ES2542407T3 - Cebadores para detectar Plasmodium - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para detectar o identificar una infección con más de una de entre Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale en una muestra; comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas (a) a (c): a) extraer ADN de la muestra; b) amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium haciendo reaccionar el ADN extraído en la etapa (a) en una mezcla de reacción que contiene una ADN polimerasa de desplazamiento de hebra y un conjunto de cebadores específicos de secuencia; y c) detectar o identificar la presencia o ausencia de un producto amplificado de más de una de entre Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale, amplificado en la etapa (b), siendo el conjunto de cebadores específicos de secuencia más de uno de entre: un conjunto de cebadores que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 7 a 12 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium falciparum, un conjunto de cebadores que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 13 a 18, SEC ID nº: 31 a 36 o SEC ID nº: 37 a 42 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium vivax, un conjunto de cebadores que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 19 a 24 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium malariae, y un conjunto de cebadores que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 25 a 30 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium ovale.

Description

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conjuntos de cebadores para P. ovale [F3 (SEC ID nº: 25), B3c (SEC ID nº: 26), FIP(Flc-F2) (SEC ID nº: 27), BIP(B1-B2c) (SEC ID nº: 28), LPF (SEC ID nº: 29), LPB (SEC ID nº: 30)].
Se realizó la reacción de LAMP con un kit de amplificación de ADN Loopamp (Eiken Chemical Co., Ltd., Tokio, Japón).
Las mezclas de reacción (25 µl) contenían de 1,6 a 2,4 µM de cada uno de FIP y BIP, 0,2 µM de cada uno de F3 y B3c, 0,8 µM de cada uno de LPF y LPB, 2 x mezcla de reacción (12,5 µl), ADN polimerasa de Bst (1 µl) y de 1 a 2 µl de muestra de ADN (correspondiente a aproximadamente de 0,125 a 0,5 µl de sangre).
Se realizó la reacción de LAMP a 60ºC durante 100 minutos, después se inactivó la enzima a 80ºC durante 2 minutos.
Análisis de productos de LAMP:
La reacción de LAMP provoca turbidez en el tubo de reacción, proporcional a la cantidad de ADN amplificado. Por tanto, se observó la turbidez a simple vista. Para confirmar la sensibilidad de LAMP, también se monitorizó la turbidez mediante un turbidímetro en tiempo real Loopamp (RT-160C, Eiken Chemical Co., Tokio, Japón).
Para confirmación adicional, se sometieron 5 µl de producto de LAMP a electroforesis a 100 V en un gel de agarosa al 3%, seguido por tinción con bromuro de etidio, utilizando un marcador de peso molecular de ADN MassRulerTM (Fermentas Inc., Hanover, MD). Se evaluó la especificidad de LAMP mediante digestión con enzimas de restricción del producto amplificado.
Basándose en los mapas de enzimas de restricción de las secuencias diana de cada producto de LAMP, se seleccionó la enzima de restricción DdeI para el análisis con enzimas de restricción de los productos de LAMP específicos del género Plasmodium, HpyCH4V para P. falciparum, P. vivax y P. malariae, y la enzima de restricción AluI para P. ovale. Tras digestión durante la noche a 37ºC, se analizaron los productos digeridos mediante electroforesis en gel de agarosa.
Umbral de diagnóstico de resultados de LAMP:
Se monitorizó la formación de productos de reacción de LAMP utilizando un turbidímetro en tiempo real Loopamp. La mayoría de las muestras positivas sometidas a prueba múltiples veces mostraron positividad en el plazo de 1 hora. Por tanto, una muestra que presentaba una turbidez superior o igual al valor umbral mediante turbidímetro en el plazo de 1 hora se consideró positiva.
Secuenciación y ADN de plásmido de control positivo:
Para la evaluación de la sensibilidad, se construyeron plásmidos que contenían la región diana del gen de ARNr 18S para la reacción de LAMP para cada especie. Se amplificó la secuencia de ADN diana con dos cebadores de LAMP (F3 y B3c) mediante PCR, después se clonó en el vector de clonación pCR® 2.1-TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Se determinaron las secuencias de nucleótidos utilizando un secuenciador de ADN automatizado (ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer, Applied Biosystems).
