ES2536978T3 - ADN polimerasas con discriminación incrementada de no correspondencias 3' - Google Patents

ADN polimerasas con discriminación incrementada de no correspondencias 3' Download PDF

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Abstract

ADN polimerasa que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80% respecto a SEC ID nº 1 y que presenta una actividad incrementada de discriminación de no correspondencias 3' en comparación con una ADN polimerasa de control, en la que la ADN polimerasa comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende K-L-K-X2-T-X3-X4-D-P-L-P, en la que: X2 es S o N, X3 es C o N, y X4 es V o I (SEC ID nº 11), y en la que el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 580 de SEC ID nº 1 es G y en la que la ADN polimerasa de control presenta la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa excepto en que el aminoácido X3 de la ADN polimerasa de control es Y.

Description

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ribosómica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que se encuentre posicionado de manera que facilite la traducción.
La expresión "célula huésped" se refiere a organismos unicelulares tanto procarióticos como eucarióticos (por ejemplo bacterias, levaduras y actinomicetos) y células individuales de plantas o animales de orden superior cultivados en cultivo celular.
El término "vector" se refiere a un trozo de ADN, típicamente de doble cadena, en el que puede haberse insertado un trozo de ADN foráneo. El vector puede ser, por ejemplo, de origen plasmídico. Los vectores contienen secuencias polinucleótidas de "replicón" que facilitan la replicación autónoma del vector en una célula huésped. El ADN foráneo se define como ADN heterólogo, que es ADN no presente naturalmente en la célula huésped, que, por ejemplo, replica la molécula del vector, codifica un marcador seleccionable o cribable, o codifica para un transgén. El vector se utiliza para transportar el ADN foráneo o heterólogo al interior de una célula huésped adecuada. Una vez dentro de la célula huésped, el vector puede replicarse independientemente o concurrentemente con el ADN cromosómico del huésped, y pueden generarse varias copias del vector y su ADN insertado. Además, el vector puede contener además los elementos necesarios que permiten la transcripción del ADN insertado para formar una molécula de ARNm o de otro modo provocar la replicación del ADN insertado en múltiples copias de ARN. Algunos vectores de expresión adicionalmente contienen elementos de secuencia contiguos al ADN insertado que incrementan la semivida del ARNm expresado y/o permiten la traducción del ARNm en una molécula de proteína. De esta manera, pueden sintetizarse rápidamente muchas moléculas de ARNm y del polipéptido codificado por el ADN insertado.
El término "nucleótido", además de referirse a los monómeros ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos naturales, en la presente memoria se entenderá que se refiere a Variantes estructurales relacionadas de los mismos, incluyendo derivados y análogos, que son funcionalmente equivalentes con respecto al contexto particular en el que se está utilizando el nucleótido (por ejemplo la hibridación con una base complementaria), a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
La expresión "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a un polímero que puede ser correspondiente de un ácido nucleico de ribosa (ARN) o un polímero ácido nucleico de desoxirribosa (ADN), o un análogo de los mismos. Lo anterior incluye polímeros de nucleótidos, tales como ARN y ADN, así como formas sintéticas, formas modificadas (por ejemplo química o bioquímicamente modificadas) de las mismas, y polímeros mixtos (por ejemplo subunidades de tanto ARN como ARN, entre otros). Entre las modificaciones ejemplares se incluyen metilación, sustitución de uno o más nucleótidos naturales por un análogo, modificaciones internucleótidas tales como enlaces sin carga (por ejemplo metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos y similares), fracciones colgantes (por ejemplo polipéptidos), intercalantes (por ejemplo acridina, psoralén y similares), quelantes, alquilantes y enlaces modificados (por ejemplo ácidos nucleicos anoméricos alfa y similares). También se encuentran incluidas moléculas sintéticas que imitan a los polinucleótidos en su capacidad de unirse a una secuencia designada, mediante enlaces de hidrógeno y otras interacciones químicas. Típicamente, los monómeros nucleótidos se unen mediante enlaces fosfodiéster, aunque algunas formas sintéticas de ácidos nucleicos pueden comprender otros enlaces (por ejemplo ácido péptido-nucleicos, tal como se indica en Nielsen et al., Science 254:1497-1500, 1991). Un ácido nucleico puede ser o puede incluir, por ejemplo, un cromosoma o segmento cromosómico, un vector (por ejemplo un vector de expresión), un casete de expresión, un polímero de ADN o ARN desnudo, el producto de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un oligonucleótido, una sonda y un cebador. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, de cadena sencilla, de doble cadena o de triple cadena, y no se encuentra limitado a ninguna longitud en particular. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácidos nucleicos comprende o codifica secuencias complementarias, además de cualquier secuencia indicada explícitamente.
