ES2544573T3 - Inhibidores diméricos de afinidad elevada de PSD-95 y su uso para el tratamiento del daño cerebral isquémico y del dolor - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que comprende un primer péptido unido a un segundo péptido mediante un ligador, en el que el primer y el segundo péptido comprenden al menos cuatro residuos unidos por amida que tienen una secuencia YTXV o YSXV, en la que a. Y se selecciona de E, Q, y A, y b. X se selecciona de A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D, y N-Me-N, y en el que el ligador comprende PEG y, en el que al menos un átomo de oxígeno del PEG está sustituido por un átomo de nitrógeno para proporcionar NPEG, en el que un péptido de penetración celular (CPP) está unido al átomo de nitrógeno del ligador mediante un enlace amida, y en el que el CPP comprende al menos 4 residuos de aminoácidos seleccionados de arginina y/o lisina.
Description
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E12720862
20-07-2015
un código de 3 letras en letras minúsculas indica un aminoácido de forma D;
"que comprende" se debería entender de manera inclusiva. Por lo tanto, a modo de ejemplo, una composición que comprende el compuesto X puede comprender el compuesto X y opcionalmente compuestos adicionales; CFA, adyuvante completo de Freund; SNC, sistema nervioso central; CPP, péptido de penetración celular; caracterizado por la capacidad de atravesar la membrana plasmática de las
células de mamífero, y de ese modo puede dar lugar a la administración intracelular de moléculas de carga, tales como péptidos, proteínas, oligonucleótidos a los que esté unido;
DCM, Diclorometano; Inhibidor de PSD-95 dimérico, es un inhibidor de PSD-95 que comprende dos péptidos o análogos de péptidos, que están unidos de manera covalente por medio de un ligador, capaz de unirse a, o interaccionar con, PDZ1 y PDZ2 de PSD-95 de manera simultánea, por lo tanto;
P0, Definido como el primer residuo de aminoácido o análogo que corresponde al aminoácido C-terminal del
péptido/análogo de péptido; P-1, Definido como el segundo residuo de aminoácido o análogo del mismo contando desde el aminoácido C-terminal del péptido/análogo de péptido;
P-2, Definido como el tercer residuo de aminoácido o análogo del mismo contando desde el aminoácido C-terminal
del péptido/análogo de péptido; P-3, Definido como el cuarto residuo de aminoácido o análogo del mismo contando desde el aminoácido C-terminal del péptido/análogo de péptido;
P-4, Definido como el quinto residuo de aminoácido o análogo del mismo contando desde el aminoácido C-terminal
del péptido/análogo de péptido; P-5, Definido como el sexto residuo de aminoácido o análogo del mismo contando desde el aminoácido C-terminal del péptido/análogo de péptido;
DIPEA, diisopropiletilamina; DMF, N,N-Dimetilformamida; Resto de etilen glicol, en la presente memoria se refiere a la unidad estructural que constituye un ligador de PEG o
NPEG. Un nombre más técnico de un "resto de etilen glicol" es "oxietileno", y la fórmula química de la unidad se muestra aquí:
PF, polarización de fluorescencia; HATU, hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio; HBTU, hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio Célula de mamífero, pretende indicar cualquier célula de origen mamífero. La célula puede ser una línea celular
establecida, muchas de las cuales están disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC, Virginia, EE.UU.) o una célula primaria con una vida limitada obtenida de un tejido de mamífero, que incluye los tejidos obtenidos de un animal transgénico, o una línea celular inmortal recién establecida obtenida de un tejido de mamífero, que incluye los tejidos transgénicos, o una célula o línea celular híbrida obtenida fusionando tipos celulares diferentes de origen mamífero, p.ej., líneas celulares de hibridoma. Las células pueden expresar opcionalmente uno o más productos de genes que no son nativos, p.ej. receptores;
MCAO, oclusión de la arteria cerebral media; nNOS, óxido nítrico sintasa neuronal; NO, óxido nítrico; NMDA, N-metil-D-aspartato;
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N-hidroxisuccinimida (NHS), éster de p-nitrofenilo, carbonato de succinimidilo, carbonato de p-nitrofenilo, succinimidil uretano, isocianato, isotiocianato, acil azida, cloruro de sulfonilo, aldehído, carbonato, imidoéster o anhídrido; y grupos tio-reactivos seleccionados de maleimida, haloacetilo, derivados de haluro de alquilo, aziridina, agentes arilantes derivados de acriloilo o reactivos de intercambio de tio-disulfuro. Los grupos funcionales nucleófilos adecuados incluyen amina, hidrazida, carbazato, acil hidrazida, semicarbamato o hidrazina, que pueden experimentar reacciones con grupos aldehído o carboxilo del inhibidor de péptido o de análogo de péptido.
La longitud óptima del ligador en el inhibidor de PSD-95 dimérico dependerá del ligador seleccionado. Cuando el ligador es PEG, el número de restos de etilen glicol (n) de PEG pueden ser n=1-28 o n=4-28, o el ligador puede tener una longitud de n= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12. Se pueden usar PEG-diácidos para unir ligandos (péptidos o análogos de péptidos), en los que, p.ej., el PEG4-ligador esté modificado de forma que haya presentes dos grupos de ácido carboxílico en cada extremo del ligador. Así, un ligador de PEG4-diácido antes del proceso de dimerización se denomina ácido 4,7,10,13,16-pentaoxanonadecan-1,19-dioico. Durante la dimerización del primer y segundo péptidos o análogos de péptidos del inhibidor con el ligador, los dos grupos de ácido carboxílico reaccionan con los grupos amino N-terminales de los péptidos (o análogos de péptidos) para crear enlaces amida. Los ligadores de PEG0,1,2,4,6,8 y 12 están de acuerdo con esta descripción.
Según un primer caso del inhibidor de PSD-95 dimérico, el ligador comprende un derivado de un ligador de PEG-diácido, denominado NPEG, en el que un átomo de oxígeno del esqueleto del ligador de PEG-diácido está sustituido por un átomo de nitrógeno. El átomo de nitrógeno se puede sustituir en cualquiera de átomos de oxígeno del esqueleto del ligador de PEG. Los grupos carbonilo del ligador de NPEG-diácido están unidos al primer y segundo péptido o análogo de péptido, respectivamente, preferiblemente donde la unión es un enlace amida a un residuo terminal del péptido o análogo de péptido.
La Figura 2 ejemplifica un ligador de NPEG de la invención, es decir, el ligador de NPEG4-diácido, en el que el átomo de oxígeno central está sustituido por nitrógeno para generar un ligador de NPEG simétrico, para el uso en el inhibidor dimérico (p.ej. AB141). La Figura 15 ejemplifica un ligador de NPEG de un inhibidor dimérico de la invención en el que el átomo de oxígeno localizado en el esqueleto del ligador de PEG, que está sustituido por nitrógeno, está a uno o dos "restos de etilen glicol" del centro del ligador, lo que da un ligador de NPEG asimétrico (p.ej., como en AB144_B y AB144_C).
