ES2539518T3

ES2539518T3 - Inhibidores de proteínas quinasas

Info

Publication number: ES2539518T3
Application number: ES08736527.6T
Authority: ES
Inventors: Philipp Wabnitz; Heike Schauerte; Hans Allgeier; Martin Augustin; Lutz Zeitlmann; Michael A. Pleiss; Gabriele Stumm; Anke Mueller
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2007-04-24
Filing date: 2008-04-24
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2028-04-24
Also published as: WO2008129070A1; US20100184789A1; US8436007B2; JP5693951B2; JP2011502956A

Abstract

Un compuesto según la fórmula general Ia**Fórmula** en donde R9 es -NR5R6 o R8 R5 y R6 independientemente entre si son hidrógeno, alquilo de C1-4, hidroxi-alquilo de C1-4 o alquenilo de C3-4, cicloalquilo de C3-8, cicloalquilo de C3-8-alquilo de C1-4 o heterocicloalquilo de C4-7-alquilo de C0-4, arilo de C4-7- alquilo de C1-4, heteroarilo de C4-7-alquilo de C0-4 o en donde R5 y R6 junto con el átomo de N al que están unidos también pueden formar un heterocicloalquilo de 5 a 8 miembros, en donde dicho cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo o alquilo está además opcionalmente sustituido por hasta 2 radicales seleccionados del grupo que consiste en halo, hidroxi, aminocarbonilo, alquilo de C1-4, hidroxi-alquilo de C1-4, alquilo de C1-4-O-alquilo de C1-4, alquilo de C1-4-O- y -NR5R6; R8 es alquilo de C1-4, hidroxi-alquilo de C2-4 o alquenilo de C3-4, cicloalquilo de C3-8, cicloalquilo de C3-8-alquilo de C1-4 o heterocicloalquilo de C4-7-alquilo de C0-4; en donde dicho cicloalquilo, heterocicloalquilo o alquilo está además opcionalmente sustituido por hasta 2 radicales seleccionados del grupo que consiste en halo, hidroxi, alquilo de C1-4, hidroxi-alquilo de C1-4, alquilo de C1-4-O-alquilo de C1-4, alquilo de C1-4-O- y -NR5R6; R2 es uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno e hidrógeno; R3a representa hidrógeno, halo o alcoxi de C1-4; R3b representa hidrógeno; R3c representa hidrógeno o halógeno; R4a representa hidrógeno; y R4b representa hidrógeno o metilo; o un compuesto seleccionado de los derivados N-óxidos, las sales farmacéuticamente aceptables y solvatos (por ejemplo, hidratos) de tales compuestos.

Description

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R4a y R4b son se han definido anteriormente; R3a, R3b y R3c son se han definido anteriormente; y

5 R9 es NR5R6 o R8, en donde R5 y R6 son cada uno independientemente hidrógeno, cicloalquilo o alquilo de C1-4 opcionalmente sustituido por hidroxilo o dialquilamino; y R8 es hidroxil-alquilo de C2-4;

10 y los derivados N-óxidos, las sales farmacéuticamente aceptables y solvatos (por ejemplo, hidratos) de tales compuestos. En estos compuestos de fórmula Ia: 15 R2 es preferiblemente hidrógeno; R3a es preferiblemente alcoxi de C1-4; lo más preferiblemente metoxi o isopropoxi. R3b es hidrógeno. 20 R3c es preferiblemente hidrógeno o halógeno, especialmente fluoro. R4a es hidrógeno.

25 R4b es preferiblemente hidrógeno o metilo; lo más preferiblemente hidrógeno. R5 y R6 son cada uno independientemente hidrógeno, cicloalquilo o alquilo de C1-4 opcionalmente sustituido por hidroxilo o dialquilamino; más preferiblemente R5 y R6 son cada uno independientemente hidrógeno, metilo, ciclopropilo, 2-hidroxietilo, 2-dimetilaminoetilo o 3-dimetilaminopropilo.

30 R8 es hidroxi-alquilo de C2-4, más preferiblemente 2-hidroxietilo. Los siguientes compuestos son preferidos: 35 {3-[4-(2-Metoxi-fenil)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-metanosulfonamida (Compuesto 1); {3-[4-(2-Isopropoxi-fenil)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-metanosulfonamida (Compuesto 2); C-{3-[4-(2-Metoxi-fenil)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-N,N-dimetil-metanosulfonamida (Compuesto 3); 40 C-{3-[4-(2-Metoxi-fenil)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-N-metil-metanosulfonamida (Compuesto 4); {3-[4-(4-Fluoro-2-metoxi-fenil)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-metanosulfonamida (Compuesto 5); 45 N-Ciclopropil-C-{3-[4-(2-metoxi-fenil)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-metanosulfonamida (Compuesto 6); N-(2-Hidroxi-etil)-C-{3-[4-(2-metoxi-fenil)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-metanosulfonamida (Compuesto 7); N-(2-Hidroxi-etil)-C-{3-[4-(2-metoxi-fenil)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-N-metil-metanosulfonamida (Compuesto 8); 50 2-{3-[4-(2-Metoxi-fenil)-pirimidin-2-ilamino]-fenilmetanosulfonil}-etanol (Compuesto 9); {3-[4-(2-Metoxi-fenil)-6-metil-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-metanosulfonamida (Compuesto 10); 55 -(2-Hidroxi-etil)-C-{3-[4-(2-metoxi-fenil)-6-metil-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-N-metil-metanosulfonamida (Compuesto 11); 2-{3-[4-(2-Metoxi-fenil)-6-metil-pirimidin-2-ilamino]-fenilmetanosulfoniI}-etanol (Compuesto 12); {3-[4-(2-Metoxi-fenil)-5-metil-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-metanosulfonamida (Compuesto 13);

60 N-(2-Hidroxi-etil)-C-{3-[4-(2-metoxi-fenil)-5-metil-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-N-metil-metanosulfonamida (Compuesto 14); y

2-{3-[4-(2-Metoxi-fenil)-5-metil-pirimidin-2-ilamino]-fenilmetanosulfoniI}-etanol (Compuesto 15). 65

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dependiente de CDK. Generalmente, los inhibidores de quinasas pueden ser proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos, moléculas pequeñas, u otras fracciones químicas. Específicamente, los inhibidores de quinasas también incluyen anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra quinasas dependientes de ciclinas.

En una forma de realización preferida, el inhibidor de la quinasa dependiente ciclina se selecciona de los compuestos representados por la fórmula I como se divulga en el presente documento.

Uso terapéutico

Los compuestos de fórmula I son inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas. Por tanto, se esperan que tengan la capacidad de parar, o recuperar el control del ciclo celular en células que se dividen anormalmente. Consecuentemente, se sugiere que los compuestos según la fórmula I se demostrarán útiles en tratar y/o prevenir trastornos proliferativos tal como cánceres.

Se sabe que las CDK desempeñan un papel en apoptosis, proliferación, diferenciación y transcripción y por tanto, los compuestos según la fórmula I también pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades diferentes de enfermedades proliferativas, tal como enfermedades infecciosas, enfermedades inmunológicas, enfermedades neurodegenerativas y enfermedades cardiovasculares.

