ES2543015T3

ES2543015T3 - Estrategia de quimioprevención del cáncer basada en la pérdida de la impronta de IGF2

Info

Publication number: ES2543015T3
Application number: ES07869063.3T
Authority: ES
Inventors: Andrew P. Feinberg; Andre Levchenko; Dan L. Longo; Minoru S.H. Ko
Original assignee: Johns Hopkins University; US Department of Health and Human Services
Current assignee: Johns Hopkins University; US Department of Health and Human Services
Priority date: 2006-12-08
Filing date: 2007-12-07
Publication date: 2015-08-13
Anticipated expiration: 2027-12-07
Also published as: CA2708006A1; WO2008073858A3; US20110014204A1; WO2008073858A9; EP2101747A4; WO2008073858A2; EP2101747A2; EP2101747B1

Abstract

Un método de determinar una estrategia de intervención farmacológica para un individuo, comprendiendo el método determinar un estado de pérdida de impronta (LOI) de factor de crecimiento similar a la insulina tipo 2 (IGF2).a partir de una muestra tomada del individuo; y determinar una estrategia de intervención farmacológica para el individuo basada en el estado de LOI determinado, en el que el individuo tiene una LOI y, por lo tanto, tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer colorrectal, la estrategia de intervención comprende administrar al individuo un inhibidor de la activación de la vía de señales mediante IGF2 y, si el individuo no tiene una LOI, la estrategia de intervención no comprende administrar dicho inhibidor al individuo.

Description

Estrategia de quimioprevención del cáncer basada en la pérdida de la impronta de IGF2

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere generalmente al cáncer y, más específicamente, a métodos de quimioprevención del desarrollo de tumores mediante la inhibición de las vías de señales asociados con la pérdida de la impronta (LOI -Loss Of Imprinting) del gen del factor de crecimiento similar a la insulina tipo 2 (IGF2).

INFORMACIÓN DE ANTECEDENTES

La impronta genómica es una modificación epigenética en el gameto o cigoto que conduce al silenciamiento relativo de un alelo parental específico en las células somáticas de la descendencia. La pérdida de la impronta (LOI) del gen del factor de crecimiento similar a la insulina tipo II (IGF2) se define como la expresión aberrante del alelo heredado de la madre normalmente silencioso, que se ha encontrado que está asociada con un aumento de cinco veces la frecuencia de la neoplasia intestinal en los seres humanos y un aumento de la frecuencia de cinco veces de los familiares de primer grado con cáncer colorrectal (CRC -ColoRectal Cancer), lo que sugiere que la LOI de IGF2 contribuye sustancialmente en la población de riesgo de CRC. Previamente, se desarrolló un modelo de epigenéticagenética combinado de neoplasia intestinal, cruzando ratones hembras con una deleción de la región diferencialmente metilada (DMR -Differentially Methylated Region) de H19 así como H19 propiamente dicho, con ratones machos que albergan una mutación en el gen poliposis adenomatosa coli (Apc -Adenomatous polyposis coli) (ratones Min). La transmisión materna de la deleción DMR conduce a la activación aberrante del alelo materno Igf2 y LOI, a un aumento de la expresión de dos veces de IGF2 en el intestino y a un aumento de 1,8 a 2,5 veces en la frecuencia de adenomas intestinales en heterocigotos dobles Min LOI(+). La LOI conduce a un aumento en el compartimiento de células progenitoras (cripta) y a una tinción incrementada con marcadores de células progenitoras. Sin embargo, el mecanismo de una tumorigénesis incrementada puede implicar una proliferación incrementada, una apoptosis disminuida o un programa de maduración alterada en la cripta, y no se observaron diferencias utilizando la proliferación o inmunotinciones específicas para la apoptosis en ese modelo de ratón que pudieran aclarar el mecanismo. Además, no está claro que el propio IGF2 sea el responsable de la tumorigénesis incrementada, ya que, alternativamente, podría reflejar otra alteración epigenética, ya sea de H19 en el locus, o incluso a través de trans-efectos que se han observado entre la DMR de H19 y loci en otros cromosomas.

IGF2 es un importante factor de crecimiento autocrino y paracrino en el desarrollo y el cáncer, principalmente a través de la señalización del receptor de factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (IGF1R), un receptor tirosina quinasa de transmembrana. La activación de IGF1R conduce a la autofosforilación del receptor y la activación de cascadas de señalización, incluyendo el IRS-1/PI3K/AKT y vías GRB2/Ras/ERK. IGF2 se sobre-expresa en una amplia diversidad de tumores malignos, incluyendo el CRC.

Sin embargo, sigue siendo enigmático cómo la LOI puede conducir a cáncer. Además de la cuestión de la especificidad de la LOI para la cascada de señalización de IGF2 a diferencia de otros efectos epigenéticos cis o trans asociados con la LOI, no está claro cómo una simple duplicación de la dosis de IGF2, especialmente en los relativamente bajos niveles de expresión encontrado en colon normal, podría conducir a un riesgo incrementado de tumores. Al mismo tiempo, si pudiera establecerse un enlace mecánico de este tipo, éste abriría la posibilidad de una quimioprevención similar al uso de estatinas para reducir el riesgo cardiovascular. Esto se debe a un estado epigenético en el tejido normal que aumenta el riesgo de cáncer que, en teoría, podría ser invertido, reduciendo el riesgo de tumores malignos,incluso antes de que surjan neoplasias.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a genes LOI y a sus productos génicos en tejidos pre-malignos, en que se pueden utilizar métodos de inhibición esos productos génicos de LOI para prevenir el desarrollo de tumores en sujetos en riesgo de desarrollar cáncer. La presente invención se refiere también a métodos de identificar un riesgo incrementado en el desarrollo de ciertos tipos de cáncer en un sujeto, incluyendo métodos de evaluar la eficacia de un régimen quimioterapéutico para ese sujeto. Además, la presente invención se refiere a métodos para identificar agentes anti-neoplásicos.

En una realización, se describe un método para prevenir el desarrollo de tumores en un sujeto que incluye la administrar un inhibidor de la activación de la vía de señales por el factor de crecimiento similar a la insulina tipo 2 (IGF2), en el que el sujeto expresa de forma aberrante IGF2 debido a la pérdida de impronta.

En un aspecto, el sujeto está en riesgo de desarrollar cáncer colorrectal (CRC), en comparación con un sujeto que no tiene la LOI en IGF2. En otro aspecto, el inhibidor se selecciona del grupo consistente en una tirfostina, una pirrolo[2,3-d]-pirimidina, un anticuerpo monoclonal, y una combinación de los mismos. En un aspecto relacionado, la pirrolo[2,3-d]-pirimidina es NVP-AEW541.

En otro aspecto, el método para prevenir el desarrollo de tumores incluye, además, la administración de un agente quimioterapéutico, incluyendo, pero no limitado a aclacinomicinas, actinomicinas, adriamicinas, ancitabinas, antramicinas, azacitidinas, azaserinas, 6-azauridinas, bisantrenos, bleomicinas, cactinomicinas, carmofurs, carmustinas, carubicinas, carzinofilinas, cromomicinas, cisplatinos, cladribinas, citarabinas, dactinomicinas, daunorubicinas, denopterinas, 6-diazo-5-oxo-L-norleucinas, doxifluridinas, doxorubicinas, edatrexatos, emitefurs, enocitabinas, fepirubicinas, fludarabinas, fluorouracilos, gemcitabinas, idarubicinas, loxuridinas, menogariles, 6mercaptopurinas, metotrexatos, mitramicinas, mitomicinas, ácidos micofenólicos, nogalamicinas, olivomicinas, peplomicinas, pirarubicinas, piritreximas, plicamicinas, porfiromicinas, pteropterinas, puromicinas, ácidos retinoicos, estreptonigrinas, estreptozocinas, tagafurs, tamoxifenos, tiamiprinas, tioguaninas, triamcinolonas, trimetrexatos, tubercidina, vinblastinas, vincristinas, zinostatinas y zorubicinas.

En un aspecto, el inhibidor previene la formación de focos de criptas aberrantes (ACF -Aberrant Crypt Foci).

En otra realización, se describe un método de identificar un riesgo incrementado de desarrollar cáncer colorrectal en un sujeto, que incluye poner en contacto una célula progenitora en una muestra de un sujeto con el factor de crecimiento similar a la insulina tipo 2 (IGF2) y determinar la sensibilidad de la célula al IGF2 según se determina midiendo un cambio en una vía de señales asociada con la replicación del ADN, el metabolismo del ADN, el ciclo celular, la apoptosis y la proliferación celular, o midiendo un cambio en la expresión génica, los niveles de proteínas, la modificación de proteínas o cinética de la modificación de proteínas, en donde un aumento de la sensibilidad de las células progenitoras a IGF2 se correlaciona con un riesgo incrementado de desarrollar cáncer colorrectal.

En un aspecto, el método incluye determinar los cambios en la expresión génica entre células progenitoras LOI positivas (LOI (+)) y LOI negativas (LOI (-)), en que las células progenitoras están asociados con el cáncer colorrectal, identificar genes que se sobre-expresan en las células progenitoras LOI (+), poner en contacto células LOI (+) y LOI (-) con un agente mutagénico, poner en contacto las células con un ligando que se expresa de forma aberrante debido a la pérdida de impronta (LOI) del gen que codifica el ligando en presencia y ausencia de un agente de ensayo. En otro aspecto, la vía de señales es IRS-1/PI3K/AKT o GRB2/Ras/ERK. En un aspecto relacionado, el método incluye determinar la cinética de modificación de una AKT o ERK. En un aspecto adicional relacionado, la modificación de AKT o ERK es la fosforilación.

En otro aspecto, la medición de los cambios en la expresión génica, los niveles de proteínas, la modificación de proteínas o la cinética de la modificación de proteínas puede llevarse a cabo mediante el control de esos cambios en los genes según se recoge en las Tablas 3 y 5-7. En un aspecto relacionado, los genes tal como se exponen en las Tablas 3 y 5-7 se pueden utilizar como un diagnóstico para determinar el riesgo. En otro aspecto, el método, según se describe, se puede utilizar en unión con métodos para el diagnóstico de cánceres, que incluyen pero no se limitan a la detección de antígenos/marcadores específicos para tumores, biopsia, cistoscopia, rayos X, escaneos por tomografías computarizadas, frotis de PAP, detección proteínas séricas y similares.

En un aspecto relacionado, el método de identificar un riesgo incrementado incluye poner en contacto la célula con IGF2 en presencia de un inhibidor del receptor de IGF1, en que una disminución adicional en la vía de activación de señales en presencia del inhibidor se correlaciona con un riesgo incrementado de desarrollar cáncer colorrectal.

En un aspecto, el inhibidor es NVP-AEW541. En otro aspecto, la vía de señales es IRS-1/PI3K/AKT o GRB2/Ras/ERK. En un aspecto relacionado, la vía de señales se mide a través de la vía de activación de Akt/PKB.

En una realización, se describe un método para identificar un agente anti-neoplásico que incluye determinar cambios en la expresión génica entre células progenitoras LOI positivas (LOI (+)) y LOI negativas (LOI (-)), en que las células progenitoras están asociadas con un trastorno neoplásico, identificar genes que son sobre-expresados en las células progenitoras LOI (+), poner en contacto células LOI + y LOI -con un agente mutagénico, poner en contacto con las células progenitoras LOI (+) con un ligando que es expresado de forma aberrante debido a la pérdida de impronta (LOI) del gen que codifica el ligando en presencia y ausencia de un agente de ensayo; en que el ligando está asociado con el trastorno neoplásico, y determinar la sensibilidad de las células LOI (+) y LOI (-) con el ligando en presencia y ausencia del agente de ensayo, en que la sensibilidad se mide determinando cambios en una vía de señales asociada con la replicación de ADN, el metabolismo de ADN, el ciclo celular, la apoptosis y la proliferación celular, en que una disminución en la sensibilidad de las células LOI (+) para el ligando es inversamente proporcional a la actividad anti-neoplásica del agente.

En un aspecto, el ligando es IGF2. En otro aspecto, el trastorno neoplásico es el cáncer. En un aspecto relacionado, el trastorno neoplásico es cáncer colorrectal (CRC).

En otro aspecto, el agente reduce la sensibilidad de la transducción de señales inducida por el ligando a través de un receptor afín para el ligando. En un aspecto, el agente mutagénico es un agente químico o físico.

En un aspecto, las células están contenidas en un chip de microfluidos. En otro aspecto, las células están contenidas en un animal no humano.

En otra realización, se describe un método para evaluar la eficacia de un régimen quimioterapéutico que incluye periódicamente aislar una célula progenitora en una muestra de un sujeto que recibe un agente quimioterapéutico, poner en contacto la célula progenitora en la muestra con el factor de crecimiento similar a la insulina de tipo 2 (IGF2) y determinar la sensibilidad de la célula progenitora a IGF2, en que la sensibilidad se mide mediante la determinación de cambios en una vía de señales asociada con la replicación del ADN, el metabolismo del ADN, el ciclo celular, la apoptosis y la proliferación celular, en que una reducción de la célula progenitora para formar focos de criptas aberrantes (ACF) se correlaciona con la eficacia del régimen.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es un histograma que ilustra la validación de la expresión alterada de genes identificados por el análisis por microarrays de criptas intestinales de ratones LOI (+) y LOI (-). El análisis fue por PCR cuantitativa en tiempo real de captura por láser de 10.000 criptas microdiseccionadas de 12 ratones LOI (+) y 9 ratones LOI (-). La expresión se normalizó a β-actina, y se muestra el nivel de expresión en muestras LOI (+) (caja gris) con relación a muestras LOI (-) (cuadro negro). Las barras indican el error típico. Rpa2, 1,38 veces (P = 0,03); Card11, 1,44 veces (P = 0,04); Ccdc5, 1,39 veces (P = 0,03); Cdc6, 1,55 veces (P = 0,003); Mcm5, 1,47 veces (P = 0,007); Mcm3, 1,49 veces (P = 0,002); Skp2, 1,37 veces (P = 0,02); Chaf1a, 1,61 veces (P = 0,009); Lig1, 1,54 veces (P = 0,008) Gmnn, 1,33 veces (P = 0,1); Rfc3, 1,31 veces (P = 0,04); Ccne1, 1,38 veces (P = 0,04). También se examinó la expresión de Msi1 y p21/Cdkn1a.

La Figura 2 es un histograma que muestra los niveles de expresión génica en las criptas intestinales microdiseccionadas. La PCR en tiempo real cuantitativa se realizó en criptas intestinales microdiseccionadas de captura por láser de 12 ratones LOI (+) y 9 ratones LOI (-). La expresión se normalizó a β-actina, y se muestra el nivel de expresión en muestras LOI (+) (en gris) con relación a muestras LOI (-) (en negro). Las barras indican el error típico. (A) Los genes supra-regulados en las categorías de anotación GO del ranking superior (replicación del ADN por genes del ciclo celular que figuran en la Tabla S 1 3). (B) La inhibición del receptor por NVP-AEW541 tenía un efecto diferencial sobre la expresión de genes relacionada con la proliferación en criptas LOI (+). El análisis fue mediante PCR en tiempo real cuantitativa de criptas microdiseccionadas de captura por láser de cuatro ratones LOI (+) y cuatro ratones LOI (-) tratados con NVP-AEW541 durante 3 semanas. Ratones LOI (+) (barras grises) y LOI (-) (barras negras normalizadas a 1,0).

La Figura 3 muestra datos del histograma que demuestra la inducción de la expresión de genes Cdc6 y Mcm5 por parte de la proteína IGF2 exógena, y la inhibición por parte de NVP-AEW541. Células ES de ratón se cultivaron en medio definido y se trataron con 800 ng/ml de proteína lgf2 de ratón. La expresión de genes se analizó mediante RT-PCR en tiempo real y se normalizó a β-actina. Se muestra el nivel de expresión sin (cajas negras) y con (cajas grises) el inhibidor de IGF1R NVP-AEW541 3 µM (una pirrolo-2,3d-pirimidina), normalizada a tiempo 0. Las barras indican el error típico.

La Figura 4 es una fotomicrografía que muestra el tamaño de las colonias de células ES LOI (-) y LOI (+) cultivadas en células de capa de alimentación. En cada caso 1000 células ES se sembraron en placas de 3,5 cm, y el tamaño de 15-30 colonias se midió por fotomicroscopía los días 1 a 6. Se muestran colonias representativas el día 6. La barra representa 100 µm.

La Figura 5 es un gráfico que muestra la tasa de crecimiento de colonias de células ES de LOI (-) y LOI (+) cultivadas en células de capa de alimentación. Para cada uno de los tipos de células se realizaron cuatro experimentos utilizando 4 líneas de células ES LOI (-) y LOI (+) independientes [cajas negras, LOI (-); cajas grises, LOI (+)]. Los tamaños de 15-30 colonias de células ES se midieron en cada caso los días 1 a 6. Las barras indican el error típico.

La Figura 6 es un gráfico que muestra la tasa de crecimiento de células ES LOI (-) y LOI (+). En cada uno de los tipos de célula se realizaron cuatro experimentos, cultivando células ES no diferenciadas sobre placas revestidas de gelatina sin células de la capa de alimentación, utilizando medio definido de Complete Clonal Grade (calidad clonal completa) (Chemicon) sin suero o IGF2. El crecimiento celular se determinó contando las células de 3 pocillos cada uno los días 1 a 6, para cuatro líneas celulares ES LOI (-) y LOI (+) independientes. El tiempo de duplicación de

células ES LOI (+) fue 9,6 ± 0,1 horas (media ± error típico), un 26% más rápido que la células ES LOI (-) (12,1 ± 0,5 horas, P = 0,01). Las barras indican el error típico.

La Figura 7 es una gráfica que demuestra la inhibición de focos de criptas aberrantes (ACF) inducida por azoximetano (AOM) por parte de NVP-AEW541. La formación de ACF en el colon se indujo por inyección intraperitoneal AOM, y el tratamiento con NVP-AEW541 fue por sonda gástrica. Cada uno de los ACF se formó de 14 criptas aberrantes, y se midieron el número de ACF (nº de ACF), el número total de criptas aberrantes (nº de AC) y el número medio de criptas aberrantes por ACF.

La figura 8 muestra una análisis de una sola célula de activación de Akt por parte de IGF2 en fibroblastos embrionarios de ratón LOI (+) y LOI (-). (A) La activación de Akt/PKB fue sometida a ensayo por inmunocitoquímica de células individuales con un anticuerpo contra Akt fosforilada (Ser 473), en un chip de PDMS de 2 capas monolítico sellado con un cubreobjetos de vidrio, con suministro de medios definido controlado por un sistema multiplexado de válvulas. Células MEF LOI (+) y LOI (-) vivas fueron estimuladas dentro de los chips de microfluídicos con dosis variables de IGF2, con mediciones en múltiples instantes a cada una de las concentraciones de IGF2. El eje Y muestra la relación de fluorescencia nuclear a de fondo. Para cada uno de los tipos de células, la concentración de IGF2 y el instante se obtuvieron al menos 200 mediciones celulares individuales mediante imagen digital y análisis. (B) Inhibición de la activación de Akt por parte de NVP-AEW541. Las células se sometieron a ensayo como en (A) a los 60 min después de la co-incubación con 400 ng/ml de IGF2 y NVP-AEW541 3 µM y se compararon con el control no estimulado. Cada una de las barras se basa en mediciones de > 400 células. El asterisco indica una diferencia estadística frente al control LOI (+) (test t, p <0,001) (C) Análisis de células individuales de la activación de ERK por IGF2 en células MEF LOI (+) y LOI (-). La activación de ERK se sometió a ensayo por inmunocitoquímica individual dentro de chips microfluídicos utilizando un anticuerpo contra Erk2 fosforilado de Upstate (Charlottesville, VA). Células LOI (+) (en gris) y células LOI (-) (en negro) fueron expuestas a 400 ng/ml de IGF2 durante los tiempos indicados. El eje y muestra la relación de fluorescencia nuclear a de fondo normalizada para el nivel máximo alcanzado en las células LOI (+). Las barras de error representan SD. Barras de error estándar están completamente subsumidas por los símbolos en esta escala. (D) Niveles de expresión de genes en fibroblastos embrionarios de ratón. La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó en células MEF LOI (+) y LOI (-), con la expresión normalizada para la transferencia de la expresión del receptor. Se muestra el nivel de expresión en muestras LOI (+) (en negro) en relación con muestras LOI (-) (en gris). Las barras indican el error típico.