Sensibilidad y especificidad analíticas de LAMP:
Para establecer el número de copias mínimo (límite de detección inferior) de secuencia génica diana detectable mediante LAMP, se utilizaron ADN de plásmido de control positivo como moldes. Se construyó la curva patrón para LAMP utilizando diluciones en serie de 10 veces de ADN de plásmido (106 para 1 copia) en agua estéril. Para cada patrón, se trazó el número de copias frente al tiempo umbral. Se analizaron los gráficos resultantes mediante regresión lineal y se analizó la significación estadística de los valores de � 2 mediante ANOVA (Free Statistics and Forecasting Software v1.1.21: http://www.wessa.net/rwaspkendall.wasp). Se consideró que probabilidades inferiores a 0,05 eran estadísticamente significativas. Se evaluó la especificidad de LAMP específica del género y de la especie con cada ADN de plásmido de control y ADN genómico de P. falciparum (ADNg) purificado a partir de la cepa NF54, ADNg de P. vivax a partir de la cepa Sal-I, ADNg de P. malariae a partir de la cepa Uganda, y ADNg de
P. ovale de tipo CDC a partir de la cepa CDC.
Resultados de sensibilidad y especificidad analíticas de LAMP específica del género Plasmodium y de la especie:
La sensibilidad de LAMP para el género Plasmodium y cuatro especies de parásito de la malaria, P. falciparum, P. vivax, P. malariae y P. ovale, fue de 10 copias para P. malariae y P. ovale, y de 100 copias para el género Plasmodium, P. falciparum y P. vivax.
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Se confirmó adicionalmente la especificidad de cada reacción de LAMP mediante digestión con enzimas de restricción de productos de LAMP. Los tamaños de los productos de digestión resultantes concordaban bien con los tamaños predichos.
Sensibilidad y especificidad clínicas:
Se calcularon la sensibilidad y especificidad clínicas de LAMP de Plasmodium con 121 muestras de sangre completa con microscopía como procedimiento patrón de referencia. Se calculó la sensibilidad como (número de auténticos positivos)/(número de auténticos positivos + número de falsos negativos), y se calculó la especificidad como (número de auténticos negativos)/(número de auténticos negativos + número de falsos positivos).
Sensibilidad y especificidad clínicas: comparación de microscopía y LAMP:
Los resultados de microscopía y LAMP se facilitan en la tabla 2.
De entre 68 pacientes que eran positivos para parásito de la malaria mediante microscopía, a 12 pacientes se les diagnosticó infección por P. falciparum, a 34 infección por P. vivax, a 12 infección por P. malariae, a 5 infección por
P. ovale y a 5 infección mixta por P. falciparum y P. vivax. Las 53 muestras restantes fueron negativas mediante microscopía.
LAMP utilizando el conjunto de cebadores específicos del género detectó parásitos de la malaria en 67 muestras de 68 muestras positivas mediante microscopía (sensibilidad del 98,5%). De entre las 53 muestras que eran negativas mediante microscopía, LAMP específica del género detectó parásitos de la malaria en 3 muestras (especificidad del 94,3%).
Las 3 muestras positivas mediante LAMP pero negativas mediante microscopía volvieron a someterse a prueba mediante LAMP.
Las tres muestras fueron de nuevo positivas mediante LAMP específica del género; a una se le diagnosticó P. falciparum y a las otras dos P. vivax mediante LAMP específica de la especie.
Por tanto, se supone que la LAMP es más sensible que la microscopía y puede reducir el diagnóstico de falsos negativos, que pueden causar clínicamente omisiones, al menor grado posible.
Las 12 muestras que eran positivas para P. falciparum mediante microscopía también fueron positivas para P. falciparum mediante LAMP específica de la especie. De entre 34 muestras positivas para P. vivax mediante microscopía, a 2 muestras se les diagnosticó infección por P. ovale, y a 1 infección mixta por P. falciparum y P. vivax, mediante LAMP. De entre 12 muestras positivas para P. malariae, a 1 muestra se le diagnosticó P. ovale ya1 muestra P. malariae y P. vivax mixta.