El ligador cumple dos funciones. Sirve para unir el primer y segundo péptidos o análogos de péptidos del inhibidor, cuya función es actuar como ligandos que se unen a PDZ1-2 de PSD-95. La afinidad de los péptidos/análogos de péptidos del inhibidor por PDZ1-2 de PSD-95 se incrementa enormemente mediante la dimerización. Además, el átomo de nitrógeno del ligador de NPEG sirve como un "asidero" químico para la derivatización adicional (Figuras 2 y 3).
Según un segundo caso del inhibidor de PSD-95 dimérico, el ligador comprende PEG-diácido, que tiene una longitud de 1 a 28 restos de etilen glicol (n=1-28), preferiblemente de 1 a 12 restos de etilen glicol (n=1-12), más preferiblemente de 4 a 6 restos de etilen glicol (n=4-6). La Figura 2 ejemplifica el ligador de PEG, es decir, el ligador de PEG4-diácido.
I.ii El péptido o análogo de péptido del inhibidor de PSD-95 dimérico
Según el primer o segundo caso del inhibidor de PSD-95 dimérico, el péptido o análogo de péptido tiene una longitud de 10, 9, 8, 7 ó 6 residuos unidos por amida, más preferiblemente una longitud de 5 ó 4 residuos unidos por amida. El péptido o análogo de péptido puede comprender al menos 4 residuos de L-aminoácidos. Preferiblemente, el residuo X del inhibidor se selecciona de A, Q, y D. Los análogos adecuados del residuo Y o X, o los análogos de cualquiera de los 4 residuos unidos por amida (YTXV o YSXV), o los análogos de sus enlaces amida que los conectan, incluyen: D-aminoácidos, aminoácidos peptoides, β-aminoácidos, enlaces dobles olefínicos (E-vinilo), retroamidas, α-azapéptidos, tioésteres, ésteres (depsipéptidos), carba-sustitución de carbonilo (metilaminas), grupos metiltio, alcanos, cetometilenos, hidroxietilenos, hidroxietilaminas, hidroxietilureas, fluoruros de vinilo (Chemistry & Biochemistry of amino acids, peptides, and proteins, vol. 7, 1983, Boris Weinstein, cap. 5, de Arno F. Spatola); tioamidas (Bach et al, J. Med. Chem., 2011, pág. 1333); la unidad aza (resto de 5-dihidro-2(3H)-pirazona), en particular la posición P-1 o P-3 que corresponde al residuo X o Y (Hammond et al, Chem. Biol., 2006, pág. 1247); en donde la elección del análogo se puede facilitar mediante el uso de las herramientas y ensayos para una aproximación de moléculas peptidomiméticas como se describe en la presente memoria. Además, un residuo del primer y/o segundo péptido o análogo de péptido del inhibidor de PSD-95 dimérico puede estar N-alquilado, en el que el residuo N-alquilado está en la posición P-3 que corresponde al residuo Y (documento WO2010/004003). El grupo N-alquilo se puede seleccionar de N-metilo, N-etilo, N-propilo, N-butilo, y N-bencilo. Un grupo N-alquilo especialmente adecuado se puede seleccionar de N-ciclohexilmetilo, N-ciclohexiletilo, N-feniletilo, N-fenilpropilo, N-(3,4-diclorofenil)propilo, N-(3,4-difluorofenil)propilo, N-(naftalen-2-il)etilo.
La Figura 2 ejemplifica un inhibidor de PSD-95 dimérico que tiene un ligador según el primer o segundo caso de la descripción, que comprende un pentapéptido IETAV dimerizado y un ligador de PEG, como en PEG4(IETAV)2 (AB125) o un ligador de NPEG, como en NPEG4(IETAV)2 (AB141).
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I.iii El péptido CPP del inhibidor de PSD-95 dimérico
El inhibidor de PSD-95 dimérico, según el primer o segundo caso, comprende además un tercer péptido que tiene las propiedades de un CPP. Este tercer péptido CPP comprende al menos 4 residuos de D-o L-aminoácidos, pero puede tener una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más residuos de D-o L-aminoácidos. Un CPP preferido tiene una estructura policatiónica y comprende al menos 4 residuos de lisina, o al menos 4 residuos de arginina, o al menos 4 residuos que comprenden residuos tanto de lisina como de arginina (p.ej., péptido Tat; péptidos de poliarginina, tal como 8 argininas; SynB1: RGGRLSYSRRRFSTSTGRA), o al menos 4 aminoácidos que tienen cadenas laterales catiónicas o básicas que son análogos a arginina o lisina, tales como, por ejemplo, 5-hidroxilisina, ornitina, ácido 2-amino-3 (o -4)-guanidinopropiónico, y homoarginina. Un CPP alternativo tiene una estructura anfipática y comprende un patrón alternante de aminoácidos polares/cargados y aminoácidos apolares, hidrófobos (p.ej. penetratina: RQIKIWFQNRRMKWFF; retroinverso-penetratina: kkwkmrrnqfwvrvqr; péptido de modelo anfipático: KLALKLALKLAKAALKA).
La Figura 3 ejemplifica un inhibidor dimérico que tiene un ligador según el segundo caso de la invención, que comprende un pentapéptido IETDV dimerizado, un ligador de NPEG, y un péptido CPP. El CPP es Tat (Secuencia: YGRKKRRQRRR; código de aminoácidos de 1 letra), como en Tat-NPEG4(IETDV)2 (AB144), o Retroinverso-D-Tat (Secuencia: rrrqrrkkr; código de D-aminoácidos de 1 letra), como en Retroinverso-D-Tat-NPEG4(IETDV)2 (AB147).
I.iv Unión del péptido CPP al inhibidor de PSD-95 dimérico
El inhibidor de PSD-95 dimérico, según el primer caso, comprende un CPP que está unido al inhibidor por medio de un enlace químico directamente o indirectamente al átomo de nitrógeno del esqueleto del ligador de NPEG, en el que el átomo de nitrógeno puede estar colocado de manera simétrica o asimétrica en el ligador. La unión del CPP al nitrógeno del ligador de NPEG puede estar mediada por un enlace amida, un acoplamiento de maleimida, un enlace disulfuro, o grupos electrófilos amino-reactivos, seleccionados de éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), éster de p-nitrofenilo, carbonato de succinimidilo, carbonato de p-nitrofenilo, succinimidil uretano, isocianato, isotiocianato, acil azida, cloruro de sulfonilo, aldehído, carbonato, imidoéster o anhídrido; y grupos tio-reactivos seleccionados de haloacetilo, derivados de haluro de alquilo, aziridina, agentes arilantes de derivados de acriloilo.
De manera alternativa, la unión del CPP al nitrógeno del ligador puede estar mediada por un grupo espaciador, en el que un grupo espaciador adecuado puede ser, por ejemplo, cualquier aminoácido tal como cisteína, glicina, alanina; cadenas cortas de alcano o cadenas cortas de PEG/NPEG.