La Figura 9 es una transferencia Western que muestra el efecto de NVP-AEW541 en la señalización de IGF2. La confirmación de que NVP-AEW541 inhibe la señalización de IGF-2 en el receptor de IGF1 se hizo de forma idéntica a la realizada para IGF131. Células NIH 3T3 se hicieron pasar cada 3 días y se mantuvieron con DMEM con bajo contenido en glucosa más CBS al 10% en 5% de CO2. El día antes de la transfección, las células se tripsinizaron y se sembraron en platos Mattek con la parte inferior de vidrio recubierta con PLL. Las células típicamente alcanzaron aproximadamente el 70% de confluencia el día siguiente, cuando fueron transfectadas con el plásmido eGFP-Akt-PH con lípidos Fugene siguiendo las instrucciones del fabricante. 8 horas después de la transfección, las células se privaron de comida en CBS al 0,2% en DMEM con bajo contenido en glucosa (sin antibióticos) durante al menos 12 horas. Se realizaron transferencias Western con los anticuerpos mostrados, y concentraciones variables de NVP-AEW541, con o sin IGF2.

La Figura 10 es un histograma que muestra la inducción de la expresión del gen Msi1 por parte de la proteína IGF2 exógena, y la inhibición por parte de NVP-AEW541. Células ES de ratón se cultivaron en medio definido y se trataron con 800 ng/ml de proteína 1gf2 de ratón. La expresión de genes se analizó mediante RT-PCR en tiempo real y se normalizó a β-actina. Se muestra el nivel de expresión sin (cajas negras) y con (cajas rosas) del inhibidor R de IGF1R NVP-AEW541 3 µM, normalizada a tiempo 0. Las barras indican el error típico.

La Figura 11 muestra histogramas para los niveles de expresión de genes en criptas intestinales microdiseccionadas. La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó en criptas microdiseccionadas de captura por láser de 12 ratones LOI (+) y 9 ratones LOI (-). La expresión se normalizó a β-actina y se muestra el nivel de expresión en muestras LOI (+) (en gris) en relación con muestras LOI (-) (en negro). Las barras indican el error típico.

La Figura 12 es una fotografía que muestra la histología del colon en ratones LOI (+) tratados con AOM. A la izquierda, un foco representativo de criptas aberrantes muestra características hiperproliferativas que incluyen una multiplicidad de criptas, una ampliación y una elevación sobre mucosa circundante. A la derecha hay una cripta císticamente dilatada revestida por células alargadas con núcleos atípicos y que contienen restos necróticos, que recuerda a los adenomas sésiles aserrados que se encuentran en el colon humano.

La Figura 13 es una fotografía que muestra la histología del colon en ratones LOI (+) tratados con AOM. En comparación con la mucosa normal del colon mostrado en el panel A que contiene criptas de tamaño y orientación uniformes, el foco representativo de criptas aberrantes mostrado en el panel B demuestra características hiperproliferativas que incluyen una multiplicidad de criptas, una ampliación y una elevación sobre mucosa

circundante. En los paneles C y D se muestran dos ejemplos diferentes de criptas císticamente dilatadas revestidas por células alargadas con núcleos atípicos y que contiene restos necróticos (indicado por asteriscos).

La Figura 14 son histogramas que demuestran la inhibición de focos de criptas aberrantes (ACF) inducida por azoximetano (AOM) por parte de NVP-AEW541. (A) La formación de ACF en el colon fue inducida por inyección i. p. de AOM, y el tratamiento con NVP-AEW541 fue por lavado gástrico. Cada uno de los ACF se formó de una de cuatro criptas aberrantes, y se midieron el número de ACF (# de ACF), el número total de criptas aberrantes (# de AC) y el número medio de criptas aberrantes por ACF. Ratones LOI (+) AOM (barras gris oscuro), ratones LOI (-) OMA (barras negras), ratones NVP LOI (+) AOM (barras gris claro), ratones NVP LOI (-) OMA (barras grises). (B) El número de ACF y el número total de criptas aberrantes (AC) fueron corregidos por superficie específica de colon (cm2).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Antes de describir las presentes composiciones y métodos, se debe entender que la invención no está limitada a las metodologías, protocolos, líneas celulares, ensayos y reactivos particulares descritos, ya que éstos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en esta memoria pretende describir realizaciones particulares de la presente invención, y de ningún modo pretenden limitar el alcance de la presente invención tal como se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Cabe señalar que, tal como se utiliza en esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y “la” incluyen referencias plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, una referencia a "un ligando" incluye una pluralidad de tales ligandos, una referencia a una "célula" es una referencia a una o más células y equivalentes de las mismos conocidas por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos y expresiones técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen los mismos significados que se entiende comúnmente por un experto ordinario en la técnica a la que esta invención pertenece. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria se pueden utilizar en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen ahora los métodos, dispositivos y materiales preferidos.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, biología celular, genética, inmunología y farmacología, dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, p. ej., Gennaro, A.R., comp. (1990) Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing Co ; Colowick, S. et al., comps., Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, comps., 1986, Blackwell Scientific Publications); Maniatis, T. et al., comps. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al., comps. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4ª edición, John Wiley & Sons; Ream et al., comps.

(1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2ª ed. (Newton y Graham comps., 1997, editorial Springer).

La impronta genómica es un parental de silenciamiento génico específico para el origen que es de origen epigenético, es decir, no implica la secuencia de ADN en sí, sino la metilación y probablemente otras modificaciones hereditarias durante la división celular (Feinberg, A.P., en The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,

C.R. Scriver, et al., comps. (McGraw-Hill, Nueva York, 2002)). La pérdida de impronta (LOI) de IGF2 se descubrió por primera vez en tumores embrionarios de la infancia tales como el tumor de Wilms (WT), pero es una de las alteraciones más comunes en cáncer, incluyendo el de ovario, pulmón, hígado y colon (Feinberg, A.P., en The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver, et al., comps. (McGraw-Hill, Nueva York, 2002)). La consecuencia de la LOI se entiende mejor en el WT. Aquí sirve como un portero en aproximadamente la mitad de los tumores, especialmente los que se producen con un brote relativamente tardío, y conduce a una expresión incrementada de IGF2 (Ravenel, J.D., et al., J Natl. Cancer Inst. 93, 1698-1703 (2001)), un importante factor de crecimiento autocrino en una amplia diversidad de cánceres, incluido el CRC (Lahm, H., et al, Br J. Cancer 65, 341346 (1992); M.C. Gelato y J. Vassalotti, J. Clin. Endocrinol. Metab. 71, 1168-1174 (1990); El-Badry, O.M., et al., Cell Growth Diff. 1, 325-331 (1990); Yee, D., et al., Cancer Res. 48, 6691-6696 (1988); Lamonerie, T., et al., Int. J. Cancer 61, 587-592 (1995); y Pommier, G. J., et al., Cancer Res. 52, 3182-3188 (1992)).

Alteraciones epigenéticas en los cánceres humanos incluyen hipometilación del ADN global, hipometilación génica e hipermetilación del promotor, y pérdida de impronta (LOI) del gen del factor de crecimiento similar a la insulina de tipo II (IGF-2).

La presente invención describe que la LOI aumenta la expresión de genes específicos para la proliferación en tejidos específicos, que incluyen, pero no se limitan a criptas intestinales. Por ejemplo, esto se puede demostrar mediante la microarray de LCM y PCR cuantitativa en tiempo real, y por la estimulación in vitro con IGF2 y su inhibición por bloqueo de IGF1R. Además, la presente invención demuestra que células LOI (+) progenitoras proliferan más rápidamente in vitro, según se mide por el tamaño de las colonias y por el crecimiento en medios definidos. Además de ello, Por otra parte, el bloqueo de IGF1R también reduce los números de focos de criptas aberrantes en sujetos LOI (+) expuestos a AOM por debajo del de los sujetos LOI (-) tratados con AOM, lo que sugiere que las células LOI (+) son inherentemente más sensibles a la señalización de IGF2, lo cual puede ser confirmado in vitro utilizando un chip microfluídico (véanse los Ejemplos).

Aunque no se está ligado por la teoría, se ha explotado la abolición de focos de criptas aberrantes inducidos por AOM por un inhibidor del receptor de señales de IGF2 para desarrollar una estrategia quimiopreventiva para sujetos que tienen trastornos neoplásicos, incluyendo, pero no limitado a, cáncer colorrectal (CRC) en sujetos con LOI. Este enfoque puede tener un impacto significativo para la salud pública, ya que el 5-10% de la población muestra esta alteración epigenética (Cui et al, (2003) Science 299:1752-1755; Woodson et al., J Natl Cancer Inst (2004) 96:407410), y puede incluir el uso de otros compuestos tal como se describe más adelante.

La presente invención representa un enfoque fundamentalmente diferente para la reducción de la mortalidad por cáncer, en comparación con el rastreo en cuanto a la presencia de tumores tempranos. Por ejemplo, en la prevención de enfermedades cardiovasculares, se ha producido un desplazamiento en el énfasis hacia una reducción del riesgo mediado farmacológicamente, incluso (y preferiblemente) en los sujetos sin enfermedad órgano terminal aparente en absoluto (Cannon et al., N Engl J Med (2004) 350: 1495-1504). En una realización, se describe un método para prevenir el desarrollo de tumores en un sujeto, que incluye la administración de un inhibidor de la activación de la vía de señales por el factor de crecimiento similar a la insulina tipo 2 (IGF2), en el que el sujeto expresa de forma aberrante IGF2 debido a la pérdida de impronta. En un aspecto, el inhibidor incluye, pero no se limita a una tirfostina, una pirrolo[2,3-d]-pirimidina, un anticuerpo monoclonal y una combinación de los mismos. En un aspecto relacionado, la pirrolo[2,3-d]-pirimidina es NVP-AEW541.

En un aspecto, el inhibidor puede ser combinado con agentes quimioterapéuticos conocidos, que incluyen, pero no se limitan a aclacinomicinas, actinomicinas, adriamicinas, ancitabinas, antramicinas, azacitidinas, azaserinas, 6azauridinas, bisantrenos, bleomicinas, cactinomicinas, carmofurs, carmustinas, carubicinas, carzinofilinas, cromomicinas, cisplatinos, cladribinas, citarabinas, dactinomicinas, daunorubicinas, denopterinas, 6-diazo-5-oxo-Lnorleucinas, doxifluridinas, doxorubicinas, edatrexatos, emitefurs, enocitabinas, fepirubicinas, fludarabinas, fluorouracilos, gemcitabinas, idarubicinas, loxuridinas, menogariles, 6-mercaptopurinas, metotrexatos, mitramicinas, mitomicinas, ácidos micofenólicos, nogalamicinas, olivomicinas, peplomicinas, pirarubicinas, piritreximas, plicamicinas, porfiromicinas, pteropterinas, puromicinas, ácidos retinoicos, estreptonigrinas, estreptozocinas, tagafurs, tamoxifenos, tiamiprinas, tioguaninas, triamcinolonas, trimetrexatos, tubercidina, vinblastinas, vincristinas, zinostatinas y zorubicinas.

En un aspecto, el sujeto está en riesgo de desarrollar cáncer colorrectal (CCR), en comparación con un sujeto que no tiene una LOI en IGF2. Así, la presente invención proporciona un método de rastrear la población en general en cuanto a una LOI, y proporcionar la intervención farmacológica que puede reducir los de alto riesgo a la media o incluso un menor riesgo de cáncer de colon.

En otra realización, se describe un método de identificar un riesgo incrementado de desarrollar cáncer colorrectal en un sujeto, que incluye poner en contacto una célula progenitora en una muestra de un sujeto con factor de crecimiento similar a la insulina tipo 2 (IGF2) y determinar la sensibilidad de la célula a IGF2 tal como se determina mediante la medición de un cambio en una vía de señales asociada con la replicación del ADN, el metabolismo del ADN, el ciclo celular, la apoptosis y la proliferación celular o midiendo los cambios en la expresión génica, los niveles de proteína, la modificación de proteínas o la cinética de la modificación de proteínas, en que un incremento en la sensibilidad de las células progenitoras a IGF2 se correlaciona con un riesgo incrementado de desarrollar cáncer colorrectal. En un aspecto, el método incluye determinar los cambios de expresión génica entre células progenitoras LOI positivas (LOI (+)) y LOI negativas (LOI (-)), en que las células progenitoras están asociadas con el cáncer colorrectal, identificar genes que se sobre-expresan en el las células progenitoras LOI (+), poner en contacto células LOI (+) y LOI (-) con un agente mutagénico, poner en contacto las células con un ligando que se expresa de forma aberrante debido a la pérdida de impronta (LOI) del gen que codifica el ligando en presencia y ausencia de un agente de ensayo; en donde el ligando está asociado con el cáncer colorrectal, y determinar la sensibilidad de las células LOI (+) y LOI (-) con el ligando en presencia y ausencia del agente de ensayo. En otro aspecto, la vía de señales es IRS-1/PI3K/AKT o GRB2/Ras/ERK. En un aspecto relacionado, el método incluye determinar la cinética de modificación de una AKT o ERK. En un aspecto adicional relacionado, la modificación de AKT o ERK es la fosforilación.

En otro aspecto, medir cambios en la expresión génica, niveles de proteína, la modificación de proteínas o la cinética de la modificación de proteínas puede llevarse a cabo vigilando este tipo de cambios en los genes según se recogen

en las Tablas 3 y 5-7. En un aspecto relacionado, los genes, según se enumeran en las Tablas 3 y 5-7 se pueden utilizar como un diagnóstico para determinar el riesgo en unión con métodos tal como se describen para los cánceres que incluyen, pero no se limitan a cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer cervical, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de ovario, cáncer de piel, incluidos métodos como se describen, pero no se limitan a las patentes de EE.UU. 7.264.928; 7.063.944; 6.890.514; 6.696.262; 6.720.189; 6.645.770; 6.410.335; 6.383.817; 6.282.305; 5.773.215. Por ejemplo, estos métodos pueden incluir, pero no se limitan a la detección de antígenos/marcadores específicos para tumores, biopsia, cistoscopia, rayos X, CTs, frotis de PAP, detección de proteínas del suero, y similares.

En otra realización, se describe un método para evaluar la eficacia de un régimen quimioterapéutico que incluye el aislamiento periódico de una célula progenitora en una muestra de un sujeto que recibe un agente quimioterapéutico, la puesta contacto de la célula progenitora en la muestra con el factor de crecimiento similar a la insulina tipo 2 (IGF2) y la determinación de la sensibilidad de la célula progenitora a IGF2, en donde la sensibilidad se mide determinando cambios en una vía de señales asociada con la replicación del ADN, el metabolismo del ADN, el ciclo celular, la apoptosis y la proliferación celular, en el que una reducción de la célula progenitora para formar focos de criptas aberrantes (ACF) se correlaciona con la eficacia del régimen.

La presente invención también proporciona datos para un "modelo progenitor epigenético", lo que demuestra que existe un cambio policlonal en los números y los estados de células progenitoras que surge antes de la mutación genética, y aumenta el riesgo de cáncer cuando se produce una mutación estocásticamente (Feinberg et al, Nat Rev Genet (2006) 7: 21-33). Por lo tanto, la LOI y el riesgo de cáncer se ha confirmado en un segundo modelo animal, y aunque no pretender estar ligado por teoría alguna, se ha ofrecido un mecanismo plausible para esta expansión de células progenitoras, a saber, una sensibilidad incrementada a IGF2 en células LOI (+), lo que conduce a una proliferación incrementada de células progenitoras. La presente invención demuestra que la LOI es un paradigma para otros cambios epigenéticos en células aparentemente normales de sujetos en riesgo de cáncer, e incluye otros genes expresados de forma aberrante debido a la LOI, la metilación del ADN o las diferencias de la cromatina que distinguen a las células no tumorales de pacientes con cáncer o sujetos en situación de riesgo de cáncer, de sus cohortes no cancerosas.

La presente invención también demuestra la ausencia de cualquier reducción de ACF por parte del inhibidor de IGF2 en ratones LOI (-), y la presencia de una reducción por el inhibidor de los números de ACF en ratones LOI (+) por debajo de la observada en ratones LOI (-). Aunque no se está ligado por la teoría, este resultado sugiere que células con LOI tienen una sensibilidad mejorada a dosis bajas de IGF2, que se confirma mediante el estudio de la señalización de Akt/PKB aguas abajo en un nuevo sistema de chip microfluídico (véanse los Ejemplos). Este análisis in vitro mostró una marcada potenciación de la señalización de IGF2 aguas abajo en células con LOI.

Una vez más, no estando ligado por la teoría, la sensibilidad incrementada a IGF2 a baja dosis podría ayudar a explicar la relación entre la señalización mediada por el receptor y el crecimiento celular. Basándose en los resultados descritos en esta memoria, las células proliferantes pueden ser más sensibles a un ligando a baja densidad, con un IGF2 acumulado relativamente bajo. A medida que aumenta la densidad celular, la estimulación autocrina y paracrina aumenta progresivamente la concentración intersticial local de IGF2, provocando un efecto disminuido sobre la proliferación celular, similar al observado en los experimentos in vitro (véanse los Ejemplos), y proporcionando una comprobación importante en el control del crecimiento a medida que el tejido alcanza una tamaño crítico. En una realización, la diferencia en la sensibilidad de células LOI (+) se utiliza para favorecer una relación terapéutica incrementada de inhibidores de IGF2 para la quimioprevención, ya que los sujetos (o células) con una impronta normal serían relativamente refractarios al fármaco. En un aspecto relacionado, para el control del riesgo de cáncer, los sujetos con mayor riesgo podrían reducirse a una categoría de riesgo aún más baja que la línea de base a través de la intervención específica, tal como se describe en esta memoria.

Tal como se utiliza en esta memoria, cuando se mide la hipometilación, "el grado de LOI" significa el porcentaje de metilación en comparación con una DMR totalmente metilada. Tal como se utiliza en esta memoria, cuando se compara la expresión de diferentes polimorfismos, "el grado de LOI" significa la expresión total (tal como se mide por la expresión o transcripción real) atribuible al alelo que normalmente se impronta. El grado de LOI se puede calcular por la relación de alelo, es decir, el alelo más abundante dividido por el alelo menos abundante. El grado de LOI se puede determinar por cualquier método que permita la determinación de las expresiones relativas de los dos alelos. Por ejemplo, un grado de LOI de 100% refleja una LOI completa (expresión igual de ambos alelos), mientras que un grado de LOI de 0% refleja ninguna LOI (expresión de sólo un alelo). Cualquier método de medir la expresión relativa de los dos alelos se considera incluido en la presente invención.