El término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico que incluye por lo menos dos unidades monoméricas de ácidos nucleicos (por ejemplo nucleótidos). Un oligonucleótido típicamente incluye entre aproximadamente seis y aproximadamente 175 unidades monoméricas de ácidos nucleicos, más típicamente entre aproximadamente ocho y aproximadamente 100 unidades monoméricas de ácidos nucleicos, y todavía más típicamente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 unidades monoméricas de ácidos nucleicos (por ejemplo aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35 o más unidades monoméricas de ácidos nucleicos). El tamaño exacto de un oligonucleótido depende de muchos factores, incluyendo la función última o utilización del oligonucleótido. Los oligonucleótidos se preparan opcionalmente mediante cualquier método adecuado, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, el aislamiento de una secuencia existente o natural, la replicación o amplificación del ADN, la transcripción inversa, la clonación y la digestión de restricción de secuencias apropiadas, o la síntesis química directa mediante un método tal como el método de fosfotriéster de Narang et al. (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979), el método de fosfodiéster de Brown et al. (Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979), el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. 22:18591862, 1981); el método de triéster de Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981); los métodos de síntesis automatizada, o el método de soporte sólido de la patente US nº 4.458.066, u otros métodos conocidos por el experto en la materia.
El término "cebador" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un polinucleótido capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de ácidos nucleicos dirigida por molde en caso de encontrarse bajo condiciones en que 8
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rNTP), debido a que estos nucleótidos presentan un grupo hidroxilo en la posición 2' del azúcar que, por el contrario, se encuentra ausente en los dNTP, tal como se utiliza en la presente memoria, los ribonucleótidos son nucleótidos no convencionales como sustratos para las ADN polimerasas. Tal como se utiliza en la presente memoria, entre los nucleótidos no convencionales se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, compuestos utilizados como terminadores para la secuenciación de ácidos nucleicos. Entre los compuestos terminadores ejemplares se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, compuestos que presentan una estructura de 2',3'-dideoxi y se denominan dideoxinucleósidos trifosfato. Los dideoxinucleósidos trifosfato ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP se denominan colectivamente ddNTP. Entre los ejemplos adicionales de compuestos terminadores se incluyen los análogos 2'-PO4 de los ribonucleótidos (ver, por ejemplo, las solicitudes publicadas de patente US nº 2005/0037991 y nº 2005/0037398). Entre otros nucleótidos no convencionales se incluyen los dNTP fosforioato ([[α]-S]dNTPs), los dNTP 5’-[α]-borano, los dNTP [α]-metil-fosfonato y los ribonucleósidos trifosfato (rNTP). Las bases no convencionales pueden marcarse con isótopos radioactivos tales como 32P, 33P o 35S, marcajes fluorescentes, marcajes quimioluminiscentes, marcajes bioluminiscentes, marcajes haptenos tales como biotina, o marcajes enzimáticos tales como estreptavidina o avidina. Entre los marcajes fluorescentes pueden incluirse pigmentos con carga negativa, tales como pigmentos de la familia de la fluoresceína, o pigmentos de carga neutra, tales como pigmentos de la familia de la rodamina, o pigmentos con carga positiva, tales como los pigmentos de la familia de la cianina. Entre los pigmentos de la familia de la fluoresceína se incluyen, por ejemplo, FAM, HEX, TET, JOE, NAN y ZOE. Entre los pigmentos de la familia de la rodamina se incluyen rojo Texas, ROX, R110, R6G y TAMRA. Diversos pigmentos o nucleótidos marcados con FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G, rojo Texas y TAMRA son comercializados por Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA) o Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR). Entre los pigmentos de la familia de la cianina se incluyen Cy2, Cy3, Cy5 y Cy7 y son comercializados por GE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, Inglaterra).