Las Figuras 3 y 15 ejemplifican inhibidores diméricos que comprenden un pentapéptido IETDV dimerizado, un ligador de NPEG, y un CPP. El CPP puede estar unido mediante un enlace amida a un ligador de NPEG simétrico, como en AB144 y AB147; o puede estar unido mediante un enlace amida a un ligador de NPEG asimétrico, como en AB144_B y AB144_C. De manera alternativa, un CPP que comprende una Cys C-terminal puede estar unido por medio de un acoplamiento de maleimida a un grupo maleimida que se prolonga desde el átomo de nitrógeno de NPEG, como en AB144_D. De manera alternativa, un CPP que comprende una Cys C-terminal puede estar unido por medio de un enlace disulfuro (S-S) a un grupo sulfhidrilo que se prolonga desde el átomo de nitrógeno de NPEG, como en AB144_E.
El inhibidor de PSD-95 dimérico, según el segundo caso, comprende un ligador de PEG, y el CPP que está unido a una cadena lateral del primer o segundo péptido o análogo de péptido. El CPP puede estar unido a una cadena lateral de un residuo (p.ej., un aminoácido) en la posición P-1 del primer o segundo péptido o análogo de péptido. Preferiblemente, el CPP está unido a la cadena lateral de un residuo >P-4, o más preferiblemente un residuo P-5 o P-6 (p.ej., aminoácido) de un primer o segundo péptido o análogo de péptido. La unión del CPP a la cadena lateral del residuo puede estar mediada por un enlace amida, un acoplamiento de maleimida, un enlace disulfuro, o grupos electrófilos amino-reactivos, seleccionados de éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), éster de p-nitrofenilo, carbonato de succinimidilo, carbonato de p-nitrofenilo, succinimidil uretano, isocianato, isotiocianato, acil azida, cloruro de sulfonilo, aldehído, carbonato, imidoéster o anhídrido; y grupos tio-reactivos seleccionados de haloacetilo, derivados de haluro de alquilo, aziridina, agentes arilantes de derivados de acriloilo.
La Figura 15 ejemplifica inhibidores diméricos que comprenden un pentapéptido KETDV dimerizado, un ligador de PEG, y un CPP unido a un aminoácido en P-4 (lisina) de un primer péptido (pentapéptido), como en AB144_H. En AB144_I, el CPP está unido a la cadena lateral del aminoácido de P-5 de un primer péptido (KIETDV, hexapéptido).
II. Afinidad del ligando de los inhibidores de PSD-95 diméricos que contienen CPP
Todos los inhibidores de PSD-95 diméricos de la presente invención tienen una afinidad por PDZ1-2 de PSD-95 en el intervalo nanomolar (Ejemplo 5), lo que los hace inhibidores sumamente potentes (Figura 5 y Tabla 2). Se introduce un CPP, unido a los inhibidores de PSD-95 diméricos de la invención, para mejorar el transporte del inhibidor a través de la barrera hematoencefálica. Sorprendentemente, la unión de un CPP al inhibidor de PSD-95 dimérico también aumenta su afinidad hacia PDZ1-2 de PSD-95. Esto se ejemplifica mediante AB144 y AB147 (Ki= 4,6 ± 0,3 y 5,1 ± 0,4 nM, respectivamente), que mostraron una afinidad incrementada al doble respecto de AB141 (Ki = 9,3 ± 1 nM), y una afinidad incrementada 1000 veces respecto del péptido Tat-NR2B9c monomérico (Ki = 4600 ± 300 nM). La afinidad del inhibidor de PSD-95 dimérico hacia PDZ1-2 de PSD-95 es un factor crítico para reducir la
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(ivDde), 2,2,2-tricloroetiloxicarbonilo (Troc), aliloxicarbonilo (Alloc), p-nitrobenciloxicarbonilo (pNZ), o-nitrobenciloxicarbonilo (oNZ) y 6-nitroveratriloxicarbonilo (NVOC), azidometoxicarbonilo (Azoc), terc-butiloxicarbonilo (Boc), carbamato de 2-trimetilsililetilo (Teoc) y 2-clorobenciloxicarbonilo (Cl-Z).
El número de restos de etilen glicol (n) en el PEG y NPEG-diácido puede ser de n1-28, o el ligador puede tener una longitud de n= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 restos de etilen glicol.
VII.iii Síntesis de ligandos diméricos: Los ligandos diméricos se pueden producir activando los Ns-NPEG4-diácido-ligadores o el PEG4-diácido-ligador in situ con reactivos de acoplamiento, tales como HBTU y HATU, seguido de la incubación con el grupo amino N-terminal del ligando peptídico unido a la resina. Mediante el uso de este procedimiento, se limita el procedimiento de dimerización a una reacción de una etapa.
VII.iv Análisis químico: Los compuestos se analizan mediante ESI-LC/MS, HPLC analítica, y espectrometría de masas de alta resolución, mediante el empleo de técnicas muy conocidas para el experto, y ejemplificadas en el Ejemplo 1.
VIII. Inhibidores de PSD-95 diméricos que contienen CPP según el primer o segundo caso de la descripción que comprende la invención para el tratamiento terapéutico de trastornos relacionados con la excitotoxicidad tales como ictus isquémico o lesión traumática
En las sinapsis neuronales, los extremos C-terminales de las subunidades de los receptores de NMDA interaccionan con los dominios PDZ de PSD-95 asociándolos a moléculas de señalización neurotóxicas posteriores (p.ej., nNOS), lo que conduce a la producción de NO y a la excitotoxicidad. La presente invención proporciona inhibidores que pueden bloquear los receptores de NMDA y la interacción de nNOS en una célula, sin afectar a las corrientes iónicas del receptor de NMDA y a las funciones de señalización del calcio del receptor de NMDA. Así, un inhibidor de PSD-95 dimérico que contiene CPP de la invención actúa como un agente neuroprotector de una o más células o tejidos, lo que proporciona una estrategia específica para tratar trastornos excitotóxicos, que incluyen lesión de la médula espinal, ictus, lesión cerebral traumática, lesión isquémica del sistema nervioso central (SNC), epilepsia, enfermedades neurodegenerativas del SNC.
El tratamiento terapéutico de sujetos en riesgo o que padecen en el presente los trastornos y enfermedades anteriores se puede dar como un tratamiento profiláctico para reducir el riesgo de inicio del trastorno o enfermedad,
o como un tratamiento terapéutico tras el inicio del trastorno o enfermedad. El sujeto puede ser un mamífero o paciente humano.
