae.

El análisis bioinformático de los resultados de RNAseq permitió seleccionar un gen cuya expresión en hojas solamente se observa en plantas que han sido inoculadas The bioinformatic analysis of the RNAseq results allowed to select a gene whose expression in leaves is only observed in plants that have been inoculated

35 con V. dahliae (Tabla 1). 35 with V. dahliae (Table 1).

Contig Contig: Control Estrés Anotación Control Stress Annotation

Frio Cold: Heridas en las raíces Inoculación con V. dahliae Root wounds Inoculation with V. dahliae

24 h 24 h: 10 días 15 días 15 días Blighl-associated protein. Putative EG45-like domain containing protein 1 (PNP=Plant Natriuretic Peptide) 10 days 15 days 15 days Blighl-associated protein. Putative EG45-like domain containing protein 1 (PNP = Plant Natriuretic Peptide)

172143 172143: 0,75 No detectado No detectado O 5,12587 0.75 Not detected Not detected OR 5,12587

. . . .

.. ..

Tabla 1. La expreslon del contlg_172143 se produce en respuesta a la Infecclon por Table 1. The expression of contlg_172143 is produced in response to the Infecclon by

V. dahliae. Datos de expresión en hojas. Los valores son RPKM (del inglés Reads per kilo base per mil/ion) y están expresados cómo lag en base 2. V. dahliae. Expression data in sheets. The values are RPKM (from English Reads per kilo base per thousand / ion) and are expressed as lag in base 2.

5 La secuencia de nucleótidos del ADNc del gen identificado, aquí denominado contig_172143, así como la proteína codificada por ella es la siguiente: 5 The nucleotide sequence of the cDNA of the identified gene, here called contig_172143, as well as the protein encoded by it is as follows:

conti9_172143 cds (SEO ID NO: 1) conti9_172143 cds (SEO ID NO: 1)

ATGGGCTGTCAAATTCGACTTCTTATGTTGTTTGGCACGTTGATAAGTTTTGCCTCAGTTGTAC ATGGGCTGTCAAATTCGACTTCTTATGTTGTTTGGCACGTTGATAAGTTTTGCCTCAGTTGTAC

10 TTTCTAAGCAGGGAACTTCTGTTTACTATGCTCGACCTTATCTTCCCTCGGCATGCTATGGCAA CCGAAACCAAGGCATCATGATAGCAGGTGCTAATCCTACATTGTACAATGGTGGAAAAGTATGT GGAAGAAGGTATAAAGTTAGGTGCTTGGGAGGCACCAACAAAACACCACATCCTTGCAAAAGGG GTGAAATAACTGTAAAAATTGTAGATCTTTGCCCAGGCTGTGGAGCAAACGAGATTAATCTATC TCAAGATGCCTTCTCGAGGATTGCTAATCTTAAGGCTGGAAGAGTCCGCATCGACTATATCCAG 10 TTTCTAAGCAGGGAACTTCTGTTTACTATGCTCGACCTTATCTTCCCTCGGCATGCTATGGCAA CCGAAACCAAGGCATCATGATAGCAGGTGCTAATCCTACATTGTACAATGGTGGAAAAGTATGT GGAAGAAGGTATAAAGTTAGGTGCTTGGGAGGCACCAACAAAACACCACATCCTTGCAAAAGGG GTGAAATAACTGTAAAAATTGTAGATCTTTGCCCAGGCTGTGGAGCAAACGAGATTAATCTATC TCAAGATGCCTTCTCGAGGATTGCTAATCTTAAGGCTGGAAGAGTCCGCATCGACTATATCCAG

15 GTTTGA 15 GTTTGA

conti9_172143 péptido (SEO ID NO: 2) conti9_172143 peptide (SEO ID NO: 2)

20 V* 20 V *

La secuencia completa del ADNc incluyendo las regiones no codificantes UTR3' y UTR5', se muestra en la SEO ID NO: 5 The complete cDNA sequence including the non-coding regions UTR3 'and UTR5', is shown in SEO ID NO: 5