Además, los compuestos según la fórmula I también muestran un efecto antinociceptivo y antiinflamatorio inesperado.

Por tanto, en una forma de realización preferida, los compuestos de fórmula I se pueden usar en métodos y/o composiciones farmacéuticas para el tratamiento de cualquier tipo de dolor, incluyendo dolor crónico, dolor neuropático y/o inflamatorio.

En una forma de realización preferida adicional, los compuestos de fórmula I se pueden usar en métodos y/o composiciones farmacéuticas para el tratamiento de trastornos inflamatorios.

En una forma de realización preferida particular, los compuestos de fórmula I para uso en el tratamiento de cualquier tipo de dolor o en el tratamiento de trastornos inflamatorios muestran una selectividad aumentada para CDK9 más que para otras CDK.

Dolor

Ha resultado que la administración de inhibidores de CDK según la fórmula I a ratones que padecen lesiones de nervios ejerce un efecto hipoalgésico, en particular en modelos murinos de dolor inflamatorio y neuropático.

El descubrimiento de que la inhibición de una quinasa dependiente de ciclina está implicada en mediar un efecto hipoalgésico era inesperado.

Por tanto, en una forma de realización preferida, esta invención se refiere a un método para tratar cualquier tipo de dolor que comprende administrar una cantidad eficaz de un inhibidor de una quinasa dependiente de ciclina según la fórmula I. Específicamente, los compuestos de fórmula I se pueden usar para el tratamiento de dolor crónico, neuropático y/o inflamatorio. En una forma de realización preferida particular, los compuestos de fórmula I para uso en el tratamiento de cualquier tipo de dolor muestran una selectividad aumentada por CDK9 más que para otras CDK.

El papel de CDK9 en el desarrollo del dolor se podría basar en el siguiente mecanismo de acción: tanto la ciclina T1 como CDK9 estimulan la actividad promotora basal de TNFα. TNFα es una citoquina proinflamatoria y mediador del dolor que controla la expresión de redes genéticas inflamatorias. Para la mediación de las respuestas del receptor de TNF celular, la ruta de factor nuclear-κB (NFκB) es crucial. TNFα desencadena su reclutamiento a genes de citoquinas mientras que NFκB interacciona con el complejo p-TEFb para la estimulación de la transcripción génica (Barboric M et al., 2001).

Además, se ha mostrado que CDK9 es un compañero de unión de TRAF2, un miembro del complejo del receptor de TNFα (MacLachlan et al., 1998), mientras que GP130, una subunidad del complejo del receptor de IL6 proinflamatoria se ha identificado recientemente como otro potencial compañero de unión de CDK9 (Falco et al, 2002). Como un jugador clave en la señalización de TNFα e interleuquina así como en la expresión de varios genes mediada por NfκB (por ejemplo, citoquinas como mediadores de dolor), CDK9 se puede, por tanto, considerar una diana central para el tratamiento de cualquier tipo de dolor, tal como dolor inflamatorio (véase la figura 2).

Para el tratamiento del dolor neuropático, la acción farmacológica tiene que tener lugar más allá de la barrera hematoencefálica (BHE) en el sistema nervioso central (SNC). Las células de microglía como las principales células inmunitarias en el SNC, por ejemplo, liberan, tras la activación, una variación de factores nocivos tal como citoquinas (TNFα, IL1β, IL6) y otras molécula proinflamatorias (Huwe 2003). La microglía se activa por estimulación del receptor

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Enfermedades inflamatorias. Sorprendentemente, se pudo mostrar que los compuestos inhibidores de CDK según la fórmula I como se divulga en el presente documento ejercen un efecto antiinflamatorio en ensayos inflamatorios in vitro e in vivo.

Por tanto, en una forma de realización preferida, esta invención se refiere a un método de tratar enfermedades inflamatorias que comprende administrar una cantidad eficaz de un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina según la fórmula I. En una forma de realización preferida particular, los compuestos de fórmula I para uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias muestran una selectividad aumentada para CDK9 más que para otras CDK.

El papel de CDK9 en el desarrollo de enfermedades inflamatorias se podría basar en el siguiente mecanismo de acción: las enfermedades inflamatorias tal como artritis reumatoide (AR); ateroesclerosis; asma; enfermedad intestinal inflamatoria, lupus eritematoso sistémico y varias otras enfermedades autoinmunitarias están mediadas por el factor de necrosis tumoral α (TNFα), un regulador clave de rutas inflamatorias y obstructivas en tejidos en dichas enfermedades. Se sabe que la señal de TNFα está mediada a través de varios transductores tal como la IκB quinasa (IKK), que fosforila la proteína IκB que se disocia de NfκB tras su fosforilación. El NfκB disociado, un regulador positivo de la transcripción de citoquinas, se transloca en el núcleo celular donde se une a sus sitios de reconocimiento.

Se ha encontrado NfκB activado en la membrana sinovial de pacientes de AR [Han et al.; 2003, Autoimmunity, 28, 197-208]. Regula genes proinflamatorios tal como TNFα, IL-6, IL-8, NOS y COX2. Dirigirse a NfκB y su compañero de señalización anterior IKK ya ha demostrado ser una estrategia terapéutica en muchos modelos animales de artritis [Firestein, 2003, Nature 423, 356-361].

El NfκB unido se asocia con un complejo coactivador que contiene histona acetiltransferasas (CBP, p300, SRC-1, y proteínas relacionadas con SRC-1) que recluta y activa CDK9 que cataliza la fosforilación del CTD de ARN Pol II [West et al.; 2001, Journal of Virology 75(18), 8524-8537]. La hiperfosforilación resultante del CTD de ARN Pol II produce la activación transcripcional de citoquinas proinflamatorias tal como IL-1β, IL-6, e IL-8 que también se sabe que están reguladas por TNFα.

Varios estudios mostraron que TNFα es un ‘regulador maestro’ de una cascada de señalización autóloga que regula la expresión de citoquinas proinflamatorias. Para interrumpir esta cascada proinflamatoria, se pueden usar con éxito anticuerpos (Ac) específicos para bloquear la señal de TNFα. El tratamiento con anti-TNFα de AR con Ac ya ha demostrado su eficacia terapéutica en varios estudios clínicos y fármacos aprobados por la FDA tal como Infliximab y Etanercept han entrado en el mercado [Feldmann y Maini, NatMed, 2003, 9 (10); 356-61]. Sin embargo, las desventajas de las terapias basadas en Ac incluyen su potencial inmunógeno, pérdida concomitante de eficacia durante el tratamiento progresivo y altos costes del tratamiento. Además, la cinética de los Ac permite una reducción más o menos de todo o nada del TNFα circulante. Como resultado, las funciones fisiológicas de la respuesta inmunitaria también se suprimen [Laufer et al., Inflammation and Rheumatic Diseases, 2003; Thieme, pp. 104-5].

