ES2538720B1 - Racemasa BsrAh para la racemización de aminoácidos - Google Patents

Racemasa BsrAh para la racemización de aminoácidos Download PDF

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Abstract

Racemasa BsrAh para la racemización de aminoácidos.#En la presente invención se incluye una racemasa de Aeromonas hydrophila la cual presenta un amplio espectro de racemización y por tanto permite la obtención de L aminoácidos desde el enantiómero D y de D aminoácidos desde el enantiómero L. Por tanto la presente invención también se refiere tanto al uso de dicha racemasa in vitro como a un método de racemización de aminoácidos. Además la presente invención se refiere a un método de síntesis de muropéptidos.

Description

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Racemasa BsrAh para la racemizacion de aminoacidos DESCRIPCION
La presente invention describe una racemasa presente en el organismo Aemmonas hydrophila la cual produce la racemizacion reversible de aminoacidos a su forma enantiomerica (L, D). Por tanto, la invencion se podrla encuadrar en el campo de la biotecnologla.
ESTADO DE LA TECNICA
En la naturaleza, de forma habitual, los aminoacidos se suelen encontrar en su forma enantiomerica L (levogira). Las protelnas que forman parte de los organismos vivos estan formadas unicamente por los enantiomeros L de los aminoacidos. Sin embargo, existen diversas estructuras en la naturaleza que incorporan algunos enantiomeros D (dextrogiros), como pueden ser por ejemplo, pequenos polipeptidos bacterianos, normalmente inferiores a 20 aminoacidos tales como aquellos que conforman el peptidoglicano (PG) de las paredes bacterianas (Vollmer W. et al., 2008 FEMS Microbiol Rev 32: 149-167) o bien como constituyentes de peptidos no ribosomales (Strieker M. et al., 2010, Curr Opin Struct Biol 20: 234-240) .
Los peptidos que incluyen D-aminoacidos (es decir, aminoacidos de forma enantiomerica D), de forma habitual, no son sintetizados mediante la maquinaria habitual de formation de protelnas mediante la slntesis de acido ribonucleico mensajero (ARNm) y la incorporation de los aminoacidos mediante la mediation del ARN de transferencia, sino mediante la polimerizacion directa de unos aminoacidos a otros mediante enzimas bacterianas.
Los D-aminoacidos que forman habitualmente parte del peptidoglicano y que se denominan D-aminoacidos canonicos son los aminoacidos D-alanina y D-glutamico. Sin embargo algunas bacterias son capaces de producir D-aminoacidos no canonicos (NCDAAs) y liberarlos al ambiente extracelular en altas concentraciones (Lam H et al. Science. 2009, 325: 1552-1555).Los NCDAAs tienen influencia en la composition y por tanto en la consistencia y resistencia del peptidoglicano en bacterias, permitiendo
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que las bacterias que los incluyen presenten una mayor resistencia a los cambios ambientales a los que se enfrenta. Ademas de su influencia en el peptidoglicano, los NCDAAs tienen influencia en otros procesos como por ejemplo la dispersion del biofilm que se puede formar en una superficie viva o inerte, (Kolodkin-Gal I et al. 2010. Science 328: 627-629). Ademas tambien presentan influencia en la germinacion de esporas en diversas especies bacterianas como por ejemplo organismos del genero Bacillus.
Debido a las multiples aplicaciones de los D-aminoacidos, especialmente a su capacidad para formar peptidos antibacterianos que permitan la inhibition de biofilms, es de interes su production a nivel industrial. Sin embargo, en la actualidad su production resulta cara ya que se utilizan catalizadores qulmicos. De esta forma se puede pasar de L-aminoacidos, los cuales son abundantes en la naturaleza y baratos de obtener, a D-aminoacidos. Los catalizadores utilizados son por ejemplo el piridoxal fosfato o el acido salicllico (Gong et al. Inorg Chem. 2010, 49:7692-7699). Sin embargo estos catalizadores presentan un rendimiento de reaction muy bajo ademas de un elevado coste, lo que hace el proceso de obtencion de D-aminoacidos poco rentable economicamente. Esto provoca que el posterior uso de los mismos e investigation de nuevos compuestos que los incluyen resulte limitado dado el coste.
Para tratar de solventar los problemas incluidos en este metodo de obtencion de aminoacidos, en la actualidad se estan desarrollando otras vlas de obtencion de forma que se solventen las limitaciones y se acelere el proceso de obtencion. De esta forma se estan tratando de utilizar biocatalizadores como por ejemplo racemasas especlficas de aminoacidos. Esta aproximacion presenta como inconveniente que estas enzimas presentan especificidad de sustrato y por tanto serla necesaria una enzima para cada tipo de sustrato, lo que no permitirla usar mezclas complejas de L-aminoacidos como material de partida para abaratar el proceso. Ademas la necesidad de usar un catalizador para cada reaccion implica un incremento en los costes de produccion. Ademas, en la actualidad no se conocen suficientes enzimas monoespeclficas que se puedan combinar para llevar a cabo el procedimiento.
