ES2543166T3 - Composiciones y métodos para modular la actividad de proteínas reguladoras del complemento sobre células diana - Google Patents

Composiciones y métodos para modular la actividad de proteínas reguladoras del complemento sobre células diana Download PDF

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Abstract

Un polipéptido modificado que puede trimerizar y reducir la actividad, cantidad o densidad de una proteína reguladora del complemento (CRP) sobre una superficie de célula diana, en el que el polipéptido tiene al menos el 90 % de identidad de secuencias con la secuencia de botón de fibra de Ad35 de SEC ID Nº: 3 e incluye los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 123-134 de SEC ID Nº: 2, o sustituciones conservativas de los mismos, en el que el polipéptido incluye adicionalmente los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 242, 279, 282 y 302 de SEC ID Nº: 2, y en el que el polipéptido comprende un primer dominio y un segundo dominio con afinidad de unión por CRP, en el que el primer dominio comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 30 o SEC ID Nº: 31, y en la que X1 no es aspartato, X2 no es treonina o X3 no es isoleucina.

Description

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GFP, como se mide por fluorescencia media de GFP de células HeLa 24 horas después de la exposición a MOI crecientes de partículas virales infecciosas de Ad35-GFP, en la que las células HeLa se pre-incubaron con tanto la proteína de botón de fibra recombinante Ad35K-279 (suprimida para unirse a CD46), Ad45K (no mutante) como Ad45K++ (mutante doble que contiene Asp207Gly y Thr245Ala) 72 horas antes de la infección con partículas virales de Ad35-GFP, como se describe en el Ejemplo 2; la FIGURA 3 ilustra gráficamente los niveles relativos de células Raji viables (positivas para CD20, negativas para CD25) como una medida de la citólisis dependiente del complemento (CDC) después de la pre-incubación con solución salina tamponada con fosfato (PBS), mAb anti-CD46 o proteínas de botón de fibra recombinantes Ad35K (no mutante) o Ad35K++ (mutantes dobles que contienen Asp207Gly y Thr245Ala), seguido de la posterior incubación con rituximab (mAb anti-CD20) o daclizumab (mAb anti-25), y seguido de suero humano normal (NHS) que proporciona complemento, en la que los niveles de viabilidad de células Raji se expresan como un porcentaje de la viabilidad media de células sin tratar (N>6), como se describe en el Ejemplo 2; la FIGURA 4A ilustra gráficamente la potenciada CDC mediada por rituximab en líneas celulares positivas para CD20 BJAB, Farage y Mino resultantes de la pre-incubación con proteínas de botón de fibra recombinantes Ad35K (no mutantes) o Ad35K++ (mutantes dobles que contienen Asp207Gly y Thr245Ala), en la que los niveles de viabilidad celular se expresan como un porcentaje de la viabilidad media de células sin tratar (N>6), como se describe en el Ejemplo 2; la FIGURA 4B ilustra gráficamente la potenciada CDC mediada por rituximab en células de linfoma primario de pacientes con leucemia linfocítica crónica (LLC) de linfocitos B después de la pre-incubación con proteínas de botón de fibra recombinantes Ad35K (no mutantes) o Ad35K++ (mutantes dobles que contienen Asp207Gly y Thr245Ala), en la que los niveles de viabilidad celular se expresan como un porcentaje de la viabilidad media de células sin tratar (N>6), como se describe en el Ejemplo 2; la FIGURA 4C ilustra gráficamente que la muestra de células que fue la más resistente a la destrucción por Ad35K++/rituximab (CCL-3) tuvo el menor porcentaje de células CD20+ y los menores niveles de CD20; la FIGURA 4D ilustra gráficamente que el efecto sensibilizador de Ad35K++ sobre células Raji se observó a una dosis de tan solo 25 ng/ml; la FIGURA 5A ilustra gráficamente que los niveles relativos de células positivas para CD20 humanas en la médula ósea de ratones con linfoma de xenoinjerto tratados con una primera inyección de tanto Ad35K-279 (suprimido para unirse a CD46) como Ad35K++ (mutante doble que contiene Asp207Gly y Thr245Ala con unión potenciada a CD46), seguido de una segunda inyección de tanto PBS como rituximab (mAb anti-CD20), en la que los niveles de células positivas para CD20 se midieron 6 horas después de la segunda inyección y se expresan como un porcentaje de células en la médula ósea positivas para CD20, como se describe en el Ejemplo 3; la FIGURA 5B ilustra gráficamente los resultados de un estudio de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones con linfoma de xenoinjerto (que reciben células Raji) tratados con una primera inyección de tanto Ad35K-279 (suprimido para unirse a CD46) como de Ad35K++ (mutante doble que contiene Asp207Gly y Thr245Ala con unión potenciada a CD46), seguido de una segunda inyección de tanto PBS como rituximab (mAb anti-CD20), en la que un grupo de ratones recibió un segundo tratamiento de Ad35K++ / rituximab 48 horas después de la primera inyección de rituximab, como se describe en el Ejemplo 3; las FIGURAS 5C y 5D ilustran gráficamente los resultados de estudios de supervivencia de ratones con linfoma de xenoinjerto (que recibieron células Farage) tratados con una primera inyección de tanto Ad35K-279 (suprimido para unirse a CD46) como de Ad35K++ (mutante doble que contiene Asp207Gly y Thr245Ala con unión potenciada a CD46), seguido de una segunda inyección de tanto PBS como rituximab (mAb anti-CD20), como se describe en el Ejemplo 3; la FIGURA 5E ilustra gráficamente el porcentaje de células positivas para CD20 humanas en médula ósea, ganglios linfáticos o bazo en un modelo de ratón de xenoinjerto inyectado con células Farage humanas, pretratado con Ad35K-279 o Ad35K++, luego se sacrificaron 12 horas después de la administración de tanto PBS como rituximab, como se mide por citometría de flujo, como se describe en el Ejemplo 3; la FIGURA 6 ilustra gráficamente el potenciado efecto de la destrucción de células mediado por CDC observado después de la pre-incubación con proteína de botón de fibra recombinante Ad35K (no mutante) o Ad35K++ (mutante doble que contiene Asp207Gly y Thr245Ala con unión potenciada a CD46), seguido de tratamiento con rituximab en presencia (suero de ratón vacunado con Ad35K++) o ausencia (suero de ratón de control) de anticuerpos reactivos para Ad35K++, que demuestra la ausencia de efecto inhibidor por los anticuerpos anti-Ad35K++ sobre CDC; en la que los niveles de viabilidad celular se expresan como un porcentaje de la viabilidad media de células sin tratar (N>6), como se describe en el Ejemplo 4; la FIGURA 7A ilustra gráficamente el porcentaje de células positivas para CD20 viables cultivadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas (de donantes sanos) después de la incubación con solución salina tamponada con fosfato (PBS), rituximab solo, suero humano normal (NHS), pretratamiento con Ad35K++ más NHS, rituximab más NHS, o pretratamiento con Ad35K++ más rituximab más NHS, como se describe en el Ejemplo 8; la FIGURA 7B ilustra gráficamente el porcentaje de PBMC humanas viables cultivadas con solución salina tamponada con fosfato (PBS), rituximab solo, suero humano normal (NHS), pretratamiento con Ad35K++ más NHS, rituximab más NHS, o pretratamiento con Ad35K++ más rituximab más NHS, como se describe en el Ejemplo 8; la FIGURA 7C ilustra gráficamente el porcentaje de viabilidad celular para células endoteliales vasculares humanas primarias, células epiteliales de la córnea, células epiteliales de ovario o células de fibroblastos de
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Wiley & Sons, New York (2002) para definiciones y términos de la materia.
Las siguientes definiciones se proporcionan para proporcionar claridad con respecto a los términos que se usan en la memoria descriptiva y reivindicaciones para describir la presente invención.
Como se usa en el presente documento, el término “identidad de secuencias” o “porcentaje de idénticas”, como se aplica a moléculas de ácidos nucleicos, es el porcentaje de residuos de ácidos nucleicos en una secuencia de moléculas de ácido nucleico candidata que son idénticas a una secuencia de moléculas de ácido nucleico objeto (tal como la secuencia de moléculas de ácido nucleico expuesta en SEC ID Nº: 4), después de alinear las secuencias para lograr la máxima identidad en porcentaje, y sin considerar ninguna sustitución de residuos de ácidos nucleicos como parte de la identidad de secuencias. No se introducen huecos en la secuencia de ácidos nucleicos candidata con el fin de lograr el mejor alineamiento. La identidad de secuencias de ácidos nucleicos puede determinarse del siguiente modo. La secuencia de moléculas de polinucleótido objeto se usa para buscar en una base de datos de secuencias de ácidos nucleicos, tales como la base de datos Genbank, usando el programa BLASTN versión 2.1 (basado en Altschul et al., Nucleic Acids Research 25:3389-3402 (1997)). El programa se usa en el modo sin huecos. Se usa filtrado por defecto para eliminar homologías de secuencias debido a regiones de baja complejidad como se define en J.C. Wootton y S. Federhen, Methods in Enzymology 266:554-571 (1996). Se utilizan los parámetros por defecto de BLASTN.
Como se usa en el presente documento, el término “identidad en porcentaje” o “porcentaje de idénticas”, cuando se usa a propósito de un polipéptido usado en la práctica de la presente invención, se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia de polipéptidos que son idénticos con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido especificado (tal como la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3), después de alinear las secuencias para lograr la máxima identidad en porcentaje. Cuando se hace la comparación, no se introducen huecos en las secuencias de biomarcador con el fin de lograr el mejor alineamiento. La identidad de secuencias de aminoácidos puede determinarse, por ejemplo, del siguiente modo. La secuencia de aminoácidos de un polipéptido (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3) se usa para buscar en una base de datos de secuencias de proteínas, tal como la base de datos GenBank usando el programa BLASTP. El programa se usa en el modo sin huecos. Se usa filtrado por defecto para eliminar homologías de secuencias debido a regiones de baja complejidad. Se utilizan los parámetros por defecto de BLASTP.
Como se usa en el presente documento, los residuos de aminoácidos se abrevian del siguiente modo: alanina (Ala; A), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), arginina (Arg; R), cisteína (Cys; C), ácido glutámico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V).