Tal como se utiliza en la presente memoria, el "porcentaje de identidad de secuencias" se determina mediante la comparación de dos secuencias alineadas óptimamente en una ventana de comparación, en la que la parte de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se observa una base de ácidos nucleicos o residuo aminoácido idéntico en ambas secuencias, rindiendo el número de posiciones correspondientes, dividiendo el número de posiciones correspondientes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el número por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencias.
Los términos "idéntico" e "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Las secuencias son "sustancialmente idénticas" en el caso de que presenten un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos aminoácidos que son iguales (por ejemplo por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad en una región especificada), al comparar y alinear para la máxima correspondiente en una ventana de comparación o región designada según se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o mediante alineación manual e inspección visual. Estas definiciones también se refieren al complemento de una secuencia de ensayo. Opcionalmente, la identidad existe en una región que presenta una longitud de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, o más típicamente en una región de 100 o 500 o 1.000 o más nucleótidos de longitud.
Las expresiones "similitud" o "porcentaje de similitud" en el contexto de dos o más secuencias de polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que presentan un porcentaje especificado de residuos aminoácidos que son iguales o similares según definen las sustituciones conservadoras de aminoácidos (por ejemplo una similitud de 60%, opcionalmente similares al 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% en una región especificada), al compararse y alinearse para la máxima correspondencia en una ventana de comparación o región designada según se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguiente, o mediante alineación manual e inspección visual. Las secuencias son "sustancialmente similares" entre sí en el caso de que sean por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50% o por lo menos 55% similares entre sí. Opcionalmente, esta similitud existe en una región que presenta una longitud de por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos, o más típicamente en una región de por lo menos aproximadamente 100 a 500 o 1.000 o más aminoácidos de longitud.
Para la comparación entre secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con las que se comparan las secuencias de ensayo. Al utilizar un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de ensayo y de referencia en un ordenador, se fijan las coordenadas de la subsecuencia, en caso necesario, y se fijan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Habitualmente se utilizan los parámetros por defecto del programa, o pueden fijarse parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades o similitudes de secuencia para las secuencias de ensayo respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.
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la segunda derivada, un valor de Cp corresponde al primer pico de una curva de segunda derivada. Este pico corresponde al inicio de una fase log-lineal. El método de segunda derivada calcula un valor de segunda derivada de la curva de intensidad de fluorescencia en tiempo real y únicamente se obtiene un valor. El método de Cp original se basa en una aproximación diferenciable definida localmente de los valores de intensidad, por ejemplo mediante una función polinómica. A continuación se calcula la tercera derivada. El valor de Cp es la raíz más pequeña de la tercera derivada. El valor de Cp también puede determinarse utilizando el método de punto de ajuste, en el que se determina el valor de Cp como la intersección de una línea paralela a la línea umbral en la región log-lineal (Van Luu-The et al., BioTechniques, vol. 38, nº 2, febrero de 2005, páginas 287-293). Estos cálculos pueden ser fácilmente realizados por cualquier experto en la materia.
La expresión "eficiencia de PCR" se refiere a una indicación de la eficiencia de amplificación ciclo a ciclo para el molde de cebador perfectamente correspondiente. La eficiencia de la PCR se calcula para cada condición utilizando la ecuación: Eficiencia de PCR (%)=(10(-pendiente)-1) x 100, en la que la pendiente se calcula mediante regresión lineal con log número de copia en el eje y Cp en el eje x.
