ES2543630T3 - Anticuerpos dirigidos contra el complejo E1E2 del virus de la hepatitis C y sus epítopos - Google Patents

Anticuerpos dirigidos contra el complejo E1E2 del virus de la hepatitis C y sus epítopos Download PDF

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Christian Trepo
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Biomerieux SA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Abstract

Utilización de un péptido que comprende una secuencia definida por SEC ID nº 1, SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3, para detectar en el suero de un paciente infectado por VHC la presencia de anticuerpos específicos que pueden reaccionar simultáneamente con las tres regiones de E1 y E2 reconocidas por el anticuerpo monoclonal secretado por el hibridoma depositado en la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, París, Francia) el 19 de marzo de 2003, bajo el número de acceso CNCM 1-2983, en el que dichas tres regiones de E1 y E2 están constituidas por cada una de las secuencias siguientes: - los aminoácidos 297 a 306 de la proteína E1 del VHC (SEC ID nº 1); - los aminoácidos 480 a 494 de la proteína E2 del VHC (SEC ID nº 2); y - los aminoácidos 613 a 621 de la proteína E2 del VHC (SEC ID nº 3).

Description

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siguiente:
- por lo menos dos ultracentrifugaciones de una muestra resultante de una plasmaféresis clarificada de un
paciente infectado por VHC, con el fin de obtener un sedimento enriquecido en VHC, 5
- resuspensión del sedimento enriquecido en VHC en una solución acuosa,
- ultracentrifugación del sedimento resuspendido enriquecido en VHC en un gradiente de densidad de sacarosa,
con el fin de separar en fracciones según su densidad los elementos del sedimento resuspendido enriquecido en 10 VHC,
- recuperación de las fracciones que contiene entre aproximadamente 5x105 y aproximadamente 106 UI de ARN de VHC por ml, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100 pg de proteína nuclear de VHC por ml, y que contienen partículas que pueden unirse al anticuerpo monoclonal definido anteriormente como D32.10 o D4.12.9,
15 con el fin de obtener una composición purificada de partículas víricas completas de VCH con cubierta.
La etapa de selección puede realizarse tal como se ha indicado anteriormente.
Según otra forma de realización, la invención describe un procedimiento para preparar un anticuerpo monoclonal 20 dirigido contra el VHC, en particular partículas subvíricas de VHC con cubierta, que comprende las etapas siguientes:
- inmunizar un animal, en particular un mamífero, con una composición de partículas subvíricas de VHC con
cubierta descrita en el presente documento, o preparada tal como se describe en el presente documento, y 25 recuperar los anticuerpos generados,
- seleccionar, de entre los anticuerpos generados, anticuerpos monoclonales según su capacidad de unirse a partículas subvíricas de VHC con cubierta contenidas en la composición anteriormente indicada de partículas subvíricas de VHC con cubierta.
30 La composición de partículas subvíricas de VHC con cubierta puede obtenerse de la manera siguiente:
- por lo menos dos ultracentrifugaciones de una muestra resultante de una plasmaféresis clarificada de un
paciente infectado por VHC, con el fin de obtener un sedimento enriquecido en VHC, 35
- resuspensión del sedimento enriquecido en VHC en una solución acuosa,
- ultracentrifugación del sedimento resuspendido enriquecido en VHC en un gradiente de densidad de sacarosa,
con el fin de separar los elementos en fracciones según su densidad del sedimento resuspendido enriquecido en 40 VHC,
- recuperación de las fracciones que no contienen sustancialmente ARN de VHC, sustancialmente exentas de proteína nuclear de VHC y que contienen partículas que pueden unirse al anticuerpo monoclonal definido anteriormente como D32.10 o D4.12.9, con el fin de obtener una composición de partículas subvíricas de VHC
45 con cubierta.
La etapa de selección puede realizarse tal como se ha indicado anteriormente.
La presente invención describe más particularmente anticuerpos dirigidos contra las partículas subvíricas de VHC 50 con cubierta de la invención.