Como se usa en el presente documento, el término “afinidad”, en el contexto de la unión de proteínas, se refiere a la intensidad de la interacción entre las proteínas de unión. La intensidad de la unión generalmente resulta de mayor fuerza intermolecular entre las dos proteínas y produce una asociación más fuerte entre ellas.
Como se usa en el presente documento, la abreviatura “Ad” se refiere a un adenovirus y normalmente va seguido de un número que indica el serotipo del adenovirus. Por ejemplo, “Ad35” se refiere al serotipo de adenovirus 35.
Como se usa en el presente documento, el término “polipéptido de fibra” se refiere al polipéptido de fibra de longitud completa expresado por adenovirus (por ejemplo, SEC ID Nº: 2) que comprende un dominio de cola del extremo N, un dominio de mango y un dominio de botón del extremo C. Los polipéptidos de fibra se ensamblan espontáneamente en homotrímeros, denominados “fibras”, que se localizan sobre el exterior del virión de adenovirus en la base de cada uno de los doce vértices de la cápside.
Como se usa en el presente documento, el término “fibra” se refiere a la estructura de proteína homotrímera compuesta de tres polipéptidos de fibra individuales. La fibra de adenovirus media en contacto con, e internalización en, la célula huésped diana.
Como se usa en el presente documento, el término “polipéptido del dominio de botón de fibra” se refiere al dominio del extremo C del polipéptido de fibra que puede formarse en un homotrímero que se une a CD46. Un ejemplo es el dominio de botón de adenovirus de serotipo 35 no mutante expuesto como SEC ID Nº: 3, que también se denomina por la abreviatura “polipéptido de Ad35K.” Como se ilustra en la FIGURA 1B, la porción del extremo C de la proteína de fibra puede trimerizarse y formar una estructura de fibra que se une a CD46.
Como se usa en el presente documento, el término “polipéptido del dominio de botón de fibra de adenovirus modificado” se refiere a un polipéptido que comprende una variante de un dominio de botón de adenovirus no mutante, en el que el polipéptido modificado comprende al menos una adición, deleción o sustitución de aminoácidos
o una combinación de los mismos, en el que el polipéptido modificado puede formar homotrímeros que pueden unirse a CD46. Preferentemente, cualquier mutación de sustitución es conservativa porque altera mínimamente las propiedades bioquímicas. Así, si se introducen mutaciones para sustituir residuos de aminoácidos, residuos
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inmunoglobulina no humana que se trasplanta en una región estructural de anticuerpo humano. Los anticuerpos humanizados normalmente son proteínas recombinantes en las que solo las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo son de origen no humano.
Como se usa en el presente documento, el término “administración sistémica” pretende incluir, pero no se limita a, vías orales y parenterales que incluyen intramuscular (IM), subcutánea, intravenosa (IV), intrarterial, inhalacional, sublingual, bucal, tópica, transdérmica, nasal, rectal, vaginal, y otras vías de administración que producen eficazmente la dispersión del agente administrado a un único sitio o múltiples sitios de acción terapéutica prevista.
PROTEÍNAS REGULADORAS DEL COMPLEMENTO
CD46 (también conocida como proteína cofactor de membrana MCP), CD55 (también conocida como factor de aceleración de la descomposición DAF) y CD59 (también conocida como protectina) se denominan indistintamente proteínas reguladoras del complemento (CRP), proteínas inhibidoras complementarias unidas a la membrana, reguladores del complemento y similares. La mayoría de las células se protegen del complemento por una o más de estas CRP. CD46 y CD55 dirigen el inicio de las vías en la etapa de C3/C5 convertasa. CD59 bloquea la vía del complemento terminal y previene la formación de MAC uniéndose a C8 y C9 durante el ensamblaje de MAC (Meri et al., 1990). Se ha observado la expresión en exceso de CRP, por ejemplo, en muchos tumores primarios y líneas de células tumorales (Fishelson et al., Mol Immunol 40 (2-4):109-23 (2003); Gelderman et al., Lab Invest 82(4):483-93 (2002); Yan et al., (2008)); enfermedades autoinmunitarias y enfermedades por infecciones.
CD46:
CD46 (MCP) es una proteína glicoproteína transmembranaria de tipo 1 expresada sobre las membranas de células nucleadas. La secuencia de proteínas de CD46 humana se proporciona en el presente documento como SEC ID Nº: 14, que se corresponde con el número de acceso de GenBank ABK81636. Desde su extremo amino extracelular, la proteína CD46 humana tiene cuatro módulos de proteína de control del complemento (CCP) en tándem: CCP1 (aa 35-88); CCP2 (aa 99-158), CCP3 (aa 162-224) y CCP4 (aa 228-283), seguido de uno o dos dominios ricos en serina/treonina/prolina (STP) altamente glicosilados en O, un dominio transmembrana y la cola citoplásmica. Los cuatro módulos de CCP forman la principal parte del dominio extracelular de CD46. Las CCP contienen tres sitios de glucosilación ligados en N. Los dominios de STP y el dominio de la cola citoplásmica pueden cada uno experimentar corte y empalme alternativo, produciendo cuatro isoformas humanas principales de CD46 (BC1, BC2, C1 y C2) que oscilan en masa molecular de 55 a 65 kDa (A. Gaggar et al., Journal of Virology 79:7503-7513 (2005)).
CD46 se describió por primera vez por su unión al complemento y propiedades reguladoras (revisado en M.K. Liszewski et al., Advances in Immunology 61:201-283 (1996)). A este respecto, CD46 protege a la célula de la formación de complejos de ataque de la membrana (MAC) sobre la membrana celular. En particular, CD46 se une a los factores del complemento C4b y C3b que están unidos a la membrana celular y actúa de cofactor para su inactivación proteolítica por el factor I de serina proteasa del plasma. Esta interacción está mediada por los dominios CD46 CCP2, CCP3 y CCP4. La inactivación proteolítica previene la formación de MAC sobre la célula en virtud de prevenir la actividad de convertasa C3 (C3a, C3b) y C5 (C5a, C5b) de los factores del complemento unidos (A. Gaggar et al., Journal of Virology 79:7503-7513 (2005)). Adicionalmente, existen dos isoformas humanas de los dominios citoplásmicos de CD46 que tienen funciones opuestas en la regulación de las reacciones inflamatorias inducidas por linfocitos T (J.C. Marie et al., Nature Immunology 3:659-666 (2002)).
Más allá de sus funciones en la regulación de respuestas inmunológicas, CD46 también sirve de receptor para diversos patógenos, que incluyen virus del sarampión, virus del herpes 6 humano y dos tipos de bacterias --Streptococcus pyogenes y Neisseria gonorrhoeae patógena. La proteína hemaglutinina del virus del sarampión interacciona con CCP1 y CCP2 de CD46. CCP2 y CCP3 sirven de diana de unión para el virus del herpes 6 humano y Streptococcus, mientras que CCP3 y un dominio de STP se requieren para la unión de Neisseria (A. Gaggar et al., Journal of Virology 79:7503-7513 (2005)). Adicionalmente, se ha demostrado que CD46 es un receptor de alta afinidad de una serie de serotipos de adenovirus humanos (S. Tuve et al., Journal of Virology 80:12109-12120 (2006); A. Gaggar et al., Nature Medicine 9:1408-1412 (2003); y D. Sirena et al., Journal of Virology 78:4454-4462 (2004)).
Adicionalmente, se ha demostrado que CD46 es un receptor de alta afinidad de una serie de serotipos de adenovirus humanos (S. Tuve et al., Journal of Virology 80:12109-12120 (2006); A. Gaggar et al., Nature Medicine 9:1408-1412 (2003); y D. Sirena et al., Journal of Virology 78:4454-4462 (2004)).
Se ha mostrado que el dominio CCP2 de CD46 media en la unión de dos serotipos de adenovirus --Ad11 y Ad35. En particular, la conformación nativa del dominio CCP2 es crucial para la unión de Ad35, y sustituciones en las posiciones de aminoácidos 130 a 135 ó 152 a 156 sobre el dominio suprimen completamente la unión de Ad35. Se ha sugerido que los diversos patógenos que utilizan CD46 para la unión celular lo hacen así debido a que proporciona a los patógenos la oportunidad de modular la respuesta inmunitaria (R. Cattaneo, Journal of Virology 78:4385-4388 (2004)). Por ejemplo, se ha informado que la reticulación de CD46 en la superficie celular, por tanto anticuerpos multivalentes como por virus del sarampión, induce pseudopodios que engullen el ligando en un proceso
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similar a la macropinocitosis, conduciendo así a la degradación de CD46 de la superficie celular, que a su vez protege a las células de la lisis del complemento (B. Crimeen-Irwin, et al., Journal of Biological Chemistry 278:4692746937 (2003); J. Schneider-Schaulies, et al., Journal of Virology 70:255-263 (1996)).
Los adenovirus son virus de ADN bicatenario no envueltos. Los adenovirus humanos se han clasificado en seis subgrupos (A a F) que contiene hasta 51 serotipos. Los adenovirus del grupo B forman dos agrupaciones genéticas --B1 (que incluye los serotipos Ad3, Ad7, Ad16, Ad21 y Ad50) y B2 (que incluye los serotipos Ad11, Ad14, Ad34 y Ad35) (G. Wadell et al., Annals of the New York Academy of Sciences 354:16-42 (1980)). La mayoría de los adenovirus B1 están principalmente asociados a enfermedad respiratoria aguda y, a diferencia de los adenovirus del grupo C (por ejemplo, Ad5), no establecen persistencia (G. Wadell, Current Topics un Microbiology and Immunology 110:191-220 (1984)). Los serotipos de B2 Ad11p, Ad34 y Ad35 se han asociado principalmente a infecciones de los riñones y las vías urinarias. Los serotipos del grupo B son únicos entre los adenovirus porque no usan receptor de virus de Coxsackie y de adenovirus (CAR) como su receptor de unión primaria. En particular, los serotipos del grupo I de B2, que incluyen Ad16, Ad21, Ad35 y Ad50, usan casi exclusivamente CD46 como receptor; los serotipos del grupo II de B2, que incluyen Ad3, Ad7p y Ad14, usan un receptor todavía sin identificar y no CD46; y finalmente, el serotipo del grupo III de B2 Ad11p usa tanto CD46 como el receptor todavía sin identificar (S. Tuve et al., Journal of Virology 80:12109-12120 (2006)).