El término "multiplex" se refiere a la amplificación con más de un grupo de cebadores, o la amplificación de más de un sitio de polimorfismo en una única reacción.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0061] La figura 1 ilustra una alineación de secuencias de aminoácidos de una región del dominio de polimerasa de ADN polimerasas ejemplares de diversas especies de bacterias: Thermus especie Z05 (Z05) (SEC ID nº 12), Thermus aquaticus (Taq) (SEC ID nº 13), Thermus filiformus (Tfi) (SEC ID nº 14), Thermus flavus (Tfl) (SEC ID nº 15), Thermus species Sps17 (Sps17) (SEC ID Nº16), Thermus thermophilus (Tth) (SEC ID nº 17), Thermus caldophilus (Tca) (SEC ID nº 18), Thermotoga maritima (Tma) (SEC ID nº 19), Thermotoga neopolitana (Tne) (SEC ID nº 20), Thermosipho africanus (Taf) (SEC ID nº 21), Deinococcus radiodurans (Dra) (SEC ID nº 23), Bacillus stearothermophilus (Bst) (SEC ID nº 24) y Bacillus caldotenax (Bca) (SEC ID nº 25). Además, las regiones polipeptídicas mostradas comprenden el motivo de aminoácidos K-L-X1-X2-T-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEC ID nº 26), las posiciones variables del cual se definen adicionalmente en la presente memoria. Este motivo se subraya en negrita para cada secuencia de polimerasa. Las posiciones de aminoácidos que pueden mutar según la presente invención se indican con un asterisco (*). La figura 2 proporciona las identidades de secuencia entre los enzimas ADN polimerasa I siguientes: Thermus sp. ADN polimerasa Z05 (Z05); ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq); ADN polimerasa de Thermus filiformis (Tfi); ADN polimerasa de Thermus flavus (Tfl); ADN polimerasa Sps17 de Thermus sp. (Sps17); ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth); ADN polimerasa de Thermus caldophilus (Tca); ADN polimerasa de Deinococcus radiodurans (Dra); ADN polimerasa de Thermotoga maritima (Tma); ADN polimerasa de Thermotoga neopolitana (Tne); ADN polimerasa de Thermosipho africanus (Taf); ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus (Bst) y ADN polimerasa de Bacillus caldotenax (Bca). (A) identidades de secuencia a lo largo del enzima polimerasa I entero (correspondiente a los aminoácidos 1 a 834 de Z05), y (B) identidades de secuencia a lo largo del subdominio de polimerasa correspondiente a los aminoácidos 420 a 834 de Z05.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente invención proporciona ADN polimerasas mejoradas en las que se han identificado uno o más aminoácidos en el dominio de polimerasa que mejoran una o más actividades o características de las polimerasas. Las ADN polimerasas de la invención son enzimas activos que presentan una actividad incrementada de discriminación de no correspondencias 3' (es decir, las polimerasas de la invención indicadas en la presente memoria es menos probable que extiendan cebadores no correspondientes con el molde en el extremo 3' del cebador o próximo al mismo) respecto a la forma no modificada de la polimerasa que de otro modo es idéntica excepto por la diferencia de aminoácido indicada en la presente memoria. Las ADN polimerasas resultan útiles en una diversidad de aplicaciones que implican la extensión de polinucleótidos o la amplificación de moldes polinucleótidos, incluyendo, por ejemplo, aplicaciones en estudios de ADN recombinante y diagnóstico médico de enfermedades.
Polimerasas de la invención
Se dan a conocer ADN polimerasas que pueden caracterizarse porque presentan el motivo siguiente: Lys-Leu-X1-X2-Thr-X3-X4-Xs-X6-X7-X8 (también denominado en la presente memoria con el código de una letra: K-L-X1-X2-T-X3-X4-X5-X6-X7-X8), en el que:
X1 es Lys (K), Arg (R) o Gln (Q),
X2 es Ser (S), Asn (N) o Gly (G),
X3 es cualquier aminoácido diferente de Tyr (Y),
X4 es Val (V), Ile (I) o Leu (L),
X5 es Asp (D) o Glu (E),
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BAA02361). Los ejemplos de formas no modificadas de ADN polimerasas que pueden modificarse tal como se indica en la presente memoria también se describen en, por ejemplo, las patentes US nº 6.228.628, nº 6.346.379, nº 7.030.220, nº 6.881.559, nº 6.794.177 y nº 6.468.775, y las solicitudes de patente US nº 20040005599; 20020012970; 20060078928 y 20040115639. También se proporcionan secuencias representativas de polimerasas de longitud completa en el listado de secuencias.
En algunas realizaciones, la polimerasa de la invención, además de presentar un dominio de polimerasa que comprende SEC ID nº 8, 9, 10 o 11, también comprende un dominio de nucleasa (por ejemplo correspondiente a las posiciones 1 a 291 de Z05).