GGCCACTAGTACTTCAAACATACAGAGAATGGGCTGTCAAATTCGACTTCTTATGTTGTTTGGC ACGTTGATAAGTTTTGCCTCAGTTGTACTTTCTAAGCAGGGAACTTCTGTTTACTATGCTCGAC CTTATCTTCCCTCGGCATGCTATGGCAACCGAAACCAAGGCATCATGATAGCAGGTGCTAATCC TACATTGTACAATGGTGGAAAAGTATGTGGAAGAAGGTATAAAGTTAGGTGCTTGGGAGGCACC 5 AACAAAACACCACATCCTTGCAAAAGGGGTGAAATAACTGTAAAAATTGTAGATCTTTGCCCAG GCTGTGGAGCAAACGAGATTAATCTATCTCAAGATGCCTTCTCGAGGATTGCTAATCTTAAGGC TGGAAGAGTCCGCATCGACTATATCCAGGTTTGAGGCAATTTARTATGRGAAAGTAAAAAAATT TCGATGCTATTCTAAATAAGCTTTTTATAGTATGGCTCATGCAAAATATATAATCTAGCACTAG TTGAATAAGAAATTAGACAGAAATCTATTTTAGATGTTAGTCAAGAAAAATAAAAACAAGGATG GGCCACTAGTACTTCAAACATACAGAGAATGGGCTGTCAAATTCGACTTCTTATGTTGTTTGGC ACGTTGATAAGTTTTGCCTCAGTTGTACTTTCTAAGCAGGGAACTTCTGTTTACTATGCTCGAC CTTATCTTCCCTCGGCATGCTATGGCAACCGAAACCAAGGCATCATGATAGCAGGTGCTAATCC TACATTGTACAATGGTGGAAAAGTATGTGGAAGAAGGTATAAAGTTAGGTGCTTGGGAGGCACC 5 AACAAAACACCACATCCTTGCAAAAGGGGTGAAATAACTGTAAAAATTGTAGATCTTTGCCCAG GCTGTGGAGCAAACGAGATTAATCTATCTCAAGATGCCTTCTCGAGGATTGCTAATCTTAAGGC TGGAAGAGTCCGCATCGACTATATCCAGGTTTGAGGCAATTTARTATGRGAAAGTAAAAAAATT TCGATGCTATTCTAAATAAGCTTTTTATAGTATGGCTCATGCAAAATATATAATCTAGCACTAG TTGAATAAGAAATTAGACAGAAATCTATTTTAGATGTTAGTCAAGAAAAATAAAAACAAGGATG

10 TCGTGTGAGTTTGACATATGTAGCTTTTGATATCTTCCTTATGGAAATGAAACTTTAAATTCAT GCAAAAAAA 10 TCGTGTGAGTTTGACATATGTAGCTTTTGATATCTTCCTTATGGAAATGAAACTTTAAATTCAT GCAAAAAAA

(las zonas no codificantes UTR5' y UTR3' se muestran subrayadas) (the non-coding zones UTR5 'and UTR3' are underlined)

15 Estos resultados se confirmaron mediante RT-PCR cuantitativa (Figura 1), donde puede observarse cómo se induce una respuesta a la presencia de la infección por V. dahliae en tan solo 7-15 días desde la inoculación con el patógeno, por lo que es un gen de respuesta suficientemente rápida cómo para servir de marcador en plantas que aún no manifiestan síntomas de verticilosis. 15 These results were confirmed by quantitative RT-PCR (Figure 1), where it can be observed how a response to the presence of V. dahliae infection is induced in just 7-15 days from inoculation with the pathogen, so It is a fast-response gene to serve as a marker in plants that do not show symptoms of verticillosis.

20 El patógeno más frecuente que infecta las raíces de los olivos y produce síntomas similares a los de la verticilosis es P. megasperma, necesitando de condiciones de encharcamiento continuado de las raíces que favorecen la infección del patógeno. Por este motivo se sometieron a encharcamiento varias plantas del cultivar Picual y a la 20 The most frequent pathogen that infects the roots of the olive trees and produces symptoms similar to those of verticillosis is P. megasperma, requiring conditions of continuous rooted pooling that favor the infection of the pathogen. For this reason, several plants of the Picual cultivar were subjected to waterlogging and the

25 mitad se le añadió un fuerte inóculo de P. megasperma. El análisis por RT-PCR no permitió detectar expresión en ningún caso, por lo que el contig_172143 no se induce por encharcamiento ni tampoco por P. megasperma. 25 half a strong inoculum of P. megasperma was added. The analysis by RT-PCR did not allow to detect expression in any case, so contig_172143 is not induced by waterlogging or by P. megasperma.

