ES2536877T3

ES2536877T3 - Muteínas de citocina

Info

Publication number: ES2536877T3
Application number: ES08842066.6T
Authority: ES
Inventors: Manuel Baca
Original assignee: CSL Ltd
Current assignee: CSL Ltd
Priority date: 2007-10-26
Filing date: 2008-10-24
Publication date: 2015-05-29
Anticipated expiration: 2028-10-24
Also published as: JP2011501754A; EP2215113A1; EP2215113A4; EP2215113B1; CA2703544C; AU2008316249B2; US20090191148A1; US8540977B2; US20110300100A1; AU2008316249A1; WO2009052588A1; JP5330398B2; US7993637B2; CA2703544A1

Abstract

Una muteína de IL-11 que muestra unión potenciada a la cadena alfa del receptor de IL-11, en la que la secuencia de aminoácidos AMSAG en la posición 58 a 62 de IL-11 de mamífero de tipo salvaje está sustituida por la secuencia de aminoácidos PAIDY o FMQIQ.

Description

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175 de SEC ID NO:14, SEC ID NO:15, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:15, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:15, SEC ID NO:16, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:16, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:16, SEC ID NO:17, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:17, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:17, SEC ID NO:18, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:18, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:18, SEC ID NO:19, aminoácidos 10 a

5 178 de SEC ID NO:19, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:19, SEC ID NO:20, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:20, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:20, SEC ID NO:21, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:21 o aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:21.

La presente invención también proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una muteína de IL-11 descrita aquí.

10 En otro aspecto, la presente invención proporciona una muteína de IL-11 que está PEGilada.

En otro aspecto, la presente invención contempla una composición farmacéutica para uso en un método para el tratamiento de una afección mediada por IL-11.

La presente invención se refiere además al uso de una muteína de IL-11 de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección mediada por IL-11.

15 Una afección mediada por IL-11 incluye (a) cualquier afección que se beneficie o se pueda beneficiar de incrementar el tratamiento con IL-11 exógena o un antagonista de IL-11, por ejemplo trombocitopenia, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, infertilidad, y daño mucosal por quimioterapia y/o terapia de radiación; y (b) cualquier afección que se beneficie o se pueda beneficiar del tratamiento de un antagonista de IL-11 para reducir o bloquear la actividad de IL-11 endógena, por ejemplo afecciones que pueden dar como resultado masa ósea total

20 disminuida, incluyendo cáncer de huesos metastásico, mieloma, enfermedad de Paget del hueso y osteoporosis, y fertilidad (es decir, se puede usar un antagonista de IL-11 como anticonceptivo). En una realización, el antagonista de muteína de IL-11 comprende una sustitución de AMSAG en la posición de aminoácido 58 a 62 junto con una mutación que interrumpe la unión a gp130. Un ejemplo de esto último es una mutación en el aminoácido 147 (por ejemplo, una mutación W147 o una sustitución W147A o W147C).

25 La presente invención se extiende a composiciones que comprenden muteínas de IL-11 de la presente invención y uno o más vehículos y/o diluyentes y/o excipiente farmacéuticamente aceptables.