La invención también describe una composición farmacéutica que comprende como sustancia activa por lo menos un anticuerpo dirigido contra partículas subvíricas de VHC con cubierta y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
55 Según otra forma de realización, la invención describe una composición farmacéutica que comprende como sustancia activa las partículas subvíricas de VHC con cubierta tal como se han definido anteriormente, o la composición que comprende las partículas subvíricas de VHC con cubierta tal como se han definido anteriormente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
60 Adicionalmente, pueden añadirse a la composición farmacéutica adyuvantes, tales como los definidos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Mack Publishing Co.; los adyuvantes pueden ser, por ejemplo, adyuvante incompleto de Freund, sales de aluminio o hidróxido de aluminio.
La composición puede administrarse, por ejemplo, en una sola dosis que comprenda entre 1 mg y 1 g de partículas 65 subvíricas de VHC con cubierta.
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45
55
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Según otra realización, la invención describe la utilización de las partículas subvíricas de VHC con cubierta definidas anteriormente, o de la composición que comprende las partículas subvíricas de VHC con cubierta definidas anteriormente, para inducir una reacción inmunológica contra dichas partículas subvíricas de VHC con cubierta o contra partículas víricas completas de VHC con cubierta definidas anteriormente.
La expresión “inducir una reacción inmunológica” se refiere a que las células B secretoras de anticuerpos dirigidos contra las partículas víricas de VHC pueden activarse o a que las células T que destruyen células infectadas por VHC pueden activarse.
Según otra forma de realización, la invención describe la utilización de las partículas subvíricas de VHC con cubierta definidas anteriormente, o de la composición que comprende partículas subvíricas de VHC con cubierta definidas anteriormente, para la preparación de un medicamento destinado al diagnóstico, a la prevención o al tratamiento de las infecciones por VHC.
Las partículas subvíricas de VHC con cubierta pueden utilizarse para evaluar la presencia de anticuerpos dirigidos contra el VHC en inmunoensayos según un método bien conocido por el experto en la materia, tal como EIA o ELISA.
Las partículas subvíricas de VHC con cubierta pueden utilizarse para la preparación de una vacuna contra la hepatitis C, en particular una vacuna terapéutica.
La expresión “vacuna terapéutica” se refiere a que la vacuna puede mejorar el estado de un paciente infectado por VHC, por ejemplo mediante la inducción de la producción de anticuerpos dirigidos contra el VHC.
Descripción de las figuras
Figuras 1A, 1B, 1C, 1D y 1E
Las figuras 1A, 1B, 1C, 1D y 1E representan electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE) de lisados de anticuerpos precipitados de células marcadas con 35S. Los carriles 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 corresponden, respectivamente, a los anticuerpos C9.19.16, C2.22.1, D32.10, D3.20.12, C7.24.19, C7.14.41 y C1.9.3. El acrónimo “MW” corresponde a un marcador de peso molecular. El tamaño de las bandas correspondiente al marcador de peso molecular, se presentan a la derecha del gel. Si resulta posible, las bandas se identifican a la izquierda del gel como E1, E2 o Ag (de “agregado”).
La figura 1A representa un SDS-PAGE de lisados de anticuerpos precipitados de células de control marcadas con35S, bajo condiciones reductoras.
La figura 1B representa un SDS-PAGE de lisados de anticuerpos precipitados de células marcadas con 35S que expresan proteína E1 de VHC, bajo condiciones reductoras.
La figura 1C representa un SDS-PAGE de lisados de anticuerpos precipitados de células marcadas con 35S que expresan proteína E2 de VHC, bajo condiciones reductoras.
La figura 1D representa un SDS-PAGE de lisados de anticuerpos precipitados de células marcadas con 35S que expresan proteína E1E2 de VHC, bajo condiciones reductoras.
La figura 1E representa un SDS-PAGE de lisados de anticuerpos precipitados de células marcadas con 35S que expresan proteína E1E2 de VHC, bajo condiciones no reductoras.
Figura 2
La figura 2 representa la transferencia western de partículas víricas de VHC, utilizando el anticuerpo monoclonal D32.10, bajo condiciones no reductoras y reductoras. De izquierda a derecha, M representa un marcador de peso molecular, bajo condiciones no reductoras, indicándose el tamaño de sus bandas a la izquierda del gel (en kDa); el carril 1 representa la transferencia western de las partículas víricas de VHC, utilizando el anticuerpo monoclonal D32.10, bajo condiciones no reductoras; el segundo carril M representa un marcador de peso molecular, bajo condiciones reductoras; el carril 2 representa la transferencia western de 2,5 µg de partículas víricas de VHC, utilizando anticuerpo monoclonal D32.10, bajo condiciones reductoras; el carril 3 representa la transferencia western de 5 µg de partículas víricas de VHC, utilizando el anticuerpo monoclonal D32.10, bajo condiciones reductoras. A la derecha del gel, se indica el tamaño de varias bandas del carril 3 (en kDa), algunas correspondientes a la proteína E2 de VHC (60 y 68) o a la proteína E1 de VHC (34 y 31).