Se da a conocer además una polimerasa que es una polimerasa quimérica, es decir, que comprende regiones polipeptídicas de dos o más enzimas. Se describen ejemplos de dichas ADN polimerasas quiméricas en, por ejemplo, la patente US nº 6.228.628. Resultan particularmente adecuadas las ADN polimerasas de familia CS quiméricas, que incluyen las polimerasas CS5 (SEC ID nº 29) y CS6 (SEC ID nº 30) y Variantes de las mismas que presentan una identidad o similitud de secuencia sustancial con la SEC ID nº 29 o la SEC ID nº 30 (típicamente una identidad de secuencia de por lo menos 80%, más típicamente de por lo menos 90% y todavía más típicamente de por lo menos 95%) y de esta manera pueden modificarse para contener SEC ID nº 8. Las ADN polimerasas CS5 y CS6 son enzimas quiméricas derivadas de las ADN polimerasas de Thermus sp. Z05 y de Thermotoga maritima (Tma). Comprenden el dominio N-terminal de nucleasa 5' del enzima de Thermus y la exonucleasa 3'-5' C-terminal y los dominios de polimerasa del enzima Tma. Estos enzimas presentan una actividad de transcriptasa inversa eficiente, pueden extender cebadores que contienen análogos de nucleótidos y pueden utilizarse dNTP, dUTP, dITP alfa-fosforotioato y también dNTP marcados con pigmentos de la familia de la fluoresceína y de la familia de la cianina. Las polimerasas CS5 y CS6 también son enzimas de PCR activados por Mg2+ eficientes. Las polimerasas quiméricas CS5 y CS6 se describen adicionalmente en, por ejemplo, la solicitud publicada de patente US nº 2004/0005599.
En algunas realizaciones, la polimerasa de la invención comprende SEC ID nº 8, 9, 10 o 11 y comprende además uno o más cambios de aminoácidos adicionales (por ejemplo la sustitución, adición o deleción de aminoácidos) respecto a una polimerasa nativa. En algunas realizaciones, dichas polimerasas contienen el motivo de aminoácidos de SEC ID nº 8 (o un motivo de SEC ID nº 9, 10 o 11) y comprenden además el motivo de aminoácidos de SEC ID nº 27 (correspondiente a la mutación D580X de Z05 (SEC ID nº 1) siguiente:
T-G-R-L-S-s-X7-X8-P-N-L-Q-N, en el que
X7 es Ser (S) o Thr (T) y
X8 es cualquier aminoácido diferente de D o E (SEC ID nº 27).
La mutación caracterizada por SEC ID nº 27 se comenta en mayor detalle en, por ejemplo, la publicación de patente US nº 2009/0148891. En algunas realizciones, dichas polimerasas Variantes funcionales típicamente presentan una identidad o similitud de secuencia sustancial con la polimerasa de tipo salvaje o natural (por ejemplo SEC ID nº 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 39, 40, 41, 42, 43 o 44), típicamente una identidad de secuencia de por lo menos 80%, más típicamente de por lo menos 90% y todavía más típicamente de por lo menos 95%.
En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición X3 se sustituye con un aminoácido tal como se indica en SEC ID nº 8, 9, 10 o 11, y el aminoácido en la posición X8 se sustituye por un aminoácido tal como se indica en SEC ID nº
27. De esta manera, en algunas realizaciones, el aminoácido en la posición X3 es cualquier aminoácido diferente de Tyr (Y) y el aminoácido en la posición X8 es cualquier aminoácido diferente de Asp (D) o Glu (E). En algunas realizaciones, entre las sustituciones de aminoácidos se incluyen leucina (L), glicina (G), treonina (T), glutamina (Q), alanina (A), serina (S), asparagina (N), arginina (R) y lisina (K) en la posición X8 de SEC ID nº 27. En determinadas realizaciones, entre las sustituciones de aminoácidos se incluyen independientemente cisteína (C) o asparagina (N) en la posición X3 y glicina (G) en la posición X8. Pueden determinarse otra u otras sustituciones de aminoácidos adecuadas en uno o más de los sitios identificados, utilizando, por ejemplo, métodos de mutagénesis dirigida a sitio y determinación del rendimiento de extensión de polinucleótido en ensayos descritos adicionalmente en la presente memoria o de otro modo conocidos por el experto en la materia.