Los resultados anteriores indican que el nuevo procedimiento de diagnóstico de la malaria mediante LAMP desarrollado por los presentes inventores presenta una mayor sensibilidad y mayor especificidad que la microscopía, y es un procedimiento ventajoso para detectar las cuatro especies de parásitos de la malaria en seres humanos.
El tiempo de detección promedio mediante LAMP fue tal como sigue.
LAMP específica del género: 25,7 ± 4,9 minutos (media ± DE; de 19,4 a 52,9 minutos);
LAMP específica de P. falciparum: 31,7 ± 4,8 minutos (de 25,8 a 44,9 minutos);
LAMP específica de P. malariae: 30,6 ± 5,2 minutos (de 25,4 a 46,9 minutos);
LAMP específica de P. vivax: 34,8 ± 4,8 minutos (de 30,5 a 46,6 minutos); y
LAMP específica de P. ovale: 36,1 ± 6,8 minutos (de 29,9 a 49,8 minutos).
Estos resultados muestran que la LAMP puede realizar el diagnóstico en un periodo de tiempo que es notablemente más corto que el tiempo de amplificación de PCR anidada.
Ejemplo 2
Los conjuntos de cebadores para detectar el género Plasmodium y las especies de Plasmodium según la presente invención, y el procedimiento para detectar o identificar el género Plasmodium, P. falciparum, P. vivax, P. malariae y
P. ovale por separado o simultáneamente utilizando los conjuntos de cebadores, se sometieron a pruebas comparativas con PCR y microscopía en una clínica de malaria en Mae Sod, noroeste de Tailandia, en la que la malaria es endémica.
También se realizó una comparación entre el procedimiento anterior llevado a cabo utilizando equipo especialmente diseñado para LAMP, y el procedimiento anterior llevado a cabo mediante un procedimiento que puede realizarse rápida y fácilmente en una zona endémica de malaria.
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LAMP, como la prueba utilizando observación visual tras la reacción en un baño de agua a temperatura constante) detectaron P. vivax, pero no P. ovale, lo que indica que el diagnóstico con microscopía era un error.
Es decir, en la prueba comparativa, 17 de los 18 resultados de reacción de LAMP correspondían con los resultados de microscopía (acuerdo del 94%). Esto significa que los resultados de reacción de LAMP concordaban al 100% con los resultados de microscopía, si se excluye el resultado de reacción anteriormente mencionado que no concordaba con el resultado de microscopía. Estos resultados revelan que los conjuntos de cebadores para detectar el género Plasmodium y las especies de Plasmodium según la presente invención, y el procedimiento para detectar o identificar el género Plasmodium, P. falciparum, P. vivax, P. malariae y P. ovale por separado o simultáneamente utilizando estos cebadores, concordaban al 100% con los diagnósticos de microscopía en la detección e identificación de infección por parásitos de Plasmodium; y los resultados de prueba utilizando un amplificador especialmente diseñado para LAMP concordaban al 100% con los resultados de observación visual tras la reacción en el baño de agua a temperatura constante. En los diagnósticos de la especie de malaria, los conjuntos de cebadores y el procedimiento concordaban al 100%, y lograron una sensibilidad equivalente a PCR.
Se demostró que, para los conjuntos de cebadores para detectar el género Plasmodium y las especies de Plasmodium según la presente invención, y el procedimiento para detectar o identificar el género Plasmodium, P. falciparum, P. vivax, P. malariae y P. ovale por separado o simultáneamente utilizando los conjuntos de cebadores, especialmente en una zona endémica de malaria, puede extraerse ADN mediante un procedimiento de ebullición, que es rápido, sencillo y económico, y llevarse a cabo una reacción de amplificación de ADN utilizando un baño de agua a temperatura constante de modo que puede tratarse de manera económica un gran número de muestras.
Los conjuntos de cebadores para detectar el género Plasmodium y las especies de Plasmodium según la presente invención y el procedimiento para detectar o identificar el género Plasmodium, P. falciparum, P. vivax, P. malariae y
P. ovale por separado o simultáneamente utilizando los conjuntos de cebadores, pueden aplicarse de manera más rápida y fácil que la microscopía, y presentan una sensibilidad equivalente a PCR. Por tanto, los conjuntos de cebadores y el procedimiento pueden aplicarse ventajosamente en el sitio, especialmente en una zona endémica de malaria, para el diagnóstico de detección de identificación rápido y sencillo del género y las especies de Plasmodium simultáneamente, en un gran número de muestras.