Figuras 3A y 3B
Las figuras 3A y 3B representan la transferencia western de partículas víricas de VHC sometidas a desglucosilación
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partículas víricas de VHC. Los híbridos que proporcionaban la señal más fuerte (P/N>10) contra VHC se clonaron a continuación nuevamente mediante dilución limitante y se determinó adicionalmente su especificidad. Se seleccionaron siete clones (C9.19.16, C2.22.1, D32.10, D3.20.12, C7.24.19, C7.14.41 y C1.9.3) y se propagaron cuatro (D32.10, C2.22.1, C9.19.16 y D3.20.12) mediante inyección en ratones BALB/c cebados con pristano para la producción de líquido ascítico, y después se purificaron mediante precipitación con (NH4)2SO4 saturado al 50% seguido de cromatografía de afinidad en sefarosa-proteína G (Pharmacia, Francia). Se determinó el isotipo mediante ELISA utilizando métodos conocidos por el experto en la materia. Los siete clones analizados proporcionaron anticuerpos del isotipo IgG1.
Caracterización de anticuerpos monoclonales
Se utilizó el EIA indirecto para evaluar la interacción de los anticuerpos monoclonales anteriormente indicados con las partículas víricas. Se recubrieron placas de 96 pocillos de poliestireno (Falcon; Becton Dickinson Francia S.A., Le Pont de Claix) con la preparación de VHC (1 mg de proteína por ml) diluida de 10-1 a 10-6 (correspondiente de 100 µg/ml a 1 ng/ml). Las placas se incubaron durante la noche a 4ºC y después se saturaron con tampón Tris-NaCl (TN) (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5 y NaCl 100 mM) que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 5% (p/v). A cada pocillo se añadieron MAb D32.10 diluido en una mezcla de tampón TN/BSA y suero humano normal (NHS) al 50% a una concentración de 5 µg/ml y se incubó durante 2 horas a 37ºC. El anticuerpo unido se detectó con el fragmento F(ab')2 conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRPO) de inmunoglobulinas antirratón (diluido 1/5.000; Immunotech) y con ortofenilendiamina (OPD) y peróxido de hidrógeno (H2O2) como sustratos. Se determinó la densidad óptica (DO) a 450 nm con un lector de placas ELISA (MRX, Dynex). Los resultados se consideraron positivos en el caso de que fuesen superiores al valor de corte, correspondientes a la media de los controles negativos multiplicada por 2,1. Los siete anticuerpos obtenidos no reconocieron las partículas víricas.
Con el fin de establecer la especificidad del polipéptido nativo de los mAb, se llevó a cabo inmunotransferencia utilizando el inmunógeno a modo de sondas antigénicas (Petit et al., 1987). Se llevó a cabo una electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico (SDS)-poliacrilamida (PAGE) en geles al 12,5% bajo condiciones reductoras (SDS al 2% + 2-ME al 5%). Tras la transferencia de proteínas a membranas de PVDF, se sometieron a ensayo los mAb (2 a 5 µg/ml) a modo de anticuerpos primarios, diluidos en NHS al 50%, y las IgG unidas se detectaron mediante incubación con fragmento (Fab')2 conjugado con peroxidasa de inmunoglobulinas antirratón (diluido 1/10.000, IMMUNOTECH), como anticuerpo secundario. Las bandas se visualizaron mediante un sistema de quimioluminiscencia mejorada (ECL+) de Amersham.
Todos los mAb sometidos a ensayo excepto D3.10 proporcionaron reacciones negativas con polipéptidos de VHC bajo condiciones reductoras. Debe indicarse que los mAb no eran reactivos con albúmina sérica humana ni con las cadenas  o  de inmunoglobulinas (Ig), excepto C1.9.3 y C7.24.19, que reaccionaron débilmente con la IgG humana en el EIA (aproximadamente 5 veces el valor negativo).