Métodos para detectar la pérdida de impronta son métodos típicamente cuantitativos para analizar el estado de la impronta. La presencia o ausencia de una LOI puede ser detectada mediante el examen de cualquier condición, estado o fenómeno que provoque la LOI o es el resultado de la LOI. Tales condiciones, estados y fenómenos incluyen, pero no se limitan a:

1. Causas de LOI, tales como el estado o condición de la maquinaria celular para la metilación del ADN, el estado de la región de control de la impronta en el cromosoma 11, la presencia de modificadores de transactuación de la impronta, el grado o la presencia de la desacetilación de histonas;

2. Estado del ADN genómico asociado a los genes o gen para el que se está evaluando la LOI tal como el 5 grado de metilación del ADN;

3. Efectos de la LOI, tales como:

a. Transcripción relativa de los dos alelos de los genes o gen para el que se está evaluando la LOI;

b. Efectos post-transcripcionales asociados con la expresión diferencial de los dos alelos de los 10 genes o gen para el que se está evaluando la LOI;

c.: Traslación relativa de los dos alelos de los genes o gen para el que se está evaluando la LOI;

d.: Efectos post-traducción asociadas con la expresión diferencial de los dos alelos de los genes o gen para el que se está evaluando la LOI;

e.: Otros efectos aguas abajo de la LOI tales como la expresión de genes alterada medida al nivel

15 de ARN, al nivel de corte y empalme o al nivel de proteína o al nivel de la post-traducción (es decir, medir una o más de estas propiedades de una manifestación impronta de un gen en diversas macromoléculas ); cambios en la función que podrían implicar, por ejemplo, el ciclo celular, la transducción de señales, los canales de iones, el potencial de membrana, la división celular, u otros (es decir, miden las consecuencias biológicas de un gen improntado específico que

20 está normalmente o no normalmente improntado (por ejemplo, intervalo QT del corazón). Otro grupo de cambios macromoleculares incluyen procesos asociados con la LOI tales como la acetilación de histonas, la desacetilación de histonas o el corte y empalme de ARN.

El grado de LOI se puede medir para el gen IGF2 cuando se rastrea la presencia de cáncer colorrectal, u otros tipos de cáncer, p. ej., el grado de LOI se mide para el gen IGF2 cuando se rastrea la presencia de cáncer de estómago,

25 cáncer de esófago o leucemia.

Puede emplearse una plataforma de detección lineal para cuantificar la LOI. Una plataforma de detección lineal es una plataforma de detección que permite la cuantificación, ya que la cantidad de diana presente y la señal detectada están linealmente relacionadas. En este sentido, se puede utilizar un PhosphorImager (modelo 4458I, fabricado por Molecular Dynamics), que detecta las emisiones radiactivas directamente de un gel. Otros sistemas de detección

30 lineales incluyen autorradiografía cuidadosamente valorada seguido por análisis de imagen, análisis de detección de emisión beta (Betascan). Otra plataforma de detección lineal es un secuenciador de ADN automatizado tal como el analizador ABI 377. Otra plataforma de detección lineal es un sistema basado en matriz con el software apropiado. Otro es SNuPE.

Además de medir el grado de impronta cuando está presente un polimorfismo improntado en un gen, es posible

35 evaluar el grado de LOI en un gen particular, incluso cuando un polimorfismo improntado no está presente en ese gen. Por ejemplo, la impronta puede ser evaluada por el grado de metilación de islas CpG en o cerca de un gen improntado (p. ej., Barletta, Cancer Research, op. cit). Además, la impronta puede ser evaluada por los cambios en la asincronía de temporización de replicación del ADN, por ejemplo, White L.M., Rogan P.K., Nicholls R.D., Wu B.L., Korf B. Knoll J H, Allele-specific replication of 15q-11q 13 loci: a diagnostic test for detection of uniparental disomy.

40 American Journal of Human Genetics. 59:423-30, 1996.

Por otra parte, determinadas técnicas se utilizan más convenientemente cuando existe un polimorfismo en los dos alelos del gen o genes para los que se está midiendo la presencia o ausencia de la LOI. Por ejemplo, RT-PCR, seguida por electroforesis en gel para distinguir polimorfismos de longitud, o RT-PCR seguida por digestión con enzimas de restricción, o por secuenciación de ADN automatizada, o por análisis de polimorfismo conformacional de

45 cadena sencilla (SSCP), o electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante, etc.; o, métodos basados completamente en ADN que explotan, por ejemplo, la metilación del ADN, que no requieren la etapa RT, para convertir el ARN en ADNc antes de la PCR.

Una vez que se ha medido el grado de LOI tal como el nivel de hipometilación para el gen o genes en cuestión, el riesgo de tener cáncer se evalúa a continuación, comparando el grado de LOI para ese gen o genes a una relación 50 conocida entre el grado de LOI y la probabilidad de la presencia del tipo particular de cáncer u otra enfermedad. La relación entre el grado de la LOI y la probabilidad de la presencia de un tipo particular de cáncer se puede

determinar para cualquier combinación de un gen o genes normalmente improntados y un tipo particular de cáncer mediante determinación.

Cuando se mide el grado de LOI tal como el grado de hipometilación de IGF2, el grado medido de la LOI se compara con una relación conocida entre el grado de LOI y la probabilidad de contraer el tipo particular de cáncer. La relación entre el grado de LOI y la probabilidad de contraer un tipo particular de cáncer puede ser determinada por un experto ordinario en la técnica para cualquier combinación de un gen o genes normalmente impresa y un tipo particular de cáncer mediante la determinación del grado de LOI en un número estadísticamente significativo de muestras de tejido obtenidas de pacientes con cáncer, y determinar el grado de LOI en un número estadísticamente significativo de muestras de tejido obtenidas de pacientes sin cáncer, y luego calcular un odds ratio como una función del grado de LOI.

También debe entenderse que la medición del grado de LOI puede llevarse a cabo comparando el grado de LOI contra uno o más valores de umbral predeterminados, de tal manera que, si el grado de LOI está por debajo de un valor umbral dado, que se puede manifestar en un patrón de metilación regular, entonces el sujetos es asignado a una población de bajo riesgo de tener cáncer, contraer cáncer y/o tener defectos de reparación de un error de replicación. Alternativamente, la técnica analítica puede no estar diseñada para producir un valor numérico explícito para el grado de LOI, sino, en su lugar, para producir sólo un primer tipo de señal cuando el grado de LOI está por debajo de un valor umbral y/o un segundo tipo de señal cuando el grado de LOI está por debajo de un valor umbral. También es posible llevar a cabo los presentes métodos por medio de un ensayo en el que el grado de LOI se señaliza por medio de un espectro no numérico tal como una gama de colores encontrados con papel de tornasol.

Aunque se han observado muchas mutaciones genéticas convencionales en el cáncer humano, la mayoría no se producen a alta frecuencia en la población general. Determinadas realizaciones de la presente invención se basan en el hallazgo de una asociación entre la pérdida de impronta (LOI) del gen IGF2 y el historial familiar de cáncer colorrectal (CRC) y entre la LOI del gen IGF2 y el historial personal presente o pasado de neoplasia colorrectal. Por consiguiente, los métodos de la presente invención analizan los marcadores moleculares comunes de riesgo de cáncer para identificar un riesgo incrementado de desarrollar cáncer en un sujeto.

Determinadas realizaciones de la presente invención se basan en el hallazgo de que la pérdida de impronta del gen IGF2 se asocia con cánceres tales como cáncer colorrectal, y que la pérdida de impronta del gen IGF2 se correlaciona con la hipometilación tanto del gen IGF2 como del gen H 19.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se refiere a un método para identificar un riesgo incrementado de desarrollar cáncer en un sujeto.

Un método de la presente invención también puede utilizarse para inferir un riesgo de cáncer de un sujeto.

Tal como se ilustra en la sección de Ejemplos, la presente invención proporciona, en determinadas realizaciones, un método de identificación un riesgo incrementado de desarrollar cáncer colorrectal en un sujeto, que incluye poner en contacto una célula progenitora LOI (+) en una muestra de un sujeto con un factor de crecimiento similar a la insulina tipo 2 (IGF2) y determinar la sensibilidad de la célula a IGF2 según se determina mediante la medición de un cambio en una vía de señales asociada con la replicación del ADN, el metabolismo del ADN, el ciclo celular, la apoptosis y la proliferación celular, en el que un aumento en la sensibilidad de la célula progenitora LOI (+) a IGF2 se correlaciona con un riesgo incrementado de desarrollar cáncer colorrectal.

La pérdida de impronta, una alteración epigenética que afecta al gen del factor de crecimiento similar a la insulina tipo II (IGF2), se encuentra en la mucosa del colon normal de aproximadamente 30% de pacientes de cáncer colorrectal (CRC), en comparación con 10% de aquellos sin neoplasia colorrectal (Cui, H., et al., Nat. Med. 4, 12761280 (1998)). Por lo tanto, la LOI se produce a una tasa relativamente alta en pacientes con CRC y en pacientes sin neoplasia colorrectal.

En el estudio proporcionado en el Ejemplo 1, 11 de 123 (9,0%) de los pacientes sin historial familiar de CRC mostraron una LOI en linfocitos, en comparación con 13 de 49 (27%) con un historial familiar positivo (relación de probabilidades ajustada 4,41, 95% CI 1,62-12,0, p = 0,004). De manera similar, 7 de 106 (6.6%) pacientes sin neoplasia de colon pasada o presente mostraron una LOI, en comparación con 12 de 56 (21%) pacientes con adenomas, y 5 de 9 (56%) de pacientes con CRC (relación de probabilidades ajustada 4,10 [95% CI 1,30-12,8, p = 0,016] y 34,4 [95% CI 6,10-194, p <0,001], respectivamente). Estos datos apoyan la utilidad y eficacia de los métodos de la presente invención en la identificación de un riesgo incrementado de desarrollar cáncer.

Un método de acuerdo con la presente invención se puede realizar durante la atención clínica de rutina, por ejemplo como parte de un chequeo regular en general, en un sujeto que tiene no tiene neoplasia aparente o sospechosa tal como cáncer. Por lo tanto, la presente invención, en determinadas realizaciones, proporciona un método de rastreo

para la población general. Los métodos de la presente invención se pueden realizar en una edad más temprana que los presentes ensayos de rastreo de cáncer, por ejemplo en los casos en los el método se puede realizar en un sujeto menor de 65, 55, 50, 40, 35, 30, 25, o 20 años de edad.

Si se encuentra que la muestra biológica del sujeto en cuestión exhibe una LOI, por ejemplo como resultado de poner en contacto una célula progenitora en una muestra de un sujeto con un gen que se expresa de forma aberrante debido a una LOI y determinar la sensibilidad de la célula a genes LOI (+) tal como se determina midiendo un cambio en una vía de señales asociada con la replicación de ADN, el metabolismo del ADN, el ciclo celular, la apoptosis y la proliferación celular, en que un aumento en la sensibilidad de las células progenitoras a IGF2 se correlaciona con un riesgo incrementado de desarrollar cáncer, entonces ese sujeto se identifica por tener una probabilidad incrementada de tener cáncer. En estas realizaciones, pueden llevarse a cabo pruebas de diagnóstico adicionales para investigar la posibilidad de que esté presente cáncer en el sujeto. Ejemplos de tales pruebas de diagnóstico adicionales incluyen, pero no se limitan a radiografía de tórax, determinación del nivel de antígeno carcinoembrionario (CEA) o de antígeno específico para la próstata (PSA), examen colorrectal, examen endoscópico, MRI, exploración CAT, u otra formación de imágenes tales como la exploración con galio, y la formación de imágenes con bario. Además de ello, el método de la invención puede ser coincidente con la sigmoidoscopia/colonoscopia rutinaria del sujeto. El método podría implicar el uso de un tubo muy delgado, o un examen digital para obtener una muestra colorrectal.

El método de la presente invención, especialmente cuando se utiliza para detectar una LOI local, se puede repetir a intervalos regulares. Aunque no se desea estar limitado a una teoría particular, los métodos dirigidos a la detección de LOI local mediante el análisis de una muestra de sangre para una LOI, típicamente identifican mutaciones de la línea germinal. Por lo tanto, típicamente es suficiente un ensayo. Sin embargo, los métodos utilizados para detectar una LOI local, se puede aislar una tercera muestra, por ejemplo de tejido colorrectal, por ejemplo al menos 2 meses después del aislamiento de la segunda muestra. Por ejemplo, la tercera muestra se puede aislar a aproximadamente 1 año después de haber aislado la segunda muestra. De hecho, el método puede repetirse anualmente, por ejemplo en un examen físico anual rutinario. Utilizando estas pruebas regulares, se utiliza un método de la presente invención para el rastreo de un riesgo incrementado de desarrollar cáncer colorrectal mediante un método que incluye poner en contacto una célula progenitora LOI (+) en una muestra de un sujeto con el factor de crecimiento similar a la insulina tipo 2 (IGF2) y determinar la sensibilidad de la célula a IGF2 según se determina mediante la medición de un cambio en una vía de señales asociada con la replicación de ADN, el metabolismo de ADN, el ciclo celular, la apoptosis y la proliferación celular, en que un aumento en la sensibilidad de las células progenitoras LOI (+) a IGF2 se correlaciona con un riesgo incrementado de desarrollar cáncer colorrectal.

En el futuro se pueden realizar pruebas de diagnóstico adicionales, incluso si no está presente cáncer en el momento en el que se detecta la LOI. Por ejemplo, si la LOI se detecta en una muestra biológica de un sujeto e indica un riesgo incrementado de contraer cáncer, se pueden programar para ese sujeto radiografías de tórax periódicas (p. ej., cada 1 a 12 meses), exámenes colorrectales, examen endoscópico, MRI, exploración CAT, otras formaciones de imágenes tales como la exploración con galio y/o la formación de imágenes con bario. Por lo tanto, en estas realizaciones, la LOI se utiliza como un ensayo de rastreo para identificar sujetos para los cuales se justifica un control más frecuente.

De acuerdo con la presente invención, la muestra biológica o tejido se puede extraer de cualquier tejido que sea susceptible al cáncer. Por ejemplo, el tejido puede obtenerse mediante cirugía, biopsia, torunda, heces, u otro método de recogida. La muestra biológica para los métodos de la presente invención puede ser, por ejemplo, una muestra de tejido colorrectal, o en determinadas realizaciones, puede ser una muestra de sangre, o una fracción de una muestra de sangre tal como una fracción de un linfocito de sangre periférica (PBL). Métodos para aislar PBL de sangre entera son bien conocidos en la técnica. Además, es posible utilizar una muestra de sangre y enriquecer la pequeña cantidad de células circulantes de un tejido de interés, p. ej., colon, mama, etc., utilizando un método conocido en la técnica.

Cuando el método de la presente invención proporciona un método para identificar un riesgo incrementado de desarrollar cáncer colorrectal, se puede aislar una muestra biológica del colon. Una muestra de tejido de este tipo puede obtenerse por cualquiera de los métodos descritos anteriormente, o mediante el uso de una torunda o una biopsia. En el caso de cánceres de estómago y de esófago, la muestra de tejido puede obtenerse mediante biopsia endoscópica o aspiración, o muestra de heces o una muestra de saliva. En el caso de leucemia, la muestra de tejido es típicamente una muestra de sangre.

Tal como se describe anteriormente, la muestra biológica puede ser una muestra de sangre. La muestra de sangre se puede obtener utilizando métodos conocidos en la técnica tales como un pinchazo en el dedo o flebotomía. Adecuadamente, la muestra de sangre es de aproximadamente 0,1 a 20 ml o, alternativamente, de aproximadamente 1 a 15 ml, siendo el volumen de sangre aproximadamente de 10 ml.

Por consiguiente, en una realización, el riesgo de cáncer identificado es para el cáncer colorrectal, y la muestra biológica es una muestra de tejido obtenida a partir del colon, sangre o una muestra de heces. En otra realización, el riesgo de cáncer identificado es para el cáncer de estómago o cáncer de esófago, y el tejido se puede obtener por biopsia endoscópica o aspiración, o muestra de heces o una muestra de saliva. En otra realización, el riesgo de cáncer identificado es el cáncer de esófago, y el tejido se obtiene mediante biopsia endoscópica, aspiración o una muestra oral o saliva. En otra realización, el riesgo de cáncer identificado es leucemia/linfoma y la muestra de tejido es sangre.

En la presente invención, el sujeto es típicamente un ser humano, pero también puede ser cualquier organismo mamífero, que incluye, pero no se limita a un perro, gato, conejo, vaca, pájaro, rata, caballo, cerdo o mono.

Tal como se mencionó anteriormente, para determinadas realizaciones de la presente invención, el método se realiza como parte de un chequeo regular. Por lo tanto, para estos métodos el sujeto no ha sido diagnosticado de cáncer, y típicamente para estas presentes realizaciones no se sabe que un sujeto tenga un trastorno hiperproliferativo tal como una neoplasia colorrectal.

Los métodos de la presente invención identifican un riesgo de desarrollar cáncer para un sujeto. Un cáncer puede incluir, pero no se limita a cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de estómago, leucemia/linfoma, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer de mama, cáncer de piel, cáncer endocrino, cáncer urinario, cáncer de páncreas, otro cáncer gastrointestinal, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de cabeza, cáncer de cuello y adenomas. En un aspecto, el cáncer es cáncer colorrectal.

Un trastorno hiperproliferativo incluye, pero no se limita a neoplasias localizadas en lo siguiente: abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (adrenal, paratiroides, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejido blando, bazo, torácico y urogenital. Típicamente, tal como se utiliza en esta memoria, el trastorno hiperproliferativo es un cáncer. En determinados aspectos, el trastorno hiperproliferativo es cáncer colorrectal.

El método puede incluir, además, el análisis de una segunda muestra biológica del sujeto en un tejido diana para la pérdida de la impronta del gen IGF2, en donde una pérdida de la impronta en la segunda muestra es indicativa de un riesgo incrementado de desarrollar cáncer en el tejido diana. En determinadas realizaciones, la segunda muestra biológica no es una muestra de sangre. Por ejemplo, la primera muestra biológica puede ser una muestra de sangre y la segunda muestra biológica se puede aislar de tejido colorrectal.

En otra realización, la presente invención proporciona un método para la gestión de la salud de un sujeto. El método incluye realizar el método para identificar un riesgo incrementado de desarrollar cáncer discutido anteriormente y la realización de un método tradicional de detección de cáncer. Por ejemplo, se puede realizar un método tradicional de detección de cáncer si el método para identificar el riesgo de cáncer indica que el sujeto está en un riesgo incrementado de desarrollar cáncer. Se conocen muchos métodos tradicionales de detección de cáncer y se pueden incluir en este aspecto de la invención. El método tradicional de detección de cáncer puede incluir, por ejemplo, uno

o más de radiografía de tórax, determinación del nivel de antígeno carcinoembrionario (CEA), examen colorrectal, examen endoscópico, MRI, exploración CAT, u otra formación de imágenes tales como la exploración con galio y la formación de imágenes con bario y sigmoidoscopia/colonoscopia, un examen de los senos, o un ensayo de antígeno específico para la próstata (PSA).

En otra realización, la presente invención proporciona un método para pronosticar el riesgo de cáncer de un sujeto. El método incluye poner en contacto una célula progenitora LOI (+) en una muestra de un sujeto con el factor de crecimiento similar a la insulina tipo 2 (IGF2) y determinar la sensibilidad de la célula a IGF2 según se determina mediante la medición de un cambio en una vía de señales asociada con la replicación del ADN, el metabolismo del ADN, el ciclo celular, la apoptosis y la proliferación celular; en donde un aumento en la sensibilidad de las células progenitoras LOI (+) a IGF2 se correlaciona con un riesgo incrementado de desarrollar cáncer colorrectal.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar la predisposición al cáncer colorrectal de un sujeto. El método incluye poner en contacto la célula con IGF2 en presencia de un inhibidor del receptor de IGF1, en el que una disminución adicional en la vía de activación de las señales en presencia del inhibidor se correlaciona con un riesgo incrementado de desarrollar cáncer colorrectal. En este aspecto de la invención, la primera muestra biológica es típicamente una muestra colorrectal.

Al detectar la presencia o ausencia de una LOI al confiar en alguna de estas condiciones, estados o fenómenos, es posible utilizar un cierto número de diferentes técnicas analíticas específicas. En particular, es posible utilizar cualquiera de los métodos para la determinación del patrón de impronta conocido en la técnica. Se reconoce que los métodos pueden variar en función del gen a analizar.