Todos los ensayos se han realizado en condiciones de vivero con sustratos no All tests have been carried out in nursery conditions with substrates not

30 esterilizados y colonizados por una importante microbiota (bacteriana y fúngica) natural, incluyendo patógenos potenciales que pueden desarrollar enfermedad bajo condiciones específicas (p.e. encharcamiento), por lo que las plantas sometidas a encharcamiento de las raíces o con heridas inducidas en las mismas suponen una aproximación a la posible infección experimental por variedad de patógenos y en 30 sterilized and colonized by an important natural (bacterial and fungal) microbiota, including potential pathogens that can develop disease under specific conditions (eg waterlogging), so that the plants subjected to root pooling or with wounds induced therein represent a approach to the possible experimental infection by variety of pathogens and in

35 ningún caso se encontró expresión del contig_172143, salvo la respuesta clara que se produce con la infección por V. dahliae. Por lo tanto, se puede concluir que el 35 no case expression of contig_172143 was found, except for the clear response that occurs with V. dahliae infection. Therefore, it can be concluded that the

contig_172143 se puede utilizar cómo marcador altamente especifico y estable de la infección por V. dahliae en el olivo. contig_172143 can be used as a highly specific and stable marker of infection with V. dahliae in the olive tree.

El contig_172143 también responde a la infección por V. dahliae en un cultivar Contig_172143 also responds to V. dahliae infection in a cultivar

5 resistente al hongo. El cultivar Frantoio es altamente tolerante a V. dahliae, si bien puede ser infectado por el patógeno sin desarrollar un síndrome tan severo como el caso de la variedad susceptible Picual. El análisis por RT-PCR cuantitativa confirmó que se puede detectar el estado de infección en este cultivar con un nivel de tolerancia muy superior 5 fungus resistant. Cultivating Frantoio is highly tolerant of V. dahliae, although it can be infected by the pathogen without developing a syndrome as severe as the case of the susceptible Picual variety. The quantitative RT-PCR analysis confirmed that the infection status can be detected in this cultivar with a much higher tolerance level

10 al de Picual (Figura 2). 10 to Picual (Figure 2).

Estos datos indican que el contig_172143 puede utilizarse cómo marcador de la verticilosis tanto en variedades susceptibles como tolerantes a V. dahliae y evidentemente sin síntomas de la enfermedad. These data indicate that contig_172143 can be used as a marker of verticillosis in both susceptible and tolerant varieties of V. dahliae and obviously without symptoms of the disease.

Uso del gen contig_172143 para detectar la infección por V. dahliae en árboles enfermos en el campo. Use of the contig_172143 gene to detect V. dahliae infection in diseased trees in the field.

Todos los ensayos anteriores se realizaron con plantas de vivero, por lo que se quiso 20 comprobar si el gen contig_172143 servía para detectar la verticilosis en olivos infectados en olivares en explotación . All the previous tests were carried out with nursery plants, so it was wanted to check if the contig_172143 gene was used to detect verticillosis in infected olive trees in exploitation olive groves.

Para ello se tomaron muestras de 7 árboles afectados procedentes de varias fincas y se analizaron muestras de hojas tomadas de la zona enferma o de ramas sin 25 síntomas, y se observó que en las 6 muestras de ramas con síntomas (uno de los árboles no tenía en ese momento ramas afectadas) y en 6 de 7 ramas sin síntomas se expresaba el contig_172143 (Figura 3). Este último resultado demuestra que el contig_172143 no solamente es un marcador temprano de infección por V. dahliae, sino que es estable en su expresión a lo largo de meses o años y se puede utilizar de For this, samples of 7 affected trees from several farms were taken and samples of leaves taken from the diseased area or from branches without 25 symptoms were analyzed, and it was observed that in the 6 samples of branches with symptoms (one of the trees did not have at that time affected branches) and in 6 of 7 branches without symptoms the contig_172143 was expressed (Figure 3). This last result demonstrates that contig_172143 is not only an early marker of infection with V. dahliae, but is stable in its expression over months or years and can be used in

30 forma generalizada como marcador de la verticilosis en el olivo. 30 generalized form as a marker of verticillosis in the olive tree.

Claims

1. An isolated nucleotide sequence encoding a protein that comprises

an amino acid sequence that has at least 90% identity with the 5 SEO ID sequence NO: 2.

2. Nucleotide sequence according to claim 1, wherein the amino acid sequence has at least 95%, in particular at least 98%, more particularly, at least 99% identity with the SEO ID sequence NO: 2.

3. Nucleotide sequence according to claim 2, wherein the amino acid sequence has 100% identity with the SEO ID NO: 2 sequence.

4. Nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 3, wherein the nucleotide sequence is RNA.

5. Nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 3, wherein the nucleotide sequence is cDNA.

: 20 6. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 5, en el que el ADNc comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 95%, preferiblemente, al menos un 98%, más preferiblemente al menos un 99% de identidad con la secuencia SEO ID NO: 1. A nucleotide sequence according to claim 5, wherein the cDNA comprises a nucleotide sequence having at least 95%, preferably, at least 98%, more preferably at least 99% identity with the SEO sequence. ID NO: 1.