IX. Inhibidores de PSD-95 diméricos para el tratamiento terapéutico del dolor
Se demuestra sorprendentemente que los inhibidores de PSD-95 diméricos de la presente invención son eficaces en la reducción del dolor en un sujeto (mamífero o paciente humano) y, además, que se pueden usar estos inhibidores en el tratamiento terapéutico, ya que no provocan ningún efecto secundario perjudicial simultáneo sobre la función cognitiva y motora del sujeto. El dolor a tratar puede ser dolor crónico, que puede ser dolor neuropático crónico o dolor inflamatorio crónico. El dolor neuropático puede estar inducido por el daño del sistema nervioso periférico o central como resultado de una lesión traumática, cirugía, o enfermedades tales como diabetes o trastornos autoinmunitarios. Cuando el dolor persiste, la afección es dolor neuropático crónico. El dolor inflamatorio crónico se puede inducir por la inflamación tras una lesión neurológica, así como iniciarse por la inflamación inducida por materia exógena, en la que los mediadores liberados por las células inmunitarias provocan una sensibilización de las rutas del dolor, es decir, una "sumación temporal" de las neuronas sensoriales localizadas en la médula espinal. Así, un fármaco analgésico eficaz debe ser capaz de alcanzar el tejido de la médula espinal y hallar su objetivo, en este caso PSD-95, para tener un efecto analgésico. De ese modo, los compuestos deben ser capaces de atravesar la barrera hematoencefálica y/o la barrera hematomedular para poder alcanzar el tejido de la médula espinal. Un inhibidor de PSD-95 dimérico adecuado para tratar el dolor crónico comprende un primer péptido o análogo de péptido unido a un segundo péptido o análogo de péptido mediante un ligador, en el que el primer y el segundo péptido o análogo de péptido comprenden al menos cuatro residuos unidos por amida que tienen la secuencia YTXV
o YSXV, en la que Y se selecciona de E, Q, y A, o un análogo del residuo seleccionado, y X se selecciona de A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D, y N-Me-N o un análogo del residuo seleccionado. Los ejemplos de inhibidores de PSD-95 diméricos adecuados incluyen AB125 y AB122 que tienen la estructura PEG6(IESDV)2 [que corresponde al compuesto 77 del documento WO2010/004003] y AB123 que tiene la estructura PEG4(IESDV)2 [que corresponde al compuesto 78 del documento WO2010/004003] y AB141 [que tiene un ligador de NPEG]. Estos compuestos son capaces sorprendentemente de alcanzar su objetivo, PSD-95, en la médula espinal (Ejemplo 12), a pesar de tener estructuras químicas hidrófilas y grandes, y a pesar de no estar unidos a un CPP -ya que éstas son propiedades que normalmente impiden que los compuestos atraviesen la barrera hematoencefálica y/o la barrera hematomedular, y así impiden que los compuestos entren en el SNC. Además, el inhibidor puede comprender adicionalmente un tercer péptido, en el que dicho tercer péptido es un CPP que tiene propiedades de penetración celular unido al inhibidor, lo que proporciona un inhibidor de la presente invención.
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X. Efectos analgésicos in vivo de los inhibidores de PSD-95 diméricos para el tratamiento terapéutico del dolor crónico
El antagonismo de los receptores de NMDA muestra una acción anti-nociceptiva en seres humanos y modelos animales de dolor crónico, pero está asociado a alteraciones graves de la función cognitiva y motora.
La ausencia de efectos secundarios perjudiciales de AB125 y AB144 en comparación con el antagonista selectivo de receptores de NMDA, MK-801, en la hiperalgesia mecánica se demuestra en el modelo de adyuvante completo de Freund (CFA) de dolor inflamatorio crónico. Una reducción de los efectos secundarios de los inhibidores de PSD-95 diméricos se demuestra comparando los efectos de AB125 y MK-801 en el ensayo de transmisión social de preferencia alimentaria (STFP) de memoria a largo plazo y el ensayo de laberinto en Y modificado de atención, así como en el ensayo Rotarod de rendimiento motor.
Cuando se administraron de manera concurrente con CFA, MK-801, AB125, y AB144 previnieron el desarrollo de hiperalgesia mecánica inducida por CFA 1 hora y 24 horas después del tratamiento (Figura 17, 18, 23; Ejemplo 11). Además, se descubrió que AB125 invertía la hiperalgesia inducida por CFA cuando se administró 24 horas después del tratamiento con CFA, un efecto que duró durante al menos 3 días (Figura 19; Ejemplo 11). A la dosis que reducía la hiperalgesia, MK-801 indujo déficits cognitivos en los ensayos de laberinto en Y modificado y STFP, así como déficits motores en el ensayo Rotarod. Sorprendentemente, incluso las dosis elevadas de AB125 estuvieron desprovistas de efectos secundarios en estos ensayos (Figura 20-22; Ejemplo 11). Los datos demuestran que los inhibidores de PSD-95 diméricos, sin (AB125) y con (AB144) un CPP, son eficaces en la prevención e inhibición del desarrollo de dolor inflamatorio crónico, mientras se evitan los efectos secundarios relacionados con el antagonismo del receptor de NMDA sobre la función cognitiva y motora.
XI. Fabricación de una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de PSD-95
Las formulaciones de un inhibidor de PSD-95 dimérico o un inhibidor de PSD-95 dimérico que contiene CPP de la presente invención en composiciones farmacéuticas es muy conocida en la técnica, y se describe adicionalmente en Gennaro (ed.), 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000); y Ansel et al, 1999, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7ª ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers.
Tal composición contiene en general de alrededor del 0,1 al 90% en peso (tal como alrededor del 1 al 20% o alrededor del 1 al 10%) del inhibidor de PSD-95 de la invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se pueden preparar diversas formulaciones líquidas y en polvo mediante métodos convencionales para la inhalación en los pulmones del mamífero a tratar.
Las composiciones adecuadas para administración oral se pueden formular combinando un inhibidor de PSD-95 dimérico o un inhibidor de PSD-95 dimérico que contiene CPP de la invención con un vehículo adecuado en forma de un comprimido, píldora, gragea, cápsula, líquido, gel, jarabe, suspensión espesa, suspensión para ingestión oral por parte del sujeto a tratar. Para las formulaciones orales/rectales sólidas, los excipientes adecuados incluyen rellenos tales como carbohidratos (p.ej., lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol); preparaciones de celulosa (p.ej., almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidina; agentes de granulación; y agentes aglutinantes. Opcionalmente, se pueden incluir agentes disgregantes, tales como polivinilpirrolidina reticulada, agar,
o ácido algínico o una sal de alginato sódico. La formulación sólida puede incluir además un revestimiento entérico.
Para las formulaciones orales líquidas, los excipientes o diluyentes adecuados incluyen agua, glicoles, aceites y alcoholes.
Las formulaciones inyectables de las composiciones pueden contener diversos vehículos, tales como aceites vegetales, dimetilacetamida, dimetilformamida, lactato de etilo, carbonato de etilo, miristato de isopropilo, etanol, polioles (glicerol, propilen glicol, polietilen glicol líquido, y similares). Para las inyecciones intravenosas, se pueden administrar versiones hidrosolubles de los compuestos mediante el método de goteo, por el que se infunde una formulación farmacéutica que contiene el agente activo (un inhibidor de PSD-95 dimérico que contiene CPP) y un excipiente fisiológicamente aceptable. Los excipientes fisiológicamente aceptables pueden incluir, por ejemplo, dextrosa al 5%, disolución salina al 0,9%, disolución de Ringer u otros excipientes adecuados. Las preparaciones intramusculares, p.ej., una formulación estéril de una forma de sal soluble adecuada de los compuestos, se pueden disolver y administrar en un excipiente farmacéutico tal como agua para inyección, disolución salina al 0,9%, o disolución de glucosa al 5%. Se puede preparar y administrar una forma insoluble adecuada del compuesto en forma de una suspensión en una base acuosa o una base oleosa farmacéuticamente aceptable, tal como un éster de un ácido graso de cadena larga (p.ej., oleato de etilo).