Condiciones, estados y fenómenos que pueden provocar una LOI y que pueden ser examinados para evaluar la presencia o ausencia de una LOI incluyen el estado o condición de la maquinaria celular para la metilación del ADN, el estado de la región de control de la impronta en el cromosoma 11, la presencia de modificadores de la impronta trans-actuantes, el grado o la presencia de desacetilación de histonas o la desacetilación de histonas, el centro de control de la impronta, factores moduladores de la transacción, cambios en la cromatina provocados por proteínas similares a Polycomb, proteínas similares a Trithorax, homólogos humanos de otras proteínas que afectan a la cromatina en otras especies tales como las proteínas Su(var) en Drosophila, las proteínas SIR en levaduras, silenciamiento de tipo apareamiento en levaduras o genes de tipo XIST en mamíferos.

También es posible detectar una LOI examinando el ADN asociado con el gen o genes para el o los que se está evaluando la presencia o ausencia de LOI. Por la expresión "el ADN asociado con el gen o genes para el o los que se está evaluando la presencia o ausencia de LOI" se quiere dar a entender el gen, el ADN próximo al gen o el ADN a cierta distancia del gen (tal como alejado una megabase o más, p. ej., cambios de metilación pueden estar tan lejos, ya que actúan sobre la cromatina a través de largas distancias). Típicamente, para la presente invención la LOI se identifica o analiza o detecta mediante la detección de la hipometilación de una DMR del gen IGF2 y/o de una DMR del gen H 19, tal como se describe en esta memoria.

El grado de metilación en el ADN, asociado con el gen o los genes para el o los que se está evaluando la presencia

o ausencia de una LOI, se puede medir o identificar utilizando un cierto número de técnicas analíticas.

Se conocen en la técnica numerosos métodos para analizar el estado de metilación de un gen y se pueden utilizar en los métodos de la presente invención para identificar una hipometilación o hipermetilación del gen IGF2. Por ejemplo, el análisis de metilación se puede realizar mediante la secuenciación genómica de bisulfito. Por consiguiente, el ADN genómico desnaturalizado puede ser tratado con disolución de bisulfito recién preparada 55ºC. en la oscuridad durante la noche, seguido de purificación en columna y tratamiento con NaOH. El tratamiento con bisulfito modifica el ADN, convirtiendo citosinas no metiladas, pero no metiladas, en uracilo.

Se reconocerá que se pueden diseñar cebadores dependiendo del sitio unido por el cebador y la dirección de extensión de un cebador. Las regiones amplificadas y/o analizadas de otro modo utilizando pares de cebadores se pueden identificar fácilmente por un experto en la técnica utilizando herramientas de comparación de secuencias y/o analizando fragmentos de nucleótidos que se replican utilizando los cebadores. Por lo tanto, se entenderá que la identificación de los sitios de unión para estos cebadores utilizando métodos computacionales tendrá en cuenta que los cebadores pueden unirse preferiblemente a un polinucleótido cuya secuencia es modificada por tratamiento con bisulfito.

El tratamiento con bisulfito puede llevarse a cabo utilizando el kit de CpG Genome DNA Modification (Intergen, Purchase, N.Y.). Para la secuenciación de clones individuales, los productos de PCR se pueden subclonar en un vector de clonación TA (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se puede seleccionar para la secuenciación una serie de clones, tal como 10-15 clones.

Los productos de la PCR pueden purificarse usando el kit de extracción de gel QIAEX II (Qiagen) y se secuenció directamente con un secuenciador de ADN ABI Prism 377 utilizando el BIGDYE™. Kit de Secuenciación del Ciclo Terminator siguiendo el protocolo del fabricante (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.).

La metilación alterada puede ser identificada por la identificación de una diferencia detectable en la metilación. Por ejemplo, la hipometilación se puede determinar identificando si después de un tratamiento con bisulfito está presente uracilo o una citosina en residuos específicos. Si uracilo está presente después de tratamiento con bisulfito, a continuación, el residuo es no metilado. La hipometilación está presente cuando hay una disminución medible en la metilación, o una disminución medible en la metilación de residuos correspondientes a las posiciones metiladas dentro de los polinucleótidos analizó utilizando cebadores seleccionados.

En una realización alternativa, una reacción de amplificación puede ser precedida por un tratamiento con bisulfito, y los cebadores se pueden hibridar selectivamente a secuencias diana de una manera que es dependiente de tratamiento con bisulfito. Por ejemplo, un cebador puede unirse selectivamente a una secuencia diana sólo cuando una o más bases de la secuencia diana se altera mediante tratamiento con bisulfito, siendo de ese modo específico para una secuencia diana metilada.

En la técnica se conocen otros métodos para determinar el estado de metilación de un gen, tal como el gen IGF2, que incluyen, pero no se limitan a análisis de metilación basado en la matriz y análisis de transferencia Southern.

Métodos que utilizan una reacción de amplificación, por ejemplo los métodos anteriores para la detección de la hipometilación de la DMR del IGF2 pueden utilizar un proceso de amplificación de detección en tiempo real. Por ejemplo, el método puede utilizar la tecnología de baliza molecular (Tyagi S., et al., Nature Biotechnology, 14:.303

(1996)) o la tecnología TAQMAN™ (Holland, P.M., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7276 (1991)). También MethylLight (Trinh B.N., Long T I, Laird P W. DNA methylation analysis by MethylLight technology, Methods 25(4):456-62 (2001), MethylHeavy (Epigenomics, Berlín, Alemania) o SNuPE (extensión del cebador de un solo nucleótido) (véase, p. ej., Watson D., et al, Genet Res. 75(3):269-74 (2000)) se puede utilizar en los métodos de la presente invención relacionada con la identificación de la metilación alterada de IGF2.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "hibridación selectiva" o "hibridar selectivamente" se refiere a la hibridación en condiciones fisiológicas moderadamente rigurosas o altamente rigurosas que puede distinguir secuencias de nucleótidos relacionadas de secuencias de nucleótidos no relacionadas.

Tal como se conoce en la técnica, en reacciones de hibridación de ácidos nucleicos, las condiciones utilizadas para conseguir un nivel particular de rigurosidad variará dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos que se estén hibridando. Por ejemplo, la longitud, el grado de complementariedad, la composición de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, el contenido de GC:AT relativo) y el tipo de ácido nucleico, es decir, si el oligonucleótido o la secuencia de ácido nucleico diana es ADN o ARN, se puede considerar en la selección de condiciones de hibridación. Una consideración adicional es si uno de los ácidos nucleicos está inmovilizado, por ejemplo, en un filtro. Métodos para seleccionar las condiciones de rigurosidad apropiadas pueden ser determinados empíricamente

: o de forma estimada utilizando diversas fórmulas, y son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra, 1989).

Un ejemplo de condiciones de rigurosidad progresivamente más altas es como sigue: 2 X SSC/SDS al 0,1% a aproximadamente temperatura ambiente (condiciones de hibridación); 0,2 X SSC/SDS al 0,1% a aproximadamente temperatura ambiente (condiciones de baja rigurosidad); 0,2 X SSC/SDS al 0,1% a aproximadamente 42ºC (condiciones de rigurosidad moderada); y 0,1 X SSC a aproximadamente 68ºC (condiciones de alta rigurosidad). El lavado puede llevarse a cabo utilizando sólo una de estas condiciones, por ejemplo, condiciones de alta rigurosidad,

: o se puede utilizar cada una de las condiciones, por ejemplo durante 10 a 15 minutos cada una, en el orden enumerado anteriormente, repitiendo cualquiera o todos los pasos que se indican.

El grado de metilación en el ADN asociado con el gen o los genes para el que se evalúan la presencia o ausencia de LOI, se puede medir por hibridación fluorescente in situ (FISH) por medio de sondas que identifican y diferencian entre ADNs genómicos, asociados con el gen para el que se evaluó la presencia o ausencia de LOI, que exhiben diferentes grados de metilación del ADN. FISH se describe en Human chromosomes: principles and techniques (Compiladores, Ram S. Verma, Arvind Babu Verma, Ram S.) 2ª ed, Nueva York: McGraw-Hill, 1995, y de Capoa A., Di Leandro M., Grappelli C, Menéndez F., Poggesi I., Giancotti P., Marotta, M.R., Spano A., Rocchi M., Archidiacono N., Niveleau A. Computer-assisted analysis of methylation status of individual interphase nuclei in human cultured cells. Cytometry. 31:85-92, 1998. En este caso, la muestra biológica será típicamente cualquiera que contenga suficientes células o núcleos enteros para llevar a cabo un cultivo a corto plazo. Habitualmente, la muestra será una muestra de tejido que contiene 10 a 10.000 o, por ejemplo, 100 a 10.000 células somáticas enteras.

Adicionalmente, tal como se mencionó anteriormente, se pueden realizar análisis MethylLight, MethylHeavy de metilación basado en la matriz, mediante el uso de ADN tratado con bisulfito que se amplifica a continuación por PCR, frente a microarrays de secuencias diana de oligonucleótidos con las diversas formas que corresponde a ADN no metilado y metilado.

Tal como se mencionó anteriormente, métodos para la detección de una LOI pueden identificar patrones de metilación alterados. Sin embargo, se conocen otros métodos para detectar una LOI. Por ejemplo, determinados métodos para detectar una LOI identifican la expresión génica específica para alelos y dependen de la transcripción diferencial de los dos alelos. Para estos métodos, el ARN se transcribe de forma inversa con transcriptasa inversa, y luego se realiza la PCR con cebadores de PCR que abarcan un sitio dentro de un exón, en que ese sitio es polimórfico (es decir, normalmente variable en la población) y este análisis se realiza en un individuo que es heterocigoto (es decir, informativo) para el polimorfismo. Se puede utilizar un cierto número de esquemas de detección para determinar si se expresa uno o ambos alelos. Véase también Rainier et al. (1993) Nature 362:747749; que enseña la evaluación de la expresión específica para alelos de IGF2 por transcripción inversa de ARN y amplificación de ADNc mediante PCR utilizando nuevos cebadores que permiten una sola ronda en lugar de una PCR anidada; Matsuoka et al. (1996) Proc. Natl. Acad Sci USA 93:3026-3030 que enseña la identificación de un polimorfismo transcrito en p57K1P2; Thompson et al. (1996) Cancer Research 56:5723-5727, que enseña la determinación de los niveles de ARNm por RPA y análisis RT-PCR de la expresión específica para los alelos de p57K1P2; y Lee et al. (1997) Nature Genet. 15:181185, que enseña el análisis RT-PCR SSCP de dos sitios polimórficos. En este caso, la muestra biológica será cualquiera que contenga suficiente ARN para permitir la amplificación y subsiguiente transcripción inversa seguida de reacción en cadena de la polimerasa. Típicamente, la muestra biológica será una muestra de tejido que contiene de 1 a 10.000.000, 1.000 a 10.000.000 o 1.000.000 a

10.000.000 células somáticas.

La LOI también puede ser detectada por la dependencia de otros efectos aguas abajo específicos para alelos. Por ejemplo, dependiendo de la vía metabólica en la que se encuentra el producto del gen improntado; la diferencia será de 2 veces frente a 1 vez (o algún número entremedias) del producto y, por lo tanto, la función o una variación en la función específica para uno de los alelos. Por ejemplo, para IGF2 una señalización mitogénica incrementada en el receptor de IGF1, una ocupación incrementada del receptor de IGF1, una actividad incrementada en el receptor catabólico de IGF2, una apoptosis disminuida debido a la dosis de IGF2; para KvLQT1, un cambio en la longitud del intervalo QT en función de la cantidad y la isoforma de la proteína, o cambio en el potencial eléctrico, o cambio en la actividad cuando el ARN se extrae y se introduce en oocitos de Xenopus.

La expresión "molécula de ácido nucleico" se utiliza ampliamente en esta memoria para dar a entender una secuencia de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos que están enlazados entre sí por un enlace fosfodiéster. Como tal, la expresión "molécula de ácido nucleico" está destinada a incluir ADN y ARN, que pueden ser de cadena sencilla o de doble cadena, así como híbridos de ADN/ARN. Además, la expresión "molécula de ácido nucleico", tal como se utiliza en esta memoria, incluye moléculas de ácido nucleico que se producen de forma natural, que se pueden aislar de una célula, por ejemplo, el gen IGF2, así como moléculas sintéticas, que se puede preparar, por ejemplo, por métodos de síntesis química o mediante métodos enzimáticos tales como mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y, en diversas realizaciones, pueden contener análogos de nucleótidos o un enlace en la cadena principal distinto de un enlace fosfodiéster.

Los términos "polinucleótido" y "oligonucleótido" también se utilizan en esta memoria para referirse a moléculas de ácido nucleico. Aunque mediante el uso de estos términos no se pretende una distinción específica entre sí o de "molécula de ácido nucleico", el término "polinucleótido" se utiliza generalmente con referencia a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, o una parte de péptido de la misma, mientras que el término "oligonucleótido" se utiliza generalmente con referencia a una secuencia de nucleótidos útil como una sonda, un cebador de PCR, una molécula antisentido o similares. Por supuesto, se reconocerá que un "oligonucleótido" también puede codificar un péptido. Como tal, los diferentes términos se utilizan principalmente para la conveniencia de la discusión.

Un polinucleótido u oligonucleótido que comprende nucleótidos que se producen de forma natural y enlaces fosfodiéster se pueden sintetizar químicamente o se pueden producir utilizando métodos de ADN recombinante, utilizando un polinucleótido adecuado como un molde. En comparación, un polinucleótido que comprende análogos de nucleótidos o enlaces covalentes distintos de los enlaces fosfodiéster se sintetizarán, en general, químicamente, aunque una enzima tal como T7 polimerasa puede incorporar determinados tipos de análogos de nucleótidos en un polinucleótido y, por lo tanto, se puede utilizar para producir de forma recombinante un polinucleótido de este tipo a partir de un molde adecuado.

En otro aspecto, la presente invención incluye kits que son útiles para llevar a cabo los métodos de la presente invención. Los componentes contenidos en el kit dependen de un cierto número de factores, que incluyen: la condición, estado o fenómeno que se basa en detectar una LOI o medir el grado de LOI, la técnica analítica particular utilizada para detectar una LOI o medir el grado de la LOI, y el gen o los genes para los que se están detectando una LOI o se están midiendo el grado de una LOI.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar pero no limitar la invención.

EJEMPLOS

Materiales y Métodos

Ratones y genotipado.

Ratones con antecedentes C57BL/6J que portan una deleción en el gen H19 (3 kb) y 10 kb de la región aguas arriba incluyen la región diferencialmente metilada (DMR) que regulan el silenciamiento de IGF2 se obtuvieron de S. Tilghman (Universidad de Princeton) y se mantuvieron criando hembra de tipo salvaje C57B/6J y machos H19 +/-. Los ratones con expresión IGF2 bialélica y compañeros de camada de control se aislaron mediante el cruce de ratones H19 +/-hembras con ratones machos de tipo salvaje. Los ratones fueron genotipados mediante PCR que identifica un producto de 847 pb para el alelo de tipo salvaje y un producto de 1.000 pb para el alelo mutante, utilizando los siguientes cebadores: H19-F, TCC CCT CGC CTA GTC TGG AAG CA (SEQ ID NO: 1); Mutante-F, GAA CTG TTC GCC AGG CTC AAG (SEQ ID NO: 2); Común-R, ACA GCA GAC AGC AAG GGG AGG GT (SEQ ID NO: 3).

Dado que se sabe que la variación de cepa está asociada con el progreso de las lesiones, los controles de compañeros de la camada fueron tratados con y sin una LOI, en que las madres eran heterocigotas para una deleción de la región diferencialmente metilada (DMR) H19; la herencia de un alelo materno que carece de la DMR

conduce a la activación de un alelo normalmente silencioso de Igf2 [LOI (+)], mientras que la herencia de un alelo materno de tipo salvaje conduce a una impronta normal [LOI (-)].

Análisis de microarrays.

En una evaluación piloto inicial, el ARN total fue extraído de intestino recién congelado y de espesor total utilizando el kit RNeasy, evaluado mediante un bioanalizador (Agilent), y 2.7 µg de ARN total se marcó y se hibridó a un microarray de ratón 44k de National Institute on Aging (NIA) (Versión 2.0, fabricado por Agilent, nº 12463). Inicialmente se compararon dos conjuntos de 6 muestras, tres LOI (+) de machos con tres LOI (-) de hembras, y un análisis separado de tres LOI (+) de hembras y tres LOI (-) de machos, confirmando la sensibilidad de la comparación por la detección de diferencias en función del género conocidos, incluyendo Xist, Eif2s3y y Ddx3y. El análisis estadístico se realizó utilizando el software de análisis del array NIA (Sharove et al., Bioinformatic (2005) 212548-2549). Se analizaron los genes que muestran cambios consistentes y estadísticamente significativos (P ≤ 0,05) en ambos conjuntos en cuanto al enriquecimiento en categorías de Ontogenia de Genes utilizando el Índice de Genes de Ratón de NIA (Ver. MM5) * Sharov et al, Genome Res (2005) 15:748-754). Esto se puede encontrar en la página web del Índice de Genes de Ratón de NIA organizado por los Institutos Nacionales de Salud, Bethesda Maryland. Para la validación, se recogieron de manera similar 14 muestras de ARN LOI (-) y 14 muestras de ARN LOI (+) y se utilizaron para la RT-PCR en tiempo real.

Para detectar el cambio en la expresión génica en células progenitoras intestinales de una manera más definitiva, se realizó la microdisección de captura por láser (LCM) para aislar células de las criptas intestinales. Los portaobjetos se trataron previamente con RNAzap (Ambion), se enjuagaron con agua tratada con DEPC, se secaron y se irradiaron por UV, a continuación, los intestinos congelados fueron embebidos en OCT, se seccionaron a 10 µm y se fijaron con etanol al 70% en los portaobjetos. Los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina (Sigma), se deshidrataron y se utilizaron para la LCM en el espacio de una semana. 5.000-13.000 criptas intestinales fueron disecadas mediante LCM de cada uno de tres ratones LOI (+) y LOI (-), y se recogieron 2-6 µg de ARN utilizando el kit RNeasy (Qiagen). Se utilizaron 1,7 µg de ARN total de cada una de las muestras para el marcaje, y la expresión génica se analizó con un microarray de ratón 44k de NIA (Ver 2.1, fabricado por Agilent, nº 014117). Los genes fueron examinados en cuanto al enriquecimiento estadísticamente significativo en las categorías de Ontogenia de Genes.

Para la validación, la LCM se realizó en 12 ratones LOI (+) y 9 ratones LOI (-) adicionales, aislando aproximadamente 800 criptas que proporcionan más de 300 ng de ARN total de cada uno. Las muestras de ARN fueron transcritas inversamente utilizando SUPERSCRIPT II (Invitrogen), y se cuantificaron utilizando Reactivos de Núcleo PCR SYBR Green y un Sistema de Detección de la Secuencia ABI Prism 7700 (Applied Biosystems), y normalizado a β-actina. Los cebadores y las temperaturas de reasociación se proporcionan en la Tabla 1.

Tabla 1. Cebadores para RT-PCR en tiempo real.