La especificidad de polipéptido de los siete anticuerpos también se examinó mediante inmunoprecipitación. Las células HepG2 infectadas por recombinantes de virus Vaccinia que expresaban proteínas del VHC (E1, E2 o E1E2) se marcaron metabólicamente con 35S-Translabel (ICN) tal como se ha descrito anteriormente (Dubuisson et al., 1996). Las células se lisaron con NP-40 al 0,5% en Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM y EDTA 2 mM. Los precipitados se trataron con tampón para muestras de Laemmli y se analizaron mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras (figura 1). Los anticuerpos monoclonales sometidos a ensayo no mostraron reactividad no específica dirigida contra componentes celulares, excepto C9.19.16 (>200 kDa), D3.20.12 (tres bandas intensas en 70, 50 y 46 kDa) y más débilmente, C2.22.1 (70, 50 y 46 kDa) y D32.10 (múltiples bandas muy débiles) (figura 1A, vector de control). Todos los anticuerpos inmunoprecipitaron específicamente E1 (figura 1B) y E2 (figura 1C), en el caso de que se expresasen las dos glucoproteínas de VHC separadamente, así como los heterodímeros E1E2 (figura 1D), en el caso de que se coexpresasen estas proteínas. Resulta interesante que el patrón era diferente tras la SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras y reductoras (figuras 1D, 1E). Todos reconocieron los agregados E1E2 unidos mediante enlaces disulfuro, que se detectaron en la parte superior de los geles bajo condiciones no reductoras (figura 1E). Se descubrió que un mAb, D32.10, reaccionaba principalmente con agregados y también con complejo E1E2 maduro no unido covalentemente (figura 1E, condiciones no reductoras). Todos los mAb no reconocieron las proteínas E1 o E2 recombinantes desnaturalizadas expresadas en el sistema heterólogo mediante análisis de transferencia western, sugiriendo que reconocían epítopos conformacionales sobre las partículas víricas de VHC. En conjunto, estos resultados indican que estos mAb reconocen específicamente complejos E1E2 unidos mediante enlaces disulfuro, expresados en la superficie de partículas víricas de VHC derivadas de suero natural. Es altamente probable que reaccionen con un epítopo conformacional compartido por las proteínas E1 y E2. Se seleccionó para estudios posteriores el anticuerpo monoclonal D32.10, que interactúa con el complejo E1E2 bajo su forma covalente o no covalente.
Mapeado de antígenos del anticuerpo monoclonal D32.10
Con el fin de someter a ensayo la especificidad de tipo de VHC de D32.10, se llevó a cabo un EIA indirecto, siguiendo el procedimiento ya descrito, con cuatro preparaciones de VHC diferentes (1 mg de proteína por ml) diluidas de 10-1 a 10-6 (correspondiente a 100 µg/ml a 1 ng/ml). Además de la preparación de inmunógeno VHC, se
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de D32.10 (fracción diluida a 1/10) nula o muy baja en las fracciones correspondientes a los complejos de baja densidad (1,006 a 1,10 g/ml). Se obtuvieron resultados similares con el aislado VHC-L (figura 14A) de genotipo 1b y con el aislado VHC-Fan (figura 14C) de genotipo 1a/2a. Algunas fracciones (6, 8, 10, 12 y 14) del aislado VHC-L (figura 14B) y todas las facciones (4 a 18) del aislado VHC-Fan se sometieron a SDS-PAGE y transferencia western con el MAb D32.10. La reactividad de E1E2-D32.10 apareció claramente entre la fracción 8 (densidad: 1,10 g/ml) y el fondo del gradiente. Debe indicarse que la reactividad de E1E2 más fuerte se observó en las fracciones 11, 12 y 13 (figura 14D), correspondientes a las densidades 1,17 a 1,20 g/ml. Pudieron detectarse unas bandas de peso molecular más alto (HMW) en estas fracciones, correspondiendo probablemente a formas oligoméricas de las glucoproteínas de cubierta E1 y E2 presentes sobre la superficie de las partículas víricas, generando bandas en dichas densidades. Se observó otra reactividad fuerte contra tanto E2 como E1 en la fracción 9 (densidad de 1,13 g/ml) correspondiente al pico del EIA (figura 14C). Todas las preparaciones de VHC derivadas de suero proporcionaron los mismos perfiles de bandeo en el equilibrio de la reactividad de E1E2-D32.10 en gradientes de densidad de sacarosa (10% a 60%).