: 25 7. Secuencia de aminoácidos según la reivindicación 6, en el que el ADNc comprende una secuencia de nucleótidos que tiene un 100% de identidad con la secuencia SEO ID NO: 1. Amino acid sequence according to claim 6, wherein the cDNA comprises a nucleotide sequence that has 100% identity with the SEO ID NO: 1 sequence.

8. Nucleotide sequence according to claim 6 or 7, wherein the cDNA

30 comprises a nucleotide sequence comprising covalently attached to its 5 'end the SEO ID NO: 3 sequence and / or operably linked to its 3' end the SEO ID NO: 4 sequence.

9. 9.: Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 8, en el que el ADNc comprende una secuencia de nucleótidos SEO ID NO: 5. Nucleotide sequence according to claim 8, wherein the cDNA comprises a nucleotide sequence SEO ID NO: 5.

10. 10.: Una construcción génica que comprende una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, operativa mente unida a una secuencia reguladora de la expresión heteróloga respecto a la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9. A gene construct comprising a nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 9, operatively linked to a regulatory sequence of heterologous expression with respect to the nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 9.

eleven . A vector comprising a nucleotide sequence according to any one of claims 5 to 9, or a gene construct according to claim 10.

12. A cell comprising a nucleotide sequence according to any of the

10 claims 5 to 9, a gene construct according to claim 10, or a vector according to claim 11.

13. A plant comprising a nucleotide sequence according to any of the

claims 5 to 9, a gene construct according to claim 10, a vector 15 according to claim 11 or a cell according to claim 12.

14. An amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 9

15. Amino acid sequence according to claim 14, wherein said sequence comprises the amino acid sequence SEO ID NO: 2.

16. In vitro use of a nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 9, a gene construct according to claim 10, a vector

25 according to claim 11 or an amino acid sequence according to claim 14 or 15 as a diagnostic marker for olive verticillosis.

17. Use according to claim 16, wherein the olive verticillosis is caused by

an infection of Verticilium sPP., in particular, by an infection of Verlicillium 30 dahliae.

18. 18.: Uso según la reivindicación 16 ó 17, en el que la secuencia de nucleótidos está sobreexpresada respecto a un valor de referencia, o la secuencia de aminoácidos está en una alta concentración respecto a un valor de referencia. Use according to claim 16 or 17, wherein the nucleotide sequence is overexpressed with respect to a reference value, or the amino acid sequence is in a high concentration with respect to a reference value.

19. 19.: Un método in vitro para detectar la presencia de VerticiJIium spp. en un olivo que comprende: a) determinar el nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o el nivel de la secuencia de aminoácidos según la An in vitro method to detect the presence of VerticiJIium spp. in an olive tree comprising: a) determining the level of expression of a nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 9, or the level of the amino acid sequence according to the

Claim 14 or 15, in a biological sample from said olive tree; Y b) compare the level of expression obtained in section a) with a value of reference.

20. Method according to claim 19, wherein the level of expression obtained in the

10 a) is greater than the reference value, or the level of the amino acid sequence is greater than a reference level, then the olive tree is infected by VerticiJIium spp., In particular, Verticillium dahliae.

twenty-one . Method according to claim 19 or 20, wherein the biological sample is derived from a leaf, trunk, bark or olive root.

22. A method according to any of claims 19 to 21, wherein the level of nucleotide sequence expression is determined by measuring the amount of mRNA.

or cDNA.

23. A method according to any of claims 19 to 22, wherein the level of expression of the nucleotide sequence is carried out by northern blotting or quantitative PCR.

A method according to any one of claims 19 to 22, wherein the level of the amino acid sequence is carried out by Western blotting.

25. A kit comprising A pair of specific primers to amplify a sequence of

30 nucleotides according to any one of claims 1 to 9, a nucleic acid probe specifically designed to hybridize with a nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 9, and / or a protein specific antibody encoded by a sequence of

Nucleotides according to any one of claims 1 to 9.

26. Kit according to claim 25, wherein the primer pair comprises a direct primer comprising the SEO ID NO: 6 nucleotide sequence and a reverse primer comprising the SEO ID NO: 7 nucleotide sequence.

Use of a kit according to claim 25 or 26 to detect the presence of Verticillium spp. in an olive tree, in particular, of Verticillium dahliae.