ES2536745T3 - Métodos de producción de composiciones de vacuna contra la gripe - Google Patents

Abstract

Un método para aumentar el rendimiento de partículas de virus reagrupados de la gripe B adaptados al frío, método que comprende: (a) la introducción de una pluralidad de virus reagrupados de la gripe B adaptados al frío en huevos de gallina embrionados SPF; (b) la incubación de los huevos hospedadores a una temperatura de 31 ± 0,5 ºC; y, (c) la recuperación de las partículas de virus de la gripe a partir de los huevos hospedadores, mediante lo cual el rendimiento, cuantificado mediante la determinación de un título logarítmico medio del cultivo tisular infeccioso por mililitro de dosis (log10 de la TCID50/ml) del líquido alantoideo de los huevos hospedadores es de al menos 1,01 veces el rendimiento obtenible mediante el cultivo de los huevos a 33 ºC.

Description

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12-05-2015

población de células hospedadoras con aproximadamente 2 µl de TransIT-LT1 diluido en 160 µl de medio, preferiblemente medio exento de suero, en un volumen total de 200 µl. Las mezclas de ADN:reactivo de transfección se incuban a la temperatura ambiente durante 45 minutos, seguido de la adición de 800 µl de medio. La mezcla de transfección se añade a las células hospedadoras, y las células se cultivan como se ha descrito anteriormente o mediante otros métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Consecuentemente, para la producción de virus recombinantes o reagrupados en un cultivo celular, se mezclan los vectores que incorporan cada uno de los 8 segmentos genómicos (PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA y NA) con aproximadamente 20 µl de TransIT-LT1 y se transfectan en células hospedadoras. Opcionalmente, el medio que contiene suero es sustituido antes de la transfección por medio exento de suero, por ejemplo, Opti-MEM I, e incubado durante 4 -6 horas.

Alternativamente, puede emplearse una electroporación para la introducción de dichos vectores que incorporan los segmentos genómicos de la gripe en las células hospedadoras. Véase la Publicación PCT WO 05/062820. Por ejemplo, los vectores de plásmido que incorporan un virus de la gripe A o B son favorablemente introducidos en células Vero mediante el uso de una electroporación de acuerdo con el siguiente procedimiento. En resumen, se resuspenden aproximadamente 5 x 106 células Vero, por ejemplo, cultivadas en medio de Eagle modificado (MEM) complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 % en 0,4 ml de OptiMEM y se colocan en una cubeta de electroporación. Se añaden veinte microgramos de ADN en un volumen de hasta 25 µl a las células de la cubeta, que a continuación se mezclan suavemente con golpecitos. La electroporación se lleva a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (por ejemplo, BioRad Gene Pulser II con un Capacitance Extender Plus conectado) a 300 v, 950 microF con un tiempo constante de entre 28 -33 ms. Las células se mezclan de nuevo golpeando suavemente y, aproximadamente 1 -2 minutos después de la electroporación, se añaden directamente 0,7 ml de MEM con un 10 % de FBS a la cubeta. Después las células se transfieren a dos pocillos de una placa de cultivo tisular estándar de 6 pocillos que contiene 2 ml de MEM, un 10 % de FBS. La cubeta se lava para recuperar cualquier resto de células y la suspensión de lavado se divide entre los dos pocillos. El volumen final es de 3,5 ml. Después, las células se incuban en unas condiciones permisivas para el crecimiento vírico, por ejemplo, aproximadamente a 33 ºC para las cepas adaptadas al frío.

En algunos métodos (por ejemplo, en los que se usan células hospedadoras para la producción de virus para la producción de una vacuna), las células hospedadoras se cultivan y se infectan con el virus de acuerdo con métodos bien conocidos en la materia. Por ejemplo, la infección de las células cultivadas se lleva a cabo preferiblemente cuando las células han conseguido una densidad celular óptima (por ejemplo, entre aproximadamente 5 x 105 y 20 x 106 células/ml, dependiendo de las condiciones de cultivo utilizadas). Las células hospedadoras se infectan a una multiplicidad de infección (m.o.i.) de desde aproximadamente 0,001 hasta aproximadamente 10 (opcionalmente, a una m.o.i. de desde aproximadamente 0,002 hasta aproximadamente 0,5). Generalmente, una replicación eficiente de virus en células animales requiere la adición de una proteasa (por ejemplo, una proteasa de serina, tal como tripsina), opcionalmente la proteasa puede añadirse al cultivo poco antes, simultáneamente o poco después de la infección. De acuerdo con la presente invención, después de la infección vírica, las células infectadas se cultivan adicionalmente para replicar los virus a unas temperaturas de menos de 33 ºC, por ejemplo, a 31 ºC (u opcionalmente a entre aproximadamente 29 ºC y aproximadamente 32 ºC), generalmente hasta que se detecta un efecto citopático máximo o una cantidad máxima de virus (por ejemplo, el ensayo de la TCID50 y el ensayo de la Q RT-PCR). Opcionalmente, el cultivo de las células infectadas células se realiza durante entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10 días. Algunos métodos específicos útiles para la producción de sobrenadantes celulares que contienen virus son conocidos en la materia (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. 4.500513, 6.656.720,

6.455.298 y 6.146.873). Se apreciará que opcionalmente se usan otras etapas (tanto similares como diferentes) con los métodos de la invención.

Kits

Para facilitar el uso de los métodos y las composiciones de la invención, cualquiera de los componentes y/o de las composiciones de la vacuna, por ejemplo, virus en diversas formulaciones, etc., y los componentes adicionales, tales como tampón, células, medio de cultivo, los útiles para el envasado y la infección de los virus de la gripe con fines de vacunas experimentales o terapéuticas pueden ser envasados en forma de un kit. Normalmente, el kit contiene, además de los componentes anteriores, materiales adicionales que pueden incluir, por ejemplo, instrucciones para la realización de los métodos de la invención, material de envasado y un recipiente.

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