Por tanto, resulta necesario conseguir elementos que permitan la obtencion de D- aminoacidos a partir de L-aminoacidos de forma que el proceso sea barato, rapido y
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sencillo, minimizando el numero de agentes implicados, y que permita una multiespecificidad del proceso.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invention se refiere a una enzima de Aemmonas hydrophila subsp. hydrophila (ATCC 7966) la cual se encuentra codificada por el locus YP_857116 de este organismo, y denominada BsrAh (Broad spectrum racemase in Aeromonas hydrophila, o racemasa de Aeromonas hydrophila de amplio espectro). Esta enzima presenta multiespecificidad de racemizacion frente a diversos aminoacidos de forma que puede transformar enantiomeros L en enantiomeros D y viceversa. Los aminoacidos que pueden ser racemizados por esta enzima son tanto naturales como sinteticos. De esta forma la enzima puede ser utilizada para racemizar aminoacidos partiendo tanto de un solo aminoacido como de mezclas de aminoacidos, y tanto de un enantiomero puro como de mezclas de enantiomeros. La enzima de la presente invencion, secuencia SEQ ID NO: 1, presenta como ventaja que para llevar a cabo la racemizacion de aminoacidos no requiere un aporte exogeno de energla. En la presente invencion se demuestra como la enzima reacciona con los aminoacidos y a partir de L-aminoacidos, D-aminoacidos, puros o mezclas de estos se alcanza un equilibrio que esta siempre proximo a una relation 1:1 entre las formas enantiomericas de los aminoacidos sustrato.
Dada la utilidad de los enantiomeros D, resulta de especial relevancia dentro de la biotecnologla la capacidad de la enzima racemasa BsrAh de racemizar de enantiomero L, el cual es facil de obtener y barato dado que es el presente de forma mayoritaria en las protelnas de los organismos en la naturaleza, a enantiomero D. Tambien resulta interesante la capacidad de alcanzar un equilibrio de reaction, de forma que se puede ir eliminando u obteniendo el enantiomero D segun se va produciendo de forma que dejando evolucionar la reaccion se alcanzan de nuevo ciertas cantidades del enantiomero de interes al alcanzarse el equilibrio de nuevo. El equilibrio se alcanza dejando evolucionar la reaccion. Sin embargo, puntos cercanos al equilibrio se alcanzan rapidamente y varlan en funcion del tiempo que se deje evolucionar la reaccion.
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Otro elemento que resulta interesante de la racemasa BsrAh es la capacidad de racemizar los aminoacidos a partir de mezclas racemicas o enantiomericas impuras, ya que estas son mas baratas y faciles de obtener que el enantiomero de forma pura.
De igual forma que ocurre entre muchas de las protelnas descritas, como por ejemplo entre protelnas homologas en diferentes organismos, BsrAh podrla tener alterado algun aminoacido, con respecto a SEQ ID NO: 1 sin que se produjera una alteracion sustancial en la protelna (Muth T. et al., 2012, Bioinformatics 28, 584-589). Esto significa que esta alteracion no serla determinante en el polipeptido ni para su estructura ni para su actividad. La enzima BsrAh puede por lo tanto presentar variantes. Estas variantes se refieren a variaciones limitadas en la secuencia aminoacldica, que permiten el mantenimiento de la funcionalidad de la enzima descrita en la presente invencion. Esto quiere decir que la secuencia de referencia y la secuencia de la variante son similares en conjunto, e identicas en muchas regiones. Estas variaciones se generan por sustituciones, deleciones o adiciones. Dichas sustituciones se dan entre aminoacidos que presentan similares caracterlsticas como por ejemplo en cuanto a polaridad, tamano o carga, e incluyen, aunque sin limitarse, sustituciones entre acido glutamico (Glu) y acido aspartico (Asp), entre lisina (Lys) y arginina (Arg), entre asparragina (Asn) y glutamina (Gln), entre serina (Ser) y treonina (Thr), y entre los aminoacidos que componen el grupo alanina (Ala), leucina (Leu), valina (Val) e isoleucina (Ile). Las variaciones pueden ser variaciones existentes en la naturaleza como por ejemplo variaciones alelicas, o generadas artificialmente como por ejemplo, mediante mutagenesis o slntesis directa. Estas variaciones no provocan modificaciones esenciales en las caracterlsticas o propiedades esenciales del polipeptido, por lo que dichas variantes mantienen su actividad biologica. Todos estos peptidos pueden ser peptidos presentes en la naturaleza o bien ser producidos de forma artificial como por ejemplo, aunque sin limitarse, de forma recombinante, de forma sintetica, o mediante la combination de metodos naturales e ingenierla genetica. Existiendo una serie de aminoacidos que se consideran esenciales en la presente invencion, como son: Cys 70, Arg 119, Arg 121, Ala 165, Ala 169, Asn 174, Pro 206, Glu 208, Gly 216, Phe 246, Gly 263, Asn 349, Thr 350, Ala 381 y Thr 396 (obtenidos mediante procedimientos informaticos, JDet software, Muth T et al., 2012, Bioinformatics 28, 584-589).