Genes Cebadores (directo; inverso; temperatura de reasociación; longitud del producto)

Igf2: cat cgt gga aga gtg ctg ct (SEQ ID NO: 4); ggg tat ctg ggg aag tcg t (SEQ ID NO: 5); 62 °C; 132 pb

Axina 2: aac aca gaa gac agc tcc tca (SEQ ID NO: 6); gtc tga atc gat ggt aaa cct g (SEQ ID NO: 7); 59 °C; 166 pb

Tiam1 cac ttc aag gag cag ctc agc (SEQ ID NO: 8); gct cag tcg atc ctc tcc ac (SEQ ID NO: 9); 59°C; 190 pb

Rpa2 atg gat gtt cgt cag tgg gtt (SEQ ID NO: 10); cca gag gaa tga tct taa agg c (SEQ ID NO: 11); 60°C; 145 pb

Card11 gaa gac gag gtg ctc aat gc (SEQ ID NO: 12); cct ttg tcc ctt ggt gtg aa (SEQ ID NO: 13); 60°C; 90 pb

Ccdc5 ggg aca tca gcc tgg taa tag a (SEQ ID NO: 14); ctt aga cag att ggc agg tga a (SEQ ID NO: 15); 60°C; 122 pb

5 Cdc6 tgt gga gtc gga tgt cag ga (SEQ ID NO: 16); ggg ata tgt gag caa gac caa (SEQ ID NO: 17); 60°C; 107 pb

Mcm5 cca ggt cat gct caa gtc aga (SEQ ID NO: 18); gaa tgg aga tac gag tag cct t (SEQ ID NO: 19); 60°C; 140 pb

Mcm3 cgc aga gag act act tgg act tc (SEQ ID NO: 20); agc cga tac tgg ttg tca ctg (SEQ ID NO: 10 21); 60°C; 97 pb

Skp2 agt caa ggg caa agg gag tg (SEQ ID NO: 22); gag gca cag aca gga aaa gat (SEQ ID NO: 23); 60°C; 136 pb

Chaf1a tcc cag tga aga ggt taa tac aag (SEQ ID NO: 24); gat gtg tct tcc tca act ttc tc (SEQ ID NO: 25); 60°C; 85 pb

15 Lig1 cgg aca ttt gag aag att gcg g (SEQ ID NO: 26); aga tag aga aca ggg agc aag tc (SEQ ID NO: 27); 60°C; 119 pb

Gmnn tga aaa taa gga tgt tgg aga cc (SEQ ID NO: 28); gcc act tct ttc caa tac tga g (SEQ ID NO: 29); 60°C; 90 pb

Rfc3 cca cct tga agt taa tcc cag t (SEQ ID NO: 30); tgt cca cct ctg tca ata ata cc (SEQ ID NO: 20 31); 60°C; 143 pb

Ccne1 agt tct tct gga ttg gct gat g (SEQ ID NO: 32); gta acg atc aaa gaa gtc ctg tg (SEQ ID NO: 33); 60°C; 91 pb

Msil tgc tgg gta ttg gga tgc t (SEQ ID NO: 34); tcg ggg aac tgg tag gtg ta (SEQ ID NO: 35); 60°C; 103 pb

25 p21 aca gcg ata tcc aga cat tca ga (SEQ ID NO: 36); cga aga gac aac ggc aca ct (SEQ ID NO: 37); 60°C; 99 pb

β-actina atac cac cat gta ccc agg ca (SEQ ID NO: 38); gga gga gca atg atc ttg at (SEQ ID NO: 39); 60°C; 93 pb

30 Establecimiento de Células Madre Embrionarias (ES) de ratón Células y Fibroblastos Embrionarios de Ratón

Se realizó un apareamiento temporizado entre ratones mutantes H19 hembras y ratones de tipo salvaje machos después de la inyección intraperitoneal de 5 UI de gonadotropina de suero de yegua preñada, dos días más tarde seguido de 5 UI de gonadotropina coriónica humana. El día embrionario 13,5 se aislaron embriones, se digirieron con tripsina, se sembraron en placas de cultivo celular de 10 cm y se separaron dos veces en 1: 3-1: 4 antes de ser 35 congelados. ADN genómico fue extraído para el genotipado de H19 (identificando así el estado LOI). Para las células ES, el apareamiento temporizado se realizó entre ratones mutantes H19 hembras de 4 semanas de edad y ratones de tipo salvaje machos de 8-10 semanas de edad. El día embrionario 3,5, los úteros fueron enjuagados y los embriones se recogieron y se cultivaron según se describe por Cowan et al., ES Cell Targeting Core Laboratory, 2006). Las excrecencias de masa celular interna se aspiraron y se sembraron. Ocho clones se ampliaron con éxito 40 en platos de 3,5 cm. Para los ensayos del tamaño de las colonias ES, células ES y células de la capa de alimentación se tripsinizaron y se sembraron en placas revestidas de gelatina durante 30 minutos para dejar que se fijaran las células de la capa de alimentación, y el sobrenadante se aspiró y se sometió a este proceso una vez más. La población de ES predominantemente no adherida se contó, y 1.000 células se sembraron en una capa de alimentación en una placa de 6 pocillos el día 0, midiendo los tamaños de 15-30 colonias ES elegidas al azar os días 45 1 a 6. Los ensayos de la tasa de crecimiento ES se realizaron en medio Complete Clonal Grade ESGRO (Chemicon). Después de recoger predominantemente la población ES no adherida como anteriormente, las células

se dividieron a una densidad 1:4 dos veces más en medio completo ESGRO para eliminar cualquier célula de la capa alimentadora. 200.000 células ES se sembraron luego en una placa de 6 pocillos revestida de gelatina sin una capa de alimentación el día 0, y el número de células se determinó los días 1, 2, 3 y 4. El análisis se realizó por triplicado, y ciego para el genotipo.

Para la estimulación de IGF2, se aislaron las células ES de tipo salvaje según se describe anteriormente y se cultivaron en medio basal completo ESGRO con 800 ng/ml de proteína recombinante Igf2 de ratón (StemCell Technologies), con o sin NVP-AEW541 3 µM (Novartis). Las células se lavaron con PBS dos veces y el ARN se extrajo utilizando el Kit RNeasy (QIAGEN) en 0 h, 3 h, 6 h, 10 h y 24 h. La expresión génica se ensayó mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real según se describe anteriormente.

Administración in vivo de azoximetano y NVP-AEW541.

Controles de compañeros de camada de 7 semanas de edad LOI (+) y LOI (-)fueron tratados con AOM a razón de 10 mg/kg de peso corporal por vía intraperitoneal una vez por semana durante tres semanas, y fueron sacrificados 5 semanas después de la primera dosis de AOM. Todo el colon fue reseccionado de los ratones después de laparotomía, enjuagado con PBS, llenado de formalina tamponada al 10% (Sigma) durante un minuto, se abrió longitudinalmente, se fijó en un plano entre papel de filtro en formalina a 4ºC durante la noche, se aclararon con PBS y se tiñeron con azul de metileno al 0,2% en solución salina. El número de ACF por colon y el número de criptas aberrantes por ACF se obtuvo bajo un microscopio óptico según se describió previamente Bird, Cancer Lett (1987) 37:147-151). NVP-AEW541 (50 mg/kg) se administró por sonda oral, comenzando 1 semana antes del tratamiento con AOM, y NVP-AEW541 se administró 7 días/semana, dos veces al día durante 5 días de la semana y una vez al día durante 2 días del fin de semana, durante 6 semanas hasta el sacrificio.

Ensayos en la Cámara Microfluídica.

El dispositivo de automatización de la inmunotinción consiste en un chip de PDMS de 2 capas monolítico sellado con un cubreobjetos de vidrio, fabricado utilizando técnicas descritas previamente (Unger et al, Science 288 (2000) 288:113-116). Válvulas de multiplexación fueron accionados por tuberías de presión conectadas a las válvulas de solenoide fuera del dispositivo. La arquitectura del chip, el rendimiento y la validación están descritos todos en un manuscrito separado presentado para su publicación. El sustrato de vidrio de la cámara de cultivo celular se revistió mediante la introducción de gelatina al 0,1% (Sigma) en el dispositivo durante al menos 30 minutos, a continuación se introdujeron las células y se dejó que se fijaran durante 3 horas. IGF2 (StemCell Technologies) disuelto en medio celular se introdujo en cada una de las cámaras en diferentes momentos, de manera que coincidió el final de todos los períodos de estimulación. Para finalizar el experimento, se introdujo PBS (Invitrogen) enfriado con hielo en todas las cámaras, seguido inmediatamente por paraformaldehído al 4% (Electron Microscopy Systems) durante 20 minutos. Las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% (Sigma) durante 5 min y se bloquearon con suero de cabra al 10% (Sigma), con lavados de PBS entremedias. Las células se incubaron en la relación 1:100 de anticuerpo primario anti-fosfo-Akt (Ser 473, Upstate) en disolución de bloqueo durante 1 hora, se lavaron en PBS, después se incubaron con anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con Alexa 488 1:200 (Invitrogen ), Hoechst 33258 1:500 (Sigma), más faloidina Rojo Texas 1:40 (Invitrogen) en disolución de bloqueo durante 1 hora. Finalmente, las células se lavaron y se mantuvieron en PBS para evitar el secado durante la formación de imágenes. La formación de imágenes se realizó utilizando un microscopio de epifluorescencia Zeiss invertido motorizado, equipado con una cámara Cascade 512B CCD. El uso de los programas de MATLAB personalizados (Mathworks), las imágenes fueron corregidas por Hatfield, cosidas y cuantificados. Brevemente, se utilizó la imagen de Hoechst para determinar la región nuclear para cada una de las células y la intensidad media de tinción en esta región se comparó con el fondo. Para cada uno de los tipos de célula e instantes, se analizaron 200-300 células de esta manera para asegurar la significancia estadística.

Puesto que tanto el IGF2 endógeno como el IGF2 utilizado en los experimentos MEF son susceptibles a la inactivación basada en la proteína de unión a IGF2 (IBP), la dosis de una variante de IGF2 IBP-resistente se determinó produciendo niveles similares de activación de Akt. Se encontró que este nivel era aproximadamente 50 ng/ml (6,5 nM; la activación de Akt es equivalente a la obtenida en aproximadamente 600 ng/ml de IGF1 sensible a IBP), comparable a los kD previamente estimados de IGF1R para IGF2 (1-10 nM), lo que indica que no se alcanzó la saturación del receptor. Estos resultados sugieren que los experimentos se llevaron a cabo en un régimen de subsaturación, incluido el caso cuando la dosis de IGF2 sensible a IBP se aumentó hasta 1600 ng/ml.

Teniendo en cuenta que el efecto de la LOI de IGF2 es sólo un cambio doble en la expresión génica y de proteínas (Sakatani et al., Science 307 (2005) 307:1976-1978) se diseñó un enfoque para detectar con suficiente poder estadístico cambios de modestos a moderados en la expresión génica aguas abajo. Los experimentos preliminares se realizaron primero comparando la expresión génica en el intestino de espesor total derivado de 6 compañeros de camada LOI (+) y 6 compañeros de camada LOI (-), mediante la extracción de ARN y la hibridación a un microarray de ratón 44K de oligo 60-meros que representan 23.933 genes (Carter et al., Genome Biol (2005) 6:R61). Se encontraron 508 genes con una expresión incrementada y 147 genes con una expresión disminuida en el intestino

de ratones LOI (+). Las anotaciones de la Ontología de Genes (GO) mostró que entre los genes sobre-expresados en el intestino de ratones LOI (+), hubo una sobre-representación en la expresión intestinal en ratones LOI (+) de genes que muestran una expresión incrementada implicados en la replicación del ADN (P < 10-10), ciclo celular (P < 10-7), y categorías de la biosíntesis del colesterol y el metabolismo (en cada caso p < 10-12), y de genes que muestran una expresión disminuida implicados en el metabolismo de hidratos de carbono, glucosa y monosacáridos (en cada caso P < 10-15) (Tabla 2).

Tabla 2. Genes con diferencias significativas en la expresión en ratones LOI (+) encontrados por el análisis de

microarrays de criptas microdiseccionadas de captura por láser.

Supra-regulado en LOI

Categoría de anotación GO: Genes Genes supra- Genes Genes Valor P

supra-regulados regulados: anotados GO anotados

en categoría: anotados GO totales en GO totales

totales: categoría

Biosíntesis de colesterol: 5 312 17 12933 10-12

Metabolismo de colesterol: 8 312 41 12933 10-12

Metabolismo de esterol: 8 312 44 12933 10-11

Biosíntesis de sterol: 5 312 19 12933 10-11

Replicación de ADN y: 13 312 103 12933 10-11

ciclo del cromosoma

Replicación de ADN: 11 312 83 12933 10-10

Metabolismo de ARN: 20 312 252 12933 10-8

Ciclo celular: 32 312 527 12933 10-7

Metabolismo de esteroides: 10 312 92 12933 10-7

Unión de ARN: 23 312 354 12933 10-6

Proliferación celular: 36 312 692 12933 10-6

Desarrollo muscular: 9 312 92 12933 10-5

Actividad del factor de corte: 5 312 35 12933 10-5

y empalme de pre-ARNm

Biosíntesis de esteroides: 6 312 49 12933 10-5

Mitosis: 8 312 82 12933 10-5

Unión de ácidos nucleicos: 81 312 2185 12933 10-5

Fase M del ciclo: 8 312 83 12933 10-5

cellular mitótico

Metabolismo de: 79 312 2142 12933 10-4

nucleósidos, nucleótidos

y ácidos nucleicos

Metabolismo: 157 312 5100 12933 10-4

Ciclo cellular mitotic: 10 312 129 12933 10-4

Procesamiento de ARN: 13 312 196 12933 10-4

Contracción muscular: 6 312 60 12933 10-4

División nuclear: 9 312 115 12933 10-4

Crecimiento cellular y/o: 102 312 3061 12933 10-4

mantenimiento

Constituyente estructural: 8 312 98 12933 10-4

del citoesqueleto

Sub-regulado en LOI

Categoría de anotación GO: Genes Genes supra- Genes Genes Valor P

supra-regulados regulados: anotados GO anotados

en categoría: anotados GO totales en GO totales

totales: categoría

Metabolismo de glucosa: 7 73 76 12933 10-15

Derivación de energía por: 8 73 112 12933 10-15

oxidación de compuestos

orgánicos

Vías de energía: 8 73 115 12933 10-15

Metabolismo de hexosa: 7 73 94 12933 10-15

(continúa)

Sub-regulado en LOI

Categoría de anotación GO: Genes Genes supra- Genes Genes Valor P

supra-regulados regulados: anotados GO anotados

5: en categoría anotados GO totales en GO totales

totales: categoría

Metabolismo de: 7 73 95 12933 10-15

monosacáridos

10: Vías principales del 6 73 80 12933 10-15

metabolismo de hidratos

de carbono

Metabolismo de hidratos: 10 73 271 12933 10-11

de carbono

15: Metabolismo del alcohol 7 73 162 12933 10-10

Metabolismo de lípidos: 8 73 379 12933 10-4

Una limitación de este análisis es que se basó en el intestino de espesor total, sin embargo el compartimiento de

20 células progenitoras, es decir, criptas, está específicamente alterado histopatológicamente en LOI (Sakatani et al. (2005)). Por lo tanto la expresión génica específica para el compartimiento fue examinado microdiseccionando una media de 8.000 criptas de cada uno de 3 ratones LOI (+) y 3 ratones LOI (-), proporcionando > 2 µg de ARN de cada uno de los ratones, suficiente para un experimento de microarray independiente. Este análisis reveló un subconjunto más limitado de genes expresados diferencialmente en criptas LOI (+), con 283 genes con una expresión

25 incrementada y 109 genes con una expresión disminuida (Tabla 3).

Tabla 3. Lista de Genes con Diferencia Significativa (P < 0,01) en el Análisis Microarrav de Criptas Microdiseccionadas de Captura por Láser (Supra-regulados en LOI(+)).

Las anotaciones GO mostraron una representación excesiva de genes que muestran una expresión incrementada implicada con la replicación del ADN (P < 10-15), el ciclo celular (P < 10-9) y la proliferación celular (P < 10-9) (Tablas 4, 5).

Tabla 4. Categorías de de anotación de Ontogenia de Genes (GO) con una expresión alterada en análisis de microarrays de criptas microdiseccionadas de captura por láser.

Supra-regulado en LOI

Categoría de anotación GO: Genes Genes supra- Genes Genes Valor P

supra-regulados regulados: anotados GO anotados

en categoría: anotados GO totales en GO totales

totales: categoría

Replicación de ADN y: 15 168 103 12933 10-15

ciclo de cromosomas

Replicación de ADN: 13 168 83 12933 10-15

Metabolismo de ADN: 24 168 373 12933 10-15

Replicación de ADN: 5 168 31 12933 10-12

ADN-dependiente

Ciclo celular: 23 168 527 12933 10-9

Proliferación celular: 27 168 692 12933 10-9

División nuclear: 8 168 115 12933 10-7

Fase M: 8 168 124 12933 10-6

Ciclo celular mitótico: 8 168 129 12933 10-6

Mitosis: 6 168 82 12933 10-6

Fase M de ciclo: 6 168 83 12933 10-6

celular mitótico

Reparación de ADN: 7 168 122 12933 10-5

Unión de ATP: 28 168 1012 12933 10-5

Unión de: 28 168 1028 12933 10-4

adenil-nucleótido

Citoquinas: 6 168 99 12933 10-4

Actividad de helicasa: 5 168 73 12933 10-4

ATP-dependiente

Unión de nucleótido: 32 168 1293 12933 10-4

purina

Metabolismo de ácido: 11 168 281 12933 10-4

carboxílico

Metabolismo de: 11 168 281 12933 10-4

ácido orgánico

Unión de nucleótidos: 32 168 1313 12933 10-4

Respuesta al estímulo: 7 168 142 12933 10-4

de lesión de ADN

Actividad de ATPasa: 9 168 213 12933 10-4

Metabolismo: 90 168 5100 12933 10-4

Respuesta a: 7 168 147 12933 10-4

estímulo endógeno

* La anotación GO fue analizada en http://lgsun ma grc NIH gov/geneindex4/upload html Se muestran categorías con > 5 genes identificados con P < 10-4. Los genes sub-regulados no fueron enriquecidos en categoría alguna

Tabla 5. Genes implicados en las categorías de graduación superior (replicación de ADN/ciclo celular), supraregulado en ratones LOI (+) ratones en análisis de microarrays de criptas microdiseccionadas de captura por láser.

Gen: Veces de cambio Función

Card 11: 1,65 BCL10 fosforilado, induce actividad

de NF-kB

CcdcS: 1,54 Regulador de la función del huso

Skp2: 1,49 Oncogen requerido para la entrada en fase

S

Gmnn: 1,49 Acumulado en S, G2 y M, inhibición de origen

inapropiado, activado por CDT1

Ccne1: 1,48 Requerido para la activación de CDK2,

dando lugar a la proliferación

Chafla: 1,48 Monta el octámero de histona sobre el

ADN en replicación durante la fase S

Mcm5: 1,47 Requerido para la replicación de ADN,

interactuando con Cdc6 y Mcm2

Rfc3: 1,44 Implicado en la elongación eficiente de ADN

Rpa2: 1,42 subunidad de 32 kD de proteína de

5: replicación A

Cdc6: 1,42 Factor de licencia esencial para la

replicación del ADN

Mertk: 1,39 Proto-oncogén expresado en los tejidos

epiteliales y reproductores

10: Pitx2 1,38 Factor de transcripción requerido para la

proliferación específica del tipo celular

efectiva

Cenph: 1,37 Quinesina asociada a centrómero mitótico

Ligl: 1,37 ADN ligasa implicada en la unión de

15: fragmentos de Okazaki

Mcm 3: 1,36 Requerido para el desenrollamiento de ADN

durante la replicación del ADN

Smc211: 1,36 Requeridos para la condensación

del cromosoma mitótico

20: Rpa1 1,35 Subunidad de proteína de replicación A

requerida para la replicación del ADN

Gen Veces de cambio Función

Spag5 1 33 Ortólogo de astrina, localizado al husillo y

requerido para la mitosis

Orc61 1,32 Une orígenes de replicación del ADN para la

iniciación de la replicación del ADN

Uhrf1 1,30 Requerido para la entrada en fase S, regula

la expresión de Top2a.