Ejemplo 3
Según la presente invención, a partir de los resultados de prueba obtenidos en el sitio (en una clínica) en una zona endémica de malaria en un corto periodo de tiempo, pueden recetarse mefloquina y artesunato para su administración a los cinco pacientes diagnosticados y que se identifica que están infectados por P. falciparum en el ejemplo 2, basándose en la información sobre agentes terapéuticos para la malaria y la prioridad de los mismos en la información sobre agentes terapéuticos para la malaria almacenada en la “base de datos de guía de tratamiento”. Igualmente, pueden recetarse cloroquina y primaquina para su administración a los 13 pacientes diagnosticados y que se identifican que están infectados por P. vivax. Por tanto, puede ponerse en funcionamiento un sistema de soporte de medidas contra la malaria que puede, en una zona endémica de malaria, detectar de manera rápida y fiable la presencia o ausencia de infección por parásitos de Plasmodium y proporcionar tratamiento para la malaria.
Ejemplo 4
Tal como se describió anteriormente, una detección sencilla y fácil del género Plasmodium (en particular, la presencia o ausencia de infección mixta) es importante en zonas endémicas de malaria.
Los presentes inventores realizaron una investigación adicional sobre cebadores que pueden detectar especies de Plasmodium.
Como resultado, los inventores hallaron que dos tipos de conjuntos de cebadores (Pv-7 y Pv-9; Pv-7 se representa por las SEC ID nº: 37 a 42 y Pv-9 se representa por las SEC ID nº: 31 a 36) que son útiles para el diagnóstico de P. vivax permiten un diagnóstico más rápido de P. vivax.
Cuando se utilizaron los dos tipos de conjuntos de cebadores, se demostró que estos conjuntos de cebadores no reaccionaban con ninguno de los ADN de P. falciparum, P. malariae y P. ovale.
La utilización de los dos tipos de conjuntos de cebadores (Pv-7 y Pv-9) útiles para el diagnóstico de P. vivax logró un diagnóstico más rápido (Pv-7: 27 minutos; Pv-9: 24 minutos) que el conjunto de cebadores anteriormente hallado para el diagnóstico de P. vivax (31 minutos). En particular, la utilización del conjunto de cebadores Pv-9 logró el diagnóstico más rápido.
La solicitud proporciona además las siguientes formas de realización:
1A. Un conjunto de cebadores para detectar el género Plasmodium, que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contienen secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 1 a 6, pudiendo el conjunto de cebadores
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Plasmodium vivax a partir de la muestra de ADN utilizando un conjunto de cebadores según la reivindicación 2A, y confirmar la presencia o ausencia de un producto amplificado.
14A. Un procedimiento para identificar Plasmodium malariae, que comprende aislar una muestra de ADN a partir de
5 una muestra, realizar amplificación mediante LAMP de una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de P. malariae a partir de la muestra de ADN utilizando un conjunto de cebadores según la reivindicación 3A, y confirmar la presencia o ausencia de un producto amplificado.
15A. Un procedimiento para identificar Plasmodium ovale, que comprende aislar una muestra de ADN a partir de
10 una muestra, realizar amplificación mediante LAMP de una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de P. ovale a partir de la muestra de ADN utilizando un conjunto de cebadores según la reivindicación 4A, y confirmar la presencia o ausencia de un producto amplificado.
16A. Un procedimiento para identificar el género Plasmodium, P. falciparum, P. vivax, P. malariae, o P. ovale, que
15 comprende aislar una muestra de ADN a partir de una muestra, realizar amplificación mediante LAMP de una región particular de secuencias de gen de ARNr 18S del género Plasmodium, una secuencia de gen de ARNr 18S de P. falciparum, una secuencia de gen de ARNr 18S de P. vivax, una secuencia de gen de ARNr 18S de P. malariae o una secuencia de gen de ARNr 18S de P. ovale, a partir de la muestra de ADN utilizando un conjunto de cebadores según la reivindicación 5A; y confirmar la presencia o ausencia de un producto amplificado.