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Se entiende por “aminoacido no canonico” o “NCDAA” en la presente invention, a aquellos aminoacidos distintos de alanina y acido glutamico, y que forman parte del PG de todas las bacterias conocidas.
Por todo ello un primer aspecto de la invencion se refiere al uso de una enzima, aislada o sintetica, de ahora en adelante enzima o protelna de la invencion, que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 95%, preferiblemente al menos un 98%, mas preferiblemente al menos un 99% y aun mas preferiblemente un 100% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 como reactivo para la racemizacion de al menos un aminoacido. En una realization preferida la enzima, aislada o sintetica, consiste en una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 95%, preferiblemente al menos un 98%, y mas preferiblemente al menos un 99% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1. De forma aun mas preferible, la enzima consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1.
El porcentaje de identidad se puede calcular mediante los metodos conocidos por el experto en la materia.
En otra realizacion preferida del primer aspecto de la invencion el aminoacido se selecciona de la lista que comprende: cistelna, histidina, lisina, leucina, metionina, asparragina, glutamina, arginina, serina, ornitina, homoserina y norleucina. Otra realizacion preferida se refiere al uso donde el aminoacido es alanina. En una realizacion preferida el aminoacido es un aminoacido basico, por este motivo, una realizacion aun mas preferida se refiere al uso de la enzima del primer aspecto de la invencion donde el aminoacido es la lisina, la arginina, la glutamina, la histidina y/o la ornitina.
Se entiende por “BsrAh” (Broad spectrum racemase in Aeromonas hydrophila, o racemasa de Aeromonas hydrophila de amplio espectro) o “enzima BsrAh” en la presente invencion a la protelna codificada por el locus YP_857116 de Aeromonas hydrophila y que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1. La enzima de la invencion participa como “catalizador” en la reaction de racemizacion, es decir, como racemasa.
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Se entiende por “racemizacion” en la presente invention el proceso por el cual un isomero optico de aminoacido se transforma en su opuesto optico o enantiomero. En la presente invencion se entiende por racemizacion la transformation de un aminoacido de enantiomero L a D o de D a L. Por todo ello, en una realization preferida de este aspecto de la invencion el aminoacido que se racemiza es el enantiomero L. En otra realizacion preferida el aminoacido que se racemiza es el enantiomero D. La racemizacion es llevada a cabo por la racemasa, en la presente invencion, por la enzima de la invencion.
Como se demuestra en los ejemplos de la invencion, el punto de equilibrio varla entre los diferentes aminoacidos de forma que a partir de mezclas racemicas se pueden producir los diferentes aminoacidos. Esta mezclas racemicas son baratas y facilmente obtenibles por lo que resultan uno de los sustratos de partida para la racemizacion mas interesantes. Ademas se puede acoplar a la racemizacion de aminoacidos un sistema que elimine o consuma alguno de los enantiomeros D o L de los aminoacidos de forma que se desplace el equilibrio y por tanto la racemasa actue sobre el enantiomero restante racemizandolo para restaurar el equilibrio. La racemizacion tambien se puede dar a partir de cualquier proportion de enantiomeros D y L, dado que la enzima provocara que se alcance el equilibrio racemizando los aminoacidos correspondientes. Por todo ello, en una realizacion preferida del primer aspecto de la invencion la racemizacion se hace a partir de una mezcla racemica o enantiomerica. En otra realizacion preferida la racemizacion se produce a partir de composiciones que comprenden unicamente uno de los enantiomeros, es decir la racemizacion se realiza a partir de un enantiomero puro. En una realizacion aun mas preferida, el enantiomero puro es el enantiomero “L”.
Se entiende por “mezcla racemica” o “mezcla enantiomerica” en la presente invencion cualquier mezcla que comprenda tanto enantiomeros D como L en cualquier proporcion.
Por otro lado, cabe indicar que dada la multiespecificidad de la enzima, se puede partir bien de un unico aminoacido el cual sea posible racemizar por la enzima o bien de mezclas complejas de aminoacidos (es decir, mezclas de mas de un aminoacido racemizable por la enzima) de forma que se obtengan diferentes aminoacidos. De esta
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forma, por ejemplo, se puede partir de una mezcla compleja de L-aminoacidos o D- aminoacidos o incluso de L y D aminoacidos, la cual mediante BsrAh sera trasformada para dar lugar a una mezcla donde los aminoacidos presentes alcanzaran el equilibrio correspondiente entre los enantiomeros D y L, y por tanto se podran obtener por ejemplo los D-aminoacidos o los L-aminoacidos en funcion del interes de cada caso. Por todo ello, otra realization preferida de este primer aspecto de la invention se refiere al uso donde la racemizacion se hace a partir de una mezcla de aminoacidos, donde dicha mezcla comprende cistelna, histidina, lisina, leucina, metionina, asparragina, glutamina, arginina, serina, alanina, ornitina, homoserina y/o norleucina.