Mre11a 1,28 Requerido para la reparación de rotura

de la doble hélice y la proliferación celular

Mcm4 1,28 Requerido para la replicación del ADN,

interactúa con Mcm6 y Mcm7

Cdc7 1,27 Requerido para la transición de G1-S y la

iniciación de la replicación del ADN

Itgb1 1,25 Marcador de células progenitoras para la

zona proliferativa de las criptas del colon

Pold3 1,24 Subunidad de ADN polimerasa delta

requerida para la replicación del ADN

Kntc1 1,24 Puesto de control mitótico

Glmn 1,22 Inmunofilina, ligando natural de FKBP59 y

FKBP 12

+ Se muestran los genes con el cambio > 1,20 veces

No se observó enriquecimiento significativo en otras categorías. Con el fin de confirmar estos resultados mediante PCR cuantitativa en tiempo real, LCM se realizó en 15.000 criptas adicionales microdiseccionadas de 12 ratones LOI (+) y 9 ratones LOI (-) adicionales, proporcionando > 300 ng de ARN de cada una de las muestras. Si bien los cambios en la expresión génica fueron moderados (~ 1,5 veces) (Tablas 4 y 5, supra), el análisis cuantitativo de PCR en tiempo real de 14 genes confirmó diferencias estadísticamente significativas en 13 (P entre 0,003 y 0,04) y las otras eran sugerentes (P = 0,1) (Figura 1).

Los genes de graduación superior en este análisis incluían Cdc6, un factor esencial de licencia que conduce a la iniciación de la replicación del ADN y al inicio de la fase S (Dutta et al, Annu Rev Cell Dev Biol (1997). 13: 293-332; Coleman et al, Cell (1996) 87: 53-63), Mcm5 y Mcm3, ambos requeridos para la replicación del ADN en la fase S temprana (Chong et al, Nature (1995). 375:418-421; Madline et al, Nature (1995) 375: 421-424), Skp2, necesario para la entrada en fase S (Reed, Nat Rev Mol Cell BGiol (2003) 4:855-864; Bashir et al, Nature (2004) 428:190-193), Ccdc5, un regulador de la función del huso (Einarson et al, Mol Cell Biol (2004). 24:3957-3971), Chaf1a, que ensambla el octámero de histona en ADN en replicación (Smith y Stillman, Cell (1989) 58:15-25), y Rpa2, una proteína de unión a ADN de cadena sencilla esencial para la replicación del ADN (Mass et al, Mol Cell Biol (1989). 18:6399-6407; Shao et al, EMBO J (1999) 18: 13971406) (Figura 1, Tablas 4, 5, supra). Estos resultados implican que la LOI provoca una alteración específica en la expresión génica asociada a la replicación en el epitelio intestinal.

No obstante, la expresión incrementada de algunos genes no asociados con la replicación del ADN se observó per se. Por ejemplo, Card11 (Figura 1) es un gen anti-apoptótico que actúa a través de la fosforilación de BCL10 y la inducción de NF-κB (Bunnell, MoI Interv (2002) 2:356-360). La expresión de Msi1 también fue analizado mediante PCR en tiempo real, dado que el marcador de células progenitoras codificado Musashi-1 mostró una inmunotinción incrementada en un estudio previo (Sakatani et al. (2005)). La expresión de Msi1 también se incrementó significativamente (P = 0,01) (Figura 1), lo que confirma el resultado anterior y soporta un mecanismo pleiotrópico para IGF2 en LOI. Por último, varios genes mostraron una regulación a la baja en criptas LOI (+), incluyendo p21 (Figura 1), un inhibidor del progreso del ciclo celular.

Ejemplo 1. Confirmación in vitro del efecto proliferativo de IGF2 LOI (+) en células progenitoras.

Seguía siendo teóricamente posible que la diferencia observada en la expresión génica simplemente refleja la sobrerepresentación de células progenitoras dentro de las criptas intestinales, en lugar de un cambio en la expresión génica celular per se. Para confirmar esto último, las células madre embrionarias (ES) de ratón se derivaron y se sembraron en medio definido Complete Clonal Grade ESGRO (Chemicon), que no contiene IGF2 y que permite el crecimiento de células ES no diferenciadas sin una capa de alimentación, que se realizó con o sin 800 ng/ml de proteína recombinante Igf2 de ratón (StemCell Technologies). De acuerdo con los experimentos de microarrays, Igf2 indujo un aumento del 50% y del 56% en la expresión génica Cdc6 a las 3 y 6 horas, respectivamente, y del 40% y 25% a las 10 y 24 horas, respectivamente (Figura 3). Se observaron resultados similares para Mcm5 (Figura 3). Para confirmar la especificidad de este efecto, estos experimentos se repitieron mediante el bloqueo de la señalización de IGF2 con NVP-AEW541, un pirrolo[2,3-d]pirimidina que inhibe específicamente IGF1R sobre el receptor de insulina relacionado, y también se confirmó que el fármaco bloquea IGF2 en IGF1R (Figura 9). NVP-AEW541 abolió completamente la expresión incrementada inducida por IGF2-de Cdc6 en todos los momentos (Figura 3). Estos experimentos se repitieron para Mcm5 y Msil, con resultados similares (Figura 3, Figura 10), lo que confirma que Igf2 inducía la expresión génica relacionada con la proliferación, así como aumentaba la proliferación de las células progenitoras in vivo.

La idea de que células progenitoras LOI (+) proliferan más rápidamente que las células LOI (-) se ensayaron entonces derivando 4 líneas ES de cada uno de los dos embriones LOI (+) y LOI (-). Células ES LOI (+) mostraron un tamaño de la colonia aparentemente mayor por microscopía óptica que lo hacían las LOI (-) (Figura 4). Con el fin de cuantificar el tamaño de la colonia, 1.000 células ES se sembraron de cada una de las cuatro líneas de células alimentadoras LOI (+) y cuatro líneas de células alimentadoras LOI (-) y se midió el tamaño de 15-30 colonias de cada una, todos los días hasta el día 6. Células ES LOI (+) mostraron un aumento estadísticamente significativo en tamaño de las colonias frente a células ES LOI (-) tan pronto como el día 3 (P = 0,001), lo que aumentó en un incremento de 86% el día 6 (P = 0,0009) (Figura 5).

El crecimiento de células ES se midió entonces directamente como células indiferenciadas en medio definido Complete Clonal Grade ESGRO (Chemicon), de nuevo utilizando cuatro líneas ES LOI (+) y cuatro líneas ES LOI (-), con pocillos por triplicado en los días 0 a 4. Las células ES LOI (+) mostraron un aumento de la tasa de crecimiento del 26% (P = 0,01), con un aumento del 160% en el número de células frente a células ES LOI (-) hacia el día 4 (P = 0,0003). Por lo tanto, las células ES LOI (+) proliferan significativamente más rápidamente que células ES LOI (-), consistente con los datos de expresión, lo que sugiere que las células progenitoras intestinales con LOI también muestran una mayor proliferación (Figura 6).

Ejemplo 2. Inhibición específica de Focos de Cripta Aberrantes en Ratones LOI (+) mediante un inhibidor de Igf1R.

Debido a la variación de cepa conocida en el progreso de estas lesiones, compañeros de camada controles fueron tratados con y sin LOI, en que las madres eran heterocigotas para una deleción de la región diferencialmente metilada (DMR) H19; la herencia de un alelo materno que carece de la DMR conduce a la activación del alelo normalmente silencioso de Igf2 [LOI (+)], mientras que la herencia de un alelo materno de tipo salvaje conduce a la impronta normal [LOI (-)]. Ocho ratones LOI (+) y 14 ratones LOI (-) recibieron AOM por vía intraperitoneal semanalmente durante 3 semanas, fueron sacrificados a las 5 semanas después de la primera dosis, y los ACF se puntuaron por el método de Bird (1987). El examen histológico de colones de los ratones tratados con AOM confirmó la presencia de ACF, con características hiperproliferativas que incluyen una mitosis incrementada, una ampliación de las criptas y un desorden de criptas (Figura 12). Estos resultados son consistentes con los cambios específicos para la proliferación en la expresión génica descrita anteriormente. Un hallazgo interesante adicional en ratones LOI (+) tratados con AOM eran criptas císticamente dilatadas revestidas por células alargadas con núcleos atípicos y que contenían desechos necróticos, que eran una reminiscencia de adenomas sésiles aserrados (SSA) vistos en el colon humano (Figura 12). SSAs también muestran una dilatación de la cripta en asociación con atipia citológica y son actualmente de gran interés por su asociación reconocida recientemente con el cáncer colorrectal (Snover et al, Am J Clin Pathol (2005) 124:380-391). Por lo tanto, será de interés para determinar si los SSAs se asocian con LOI en la población humana.

Ratones LOI (+) mostraron 19,8 ± 2,2 ACF por colon, en comparación con 12,4 ± 0,9 ACF por colon en ratones LOI (-), un aumento del 60% (P = 0,002). 9 ratones LOI (+) adicionales y 9 compañeros de camada de control LOI (-) fueron expuestos de manera similar a AOM, añadiendo un tratamiento con NVP-AEW541, un inhibidor de IGF1R, a una dosis de 50 mg/kg por sonda oral diaria durante 6 semanas (dos veces todos los días excepto los fines de semana todos los días). Ratones LOI (-) no mostraron diferencia alguna en la formación de ACF después del tratamiento con el fármaco NVP-AEW541 (11,3 ± 1,6, N.S.). Sin embargo, los ratones LOI (+) mostraron una reducción notable en la formación ACF inducida por AOM después del tratamiento con NVP-AEW541 (7,8 ± 1,2; P = 0,0002), significativamente menor incluso que la observada en ratones LOI (-) tratados con AOM (P = 0,007). Por lo tanto, la LOI de Igf2 aumenta la sensibilidad a AOM través de un mecanismo IGF1R-dependiente. Además, ratones LOI (+) son más sensibles a los efectos del bloqueo de IGF1R que lo son los ratones LOI (-), lo que sugiere una sensibilidad incrementada a la señalización de IGF2 en ratones LOI (+) (Figura 7).

Estos resultados, tomados juntos, sugieren una posible estrategia de quimioprevención en la que los pacientes con LOI son tratados con un fármaco diseñado para inhibir la señalización de IGF2, reduciendo así la proliferación incrementada de células progenitoras. Como prueba del experimento principal, se desarrolló un nuevo modelo animal de LOI utilizando el carcinógeno químico azoximetano (AOM) que, a diferencia del modelo Mln, es específico para el colon y la exposición se puede programar después del nacimiento. La cepa C57BI/6 en la que se estableció el modelo de LOI desarrolla focos de criptas aberrantes (ACF), que son lesiones de la mucosa con diversos grados de multiplicidad de criptas, elevación y ampliación. Esta cepa es no tumoral, pero idealmente es adecuada para el estudio de las etapas tempranas del desarrollo del tumor, que es el objetivo presunto de LOI, así como la estrategia quimiopreventiva de los autores de la invención. ACFs se han utilizado como un modelo para tumores intestinales de roedores durante dos décadas (Schoonjans et al, Proc Natl Acad Sci USA (2005) 102:2058-2062; Osawa et al, Gastroenterology (2003) 124:361-367). Ejemplo 3. LOI provoca una Potenciación a Largo Plazo de señalización Akt en respuesta a Igf2.

Para determinar si las células de ratones LOI (+) por sí mismas difieren en la sensibilidad de IGF2, se desarrolló un nuevo alto rendimiento de ensayo de transducción de señales en base a un dispositivo de automatización de inmunotinción que comprende cámaras microfluídicas que albergan múltiples células (Wang et al., en la 10ª Conferencia Internacional sobre Sistemas Miniaturizados de Química y Ciencias de la Vida (MicroTAS2006) (Tokio, Japón, 2006). Una ventaja del chip microfluídico es que todas las células pueden cultivarse simultáneamente en el mismo chip y bajo condiciones idénticas, con un exquisito control del medio celular a lo largo del tiempo del experimento y el subsiguiente análisis, lo que permite un número mucho mayor de mediciones de lo que sería ser posible por medios convencionales. El dispositivo se construyó dentro de un chip de PDMS de 2 capas monolítico sellado con un cubreobjetos de vidrio, con un suministro de medios definido controlado por un sistema multiplexado de válvulas. Se examinó Akt/PKB, un objetivo conocido y bien caracterizado de la activación de IGF2, y para este propósito se derivaron líneas de fibroblastos de embrión de ratón (MEF) de embriones LOI (+) y LOI (-). Las líneas MEF fueron escogidas frente a las células madre embrionarias en este análisis para facilitar el examen de células individuales en cámaras microfluídicas en lugar de en colonias densas. Células LOI (+) y LOI (-) vivas se estimularon dentro de los chips con dosis variables de IGF2, con las mediciones de Akt/PKB en múltiples momentos y la concentración de IGF2. Para cada tipo de célula, la concentración de IGF2, y el momento, se obtuvieron al menos 200 mediciones celulares individuales mediante formación de imágenes digitales y análisis, proporcionando una amplia información para la evaluación estadísticamente significativa tanto de la respuesta media como de la variabilidad célula-célula. Los resultados fueron consistentes con el análisis de la variación chip a chip, utilizándose dos chips para cada línea celular. Como lectura se utilizó la inmunotinción de la Akt fosforilada nuclear (Ser 473, Upstate). Estudios anteriores han revelado una importancia de Akt para la regulación del ciclo celular, con actividad sostenida implicado en la transición mediada por factor de crecimiento a través de G1 (Jones et al, Curr Biol (1999) 9:512-521).

IGF2 desencadenó una señal de activación de Akt transitoria (pico en 10 a 40 minutos, seguido de un retorno a la línea de base dentro de 90 min) en células LOI (-) (Figura 8A) en todas las concentraciones sometidas a ensayo (400, 800 y 1.600 ng/ml), equiparable a los niveles utilizados para apoyar las células madre hematopoyéticas de hígado fetal de ratón (500-1000 ng/ml) (Zhang y Lodish, Blood (2004) 103:2513-2521). En contraposición, cuando se someten a la concentración más baja (400 ng/ml) de Igf2, las células LOI (+) mostraron una activación de Akt marcadamente sostenida (> 120 minutos), que aumentó constantemente con el tiempo después de la estimulación (Figura 8A). A dosis más altas de IGF2, la señal de Akt en las células LOI se convirtió cada vez más transitoria y menos pronunciada. Estos resultados demuestran que las células LOI (+) tienen una sensibilidad mejorada a IGF2 en dosis más bajas, y podrían ayudar a explicar la mayor sensibilidad de ratones LOI (+) para la inhibición de IGF1R.

Ejemplo 4. El Incremento Relacionado con la LOI de la Expresión Génica Relacionada con la Proliferación es Diferencialmente Sensible a la inhibición de IGF1R.

Anteriormente se había demostrado que la LOI conduce a un aumento en el compartimiento de células progenitoras en células de las criptas de ratones Mln (Sakatani et al. (2005)), pero el mecanismo era desconocido. Por lo tanto, se buscó determinar qué cambios en la expresión génica se producen en células progenitoras epiteliales

gastrointestinales en ratones LOI. La expresión génica se mide en criptas microdiseccionadas de captura por láser, comparando 8000 criptas de cada uno de 3 ratones LOI (+) y 3 ratones LOI (-) en microarrays. 283 genes mostraron una expresión incrementada y 109 genes mostraron una expresión disminuida (Tabla 3, supra). La anotación GO mostró una sobre-representación de genes que muestran una expresión incrementada implicada con la replicación de ADN (P < 10-15), el metabolismo de ADN (P < 10-15), el ciclo celular (P < 10-9) y la proliferación celular (P < 10-9) (Tablas 3 y 6), en consonancia con observaciones anteriores de células progenitoras incrementadas en ratones LOI (+) (Sakatani et al., (2005)).

Tabla 6. Lista de Genes con Diferencia Significativa (P < 0,01) en Análisis de Microarray de criptas Microdiseccionadas de Captura por Láser (Sub-regulación en cripta LOI(-)).

Caracterizado: Media (H19mu t, LOI +) Media (H19ts , LOI-) Relación Log Veces de Cambio PPFDR Símbolo ruidoso Anotación Índice de Genes Racimo 'U' RefSeqA cc AccGenBank MGI

Z00027742 -1: 3.5267 3.848 5 -0.321 8 2.097 0 0.0005 0 Grin2d Receptor de glutamato, ionotrópico, NMDA2D (epsilon 4) U02854 6 NM_0081 72.1 AK077611 MGI: 95823

Z00005302 -1: 3.12 3.352 59 -0.232 59 1.708 0 0.0015 0 Cdknla Inhibidor de quinasa 1A dependiente de ciclina (P21) U01776 1 NM_0076 69.2 AB017817 MGI: 104556

Z00041932 -1: 2.7672 2.927 6 -0.160 4 1.446 0 0.0075 0 Ahnak Nucleoproteína de Mus musculus AHNAK (desmovoki na) U16883 7 AK003448 MGI: 131664 8

Z00027819 -1: 3.106 3.254 -0.148 1.406 0 0.0306 0 Gm502 Modelo de gen 502, (NCBI) U00944 0 XM_1463 97.2 BC010572 MGI: 268534 8

Z00011777 -1: 2.9645 3.133 59 -0.169 09 1.476 0 0.0331 0 A630082 K20Ri k Gen RIKEN cDNA A630082K2 0 U02720 0 XM_1452 54.4 AK035529

Z00021589 -1: 3.2141 3.386 99 -0.172 89 1.488 0 0.0463 0 Map3k6 Proteína quinasa quinasa quinasa-6 activada por mitógeno U00491 5 NM_0166 93.2 AB021861 MGI: 185569 1

Z00039323 -1: 2.6312 2.768 89 -0.137 69 1.373 0 0.0664 0 A930008 A22Ri k Gen RIKEN cDNA A930008A2 2 U03073 7 NM_1727 68.1 AK020827

Z00013598 -1: 3.1007 3.244 6 -0.143 9 1.392 0 0.0717 0 Skiip Proteína interactuante SKI U03421 4 NM_0255 07.1 AK009218 MGI: 191360 4

Z00044310 -1: 3.0685 3.289 3 -0.220 8 1.662 0 0.0937 0 1700011 H14Ri k Gen RIKEN cDNA 1700011H1 4 U03549 1 NM_0259 56.2 AK005866

Z00035971 -1: 2.8825 3.006 6 -0.124 1 1.33 0.0001 0 Ckap4 Proteína 4 asociada al citoesqueleto U03207 5 XM_1258 08.5 AK030708 MGI: 244492 6


: 0.1121

Z00064631 -1: 2.6715 2.793 69 -0.122 19 1.324 0.0001 0





: 0.1194

Z00063868 -1: 2.5884 2.713 69 -0.125 29 1.334 0.0002 0 Herc5 Dominio hect de Mus musculus y RLD 5 (Herc5), ARNm U00693 0 NM_0259 92.1 AK007221 MGI: 191438 8





: 0.1607

Z00005771 -1: 3.5523 3.768 3 -0.216 1.644 0.0002 0 Klf6 Factor 6 tipo Kruppel U01451 7 NM_0118 03.1 AF072403 MGI: 134631 8





: 0.1655

Z00057298 -1: 2.6089 2.731 29 -0.122 39 1.325 0.0002 0 AI9876 secuencia AI987662 expresada U04103 7 NM_1788 99.3 AK033728





: 0.1801 62

Z00060167 -1: 3.8979 4.070 59 -0.172 69 1.488 0.0003 0 Chmp4 Proteína 4B modificador a de cromatina U00269 1 NM_0293 62.2 AK008205





: 0.2387 b

Z00055119 ~1: 2.6125 2.732 4 -0.119 9 1.317 0.0003 0 9530033 F24Ri k Gen RIKEN cDNA 9530033F2 4 de Mus musculus (9530033F2 4Rik ) U01323 1 NM_2016 09.1 AK053008





: 0.2387

Z00031167 -1: 2.6209 2.735 8 -0.114 9 1.302 0.0004 0 Xlr Complejo (XIr) regulado en linfocitos enlazado a X de Mus musculus U04738 3 NM_0117 25.2 AK012549

