ES2536448T3

ES2536448T3 - Uso de lignina peroxidasa en el aclaramiento de piel y pelo

Info

Publication number: ES2536448T3
Application number: ES10176875.2T
Authority: ES
Inventors: Paula Belinky; Haim Lasser; Carlos Dosoretz
Original assignee: R B T (Rakuto Bio Technologies) Ltd; RBT Rakuto Bio Technologies Ltd
Current assignee: R B T (Rakuto Bio Technologies) Ltd; RBT Rakuto Bio Technologies Ltd
Priority date: 2002-12-12
Filing date: 2003-12-11
Publication date: 2015-05-25
Anticipated expiration: 2023-12-11
Also published as: EP2338896A3; PT2338896E; EP2338896A2; US20140212366A1; US20170273885A1; EP1583512B3; WO2004052275A3; HUE025745T2; JP2009100756A; DK2338896T3; CN100402016C; US7422734B2; EP2338896B1; ATE486637T1; JP2006514943A; CY1111160T1; US20060051305A1; US9693946B2; EP1583512A4; PT1583512E

Abstract

Una composición cosmética para el aclaramiento de una región de la piel o pelo de un sujeto que comprende una enzima lignina peroxidasa a una concentración de 1-100 U/g, un mediador oxidante, en la que dicho mediador oxidante es alcohol veratrílico o veratrol y un vehículo cosméticamente aceptable formulado para su uso sobre piel o pelo.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

15

25

35

45

55

65

E10176875

07-05-2015

medio de cultivo por minutos. Según configuraciones presentemente preferidas, el fermentador se airea a una tasa de aireación de 0,2 litros de aire por litro de medio de cultivo por minuto.

Como se describe bajo Materiales y Métodos experimentales de la sección de ejemplos que sigue, Phanerochaete chrysosporium se cultiva bajo condiciones de cultivo que carecen de iones manganeso y que contienen glicerol como fuente de carbono. Preferentemente, el glicerol de la presente invención se proporciona a un intervalo de concentración de 3-20 gramos por litro. Según configuraciones presentemente preferidas, el glicerol se proporciona a una concentración de 6 gramos por litro.

Durante el proceso de purificación de la isoenzima H1 de lignina peroxidasa del hongo anterior, la actividad enzimática de la proteína purificada se ha probado adicionalmente por un cambio en la absorbancia a 310 nm que se produce debido a la oxidación de alcohol veratrílico a veratrilaldehído.

Como la isoenzima H1 de lignina peroxidasa puede resultar de una desfosforilación postraduccional de la isoenzima H2 (Kuan y Tien, 1989), la lignina peroxidasa usada por la presente invención puede prepararse desfosforilando la isoenzima H2 de lignina peroxidasa.

Las enzimas modificadoras de lignina usadas por la presente invención también pueden extraerse de células bacterianas modificadas para expresar la enzima modificadora de lignina como se ha desvelado en la patente de EE.UU. 5.200.338. Por ejemplo, una célula bacteriana, tal como, E. coli, puede transformarse con un vector de expresión que incluye la secuencia codificante de LIP (SEC ID Nº: 1) puesta bajo el control regulador de un promotor constitutivo fuerte (por ejemplo, SP6). Tras la expresión, las células bacterianas pueden lisarse y el LIP puede recogerse usando técnicas cromatográficas (véase, Billman-Jacobe, 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7: 500-4; Harris y Emtage, 1986, Microbiol. Sci. 3: 28-31, para más detalles).

Las enzimas modificadoras de lignina usadas por la presente invención también pueden extraerse de líneas celulares de mamífero tales como células HeLa. En este caso, la secuencia codificante de LIP está puesta bajo un fuerte promotor de mamífero (por ejemplo, CMV) en un vector de expresión adecuado (por ejemplo, pcDNA3.1, Invitrogen Life Technologies, Frederick, MD, EE.UU.). Tras la transfección de células HeLa con el vector de expresión, el producto de expresión de LIP puede extraerse de las células, o medio (por ejemplo, modificando la secuencia de LIP para incluir una señal de secreción) por técnicas de purificación y cromatografía convencionales (véase Cunha y Aires-Barros, 2002. Mol. Biotechnol. 20: 29-40 para más detalles).

Aunque la enzima modificadora de lignina puede aplicarse a la piel o pelo sin necesitar co-aplicación de compuestos adicionales, la capacidad de aclaramiento de la enzima modificadora de lignina LIP se potencia cuando se aplica en presencia de un aceptor de electrones (es decir, una molécula que puede oxidar un sustrato), que sirve de activador oxidante, y/o en presencia de compuestos fenólicos, tales como alcohol veratrílico (Harvey et al., 1992, Biochem Soc Trans 20: 345-9), y veratrol que sirven de mediadores oxidantes (Ward et al., Enzyme and Microbial Technology (2002), 30: 490-498).