El uso de BsrAh presenta su mayor aplicabilidad en procesos de laboratorio y fundamentalmente en procesos industriales, ya que su capacidad de racemizar se puede acoplar a otros sistemas que permitan el consumo del enantiomero de interes y por tanto, se seguira produciendo dicho enantiomero ya que la enzima tratara de alcanzar el punto de equilibrio. Dado que los procesos industriales requieren de una enzima con elevada actividad y estabilidad, esta enzima se puede encontrar por ejemplo inmovilizada de forma que se encuentre mas protegida sin producir un perjuicio en el acceso a los sustratos. De esta forma se asegura una mayor estabilidad de la enzima asl como una mayor facilidad de manejo de la misma. Todo esto conlleva ademas una menor necesidad de recambio de la misma enzima en el proceso industrial ya que puede ser reutilizada en varias ocasiones sin que se produzca una disminucion considerable en su actividad. Esta inmovilizacion de la enzima se puede producir por ejemplo, aunque sin limitarse, mediante retention flsica (atrapamiento o inclusion en membranas), o por union qulmica (adsorcion, union covalente o reticulado), y en diferentes soportes conocidos en el estado de la tecnica tales como los soportes porosos glioxil-agarosa, agarosa activada con bromocianogeno, soportes activados con glutaraldehldo, grupos aminos primarios (Sepabeads® EA), epoxido (EC-EP), epoxido y grupos amino (Sepabeads® EC-HFA). Por todo ello, en otra realizacion preferida de este aspecto de la invencion la enzima BsrAh se encuentra inmovilizada.
La racemizacion con la enzima de la invencion tambien se puede acoplar a la production de un compuesto en concreto que requiera la racemizacion de un aminoacido. Si es una enzima enantioselectiva (es decir, que su actividad este
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restringida a uno de los enantiomeros,) desplazara el equilibrio favoreciendo la production hacia uno de los enantiomeros. Por otra parte, si la racemasa es capaz de utilizar tanto el enantiomero L como el D de los aminoacidos ya mencionados, si la reaction se acopla con otra enzima, la cual utiliza exclusivamente bien el D o el L, se desplazarla el equilibrio de la reaccion hacia la formation de unos de los enantiomeros, generando productos que puedan ser de interes.
Otro aspecto de la invention se refiere a un metodo de racemizacion de aminoacidos que comprende poner en contacto al menos un aminoacido seleccionado de la lista que comprende cistelna, histidina, lisina, leucina, metionina, asparragina, glutamina, arginina, serina, ornitina, homoserina y norleucina con una enzima, aislada o sintetica, de ahora en adelante enzima o protelna de la invencion, que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 95%, preferiblemente al menos un 98%, mas preferiblemente al menos un 99% y aun mas preferiblemente un 100% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 como reactivo para la racemizacion de al menos un aminoacido. En una realization preferida la enzima, aislada o sintetica, consiste una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 95%, preferiblemente al menos un 98%, y mas preferiblemente al menos un 99% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1. De forma aun mas preferible, la enzima consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1. En una realizacion preferida el aminoacido es un aminoacido basico, por este motivo, una realizacion aun mas preferida se refiere al metodo donde el aminoacido es la lisina, la arginina, la glutamina, la histidina y/o la ornitina. En una realizacion preferida de este aspecto de la invencion el aminoacido se encuentra en forma de mezcla racemica o enantiomerica. En otra realizacion preferida de este aspecto de la invencion el aminoacido se encuentra en una forma enantiomerica pura. En una realizacion aun mas preferida, el enantiomero puro es el enantiomero L. En otra realizacion preferida el aminoacido se encuentra incluido en una mezcla de aminoacidos. En otra realizacion preferida la enzima se encuentra aislada, es decir, no inmovilizada.
Dada la capacidad de la enzima BsrAh de racemizar los enantiomeros L en enantiomeros D, esta enzima puede ser utilizada por ejemplo en un sistema multienzimatico para llevar a cabo un metodo de obtencion de muropeptidos no canonicos (incorporation de un D-aminoacido diferente a la D-alanina en un
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muropeptido canonico), a partir de un L-aminoacido, preferiblemente seleccionado de la lista que comprende L-cistema, L-histidina, L-lisina, L-leucina, L-metionina, L- asparragina, L-glutamina, L-arginina, L-serina, L-homoserina, L-norleucina y L-ornitina, y un muropeptido canonico (no modificado por algun D-aminoacido distinto a os presentes de forma habitual en el peptidoglicano) o un muropeptido no canonico. El sistema multienzimatico ademas de comprender la enzima de la invention ha de incluir al menos una L, D transpeptidasa y/o al menos una ligasa. Estas enzimas pueden ser provenientes del mismo o diferente organismo que la racemasa de la invencion.