TABLA 1

Sumario de identificadores de secuencia

SECUENCIA Nº: DESCRIPCIÓN

1: Secuencia de aminoácidos de IL-11 madura humana

2: Secuencia de aminoácidos de IL-11 madura murina

3: Secuencia de aminoácidos de IL-11 madura de macaco

4: Secuencia de aminoácidos de muteína de IL-11 PAIDY de macaco

5: Secuencia de aminoácidos de muteína de IL-11 PAIDY humana

6: Secuencia de aminoácidos de muteína de IL-11 PAIDY murina

7: Secuencia de aminoácidos de muteína de IL-11 FMQIQ humana

8: Secuencia de aminoácidos de muteína de IL-11 FMQIQ murina

9: Secuencia de aminoácidos de muteína de IL-11 PAIDY y W147A humana

10: Secuencia de aminoácidos de muteína de IL-11 PAIDY y W147A murina

11: Secuencia de aminoácidos de muteína de IL-11 PAIDY y W147C humana

12: Secuencia de aminoácidos de muteína de IL-11 PAIDY y W147C murina

13: Secuencia de aminoácidos de muteína de IL-11 FMQIQ de macaco

14: Secuencia de aminoácidos de muteína de IL-11 PAIDY y W147A de macaco

15: Secuencia de aminoácidos de muteína de IL-11 PAIDY y W147C de macaco

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178 de SEC ID NO:10, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:11, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:11, SEC ID NO:12, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:12, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:12, SEC ID NO:13, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:13, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:14, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:14, SEC ID NO:15, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:15, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:15, SEC ID NO:16, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:16, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:16, SEC ID NO:17, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:17, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:17, SEC ID NO:18, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:18, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:18, SEC ID NO:19, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:19, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:19, SEC ID NO:20, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:20, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:20, SEC ID NO:21, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:21 o aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:21.

La presente invención también proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican las muteínas de IL-11 descritas aquí. Una secuencia de ácido nucleico o un ácido nucleico incluye un polinucleótido o molécula de ácido nucleico.

La presente invención emplea técnicas de biología molecular, microbiología, y ADN recombinante convencionales para modificar las secuencias de ácido nucleico de IL-11 de tipo salvaje para producir las muteínas de IL-11 de la presente invención. Las técnicas son bien conocidas en la técnica, y se describen en diversas publicaciones, tales como Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, 1989.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985), Ausubel, et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994, Sidhu et al, Methods Enzymol 328:333-363, 2000) y Kunkel et al, Methods Enzymol 204: 1991.

Los términos “polinucleótido”, “ácido nucleico” o “molécula de ácido nucleico” se refiere a la forma polimérica de éster de fosfato de ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; “moléculas de ARN”) o desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina, o desoxicitidina; “moléculas de ADN”), o cualesquiera análogos de fosfoéster de los mismos, tales como fosforotioatos y tioésteres, en forma monocatenaria, en forma bicatenaria, o de otro modo.

Las expresiones “secuencia polinucleotídica”, “secuencia de ácido nucleico” o “secuencia nucleotídica” se refieren a una serie de bases nucleotídicas (también denominadas como “nucleótidos”) en un ácido nucleico, tal como ADN o ARN, y significa cualquier cadena de dos o más nucleótidos.

Las expresiones “secuencia codificante” o una secuencia “que codifica” un producto de expresión, tal como un ARN, polipéptido, proteína, o enzima, es una secuencia nucleotídica que, cuando se expresa, da como resultado la producción del producto.

El término “gen” significa una secuencia de ADN que codifica o corresponde a una secuencia particular de ribonucleótidos o aminoácidos que comprenden toda o parte de una o más moléculas de ARN, proteínas o enzimas, y puede incluir o no secuencias de ADN reguladoras, tales como secuencias promotoras, que determinan, por ejemplo, las condiciones en las que se expresa el gen. Los genes se pueden transcribir a partir de ADN a ARN, que se puede traducir o no en una secuencia de aminoácidos.

La expresión “amplificación” de secuencia nucleotídica, como se usa aquí, puede significar el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para incrementar la concentración de una secuencia nucleotídica particular en una mezcla de secuencias nucleotídicas. Saiki, et al, Science 239:487, 1988 proporcionan una descripción de la PCR.

El término “oligonucleótido” se refiere a un ácido nucleico, generalmente de al menos 10, particularmente al menos 15, y más particularmente al menos 20 nucleótidos, particularmente no más de 100 nucleótidos, que se puede hibridar a una molécula de ADN genómico, a una molécula de ADNc, o a una molécula de ARNm que codifica un gen, ARNm, ADNc, u otro ácido nucleico de interés. Los oligonucleótidos se pueden marcar, por ejemplo, mediante incorporación de 32P-nucleótidos, 3H-nucleótidos, 14C-nucleótidos, 35S-nucleótidos, o nucleótidos a los que se ha conjugado covalentemente un marcador, tal como biotina. En una realización, un oligonucleótido marcado se puede usar como sonda para detectar la presencia de un ácido nucleico. En otra realización, se pueden usar oligonucleótidos (de los cuales uno o ambos pueden estar marcados) como cebadores de la PCR, ya sea para clonar la longitud completa o un fragmento del gen, o para detectar la presencia de ácidos nucleicos. Generalmente, los oligonucleótidos se preparan sintéticamente, de forma preferible en un sintetizador de ácidos nucleicos.