El virión de adenovirus es un icosaedro caracterizado por una fibra localizada en la base de cada uno de los 12 vértices de la cápside. La fibra sobre el virión es una estructura homotrímera que consiste en 3 polipéptidos de fibra individuales. Cada polipéptido de fibra de adenovirus es una estructura asimétrica que consiste en: una cola del extremo N, que interacciona con la proteína de base de pentona de la cápside y contiene las señales necesarias para el transporte de la proteína al núcleo de la célula; un mango, que contiene varias unidades de repetición de 15 residuos; y un dominio de botón del extremo C que contiene los determinantes para la unión del receptor (J.S. Hong y J.A. Engler, Journal of Virology 70:7071-7078 (1996)). Adenovirus de todos los grupos, tanto adenovirus que interaccionan con CAR como del grupo B, se unen a sus receptores mediante la estructura de botón sobre el extremo de la fibra (A. Gaggar et al., “CD46 Is a Cellular Receptor for Group B Adenoviruses”, Journal of Natural Medicines 9:1408-1412 (2003)). Se requiere la trimerización de los polipéptidos de fibra para la unión de adenovirus a sus receptores (J.S. Hong y J.A. Engler, Journal of Virology 70:7071-7078 (1996); H. Wang et al., Journal of Virology 81:12785-12792 (2007)). Estudios de fibras de Ad2 mutante demuestran que la trimerización de los polipéptidos de fibra solo requiere porciones del dominio de botón del extremo C y una corta porción del extremo C de la región de mango. Parece que al menos la mitad del extremo N de la fibra puede delecionarse sin afectar la trimerización (J.S. Hong y J.A. Engler, Journal of Virology 70:7071-7078 (1996)).
La estructura específica del dominio de botón de adenovirus se ha determinado para el serotipo Ad5 del grupo C (se une al receptor CAR) (D. Xia et al., Structure 2:1259-1270 (1994)), serotipo Ad11 del grupo B (se une al receptor de CD46) (B.D. Persson et al., Nature Structural & Molecular Biology 14:164-166 (2007)) y serotipo Ad35 del grupo B (se une al receptor de CD46) (H. Wang et al., Journal of Virology 81:12785-12792 (2007)). El dominio de botón homotrímero parece formar una estructura como una hélice de tres palas, por lo que cada pala (es decir, dominio de botón individual) contiene múltiples hojas beta muy compactadas (marcadas A a J). La cristalización del botón de fibra de Ad11 recombinante unido a los dominios de CD46 CCP1 y CCP2 revelaron tres regiones de contacto críticas dentro de los bucles F-G, H-I y I-J del dominio de botón de fibra (B.D. Persson et al., Nature Structural & Molecular Biology 14:164-166 (2007)). Este modelo está soportado por estudios que demuestran que la unión del virus Ad11 a CD46 puede suprimirse por la introducción de una sustitución de un único aminoácido (Arg279Gln) dentro del bucle H-I de Ad11 (D.J. Gustafsson et al., Journal of Virology 80:1897-1905 (2006) [corrección del autor, 80:5101.]).
Los estudios de cristalización y mutación han iluminado regiones críticas del botón de fibra de Ad35 para la unión a CD46, conduciendo a un modelo de interacción con CD46 del dominio de botón de fibra de Ad35 en el que una unidad de CD46 se une entre cada par de dominios de botón de fibra dentro de la estructura homotrímera del botón
(H. Wang et al., Journal of Virology 81:12785-12792 (2007), incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad). Así, un único homotrímero de botón de fibra puede reticular tres receptores de CD46. Se ha establecido que se requiere la trimerización para la unión del botón de fibra de Ad35 a CD46 soluble usando un anticuerpo específico para la forma trímera de las proteínas de botón (ab1187-100, lote nº 134173; Abcam), H. Wang et al., Journal of Virology 81:12785-12792 (2007). Como se describe en H. Wang et al., se generó una biblioteca de polipéptidos mutantes de botón de fibra de Ad35 usando PCR mutagénica para generar un promedio de una o dos mutaciones de aminoácido por polipéptido del dominio de botón de fibra. La biblioteca se seleccionó doblemente para la trimerización y unión a CD46 soluble. Ninguna de las mutaciones que destruyeron la trimerización fue capaz de unirse a CD46. Se identificaron cuatro residuos en los que las mutaciones suprimieron la unión del botón de fibra de Ad35 a CD46 sin afectar la trimerización: Phe en la posición de aminoácido 242, Arg en la posición 279, Ser en la posición 282 y Glu en la posición 302. Estos residuos se localizaron en áreas correspondientes a las tres regiones de contacto informadas para el dominio de botón de fibra de Ad11. Rondas adicionales de cribado no descubrieron regiones adicionales, que indica que se habían encontrado todas las áreas de interacción críticas de CD46 detectable. La superposición de imágenes cristalográficas indicó que la estructura central entre Ad35 y Ad11 es altamente similar. Además, todas las mutaciones de Ad35 estuvieron en regiones de bucle expuestas dentro de la estructura de botón de fibra de Ad35 globular, enfatizando su función en la unión al receptor. Particularmente, los residuos de contacto en los bucles de F-G y H-I estuvieron situados en lados opuestos
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del monómero de Ad35 con respecto al área de contacto en el bucle I-J, que indica que una unidad de CD46 se une entre dos monómeros de botón de fibra de Ad35. Esto estuvo respaldado por los datos de estequiometría que indican una interacción 1:1 entre las moléculas CD46 y los monómeros de botón de fibra de Ad35 (H. Wang et al., Journal of Virology 81:12785-12792 (2007)). Así, la interacción de CD46 del dominio de botón de fibra de Ad35 conduce no solo a una estrecha asociación, sino también a la reticulación de varias moléculas de CD46.
CD55:
CD55 (DAF) es una proteína de 70 kDa que en seres humanos está codificada por el gen CD55 (Medof ME, et al. (Abril de 1987). “Cloning and characterization of cDNAs encoding the complete sequence of decay-accelerating factor of human complement”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (7): 2007-11). La secuencia de proteínas de CD55 humana se corresponde con el número de acceso de GenBank AAC60633. CD55 es una proteína de la membrana de 70 kDa que regula el sistema del complemento sobre la superficie celular. Previene el ensamblaje del complejo C3bBb (la C3 convertasa de la vía alternativa) o acelera el desensamblaje de la convertasa previamente formada, bloqueando así formación del complejo de ataque de la membrana. La glicoproteína CD55 está ampliamente distribuida entre células hematopoyéticas y no hematopoyéticas. La proteína comparte algunos motivos de repetición de aminoácidos y similitudes funcionales con algunas proteínas del complemento. Osuka et al., “Molecular Cloning and Characterization of Novel Splicing Variants of Human Decay-Accelerating Factor”, Genomics 88(3):316-322, Septiembre de 2006; han informado de una variedad de variantes de corte y empalme que se expresan en casi todos los tejidos probados, pero varían en sus patrones de expresión. Algunas variantes son formas solubles de CD55 secretada después de la glucosilación (M.A. Davitz et al., Release of Decay-Accelerating Factor (DAF) From the Cell Membrane by Phosphatidylinositol-Specific Phospholipase C (PIPLC)”, Journal of Experimental Medicine 163(5):1150-1161, Mayo de 1986).
CD55 es un regulador del complemento que funciona intrínsecamente en las membranas de las propias células para eludir la deposición de C3b autólogo sobre sus superficies (V. Nussenzweig et al., “Inhibition of Complement Activation on the Surface of Cells After Incorporation of Decay-Accelerating Factor (DAF) Into Their Membranes”, Journal of Experimental Medicine 160(5):1558-1578, Noviembre de 1984). Actúa acelerando la descomposicióndisociación de las C3 convertasas bimoleculares, las enzimas fundamentales de la amplificación de la cascada (A. Nicholson-Weller et al., “Isolation of a Human Erythrocyte Membrane Glycoprotein With Decay-Accelerating Activity for C3 Convertases of the Complement System”, The Journal of Immunology 129(1):184-189, Julio de 1982; M.K. Pangburn et al., “Breakdown of C3 After Complement Activation: Identification of a New Fragment C3g, Using Monoclonal Antibodies”, Journal of Experimental Medicine 156(1):205-216, Julio de 1982; T. Fujita et al., “The Mechanism of Action of Decay-Accelerating Factor (DAF): DAF Inhibits the Assembly of C3 Convertases by Dissociating C2a and Bb”, Journal of Experimental Medicine 166(5):1221-1228, Noviembre de 1987).
CD55 es el ligando celular para CD97 (J. Hamann et al., “The Seven-Span Transmembrane Receptor CD97 Has a Cellular Ligand (CD55, DAF)”, Journal of Experimental Medicine 184(3):1185-1189, Septiembre de 1996). CD55 es deficiente en glóbulos rojos de pacientes con hemoglobinuria paroxística nocturna. Las células de estos pacientes dejan de adherirse a las células que expresan el contra-receptor. Una deficiencia de CD55 no parece tener ninguna anomalía hematológica asociada u otra anomalía (D.M. Lublin et al., “Molecular Basis of Reduced or Absent Expression of Decay-Accelerating Factor in Cromer Blood Group Phenotypes”, Blood 84(4):1276-1282, Agosto de 1994). La ausencia de CD55 en hemoglobinuria paroxística nocturna conduce a la elevada captación de C3b sobre células afectadas (M.E. Medof et al., “Amelioration of Lytic Abnormalities of Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria With Decay-Accelerating Factor”, Proceedings of the National Academy of Sciences USA (PNAS) 82(9):2980-2984, Mayo de 1985).