Así, la enzima modificadora de lignina se aplica con aplicación previa, concomitante o posterior de un activador oxidante, tal como peróxido de hidrógeno y un mediador oxidante, tal como alcohol veratrílico.

La enzima modificadora de lignina puede aplicarse a la piel o pelo en sí misma, sin embargo, con el fin de aumentar la eficiencia de aclaramiento, la enzima modificadora de lignina se incluye preferentemente en una composición cosmética que se formula para uso específico, tal como, por ejemplo, aclaramiento de la piel general, aclaramiento de pecas o aclaramiento del pelo. Estas composiciones cosméticas pueden incluir penetrantes epidérmicos tales como butilenglicol y transcutol, y penetrantes del pelo tales como alcanolaminas.

Como se usa en el presente documento, una “composición cosmética” se refiere a una preparación que incluye los principios activos descritos anteriormente en este documento (por ejemplo, LIP) y componentes químicos adicionales tales como vehículos y excipientes fisiológicamente adecuados, un activador oxidante y/o un mediador oxidante. El fin de una composición cosmética es facilitar la administración del principio activo a un organismo.

A continuación, el término “vehículo adecuado” usado se refiere a un vehículo o un diluyente que no produce irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica y propiedades de la enzima modificadora de lignina.

En el presente documento, el término “excipiente” se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición cosmética para facilitar adicionalmente la administración de un principio activo. Ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato cálcico, fosfato de calcio, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

La composición cosmética puede aplicarse de una manera local, por ejemplo, mediante la administración de la composición cosmética directamente a una región de tejido de un paciente. Vías de administración adecuadas pueden incluir, por ejemplo, inyecciones tópicas, subcutáneas e intradérmicas.

5

15

25

35

45

55

65

E10176875

07-05-2015

Las composiciones cosméticas de la presente invención pueden fabricarse por procesos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, preparación de comprimidos recubiertos de azúcar, trituración, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

Las composiciones cosméticas para su uso según la presente invención pueden así formularse de manera convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los principios activos en preparaciones. La apropiada formulación depende del enfoque de administración elegido.

Para inyección, los principios activos de la composición cosmética pueden formularse en disoluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como disolución de Hank, disolución de Ringer o tampón de sal fisiológico.

Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, disolución basada en agua libre de pirógenos estéril, antes de uso.

La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está perfectamente dentro de la capacidad de aquellos expertos en la materia, especialmente en vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.

Para cualquier preparación usada en los métodos de la invención, la cantidad terapéuticamente eficaz o dosis puede estimarse inicialmente de ensayos in vitro. Como se muestra en el presente documento en la sección de ejemplos, las concentraciones de LIP y peróxido de hidrógeno podrían optimizarse de ensayos in vitro y adaptarse adicionalmente para un uso in vivo. Además, puede formularse una dosis en sistemas de cultivo de tejido o en modelos animales para lograr una concentración deseada o título. Tal información puede usarse para determinar con más exactitud dosis útiles en seres humanos.

Dependiendo de la gravedad de la pigmentación del trastorno de la piel (por ejemplo, cloasma, melasma, ocronosis y lentigo) y la sensibilidad de la piel, la dosificación puede ser una administración única o una pluralidad de administraciones, con ciclo de tratamiento que dura de varios días a varias semanas o hasta que se efectúa la cura

o se logra la diminución del trastorno de la piel.

La cantidad de una composición que va a administrarse dependerá, por supuesto, del sujeto que está tratándose, la gravedad de la aflicción, el modo de administración, el criterio del médico que receta, etc.

La enzima modificadora de lignina incluida en la composición cosmética de la presente invención también puede proporcionarse a mayores concentraciones y recetarse por un médico como una composición farmacéutica para tratar trastornos de pigmentación de la piel tales como melasma, cloasma, ocronosis y lentigo.

Lo siguiente es una descripción de formulaciones que incorporan una enzima modificadora de lignina y se formulan para el aclaramiento de la piel o el pelo.

Aclaramiento de la piel

Para optimizar y controlar el aclaramiento de la piel, la enzima modificadora de lignina se incluye preferentemente en una composición cosmética que se formula para fines de aclaramiento de la piel.