Las intervenciones terapéuticas en la cascada de señalización mediada por TNFα con inhibidores de quinasas que se dirigen a dianas tal como p38 MAPK o IKK han mostrado efectos secundarios graves -en la mayoría de los casos debido a la falta de especificidad contra la diana respectiva.

En contraste a lo mismo, los inhibidores específicos de CDK según la fórmula I como se presentan en el presente documento pueden intervenir en el extremo más bajo de las rutas de señalización de TNFα reduciendo la interacción con funciones fisiológicas. Además, dichos compuestos permitirán la interrupción de la red inflamatoria mediada por TNFα autóloga evitando los efectos secundarios a través de una especificidad superior. Por tanto, el tratamiento con inhibidores específicos de CDK9 de fórmula I constituye una estrategia prometedora para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias.

Por tanto, los compuestos según la fórmula I como se presentan en el presente documento se pueden usar para el tratamiento y/o prevención de enfermedades inflamatorias.

El término “enfermedades inflamatorias” como se usa en el presente documento se refiere a enfermedades desencadenadas por mediadores celulares o no celulares del sistema inmunitario o tejidos que causan la inflamación de tejidos del cuerpo y posteriormente producen una afección inflamatoria aguda o crónica.

Los ejemplos de tales enfermedades inflamatorias son reacciones de hipersensibilidad de tipo I-IV, por ejemplo, pero no limitadas a enfermedades de hipersensibilidad del pulmón incluyendo asma, enfermedades atópicas, rinitis o conjuntivitis alérgica, angioedema de los párpados, angioedema hereditario, reacciones de hipersensibilidad y enfermedades autoinmunitarias antirreceptor, tiroiditis de Hashimoto, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, pénfigo, miastenia grave, enfermedad de Grave y Raynaud, diabetes resistente a insulina de tipo B, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn, escleroderma, enfermedad del tejido conjuntivo mixta, polimiositis, sarcoidosis, granulomatosis de Wegener, glomerulonefritis, reacciones del huésped contra el injerto agudas o crónicas.

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Además, el término “enfermedades inflamatorias” incluye pero no está limitado a inflamación de la cavidad abdominal, dermatitis, inflamación gastrointestinal (incluyendo enfermedad intestinal inflamatoria, colitis ulcerativa), fibrosis, inflamación ocular y orbital, enfermedad de ojos secos y enfermedad de ojos secos grave resultante del síndrome de Sjörgen, mastitis, otitis, inflamación en la boca, inflamación del sistema musculoesquelético (incluyendo gota, artrosis), enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central (incluyendo esclerosis múltiple, meningitis bacteriana, meningitis), inflamación del aparato genitourinario (incluyendo prostatitis, glomerulonefritis), inflamación cardiovascular (incluyendo ateroesclerosis, insuficiencia cardiaca), inflamación del aparato respiratorio (incluyendo bronquitis crónica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica), tiroiditis, diabetes mellitus, osteítis, miositis, insuficiencia orgánica múltiple (incluyendo septicemia), polimiositis y artritis psoriásica.

Enfermedades inmunológicas

También se prevé que los compuestos según la fórmula I sean útiles en el tratamiento y/o prevención de enfermedades inmunológicas, tal como, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias.

Según esto, la presente invención proporciona un método para el tratamiento y/o prevención de enfermedades inmunológicas que comprende la administración de una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de CDK según la fórmula I a un sujeto en necesidad de ello.

El término “enfermedades inmunológicas” como se usa en el presente documento se refiere a enfermedades incluyendo, pro no limitadas a alergia, asma, enfermedad de injerto contra el huésped, deficiencia inmunitarias y enfermedades y enfermedades autoinmunitarias.

Específicamente, las enfermedades inmunológicas incluyen diabetes, enfermedades reumáticas, SIDA, enfermedad granulomatosis crónica, rechazo de órganos y tejidos trasplantados, rinitis, enfermedades pulmonares obstructivas crónicas, osteoporosis, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, sinusitis, lupus eritematoso, psoriasis, esclerosis múltiple, miastenia grave, alopecia, infecciones recurrentes, dermatitis atópica, eccema y reacciones anafilácticas graves, pero no están limitadas a las mismas. Además, las “enfermedades infecciosas” también incluyen alergias tal como alergias de contacto, alergias alimenticias o alergias a fármacos.

Enfermedades proliferativas

Los compuestos de fórmula I son inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas, que representan moléculas clave implicadas en la regulación del ciclo celular. La disregulación del ciclo celular es una de las características principales de las células neoplásicas. Por tanto, se espera que dichos compuestos se demuestren útiles en parar o recuperar el control del ciclo celular en células que se dividen anormalmente. Por tanto, se espera que los compuestos según la fórmula I sean útiles en el tratamiento y/o prevención de enfermedades proliferativas tal como cáncer.

Según esto, la invención proporciona un método para el tratamiento y/o prevención de enfermedades proliferativas que comprende administrar una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de una quinasa dependiente de ciclina según la fórmula I.

Como se usa en el presente documento, el término “enfermedad proliferativa” se refiere a trastornos cancerosos, incluyendo, pero no limitados a, neoplasias benignas, displasias, hiperplasias así como neoplasias que muestran crecimiento metastásico o cualquier otra transformación.

El término “cáncer” incluye pero no está limitado a neoplasia benigna y maligna como carcinoma, sarcoma, carcinosarcoma, cánceres de los tejidos que forman la sangre, tumores de tejidos nerviosos incluyendo el cerebro y cáncer de células de la piel.

Los ejemplos de cánceres que se pueden tratar incluyen, pero no están limitados a, un carcinoma, por ejemplo, un carcinoma de la vejiga, mama, colon (por ejemplo, carcinomas colorrectales tal como adenocarcinoma de colon y adenoma de colon), riñón, epidérmico, hígado, pulmón, por ejemplo, adenocarcinoma, carcinoma de pulmón microcítico y de pulmón no microcítico, esófago, vesícula biliar, ovario, páncreas, por ejemplo, carcinoma pancreático exocrino, estómago, cuello uterino, tiroides, próstata o piel, por ejemplo, carcinoma de células escamosas; un tumor hematopoyético de linaje linfoide, por ejemplo, leucemia, leucemia linfocítica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, linfoma de células pilosas, o linfoma de Burkett; un tumor hematopoyético de linaje mieloide, por ejemplo, leucemias mielógenas aguda y crónica, síndrome mielodisplásico, o leucemia promielocítica; cáncer folicular del tiroides; un tumor de origen mesenquimatoso, por ejemplo, fibrosarcoma o habdomiosarcoma; un tumor del sistema nervioso central o periférico, por ejemplo, astrocitoma, neuroblastoma, glioma o schwannoma; melanoma; seminoma; teratocarcinoma; osteosarcoma; xeroderma pigmentosa; queratotantoma; cáncer folicular del tiroides; sarcoma de Kaposi, astrocitoma, carcinoma de células basales, cáncer del intestino delgado, tumores del intestino delgado, tumores gastrointestinales, glioblastomas, liposarcoma, tumor de células germinales, tumores de cabeza y cuello (tumores del oído, nariz y área