Debido a que la longitud exacta de las ADN polimerasas varía, las posiciones aminoácidas exactas correspondientes a cada uno de X3 y X8 pueden variar dependiendo de la polimerasa particular utilizada. Los programas de alineación de secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos se encuentran disponibles fácilmente (ver, por ejemplo, los indicados supra) y, dados los motivos particulares identificados en la presente memoria, sirven para ayudar en la identificación de los aminoácidos exactos (y codones correspondientes) para la modificación según la presente invención. Las posiciones correspondientes a cada uno de X3 y X8 se muestran en la Tabla 1 de ADN polimerasas termoestables quiméricas representativas y ADN polimerasas termoestables de especies termofílicas ejemplares.
Tabla 1. Posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones de motivo X3 (por ejemplo de SEC ID nº 8, 9, 10 y 11) y X8 (de SEC ID nº 27) en las polimerasas ejemplares.
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seguidamente puede cortarse y analizarse mediante electroforesis, tal como, por ejemplo, en un gel Mutation Detection Enhancement gel [gel de detección mejorada de mutaciones] (Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) para confirmar que no se han producido otras alteraciones en la secuencia (mediante comparación del desplazamiento de las bandas con el control no mutagenizado). Alternativamente, puede secuenciarse la región de ADN entera para confirmar que no se han producido sucesos de mutación adicionales en el exterior de la región diana.
Los dúplex mutantes verificados en vectores de sobreexpresión pET (u otro) pueden utilizarse para transformar E. coli, tal como, por ejemplo, la cepa E. coli BL21 (DE3) pLysS, para la producción de nivel elevado de la proteína mutante y la purificación mediante protocolos estándares. El método de mapeado FAB-MS, por ejemplo, puede utilizarse para comprobar rápidamente la fidelidad de la expresión del mutante. Esta técnica permite la secuenciación de segmentos de toda la proteína y proporciona la confianza necesaria en la asignación de las secuencias. En un experimento de mapeado de este tipo, se digirió la proteína con una proteasa (la elección dependerá de la región específica que debe modificarse, ya que este segmento es de gran interés y el mapa restante debería ser idéntico al mapa de la proteína no mutagenizada). El juego de fragmentos cortables se fracciona mediante, por ejemplo, HPLC microbore (de fase inversa o de intercambio iónico, nuevamente según la región específica que debe modificarse) para proporcionar varios péptidos en cada fracción y se determinan los pesos moleculares de los péptidos mediante métodos estándares, tales como FAB-EM. A continuación, se compara la masa determinada de cada fragmento con los pesos moleculares de los péptidos esperados de la digestión de la secuencia predicha y se determina rápidamente la corrección de la secuencia. Debido a que este enfoque de mutagénesis a la modificación de proteínas es dirigido, la secuenciación del péptido alterado no debería resultar necesaria en el caso de que los datos de la EM concuerden con la predicción. En caso de que resulte necesario para verificar un residuo modificado, puede utilizarse la EM/EM-CAD en tándem para secuenciar los péptidos de la mezcla en cuestión, o puede purificarse el péptido diana para degradación de Edman subtractiva o digestión con carboxipeptidasa Y, según la localización de la modificación.