También se puede formular un inhibidor de PSD-95 dimérico o un inhibidor de PSD-95 dimérico que contiene CPP de la invención en forma de una preparación de liberación lenta de acción prolongada. Por ejemplo, el inhibidor se puede formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (p.ej., una emulsión de un aceite aceptable) o resina de intercambio iónico, o en forma de un derivado escasamente soluble, tal como una sal escasamente
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Ejemplo 2. Síntesis de análogos marcados de los inhibidores diméricos de PSD-95
2.1 Síntesis de análogos marcados con fluoróforo (AB143, AB145, AB148, MS23)
Se prepararon ligandos fluorescentes acoplando 5-FAM (5-carboxifluoresceína; Anaspec, San Jose, CA, EE.UU.) al grupo amino N-terminal del AB144, AB147, o Tat-NR2B9c finales y desprotegidos de Fmoc, mientras estaban unidos a la resina, para producir AB145, AB148, y MS23, respectivamente. De forma similar, se acopló 5-FAM a AB141 unido a la resina, desprotegido de Ns, para producir AB143. 5-FAM se acopló en una proporción 1/2/2/3 de sitios N de resina/5-FAM/HATU/colidina en un total de 2 mL de DMF a una escala 0,07 mmol (molar de NPEG-ligador). Para AB145, AB148, o MS23, el tiempo de acoplamiento fue 6 horas. Para AB143, 5-FAM se acopló mediante dos acoplamientos consecutivos de 6 y 16 horas, respectivamente.
2.2 Síntesis de ligando dimérico marcado con 15N, 13C de PSD-95
Se sintetizó [15N, 13C]-PEG4(IETAV)2 (AB140) mediante el uso de aminoácidos protegidos con Fmoc que contenían átomos de aminoácidos completamente marcados con 15N, 13C (Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Andover, MA, EE.UU.). Los bloques de construcción de aminoácidos para Thr y Glu se protegieron en la cadena lateral con grupos terc-butilo. Se disolvió Fmoc-Val-OH marcado (0,125 mmol, 43 mg) en DMF (1,5 mL) y se cargó en la resina de cloruro de 2-clorotritilo (0,1875 mmol, 119 mg) que se había dejado hinchar en DMF (2 mL) durante 20 min y se había drenado. Se añadió DIPEA (0,625 mmol, 109 μL) y se continuó con la agitación durante 60 min. Se añadió MeOH (100 μL), y se continuó con la agitación durante 15 min, y la resina se lavó con DMF. Fmoc se eliminó con piperidina/DMF, y se sintetizó adicionalmente IETAV marcado mediante el uso de condiciones de acoplamiento y estequiometrías de 1/2/2/3 de resina/Fmoc-aminoácido/HATU/colidina en DMF (1 mL) durante 40 min. Tras la eliminación final de Fmoc, la resina se lavó con DMF y DCM, se secó a vacío y se usó adicionalmente para preparar AB140 mediante el proceso de dimerización en resina con el ligador de PEG4-diácido (sin marcar) (IRIS Biotech, Marktredwitz, Alemania) descrito previamente (documento WO2010/004003).
Ejemplo 3. Purificación y caracterización de los inhibidores de PSD-95 diméricos de PSD-95 y los derivados marcados de los mismos
Los compuestos sintetizados, que incluyen los inhibidores de PSD-95 diméricos y los derivados de los mismos, se obtuvieron en forma de sales de TFA tratando los productos unidos a la resina con ácido trifluoroacético (TFA)/triisopropilsilano/H2O (90/5/5) durante 2 horas (a menos que se especifique de otra manera), evaporación a vacío, precipitación con éter frío, liofilización, y purificación con cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) preparativa. Los compuestos se caracterizaron mediante HPLC analítica y espectrometría de masas (Tabla 1).
Tabla 1. Caracterización de compuestos. 1Se indica el ión más abundante (ESI-LC/MS). 2Se llevó a cabo HPLC analítica (UV218) y ESI-LC/MS (ELSD) para todos los compuestos para determinar la pureza. 3La parte del péptido, IETAV, está marcada con [15N, 13C].
Compuestos Fórmula PM m/z1 Pureza2
IETDV C24H41N5O11 575,6 576,4 [M+H]+ >98%
AB141 C60H105N11O24 1364,5 1364,7 [M+H]+ >98%
AB144 C126H221N43O41 2994,4 599,8 [M+5H]+ >98%
AB147 C115H209N41O38 2774,1 555,9 [M+5H]+ >98%
Tat-NR2B9c C105H188N42O30 2518,9 504,7 [M+5H]+ >98%
AB143 C81H115N11O30 1722,8 862,1 [M+2H]+ >98%
AB145 C147H231N43O47 3352,7 671,5 [M+5H]+ >98%
AB148 C136H219N41O44 3132,4 627,5 [M+5H]+ >98%
MS23 C126H198N42O36 2877,2 576,4 [M+5H]+ >98%
AB1403 C60H104N10O25 1421,1 711,2 [M+2H]+ >98%
AB144_B C126H221N43O41 2994,4 599,8 [M+5H]+ 95%
AB144_C C126H221N43O41 2994,4 599,8 [M+5H]+ 95%
AB144_D C138H236N46O47S 3323,7 665,7 [M+5H]+ >98%
AB144_E C134H234N46O45S2 3273,7 655,8 [M+5H]+ 96%
AB144_H C190H338N76O55 4567,2 508,4 [M+9H]+ 96%
AB144_I C202H360N78O57 4793,5 533,5 [M+9H]+ 95%
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Para los experimentos in vivo, los compuestos se prepararon en forma de sales de HCl incubando las sales de TFA de los compuestos con HCl ac. helado (50 mM; exceso molar de 3 veces de HCl respecto de TFA) durante 20 min seguido de liofilización.
3.1 RP-HPLC preparativa:
Los compuestos se purificaron en un sistema Agilent 1200 con una columna de fase inversa C18 (Zorbax 300 SB-C18, 21,2x250 mm) mediante el uso de un gradiente lineal de H2O/MeCN/TFA (A: 95/5/0,1 y B: 5/95/0,1) y un caudal de 20 mL/min.
3.2 ESI-LC/MS:
Los espectros de masas se obtuvieron con un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Agilent 6410 mediante el uso de ionización por electronebulización (ESI), acoplado a un sistema de HPLC Agilent 1200 (ESI-HPLC-MS) con una columna de fase inversa C18 (Zorbax Eclipse XBD-C18, 4,6x50 mm), detector evaporativo de dispersión de luz (ELSD, Sedere Sedex 85) y un detector de matriz de diodos (UV) mediante el uso de un gradiente lineal de H2O/MeCN/Ácido Fórmico (A: 95/5/0,1 y B: 5/95/0,086) con un caudal de 1 mL/min.