La secuencia de cualquier ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una proteína de IL-11 de tipo salvaje o una muteína de IL-11) se puede secuenciar mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como mediante secuenciación química o secuenciación enzimática. La “secuenciación química” del ADN se puede realizar mediante el método de Maxam y Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74(2): 560-564, 1977), en el que el ADN se escinde aleatoriamente usando reacciones específicas de bases individuales. La “secuenciación enzimática” del ADN se puede realizar mediante el método de Sanger (Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74(12):5463 5467, 1977).

Los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden flanquear por secuencias reguladoras (de control de la

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intercambiables incluyen histidina, lisina y arginina. Preferiblemente, las variantes conservativas de funciones de las muteínas de IL-11 de la invención tienen menos de 20, más preferiblemente menos de 15, más preferiblemente menos de 10 cambios de aminoácidos.

También están incluidas en la presente invención muteínas de IL-11 en las que las secuencia de aminoácidos AMSAG (SEC ID NO:23) en las posiciones 58 a 62 de IL-11 de mamífero de tipo salvaje está sustituida por la secuencia de aminoácidos PAIDY (SEC ID NO:24) o FMQIQ (SEC ID NO:25) y que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos 85% idénticas, particularmente al menos 90% idénticas, más particularmente al menos 94% idénticas (por ejemplo 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) a las secuencias de aminoácidos descritas aquí cuando la comparación se realiza mediante un algoritmo BLAST en el que los parámetros del algoritmo se seleccionan para dar la coincidencia más grande entre las secuencias respectivas a lo largo de toda la longitud de las secuencias de referencia respectivas.

Identidad de secuencias se refiere a coincidencias exactas entre los aminoácidos de dos secuencias que se están comparando.

Las descripciones para los algoritmos BLAST se pueden encontrar en las siguientes referencias que se incorporan aquí como referencia: BLAST ALGORITHMS: Altschul et al, J Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Altschul et al, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Altschul, J. Mol. Biol. 219:555-565, 1991.

Las muteínas de IL-11 de la presente invención se pueden producir recombinantemente, por ejemplo en un sistema de expresión de E. coli. La transformación puede ser mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedante. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica, e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación y encapsulamiento del polinucleótido o polinucleótidos en liposomas, inyección biolística y microinyección directa del ADN en los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico se pueden introducir en células de mamífero mediante vectores víricos. Los métodos para transformar células son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes US nos 4.399.216; 4.912.040; 4.740.461 y 4.959.455.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para la producción de una muteína de IL-11 de la invención, comprendiendo dicho método clonar una secuencia de ácido nucleico que codifica una muteína de IL-11 en un vector apropiado, transformar una estirpe celular hospedante con el vector, y cultivar la estirpe celular hospedante transformada en condiciones adecuadas para la expresión de las muteínas de IL-11 de la presente invención.

Los vectores disponibles para la clonación y expresión en estirpes celulares hospedantes son bien conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, vectores para la clonación y expresión en estirpes celulares de mamíferos, vectores para la clonación y expresión en estirpes celulares bacterianas, y vectores para la clonación y expresión en estirpes celulares de insectos. Las muteínas de IL-11 se pueden recuperar usando métodos de purificación de proteínas estándar.

En otro aspecto, la presente invención proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican muteínas de IL-11 que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID NOs:5 a 12.

En todavía un aspecto adicional, la presente invención proporciona estirpes celulares hospedantes transformadas con los vectores de la presente invención. Las estirpes celulares hospedantes incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas, tales como E. coli, y estirpes celulares de mamíferos.

Las estirpes celulares de mamíferos disponibles como hospedantes para la expresión son bien conocidas en la técnica, e incluyen muchas estirpes celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC). Éstas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de riñón de hámster bebé (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep 02), células A549, células 3T3, y un número de otras estirpes celulares. Las células hospedantes de mamíferos incluyen células humanas, de ratón, de rata, de perro, de mono, de cerdo, de cabra, bovinas, de caballo y de hámster. Las estirpes celulares de preferencia particular se seleccionan determinando qué estirpes celulares tienen niveles altos de expresión. Otras estirpes celulares que se pueden usar son estirpes celulares de insectos, tales como células Sf9, células de anfibios, células bacterianas, células vegetales y células fúngicas. Cuando se introducen en las células hospedantes de mamíferos vectores de expresión recombinantes que codifican las muteínas de IL-11, las muteínas de IL-11 se producen cultivando las células hospedantes durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión de las muteínas de IL-11 en las células hospedantes o, más preferiblemente la secreción de las muteínas de IL-11 en el medio de cultivo en el que se hacen crecer las células hospedantes.