CD55 se usa como receptor por algunos virus de Coxsackie y otros enterovirus, por ejemplo, ecovirus y virus de Coxsackie B (Karnauchow TM, Tolson DL, Harrison BA, Altman E, Lublin DM, Dimock K (Agosto de 1996). “The HeLa cell receptor for enterovirus 70 is decay-accelerating factor (CD55)”. J. Virol. 70 (8): 5143-52; Goodfellow et al., J Gen Virol 81(5):1393-401 (2000)). Se ha probado Fc de CD55 soluble recombinante en ratones como una terapia anti-enterovirus para lesión al corazón (Yanagawa B, Spiller OB, Choy J, Luo H, Cheung P, Zhang HM, Goodfellow IG, Evans DJ, Suarez A, Yang D, McManus BM (Enero de 2003). “Coxsackievirus B3-associated myocardial pathology and viral load reduced by recombinant soluble human decay-accelerating factor in mice”. Lab. Invest. 83 (1): 75-85).
CD59:
CD59 es una glicoproteína de 18-20 kDa anclada a glicosilfosfatidilinositol (anclada a GPi). La secuencia de proteínas de CD59 humana se corresponde con el número de acceso de GenBank CAG46523. CD59 se expresa sobre leucocitos de sangre periférica humana, eritrocitos y varias líneas celulares humanas. La proteína se expresa también sobre células endoteliales, sobre la vaina de las células de Schwann de fibras nerviosas periféricas, neuronas, microglía, oligodendrocitos, astrocitos, células ependimarias y ciertas células epiteliales tales como células acinares de la glándula salival, epitelio bronquial, túbulos renales y epitelio escamoso (Nose et al., “Tissue distribution of HRF20, a novel factor preventing the membrane attack of homologous complement, and its predominant expression on endothelial cells in vivo”, Immunology 70(2):145-9, Junio de 1990; Vedeler et al., “The
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comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 19, en la que X1 no es aspartato; SEC ID Nº: 26, en la que X2 no es treonina; o SEC ID Nº: 31, en la que X3 no es isoleucina.
Descripción de SEC ID Nº: 15 a SEC ID Nº: 31
SEC ID Nº: 15. (SECUENCIA DE AA DEL BUCLE DE DEL DOMINIO DE BOTÓN DE FIBRA DE AD35)
DSSGNLLTX1ESDLKIPL
en la que X1 es cualquier aminoácido; en la que X1 es D (no mutante); en la que X1 es G (mutante); o en la que X1 es E (sustitución conservativa)
SEC ID Nº: 16. (SECUENCIA DE AA PARCIAL DEL BUCLE DE DEL DOMINIO DE BOTÓN DE FIBRA DE AD35)
GNLLTX1ESDLK
en la que X1 es cualquier aminoácido; en la que X1 es D (no mutante); en la que X1 es G (mutante); o en la que X1 es E (sustitución conservativa)
SEC ID Nº: 17. (SECUENCIA DE AA PARCIAL DEL BUCLE DE DEL DOMINIO DE BOTÓN DE FIBRA DE AD35)
NLLTX1ESDL
en la que X1 es cualquier aminoácido; en la que X1 es D (no mutante); en la que X1 es G (mutante); o en la que X1 es E (sustitución conservativa)
SEC ID Nº: 18. (SECUENCIA DE AA PARCIAL DEL BUCLE DE DEL DOMINIO DE BOTÓN DE FIBRA DE AD35)
LLTX1ESD
en la que X1 es cualquier aminoácido; en la que X1 es D (no mutante); en la que X1 es G (mutante); o en la que X1 es E (sustitución conservativa)
SEC ID Nº: 19. (SECUENCIA DE AA PARCIAL DEL BUCLE DE DEL DOMINIO DE BOTÓN DE FIBRA DE AD35)
LTX1ES
en la que X1 es cualquier aminoácido; en la que X1 es D (no mutante); en la que X1 es G (mutante); o en la que X1 es E (sustitución conservativa)
SEC ID Nº: 20. (SECUENCIA DE AA PARCIAL DEL BUCLE DE DEL DOMINIO DE BOTÓN DE FIBRA DE AD35)
TX1E
en la que X1 es cualquier aminoácido; en la que X1 es D (no mutante); en la que X1 es G (mutante); o en la que X1 es E (sustitución conservativa)
SEC ID Nº: 21. (SECUENCIA DE AA PARCIAL DEL BUCLE DE DEL DOMINIO DE BOTÓN DE FIBRA DE AD35)
GNLLTX1ES
en la que X1 es cualquier aminoácido; en la que X1 es D (no mutante); en la que X1 es G (mutante); o en la que X1 es E (sustitución conservativa)
SEC ID Nº: 22. (SECUENCIA DE AA PARCIAL DEL BUCLE DE DEL DOMINIO DE BOTÓN DE FIBRA DE AD35)
GNLLTX1
en la que X1 es cualquier aminoácido; en la que X1 es D (no mutante);
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en la que X1 es G (mutante); o en la que X1 es E (sustitución conservativa)
SEC ID Nº: 23. 5 (SECUENCIA DE AA DEL BUCLE FG DEL DOMINIO DE BOTÓN DE FIBRA DE AD35 DE)
TSETVASSKAFMPSTTAYPFNTX2TRDSENYIHGX3
en la que X2 es cualquier aminoácido; en la que X2 es T (no mutante); en la que X2 es A (mutante); en la que X2 es C, G, N, Q, So Y; o en la que X2 es F, I, L, M, P, V o W en la que X3 es cualquier aminoácido; en la que X3 es I (no mutante) en la que X3 es l (mutante)
15 en la que X3es A, F, M, P, Vo W
SEC ID Nº: 24. (SECUENCIA DE AA PARCIAL DEL BUCLE FG DEL DOMINIO DE BOTÓN DE FIBRA DE AD35)
FNTX2TRDSENYIHGX3
en la que X2 es cualquier aminoácido; en la que X2 es T (no mutante); en la que X2 es A (mutante); en la que X2 es C, G, N, Q, S o Y; o en la que X2 es F, I, L, M, P, V o W
25 en la que X3 es cualquier aminoácido; en la que X3 es I (no mutante) en la que X3 es l (mutante) en la que X3 es A, F, M, P, V o W
SEC ID Nº: 25. (SECUENCIA DE AA PARCIAL DEL BUCLE FG DEL DOMINIO DE BOTÓN DE FIBRA DE AD35)
FNTX2TRD
en la que X2 es cualquier aminoácido; en la que X2 es T (no mutante);
35 en la que X2 es A (mutante); en la que X2 es C, G, N, Q, S o Y; o en la que X2 es F, I, L, M, P, V o W
SEC ID Nº: 26. (SECUENCIA DE AA PARCIAL DEL BUCLE FG DEL DOMINIO DE BOTÓN DE FIBRA DE AD35)
NTX2TR
en la que X2 es cualquier aminoácido; en la que X2 es T (no mutante); en la que X2 es A (mutante);
45 en la que X2es C, G, N, Q, S o Y; o en la que X2 es F, I, L, M, P, V o W
SEC ID Nº: 27. (SECUENCIA DE AA PARCIAL DEL BUCLE FG DEL DOMINIO DE BOTÓN DE FIBRA DE AD35)
TX2T
en la que X2 es cualquier aminoácido; en la que X2 es T (no mutante); en la que X2 es A (mutante); en la que X2 es C, G, N, Q, S o Y; o
55 en la que X2es F, I, L, M, P, V o W
SEC ID Nº: 28. (SECUENCIA DE AA PARCIAL DEL BUCLE FG DEL DOMINIO DE BOTÓN DE FIBRA DE AD35)
X2TRDSENYIHGX3
en la que X2 es cualquier aminoácido; en la que X2 es T (no mutante); en la que X2 es A (mutante); en la que X2 es C, G, N, Q, S o Y; o en la que X2 es F, I, L, M, P, V o W
65 en la que X3 es cualquier aminoácido; en la que X3 es I (no mutante);
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en la que X3 es l (mutante); o en la que X3 es A, F, M, P, V o W
SEC ID Nº: 29. (SECUENCIA DE AA PARCIAL DEL BUCLE FG DEL DOMINIO DE BOTÓN DE FIBRA DE AD35)
TRDSENYIHGX3
en la que X3 es cualquier aminoácido; en la que X3 es I (no mutante); en la que X3 es l (mutante); o en la que X3 es A, F, M, P, V o W
SEC ID Nº: 30. (SECUENCIA DE AA PARCIAL DEL BUCLE FG DEL DOMINIO DE BOTÓN DE FIBRA DE AD35)
YIHGX3
en la que X3 es cualquier aminoácido; en la que X3 es I (no mutante); en la que X3 es l (mutante); o en la que X3 es A, F, M, P, V o W
SEC ID Nº: 31. (SECUENCIA DE AA PARCIAL DEL BUCLE FG DEL DOMINIO DE BOTÓN DE FIBRA DE AD35)
HGX3
en la que X3 es cualquier aminoácido; en la que X3 es I (no mutante); en la que X3 es l (mutante); o en la que X3 es A, F, M, P, V o W
En otra realización relacionada más, el primer y segundo dominios se unen a la misma CRP o alternativamente el primer y segundo dominios se unen a CRP diferentes. En las realizaciones proporcionadas en este aspecto de la invención, la CRP es CD35, CD46, CD55 o CD59. En una realización específica, la CRP es CD46. En realizaciones relacionadas, el polipéptido produce la internalización o secuestro de la CRP en una célula; y/o el polipéptido se une a la CRP con una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 1 nM o menos o incluso aproximadamente 0,65 nM o menos. En algunas realizaciones, el polipéptido no es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. El polipéptido puede ser una proteína viral modificada aislada, por ejemplo, un polipéptido derivado de una proteína de botón de fibra adenoviral. Tal polipéptido derivado de un dominio de botón de fibra de un adenovirus pueden seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en Ad11, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35 y Ad50. En una realización muy específica, el polipéptido se deriva del dominio de botón de fibra de Ad35 que comprende al menos una sustitución de aminoácidos en los residuos seleccionados de Asp207, Thr245, Ile256, y una combinación de los mismos; o más específicamente la sustitución de aminoácidos es Asp207Gly, Thr245Ala, Ile256Leu, o una combinación de los mismos. En otra realización, el polipéptido es inferior a 25.000 Daltons.