Con el fin de caracterizar adicionalmente las poblaciones de VHC con cubierta, el sedimento de VHC-Fan se sometió a centrifugación isopícnica en un gradiente de sacarosa de 30% a 45% de tipo 1 (2 ml de 30%, 3 ml de 35%, 3 ml de 40%, 2 ml de 45%). Bajo estas condiciones experimentales, pudieron individualizarse claramente dos picos de reactividad de E1E2-D32.10, tal como se muestra en la figura 15A. El EIA indirecto reveló un primer pico estrecho (pico 1) a una densidad de aproximadamente 1,15 g/ml y un segundo pico grande y ancho (pico 2) a una densidad de aproximadamente 1,18 a 1,22 g/ml. Las partículas de los picos 1 (fracción 8) y 2 (fracciones 12 y 13) del gradiente de sacarosa (30% a 45%) se sometieron individualmente a una segunda centrifugación de equilibrio. El pico 1 se centrifugó en un gradiente de sacarosa de 30% a 45% de tipo 2 (3 ml de 30%, 3 ml de 35%, 2 ml de 40%,2 ml de 45%) (figura 15B). Únicamente un pico antigénico E1E2 estrecho (pico 1) se desplazó hasta una densidad de 1,13 a 1,14 g/ml (aproximadamente sacarosa al 32%, fracciones 5 y 6). El pico 2 se centrifugó en un gradiente de sacarosa de 30% a 45% de tipo 3 (2 ml de 30%, 2 ml de 35%, 3 ml de 40% y 3 ml de 45%) (figura 15C). Un pico principal (pico 2) sedimentó mucho más rápido, mostrando antigenicidad de E1E2 máxima a una densidad de aproximadamente 1,18 g/ml (correspondiente a sacarosa al 40%). El último pico antigénico E1E2 (pico 2) presentaba una apariencia asimétrica, con las densidad más bajas desplazadas hacia adelante, y con ligero solapamiento con el bandeo de la población E1E2 a una densidad en sacarosa de 1,14 g/ml (pico 1), sugiriendo una mayor heterogeneidad que el pico antigénico E1E2 anterior (pico 1) (figuras 15B, 15C).
Con el fin de elucidar las diferentes de densidad de flotación entre las dos poblaciones de partículas víricas con cubierta E1E2 (picos 1 y 2), las fracciones de gradiente de sacarosa de 30% a 45% de tipo 1 indicadas anteriormente se sometieron a ensayo para el antígeno nuclear de VHC mediante el ensayo de núcleo de VHC Ortho (figura 9A) y mediante transferencia western (figura 15B).
Brevemente, se determinó la especificidad de polipéptido mediante inmunotransferencia utilizando muestras de VHC a modo de sondas antigénicas (1 a 5 µg/ml). Se llevó a cabo una electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico (SDS)-poliacrilamida (PAGE) en geles al 12,5% bajo condiciones reductoras (SDS al 2% + 2-ME al 5%). Tras la transferencia de proteínas a membranas de PVDF, se utilizó el mAb D32.10 anti-E1E2 (2 a 5 µg/ml) o los MAb antinúcleo 7G12A8, 2G9A7 y 19D9D6 (5 µg/ml cada uno) como anticuerpos primarios, diluidos en NHS al 50% y las IgG unidas se detectaron mediante incubación con fragmento (Fab')2 conjugado con HRPO antiinmunoglobulinas de ratón (diluido 1/10.000, obtenido de Immunotech), como segundo anticuerpo. Los filtros se revelaron con un sistema de quimioluminiscencia mejorada (ECL Plus) de Amersham.