Pueden generarse de diversas maneras ADN polimerasas mutantes con más de una sustitución de aminoácido. En el caso de los aminoácidos situados muy próximos entre sí en la cadena polipeptídica, pueden mutarse simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifica para la totalidad de las sustituciones de aminoácidos deseadas. Sin embargo, en el caso de que los aminoácidos se encuentren situados a cierta distancia unos de otros (separados por más de diez aminoácidos, por ejemplo), resulta más difícil generar un único oligonucleótido que codifique para todos los cambios deseados. En su lugar, puede utilizarse dos métodos alternativos. En el primer método, se genera un oligonucleótido separado para cada aminoácido que debe sustituirse. A continuación, los oligonucleótidos se hibridan con el ADN molde de cadena sencilla simultáneamente y la segunda cadena del ADN que se sintetiza a partir del molde codificará todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. Un método alternativo incluye dos o más rondas de mutagénesis para producir el mutante deseado. La primera ronda es tal como se ha indicado para los mutantes únicos: el ADN codificante de la polimerasa no modificada se utiliza para el molde, un oligonucleótido codificante de la primera o primeras sustituciones de aminoácidos deseadas se hibrida con dicho molde y seguidamente se genera la molécula de ADN heterodúplex. La segunda ronda de mutagénesis utiliza el ADN mutado que se ha producido en la primera ronda de mutagénesis a modo de molde. De esta manera, este molde ya contiene una o más mutaciones. El oligonucleótido codificante de la sustitución o sustituciones de aminoácidos deseadas adicionales seguidamente se hibrida con dicho molde y la cadena de ADN resultante ahora codifica mutaciones procedentes de tanto la primera como la segunda rondas de mutagénesis. Este ADN resultante puede utilizarse como molde en una tercera ronda de mutagénesis, y de esta manera sucesivamente. Alternativamente, puede utilizarse el método de mutagénesis multisitio de Seyfang y Jin (Anal. Biochem. 324:285291, 2004).
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, también se proporcionan ácidos nucleicos recombinantes que codifican cualquiera de las ADN polimerasas de la presente invención (por ejemplo polimerasas que comprenden cualquiera de entre SEC ID nº 8, 9, 10 o 11). Utilizando un ácido nucleico de la presente invención, codificante de una ADN polimerasa de la invención, puede generarse una diversidad de vectores. Cualquier vector que contenga replicón y secuencias de control que se derivan de una especie compatible con la célula huésped puede utilizarse en la práctica de la invención. Generalmente, entre los vectores de expresión se incluyen regiones de ácidos nucleicos reguladoras de la transcripción y de la traducción operablemente ligadas con el ácido nucleico codificante de la ADN polimerasa mutante. La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operablemente ligada en un organismo huésped particular. Entre las secuencias de control que resultan adecuadas para los procariotas se incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión ribosómica. Además, el vector puede contener un elemento retrorregulador positivo (ERP) para incrementar la semivida del ARNm transcrito (ver Gelfand et al., patente US nº 4.666.848). Las regiones de ácidos nucleicos reguladoras de transcripción y traducción generalmente resultarán apropiadas para la célula huésped utilizada para expresar la polimerasa. Se conocen de la técnica numerosos tipos de vectores de expresión apropiados, y secuencias reguladoras adecuadas, para una diversidad de células huésped. En general, entre las secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción pueden incluirse, por ejemplo, secuencias de promotor, sitios de unión ribosómica, secuencias de inicio y parada transcripcional, secuencias de inicio y parada traduccional y secuencias intensificadoras o activadoras. En realizaciones típicas, entre las secuencias reguladoras se incluyen un promotor y secuencias de inicio y parada transcripcional. Entre los
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fluorescencia) de marcaje dual y sondas de baliza molecular. En otra realización, el kit contiene un aptámero, por ejemplo para ensayos de PCR de inicio en caliente.
Mezclas de reacción
En otro aspecto de la presente invención se proporcionan mezclas de reacción que comprenden las polimerasas con actividad incrementada de discriminación de no correspondencias 3', tal como se describe en la presente memoria. Las mezclas de reacción pueden comprender además reactivos para la utilización en, por ejemplo, procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo PCR, RT-PCR), procedimientos de secuenciación del ADN o procedimientos de marcaje del ADN. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, las mezclas de reacción comprenden un tampón adecuado para una reacción de extensión de cebadores. Las mezclas de reacción pueden contener además un ácido nucleico molde (ADN y/o ARN), uno o más polinucleótidos cebadores o de sonda, nucleósidos trifosfato (incluyendo, por ejemplo, desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos marcados, nucleótidos no convencionales), sales (por ejemplo Mn2+, Mg2+) y marcajes (por ejemplo fluoróforos). En algunas realizaciones, la mezcla de reacción comprende además pigmentos de unión a ADN de doble cadena, tales como verde SYBR o pigmentos intercalantes de ADN de doble cadena, tales como bromuro de etidio. En algunas realizaciones, las mezclas de reacción contienen un cebador de sentido 5' hibridable, bajo condiciones de extensión de cebador, a un polinucleótido molde predeterminado, o una pareja de cebadores que comprende el cebador de sentido 5' y un cebador antisentido 3' correspondiente. En determinadas realizaciones, la mezcla de reacción comprende además una sonda de hidrólisis FRET fluorogénica para la detección de ácidos nucleicos de molde amplificados, por ejemplo una sonda Taqman®. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción contiene dos o más cebadores que son totalmente complementarios a polimorfismos de nucleótido único o a polimorfismos de múltiples nucleótidos. En algunas realizaciones las mezclas de reacción contienen dNTP alfa-fosforotioato, dUTP, dITP y/o dNTP marcados tales como, por ejemplo, dNTP-pigmento de la familia de la fluoresceína o de la familia de la cianina.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes se ofrecen a título ilustrativo, aunque no limitativo, de la invención reivindicada.