Los polipéptidos proporcionados en el presente documento pueden dimerizarse, trimerizarse, homodimerizarse u homotrimerizarse. En una realización, el polipéptido se dimeriza, homodimeriza, trimeriza u homotrimeriza espontáneamente. El dímero, trímero, homodímero u homotrímero puede tener una estructura tridimensional, en el que cada monómero comprende dos bucles con afinidad por la unión una CRP. La secuencia entre los bucles puede ser sustituible y sin reducir la unión a la CRP.
En una realización relacionada, en el presente documento se proporciona un polipéptido monomérico que comprende una secuencia que no se produce naturalmente que tras la dimerización o trimerización puede unirse a una proteína reguladora del complemento (CRP). Pueden determinarse formaciones de dímeros, trímeros, homodímeros y homotrímeros según métodos conocidos para los profesionales en la materia. Por ejemplo, la trimerización de polipéptidos puede evaluarse por criterios que incluyen la sedimentación en gradientes de sacarosa, resistencia a la proteólisis por tripsina y movilidad electroforética en geles de poliacrilamida (Hong y Engler, Journal of Virology 70:7071-7078 (1996)).
Los polipéptidos de la presente invención pueden comprender además un dominio de trimerización. En una realización, el dominio de trimerización se deriva de una proteína viral. A modo de ejemplo, el dominio de trimerización es un dominio de fibritina del bacteriófago T4 o un dominio de la proteína σ1 de fibra de reovirus. En una realización, el dominio de trimerización comprende la secuencia de aminoácidos: GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEC ID Nº: 32).
En el presente documento también se proporciona un complejo de polipéptido que comprende al menos uno, dos, tres o más de cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento. En una realización, el complejo de polipéptido puede unirse a dos o más moléculas de CRP. La CRP puede ser CD35, CD46, CD55 o CD59. En una realización específica, la CRP es CD46.
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En una realización, el complejo de polipéptido de la presente divulgación tiene al menos 1000, 2500, 5000, 7500, 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000, o incluso 100.000 Daltons de peso.
En una realización específica, como se describe en el Ejemplo 1, las sustituciones de aminoácidos específicas dentro del dominio de botón de fibra de Ad35 (es decir, polipéptidos del dominio de botón de fibra de Ad35 mutante o modificado) potencian la afinidad de unión de los polipéptidos del dominio de botón de fibra homotrímeros por CD46 en comparación con los polipéptidos del dominio de botón de fibra no mutantes de Ad35. Como se demuestra en el Ejemplo 2, el poner en contacto las células con los polipéptidos del dominio de botón de fibra de Ad35 mutantes induce la internalización de los complejos de CD46-botón de fibra de Ad35, reduciéndose así la prevalencia de CD46 sobre la superficie celular. Además, el polipéptido del dominio de botón de fibra de Ad35 mutante (Asp207Gly y Thr245Ala) con afinidad potenciada de unión por CD46 provocó una mayor reducción de CD46 de la superficie celular, y la reducción duró durante un periodo de tiempo más largo que el observado con el polipéptido del dominio de botón de fibra de Ad35 no mutante. Como se demuestra en los Ejemplos 2 y 3, la reducción transitoria de los niveles de CD46 superficial produjo la sensibilización de células tumorales a la CDC por mAb anticancerígenos. El efecto de sensibilización fue mayor para los polipéptidos del dominio de botón de fibra de Ad35 mutantes con unión potenciada a CD46, seguido del polipéptido del dominio de botón de fibra de Ad35 no mutante, ambos de los cuales tuvieron un mayor efecto que el efecto de sensibilización de mAb anti-CD46. Como se demuestra en el Ejemplo 3, los efectos terapéuticos de esta sensibilización se observaron in vivo, en los que los ratones que recibieron xenoinjertos de linfoma tuvieron menores niveles de células de linfoma en su médula ósea y periodos de supervivencia potenciados después de recibir un tratamiento de sensibilización de polipéptidos del dominio de botón de fibra de Ad35 mutantes antes de un tratamiento con mAb. Como se ha demostrado adicionalmente en el Ejemplo 2, la reducción de los niveles superficiales de CD46 inducida por polipéptidos del dominio de botón de fibra de Ad35 mutantes redujo la infectividad celular por un vector Ad35-GFP. Así, la alta afinidad de polipéptidos del dominio de botón de fibra de Ad35 mutantes (por ejemplo, Ad35K++), junto con su capacidad para reticular varias moléculas de CD46, produjeron internalización transitoria de CD46, que a su vez sensibilizó a células de linfoma a la CDC medicada con rituximab in vitro, y en un modelo animal in vivo de linfoma.
Reducción de la actividad de una CRP sobre una superficie de célula diana
La unión de los polipéptidos, dímeros o trímeros a una CRP puede determinarse según métodos muy conocidos para los profesionales en la materia. Por ejemplo, la unión a CD46, CD55, CD59 o CD35 puede determinarse por simple transferencia Western o ensayos de resonancia de plasmones superficiales como se describe en Wang, H., et al., Journal of Virology 81:12785-12792 (2007) y en el Ejemplo 1 (para CD46). Por ejemplo, la afinidad de unión de homotrímeros por CD46 puede cuantificarse según métodos muy conocidos para los profesionales en la materia, tales como el ensayo de resonancia de plasmones superficiales descrito en el Ejemplo 1.
Por consiguiente, en una realización, se proporciona un polipéptido modificado que comprende secuencias de aminoácidos que no se producen naturalmente y al menos dos dominios que pueden unirse a una CRP. El propio polipéptido puede unirse a una CRP, o puede dimerizarse, trimerizarse, homodimerizarse u homotrimerizarse para unirse a una CRP. El polipéptido puede ser adicionalmente parte de un complejo de proteína que puede unirse a una CRP. En el presente documento se proporcionan polipéptidos modificados que comprenden secuencias de aminoácidos que no se producen naturalmente, dímeros o trímeros que comprenden estos polipéptidos modificados,
o complejos de polipéptido que comprenden dos o más de estos polipéptidos modificados en los que los polipéptidos modificados, dímeros, trímeros o complejos pueden unirse a una CRP con una mayor afinidad (tal como al menos 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 500, o al menos aproximadamente 1000 veces mayor) en comparación con un polipéptido por lo demás sin modificar, no mutante o parental. Por consiguiente, la constante de disociación (Kd) de la CRP por el polipéptido modificado, dímero, trímero o complejo es no superior a 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1,5 nM, 1 nM, 0,9 nM, 0,8 nM, 0,7 nM, 0,65 nM, 0,63 nM, 0,6 nM, 0,5 nM, 0,4 nM, 0,3 nM, 0,25 nM, 0,2 nM, 0,15 nM, 0,1 nM, 0,05 nM, 0,01 nM, 0,005 nM, 0,001nM, 0,0005nM o 0,0001nM. En una realización específica, como se describe en el Ejemplo 1, la Kd de un polipéptido del dominio de botón de fibra modificado y CD46 es 0,63 nM.
Por consiguiente, en una realización, los polipéptidos modificados proporcionados en el presente documento pueden formar trímeros, u homotrímeros que se unen a una CRP (CD46, CD55, CD59 o CD35) expresada sobre una superficie de célula diana e induce la internalización de la CRP en la célula. En otra realización, los polipéptidos modificados proporcionados en el presente documento pueden formar trímeros, u homotrímeros que se unen a una CRP (CD46, CD55, CD59 o CD35) expresada sobre una superficie de célula diana e induce el secuestro de la CRP. En otra realización más, los polipéptidos modificados proporcionados en el presente documento pueden formar trímeros u homotrímeros que se unen a una CRP (CD46, CD55, CD59 o CD35) expresada sobre una superficie de célula diana y reduce la densidad de CRP receptores sobre la célula diana. En otra realización relacionada, los polipéptidos modificados proporcionados en el presente documento pueden formar trímeros u homotrímeros que se unen a una CRP (CD46, CD55, CD59 o CD35) expresada sobre una superficie de célula diana y reduce la actividad de la CRP sobre la célula diana.
En una realización, la incubación con o poner en contacto un polipéptido modificado produce al menos una
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reducción del 5 % de los niveles de CRP de la superficie celular, y preferentemente al menos una reducción del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o 70 % en los niveles de CRP de la superficie celular.
En otra realización, la incubación con o poner en contacto un polipéptido modificado produce al menos una reducción del 5 % de la densidad de CRP en la superficie celular, y preferentemente al menos una reducción del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o 70 % en la densidad de CRP en la superficie celular.
En otra realización, la incubación con o poner en contacto un polipéptido modificado produce al menos una reducción del 5 % de actividad de CRP en la superficie celular, y preferentemente al menos una reducción del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o 70 % en la actividad de CRP en la superficie celular.
En otra realización más, la incubación con o poner en contacto un polipéptido modificado produce al menos un aumento del 5 % en el secuestro o internalización de la CRP en la superficie celular, y preferentemente al menos un aumento del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o 70 % en el secuestro o internalización en la superficie celular.
En algunas realizaciones, la reducción en los niveles de CRP de la superficie celular, reducción en la densidad de la CRP sobre la superficie celular, reducción de la actividad de la CRP sobre la superficie de célula diana, aumentos en la internalización de CRP, aumentos en el secuestro de CRP por una incubación con un polipéptido modificado dura durante al menos 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, y preferentemente dura durante al menos 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas o 96 horas, antes de que los niveles de CRP de la superficie celular vuelvan a los niveles de pre-incubación.
En una realización a modo de ejemplo, un polipéptido del dominio de botón de fibra modificado que comprende al menos 12 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID Nº: 3 comprende motivos de andamiaje para facilitar la unión de CD46.