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adulta, aneurisma, angina de pecho, edema angioneurótico, estenosis de la válvula aortica, aneurisma aórtico, insuficiencia valvular aortica, displasia ventricular derecha arritmogénica, malformaciones arteriovenosas, fibrilación auricular, síndrome de Behcet, bradicardia, cardiomegalia, cardiomiopatías tal como cardiomiopatía congestiva, hipertrófica y restrictiva, estenosis carótida, hemorragia cerebral, síndrome de Churg-Strauss, embolia por colesterol, endocarditis bacteriana, displasia fibromuscular, insuficiencia cardiaca congestiva, enfermedades de las válvulas del corazón tal como válvulas incompetentes o válvulas con estenosis, ataque al corazón, hematoma epidural o subdural, enfermedad de von Hippel-Lindau, hiperemia, hipertensión, hipertensión pulmonar, crecimiento hipertrófico, hipertrofia ventricular izquierda, hipertrofia ventricular derecha, síndrome del corazón izquierdo hipoplásico, hipotensión, claudicación intermitente, cardiopatía isquémica, síndrome de Klippel-Trenaunay-Weber, síndrome medular lateral, prolapso de la válvula mitral, prolapso de la válvula mitral síndrome QT largo, isquemia miocárdica, miocarditis, trastornos del pericardio, pericarditis, enfermedades vasculares periféricas, flebitis, panarteritis nudosa, atresia pulmonar, enfermedad de Raynaud, restenosis, cardiopatía reumática, síndrome de Sneddon, estenosis, síndrome de la vena cava superior, síndrome X, taquicardia, telangiectasia hemorrágica hereditaria, telangiectasia, arteritis temporal, tromboangitis obliterante, trombosis, tromboembolia, venas varicosas, enfermedades vasculares, vasculitis, vasoespasmo, fibrilación ventricular, síndrome de Williams, enfermedad vascular periférica, venas varicosas y úlceras en las piernas, trombosis venosa profunda y síndrome de WolffParkinson-White.

Además, el término enfermedades cardiovasculares incluye enfermedades resultantes de defectos congénitos, defectos genéticos, influencias medioambientales (por ejemplos influencias de la dieta, estilo de vida, estrés, etc.), y otros defectos o influencias.

Enfermedades neurodegenerativas

Se ha descrito que los inhibidores de CDK ejercen efectos neuroprotectores. Específicamente, se ha descrito que los inhibidores de CDK previenen la muerte neuronal en enfermedades neurodegenerativas tal como la enfermedad de Alzheimer (Biochem Biophys Res Commun 2002 (297):1154-1158; Trends Pharmacol Sci 2002 (23):417-425; Pharmacol Ther 1999, 82(2-3):279-284).

Por tanto, se espera que los compuestos según la fórmula I, que son inhibidores de CDK, proporcionen efectos beneficiosos en el tratamiento terapéutico de enfermedades neurodegenerativas.

Según esto, la invención se refiere a un método de tratar y/o prevenir enfermedades neurodegenerativas que comprende administrar una cantidad eficaz de al menos un inhibidor de una quinasa dependiente de ciclina según la fórmula I.

El término “enfermedades neurodegenerativas” como se usa en el presente documento incluye trastornos del sistema nervioso central así como trastornos del sistema nervioso periférico incluyendo, pero no limitados a, lesiones cerebrales, enfermedades cerebrovasculares y sus consecuencias, enfermedad de Parkinson, degeneración corticobasal, enfermedad de motoneuronas, demencia incluyendo ELA, esclerosis múltiple, lesión cerebral traumática, ictus, post-ictus, lesión cerebral postraumática, y enfermedad cerebrovascular de vasos pequeños, demencias, tal como enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, demencia con cuerpos de Lewis, demencia frontotemporal y parkinsonismo ligado al cromosoma 17, demencias frontotemporales, incluyendo enfermedad de Pick, parálisis nuclear progresiva, degeneración corticobasal, enfermedad de Huntington, degeneración talámica, demencia de Creutzfeld-Jakob, demencia por VIH, esquizofrenia con demencia, psicosis de Korsakoff y demencia relacionada con SIDA.

Similarmente, también se considera que los trastornos cognitivos, tal como deterioro cognitivo leve, deterioro de memoria senil, debilitamiento cognitivo senil, deterioro cognitivo vascular, trastornos de falta de atención, trastornos de hiperactividad por falta de atención, y problemas de memoria en niños con discapacidades de aprendizaje son trastornos neurodegenerativos.

Específicamente la presente invención se refiere a un método para tratar los tipos de dolor y afecciones asociadas y enfermedades inflamatorias, enfermedades inmunológicas, enfermedades proliferativas, enfermedades infecciosas, enfermedades cardiovasculares y enfermedades neurodegenerativas anteriormente referidas, en donde el término “tratar” comprende la prevención, alivio, o tratamiento del dolor y afecciones asociadas y enfermedades inflamatorias, enfermedades inmunológicas, enfermedades proliferativas, enfermedades infecciosas, enfermedades cardiovasculares y enfermedades neurodegenerativas.

Composiciones farmacéuticas

Las formas de realización preferidas de la presente invención incluyen la administración de composiciones que comprenden al menos un inhibidor de quinasas dependientes de ciclina según la fórmula I como principio activo junto con al menos un soporte, excipiente y/o diluyente farmacéuticamente aceptable (es decir, no tóxico).

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Preferiblemente, la composición comprende al menos un inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas según la fórmula I como un principio activo, en donde dicho al menos un inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas tiene una selectividad aumentada para CDK9 más que para otras CDK.

Además, la invención también comprende composiciones que combinan al menos dos inhibidores de CDK y/o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Dichos al menos dos inhibidores pueden inhibir la misma quinasa dependiente de ciclina o también pueden inhibir diferentes tipos de quinasas dependientes de ciclina, por ejemplo, un inhibidor en la composición puede inhibir CDK9 mientras que el otro inhibidor es capaz de inhibir CDK2, por ejemplo.

Teniendo en cuenta el tratamiento del dolor, una medicación contra el dolor individual con frecuencia proporciona solo alivio del dolor parcialmente eficaz porque interfiere con solo una ruta de transducción del dolor de muchas. Por tanto, también se pretende administrar inhibidores de CDK según la fórmula I junto con un agente reductor del dolor (analgésico) que actúa en un punto diferente en el proceso de percepción del dolor.

Un “agente analgésico” comprende una molécula o combinación de moléculas que produce una reducción en la percepción del dolor. Un agente analgésico emplea un mecanismo de acción diferente de la inhibición de CDK.

Una clase de analgésicos, tal como los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), disminuye los mensajeros químicos de los estímulos que son detectados por los nocirreceptores y otra clase de fármacos, tal como los opiáceos, altera el procesamiento de la información nociceptiva en el SNC. Otros analgésicos son anestésicos locales, anticonvulsivos y antidepresivos tal como antidepresivos tricíclicos. Administrar una o más clases de fármacos además de inhibidores de CDK puede proporcionar alivio más eficaz del dolor.