3.3 RP-HPLC analítica: Las purezas de los compuestos se determinaron mediante un sistema Agilent 1100 con una columna de fase inversa C18 (columna Zorbax 300 SB-C18, 4,6x150 mm) mediante el uso de un gradiente lineal de H2O/MeCN/TFA (A: 95/5/0,1 y B: 5/95/0.1) y un caudal de 1 mL/min.
3.4 Espectros de masas de alta resolución (HRMS): Los HRMS se obtuvieron para AB144 y AB147 mediante el uso de ionización por electronebulización (ESI) y un instrumento Micromass Q-Tof2.
Ejemplo 4. Expresión y purificación de PDZ1-2 de PSD-95
El cADN que codifica el tándem PDZ1-2 de PSD-95 (que corresponde a los residuos 61-249 de PSD95α humano de longitud completa sin el exón 4b) se amplificó mediante PCR inversa y se clonó en un vector pRSET marcado con His modificado (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). El péptido PDZ1-2 codificado comprendió además la secuencia MHHHHHPRGS, que se usó como marcador para la purificación (marcador de His), y las secuencias codificantes de ADN y las proteínas codificadas se denominan como sigue: ADN de HIS-PDZ1-2 [SEQ ID Nº: 1] que codifica la proteína HIS-PDZ1-2 [SEQ ID Nº: 2]. Se transformaron bacterias E. coli competentes (BL21 -DE3, pLysS) con una construcción que expresaba PDZ1-2 y se cultivaron durante la noche en placas de agar que contenía ampicilina (100 μg/mL) y cloranfenicol (35 μg/mL) a 37 °C. Las colonias se recogieron y se usaron para inocular cultivos bacterianos (medio LB con 50 μg/mL de ampicilina). Estos se agitaron mientras se incubaban a 37 °C hasta que la A600 del cultivo alcanzó 0,45, en cuyo punto se añadió isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido 1 mM. Los cultivos inducidos se incubaron durante la noche a 30 °C (PDZ1-2). Las células se recogieron centrifugando a 10.000 g durante 10 min a 4 °C, y se resuspendieron en tampón de lisis (Tris/HCl 50 mM, pH 7,5, PMSF 1 mM, 25 μg/ml de ADNasa, Mg2SO4 40 mM). Las células se destruyeron mediante el uso de un aparato de ruptura de células a 6,9 MPa. El lisado celular se centrifugó a 35.000 g durante 1 hora, y el sobrenadante se filtró con un filtro de 0,45 μm y de 0,22 μm. La purificación del péptido PDZ1-2 expresado se llevó a cabo primero con una columna cargada con níquel (II) (HisTrap™ HP, GE Healthcare, R.U.) equilibrada con tampón Tris (tampón Tris/HCl 50 mM, pH 7,5), seguido de filtración en gel. Para la filtración en gel, la muestra de PDZ1-2 se cargó en una columna Superdex™ 75 HR 10/30 (GE Healthcare, R.U.) equilibrada con tampón Tris (Tris/HCl 20 mM, pH 7,5) con un caudal constante de 0,5 mL/min. Las fracciones relevantes se analizaron en un gel de SDS-PAGE teñido mediante un protocolo estándar de tinción de plata. La purificación final se analizó mediante ionización por electronebulización-cromatografía líquida-espectrometría de masas (ESI-LC/MS) para conseguir el peso molecular exacto, y de ese modo verificar la identidad del dominio PDZ1-2. Los coeficientes de extinción molar se hallaron mediante análisis de aminoácidos (Alphalyse, Odense, Dinamarca) y después se usaron para medir las concentraciones de proteínas. Para los estudios de RMN, se expresó [15N]PDZ1-2 marcado de manera uniforme realizando el cultivo bacteriano en medios M-9 seguido de purificación como se describió anteriormente.
Ejemplo 5. Inhibidores de PSD-95 diméricos de afinidad incrementada hacia el dominio PDZ de PSD-95
5.1 Ensayo de polarización de fluorescencia (PF) para determinar la afinidad de los ligandos (inhibidores de PSD-95 diméricos) hacia el dominio PDZ de PSD-95
Se desarrolló un ensayo de medida de la afinidad in vitro basado en el principio de polarización de fluorescencia para proporcionar las constantes de afinidad (valores de Ki) entre los ligandos sintetizados (p.ej., inhibidores diméricos) y PDZ1-2 de PSD-95. En primer lugar, la afinidad entre la sonda de NPEG4(IETAV)2 marcada con 5-FAM, denominada AB143 (Figura 4), y PDZ1-2 se estableció mediante un experimento de unión de saturación, en el que se añadieron concentraciones crecientes de PDZ1-2 a una concentración fija (0,5 nM) de la sonda. El ensayo se llevó a cabo en tampón TBS (NaCl 150 mM, Tris 10 mM, pH 7,4) en placas de 384 pocillos negros, de fondo plano (Corning Life Sciences, NY, EE.UU.). Tras la incubación durante 10 min a temperatura ambiente, se midió la polarización de fluorescencia de las muestras en un lector de placas Safire2 (Tecan, Mannedorf, Suiza) a valores de excitación/emisión de 470/525 nm. Los valores de polarización de fluorescencia se ajustaron a la ecuación Y = Bmax x X/(Kd+ X), en la que Bmax es el valor de polarización de fluorescencia máxima, X es la concentración de PDZ1-2, e
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Ejemplo 6. Los inhibidores de PSD-95 diméricos modificados tienen una estabilidad incrementada en plasma sanguíneo humano
6.1 Ensayo de estabilidad en plasma sanguíneo humano
Se disolvieron ligandos (inhibidores de PSD-95 diméricos) hacia el dominio PDZ de PSD-95 en plasma sanguíneo humano (270 μL; 3H Biomedical, Suecia, nº de cat. 1300-1-P50) a una concentración de 0,25 mM (30 μL de 2,5 mM) y se incubaron a 37 °C. Se extrajeron alícuotas (30 μL) a diversos intervalos de tiempo (p.ej., 0, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 960, 1280, 2550, 4560 y 7240 min) y se inactivaron con 60 μL de ácido tricloroacético (ac., 5%). Las alícuotas se agitaron en vórtex, y se incubaron 15 min a 4 °C antes de la centrifugación a 18.000 g durante 2 min. Los sobrenadantes se analizaron mediante RP-HPLC analítica (UV218) para cuantificar el compuesto respecto del tiempo cero, y también se estudiaron de manera cualitativa mediante ESI-LC/MS para identificar el compuesto (m/z) en la muestra. Se investigó procaína (control positivo) y procainamida (control negativo) a 50 μΜ para validar el procedimiento. Las recuperaciones de ligandos tras el procedimiento de precipitación fueron del 85-95%.