Como la composición cosmética de aclaramiento de la piel de la presente invención se utiliza in vivo, la composición es preferentemente de alta pureza y está sustancialmente libre de contaminantes potencialmente perjudiciales, por ejemplo, al menos calidad de alimento nacional (NF), generalmente al menos calidad analítica, y preferentemente al menos calidad farmacéutica. Hasta el punto que un compuesto dado debe sintetizarse antes de uso, tal síntesis o posterior purificación debe producir preferentemente un producto que está sustancialmente libre de cualquier agente tóxico potencialmente contaminante que pueda ser usado durante la síntesis o procedimientos de purificación.

Principios activos

La lignina peroxidasa se incluye en la composición cosmética de la presente invención a una concentración seleccionada de un intervalo de 1-100 U/g. Según configuraciones presentemente conocidas, la enzima modificadora de lignina incluida en la composición cosmética de la presente invención se proporciona a una concentración seleccionada de un intervalo de 5-100 U/g. Se apreciará que una concentración preferida de la enzima modificadora de lignina está seleccionada según el uso específico de la composición, así, para el aclaramiento de la piel general, se utiliza una concentración preferida de 5-20 U/g, mientras que para el aclaramiento de pecas, se utiliza un intervalo más amplio de concentración de 5-100 U/g.

El aceptor de electrones (activador oxidante) usado por la composición cosmética de aclaramiento de la piel es preferentemente peróxido de hidrógeno proporcionado a una concentración de al menos el 0,005 %. El peróxido de

imagen6

imagen7

imagen8

5

15

25

35

45

55

65

E10176875

07-05-2015

3.959.461; McCutcheon's, Detergents & Emulsifiers (North-American edition 1979) M.C. Publishing Co.; y Schwartz, et al., Surface Active Agents, Their chemistry and Technology, New York: Interscience Publishers, 1949.

Alternativamente, otros emulsionantes catiónicos útiles incluyen amino-amidas. Ejemplos no limitantes de estos emulsionantes catiónicos incluyen fosfato de cloruro de estearamidopropil PG-dimonio, cloruro de behenamidopropil PG dimonio, etosulfato de estearamidopropiletildimonio, cloruro de estearamidopropildimetil (miristil acetato) amonio, tosilato de estearamidopropildimetilcetearilamonio, cloruro de estearamidopropildimetilamonio, lactato de estearamidopropildimetilamonio, y mezclas de los mismos.

La emulsión de aceite en agua preferida comprende de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 98 %, preferentemente de aproximadamente el 65 % a aproximadamente el 95 %, más preferentemente de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 90 % de agua en peso del vehículo tópico.

Composiciones tópicas

La composición cosmética puede formularse en cualquiera de una variedad de formas utilizadas por la industria cosmética para la aplicación a la piel que incluye disoluciones, lociones, esprays, cremas, pomadas, bálsamos, geles, etc., como se describe más adelante.

Preferentemente, la composición cosmética se formula suficientemente viscosa para permanecer sobre el área de piel tratada, no se evapora fácilmente y/o no se elimina fácilmente por aclarado con agua, sino que se elimina con la ayuda de jabones, limpiadores y/o champús.

Métodos para preparar composiciones que tienen tales propiedades son muy conocidos para aquellos expertos en la materia, y se describen en detalle en Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990 (arriba); y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th ed., Williams & Wilkins (1995).

Vehículos

Las composiciones tópicas de la invención objeto, que incluyen, pero no se limitan a, lociones y cremas, pueden comprender un emoliente dermatológicamente aceptable. Tales composiciones contienen preferentemente de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 50 % del emoliente. Como se usa en el presente documento, “emoliente” se refiere a un material útil para la prevención o alivio de sequedad, además de para la protección de la piel. Se conocen una amplia variedad de emolientes adecuados y pueden usarse en el presente documento. Véase, por ejemplo, Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2ª edición, vol. 1, pág. 3243 (1972), que contiene numerosos ejemplos de materiales adecuados como emoliente. Un emoliente preferido es glicerina. La glicerina se usa preferentemente en una cantidad de o aproximadamente el 0,001 a o aproximadamente el 20 %, más preferentemente de o aproximadamente el 0,01 a o aproximadamente el 10 %, lo más preferentemente de o aproximadamente el 0,1 a o aproximadamente el 5 %, por ejemplo, el 3 %.

Las lociones y cremas según la presente invención generalmente comprenden una sistema de vehículo en disolución y uno o más emolientes. Las lociones normalmente comprenden de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 20 %, preferentemente de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 10 % de emoliente; de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 90 %, preferentemente de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 80 % de agua; y una cantidad farmacéuticamente eficaz de un agente descrito en el presente documento. Una crema normalmente comprende de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 50 %, preferentemente de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 20 % de emoliente; de aproximadamente el 45 % a aproximadamente el 85 %, preferentemente de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 75 % de agua; y una cantidad farmacéuticamente eficaz de un agente descrito en el presente documento.