Se entiende por “muropeptido” en la presente invencion a cada una de las unidades estructurales que constituyen el peptidoglicano (PG) (disacarido N-acetil glucosamina- N-acetil muramico unido a una cadena peptidica de longitud y composition variable). Estos muropeptidos pueden estar entrecruzados, acetilados, amidados y/o deshidratados (terminales de cadena o anhidro-muropeptidos).
Se entiende por “L-D transpeptidasa” en la presente invencion, aquella transpeptidasa que presenta la capacidad de formar un enlace peptidico L-D bien entrecruzando muropeptidos a traves del meso-diaminopimelato o bien intercambiando el amino- acido C-terminal (position 4) en un tetrapeptido.
Se entiende por “muropeptido no canonico” en la presente invencion al muropeptido que comprende al menos un NCDAA.
Por todo ello, otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo de production de un muropeptido que comprende:
a) poner en contacto al menos un L-aminoacido seleccionado de la lista que comprende L-cistema, L-histidina, L-lisina, L-leucina, L-metionina, L-asparragina, L- glutamina, L-arginina, L-serina, L-homoserina, L-norleucina y L-ornitina con la enzima BsrAh para racemizar el aminoacido a su forma D, y
b) poner en contacto el D-aminoacido obtenido en (a) con un muropeptido y al menos una L, D transpeptidasa y/o al menos una ligasa.
En una realization preferida de este aspecto de la invencion se refiere al metodo donde la identidad de la enzima del paso (a) con respecto a la secuencia SEQ ID NO:
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1 es de al menos un 98%, mas preferiblemente un 99%. En otra realization aun mas preferida la enzima comprende la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1. En una realization aun mas preferida, la enzima consiste en la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1.
Otra realization preferida de este aspecto de la invention se refiere al metodo donde el muropeptido que se sintetiza es un muropeptido no canonico.
En una realization preferida de este aspecto de la invention el aminoacido del paso (a) se encuentra incluido en una mezcla racemica o mezcla enantiomerica. En otra realization preferida el aminoacido de partida se encuentra en una forma enantiomerica pura. En otra realization preferida el aminoacido del paso (a) se encuentra en una mezcla compleja de aminoacidos. En otra realization preferida de este aspecto de la invention, la L, D transpeptidasa del paso (b) es LdtA (codificada por el locus vc1268 de V. cholerae N16961) o cualquiera de sus ortologos L,D- transpeptidasas en otras bacterias. En una realization aun mas preferida la enzima LdtA carece de dominio transmembrana por lo que puede ser empleada en mezclas de reaction enzimatica libres de detergentes. En otra realization preferida la ligasa del paso (b) es Vc-Ddl (codificada por el locus vca0572 de V. cholerae N16961) y/o Vc- MurF (codificada por el locus vc2405 de V. cholerae N16961) o cualquiera de sus ortologos Ddl/MurF en otras bacterias. En otra realization preferida cualquiera de las enzimas BsrAh, y/o L,D transpeptidasa y/o ligasa se encuentran aisladas (es decir, puras).
Se entiende por "mezcla compleja de aminoacidos” aquella mezcla que comprende varios aminoacidos donde algunos de ellos se van a racemizar y otros no, de modo que solo se incorporan al muropeptido aquellos que racemizan. Esta mezcla conlleva que la reaction de racemizacion sea mas economica.
Mediante el sistema descrito se obtienen por ejemplo, los muropeptidos muro3-X (es decir, la sustitucion se realiza en la position 4) y muro4-X (es decir, la sustitucion se realiza en la position 5). Por todo ello, en una realization preferida de este aspecto de la invention, el muropeptido que se produce es muro3-X o muro4-X donde X es cualquier aminoacido en su forma D distinto de la D-alanina. En una realization mas
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preferida X es cualquier aminoacido seleccionado de la lista que comprende D- cistelna, D-histidina, D-lisina, D-leucina, D-metionina, D-asparragina, D-glutamina, D- arginina, D-serina, D-ornitina, D-homoserina y D-norleucina. En otra realization mas preferida el aminoacido es un aminoacido basico en su forma D. En una realizacion aun mas preferida X es arginina.
A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la invention se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invention. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1. En la figura se muestra una representation esquematica de la metodologla realizada mediante racemizacion y posterior derivatizacion con el reactivo de Marfey (FDAA, 1-fluoro-2-4-dinitrofenil-5-L-alanina amida).