6.2 Estabilidad incrementada en plasma sanguíneo de los inhibidores diméricos que tienen un péptido Tat
Los inhibidores diméricos AB144 (CPP es Tat) y AB147 (CPP es Retroinverso-D-Tat) se incubaron en plasma sanguíneo humano, y se monitorizó su degradación in vitro. Al comparar la susceptibilidad a la degradación del pentapéptido monomérico IETDV y Tat-NR2B9c, que mostraron semividas (T1/2) de 37 ± 6 y 1100 ± 300 minutos, respectivamente, AB144 exhibió una T1/2 = 4900 ± 100, que corresponde a una mejora de más de 100 veces de la estabilidad en comparación con el pentapéptido monomérico IETDV (Figura 5). No se observó una degradación detectable de AB147 en el periodo de medida (130 horas) (Figura 5), lo que ilustra el efecto de introducir un CPP estable a proteasas en el inhibidor dimérico.
Ejemplo 7. Los inhibidores de PSD-95 diméricos se unen a los dominios PDZ1 y PDZ2 de PSD-95
7.1 Análisis mediante RMN de la unión de ligandos a los dominios PDZ1 y PDZ2 de PSD-95
Se preparó una muestra de RMN que comprendía [15N,13C]-PEG4(IETAV)2 libre (AB140) 3,5 mM y 2,2 mM del mismo compuesto saturado con PDZ1-2 sin marcar en KPi 50 mM, pH 7,5 en un 90% de H2O/10% de D2O para los estudios de unión. Todos los experimentos se registraron a 25 °C en un campo magnético estático que correspondía a una frecuencia de Larmor de protón de 600 MHz. Se registraron experimentos de HNCA, HN(CA)CO y HSQC para asignar el esqueleto de los restos peptídicos del compuesto libre. Para el compuesto unido se registraron experimentos de HNCACB, HN(CA)CO y HSQC para fines de asignación.
Las velocidades de relajación R1 y R1ρ de 15N, así como el NOE de 15N-[1H], se midieron para [15N]-PDZ1-2 2,83 mM saturado con AB125 sin marcar mediante el uso de las secuencias de pulsos previamente descritas. Las condiciones de las muestras fueron como se describieron anteriormente. Para el experimento de R1, se usaron los siguientes retardos de relajación: 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 seg. Las incertidumbres en las intensidades de los picos se estimaron a partir de cinco puntos de datos duplicados. El experimento de R1ρ se registró con un campo de confinamiento de 1661 Hz, y el portador de radiofrecuencia se colocó a 119 ppm y retardos de relajación de 0,004, 0,008, 0,012, 0,016, 0,0,02, 0,024, 0,03, 0,036, 0,04, 0,05, 0,055, 0,06 seg. Se registraron cinco puntos de datos duplicados para la estimación de incertidumbres en los volúmenes de los picos. El NOE de 15N-[1H] se registró tomando la proporción de los experimentos registrados saturando y sin saturar los protones. El retardo de recirculación total para ambos experimentos fue 12 seg, y el experimento sin los pulsos de saturación se duplicó para la estimación de las incertidumbres.
Todos los datos de RMN se procesaron con RMN pipe y se visualizaron mediante el uso de Sparky (Goddard y Kneller, Universidad de California en San Francisco). Las asignaciones para la forma unida de PDZ1-2 se obtuvieron transfiriendo las asignaciones a partir de PDZ1-2/cipina (Wang et al, J. Am. Chem. Soc. 131, 787, 2009). Debido a que se usó un compuesto diferente en este estudio, y debido a que las condiciones de las muestras fueron diferentes, solamente se pudieron transferir algo más de la mitad de las asignaciones con confianza. Los picos restantes de los espectros no se analizaron. Los picos se integraron y los volúmenes se convirtieron en velocidades de relajación mediante el uso del programa propio PINT. Se usó el mismo programa para convertir las velocidades de relajación R1ρ en las velocidades de relajación R2.
7.2 Los inhibidores de PSD-95 diméricos se unen a PDZ1 y PDZ2
Se analizó la unión del ligando dimérico marcado con 15N, 13C (AB140) a PDZ1 y PDZ2 determinando su estructura mediante RMN en presencia/ausencia de PDZ1-2 sin marcar, como se describió en 7.1. Se detectaron cinco picos en un espectro de HSQC para el ligando simétrico [15N, 13C]-PEG4(IETAV)2 (AB140). Sin embargo, cuando el ligando se combinó con PDZ1-2, se observaron diez picos diferentes que correspondían a cada uno de los diez aminoácidos (Figura 6). Esto demuestra claramente que ambos restos de ligando interaccionan con PDZ1-2, y que se orientan hacia diferentes entornos de la proteína, concretamente PDZ1 y PDZ2, respectivamente. A partir de los cálculos estructurales secundarios basados en los desplazamientos químicos para el ligando dimérico unido y sin unir, se puede deducir que el ligando sin unir exhibe un carácter de cadena aleatoria, mientras el ligando unido adopta una estructura de cadena β (Figura 7). Finalmente, las medidas de velocidad de relajación R1 y R2
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confirmaron que PDZ1-2 en un complejo con los ligandos diméricos se desploma como una unidad, y así se descartan otros modelos potenciales tales como una estequiometría de unión 2:2 (Tabla 3). Por lo tanto, los estudios mediante RMN confirman una estequiometría de unión 1:1, y demuestran de manera inequívoca que cada resto de ligando del ligando dimérico se une a PDZ1 o PDZ2 en PDZ1-2 con un modo de unión auténticamente bivalente.
Tabla 3. Velocidades de relajación R1 y R2 de 15N y NOE de 1H-15N medidas para PDZ1-2 de [15N]-PSD95 en un complejo con AB125. Solamente se muestran los resultados para los residuos en los que se pudieron transferir las asignaciones con confianza de Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 131, 787, 2009.