Polipéptidos del dominio de botón de fibra de adenovirus modificados
En una realización a modo de ejemplo, los polipéptidos del dominio de botón de fibra de adenovirus modificados se usan para reducir la actividad de CD46 sobre una superficie celular. La FIGURA 1A es una ilustración esquemática del polipéptido de fibra de adenovirus no mutante de longitud completa serotipo 35 (Ad35), proporcionado como SEC ID Nº: 2 (que está codificado por el ADNc proporcionado como SEC ID Nº: 1), que indica las posiciones relativas del dominio de cola del extremo N (aa 1-45), el dominio de mango (aa 46-133) y el dominio de botón (k) de fibra del extremo C (aa 134-323). Se determinó previamente que además del dominio de botón (aa 134-323), la sección más hacia el extremo C del dominio de mango (aa 123-133) se requiere para la trimerización de fibra. Hong y Engler, J. Virology 70:7071-7078 (1996). Por consiguiente, como se muestra en la FIGURA 1B, el polipéptido de Ad35 no mutante que engloba una porción de 11 aminoácidos (aa 123-133) del dominio de mango, y el dominio de botón entero (aa 134-323) se proporciona como SEC ID Nº: 3. En el presente documento se desvelan sustituciones de aminoácidos numeradas secuencialmente con respecto al primer residuo de aminoácido de SEC ID Nº: 2 (mostrado en la FIGURA 1A). Por consiguiente, el primer residuo de aminoácido en SEC ID Nº: 3 se corresponde con el aminoácido 123 del polipéptido de fibra de longitud completa (SEC ID Nº: 2). Este esquema de numeración también se usa para las posiciones de aminoácidos correspondientes en secuencias de polipéptidos que comprenden solo una subparte o una variación de SEC ID Nº: 2 para comunicar la posición relativa de la secuencia con la secuencia de longitud completa.
Como se describe en el presente documento, las siguientes sustituciones de aminoácidos en el dominio de botón (SEC ID Nº: 3) del polipéptido de fibra (SEC ID Nº: 2): residuo de aminoácido 207, en el que la Asp está sustituida por Gly, residuo de aminoácido 245, en el que la Thr está sustituida por Ala, y residuo de aminoácido 256, en el que la Ile está sustituida por Leu, individualmente o en combinación, producen afinidad potenciada de unión de los polipéptidos del dominio de botón de fibra de Ad35 modificados por CD46. Véase la Tabla 2 y Ejemplo 1.
Por consiguiente, en algunas realizaciones, la invención proporciona un polipéptido del dominio de botón de fibra modificado de la invención que comprende al menos 12 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID Nº: 3, en el que el polipéptido incluye al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en Asp207Gly, Thr245Ala e Ile256Leu, o una combinación de las mismas, y en el que el polipéptido puede formar homotrímeros que pueden unirse a CD46.
Como se usa en el presente documento, la expresión “aminoácidos contiguos de SEC ID Nº: 3” se refiere a un orden secuencial de residuos de aminoácidos como aparece en SEC ID Nº: 3 sin inserciones, deleciones, o como mucho sustituciones. Esta expresión, sin embargo, permite la incorporación de las sustituciones de aminoácidos descritas (es decir, Asp207Gly, Thr245Ala, Ile256Leu). Así, en una realización a modo de ejemplo, el polipéptido puede comprender al menos los residuos 1-12 de SEC ID Nº: 3 (correspondientes a SEC ID Nº: 2, residuos de aminoácidos 123-135) y una o más de una sustitución de Gly en la posición 85 (correspondiente a Asp en la posición 207 de SEC ID Nº: 2); una sustitución de Thr en la posición 120 (correspondiente a Ala en la posición 245 de SEC ID Nº: 2); y/o una sustitución de Ile en la posición 134 (correspondiente a Leu en la posición 134 de SEC ID Nº: 2).
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menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o es absolutamente idéntica a SEC ID Nº: 3. En una realización, el polipéptido del dominio de botón de fibra modificado comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del dominio de botón de fibra de Ad35 mutante que contiene sustituciones de aminoácidos en la posición 207, en la que la Asp está sustituida con Gly, y en la posición 245, en la que la Thr está sustituida con Ala, expuesta como SEC ID Nº: 5. La combinación de estas dos sustituciones en el dominio de botón produce un polipéptido del dominio de botón de fibra de Ad35 mutante (también denominado en el presente documento Ad35K++) que se trimeriza para formar una estructura de botón homotrímera con una afinidad para unirse a CD46 que es 23,2 veces superior a la de la estructura de botón homotrímera formada por polipéptido del dominio de botón de fibra de Ad35 no mutante (SEC ID Nº: 3) (también denominado en el presente documento Ad35K), como se muestra en la Tabla 2 y Ejemplo 1.
Según este aspecto, el polipéptido del dominio de botón de fibra modificado puede formar estructuras de botón homotrímeras que pueden unirse a CD46 expresada sobre la superficie de una célula. La formación de homotrímeros se produce espontáneamente, y no requiere la totalidad de los polipéptidos de fibra individuales. Como se muestra por Hong y Engler, Journal of Virology 70:7071-7078 (1996), incorporado en el presente documento por referencia, la deleción de la mitad del extremo N entero de la proteína de fibra de Ad2 no afectó la homotrimerización. Por tanto, como máximo, la mitad del extremo C de la proteína de fibra es suficiente para la trimerización. En particular, los investigadores encontraron que las deleciones más pequeñas en el extremo C (SEC ID Nº: 2 aa 123-134) destruyeron la trimerización, mientras que adiciones o sustituciones seleccionadas que preservan la carga del residuo produjeron homotrímeros relativamente estables. Por tanto, la trimerización de fibra puede lograrse con el dominio de botón de fibra entero y al menos los aminoácidos del extremo C (SEC ID Nº: 2 aa 123-134) del mango.
La formación de homotrímeros puede determinarse según métodos muy conocidos para los profesionales en la materia. Por ejemplo, la trimerización de las proteínas de botón de fibra puede evaluarse por criterios que incluyen la sedimentación en gradientes de sacarosa, resistencia a la proteólisis por tripsina y movilidad electroforética en geles de poliacrilamida (Hong y Engler, Journal of Virology 70:7071-7078 (1996)). Con respecto a la movilidad electroforética, el homotrímero de dominio de botón de fibra es un complejo muy estable y migrará a un peso molecular de acuerdo con el de un trímero cuando la muestra no se hierve antes de SDS-PAGE. Tras la ebullición, sin embargo, la estructura trímera se rompe y la proteína migra posteriormente a un tamaño de acuerdo con el monómero de proteína. La trimerización de la proteína de botón de fibra también puede determinarse usando el anticuerpo policlonal de conejo anti-His6-HRP como se describe en Wang, H., et al., Journal of Virology 81:1278512792 (2007) y en el Ejemplo 1.
La unión de los homotrímeros a CD46 puede determinarse según métodos muy conocidos para los profesionales en la materia. Por ejemplo, la unión a CD46 puede determinarse por simple transferencia Western o ensayos de resonancia de plasmones superficiales como se describe en Wang, H., et al., Journal of Virology 81:12785-12792 (2007) y en el Ejemplo 1. Además, la afinidad de unión de los homotrímeros por CD46 puede cuantificarse según métodos muy conocidos para los profesionales en la materia, tales como el ensayo de resonancia de plasmones superficiales descrito en el Ejemplo 1.
La formación de homotrímeros puede determinarse en general según métodos muy conocidos para los profesionales en la materia. Por ejemplo, la trimerización de polipéptidos puede evaluarse por criterios que incluyen sedimentación en gradientes de sacarosa, resistencia a la proteólisis por tripsina y movilidad electroforética en geles de poliacrilamida (Hong y Engler, Journal of Virology 70:7071-7078 (1996)). Con respecto a la movilidad electroforética, el homotrímero de proteína de botón de fibra es un complejo muy estable y migrará a un peso molecular de acuerdo con el de un trímero cuando la muestra no se hierve antes de SDS-PAGE. Tras la ebullición, sin embargo, la estructura trímera se rompe y la migra posteriormente a un tamaño de acuerdo con el monómero de proteína. La trimerización de la proteína de botón de fibra también puede determinarse usando el anticuerpo policlonal de conejo anti-His6-HRP como se describe en Wang, H., et al., Journal of Virology 81:12785-12792 (2007) y en el Ejemplo 1.
En una realización específica, como se describe en el Ejemplo 2, la unión de polipéptidos del dominio de botón de fibra de Ad35 modificados (por ejemplo, Ad35K++) a CD46 expresada sobre una membrana celular induce la internalización del complejo de polipéptido del dominio de botón de fibra/CD46 en el interior de la célula, como se describe en el Ejemplo 2. La FIGURA 2A ilustra los niveles en la superficie celular de CD46 sobre células HeLa en diferentes momentos de tiempo después de la adición de 20 µg/ml de PBS (control), Ad35K no mutante (no mutante), Ad35K++ (SEC ID Nº: 5) o mAb anti-CD46. Después de 15 minutos, las células puestas en contacto con Ad35K++ tuvieron aproximadamente una reducción del 70 % en los niveles de CD46 sobre su superficie en comparación con las células tratadas con PBS. Ad35K++ provocó la mayor disminución en los niveles de CD46 y el regreso más lento hacia los niveles de pre-incubación. A diferencia, las células tratadas con mAb anti-CD46 solo mostraron aproximadamente una disminución del 30 % en los niveles de CD46 de la superficie con un regreso más rápido a los niveles de pre-incubación.
La FIGURA 2B ilustra los resultados de estudios de citometría de flujo que muestran una disminución de Ad35K unido a célula y Ad35K++, que indica que los polipéptidos del dominio de botón de fibra son internalizados junto con la CD46. Estudios de inmunofluorescencia indicaron que 30 minutos después de poner en contacto células con
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Ad35K y Ad35K++, los polipéptidos del dominio de botón de fibra y CD46 se detectaron en endosomas/lisosomas tardíos. Además, 12 horas después de poner en contacto las células con los polipéptidos del dominio de botón de fibra, las células tratadas con Ad35K++ demostraron tinción de CD46 predominantemente citoplásmica con una intensidad que indica degradación de CD46 en los lisosomas. Similar a los resultados en el Ejemplo 2, la reducción mediada por Ad35K++ en los niveles de CD46 superficial se observó para las siguientes células de linfoma/leucemia: Raji, Jurkat, K562, Mo7e, Mino y Farage; y para las siguientes células tumorales sólidas: células A549 (pulmón), SKOV3 (ovario), HT29 (colon) y MDA235MB (mama). De acuerdo con estos resultados, como se muestra en la FIGURA 2C, los intentos por infectar células con Ad35-GFP (que requieren CD46 de superficie para la infección) 72 horas después de poner en contacto las células con botón de fibra de Ad35 o Ad35K++ produjeron células relativamente resistentes, que indica una ausencia de CD46 superficial. Citometría de flujo de CD46 y ensayo de Ad35-GFP similares realizados en otras líneas de células tumorales, tales como células Mo7e de eritroleucemia y células Raji de linfoma B, dieron resultados similares.