Los AINE preferidos para su uso en los métodos y composiciones de la presente invención son aspirina, paracetamol, ibuprofeno e indometacina. Además, también se pueden usar inhibidores de cicloxigenasa-2 (COX-2), tal como inhibidores específicos de COX-2 (por ejemplo, celecoxib, COX189 y rofecoxib) como un agente analgésico en los métodos y composiciones de la presente invención.

Los antidepresivos tricíclicos preferidos se seleccionan del grupo que consiste en clomipramina, amoxapina, nortriptilina, amitriptilina, imipramina, desipramina, doxepina, trimipramina, protriptilina y pamoato de imipramina.

Además, el uso de anticonvulsivos (por ejemplo, gabapentina), agonistas de GABAB (por ejemplo, L-baclofeno), opiáceos, antagonistas del receptor vainilloide y agonistas del receptor canabinoide (CB), por ejemplo agonistas del receptor CB1 como analgésico también se prefiere en los métodos y composiciones en la invención.

Al preparar composiciones con inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas de esta invención, se pueden seguir las recomendaciones de fuentes farmacéuticas bien conocidas tal como Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª ed. (Mack Publishing, 1995).

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden preparar en un soporte o diluyente sólido o líquido convencional y un adyuvante farmacéuticamente hecho convencional a un nivel de dosis adecuado de una manera conocida. Las preparaciones preferidas están adaptadas para la aplicación oral. Estas formas de administración incluyen, por ejemplo, píldoras, comprimidos, comprimidos con película, comprimidos recubiertos, cápsulas, polvos y depósitos.

Además, la presente invención también incluye preparaciones farmacéuticas para aplicación parenteral, incluyendo aplicación dérmica, intradérmica, intragástrica, intracutánea, intravasal, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, intravaginal, intrayugal, percutánea, rectal, subcutánea, sublingual, tópica o transdérmica, en donde dichas preparaciones además de vehículos y/o diluyentes típicos contienen al menos un inhibidor según la presente invención y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo como principio activo.

Las composiciones farmacéuticas según la presente invención que contienen al menos un inhibidor según la presente invención y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo como principio típicamente se administrarán junto con materiales soporte adecuados seleccionados con respecto a la forma deseada de administración, es decir, para la administración en forma de comprimidos, cápsulas (bien rellenas de sólido, rellenas de semisólido o rellenas de líquido), polvos para reconstitución, geles, elixires, gránulos dispersables, jarabes, suspensiones, y similares, y consistentes con prácticas farmacéuticas convencionales. Por ejemplo, para la administración oral en forma de comprimidos o cápsulas, el componente fármaco activo se puede combinar con cualquier soporte farmacéuticamente aceptable no tóxico oral, preferiblemente, con un soporte inerte como lactosa, almidón, sacarosa, celulosa, estearato de magnesio, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, talco, manitol, alcohol etílico (cápsulas rellenas de líquido) y similares.

Además, también se pueden incorporar aglutinantes, lubricantes, agentes disgregantes y agentes colorantes adecuados en el comprimido o cápsula. Los polvos y comprimidos pueden contener desde aproximadamente el 5 hasta aproximadamente el 95% en peso de un inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas según la fórmula I

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El término disgregantes se refiere a materiales añadidos a la composición para apoyar la disgregación y liberación de los ingredientes farmacéuticamente activos de un medicamento. Los disgregantes adecuados incluyen almidones, almidones modificados “solubles en agua fría” tal como carboximetilalmidón sódico, gomas naturales y sintéticas tal como goma garrofín, karaya, guar, tragacanto y agar, derivados de celulosa tal como metilcelulosa y carboximetilcelulosa de sodio, celulosas microcristalinas, y celulosas microcristalinas entrecruzadas tal como croscarmelosa de sodio, alginatos tal como ácido algínico y alginato de sodio, arcillas tal como bentonitas, y mezclas efervescentes. La cantidad de disgregante en la composición puede variar desde aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 20% en peso, de la composición, más preferiblemente, desde aproximadamente el 5 hasta aproximadamente el 10% en peso.

Los aglutinantes son sustancias que unen o “pegan” partículas de polvo y las hacen cohesivas formando gránulos, sirviendo por tanto como el “adhesivo” en la formulación. Los aglutinantes añaden fuerza cohesiva ya disponible en el diluyente o agente de carga. Los aglutinantes adecuados incluyen azúcares tal como sacarosa, almidones derivados de trigo maíz arroz y patata, gomas naturales tal como goma arábiga, gelatina y tragacanto, derivados de algas tal como ácido algínico, alginato de sodio y alginato de calcio y amonio, materiales de celulosa tal como metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio e hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, y compuestos inorgánicos, tal como silicato de magnesio y aluminio. La cantidad de aglutinante en la composición puede variar desde aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 20% en peso de la composición, preferiblemente desde aproximadamente el 3 hasta aproximadamente el 10% en peso, y más preferiblemente desde aproximadamente el 3 hasta aproximadamente el 6% en peso.

Lubricantes se refiere a una clase de sustancias que se añaden a la forma farmacéutica para permitir que los gránulos del comprimido etc., después de ser comprimidos se liberen del molde o troquel reduciendo la fricción o desgaste. Los lubricantes adecuados incluyen estearatos metálicos tal como estearato de magnesio, estearato de calcio, o estearato de potasio, ácido esteárico, ceras de alto punto de fusión, y otros lubricantes solubles en agua tal como cloruro de sodio, benzoato de sodio, acetato de sodio, oleato de sodio, polietilenglicoles y D,L-leucina. Los lubricantes habitualmente se añaden en el último paso antes de la compresión, ya que deben estar presentes en la superficie de los gránulos. La cantidad de lubricante en la composición puede variar desde aproximadamente el 0,2 hasta aproximadamente el 5% en peso de la composición, preferiblemente desde aproximadamente el 0,5 hasta aproximadamente el 2% en peso, y más preferiblemente desde aproximadamente el 0,3 hasta aproximadamente el 1,5% en peso de la composición.

Los deslizantes son materiales que previenen apelmazamiento de los componentes de la composición farmacéutica y mejoran las características de flujo del granulado de modo que el flujo sea suave y uniforme. Los deslizantes adecuados incluyen dióxido de silicona y talco.

La cantidad de deslizante en la composición puede variar desde aproximadamente el 0,1 hasta aproximadamente el 5% en peso de la composición final, preferiblemente desde aproximadamente el 0,5 hasta aproximadamente el 2% en peso.

Los agentes colorantes son excipientes que proporcionan color a la composición o la forma farmacéutica. Tales excipientes pueden incluir colorantes de grado alimentario adsorbidos en un adsorbente adecuado tal como arcilla u óxido de aluminio. La cantidad de agente colorante puede variar desde aproximadamente el 0,1 hasta aproximadamente el 5% en peso de la composición, preferiblemente desde aproximadamente el 0,1 hasta aproximadamente el 1% en peso.

La presente invención se refiere a la administración de composiciones que contienen como principio activo un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina a un sujeto en necesidad de ello para el tratamiento de cualquier tipo de dolor, trastornos inflamatorios, enfermedades inmunológicas, enfermedades proliferativas, enfermedades cardiovasculares o enfermedades neurodegenerativas.