Ambos enfoques experimentales demostraron que se recuperaba la reactividad máxima de antígeno nuclear de VHC en el segundo pico antigénico E1E2 (pico 2) a una densidad de aproximadamente 1,17 a 1,19 g/ml (sacarosa al 40%). Mediante análisis de transferencia western (figura 9B), se identificó la proteína nuclear del VHC de 25 kDa en el material inicial (sedimento VHC-Fan) y en las fracciones 8 a 13. También se detectaron bandas en 50, 75 y 150 kDa, que podrían corresponder a oligómeros del producto codificado por el gen nuclear de VHC. Se analizó el ARN de VHC mediante el ensayo cuantitativo RT-PCR Monitor (Roche) de todas las fracciones del gradiente inicial de sacarosa de 10% a 60% (figura 10). Se observaron dos picos de ARN vírico a una densidad de 1,055 a 1,075 g/ml y a una densidad de 1,16 a 1,21 g/ml. El título total de este último pico era de 106 IU/ml y correspondía al segundo pico antigénico de E1E2 (pico 2). En contraste, la fracción 9 (densidad de 1,13 g/ml), que correspondía al pico 1, contenía el título más bajo de ARN de VHC. De esta manera, el pico 2 (aproximadamente 1,17 a 1,20 g/ml) contenía complejos E1E2, proteína nuclear de VHC y un título elevado de ARN de VHC y probablemente representa viriones completos. El pico 1 (1,13 a 1,15 g/ml) contenía principalmente complejos E1E2 y probablemente representa partículas subvíricas (SVP). Los complejos de baja densidad (1,006 a 1,10 g/ml) contenía únicamente núcleo y ARN de VHC, correspondiendo a nucleocápsides desnudas.
De esta manera, utilizando el anticuerpo monoclonal D32.10 de la invención, se analizaron los tipos más prevalentes de partículas víricas con cubierta presentes en el suero de pacientes de hepatitis C crónica. Mediante sedimentación en gradientes de sacarosa del material vírico concentrado, análisis de la composición de proteínas (proteínas de núcleo y de cubierta) mediante inmunoensayos e inmunotransferencia, acoplado al seguimiento del ARN de VHC mediante RT-PCR cuantitativa, se identificaron dos poblaciones de partículas con cubierta de E1E2 que sedimentaban en dos densidades diferentes, 1,13-1,15 g/ml y 1,17-1,21 g/ml, respectivamente. La primera población
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(Mason et al., 1991). También se observan en células infectadas por virus de la hepatitis B (VHB) y se producen SVP que se secretan, mediante expresión de solo proteínas de cubierta (Laub et al., 1983). Estas partículas son de menor tamaño que los viriones. Esto demuestra que estas proteínas son capaces intrínsecamente de autoformar estructuras particuladas específicas en presencia o en ausencia de un núcleo. Estas partículas se ensamblan y experimentan el mismo proceso de maduración que los viriones completos, incluyendo la glucosilación y procesamiento con carbohidratos. La inmunización con dichas SVP con cubierta recombinantes muestra que son excelentes inmunógenos protectores en modelos animales (Konishi et al., 1992; Heinz et al., 1995), así como en seres humanos (Leroux-Roels et al., 1994).
La reactividad de los viriones completos y de las SVP con mAb D32.10 demuestra que el epítopo conformacional E1(297-306)-E2(480-494) (613-621) se presenta esencialmente de la misma manera sobre la superficie de los viriones de VHC y sobre las SVP. Sin embargo, dicho epítopo detectado sobre viriones y SVP derivados de suero no se encuentra sobre partículas obtenidas mediante recombinación genética y se produce en sistemas heterólogos de baculovirus/células de insecto (Baumert et al., 1999) o de retrovirus/células 293T (Bartosch et al., 2003), sugiriendo que este sitio compuesto se encuentra ausente y/o presente en regiones inaccesibles separadas sobre las superficies de dichas partículas de VHC recombinantes. Las primeras partículas de tipo VHC (VHC-LP) se retuvieron en el RE, y sólo una fracción reducida de dichas pseudopartículas de VHC (VHCpp) alcanzó la superficie celular. Debe indicarse que mAb D32.10 no es reactivo con HSA o con las cadenas  o  de inmunoglobulinas. Puede inmunoprecipitar específicamente E1 y E2, así como los heterodímeros E1E2, en el caso de que estas dos proteínas sean expresadas separadamente o conjuntamente por virus Vaccinia recombinantes en células HepG2. De esta manera, reacciona principalmente con agregados unidos mediante enlaces disulfuro y más débilmente con complejo E1E2 maduro no unido