Identificación de moléculas que pueden reducir la actividad, cantidad o densidad de una CRP sobre una superficie de célula diana
En una realización se proporciona un método para cribar una molécula o compuesto que puede modificar una actividad de CRP. El método incluye generar una biblioteca de moléculas candidatas, seleccionar moléculas candidatas que pueden unirse a la CRP y determinar si la molécula modifica la actividad de la CRP. La CRP puede ser CD46, CD55, CD59 o CD35. En una realización específica, la CRP es CD46. En una realización, la molécula se une a la CRP, por ejemplo, con una afinidad de unión de 1 nM o menos. La molécula que se criba puede seleccionarse del grupo que consiste en una proteína, un polipéptido, una molécula pequeña, un fármaco, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo híbrido, un conjugado de anticuerpo-fármaco, un ARNip, un ARN antisentido, un miARN, un virus y un aptámero. En una realización a modo de ejemplo, la molécula es una molécula pequeña. En otra realización a modo de ejemplo, la molécula es un polipéptido. En realizaciones relacionadas, la molécula modifica la actividad de la CRP por internalización o secuestro de la CRP en una célula, o reduciendo la cantidad o densidad de la CRP sobre una superficie celular.
Una molécula que puede modificar la actividad de una CRP o unirse a una CRP puede identificarse por cribado de tanto una población de células como células fraccionadas que expresan una CRP contra moléculas de prueba. Pueden aislarse o identificarse moléculas novedosas usando diferentes compuestos de prueba de composición conocida unidos a un sustrato, tal como una matriz o una pluralidad de partículas, que pueden permitir que una gran cantidad del espacio químico/estructural se muestree adecuadamente usando solo una pequeña fracción del espacio. Como se conoce la composición de cada compuesto de prueba sobre la superficie del sustrato, esto constituye un cribado para elementos de afinidad. Por ejemplo, un compuesto de matriz de prueba comprende compuestos de prueba en localizaciones específicas sobre las localizaciones direccionables del sustrato, y puede usarse para identificar uno o más agentes de unión para una CRP. Los compuestos de prueba pueden estar sin relacionar o relacionados basándose en variaciones menores de una secuencia o estructura de núcleo. Los diferentes compuestos de prueba pueden incluir variantes de un compuesto de prueba dado (tales como isoformas de polipéptidos), compuestos de prueba que están estructuralmente o composicionalmente sin relacionar, o una combinación de los mismos.
Los compuestos de prueba pueden ser moléculas pequeñas, fármacos, peptoides, polisacáridos, compuestos orgánicos, compuestos inorgánicos, polímeros, lípidos, ácidos nucleicos, polipéptidos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos híbridos, conjugados de anticuerpo-fármaco, ARNip, ARN antisentido, miARN, virus, aptámeros, proteínas, polisacáridos, u otros compuestos. Los compuestos de prueba pueden ser naturales o sintéticos. Los compuestos de prueba pueden comprender o consistir en compuestos heteropoliméricos lineales o ramificados basados en cualquiera de varios enlaces o combinaciones de enlaces (por ejemplo, amida, éster, éter, tiol, adiciones de radicales, coordinación de metales, etc.), estructuras dendríticas, estructuras circulares, estructuras de cavidad u otras estructuras con múltiples sitios de unión próximos que sirven de andamiajes sobre los que se hacen adiciones específicas. Estos compuestos de prueba pueden aplicarse en puntos sobre el sustrato o sintetizarse in situ, usando métodos convencionales en la materia. Además, los compuestos de prueba pueden aplicarse en puntos o sintetizarse in situ en combinaciones con el fin de detectar interacciones útiles, tales como unión cooperativa.
En una realización, los compuestos de prueba pueden ser polipéptidos con secuencias de aminoácidos conocidas. Por ejemplo, pueden aplicarse CRP solubles a una matriz aplicada con puntos sobre un portaobjetos que contiene entre algunos y 1.000.000 de polipéptidos de prueba que tienen una longitud de aminoácidos variables. Los polipéptidos pueden unirse a la superficie mediante el extremo C. La secuencia de los polipéptidos puede generarse aleatoriamente a partir de 19 aminoácidos, excluyendo cisteína. La reacción de unión puede incluir un competidor no específico, tal como proteínas bacterianas en exceso marcadas con otro colorante de forma que pueda determinarse la relación de especificidad para cada polipéptido que se une a diana. Pueden seleccionarse los polipéptidos con la mayor especificidad y unión. Se conoce la identidad del polipéptido sobre cada punto, y así puede identificarse fácilmente.
Un anticuerpo o anticuerpo sintético que va a usarse como modulador de la actividad de CRP puede identificarse
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presentes durante otras etapas del desarrollo del organismo. Alternativamente, los niveles de expresión de proteínas de la superficie celular pueden alterarse en células cancerosas. Por consiguiente, existen diversos marcadores de la superficie celular que pueden identificar únicamente células cancerosas de células normales. Según los métodos proporcionados, marcadores para la enfermedad de células incluyen marcadores para células cancerosas. Los 5 marcadores de células cancerosas pueden incluir proteínas asociadas virales, auto-antígenos de tumor alterados que se expresan a niveles elevados sobre células cancerosas, antígenos específicos de tumor que se expresan exclusivamente sobre células cancerosas (incluyendo versiones mutadas de auto-moléculas). En realizaciones preferidas, el nivel de expresión del marcador es mayor sobre las células cancerosas que en células normales, y más preferentemente, el marcador se expresa casi exclusivamente sobre células cancerosas. Ejemplos no limitantes
10 de marcadores de la superficie celular útiles para células diana cancerosas incluyen: CD3, CD10, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD35, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD70, CD80, CD133, CD200, receptor 1 del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico (Her2/neu), glóbulo 1 de grasa de leche humana (HMFG1), receptor de interleucina 2 (IL2R), mucina 1 y factores de crecimiento endoteliales vasculares.
15 Los anticuerpos monoclonales han surgido como una clase prometedora de terapéuticos anticancerígenos. Debido a su capacidad para unirse específicamente a marcadores característicos de células cancerosas, los mAb permiten dirigir los propios sistemas inmunitarios del paciente a la destrucción de las células cancerosas. Anticuerpos monoclonales útiles en los métodos en el presente documento se proporcionan frecuentemente modificados para
20 contener dominios Fc humanos para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y para potenciar la capacidad para reclutar sistemas efectores inmunitarios humanos. Se contempla que como estos métodos se aplican a sujetos no humanos, los dominios Fc de los anticuerpos pueden modificarse para coincidir con el sujeto. Pueden usarse diferentes isotipos de anticuerpos humanos como el esqueleto de mAb terapéuticos anticancerígenos. Normalmente, la IgM es el isotipo más eficaz para la activación del complemento, sin embargo no se usa ampliamente en oncología
25 clínica debido a que no se extravasa fácilmente de estructuras vasculares (Adams, G.P., y Weiner, L.M., “Monoclonal Antibody Therapy of Cancer”, Nature Biotechnology 23:1147-1157 (2005)). Por tanto, la aplicabilidad del isotipo IgM puede estar más limitada a tumores malignos hematológicos. Los isotipos IgG1 e IgG3 son ambos muy eficaces en dirigirse a CDC. Ejemplos no limitantes de anticuerpos mAb anticancerígenos útiles se enumeran en la Tabla 1, y como se describe adicionalmente en Campoli, M., et al., Principle & Practise of Oncology 23(1&2):1-19
30 (2009), incorporado en el presente documento por referencia.