La composición cosmética tópicamente aplicada de la presente invención también puede incluir componentes adicionales que se añaden, por ejemplo, con el fin de enriquecer las composiciones cosméticas con fragancia y factores de nutrición de la piel.

Tales componentes se seleccionan adecuadamente para su uso sobre tejido queratinoso humano sin inducir toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, respuesta alérgica y similares dentro del alcance del criterio médico sensato. Además, tales componentes opcionales son útiles a condición de que no alteren inaceptablemente los beneficios de los compuestos activos de la invención.

The CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, segunda edición (1992), describe una amplia variedad de componentes cosméticos no limitantes comúnmente usados en la industria del cuidado de la piel, que son adecuados para su uso en las composiciones de la presente invención. Ejemplos de estas clases de componentes incluyen: abrasivos, absorbentes, componentes estéticos tales como fragancias, pigmentos, colores/colorantes, aceites esenciales, productos para la piel, astringentes, etc. (por ejemplo, aceite de clavo, mentol, alcanfor, aceite de eucalipto, eugenol, lactato de mentilo, destilado de hamamelis), agentes antiacné, agentes antiapelmazantes, agentes antiespumantes, agentes antimicrobianos (por ejemplo, butilcarbamato de yodopropilo), antioxidantes, aglutinantes, aditivos

5

15

25

35

45

55

65

E10176875

07-05-2015

biológicos, agentes de tamponamiento, agentes de carga, agentes quelantes, aditivos químicos, colorantes, astringentes cosméticos, biocidas cosméticos, desnaturalizantes, astringentes de fármacos, analgésicos externos, formadores o materiales de película, por ejemplo, polímeros, para ayudar en las propiedades de formación de películas y sustantividad de la composición (por ejemplo, copolímero de eicoseno y vinilpirrolidona), opacificantes, ajustadores del pH, propulsores, agentes reductores, secuestrantes, agentes acondicionadores de la piel (por ejemplo, humectantes, que incluyen diversos y oclusivos), agentes relajantes y/o de curación de la piel (por ejemplo, pantenol y derivados (por ejemplo, etilpantenol), aloe vera, ácido pantoténico y sus derivados, alantoína, bisabolol y glicirricinato de dipotasio), agentes de tratamiento de la piel, espesantes y vitaminas, y derivados de los mismos.

La composición cosmética puede aplicarse directamente a la piel. Alternativamente, puede administrarse mediante aplicación a la piel normal por diversos sistemas de administración de fármacos transdérmicos que se conocen en la técnica, tales como parches transdérmicos que liberan la composición en la piel en un modo de liberación con el tiempo. Otros sistemas de administración de fármacos conocidos en la técnicas incluyen frasco presurizado de aerosol, iontoforesis o sonoforesis. La iontoforesis se emplea para aumentar la permeabilidad de la piel y facilitar la administración transdérmica. Las patentes de EE.UU. nº 5.667.487 y 5.658.247 desvelan un aparato ionosónico adecuado para el transporte ultrasónico-iontoforéticamente mediado de agentes terapéuticos a través de la piel. Alternativamente, o además, también pueden emplearse liposomas o micelas como vehículo de administración.

Los principios activos incluidos en las composiciones cosméticas de la presente invención son adecuados para el aclaramiento de la piel mediante la oxidación de melanina. Sin embargo, la reacción de oxidación puede controlarse y detenerse cuando se desee mediante la adición de reactivos reductores. Estos reactivos pueden formularse en una composición cosmética separada y aplicarse sobre la piel cuando se desee.

Aclaramiento del pelo

Principios activos

Las composiciones de aclaramiento del pelo formuladas según las enseñanzas de la presente invención incluyen el agente de oxidación y mediador descritos anteriormente.

Como se demuestra en la sección de ejemplos más adelante, el aclaramiento del pelo puede lograrse en presencia de alcohol veratrílico 1,5 mM y peróxido de hidrógeno 8,8 mM en tampón tartrato a un pH de 3,5.