Residuo R1 (s-1) R2 (s-1) NOE
I6 1,10 ± 0,02 15,0 ± 0,4 0,56 ± 0,02 T7 0,95 ± 0,03 15,2 ± 0,6 0,70 ± 0,08 G11 1,60 ± 0,49 15,4 ± 0,6 0,50 ± 0,01 G14 0,98 ± 0,05 13,3 ± 0,8 0,45 ± 0,01 G16 1,01 ± 0,03 16,8 ± 0,8 0,83 ± 0,02 F17 1,03 ± 0,02 19,7 ± 0,6 0,66 ± 0,06 T23 0,98 ± 0,02 18,7 ± 0,7 0,80 ± 0,00 D24 1,08 ± 0,04 18,7 ± 0,7 0,83 ± 0,01 N25 1,06 ± 0,03 17,0 ± 0,7 0,65 ± 0,01 H27 1,12 ± 0,04 17,6 ± 0,9 0,76 ± 0,01 S33 1,05 ± 0,04 21,3 ± 0,9 0,82 ± 0,07 I34 1,13 ± 0,05 16,8 ± 1,2 0,90 ± 0,06 I40 1,08 ± 0,03 15,5 ± 0,9 0,85 ± 0,02 G42 0,96 ± 0,04 14,2 ± 1,3 0,68 ± 0,07 G43 0,99 ± 0,02 19,2 ± 0,8 0,77 ± 0,02 A46 1,05 ± 0,02 19,0 ± 0,6 0,80 ± 0,04 Q47 0,88 ± 0,03 17,1 ± 0,4 0,84 ± 0,00 G49 1,07 ± 0,03 16,7 ± 0,8 0,86 ± 0,02 R50 1,03 ± 0,01 18,1 ± 0,4 0,82 ± 0,03 L51 1,02 ± 0,05 18,3 ± 0,7 0,68 ± 0,00 L58 1,16 ± 0,04 16,0 ± 1,1 0,84 ± 0,02 N61 1,07 ± 0,03 25,9 ± 0,9 0,62 ± 0,01 D64 1,01 ± 0,02 17,2 ± 0,6 0,87 ± 0,05 V65 1,07 ± 0,02 16,1 ± 0,5 0,76 ± 0,02 E67 1,02 ± 0,01 16,1 ± 0,4 0,75 ± 0,02 V68 1,04 ± 0,04 17,4 ± 0,6 0,77 ± 0,00 T69 0,95 ± 0,02 17,0 ± 0,4 0,92 ± 0,03 H70 1,07 ± 0,05 15,5 ± 1,0 0,56 ± 0,12 S71 1,06 ± 0,02 16,2 ± 0,5 0,80 ± 0,03 A72 1,10 ± 0,02 18,9 ± 0,7 0,77 ± 0,04 A73 1,12 ± 0,03 17,3 ± 0,6 0,76 ± 0,07 V74 1,07 ± 0,02 15,1 ± 0,5 0,65 ± 0,02 L77 1,01 ± 0,03 15,8 ± 0,5 0,73 ± 0,03 E79 1,01 ± 0,02 16,2 ± 0,7 0,69 ± 0,05 A80 1,02 ± 0,01 18,0 ± 0,4 0,57 ± 0,01 G81 1,13 ± 0,03 16,0 ± 1,1 0,68 ± 0,00 I83 1,04 ± 0,02 16,6 ± 0,6 0,72 ± 0,02 V84 1,08 ± 0,02 15,9 ± 0,6 0,71 ± 0,01 R85 1,02 ± 0,03 19,7 ± 1,0 0,88 ± 0,04 L86 1,17 ± 0,03 15,9 ± 0,7 0,64 ± 0,07
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- M99
- 1,23 ± 0,04 16,0 ± 1,2 0,57 ± 0,01
- K102
- 1,05 ± 0,03 13,5 ± 0,7 0,74 ± 0,02
- I104
- 1,09 ± 0,02 13,8 ± 0,3 0,61 ± 0,03
- K105
- 1,23 ± 0,02 14,2 ± 0,5 0,69 ± 0,03
- G106
- 1,05 ± 0,03 14,6 ± 0,7 0,60 ± 0,01
- G109
- 0,99 ± 0,02 15,3 ± 0,5 0,47 ± 0,01
- G111
- 1,18 ± 0,02 15,9 ± 0,6 0,81 ± 0,01
- F112
- 1,18 ± 0,01 15,6 ± 0,6 0,88 ± 0,01
- G119
- 1,11 ± 0,04 16,5 ± 0,9 0,87 ± 0,07
- Q121
- 1,09 ± 0,03 15,8 ± 0,7 0,85 ± 0,03
- H122
- 1,04 ± 0,03 17,6 ± 0,5 0,73 ± 0,02
- I123
- 1,05 ± 0,05 12,8 ± 1,5 0,64 ± 0,09
- G125
- 1,11 ± 0,06 12,9 ± 0,5 0,70 ± 0,09
- N127
- 1,12 ± 0,03 15,8 ± 1,6 0,64 ± 0,01
- S128
- 1,00 ± 0,03 19,1 ± 0,6 0,75 ± 0,01
- I135
- 1,18 ± 0,03 15,4 ± 0,8 0,69 ± 0,03
- E136
- 1,12 ± 0,06 18,7 ± 1,0 0,72 ± 0,04
- G137
- 1,06 ± 0,05 13,9 ± 1,2 1,27 ± 0,14
- G138
- 1,06 ± 0,03 17,3 ± 0,6 0,67 ± 0,02
- H141
- 1,27 ± 0,04 17,0 ± 1,4 0,69 ± 0,02
- K142
- 1,11 ± 0,04 13,5 ± 0,7 0,71 ± 0,01
- D143
- 1,16 ± 0,02 14,4 ± 0,5 0,90 ± 0,02
- G144
- 1,02 ± 0,02 14,5 ± 1,2 0,82 ± 0,00
- I148
- 1,11 ± 0,03 16,1 ± 0,4 0,70 ± 0,04
- G149
- 1,10 ± 0,03 18,2 ± 0,8 0,74 ± 0,03
- D150
- 1,15 ± 0,02 18,1 ± 0,5 0,81 ± 0,02
- L153
- 1,12 ± 0,03 15,3 ± 0,9 0,76 ± 0,00
- V155
- 1,14 ± 0,04 16,7 ± 0,5 0,68 ± 0,01
- N156
- 1,19 ± 0,03 17,0 ± 0,7 0,76 ± 0,09
- E166
- 1,03 ± 0,02 17,8 ± 0,5 0,74 ± 0,06
- A168
- 1,00 ± 0,02 18,0 ± 0,4 0,71 ± 0,01
- V169
- 1,02 ± 0,02 19,3 ± 0,6 0,75 ± 0,10
- L172
- 1,03 ± 0,02 16,2 ± 0,6 0,63 ± 0,03
- T175
- 1,05 ± 0,03 9,0 ± 0,4 0,40 ± 0,00
- V178
- 1,02 ± 0,02 13,2 ± 0,3 0,68 ± 0,02
- V179
- 1,12 ± 0,02 15,2 ± 0,7 0,71 ± 0,10
- L181
- 1,06 ± 0,03 15,3 ± 0,6 0,93 ± 0,04
Ejemplo 8. Los inhibidores de PSD-95 diméricos que contienen CPP atraviesan la barrera hematoencefálica
8.1 Análisis de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BBB)
Estos ligandos marcados con fluorescencia se usaron como medidas sustitutas de la capacidad de los inhibidores de
5 PSD-95 diméricos que contienen CPP de atravesar la barrera hematoencefálica y entrar en el cerebro en ratones. Los ligandos fluorescentes se inyectaron de manera intravenosa (3 nmol/g), y se detectó la localización de los ligandos mediante microscopía de fluorescencia de cortes cerebrales frontales (n=8) de ratones, que se estudiaron 2 horas tras la inyección. Se seleccionaron dos cortes del cerebro antes y dos después de la comisura anterior (n=5) para el análisis de la permeabilidad de BBB. Se usó la comisura anterior (Bregma: -0,3) como punto fijo del cerebro
10 para analizar cortes de cerebro anatómicamente idénticos. La intensidad del fluoróforo 5-FAM se midió de manera semi-cuantitativa mediante el uso de un sistema de microscopía de fluorescencia (Olympus System Microscope modelo BX-51, Dinamarca) con un objetivo 10x (Olympus 10x/0,15 UPlanApo) conectado a una cámara digital para
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