Tabla 1: mAb específicos de antígeno tumoral para el tratamiento de cáncer
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Anticuerpo
Isotipo Objetivo Indicación de enfermedad
OKT3 (Muromonab)
murino IgG2a CD3 células T de leucemia linfoblástica aguda; rechazo del trasplante *
Zanolimumab (Hu-Max-CD4)
IgG1 humanizado CD4 linfomas cutáneos de células T (CTCL), linfoma periférico de células T (CTCL), micosis fungoide (MF)
SGN-19A
IgG1 humanizado CD19 linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda
Rituximab (Rituxan)
quimérico IgG1 CD20 linfoma de bajo grado*, linfoma difuso de células B*, linfoma folicular*, linfoma no Hodgkin de células B*, el linfoma de células del manto*, leucemia de células peludas*, la leucemia linfocítica crónica*, enfermedades autoinmunes*, el rechazo agudo mediado por anticuerpos de los trasplantes*
Ofatumumab (Arzerra)
IgG1 humanizado CD20 La leucemia linfocítica crónica (LLC), recaída linfoma folicular no Hodgkin (FL), linfoma difuso de células B
90Y ibritumomab + tiuxetan
murino radiomarcado IgG1 CD20 CD20 (+) linfoma de bajo grado*
131-I tositumomab
murino radiomarcado IgG1 CD20 CD20 (+) linfoma de bajo grado*
Epratuzumab
IgG1 Humanizado CD22 linfoma no Hodgkin de células B, el linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), el linfoma folicular no Hodgkin (FL)
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Anticuerpo
Isotipo Objetivo Indicación de enfermedad
Lumiliximab (IDEC-152)
quimérico IgG1-prim humanizado CD23 leucemia linfoide crónica (LLC)
Daclizumab (Zenapax)
IgG1 humanizado CD25 Enfermedad de injerto contra huésped; rechazo agudo de los trasplantes*, leucemia de células T adultas / linfoma, rechazo de aloinjerto renal,
Basiliximab (Simulect)
quimérico CD25 Enfermedad de injerto contra huésped; rechazo agudo de los trasplantes
HeFi-1
Ratón IgG1 CD30 Linfoma anaplásico de células grandes (LACG); Enfermedad de Hodgkin (HD), CD30 (+) linfoma
MDX-060
IgG1 Humanizado CD30 Linfoma anaplásico de células grandes (LACG); Enfermedad de Hodgkin (HD), CD30 (+) linfoma
SGN-30
quimérico IgG1 CD30 Linfoma anaplásico de células grandes (LACG); Enfermedad de Hodgkin (HD), CD30 (+) linfoma
Lintuzumab
IgG1 humanizado CD33 leucemia mieloide aguda (LMA), síndromes mielodisplásicos (SMD), avanzado MDS
Bi213-Hum195
IgG1 Humanizado CD33 leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia promielocítica aguda (APML), síndromes mielodisplásicos (MDS)
Gemtuzumab + oxogamacin (Mylotarg)
IgG4-conjugado humanizado recombinante para caliqueamicina CD33 leucemia mielógena aguda*
TRU-016
IgG1 humanizado CD37 leucemia linfocítica crónica
Dacetuzumab (SGN-40)
IgG1 humanizado CD40 linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular no Hodgkin (FL)
Lucatumumab CHIR-12.12
IgG1 humanizado CD40 Leucemia linfoide crónica (LLC); mieloma múltiple,
Alemtuzumab (Campath)
IgG1 humanizado CD52 leucemia linfocítica crónica*
SGN-75
IgG1 humanizado CD70 tumores sólidos, como el cáncer de células renales, enfermedades malignas hematológicas CD70 +
Galiximab
quimérico IgG1-prim humanizado CD80 linfoma folicular, linfoma no Hodgkin de células B
Tastuzumab
IgG1 humanizado HER2/neu HER2 / neu (+) cáncer de mama*
Cetuximab
IgG1 quimérico EGFR EGFR (+) cáncer de colon*
Panitumumab
IgG2 totalmente humana EGFR EGFR (+) cáncer de colon*
Matuzumab
IgG1 humanizado EGFR cáncer no escamoso de pulmón no microcítico (CPNM), carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (CECC), cáncer de mama y de páncreas, cáncer de colon (CC)
Pertuzumab
IgG1 humanizado EGFR CPNM, CECC, CC, cáncer de mama y de ovario
Ipilimumab (MDX010)
IgG1 humanizado CTLA-4 CPNM, RCC, melanoma metastásico
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Anticuerpo
Isotipo Objetivo Indicación de enfermedad
Tremelimumab (CP-675, 206)
IgG1 humanizado CTLA-4 CPNM, RCC, melanoma metastásico
Sibrotuzumab
IgG1 humanizado FAP** CPNM, CC
DR-4-specific mapatumumab (TRM-1, HGS-ETR1)
IgG1 humanizado TRAIL NSCLC, CC, cáncer de ovario, mieloma múltiple
DR-5-specific lexatumumab (HGS-ETR2, TRA8)
IgG1 humanizado TRAIL tumores sólidos
Cantuzumab mertansine
Humanizado IgG1maitansinoide CanAg*** CC, cáncer pancreático
Bevacizumab (Avastatin)
IgG1 humanizado factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) cáncer de colon*, cáncer no escamoso de pulmón no microcítico (CPNM)*, cáncer de mama metastásico*
Apolizumab (Hu1D10)
IgG1 humanizado HLA-DR Células B no Hodgkin, leucemia linfoide crónica de (LLC); leucemia linfoblástica aguda (LLA); leucemia mieloide aguda (AML); , Enfermedad de Hodgkin de Waldenstrom,
Milatuzumab
IgG1 humanizado HLA-DR Células B no Hodgkin, leucemia linfoide crónica de (LLC); mieloma múltiple,
* Existe aprobación de la actual FDA para la enfermedad indicada ** FAP es un tipo II glicoproteína de membrana que pertenecen a la familia de genes de la proteasa de serina que se encuentra en las líneas celulares de sarcoma. *** CanAg es una glicoforma de mucina asociado a células (MUC1) que se encuentra en la mayoría de cáncer páncreas, biliar y colorrectal.
La capacidad de cualquier anticuerpo para inducir CDC sobre una célula depende de su capacidad para reclutar C1q, un constituyente del primer componente del complemento. C1q se une al dominio CH2 de moléculas de Ig. Pueden incorporarse modificaciones en los mAb que potencian su eficacia para reclutar el complemento e inducir CDC sobre la célula diana. Por ejemplo, se han identificado dos residuos dentro del dominio CH2 que potencian la inducción de CDC por rituximab (Idusogie, E.E., et al., The Journal of Immunology 166:2571-2575 (2001)). Específicamente, Idusogie et al., muestran que sustituciones en las posiciones de aminoácidos K326 y E333 potenciaron la unión de C1q al anticuerpo, produciendo elevada actividad de CDC. En DAll'Acqua, W., et al., The Journal of Immunology 177:1129-1138 (2006), los investigadores se involucraron en análisis sistemáticos de las 45 características funcionales de una región bisagra de IgG1 humana en el contexto de interacciones con activación del complemento. Se diseñaron mutaciones dirigidas para aumentar o disminuir la flexibilidad de la bisagra, o aumentar
o disminuir la longitud de la bisagra. Los investigadores encontraron que la pérdida de rigidez de la bisagra central es perjudicial para la unión de C1q, mientras que la pérdida de rigidez en la bisagra superior tuvo efecto mínimo o no tuvo. Además, se identificaron varias sustituciones en la bisagra superior que potenciaron la fijación del complemento, que indica una función influyente de esta bisagra.
En algunas realizaciones, el agente que comprende una pluralidad de polipéptidos modificados comprende además moléculas o dominios adicionales que potencian la eficacia de un anticuerpo monoclonal anticancerígeno. Por ejemplo, moléculas o dominios adicionales puede disminuir la inmunogenicidad. En una realización, el agente
55 comprende además uno o más cadenas de polietilenglicol (PEG). Las cadenas de PEG conjugadas con polipéptidos terapéuticos pueden proporcionar diversas ventajas, tales como elevado tamaño para reducir la filtración de agente en el riñón, para enmascarar epítopes antigénicos, aumentar la solubilidad del agente debido a la hidrofobia de PEG y reducida accesibilidad del agente para enzimas proteolíticas y anticuerpos. Así, la terapia puede potenciarse mediante la PEGilación por elevada retención del agente en el cuerpo, una reducción de la inmunogenicidad del agente y elevada estabilidad del agente. Está madurando la química de PEGilación y se conocen una variedad de cadenas de PEG con atributos variables. También se conocen estrategias para llevar a cabo la PEGilación mientras que se preserva la actividad del agente. Para una revisión, véase Veronese, F.M., y Pasut, G., Drug Discovery Today 10:1451-1458 (2005).
65 Dosificaciones y vías de administración
34
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E10764877
21-07-2015
Tabla 4: Inmuno-reactividad de proteínas de botón de fibra de Ad35 después de infección en ratones
Ad35K
Ad35K++ Ad35 virus
Mancha Coomassie
++ ++ +
Western (suero después de régimen de vacunación: serie de tres inyecciones subcutáneas)
+ ++ -
Western (suero después de régimen terapéutico: administración única IV)
- - -
10
Como se muestra anteriormente en la Tabla 4, se detectaron anticuerpos en suero que reaccionaban con Ad35K++ y, a un menor grado, con Ad35K en ratones que recibieron tres inyecciones subcutáneas de las proteínas recombinantes; sin embargo, no se observaron anticuerpos detectables cuando proteínas Ad35K++ recombinantes o
15 Ad35K se inyectaron intravenosamente. Esto es probablemente debido a la ineficaz captación de las proteínas recombinantes (Ad35K++ o Ad35K) por células presentadoras de antígeno después de la inyección intravenosa.
La Tabla 5 muestra los parámetros hematológicos después de la inyección de Ad35K++. Ratones transgénicos para CD46 macho y hembra (cepa MCP8B) se inyectaron intravenosamente con 50 mg de Ad35K++ y se analizaron 20 muestras de sangre 16 y 48 horas después. Se muestra el promedio de dos mediciones en comparación con animales tratados de control. En ratones, el homólogo de CD46 se expresa solo en el testículo. Así, los ratones transgénicos que expresan huCD46 en un patrón y a niveles similares a seres humanos pueden ser un mejor modelo para estudios de seguridad. La misma dosis de Ad35K++ que se usó en los estudios de terapia se inyectó intravenosamente en ratones C57B1/6 inmunocompetentes transgénicos para huCD46 (cepa MCP-8B). Los análisis
25 de las cifras de células sanguíneas y otros parámetros hematológicos 6 y 48 horas después de la inyección de Ad35K++ no mostraron anomalías (TABLA 5). En la autopsia (día 14 p.i.), no se encontraron cambios patológicos o histológicos en todos los órganos analizados (cerebro, pulmón, corazón, hígado, riñón, intestinos, médula ósea).
Tabla 5: Parámetros hematológicos después de la inyección de Ad35K++
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40
45
50
55
60
Simulado
Ad35K++ (16h p.i.) Ad35K++ (48h p.i.)
Masculino
Femenino Masculino Femenino Masculino Femenino
Glóbulos Blancos de Sangre (K/ml)
11.98 10.62 10.61 12.7 11.92 10.76
Neutrófilos (%)
19.91 23.15 22.56 30.1 22.27 22.21
Linfocitos (%)
75.93 69.88 68.46 62.28 68.69 72.12
Monocitos (%)
6.18 6.49 7.46 6.14 6.44 5.33
Eosinófilos (%)
0.92 0.39 1.3 1.2 2.17 0.25
Basófilos (%)
0.06 0.09 0.23 0.28 0.43 0.1
Glóbulos Rojas de Sangre (M/ml)
9.52 9.31 9.28 8.81 9.23 9.52
Plaquetas (K / ml)
721 781 605 586 539 843
Hemoglobina (g/dL)
16.2 16 15.1 14.7 15.3 15.2
Sodio (mEq/L)
156 152 152 154 152 154
Potasio (mEq/L)
8.2 6.8 7.2 7.6 8.2 8.2
Cloruro (mEq/L)
120 120 118 120 116 120
Dióxido de carbono (mEq/L)
18 20 18 22 20 16
Ion Gap
18 12 16 12 16 18
Glucosa (mg/dL)
110 168 128 158 142 120
Urea Nitrogeno (mg/dL)
18 18 20 18 14 16
Creatinina (mg/dL)
0.2 <0.1 <0.1 <0.1 0.2 0.2
Proteina (Total) (g/dL)
5 4.8 5 5 4.8 4.6
50
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