Las muteínas de IL-11 se pueden recuperar del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas estándar. Además, la expresión de muteínas de IL-11 de la invención procedentes de estirpes celulares de producción se puede potenciar usando un número de técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de glutamina sintetasa (el sistema GS) es un enfoque habitual para potenciar la expresión en ciertas

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condiciones. El sistema GS se explica en todo o en parte en relación con las Patentes Europeas nos 0.216.846, 0.256.055, y 0.323.997 y la Solicitud de Patente Europea nº 89303964.4.

Es probable que las muteínas de IL-11 expresadas por diferentes estirpes celulares o en animales transgénicos tendrán diferente glicosilación entre sí. Sin embargo, todas las muteínas de IL-11 codificadas por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas aquí, o que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas aquí, son parte de la invención, independientemente de la glicosilación de las muteínas de IL-11.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona muteínas de IL-11 humanas o murinas que se han modificado adicionalmente para potenciar sus propiedades farmacocinéticas y semivida in vivo. Las modificaciones incluyen PEGilación con polietilenglicol, (Clark et al, J Biol Chem. 271(36):21969-77, 1996), fusiones a grandes proteínas vivas largas tales como albúmina (Yeh et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 89(5):1904-8, 1992) o la porción Fc de una Ig (Ashkenazi y Chamow, Curr Opin Immunol. 9(2):195-200, 1997), y la introducción de sitios de glicosilación (Keyt et al, Proc Natl Acad Sci USA. 91(9):3670-4, 1994).

Un aspecto de la invención proporciona antagonistas de muteínas de IL-11 que están PEGilados.

Un aspecto de la presente invención proporciona muteínas de IL-11 que tienen las secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:11, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:11, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:11, SEC ID NO:12, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:12 aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:15, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:15, SEC ID NO:19, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:19, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:19, SEC ID NO:20, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:20, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:20, SEC ID NO:21, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:21 o aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:21 que están PEGiladas.

Las muteínas de IL-11 de la invención se pueden suministrar convenientemente en composiciones adecuadas para uso farmacéutico. Tales composiciones son otro aspecto de la presente invención.

La administración puede ser sistémica o local. La administración sistémica es particularmente útil. La referencia a “administración sistémica” incluye intraarticular, intravenosa, intraperitoneal, e inyección subcutánea, infusión, así como administración por vía oral, rectal y nasal, o por vía de inhalación.

Las composiciones adecuadas para uso sistémico incluyen disoluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua), polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones inyectables estériles, y polvos estériles para inhalación. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe de conservar frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser cualesquiera vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de tensioactivos. Se pueden incluir diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes para ajustar la tonicidad, por ejemplo azúcares y cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.

Las disoluciones estériles se preparan incorporando el ingrediente activo en la cantidad requerida en el disolvente apropiado y opcionalmente con otros ingredientes activos y excipientes según sea necesario, seguido de la esterilización por filtración u otros medios apropiados de esterilización. En el caso de polvos estériles, los métodos adecuados de preparación incluyen secado a vacío y la técnica de liofilización que produce un polvo de ingrediente activo más cualquier ingrediente adicionalmente deseado que se puede obtener en un tamaño de partículas apropiado.

Cuando el ingrediente activo se protege adecuadamente, se puede administrar oralmente, por ejemplo con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o se puede encerrar en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o se puede comprimir en comprimidos. Para la administración terapéutica oral, el ingrediente activo se puede incorporar con excipientes y se puede usar en la forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares.

Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo, o la dosis se puede reducir o incrementar proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidades de dosificación para la facilidad de administración y uniformidad de dosificación.

Un médico o veterinario que tenga pericia normal en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría iniciar dosis del antagonista, empleado en la composición farmacéutica, a niveles menores que los requeridos a fin de lograr el efecto terapéutico deseado, e incrementar gradualmente la dosis hasta que se logra el efecto deseado. En general, una dosis adecuada de una composición de la invención puede ser aquella cantidad del compuesto que sea la dosis

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Claims

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