Z00059181 -1: 2.6076 2.766 09 -0.158 49 1.44 0.0005 0 AA53674 9 Secuencia AA536749 expresada de Mus musculus (AA536749) U01268 7 NM_0120 27.1 AB093269 MGI:13 49438

Z00047700: 2.9974 3.148 - 1.417 0.0005 0 Gen RIKEN U03276 NM_1831 AK043538

-1: 89 0.151 49 A830006 N08Ri k cDNA A830006N0 8 de Mus musculus (A830006N 08Ri k) 2 73.1





: 0.2551

Z00042720 -1: 3.1281 3.251 5 -0.123 4 1.328 0.0005 0643052 7G18 Rik Gen RIKEN cDNA 6430527G1 8 U03420 0 NM_1458 36.1 AF525300





: 0.2551

Z00021452 -1: 4.1943 4.368 69 -0.174 39 1.494 0.0005 0 Gdpd1 Dominio de glicerofosfodiéster fosfodiester asa que contiene 1 U93323 3 NM_0256 38.1 AK011487





: 0.2588

Z00033810 -1: 3.137 3.302 -0.165 1.462 0.0006 0





: 0.2903

Z00027804 -1: 2.7244 2.936 1 -0.211 7 1.628 0.0006 0 Gpr120 Receptor 120 acoplado a proteína G de Mus musculus (Gpr120) U10086 6 NM_1817 48.1 AB115769

Z00041224 -1: 3.2239 3.396 7 -0.172 8 1.488 0.0006 0 BC02507 6 Secuencia de ADNc BC025076 U10495 7 AK087807





: 0.3018

Z00025480 -1: 2.5353 2.664 6 -0.129 3 1.346 0.0007 0.3319 0 Bmper Regulador endotelial de unión a BMP U01017 0 NM_0284 72.1 AF454954 MGI: 192048 0

Z00004154 -1: 2.8682 2.980 4 -0.112 2 1.294 0.0008 0 Ssfa2 antígeno 2 específico para esperma U00196 4 NM_0805 58.3 AB093303 MGI: 191784 9





: 0.3335

Z00024307 -1: 2.8206 2.931 19 -0.110 59 1.29 0.0008 0 Ly6d Complejo de linfocitos antígeno 6, U03629 0 NM_0107 42.1 BC025135 MGI: 96881







: locus D





: 0.3457

Z00040747 -1: 2.9132 3.081 8 -0.168 6 1.474 0.0009 0 B430201 A12Ri k Gen RIKEN cDNA B430201A1 2 U02453 9 XM_2839 03.2 AK005412





: 0.349

Z00040571 -1: 2.5402 2.646 59 -0.106 39 1.277 0.0009 0 Atp8bl ATPasa, clase I, tipo 8B, miembro 1 U38499 NM_0010 01488.1 AF395823 MGI: 185966 5





: 0.3646

Z00026784 -1: 2.974 3.088 09 -0.114 09 1.3 0.001 0 Naaladl 1 Dipeptidasa tipo 1 acídica alfaenlazada Nacetilada U08539 0 NM_0010 09546.1

Z00042521 -1: 4.2784 4.500 09 -0.221 69 1.666 0.0011 0 1110006 O24Rik Gen RIKEN cDNA 1110006O2 4 U02663 6 NM_0214 17.1 AB041800





: 0.3834

Z00016189 -1: 2.6902 2.820 19 -0.129 99 1.348 0.0012 0 Thbs1 tromboespondina 1 U00227 5 NM_0115 80.2 AK080686 MGI: 98737





: 0.3878

Z00064702 -1: 2.6282 2.735 19 -0.106 99 1.279 0.0012 0





: 0.3878

Z00023675 -1: 2.5968 2.705 09 -0.108 29 1.283 0.0013 0 Cd3g Antígeno CD3, polipéptido gamma U03078 9 NM_0098 50.1 BC027528 MGI: 88333





: 0.3949

Z00008387 -1: 3.3617 3.482 5 -0.120 8 1.32 0.0013 0 D16Ertd 480e Segmento de ADN, Chr 16, ERATO Doi 480, expresado U01716 2 NM_1445 50.2 AK048789





: 0.405

Z00058668 -1: 2.7168 2.841 -0.124 2 1.331 0.0015 0 2410195 B05Rik Gen RIKEN cDNA 2410195B0 5 U00618 5 NM_0302 41.1 AK008845





: 0.4327

Z00029694 -1: 3.8014 4.083 4 -0.282 1.914 0.0015 0 5730442 P18Rik Gen RIKEN cDNA 5730442P1 8 U01341 5 AF215666

200015708 -1: 2.9609 3.080 09 -0.119 19 1.315 0.0016 0 Elovl7 Miembro 7 de familia ELOVL, elongación de ácidos grasos de cadena larga (levadura) U01523 4 NM_0290 01.2 AK018616





: 0.4486

Z00027266 -1: 2.5555 2.658 9 -0.103 4 1.268 0.0017 0 4930535 E21Rik Gen RIKEN cDNA 4930535E2 1 U03093 2 NM_0292 12.1 ABO48860 MGI: 192246 4





: 0.4579

ZO003244 4~1: 2.7836 2.886 8 -0.103 2 1.268 0.0019 0 Mylc2b Cadena ligera de miosina, regulador B U03803 7 NM_0234 02.1 AK002885 MGI: 107494





: 0.5016

Z00014295 -1: 3.141 3.250 59 -0.109 59 1.287 0.0019 0 Hsd12 Deshidrogenasa hidroxiesteroide tipo 2 U00438 1 NM_0242 55.1 AJ293845





: 0.5061

Z00024114 -1: 2.5759 2.703 5 -0.127 6 1.341 0.002 0 Cdx1 caudal tipo caja homeo 1 U03846 5 NM_0098 80.2 BC019986 MGI: 88360





: 0.5224

Z00009280 -1: 3.419 3.543 -0.124 1.33 0.0021 0 Nhsl1 NHS-tipo 1 U01130 5 NM_1733 90.2 AK043447 MGI: 106390





: 0.5336

Z00023930 -1: 2.835 2.977 5 -0.142 1.388 0.0021 0 Gdf15 factor 15 de diferenci- U02992 4 NM_0118 19.1 AF159571 MGI: 134604



: 5 ación de crecimiento 7

Z00025459 -1: 2.8792 2.979 2 -0.1 1.258 0.0027 0 Arid3a Dominio 3A interactivo rico en AT (tipo Bright) U01173 0 NM_0078 80.1 AK034824 MGI:13 283.60





: 0.6414

Z00006544 -1: 3.4135 3.533 79 -0.120 29 1.319 0.0027 0 Npepps Aminopepti dasa sensible a puromicina U03333 7 NM_0089 42.1 BC009653 MGI: 110135 8





: 0.6414

Z00024111 -1: 3.3292 3.437 8 -0.108 6 1.284 0.0028 0 Syt10 sinaptotagmina 10 U10564 9 NM_0188 03.1 AK051232





: 0.6568

Z00033010 -1: 2.7361 2.829 8 -0.093 7 1.24 0.0029 0 Efemp2 Factor de crecimiento epidermal que contiene proteína 2 de la matriz extracelular tipo fibulina U05137 6 NM_0214 74.2 AF104223 MGI: 189120 9





: 0.6608

Z00056587 -1: 2.6828 2.790 9 -0.108 1 1.282 0.0032 0 1810003 N24Ri k Gen RIKEN cDNA 1810003N2 4 U03253 6 NM_0254 43.1 AF349950





: 0.7043

Z00057248 -1: 2.6492 2.774 5 -0.125 3 1.334 0.0033 0 Xlr Complejo regulado en linfocitosX(XIr) enlazado de Mus musculus U04009 6 NM_0275 10.1

Z00023103 -1: 2.9645 3.087 49 -0.122 99 1.327 0.0033 0 Clic5 Canal 5 intracelular de cloruro U04360 5 NM_1726 21.1 AK017800





: 0.7043

Z00060328 -1: 3.1619 3.321 99 -0.160 09 1.445 0.0033 0 Bzwl Dominios 1 de cremallera y W2 de leucina básicos U00030 6 NM_0258 24.2 AK004784





: 0.7116

Z00036150 -1: 3.1027 3.208 29 -0.105 59 1.275 0.0034 0 Fcgrt Receptor Fc, IgG, transportad or de cadena alfa U02851 4 NM_0101 89.1 AK008167 MGI:10 3017





: 0.7116

Z00060861 -1: 2.5462 2.645 2 -0.099 1.256 0.0034 0 1810047 C23Ri k Gen RIKEN cDNA 1810047C2 3 U00930 9 NM_1386 68.1 AK075795





: 0.7166

Z00062597 -1: 2.7107 2.803 59 -0.092 89 1.238 0.0038 0 Fst Foliistatina U03519 9 NM_0080 46.1 AK079 916





: 0.7706

Z00068378 -1: 3.2094 3.354 6 -0.145 2 1.397 0.0039 0 U05889 6





: 0.7736

Z00022408 -1: 3.4615 3.574 3 -0.112 8 1.296 0.0039 0 Cited2 Transactivador interactuante Cbp/p300, con dominio carboxiterminal rico en Glu/Asp, 2 U01129 6 NM_0108 28.1 AK177398 MGI:13 06784

Z00022297 -1: 2.9252 3.022 8 -0.097 6 1.251 0.004 0 Rhoj Familia de genes homólogos ras, miembro J U01409 6 NM_0232 75.1 ABO60651 MGI:19 31551





: 0.7784

Z00003251 -1: 2.7864 2.881 2 9 -0.094 89 1.244 0.0041 0 UI-M-FY0ccp-j-21-0Ul.r1 NIH_BMAP _FY 0 Mus musculus cDNA clon IMAGE:682 2742 U27106 8





: 0.7806

Z00001120 -1: 2.7223 2.813 2 9 -0.090 99 1.233 0.0042 0 Thop 1 thimct oligopeptidasa 1 U01177 3 NM_0226 53.2 AF314187 MGI:13 54165





: 0.7925

Z00015596 -1: 2.922 3.129 1 9 -0.207 19 1.611 0.0044 0 Oact 1 1 que contiene el dominio Oaciltransferasa (unido a membrana) U01469 2 NM_1535 46.1 AK020281

Z00055229 -1: 2.8801 3.009 3 9 -0.129 29 1.346 0.0044 0 LOC38 0843 PREDICHO : Mus musculus similar a proteína FLJ30829 hipotética U01479 4 XM_3547 52.2





: 0.7972

Z00061294 -1: 2.8519 2.948 3 9 -0.096 49 1.248 0.0044 0





: 0.8005

Z00036109 -1: 2.5678 2.66 -0.092 2 1.236 0.0046 0 Lamb1-1 Subunidad 1 de laminina B1 U01383 7 NM_0084 82.1 AK013952 MGI:96 743





: 0.8062

Z00018830 -1: 2.8117 2.905 0 9 -0.093 39 1.239 0.0047 0 C1r componente 1 del complement o subcomponente r U02077 9 NM_0231 43.1 AF148216





: 0.8062

Z00016016 -1: 2.9404 3.066 3 9 -0.125 99 1.336 0.0047 0 Plec1 plectina 1 U03633 6 NM_0111 17.1 AF188006 MGI:12 77961





: 0.8062

Z00058245 -1: 3.2352 3.336 7 -0.101 5 1.263 0.0048 0 LOC38 2906 PREDICHO : Mus musculus similar a Ac2-008 (LOC38290 6), ARNm U05629 2 XM_3567 44.1

Z00059003 -1: 2.6504 2.751 3 -0.100 1.261 0.0056 0 Slit2 Homólogo 2 slit U00556 4 NM_1788 04.2 AF074960 MGI:13 15205



: 9 (Drosophila)





: 0.8199

Z00009502 -1: 2.5168 2.610 7 9 -0.093 99 1.241 0.0057 0 Hspb1 proteína 1 de choque térmico U00629 5 NM_0135 60.1 AF047377 MGI:96 240





: 0.8199

Z00034606 -1: 3.1133 3.226 4 9 -0.113 19 1.297 0.0055 0 Kdelr2 Receptor 2 de retención de proteínas del retículo endoplásmico KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) U00640 5 NM_0258 41.1 AJ278133





: 0.8199

Z00020266 -1: 3.3706 3.479 9 9 -0.109 39 1.286 0.005 0 Arfrp2 Proteína 2 relacionada con factor de ribosilación ADP U01526 5 NM_1725 95.1 AK039965





: 0.8199

Z00060766 -1: 2.6172 2.707 9 -0.090 7 1.232 0.0057 0 1300007 B12Ri k Gen RIKEN cDNA 1300007B1 2 U02178 5 NM_0205 88.1 AB041592





: 0.8199

Z000386 71-1: 2.6457 2.733 39 -0.087 69 1.223 0.005 0 D5Bwg 0834e Segment de ADN, Chr 5, expresado Brigham & Women's Genetics 0834 U02673 9 NM_1448 19.1 AK028192

Z00056132 -1: 3.3804 3.490 4 -0.11 1.288 0.0057 0 Wasl Tipo síndrome de Wiskott-Aldrich (humano) U02708 7 NM_0284 59.1 AJ318416 MGI:19 20428





: 0.8199

Z00024939 -1: 2.5325 2.655 19 -0.122 69 1.326 0.0049 0 Irf7 Factor 7 regulador de de interferón U02945 1 NM_0168 50.1 AK002830





: 0.8199

Z00015996 -1: 2.7647 2.851 5 -0.086 8 1.221 0.0052 0 Akap2, Palm2 Una proteína 2 de anclaje a quinasa (PRKA) U04253 5 NM_0096 49.1 AF033274 MGI:13 06795





: 0.8199

Z00068882 -1: 2.5079 2.603 4 -0.095 5 1.245 0.005 0 LOC432 634 PREDICHO : Mus musculus LOC432634 (LOC43263 4), ARNm U09205 8 NM_4886 25.1





: 0.8199

Z00066890 -1: 2.6898 2.780 5 -0.090 7 1.232 0.0054 0 Clon de ADNc de cerebro de Mus musculus macho adulto enriquecido de longitud completa BY 122082 RIKEN L630004J03 U14983 1

Z00055441 -1: 3.4335 3.542 6 -0.109 1 1.285 0.0061 0 Atp6v0c ATPasa, transportador de H+, subunidad V0 U01770 9 NM_0252 72.2 AK007610





: 0.8288

Z00005843 -1: 3.8481 4.038 49 -0.190 39 1.55 0.0061 0 Aphla Homólogo defectuoso 1a de la faringe anterior (C. elegans) U02195 8 AK178736





: 0.8288

Z00043229 -1: 3.0792 3.190 29 -0.111 09 1.291 0.006 0 2600009 E05Rik Gen RIKEN cDNA 2600009E0 5 U02336 1 XM_4850 67.1 AK011170





: 0.8288

Z00007361 ~1: 2.5133 2.606 39 -0.093 09 1.239 0.0062 0 E130014 J05Rik Gen RIKEN cDNA E130014J0 5 U02467 3 AK033781





: 0.8288

Z00035126 -1: 3.0869 3.188 -0.101 1 1.262 0.0062 0 Wasl Tipo síndrome Wiskott-Aldrich (humano) U02708 7 NM_0284 59.1 AJ318416





: 0.8288

Z00060705 -1: 2.8653 2.990 4 -0.125 1 1.333 0.0062 0 Cd2ap Proteína asociada a CD2 U03781 9 NM_0098 47.2 AF077003





: 0.8288

Z00067827 -1: 2.8661 2.956 8 -0.090 7 1.232 0.0062 0





: 0.8288

Z00030081 ~1: 2.9433 3.112 3 -0.169 1.475 0.0062 0





: 0.8288

Z00063055 -1: 2.9086 3.016 2 -0.107 6 1.281 0.0066 0 Clon de ADNc de Mus musculus U00931 4 AB120968

Z00023416 -1: 2.72 64 2.811 7 -0.085 3 1.217 0.0068 0 Tnfrsf1 4 Superfamili a del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 14 (mediador en la entrada de virus herpes) U02586 4 NM_1789 31.2 AF515707





: 0.8527

Z00021381 -1: 3.26 92 3.381 89 -0.112 69 1.296 0.0068 0 Gyk glicerol quinasa U03951 3 NM_0081 94.2 AK008186





: 0.8601

Z00022714 -1: 3.28 62 3.384 9 -0.098 7 1.255 0.0071 0 Grcc3f Racimo rico en genes, gen C3f U00739 3 NM_1451 30.1 AK083687





: 0.8608

Z00024151 -1: 2.68 91 2.790 4 -0.101 3 1.262 0.007 0 Rasgrfl Factor 1 liberador de nucleotides de guanina específico para proteínas RAS U01084 4 NM_0112 45.1 AF169826

Z00011773 -1: 2.50 31 2.594 8 -0.091 7 1.235 0.007 0 Adamts 2 Una tipo desintegrina y metaloproteasa (tipo reprolisina) con tromboespondina tipo 1 motivo, 2 U01255 5 AK084657





: 0.8608

Z00035615 -1: 3.06 93 3.158 69 -0.089 39 1.228 0.0072 0 Cobl cordon-bleu U03251 8 NM_1724 96.2 AK028833





: 0.8608

Z00066214 -1: 4.02 45 4.168 -0.143 5 1.391 0.0072 0





: 0.8608

Z00043624 -1: 2.55 83 2.708 6 -0.150 3 1.413 0.0073 0 Chmp4b Proteína 4B modificadora de cromatina U00269 1 NM029362.2 AK008205





: 0.8667

Z00040734 -1: 2.84 16 2.944 69 -0.103 09 1.267 0.0073 0 4930432 B04Rik Gen RIKEN cDNA 4930432B0 4 U00212 6 XM_1302 87.6 AK014169





: 0.8701

Z00026828 -1: 3.52 52 3.783 5 -0.258 3 1.812 0.0077 1 E030010 A14 Proteína hipotética de Mus musculus E030010A1 4 (E030010A 14), ARNm U01931 4 NM_1831 60.1 AK086895





: 0.8976

Z00055606 -1: 3.12 44 3.298 19 -0.173 1.492 0.0078 0 Tsx Gen enlazado a U02009 9 NM_0094 40.1 AK018925



: 79 X específico para testículos





: 0.8976

Z00008080 -1: 3.19 37 3.383 99 -0.190 29 1.549 0.008 0 Prkcbp1 Proteína 1 de unión a proteína quinasa C U02366 4 NM_0272 30.2 AB093284





: 0.8993

Z00057842 -1: 2.77 6 3.220 9 -0.444 9 2.785 0.008 1 Nptx2 Pentraxina 2 neuronal U13088 3 NM_0167 89.2 AF049124





: 0.8993

Z00025293 -1: 2.95 41 3.043 -0.088 9 1.227 0.008 0 Gdf1,Las s1 Factor 1 de diferenciación del crecimiento U12772 2 NM_0081 07.2 AK053885





: 0.9032

Z00030376 -1: 2.9933 3.104 39 -0.111 09 1.291 0.0083 0 2700062 C07Rik Gen RIKEN cDNA 2700062C0 7 U01848 2 NM_0265 29.2 AK011228





: 0.9164

Z00049596 -1: 2.7014 2.842 6 -0.141 2 1.384 0.0083 0 9130218 O11Rik Gen RIKEN cDNA 913021801 1 U03636 9 NM_1778 20.2 BC038135





: 0.9164

Z00054220 -1: 3.4174 3.521 9 -0.103 79 1.269 0.0084 0 Dnajb1 0 Homólogo DnaJ (Hsp40), subfamilia B, miembro 10 U00047 0 NM_0202 66.1 AB028858





: 0.9186

Z00016776 -1: 2.8349 2.921 09 -0.086 19 1.219 0.0085 0 Ssb Antígeno B del síndrome de Sjogren U00187 5 NM_0092 78.1 AK017822





: 0.9218

Z00026542 -1: 2.6124 2.703 29 -0.090 89 1.232 0.0086 0 D130060 C09Rik Gen RIKEN cDNA D130060C0 U00235 7 NM_1770 54.3 AK080364