Figura 2. Cromatogramas obtenidos despues de realizar ensayos de racemizacion de BsrAh con alanina y ser derivatizados con FDAA y analizados en el HPLC. El eje X corresponde a tiempo representado en minutos. El eje Y a Absorbancia a 340 nm.
Figura 3. Cromatogramas obtenidos despues de realizar ensayos de racemizacion de BsrAh con cistelna y ser derivatizados con FDAA y analizados en el HPLC. El eje X corresponde a tiempo representado en minutos. El eje Y a Absorbancia a 340 nm.
Figura 4. Cromatogramas obtenidos despues de realizar ensayos de racemizacion de BsrAh con histidina y ser derivatizados con FDAA y analizados en el HPLC. El eje X corresponde a tiempo representado en minutos. El eje Y a Absorbancia a 340 nm.
Figura 5. Cromatogramas obtenidos despues de realizar ensayos de racemizacion de BsrAh con lisina y ser derivatizados con FDAA y analizados en el HPLC. El eje X corresponde a tiempo representado en minutos. El eje Y a Absorbancia a 340 nm.
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Figura 6. Cromatogramas obtenidos despues de realizar ensayos de racemizacion de BsrAh con leucina y ser derivatizados con FDAA y analizados en el HPLC. El eje X corresponde a tiempo representado en minutos. El eje Y a Absorbancia a 340 nm.
Figura 7. Cromatogramas obtenidos despues de realizar ensayos de racemizacion de BsrAh con metionina y ser derivatizados con FDAA y analizados en el HPLC. El eje X corresponde a tiempo representado en minutos. El eje Y a Absorbancia a 340 nm.
Figura 8. Cromatogramas obtenidos despues de realizar ensayos de racemizacion de BsrAh con asparragina y ser derivatizados con FDAA y analizados en el HPLC. El eje X corresponde a tiempo representado en minutos. El eje Y a Absorbancia a 340 nm.
Figura 9. Cromatogramas obtenidos despues de realizar ensayos de racemizacion de BsrAh con glutamina y ser derivatizados con FDAA y analizados en el HPLC. El eje X corresponde a tiempo representado en minutos. El eje Y a Absorbancia a 340 nm.
Figura 10. Cromatogramas obtenidos despues de realizar ensayos de racemizacion de BsrAh con arginina y ser derivatizados con FDAA y analizados en el HPLC. El eje X corresponde a tiempo representado en minutos. El eje Y a Absorbancia a 340 nm.
Figura 11. Cromatogramas obtenidos despues de realizar ensayos de racemizacion de BsrAh con serina y ser derivatizados con FDAA y analizados en el HPLC. El eje X corresponde a tiempo representado en minutos. El eje Y a Absorbancia a 340 nm.
Figura 12. Cromatogramas obtenidos despues de realizar ensayos de racemizacion de BsrAh con ornitina y ser derivatizados con FDAA y analizados en el HPLC. El eje X corresponde a tiempo representado en minutos. El eje Y a Absorbancia a 340 nm.
Figura 13. Cromatogramas obtenidos despues de realizar ensayos de racemizacion de BsrAh con homoserina y ser derivatizados con FDAA y analizados en el HPLC. El eje X corresponde a tiempo representado en minutos. El eje Y a Absorbancia a 340 nm.
Figura 14. Cromatogramas obtenidos despues de realizar ensayos de racemizacion de
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BsrAh con norleucina y ser derivatizados con FDAA y analizados en el HPLC. El eje X corresponde a tiempo representado en minutos. El eje Y a Absorbancia a 340 nm.
Figura 15. Ejemplo de production de muropeptidos. A, esquema de la reaction acoplada de la racemasa BsrAh y la Ldt (Ld-transpeptidasa) para generar muropeptidos modificados. La enzima Ldt sustituye el amino acido terminal en los muropeptidos. Dado que esta enzima tan solo utiliza D-aminoacidos, se desplaza el equilibrio de la reaccion reduciendo progresivamente el porcentaje de aminoacidos D libres. Este hecho, a su vez, implica que la racemasa BsrAh convierte L- en D- aminoacidos para restablecer constantemente el equilibrio entre enantiomeros los cuales terminarlan incorporados en su totalidad en la estructura del muropeptido. Ldt corresponde a una Ld-transpeptidasa y BsrAh a la racemasa. M4 corresponde al muropeptido habitual (N-acetilglucosamina-N-acetilmuramico-L-alanina-D-glutamico- meso-Diaminopimelico-D-alanina) y M4aa corresponde a un M4 en el que se ha sustituido la alanina final por un D-aminoacido. B, cromatogramas de la reaccion acoplada durante dos horas con la racemasa BsrAh y la Ldta de Vibrio cholerae. El eje X corresponde a tiempo representado en minutos. El eje Y a Absorbancia a 204 nm.