Emolientes

Los emolientes incluyen, pero no se limitan a, aceites y ceras de hidrocarburo, tales como aceite mineral, petrolato y similares, aceites y grasas vegetales y animales, tales como aceite de oliva, aceite de palma, aceite de ricino, aceite de maíz, aceite de soja y similares, y lanolina y sus derivados, tales como lanolina, aceite de lanoleno, cera de lanolina, alcoholes de lanolina y similares. Otros emolientes incluyen ésteres de ácidos grasos que tienen 10 a 20 átomos de carbono, tales como que incluyen mirístico, esteárico, isoesteárico, palmítico y similares, tales como miristato de metilo, miristato de propilo, miristato de butilo, estearato de propilo, isoestearato de propilo, palmitato de propilo y similares. Otros emolientes incluyen ácidos grasos que tienen 10 a 20 átomos de carbono, que incluyen esteárico, mirístico, láurico, isoesteárico, palmítico y similares. Los emolientes también incluyen alcoholes grasos que tienen diez a veinte átomos de carbono, tales como cetilo, miristilo, laurilo, isoestearilo, estearilo y similares.

Aunque algunos son solubles en agua, los alcoholes polihidroxilados y derivados de poliéter están incluidos como emolientes, que incluyen glicoles, glicerol, sorbitol, polialquilenglicoles y similares, tales como propilenglicol, dipropilenglicol, polietilenglicol 200-500 y similares. Se prefieren los ejemplos solubles en agua.

Tensioactivos

También se utiliza preferentemente un emulsionante/tensioactivo por la composición de aclaramiento del pelo de la presente invención.

Ejemplos de tensioactivos incluyen, pero no se limitan a, productos de condensación de poli(oxióxido de alquileno) de alquilo hidrófobo, alqueno, o grupos funcionales aromáticos de alquilo que tienen un hidrógeno reactivo libre disponible para la condensación con óxido de alquileno hidrófilo, poli(óxido de etileno), óxido de propileno, óxido de butileno, poli(óxido de etileno) o polietilenglicol. Son particularmente eficaces los productos de condensación de octilfenol con aproximadamente 7 a aproximadamente 13 moles de óxido de etileno, comercializados por Rohm & Haas Company bajo sus productos de la serie TRITON 100® de marca registrada.

Otros componentes tales como fragancias, agentes estabilizantes, colorantes, agentes antimicrobainos, agentes antibacterianos, antiaglomerantes, absorbentes de radiación ultravioleta y similares también están incluidos en la composición de aclaramiento del pelo de la presente invención.

Acondicionadores

imagen9

imagen10

5

15

25

35

45

55

65

E10176875

07-05-2015

ANTECEDENTES

Lignina peroxidasas en el hongo P. chrysosporium

Hay más de 12 proteínas hemo que muestran actividad ligninolítica en el fluido extracelular de cultivos de P. chrysosporium BKM-F-1767. Éstas pueden clasificarse en dos tipos de peroxidasas hemo glucosiladas, lignina peroxidasa (LIP) y manganeso peroxidasa (MNP). Se ha informado que las isoenzimas H1, H2, H6, H7, H8 y H10 son LIP y se han identificado H3, H4, H5 y H9 como MNP (Farrell et al., 1989). Las isoenzimas LIP de P. chrysosporium están codificadas por una familia de genes estructuralmente relacionados y son diferentes en sus características físicas, especificidad y estabilidad por sustrato (Farrell et al., 1989; Stewart et al., 1992). Como parte del proceso que conduce a su secreción, las isoenzimas de LIP se escinden proteolíticamente y se glucosilan (Ghose, 1987; Ritch et al., 1991; Tien y Kirk, 1984). Además, se ha informado que las isoenzimas de LIP H2, H6, H8 y H10 están fosforiladas en un resto de manosa 6-fosfato, contenido en el sacárido ligado a asparagina. El análisis de fluido extracelular envejecido ha conducido a la sugerencia de que la isoenzima H1 se deriva probablemente de desfosforilación postraduccional de H2 (Kuan y Tien, 1989).

La expresión de las enzimas ligninolíticas por P. chrysosporium es un acontecimiento idiofásico desencadenado por la limitación de nitrógeno o carbono y depende mucho de las condiciones de cultivo y la composición del medio (Dosoretz y Grethlein, 1991; Faison y Kirk, 1985; Stewart et al., 1992; van der Woude et al., 1993). La formación de LIP es particularmente dependiente de la exposición de cultivos a altas tensiones de oxígeno (Dosoretz et al., 1990; Faison y Kirk, 1985). Se ha propuesto que la transferencia de oxígeno en cultivos estacionarios está limitada, y por consiguiente se necesita una alta presión de oxígeno parcial en el espacio de cabeza del cultivo para poner a disposición oxígeno suficiente para las hifas sumergidas (Leisola et al., 1983; Michel et al., 1992). Se observó la formación de LIP en un cultivo que se expuso a aire inmovilizando el hongo sobre un soporte poroso en un cultivo líquido no sumergido, que mejoró la disponibilidad del oxígeno para el hongo (Dosoretz et al., 1990; Popp et al., 1990). La concentración de Mn2+ en el medio afecta adversamente la formación de LIP y MNP. Aunque la formación de MNP depende del Mn, que potencia la transcripción de MNP, la formación de LIP se inhibe por Mn. Rothschild et al., (1999) mostraron que en tanto cultivos de nitrógeno limitado como de exceso de nitrógeno de P. chrysosporium, el alto nivel de oxígeno requerido para la formación de LIP podría sustituirse por deficiencia de Mn.

MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES

Crecimiento del hongo Phanerochaete chrysosporium para la producción de lignina peroxidasa - El hongo Phanerochaete chrysosporium BKMF-1767 (ATCC 24725) se mantuvo a 4 ºC sobre 2 % de disolución madre de agar inclinado de extracto de malta (Difco, Detroit, MI, EE.UU.).

Preparación de la suspensión de esporas - Se obtuvieron esporas del hongo inoculando tapones de disoluciones madre de agar inclinado en placas de Petri que contenían agar de dextrosa de patata (PDA) esterilizado en autoclave a una concentración de 39 g/litro. A continuación, las placas de PDA se incubaron durante hasta 2 semanas a 37 ºC. Para la preparación de la suspensión de esporas, placas de PDA se cubrieron con 0,9 % de NaCl, la suspensión de conidios se filtró a través de lana de vidrio estéril y se recogió la suspensión de esporas. A continuación, la suspensión de esporas se mantuvo congelada a -80 ºC.

Preparación del inóculo - Se inocularon esporas en un medio de inóculo esterilizado (véase la formulación en el presente documento más adelante) a una concentración final de 7,5 x 105 esporas/ml. Se añadieron noventa ml de la mezcla a cada lote de fermentación (Tien y Kirk, 1988. Meth. Enzymol. 161: 238-490; Dosoretz et al., 1990, Appl. Microbiol. Biotechnol. 34: 131-7), y a continuación los lotes se taparon con tapones de algodón. Los cultivos se cultivaron estáticamente durante 48 h a 37 ºC como cultivos superficiales. Para la inoculación de cultivos, los contenidos de los lotes de fermentación se mezclaron durante 2 min con una mezcladora (Waring, Inglaterra).

Crecimiento del hongo en fermentador de reactor de tanque con agitación (STR) - Antes del crecimiento del hongo, se depositó espuma de poliuretano alrededor de los tubos de refrigeración del fermentador y se esterilizó el fermentador STR entero. Entonces se vertieron diez litros de un medio de fermentador (véase la formulación en el presente documento más adelante) en el fermentador STR y se añadieron 900 ml de inóculo mezclado (el contenido de 10 lotes de fermentación). El fermentador se conectó a un sistema de refrigeración para mantener una temperatura de 37 ºC y se agitó a 100 rpm. Se introdujo aire esterilizado en el fermentador a 2 ml/min. El flujo se cambió a 4 ml/min después de 2 días de crecimiento. El crecimiento continuó durante 3-5 días.

Se preparó medio de inóculo mezclando las siguientes disoluciones y se esterilizó con un membrana de filtración de 0,45 µm (MSI, Westborough, MA, EE.UU.). Para la preparación de 1 litro de medio líquido se combinaron los siguientes componentes:

100 ml de medio básico para el crecimiento de P. chrysosporium x 10 (véase la formulación más adelante) 10 ml de disolución madre de CaCl2 (13,2 g/l) (Sigma-Aldrich Corp., St Louis, MO, EE.UU.). Concentración final 0,132 g/l 12 ml de disolución madre de glicerol (50 g/100 ml) (Frutarom, Israel). Concentración final 6 g/l.

imagen11

5

15

25

35

45

55

65

E10176875

07-05-2015

Fase aceitosa para la crema enzimática:

5 % de aceite mineral ligero;

2,5 % (peso/peso) de Dragorin 100 SEP (estearato de GMS & PEG-100, Dragoco, Alemania);

3 % (peso/peso) de alcohol cetílico (Cognis, Alemania);

0,2 % (peso/peso) de sorbato de potasio (Chisso Corp., Japón);

1 % (peso/peso) de brij 721 (Uniqema, Italia).

Preparación de la crema enzimática: Se calentaron las fases acuosa y aceitosa de la crema enzimática a 80 ºC y a continuación se mezclaron. La mezcla se homogeneizó durante 10 min y se enfrió a 55 ºC. Después el pH se ajustó a 3,5 con ácido láctico.