covalentemente. Sin embargo, no reconoce la proteína E1 o E2 recombinante y desnaturalizada expresada en dicho sistema heterólogo, según el análisis de transferencia. Esto concuerda con una organización de E1, E2 y E1E2 sobre la superficie del virus derivado de suero que es diferente de la presente en las partículas de VHC recombinantes. La estructura natural depende de las condiciones de ensamblaje. En el caso de que las condiciones que regulan la formación de una estructura única no se encuentren presentes en sistemas heterólogos, la organización del dímero en las VLP y VHCpp no es similar, en contraste con la similitud entre las superficies de las SVP y de los viriones en el caso de que se aíslen ambas del suero de pacientes infectados. Una característica particularmente notable del empaquetamiento de las proteínas de cubierta (E) de los flavivirus, entre ellos el virus de la encefalitis transmitida por garrapata (TBEV), en partículas subvíricas recombinantes (RSP) y en viriones, es que se disponen planas sobre la superficie vírica, en una orientación de cabeza-a-cola (Ferlengi et al., 2001). La superficie lateral del dominio III, que presenta un pliegue de tipo Ig y participa en la unión a receptores, es accesible, mientras que el péptido de fusión es un bucle interno (Rey et al., 1995). Por lo tanto, los flavivirus entran en las células mediante endocitosis mediada por receptores y fusión inducida por pH bajo en endosomas (Rice, 1996). Se cree que una partícula en ensamblaje obtiene su cubierta mediante gemación a través de la membrana del RE o de un compartimiento intermedio de la ruta secretoria temprana. A continuación, las partículas son transportadas a través de la red trans-Golgi (TGN) hasta la membrana plasmática, maduran y de esta manera adquieren sacáridos complejos. Todas estas etapas resultan cruciales para el ensamblaje del virus y desempeñan un papel crucial en muchas etapas del ciclo de replicación.
Inesperadamente, todas las partículas de VHC muestran aparentemente unas propiedades biofísicas similares con independencia de su origen. El patrón de sedimentación en gradiente de sacarosa de las VHC-LP ensambladas en células de insecto, derivadas a partir de ADNc de VHC cepa J o del clon infeccioso H77c, era de entre 1,14 y 1,20 g/ml en gradientes de sacarosa en el equilibrio (Wellnitz et al., 2002). La mayoría de las partículas presentaba un diámetro de entre 40 y 60 nm. Sin embargo, todos los epítopos presentados sobre los ectodominios de E1 y E2 de la superficie externa de las VHC-LP (Wellnitz et al., 2002) eran diferentes de la especificidad para E1 y E2 ofrecida por el MAb D32.10. Por lo tanto, aunque las partículas sedimenten a la misma densidad en sacarosa, presentan diferentes inmunorreactividades, lo que puede relacionarse con un transporte y/o plegamiento incorrectos, y evidentemente resulta en diferentes propiedades funcionales, en términos de unión e infectividad celulares.
Al contrario que las partículas de VHC con cubierta del suero, las partículas de núcleo de VHC aisladas a partir del plasma de individuos infectados por VHC aparentemente son similares a las partículas de tipo nucleocápside producidas en las células de insecto. Las nucleocápsides de VHC generaban una banda a una densidad de entre 1,32 y 1,34 g/ml en el gradiente de CsCl y presentaban un tamaño muy heterogéneo, de entre 38 y 62 nm de diámetro (Maillard et al., 2001). Todas estas partículas eran reactivas con mAb antinúcleo, pero no con mAb anti-E1 y anti-E2 producidos mediante inmunización con proteínas recombinantes (Deleersnyder et al., 1997; Dubuisson et al., 1994).
De esta manera, diferentes tipos de partículas de tipo VHC (VHC-LP, nucleocápsides de VCH de suero, viriones de VHC de suero) presentan algunas similitudes de tamaño y/o densidad, pero muestran diferentes propiedades antigénicas (plegamiento incorrecto o correcto de los complejos E1E2, viriones con cubierta o nucleocápsides sin cubierta). Por lo tanto, conjuntamente lo anterior demuestra que resulta crucial disponer de buenas herramientas inmunológicas para analizar las propiedades antigénicas reales de las partículas de VHC, para identificar así los viriones de VHC naturales.
A partir de dichos datos y de los de otros (Andre et al., 2002; Maillard et al., 2001), podría obtenerse una mejor
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