Ejemplo 1: identificación de ADN polimerasas mutantes con discriminación incrementada de no correspondencias 3'
La ADN polimerasa de control del presente ejemplo es una ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. de SEC ID nº 1 excepto en que el aminoácido en la posición 580 es glicina (por ejemplo una sustitución D580G) (en lo sucesivo polimerasa Z05 D580G).
Se identificaron las mutaciones en la polimerasa Z05 D580G que proporcionaban una capacidad reducida de extender un cebador oligonucleótido con una no correspondencia 3' respecto a un molde. Brevemente, las etapas en este procedimiento de cribado incluían la generación de una biblioteca, la expresión y purificación parcial de los enzimas mutantes, el cribado de los enzimas para la propiedad deseada, la secuenciación del ADN, la purificación clonal y la caracterización adicional de los mutantes candidatos seleccionados. Se describe en mayor detalle cada una de estas etapas a continuación.
Generación de biblioteca clonal: Un ácido nucleico codificante del dominio de polimerasa de la ADN polimerasa Z05 D580G se sometió a PCR con tendencia a errores (mutagénica) entre los sitios de restricción Blp I y Bgl II de un plásmido que incluía esta secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia amplificada se proporciona como SEC ID nº
33. Los cebadores utilziados para ello se proporcionan a continuación: Cebador directo: 5’-
CTACCTCCTGGACCCCTCCAA-3’ (SEC ID nº 31) y Cebador inverso: 5’-ATAACCAACTGGTAGTGGCGTGTAA-3’ (SEC ID nº 32).
Se llevó a cabo una PCR utilizando un abanico de concentraciones de Mg2+ de entre 1,8 y 3,6 mM con el fin de generar bibliotecas con un rango de tasas de mutación. Las condiciones de tampón fueron bicina 50 mM, pH 8,2, KOAc 115 mM, glicerol al 8% p/v y 0,2 mM de cada dNTP. Se utilizó el enzima de PCR de inicio en caliente GeneAmp® AccuRT a razón de 0,15 U/ml. Partiendo de 5x105 copias de ADN plasmídico Z05 D580G linearizado por cada volumen de reacción de 50 μl, las reacciones se desnaturalizaron utilizando una temperatura de 94ºC durante 60 segundos, seguido de 30 ciclos de amplificación utilizando una temperatura de desnaturalización de 94ºC durante 15 segundos, una temperatura de hibridación de 60ºC durante 15 segundos, una temperatura de extensión de 72ºC durante 120 segundos y seguido de una extensión final a una temperatura de 72ºC durante 5 minutos.
El amplicón resultante se purificó con un kit de purificación por PCR QIAquick (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA) y se cortó con Blp I y Bgl II y después se purificó nuevamente con un kit de purificación por PCR QIAquick. Se preparó un vector plasmídico Z05 D580G mediante corte con los mismos dos enzimas de restricción y con tratamiento con fosfatasa alcalina, recombinante (RAS, nº de cat. 03359123001) y se purificó con un kit de purificación por PCR QIAquick. El vector cortado y el inserto mutado se mezclaron en una proporción de 1:3 y se trataron con ADN ligasa de T4 durante 5 minutos a temperatura ambiente (kit NEB Quick LigationTM). Las ligaciones se purificaron con un kit de purificación por PCR QIAquick y se transformaron en una cepa huésped E. coli mediante electroporación.
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