20 17A. Un procedimiento de identificación según la reivindicación 16A, en el que la identificación de cualquiera del género Plasmodium, P. falciparum, P. vivax, P. malariae o P. ovale se realiza simultáneamente o por separado.
18A. Un kit de detección para el género Plasmodium, P. falciparum, P. vivax; P. malariae o P. ovale; que comprende 25 al menos un conjunto de cebadores de cualquiera de la reivindicación 1A a 5A, una ADN polimerasa de desplazamiento de hebra, dNTP y un tampón de reacción.
19A. Un kit de detección según la reivindicación 18A, detectando el kit de detección el género Plasmodium, P. falciparum, P. vivax, P. malariae o P. ovale, simultáneamente o por separado. 30 20A. Un sistema de soporte de medidas contra la malaria que comprende:
unos medios para introducir y almacenar información de pacientes infectados por malaria incluyendo el número de positivos para los parásitos del género Plasmodium que provocan malaria en una zona endémica de malaria, 35 y la tasa de portadores en la zona;
una base de datos de guía de medidas de salud pública de prevención de la infección por malaria que especifica medidas de salud pública para la zona endémica de malaria basándose en la información de pacientes infectados por malaria, base de datos en la que se ha introducido información de selección de medidas de salud
40 pública para una zona infectada por parásitos de la malaria que debe introducirse junto con la prioridad de medida que indica a cuál de las medidas de salud pública se le debe dar prioridad en la selección;
una sección de extracción de medidas de salud pública que extrae medidas de salud pública para la zona endémica infectada por malaria y la prioridad de la misma de la base de datos de guía de medidas de salud 45 pública de prevención de la infección por malaria, según información de pacientes infectados por malaria sobre parásitos de la malaria en un sujeto; y
una sección de visualización de medidas de salud pública que presenta visualmente las medidas de salud pública extraídas en la sección de extracción de medidas de salud pública, junto con la prioridad de las mismas.
50 21A. Un sistema de soporte de medidas contra la malaria según la reivindicación 20A, en el que la información de pacientes infectados por malaria sobre parásitos de la malaria en la zona endémica de malaria se obtiene identificando la presencia o ausencia de infección por el género Plasmodium utilizando un conjunto de cebadores según la reivindicación 1A y/o un procedimiento de detección según la reivindicación 6A, o el kit de detección del
55 género Plasmodium según la reivindicación 19A.
22A. Un sistema de soporte de medidas contra la malaria que comprende:
unos medios para introducir y almacenar información de agentes terapéuticos para la malaria para especificar un 60 agente terapéutico para la malaria que actúa sobre la infección por una o una pluralidad de cuatro especies de parásitos de la malaria;
unos medios de introducción de información de pacientes para introducir y almacenar información de pacientes incluyendo información sobre el patógeno de infección por malaria en un paciente con fiebre en una zona 65 endémica de malaria;
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8323901B2 (en) * 2006-11-30 2012-12-04 Id-Fish Technology, Inc. Nucleic acid probes and methods for detecting plasmodium parasites
WO2010080616A1 (en) * 2008-12-19 2010-07-15 Abbott Laboratories Molecular assay for diagnosis of malaria