: 9





: 0.9218

Z00036665 -1: 3.5566 3.678 39 -0.121 79 1.323 0.0085 0 Atp2c1 ATPasa, secuestrante de Ca++ U03127 7 NM_1750 25.2 AJ551270





: 0.9218

Z00018373 -1: 3.6543 3.770 09 -0.115 79 1.305 0.0087 0 Smad4 Homólogo 4 de MAD (Drosophila) U03854 9 NM_0085 40.2 AK004804





: 0.9218

Z00019928 -1: 2.6567 2.740 1 -0.083 4 1.211 0.009 0 D330010 C22Rik Gen RIKEN cDNA 330010C22 U02584 1 XM_1318 65.5 AK052224





: 0.939

Z00009274 -1: 3.0732 3.194 39 -0.121 19 1.321 0.0091 0 Sulf2 sulfatasa 2 U02366 7 XM_3583 43.2 AK008108





: 0.9435

Z00032201 -1: 3.3134 3.456 79 -0.143 39 1.391 0.0095 0





: 0.9555

Z00040312 -1: 2.8784 2.966 4 -0.088 1.224 0.0093 0 Abi3 Familia de genes ABI, miembro 3 U03330 9 NM_0256 59.1 AK008928





: 0.9555

Z00057502 -1: 2.9689 3.056 7 -0.087 8 1.224 0.0095 0 Znhit2 Dedo de zinc, dominio HIT que contiene 2 U03870 3 NM_0138 59.2 AF119498





: 0.9555

Z00070092 -1: 2.6803 2.773 49 -0.093 19 1.239 0.0095 0





: 0.9555

Z00006417 -1: 2.4712 2.559 29 -0.088 1.224 0.0096 0 Hs3st3b Sulfato de heparano U03291 5 NM_0188 05.1 AF168992



: 09 1 (glucosamina) 3-0sulfotransferasa 3B1 (Hs3sL3b1) de Mus musculus, ARNm





: 0.9593

Z00006170 -1: 3.2905 3.399 39 -0.108 89 1.284 0.0097 0 Cpne3 copina III U05143 0 NM_0277 69.1 AK017357





: 0.9593

Z00024368 -1: 4.3807 4.939 79 -0.559 09 3.623 0.0099 1 Slc6a9 Familia 6 de soporte de soluto (transportador del neurotransmisor, glicina), miembro 9 U00471 4 NM_0081 35.1 AK014572

Z00036435 -1: 2.6826 2.780 6 -0.098 1.253 0.0099 0 Pcdhal 1 y otros protocadherina alfa 11 U01860 1 NM_0010 0367 1.1 AB008178





: 0.9675

Estos resultados fueron confirmados mediante análisis RT-PCR cuantitativa en tiempo real de 15.000 criptas

adicionales microdiseccionadas de 12 ratones LOI (+) y 9 ratones LOI (-) adicionales (Fig. 2A). La duplicación

prevista de los niveles de ARNm de Igf2 también se confirmó en ratones LOI (+) (Fig. 2A). Los genes de orden

superior que muestran expresión alterada con LOI incluían: Cdc6, 1,55 veces (P = 0,003), un factor esencial de

5 licencia que conduce a la iniciación de la replicación del ADN y el inicio de la fase S (Dutta (1997); Coleman (1996));

Mcm5, 1,47 veces (P = 0,007) y Mcm3, 1,49 veces (P = 0,002), ambos necesarios para la replicación de ADN en la

fase S temprana (18, 19); Chaf1a, 1,61 veces (P = 0,009), que monta el octámero de histona sobre el ADN

replicante (20); Lig1, 1,54 veces (P = 0,008), ADN ligasa implicada en formar parte de fragmentos de Okazaki

durante la replicación del ADN (Tomkinson y Mackey, Mutat Res (1998) 407:1-9); y Cone1 1,38 veces (P = 0,04), 10 que estimula la replicación del conjunto complejo mediante la cooperación con Cdc6 (Coverley et al, Nat Cell Biol

(2992) 4:523-528)) (Fig. 2A, Tabla 4, supra).

Tabla 7. Señalización de Genes diana de Wnt/b-catenina.

Cuatro ratones LOI (+) y cuatro ratones LOI (-) también fueron tratados con NVP-AEW541 para inhibir la señalización de IGF2, a una dosis de 50 mg/kg por sonda gástrica oral diaria durante 3 semanas (dos veces al día todos los días excepto los fines de semana). NVP-AEW541 es un inhibidor ATP-competitivo de IGF-IR que bloquea la señalización en el receptor de IGF1, que media en la señalización de IGF2 (Garcia-Echeverria et al, Cancer Cell (2004) 5:231-239). También se confirmó que ese NVP-AEW541 bloquea IGF2 en IGF1R in vitro (Fig. 9). Curiosamente, NVP-AEW541 tenía un efecto drástico sobre la expresión de genes relacionados con la proliferación en criptas LOI (+), con una reducción a niveles incluso más bajos que los observados en criptas LOI (-) (5 de 6 genes estadísticamente significativos): Cdc6, 0,49 veces (P = 0,048); Mcm5, 0.48 veces (P = 0,007); Mcm3, 0,65 veces (P = 0,1); Chaf1a, 0,42 veces (P = 0,010); Lig1, 0,42 veces (P = 0,029); y Ccne1, 0,57 veces (P = 0,030) (Fig. 2B). Por lo tanto, se medió en cambios inducidos por la LOI en la expresión de genes relacionados con la proliferación, al menos en parte, a través de la propia señalización de IGF2. La disminución inducida por el fármaco en la expresión de genes relacionados con la proliferación no se produjo simplemente debido simplemente a los cambios en los números de células en proliferación de las criptas, porque había aproximadamente el mismo número de células en este tratamiento a corto plazo.

Estos resultados implican que la LOI provoca una alteración específica en la expresión génica asociada con la replicación en el epitelio intestinal. No obstante, se observó per se.la expresión incrementada de algunos genes no asociados con la replicación del ADN. Por ejemplo, Card11 (1,44 veces, P = 0,04; Figura 11) es un gen antiapoptótico que actúa a través de la fosforilación de BCL10 y la inducción de NF-κB (Narayan et al, Mol Cell Biol (2006) 26:2327-2336). La expresión de Msi1 también se analizó mediante PCR en tiempo real, ya que el marcador de células progenitoras codificadas Musashi-1 mostró una inmunotinción incrementada en estudios previos. La expresión o Msi1 también se incrementó significativamente (1,49 veces, P = 0,01, Fig. 11), apoyando un mecanismo pleiotrópico para IGF2 en LOI. Además, varios genes mostraron regulación a la baja en criptas LOI (+) (Tabla 2, supra), incluyendo p21 (0,55 veces, P = 0,007, Fig. 11), un inhibidor del progreso del ciclo celular (Gartel et al., Proc Soc Exp Biol Med (1996) 213:138-149).

Ejemplo 5.

Sensibilidad Mejorada de la Red de Señalización de IGF2 en LOI.

Los experimentos in vivo descritos condujeron a la determinación de si células LOI (+) tienen una sensibilidad diferencial a IGF2 y el NVP-AEW541, en que se realizó un ensayo de transducción de señales de alto rendimiento basado en un dispositivo de automatización de inmunotinción que comprende cámaras microfluídicas que albergan múltiples células. Una ventaja del chip microfluídico es que todas las células pueden cultivarse simultáneamente en el mismo chip y bajo condiciones controladas internamente, con determinación precisa del micro-entorno de la célula durante el tiempo del experimento y el subsiguiente análisis, lo que permite un número mucho mayor de mediciones de lo que sería posible por medios convencionales. El dispositivo se construyó dentro de un chip de PDMS de 2 capas monolítico sellado con un cubreobjetos de vidrio, con un suministro de medios definidos controlado por un sistema multiplexado de válvulas. También se examinó la señalización de Akt/PKB y Erk2, dos vías de señalización canónicas activadas por IGF2, después de haber derivado para este propósito líneas de fibroblastos de embrión de ratón (MEF) de embriones LOI (+) y LOI (-). Células vivas LOI (+) y LOI (-) fueron estimuladas con dosis variables de IGF2, durante períodos de tiempo variables, se fijaron y procesaron para mediciones de Akt/PKB, con todas las etapas realizadas dentro del chip.

Para cada uno de los tipos de célula, concentración de IGF2, y momentos, al menos 200 mediciones celulares individuales se obtuvieron mediante formación de imágenes digitales y análisis, proporcionando una amplia información para la evaluación estadísticamente significativa tanto de la respuesta media como de la variabilidad célula-célula. Los resultados fueron consistentes en el análisis de la variación chip a chip, utilizándose dos chips para cada una de las líneas celulares. Como se leyó, los autores de la invención utilizaron la inmunotinción de la Akt fosforilada nuclear (Ser 473) debido a su actividad nuclear en la regulación de FOXO (Shao et al, EMBO J (1999) 18:1397-1406) y otras proteínas control del progreso del ciclo celular, así como posibles interacciones con modificadores de la modulación de histonas (García Echeverria et al, Cancer Cell (20040). 5:231-239).

IGF2 desencadenó una señal de activación de Akt transitoria (pico en 10 a 40 minutos, seguido de un retorno a la línea de base dentro de 90 min) en células LOI(-) (Fig. 8A) en todas las concentraciones ensayadas (400, 800 y 1600 ng/ml), comparable a los niveles utilizados para apoyar las células madre hematopoyéticas de hígado fetal de ratón (500-1000 ng/ml) (Zhang y Lodish (2004)). En contraposición, cuando se someten a la más baja concentración (400 ng/ml) de IGF2, las células LOI (+) mostraron una activación de Akt acusadamente sostenida (> 120 minutos), que aumentó de manera constante en el tiempo después de la estimulación (Fig. 8A). A dosis más altas de IGF2, la señal de Akt en células LOI(+) se convirtió progresivamente más transitoria y menos pronunciada (Fig. 8A). Además de ello, si NVP-AEW541 se añadió junto con IGF2, la activación de Akt se inhibió a los niveles de la línea base en células LOI(-) y significativamente por debajo de la línea base en células LOI (+) (Fig. 8B). Las diferencias de señalización en Erk2 entre LOI (-) y LOI (+), aunque estadísticamente significativas, eran muy pequeñas en

comparación con el efecto de LOI sobre la activación de Akt (Fig. 8C), lo que sugiere que Akt tiene un papel particularmente importante en la respuesta de IGF2 en estas células. Estos resultados demuestran que la respuesta de Akt en células LOI (+) ha mejorado la sensibilidad a IGF2 en dosis más bajas, así como la hipersensibilidad a la inhibición de IGF1R.

Un mecanismo potencial de esta hipersensibilidad podría basarse en la expresión diferencial de los componentes de la red de señalización subyacente, p. ej., el receptor de IGF1, que es el receptor de señalización primario para IGF2,

o miembros de la familia de receptores de insulina sensibles a IGF2 (33). Se analizó la expresión de Igf1r, IgJ2r, cuyo producto proteico es un sumidero para IGF2 e Insr, en MEFs que muestran la respuesta de señalización alterada. Sorprendentemente, se observó una duplicación de la expresión de Igf1r e Insr en células LOI (+) (Fig. 8D). Aunque, las razones de la expresión alterada de Igf1r e Insr no son claras en este punto, este cambio en la expresión de estos receptores proporciona un modelo intrigante para alteraciones en la sensibilidad de señalización en LOI.

Ejemplo 6.

La LOI Incrementa la Formación de Lesiones Premalignas en el Modelo de AOM/LOI, que muestra una Sensibilidad Incrementada a la Inhibición de la Señalización de IGF2.

Basándose en estos resultados, era de interés determinar si la inhibición de señalización de IGF2 inhibiría la carcinogénesis vivo, o incluso mostraría un efecto quimioprotector mejorado. El tratamiento con NVP-AEW541 requiere una alimentación por sonda dos veces al día, y los ratones Min desarrollan lesiones durante un período de tiempo más largo de lo que era en la práctica para el uso de este fármaco. Además, una limitación del modelo Min es que no refleja la situación humana, en la que LOI se produce en células normales antes de que esté presente la mutación Apc (Cui et al, Nat Med (1998) 4:1276-1280). De acuerdo con ello, se utilizó el modelo de azoximetano (AOM) en el que se administra el carcinógeno después del nacimiento, y las lesiones premalignas, denominadas focos de criptas aberrantes (ACF), aparecen 5 semanas después de la primera dosis. Una ventaja adicional es que AOM es un modelo de cáncer de colon de roedores ampliamente estudiado (Bissahoyo et al, Toxicol Sci (2005) 88:340-345; Bird (1987)).

Ocho ratones LOI (+) y 14 ratones LOI (-) recibieron AOM por vía intraperitoneal semanalmente durante 3 semanas, se sacrificaron a las 5 semanas después de la primera dosis y los ACFs fueron anotados según se describe (Bird (1987)). El examen histológico de colones de ratones tratados con AOM confirmó la presencia de ACFs, incluyendo características hiperproliferativas el aumento de la mitosis, la ampliación de las criptas y el desorden de las criptas (Fig. 14A, B). Ratones LOI (+) mostraron 19,8 ± 2,2 ACF por colon, en comparación con 12,4 ± 0,9 ACF por colon en ratones LOI (-), un aumento del 60% (P = 0,002; Fig. 14A).

9 ratones LOI (+) y 9 ratones LOI (-) adicionales, compañeros de camada de control a AOM, fueron expuestos de manera similar, añadiendo un tratamiento con NVP-AEW541 para inhibir la señalización de IGF2, a una dosis de 50 mg/kg por alimentación por sonda oral diaria durante 6 semanas (dos veces todos los días excepto diariamente los fines de semana), a partir de una semana antes de la administración de AOM. Ratones LOI (-) no mostraron diferencia alguna en la formación de ACF después del tratamiento con fármacos NVP-AEW541 (11,3 ± 1,6, N.S.; Fig 14A). Sorprendentemente, ratones LOI (+) mostraron una reducción notable en la formación de ACF inducida por AOM después del tratamiento con NVP-AEW541 (7,8 ± 1,2, P = 0,0002; Fig. 14A), significativamente inferior incluso que la observada en ratones LOI (-) tratados con AOM (P = 0,007).

Dado que la LOI también conduce a un aumento en el peso de nacimiento y, por lo tanto, potencialmente en el tamaño del colon, se normalizó el número de ACFs a superficie específica de colon. Se observó un aumento similar en ACFs en ratones LOI (+), 59% (P = 0,004), al igual que una disminución similar en ratones LOI (+) tratados con el inhibidor, 56% (P = 0,0008), pero no hubo disminución en ACFs con inhibidor en ratones LOI (-) (Fig. 14B). Por lo tanto, la LOI de Igf2 aumentaba la sensibilidad a AOM a través de un mecanismo dependiente de IGF1R, y los ratones LOI (+) eran más sensibles a los efectos del bloqueo de IGF1R que los eran los ratones LOI (-).

Un hallazgo adicional intrigante en ratones LOI (+) tratados con AOM eran criptas dilatadas císticamente revestidas por células alargadas con núcleos atípicos y que contiene desechos necróticos, que eran una reminiscencia de adenomas sésiles aserrados (SSAs) vistos en el colon humano (SI Fig. 13C, D). Los SSAs también muestran una dilatación de las criptas en asociación con una atipia citológica y son actualmente de enorme interés por su asociación reconocida recientemente con el cáncer colorrectal (Sonver et al. (2005)).

Aunque la invención se ha descrito con referencia a los ejemplos anteriores, se entenderá que modificaciones y variaciones están abarcadas dentro del espíritu y alcance de la invención. Por consiguiente, la invención está solamente limitada por las siguientes reivindicaciones.

Desde que se informó que IGF2 causaba la reubicación de β-catenina en el núcleo in vitro y la transcripción activada de genes diana del complejo β-catenina/TCF4 (Morali et al., Oncogene (2001) 20:4942-4950)), se determinó si la señalización de Wnt está activada en criptas intestinales LOI (+). Sin embargo, entre los 36 genes diana de la señalización Wnt/β-catenina, solamente Tiam1, un activador de Rac GTPasa sensible a Wnt (Malliri et al, J Biol 5 Chem (2006) 281:543-548), mostró un valor P menor que 0,0001, y los otros 35 genes no mostraron diferencias significativas entre criptas LOI (-) y LOI (+) (Tabla 7, supra). Además, no se detectó aumento significativo alguno en la RT-PCR en tiempo real de Tiam1 (1,16 veces, P = 0,5), ni era el gen diana Axin2 bien conocido (Yan et al, Proc Natl Acad Sci USA (2001) 98:14973-14978; Vogt et al, Cell Cycle (2005) 4: 908-913 29) (1,19 veces, P = 0,4) (Fig. 10). Por lo tanto, la activación de la señalización de Wnt no parece estar implicada en el aumento de células

10 progenitoras en criptas LOI (+).

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY FEINBERG, Andrew P. LEVCHENKO, Andre LONGO, Dan L. KO, Minoru S.H.

<120> ESTRATEGIA DE QUIMIOPREVENCIÓN DEL CÁNCER BASADA EN LA PÉRDIDA DE LA IMPRONTA DE IGF2

<130> JHU3010-1WO

<150> US 60.873.830

<151>

<160> 39

<170> PatentIn version 3.4

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Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un método de determinar una estrategia de intervención farmacológica para un individuo, comprendiendo el método determinar un estado de pérdida de impronta (LOI) de factor de crecimiento similar a la insulina tipo 2 (IGF2).a partir de una muestra tomada del individuo; y determinar una estrategia de intervención farmacológica para el individuo basada en el estado de LOI determinado, en el que el individuo tiene una LOI y, por lo tanto, tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer colorrectal, la estrategia de intervención comprende administrar al individuo un inhibidor de la activación de la vía de señales mediante IGF2 y, si el individuo no tiene una LOI, la estrategia de intervención no comprende administrar dicho inhibidor al individuo.
2.

Un método de identificar un riesgo incrementado de desarrollar cáncer colorrectal en un sujeto, que comprende:

a) poner en contacto una célula progenitora en una muestra de un sujeto con factor de crecimiento similar a la insulina tipo 2 (IGF2); b) determinar la sensibilidad de IGF2 de la célula progenitora midiendo un cambio en la vía de señales IRS-1/PI3K/AKT o la vía de señales GRB2/Ras/ERK; y c) comparar la sensibilidad de IGF2 de la célula progenitora con la sensibilidad a IGF2 de una célula que carece de una LOI de IGF2; en el que un incremento en la sensibilidad de IGF2 de la célula progenitora en comparación con la célula que carece de una LOI de IGF2 se correlaciona con un riesgo incrementado de desarrollar cáncer colorrectal.
3.

El método de la reivindicación 2, que comprende, además, poner en contacto la célula progenitora con IGF2 en presencia de un inhibidor del receptor de IGF1.
4.

El método de la reivindicación 3, en el que el inhibidor es un agente seleccionado del grupo que consiste en una tifostina, una pirrolo[2,3-d]-pirimidina, y un anticuerpo monoclonal.
5.

Un método de evaluar la eficacia de un régimen quimioterapéutico, que comprende:

a) periódicamente aislar una célula progenitora en una muestra de un sujeto que recibe un producto quimioterapéutico; teniendo o estando el riesgo el sujeto de desarrollar cáncer colorrectal; b) poner en contacto la célula progenitora en la muestra con factor de crecimiento similar a la insulina tipo 2 (IGF2); y c) determinar la sensibilidad de la célula progenitora a IGF2 midiendo un cambio en la vía de señales IRS-1/PI3K/AKT o la vía de señales GRB2/Ras/ERK, en donde una reducción en la sensibilidad a IGF2 en comparación con un nivel previamente determinado de sensibilidad exhibido por una célula progenitora del individuo se correlaciona con una eficacia incrementada del régimen