“Un sujeto en necesidad de ello” comprende un animal, preferiblemente un mamífero, y lo más preferiblemente un ser humano, que se espera experimente cualquier tipo de dolor, trastornos inflamatorios, enfermedades inmunológicas, enfermedades proliferativas, enfermedades cardiovasculares o enfermedades neurodegenerativas en el futuro próximo o que tiene experiencia continua de dichas afecciones. Por ejemplo, tal animal o ser humano puede tener una afección continua que está causando dolor actualmente y es probable que continúe causando dolor, o el animal o ser humano ha estado, está o estará soportando un procedimiento o suceso que habitualmente tienen consecuencias dolorosas. Las afecciones dolorosas crónicas tal como hiperalgesia neuropática diabética y enfermedades vasculares de colágeno son ejemplos del primer tipo; el trabajo dental, particularmente en un área de inflamación o daño nervioso, y la exposición a toxinas (incluyendo exposición a agentes quimioterapéuticos) son ejemplos del último tipo.

Para alcanzar el efecto terapéutico deseado, el respectivo inhibidor de quinasa dependiente de ciclina se tiene que administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz.

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a. Se disolvió cloruro de (nitrofenil)metanosulfonilo (4,17 g, 20 mM) (Ziegler, Carl y Sprague, James M., J. of Org. Chem. (1951), 16, 621-5) en acetonitrilo (20 ml), se añadió amoniaco concentrado (20 ml), saturado con carbonato

5 de amonio, y la mezcla se agitó vigorosamente durante 1 h a temperatura ambiente. Después el acetonitrilo se evaporó, el residuo se diluyó con agua fría (20 ml) produciendo la formación de un precipitado que se filtró y se lavó con agua (2x25 ml) y éter y se secó a presión reducida. Rendimiento de (3-nitro-fenil)metanosulfonamida: 3,5 g (80%).

10 b. Se hidrogenó (3-nitrofenil)metanosulfonamida (3,5 g, 16 mM) sobre níquel Raney (0,5 g) a 50ºC y 70 psi durante 4 horas. Después el catalizador se filtró y lavó con metanol templado. Los filtrados combinados se evaporaron para dar 2,83 g (95%) de (3-amino-fenil)-metanosulfonamida.

c. Se disolvieron 4,6-dicloro-pirimidina (6 g, 0,04 mol) (Ranganathan, Subramania et al., Proceedings -Indian

15 Academy of Sciences, Chemical Sciences (1994), 106(5), 1051-70. Maggiali, C. et al., Farmaco, Edizione Scientifica (1988), 43(3), 277-91. Gershon, Herman et al., J. of Med. Chem. (1963), 6, 87-9) y ácido (2-metoxi-fenil)-borónico (4,37 g, 0,029 mol) en dimetoxietano (120 ml) y agua (18 ml). A esta solución se añadieron NaHCO3 (6,72 g, 0,08 mol), PdCl2(PPh3)2 (0,84 g) y se dejó a reflujo durante 7 horas (control por TLC). A continuación la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y los solventes se eliminaron a presión reducida. El sólido crudo obtenido se disolvió en

20 diclorometano (100 ml), se lavó con agua (1 x 100 ml), la fase orgánica se separó, se secó sobre K2CO3, se filtró y el solvente se eliminó a presión reducida. El sólido obtenido se purificó adicionalmente por cromatografía rápida (eluyente diclorometano) para dar un producto crudo que se cristalizó de hexano para dar 2-cloro-4-(2-metoxi-fenil)pirimidina (4,7 g, 73%).

25 d. Una solución de 2-cloro-4-(2-metoxi-fenil)-pirimidina (0,882 g, 0,004 mol) y (3-amino-fenil)-metanosulfonamida (0,865 g, 0,005 mol) en DMF (12 ml) se agitó durante 2 horas a 80ºC (control por TLC). El solvente se eliminó a presión reducida para dar {3-[4-(2metoxi-fenil)-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-metanosulfonamida.

Ejemplo 2: Síntesis de 2-{3-[4-(2-metoxi-fenil)-pirimidin-2-ilamino]-fenilmetanosulfonil}-etanol (Compuesto 9) 30

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a. Se colocó 2-(3-nitro-fenilmetanosulfonil)-etanol (0,8 g, 3,3 mmol) (Harms, Wolfgang et al., Ger. Offen. (1995), documento DE 4402189 A1, 19950727) en un matraz de hidrogenación y se disolvió en metanol (100 ml). Después 5 de la adición de níquel Raney (200 mg), la mezcla se dejó agitar a una presión de hidrógeno de 70 psi a 50ºC durante 4 horas. A continuación el catalizador se eliminó por filtración y se lavó con metanol. Las soluciones de metanol se combinaron y el solvente se evaporó a presión reducida. El producto crudo se purificó por cromatografía rápida (sistema eluyente: diclorometano/metanol -10/1), las fracciones deseadas se combinaron, secaron y evaporaron. El residuo se lavó con éter dietílico para dar 2-(3-amino-fenilmetanosulfonil)-etanol (0,51, rendimiento

10 del 73%).

b. Una solución de 2-(3-amino-fenilmetanosulfonil)-etanol (0,215 g, 1 mmol) y 2-cloro-4-(2-metoxi-fenil)-pirimidina (0,22 g, 1 mmol) en DMF (3 ml) se agitó durante 2 horas a 80ºC (control por TLC). El solvente se eliminó a presión reducida para dar un residuo oleaginoso que se cristalizó de isopropanol dando 2-{3-[4-(2-metoxi-fenil)-pirimidin-2

15 ilamino]-fenilmetanisulfonil}-etanol (0,3 g, 75%).

En analogía, se han sintetizado los siguientes compuestos usando los materiales de partidas correspondientemente sustituidos.

Compuesto No.: Estructura Nombre de la IUPAC Ms m/z

1: {3-[4-(2-Metoxi-fenil)-pirimidin-2-ilamino]fenil}-metanosulfonamida 371 (M+1)

2: {3-[4-(2-Isopropoxi-fenil)-pirimidin-2-ilamino]fenil}-metanosulfonamida 399 (M+1)

3: C-{3-[4-(2-Metoxi-fenil)-pirimidin-2-ilamino]fenil}-N,N-dimetilmetanosulfonamida 399 (M+1)

4: C-{3-[4-(2-Metoxi-fenil)-pirimidin-2-ilamino]fenil}-N-metil-metanosulfonamida 385 (M+1)

5: {3-[4-(4-Fluoro-2-metoxi-fenil)-pirimidin-2ilamino]-fenil}-metanosulfonamida 389 (M+1)

6: N-Ciclopropil-C-{3-[4-(2-metoxi-fenil)pirimidin-2-ilamino]-fenil}-metanosulfonamida 411 (M+1)

7: N-(2-Hidroxi-etil)-C-{3-[4-(2-metoxi-fenil)pirimidin-2-ilamino]-fenil}-metanosulfonamida 415 (M+1)