Cuando la mezcla se enfrió a 40 ºC, se añadió lignina peroxidasa (20-50 unidades/g). La mezcla enzimática se homogeneizó durante 1 min.

Crema activadora

Fase acuosa para la crema activadora:

82,888 (peso/peso) de DDW (RO Water, Israel);

0,1 % (peso/peso) de EDTA disódico (Merck, Alemania);

4 % (peso/peso) de transcutol (PEG-400, etoxidiglicol, Gattefosse, Francia);

0,1 % (peso/peso) de sorbato de potasio (Chisso Corp., Japón):

Fase aceitosa para la crema activadora:

3,5 % (peso/peso) de brij 72 (Steareth-2, Uniqema, Italia);

2,5 % (peso/peso) de brij 721 (Steareth-20, Uniqema, Italia);

5 % (peso/peso) de aceite mineral;

1,3 % (peso/peso) de alcohol cetílico (Cognis, Alemania);

0,5 % (peso/peso) de silicona 350 (Dimethicon, Dow Corning, EE.UU.);

0,1 % (peso/peso) de sorbato de potasio (Chisso Corp., Japón).

Preparación de la crema activadora - Se calentaron las fases acuosa y aceitosa de la crema activadora a 80 ºC y se mezclaron. La mezcla se homogeneizó durante 10 min, se enfrió a 45 ºC y se ajustó a pH 3,5 con ácido fosfórico.

Cuando la mezcla se había enfriado a 40 ºC se añadió peróxido de hidrógeno (Riedel-de Haen, Alemania) (0,012 % (peso/peso)) con agitación suave, se verificó el pH correcto y se homogeneizó la mezcla activadora durante 1 min.

Determinación del efecto de aclaramiento de la piel in vivo - Con el fin de cuantificar el efecto de LIP sobre el aclaramiento de la piel, se probó el color de la piel de la mano tratada usando tres longitudes de onda del cromámetro Minolta (CR-200, Japón): Minolta L mide oscuridad y brillo, Minolta A mide tonos rojos y Minolta B mide tonos amarillos. El aumento en los valores de Minolta L refleja el grado de brillo de la piel, es decir, mayores valores se corresponden con piel más brillante.

Resultados experimentales

Ejemplo 1

Purificación de LIP de P. chrysosporium

Preparación de H1 de LIP altamente purificada de P. chrysosporium - Con el fin de purificar la isoenzima H1 de LIP de P. chrysosporium, el hongo se cultivó en un fermentador STR (Figura 2) como se ha descrito en detalle en la sección de métodos anterior en este documento. Se detectó actividad de LIP inicial después de 48 h de crecimiento y se detectaron aumentos significativos en la actividad cuando el crecimiento se mantuvo hasta 120 h (Figura 3). Para la purificación de la isoenzima H1 de LIP, el fluido extracelular del hongo se recogió en la actividad de LIP pico (120 h). A continuación, la proteína isoenzima H1 de LIP se purificó y su concentración se determinó como se ha descrito en Métodos. Así, usando el aparato y condiciones anteriormente mencionadas, LIP puede producirse de manera fiable y su isoenzima H1 puede purificarse por HPLC.