EJEMPLOS
A continuation se ilustrara la invention mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del uso de la enzima de la invencion.
Ejemplo 1: Produccion y Purification de BsrAh
La racemasa de amplio espectro BsrAh se expreso de forma heterologa en Escherichia coli BL21 (DE3). Para ello, el gen codificante de BsrAh (codificada por el locus YP_857116 de Aeromonas hydrophila (ATCC 7966) fue amplificado por PCR usando para ello oligonucleotidos (coleccion del laboratorio de Felipe Cava: FCP345: SEQ ID NO: 2, 5’- AAACCATGGCCCCAAGAAGATCAAGCGCT - 3’, oligonucleotido sentido, y FCP388: SEQ ID NO: 3, 5’-
AAAAAGCTTGCGCTTGATCTTCTTGGGGTTGGTGTAGCCCCAGATG -3’,
oligonucleotido antisentido) que portaban sitios de restriction apropiados (Xbal, Not1) para su posterior clonaje en el vector pET28b (Novagen). Ademas, el oligonucleotido
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reverso adicionaba una diana de restriction Not1 permitiendo la utilization de la secuencia codificante de 6 histidinas (6His) justo antes del codon de termination, del vector pET28b. La fusion de las 6His en el extremo C-terminal de BsrAh permite su posterior purification mediante cromatografla de afinidad Ni-NTA (Qiagen). La purification se realizo en tampon Tris-HCl 150mM pH7,5; 0,2M NaCl; 10% Glicerol, y se eluyo la enzima de la columna competitivamente mediante el mismo tampon suplementado con imidazol 0,5M. El imidazol fue eliminado al dializar las muestras contra un tampon Tris HCl 20mM pH7,5. Finalmente las muestras fueron concentradas a 10mg/ml usando centricones (Centrifugal Filter Units, Millipore).
Ejemplo 2: Ensayo in vitro de racemizacion
Para caracterizar el espectro de aminoacidos utilizables por BsrAh se incubo en buffer bicarbonato 30 mM (pH8) 1 ^g de BsrAh con 20 mM del L-aminoacido deseado. La reaction se prolongo durante 15 min tras los cuales se inactivo BsrAh hirviendo la muestra durante 5 min y centrifugando para eliminar el precipitado (BsrAh desnaturalizada). La actividad de BsrAh fue probada con actividad siempre mayor del >90% con tampones Tris-HCl, PBS, CHES asl como pH entre 6,5 y 9.
La enzima BsrAh utilizo varios aminoacidos como sustratos (ver figuras 1 a 14) y todos ellos los transformo en su forma enantiomerica hasta alcanzar una relation 50% aproximadamente entre las formas enantiomericas, demostrandose asl que la reaction era reversible. Como la reaction de racemizacion alcanzaba un equilibrio, esto implica que la enzima no solo utilizo el L-aminoacidos como sustrato sino tambien la forma enantiomerica D, demostrandose asl la utilidad tanto en la racemizacion de enantiomeros L como D.
Ademas, se utilizaron tanto enantiomeros puros como mezclas racemicas. En las mezclas racemicas se utilizaron mezclas del mismo aminoacido tanto en su forma L como en su forma D.
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Ejemplo 3: Cuantificacion de la actividad BsrAh
Para cuantificar la actividad BsrAh es necesario separar cromatograficamente las formas enantiomericas. Esto es posible gracias al reactivo de Marfey (1-fluoro-2,4- dinitrofenil-5-L-alanina amida), el cual reacciona con los grupos amino primarios de los aminoacidos alterando su tiempo de retencion en cromatografla en fase reversa (ver esquema en fig. 1).
Para la derivatizacion se siguieron las indicaciones tecnicas del distribuidor (Thermo Scientific Pierce). La reaccion tiene lugar durante 5 min a 80°C y se detiene agregando un volumen de HCl 1 M ,tal y como se describe en Bhushan R y Bruckner H, 2004 Amino Acids 27:231-247.
Los resultados indicaron que al cabo de 5 minutos BsrAh convirtio el 50% (alcanzado el equilibrio) de los siguientes aminoacidos: Ala (fig. 2), Cys (fig. 3), His (fig. 4), Lys (fig. 5), Leu (fig. 6), Met (fig. 7), Asn (fig. 8), Gln (fig. 9), Arg (fig. 10), Ser (fig. 11), Ornitina (fig. 12), homoserina (fig. 13) y norleucina (fig. 14). Al cabo de 90 minutos se confirmo que el resto de aminoacidos naturales no fueron racemizados en modo alguno por lo que la especificidad de BsrAh queda restringida a los aminoacidos mencionados anteriormente. Entre los aminoacidos naturales no racemizados se encuentran los siguientes: glutamico, aspartico, isoleucina, valina, treonina, fenilalanina, tirosina, triptofano y prolina.