8: N-(2-Hidroxi-etil)-C-{3-[4-(2-metoxi-fenil)pirimidin-2-ilamino]-fenil}-N-metilmetanosulfonamida 429 (M+1)

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9: 2-{3-[4-(2-Metoxi-fenil)-pirimidin-2-ilamino]fenilmetanosulfonil}-etanol 400 (M+1)

10: {3-[4-(2-Metoxi-fenil)-6-metil-pirimidin-2ilamino]-fenil}-metanosulfonamida 367,9 (M+1) 365,6 (-MS)

11: N-(2-Hidroxi-etil)-C-{3-[4-(2-metoxi-fenil)-6metil-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-N-metilmetanosulfonamida 444 (M+1)

12: 2-{3-[4-(2-Metoxi-fenil)-6-metil-pirimidin-2ilamino]-fenilmetanosulfoniI}-etanol 413,9 (M+1)

13: {3-[4-(2-Metoxi-fenil)-5-metil-pirimidin-2ilamino]-fenil}-metanosulfonamida 384,9 (M+1)

14: N-(2-Hidroxi-etil)-C-{3-[4-(2-metoxi-fenil)-5metil-pirimidin-2-ilamino]-fenil}-N-metilmetanosulfonamida 444 (M+1)

15: 2-{3-[4-(2-Metoxi-fenil)-5-metil-pirimidin-2ilamino]-fenilmetanosulfoniI}-etanol 414, 416 (M+1)

Ejemplo 3

I. Modelos animales de comportamiento para el análisis de dolor inflamatorio y neuropático

5 Se conocen varios modelos animales para el análisis del dolor inflamatorio y neuropático, Dichos modelos comparten la característica común de que después de, por ejemplo, inducción de una lesión en un nervio (por ejemplo lesión del nervio conservado, SNI) o después de exponer animales experimentales a un estímulo nocivo (por ejemplo, inyección de formalina o carragenano), los signos del dolor inducido por dichas intervenciones se

10 miden por componentes de comportamiento cuantificables tal como, por ejemplo, umbral de retirada de la pata a estimulación mecánica con filamentos de von Frey (o a la estimulación térmica usando una fuente laser o comportamiento de lamerse). Estas reacciones se interpretan como que son equivalentes a alodinia mecánica y térmica (hipersensibilidad a estímulos mecánicos) o hiperalgesia en seres humanos.

15 El modelo de la lesión del nervio conservado (modelo SNI, desarrollado por Decosterd y Woolf (2000), véase la figura 1) se caracteriza por la inducción de lesiones nerviosas clínicamente relevantes y después de la intervención quirúrgica, experimentos de comportamiento posteriores (por ejemplo, ensayo de von Frey). Dicho modelo constituye un modelo de lesión nerviosa común que consiste en la ligación y sección de dos ramas del nervio ciático (es decir, los nervios ciático poplíteo interno y safeno interno) dejando el nervio safeno externo intacto. El modelo de

20 SNI produce cambios tempranos (menos de 24 horas), prolongados y sustanciales en la sensibilidad mecánica y al frío que mimetizan estrechamente las características del dolor neuropático clínico. Se ha mostrado que los animales con estos tipos de lesión nerviosa desarrollan sensaciones de dolor anormales e hipersensibilidad a estímulos mecánicos (alodinia) similares a los descritos por pacientes de dolor neuropático.

25 Alternativamente, el ensayo de formalina es un modelo de comportamiento válido y fiable de nocicepción en dolor inflamatorio y neuropático. Es sensible a varias calases de fármacos analgésicos (Hunskaar S, Hole K, Pain. 1987 Jul;30(1):103-14.) El estímulo nocivo consiste en una inyección de 10 μl de formalina diluida (2% en solución salina) bajo la piel de la superficie dorsal de la pata posterior izquierda (subcutánea o interplantar en la pata posterior izquierda). La respuesta es lamer y encoger la pata inyectada.

30 Para el ensayo del carragenano se aplica una inyección subcutánea de 25 μl de carragenano al 1% (en solución salina) en una única pata posterior (pata ipsilateral) de ratones. La posterior inflamación produce hinchazón de larga duración e hipersensibilidad (contra estímulos mecánicos y térmicos) de la pata. El ensayo del carragenano es un ensayo estándar de laboratorio para predecir actividad antiinflamatoria de compuestos de prueba. Se usan medidas

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de edema y ensayo de Hargreaves (retirada de las patas debido a estimulación térmica a través de una fuente de luz) para la lectura.

Respecto a la presente invención, el efecto de la administración de compuestos inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas (CDK) según la fórmula I sobre el desarrollo de dolor inflamatorio y neuropático se ensaya en un modelo de SNI, en un ensayo de carragenano y uno de formalina. El procedimiento experimental y los resultados se describen en detalle a continuación.

Ejemplo 4

A. Lesión del nervio conservado (SNI) -Modelo de dolor neuropático crónico

Como se ha esbozado anteriormente el modelo de la lesión del nervio conservado (véase la figura 1) implica una lesión de dos de las tres ramas terminales del nervio ciático (nervios ciático poplíteo interno y safeno interno) de animales experimentales, dejando el nervio safeno externo intacto. La SNI produce alodinia mecánica y térmica en el territorio de la piel del nervio safeno externo no lesionado (Decosterd y Woolf, Pain 2000; 87:149-158. (2) Tsujino et al., Mol. Cel. Neurosci. 2000; 15:170-182).

1. Inducción de lesión del nervio conservado (lesión nerviosa) en ratones de tipo salvaje

Se anestesiaron ratones de tipo salvaje (cepa C3HeB/FeJ) (edad, sexo y peso coincidentes) con Hypnorm (0,315 mg/ml de citrato de fentanilo + 10 mg/ml de fluanisona; Janssen)/Hypnovel (5 mg/ml de midazolam; Roche Applied Sciences)/agua en una proporción de 1:1:2 a 4 μl/g antes de preparación quirúrgica.

Posteriormente, se hizo una incisión con precauciones asépticas en la pata trasera derecha ipsilateral de todos los ratones justo por encima del nivel de la rodilla, exponiendo las tres ramas terminales el nervio ciático: los nervios safeno interno, ciático poplíteo interno y safeno externo. Los nervios safeno interno y ciático poplíteo interno se ligaron fuertemente con seda 7/0 y se seccionaron distales a la ligación eliminando ≈2 mm de fragmento de nervio distal. La rama safena externa se dejó sin tocar durante el procedimiento (denominado en el presente documento “SNI ipsi”). El músculo que recubre y la piel se suturaron, y los animales se dejaron recuperar y para permitir la cicatrización. En los mismos ratones las ramas del nervio ciático de la pata trasera izquierda contralateral se expusieron pero no se lesionaron (indicado aquí “SNI contralateral”). Los ratones que se sometieron a lesión de nervio conservado se indican de aquí en adelante “ratones SNI”.

2. Administración de compuestos que inhiben CDK a ratones SNI

Después de la recuperación de la cirugía y la cicatrización, los ratones SNI recibieron inyecciones orales (v.o) de compuestos que inhiben CDK.