Ejemplo 2

Optimización de melanina en una oxidación en fase acuosa

Usando LIP purificada

imagen12

imagen13

imagen14

E10176875

07-05-2015

Resultados de la prueba hipoalergénica

Nº: Sujeto Sexo Edad 20 minutos 24 horas 48 horas

8: D.P. F 65 0 0 0

9: E.T. F 46 0 0 0

10: I.M. F 58 0 0 0

11: M.I. F 40 0 0 0

12: G.O. F 30 0 0 0

13: M.L. F 49 0 0 0

14: S.A. M 22 0 0 0

15: C.B. F 38 0 0 0

16: B.A. F 34 0 0 0

17: S.I. F 45 0 0 0

18: K.S. F 35 0 0 0

19: S.S. F 28 0 0 0

20: F.H. F 26 0 0 0

21: R.S. F 44 0 0 0

22: A.A. F 25 0 0 0

23: S.T. M 21 0 0 0

24: F.A. M 38 0 0 0

25: S.S. F 42 0 0 0

26: S.R. M 49 0 0 0

27: S.I. M 19 0 0 0

28: C.T. F 32 0 0 0

29: C.J. M 35 0 0 0

30: H.P. F 30 0 0 0

31: F.S. F 36 0 0 0

32: P.A. F 45 0 0 0

33: P.N. M 51 0 0 0

34: M.R. F 30 0 0 0

35: S.L. F 31 0 0 0

36: T.I. F 23 0 0 0

37: V.I. F 30 0 0 0

38: L.A. F 45 0 0 0

39: T.R. F 43 0 0 0

40: C.D. F 38 0 0 0

41: S.S. F 36 0 0 0

42: L.B. F 36 0 0 0

43: M.L. F 31 0 0 0

44: A.T. M 37 0 0 0

45: G.K. F 42 0 0 0

46: B.P. F 51 0 0 0

47: L.T. F 56 0 0 0

48: I.V. F 35 0 0 0

49: P.O. F 43 0 0 0

50: C.P. F 31 0 0 0

Tabla 3: Los resultados de una prueba hipoalergénica como se clasificó 20 minutos, 24 horas o 48 horas tras la eliminación de la aplicación.

La sensibilización y exposición de piel normal a la crema de LIP produjo ausencia de cualquier reacción de la piel -

La crema de LIP se insertó en los parches y se llevó a cabo la prueba repetida de irritabilidad dérmica en personas en 50 voluntarios sanos. Tras cada aplicación del parche, se registró la reacción de la piel usando la escala de clasificación descrita en la sección de métodos anterior en este documento. Como se muestra en la Tabla 4 en el presente documento a continuación, en los 50 voluntarios no hubo reacción de la piel visible durante las 9 aplicaciones de crema de la fase de inducción, además de tras la última aplicación de la fase de exposición.

Tabla 4

Resultados de las pruebas de inducción y exposición de la crema de LIP

Nº: Sujeto Sexo Edad Resultados según la escala de clasificación

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1.: D.P. M 37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2.: G.B. F 62 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3.: Z.A. F 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

4.: S.E. F 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

E10176875

07-05-2015

Resultados de las pruebas de inducción y exposición de la crema de LIP

Nº: Sujeto Sexo Edad Resultados según la escala de clasificación

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10

5.: E.R F 61 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6.: G.C. F 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

7.: S.S. F 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

8.: D.P. F 65 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

9.: E.T. F 46 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

10.: I.M. F 58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

11.: M.I. F 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12.: G.O. F 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

13.: M.L. F 49 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

14.: S.A. M 22 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

15.: C.B. F 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

16.: B.A. F 34 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

17.: S.I. F 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

18.: K.S. F 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

19.: S.S. F 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

20.: F.H. F 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

21.: R.S. F 44 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

22.: A.A. F 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

23.: S.T. M 21 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

24.: F.A. M 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

25.: S.S. F 42 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

26.: S.R. M 49 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

27.: S.I. M 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

28.: C.T. F 32 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

29.: C.J. M 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

30.: H.P. F 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

31.: F.S. F 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

32.: P.A. F 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

33.: P.N. M 51 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

34.: M.R. F 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

35.: S.L. F 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

36.: T.I. F 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

37.: V.I. F 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

38.: L.A. F 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

39.: T.R F 43 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

40.: C.D. F 38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

41.: S.S. F 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

42.: L.B. F 36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

43.: M.L. F 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

44.: A.T. M 37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

45.: G.K. F 42 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

46.: B.P. F 51 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

47.: L.T. F 56 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

48.: I.V. F 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

49.: P.O. F 43 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

50.: C.P. F 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabla 4: Puntuaciones de clasificación tras cada aplicación de parche en la fase de inducción (resultados de puntuación nº 1-9) y la fase de exposición (resultados de puntuación nº 10). M = masculino; F = femenino.

Prueba dermatológica sobre piel sensible - Para caracterizar adicionalmente las propiedades sensibilizantes de la crema de LIP se llevó a cabo una prueba de parche de irritación en 50 voluntarios sanos sobre piel sensible. En la pre-prueba, se encontró que 11 sujetos tenían diversos grados de escozor: 2 con piel sensible grave, 8 con piel

5 moderadamente sensible y 1 con piel ligeramente sensible. El parche irritante que incluye la crema de LIP se colocó sobre la espalda de los voluntarios durante 48 horas. El área probada se inspeccionó tras 1 h, 24 h y 48 horas y se encontró que no hubo reacción de la piel en ninguno de los 50 voluntarios.

Estos resultados descartan reacciones hipoalergénicas e irritantes a la crema de LIP en piel normal y sensible.

10 Además, los resultados de la prueba repetida de irritabilidad dérmica en personas sugieren adicionalmente el uso de la crema de LIP como una composición cosmética segura.

imagen15

Claims

imagen1