Por lo tanto, la BsrAh es una racemasa de amplio espectro. Este amplio espectro de racemizacion es sorprendente puesto que no es lo esperado en racemasas monoespeclficas (como pueden ser las alaninas racemasas monoespeclficas).
Ejemplo 4: Formacion de muropeptidos
La formacion de muropeptidos mediante la enzima BsrAh consistio en el intercambio del ultimo aminoacido terminal (alanina) por otro de interes, ver figura 15, segun el protocolo descrito en Cava F et al. 2011 The EMBO Journal 30:3442-3453. En la reaccion se utilizo la racemasa BsrAh y una Ldt (Ld-transpeptidasa) para generar muropeptidos modificados, en la cual a partir de una mezcla racemica, (como la Ldt es
enantioespecifica para las formas D) se desplazo el equilibrio de la reaccion (favoreciendo la formacion del D) y se cambio la alanina terminal por el aminoacido de interes.

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    REIVINDICACIONES
    1. Uso de una enzima que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 como catalizador para la racemizacion de al menos un aminoacido seleccionado de la lista que comprende cistelna, histidina, lisina, leucina, metionina, asparragina, glutamina, arginina, serina, ornitina, homoserina y norleucina.
  2. 2. Uso de una enzima segun la reivindicacion 1 donde la identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 es de al menos un 98%.
  3. 3. Uso de una enzima segun la reivindicacion 2 donde la identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 es de al menos un 99%.
  4. 4. Uso de una enzima segun la reivindicacion 3 donde la enzima comprende la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1.
  5. 5. Uso de una enzima segun la reivindicacion 4 donde la enzima consiste en la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1.
  6. 6. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el aminoacido es al menos un aminoacido seleccionado de la lista que comprende la histidina, la lisina, la arginina, la ornitina y la glutamina.
  7. 7. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde la racemizacion se hace a partir de una mezcla enantiomerica.
  8. 8. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde la racemizacion se hace a partir de un enantiomero puro.
  9. 9. Uso segun la reivindicacion 8 donde el enantiomero puro es el enantiomero L.
  10. 10. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la racemizacion se hace a partir de una mezcla de aminoacidos.
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  11. 11. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde la enzima se encuentra inmovilizada.
  12. 12. Metodo de racemizacion de aminoacidos que comprende poner en contacto al menos un aminoacido seleccionado de la lista que comprende cistelna, histidina, lisina, leucina, metionina, asparragina, glutamina, arginina, serina, ornitina, homoserina y norleucina con una enzima que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1.
  13. 13. Metodo segun la reivindicacion 12 donde la identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 es de al menos un 98%.
  14. 14. Metodo segun la reivindicacion 13 donde la identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 es de al menos un 99%.
  15. 15. Metodo segun la reivindicacion 14 donde la enzima comprende la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1.
  16. 16. Metodo segun la reivindicacion 15 donde la enzima consiste en la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1
  17. 17. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 donde el aminoacido es al menos un aminoacido seleccionado de la lista que comprende la histidina, la lisina, la arginina, la ornitina y la glutamina.
  18. 18. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17 donde la racemizacion se hace a partir de una mezcla enantiomerica.
  19. 19. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17 donde la racemizacion se hace a partir de un enantiomero puro.
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  20. 20. Metodo segun la reivindicacion 19 donde el enantiomero puro es el enantiomero L.
  21. 21. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20, donde la racemizacion se hace a partir de una mezcla de aminoacidos.
  22. 22. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 12 a 21 donde la enzima se encuentra inmovilizada.
  23. 23. Metodo de produccion de un muropeptido que comprende:
    a) poner en contacto al menos un L-aminoacido seleccionado de la lista que comprende cistelna, histidina, lisina, leucina, metionina, asparragina, glutamina, arginina, serina, ornitina, homoserina y norleucina con una enzima que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 para racemizar el aminoacido a su forma D, y
    b) poner en contacto el D-aminoacido obtenido en (a) con un muropeptido y al menos una L, D transpeptidasa y/o al menos una ligasa.
  24. 24. Metodo segun la reivindicacion 23 donde la identidad de la enzima con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 es de al menos un 98%.
  25. 25. Metodo segun la reivindicacion 24 donde la identidad de la enzima con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1 es de al menos un 99%.
  26. 26. Metodo segun la reivindicacion 25 donde la enzima comprende la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1.
  27. 27. Metodo segun la reivindicacion 26 donde la enzima consiste en la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1.
  28. 28. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27 donde el muropeptido que se sintetiza es un muropeptido no canonico.
  29. 29. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28 donde el aminoacido del paso (a) se encuentra en forma de mezcla enantiomerica.
  30. 30. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28 donde el aminoacido del paso (a) se encuentra en una forma enantiomerica pura.
    5 31. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30 donde el aminoacido del
    paso (a) se encuentra en una mezcla de aminoacidos.
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