Se administraron 30 mg/kg de un inhibidor de CDK, disuelto en 400 μl de hidroxipropilcelulosa al 2%; ácido láctico al 0,25% (solución al 85%) mediante una aplicación por vía oral 30 minutos antes de las medidas de von Frey (alodinia mecánica). Como control negativo, se administró la misma cantidad de vehículo (400 μl) de hidroxipropilcelulosa al 2%; ácido láctico al 0,25% (solución al 85%) mediante una aplicación por vía oral única 30 minutos antes de las medidas de von Frey.

La inyección de inhibidor o vehículo, y posteriores de medidas del umbral de retirada de la pata a estimulación mecánica en ensayos de von Frey se realizaron el 107 después de SNI. Las respuestas nociceptivas reflejas a la estimulación mecánica se midieron en un ensayo de von Frey 30 minutos después de cada inyección.

El efecto de la administración de inhibidores de CDK a ratones SNI sobre el desarrollo de alodinia mecánica se analizó en un ensayo de von Frey, como se describe a continuación.

3. Ensayo de comportamiento de ratones SNI después de la administración de compuestos que inhiben CDK (ensayo de von Frey)

Los ratones que se sometieron a SNI y posterior administración de los compuestos de la presente invención se probaron para signos de alodinia mecánica tras la lesión nerviosa y tras la administración en un ensayo de von Frey (Decosterd y Woolf, Pain 2000; 87:149-158). Este ensayo determina el umbral mecánico en el que un estímulo, que normalmente no es doloroso, es reconocido por un animal como incómodo o doloroso. Se establecieron líneas basales de SNI ipsi y SNI contra, respectivamente.

Los umbrales mecánicos de ratones SNI se cuantificaron usando el método arriba-abajo basado en Chaplan et al. (1994) y Malmberg y Basbaum (1998).

Los ratones se colocaron en cilindros de plexiglás de aproximadamente 9,5 cm de diámetro, 14 cm de altura con cuatro agujeros de ventilación hacia arriba y una tapa de plexiglás. Los cilindros se colocaron en una superficie de

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Las células monocíticas THP-1 (ATCC; TIB-202) se pueden diferenciar a células similares a macrófagos que expresan citoquinas proinflamatorias como TNFα, IL6 e IL1β tras la inducción con LPS o por TNFα (inducción autocrina) mismo.

Se ha reconocido que los mediadores inflamatorios tal como las citoquinas TNFα, IL6 e IL1β pueden contribuir a estados de dolor persistentes así como a trastornos inflamatorios. Después de ser liberados de las células inmunitarias como macrófagos en tejidos periféricos y microglia en el SNC, estos mediadores parecen desempeñar un papel central no solo en el dolor neuropático e inflamatorio sino también en trastornos inflamatorios tal como artritis reumatoide (F Marchand et al., Nat Rev Neurosci 2005; 6 (7); 521-532). Por tanto la inhibición del factor de necrosis tumoral α (TNFα) representa una diana relevante también en el tratamiento de trastornos inflamatorios [Lavagno et al., Eur J Pharmacol 2004; 501, 199-208].

Por tanto, el ensayo in vitro en THP-1 se puede usar como un modelo de cribado poderoso para abordar la inhibición farmacológica de la expresión de citoquinas (U Singh et al, Clin Chem 2005; 51 (12); 2252-6], K Rutault et al., J Biol Chem 2001; 276 (9); 6666-74].

1. Crecimiento y diferenciación de células THP-1

Las células THP-1 se hacen crecer en medio RPMI-1640 modificado (ATCC, No. de Cat. 30-2001) suplementado con SFT al 10% y Pen/Strep al 1%. Para los ensayos de inhibición de citoquinas, las células se siembran a una densidad de 5 x 105 células/ml en placas de 6 pocillos en medio de crecimiento estándar suplementado con PMA 100 ng/ml (Sigma, P1585) para inducir la diferenciación a células similares a macrófagos. Después de 24 horas, el medio se sustituye con medio de crecimiento estándar (sin PMA) y las células se incuban durante otras 48 horas para completar la diferenciación.

2. Tratamiento de células THP-1 diferenciadas con compuestos inhibidores de CDK y estimulación con LPS

Después de 72 horas de diferenciación, el medio se sustituye con medio de crecimiento sin suero, y se añaden compuestos inhibidores de CDK así como compuestos de referencia tal como controles positivos y negativos, disuelto cada uno en DMSO, a concentraciones que varían desde 0,5 a 5 μM (la concentración final de DMSO en el pocillo es 0,1%). Las células se incuban durante 60 minutos con los compuestos antes de la estimulación con LPS 10 ng/ml (Sigma, L2630) durante otras 4-48 horas. Los sobrenadantes se recogen y se ensaya inmediatamente la expresión de citoquinas, por ejemplo, para TNFα, IL6 e IL1b usando ensayos de ELISA sándwich comercialmente disponibles (eBioscience, No. Cat. 88-7346, 88-7066, 88-7010) o se mantienen congelados a 20ºC hasta su evaluación.

3. Determinación de las concentraciones de citoquinas en sobrenadante de THP-1 después de la administración de compuestos inhibidores de CDK

Las concentraciones de TNFα, IL6 e IL1β en los sobrenadantes del cultivo celular se miden usando kits de ELISA comerciales (eBioscience) según las instrucciones del fabricante.

4. Efectos del tratamiento con compuestos inhibidores de CDK sobre la expresión de proteína de citoquinas en sobrenadantes de células THP-1

Se administraron compuestos inhibidores de CDK # 1, 5, 6, 8 y 9 a células THP-1 diferenciadas en triplicados como se ha descrito anteriormente (véase la sección 2). Después de 60 minutos de preincubación con el compuesto de prueba o referencia (SB203580, un inhibidor de p38 y BMS345541, un inhibidor de IKK) solo, las células se estimularon con LPS. Después de la incubación durante 4-48 horas, los sobrenadantes se recogieron y se realizaron determinaciones de las concentraciones de citoquinas en sobrenadantes basadas en ELISA como se describe en la sección 3, anteriormente.

La comparación de las células tratadas con los compuestos # 1, 5, 6, 8 y 9 y compuestos de referencia frente a células tratadas con vehículo (DMSO) mostró un efecto inhibidor significativo del compuesto # 1, 5, 6, 8 y 9 en la concentración de proteína TNFα e IL6 en el sobrenadante celular. Comparados a los compuestos de referencia, SB203580 o BMS345541, estos compuestos mostraron una inhibición similar o mejor de la expresión TNFα/IL6.

Los efectos de la administración de los compuestos # 1, 5, 6, 8 y 9 sobre la expresión de TNFα en macrófagos THP1 inducidos con LPS se muestran en la figura 3.

Estos descubrimientos indican que los compuestos inhibidores de CDK # 1, 5, 6, 8 y 9 son supresores eficaces de la expresión de la citoquina TNFα.

Ejemplo 10

A. Ensayos de inhibición de quinasas in vitro

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Koltzenburg M, Neural mechanisms of cutaneous nociceptive pain. Clin J Pain, 2000, 16(3 Supl), 131-138

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Claims

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