KR20110118179A (ko) * 2009-02-24 2011-10-28 빅텍 프라이빗 리미티드 말라리아 검출을 위한 프로브 및 프라이머
WO2012108961A1 (en) * 2011-02-09 2012-08-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Detection of hepatitis b virus in blood using lamp method
WO2015006755A2 (en) * 2013-07-12 2015-01-15 Castellanos Alejandro Recombinase polymerase amplification (rpa) method for leishmania spp. and trypanosoma cruzi
WO2015071759A1 (en) * 2013-11-15 2015-05-21 Institut Pasteur A molecular marker of plasmodium falciparum artemisinin resistance
CN104531840A (zh) * 2014-11-26 2015-04-22 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 一种快速灵敏的恶性疟原虫检测方法
CN104673919A (zh) * 2015-02-27 2015-06-03 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒及其方法
CN106319060B (zh) * 2016-08-31 2019-06-28 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 用于多重pcr检测血液寄生虫的引物组及试剂盒
CN106801097A (zh) * 2017-02-17 2017-06-06 湖北医药学院 基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法
KR101847422B1 (ko) * 2017-02-24 2018-04-11 대한민국 Lamp를 이용한 말라리아 감염 진단용 조성물 및 이의 용도
TW202030333A (zh) * 2018-12-20 2020-08-16 美商簡 探針公司 用於檢測瘧原蟲物種核酸之組成物及方法
CN110331221B (zh) * 2019-08-19 2023-05-02 昆明医科大学 疟原虫基因诊断引物
WO2021146814A1 (en) * 2020-01-24 2021-07-29 Uti Limited Partnership Ultrasensitive loop mediated isothermal amplification (us-lamp) to detect malaria
CN111118190A (zh) * 2020-02-24 2020-05-08 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 一种基于疟原虫18s rRNA基因阳性对照标准品及其制备方法和应用
CN111926096B (zh) * 2020-08-21 2022-01-11 江南大学 一种利用pcr技术检测卵形疟原虫感染的方法
CN112063736A (zh) * 2020-09-01 2020-12-11 武汉市疾病预防控制中心 基于环介导等温扩增技术的疟原虫快速检测试剂盒及检测方法
US20240102110A1 (en) * 2020-12-04 2024-03-28 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detection of malaria
CN113130000B (zh) * 2021-03-22 2022-09-16 同济大学 一种青蒿素抗疟作用靶基因的筛选方法
KR102589646B1 (ko) * 2021-07-16 2023-10-16 대한민국(질병관리청장) 말라리아 5종 검출용 프라이머 세트
CN113755621A (zh) * 2021-09-02 2021-12-07 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 等温扩增检测疟原虫属及能区分四种疟原虫种的试剂、试剂盒及其应用
CN114807404A (zh) * 2022-06-06 2022-07-29 江苏省血液中心(江苏省医学生物制品研究所) 一种快速检测疟原虫的核酸检测试剂盒及其应用
CN117947199B (zh) * 2024-03-26 2024-06-25 江苏硕世生物科技股份有限公司 一种用于区分疟原虫虫种的引物组合及试剂盒

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3200134B2 (ja) 1992-02-24 2001-08-20 湧永製薬株式会社 マラリア原虫の検出
JPH06261758A (ja) 1993-03-12 1994-09-20 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd マラリアの検出
EP1020534B2 (en) 1998-11-09 2011-01-05 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Process for synthesizing nucleic acid
JP4437856B2 (ja) 2000-02-29 2010-03-24 栄研化学株式会社 同一鎖内に相補性領域を有する核酸の検出方法
CN100497655C (zh) 2000-05-01 2009-06-10 荣研化学株式会社 检测核酸合成的反应产物的方法
JP2002272475A (ja) 2001-03-22 2002-09-24 Eiken Chem Co Ltd 蛍光偏光法による核酸増幅産物の検出方法
CN1283807C (zh) 2001-06-18 2006-11-08 荣研化学株式会社 有效检测双链核酸的方法
KR100451398B1 (ko) * 2001-10-09 2004-10-06 (주)바이오니아 열대열말라리아와 삼일열말라리아의 동시 검출방법
JP2003219878A (ja) 2002-01-25 2003-08-05 Eiken Chem Co Ltd レジオネラ属菌検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法
JP3828022B2 (ja) 2002-03-01 2006-09-27 独立行政法人科学技術振興機構 四日熱マラリア原虫とその診断
JP2005245257A (ja) 2004-03-02 2005-09-15 Sapporo Breweries Ltd フザリウム属菌検出用プライマー
EP2351857B1 (en) 2005-02-17 2014-10-29 TrovaGene, Inc. Compositions and methods for detecting pathogen specific nucleic acids in urine
JP2007061061A (ja) 2005-09-02 2007-03-15 Eiken Chem Co Ltd リステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の検出法
JP5227998B2 (ja) 2010-04-22 2013-07-03 株式会社ミズグチ 屋根用落雪防止具

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