ES2545093T3 - Métodos basados en plantas transgénicas para plagas de plantas usando ARNi - Google Patents

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Abstract

Un ARN bicatenario aislado que comprende hebras complementarias hibridadas, en el que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleótido seleccionado entre el grupo que consiste en: (i) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 1073, 1577, 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420 y 2466, (ii) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana que codifica la secuencia de aminoácidos representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 1074, 4, 796, 891, 1685 y 2367, y (iii) polirribonucleótidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleótidos de (i) o (ii).

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos basados en plantas transgénicas para plagas de plantas usando ARNi
Campo de la invención 5
La presente invención se refiere en general al control genético de infestaciones por plagas. Más específicamente, la presente invención se refiere a tecnologías recombinantes de ARN bicatenario para suprimir o inhibir la expresión de una secuencia codificante diana en una plaga.
10
Introducción
El ambiente está repleto de plagas y se han probado numerosos métodos para controlar las infestaciones por plagas de las plantas. Las composiciones para controlar infestaciones por plagas microscópicas se han proporcionado en forma de composiciones antibióticas, antivirales y antifúngicas. Los métodos para controlar las infestaciones por 15 plagas mayores, tales como los nematodos, han estado típicamente en forma de composiciones químicas que se aplican a las superficies sobre las que residen las plagas, o se han administrado a los animales infestados en forma de gránulos, polvos, comprimidos, pastas, o cápsulas.
Los cultivos comerciales son a menudo dianas para el ataque de insectos. Se ha logrado un progreso sustancial en 20 las últimas décadas hacia el desarrollo de métodos y composiciones más eficientes para controlar las infestaciones por insectos en plantas. Los pesticidas químicos han sido muy eficaces para erradicar las infestaciones por plagas. Sin embargo, hay varias desventajas en cuanto al uso de agentes pesticidas químicos. Los pesticidas químicos no son solo potencialmente perjudiciales para el ambiente, sino que los pesticidas químicos no son selectivos y son dañinos para varios cultivos y para fauna no diana. Los pesticidas químicos persisten en el ambiente y generalmente 25 se metabolizan lentamente, o no se metabolizan. Se acumulan en la cadena alimentaria y particularmente en las especies de depredadores superiores. La acumulación de estos agentes pesticidas químicos da como resultado el desarrollo de resistencia a los agentes y en especies más arriba en la escala evolutiva, pueden actuar como agentes mutagénicos y/o carcinogénicos causando modificaciones genéticas irreversibles y perjudiciales.
30
Debido a los peligros asociados con los pesticidas químicos, se han desarrollado estrategias moleculares para controlar las infestaciones por plagas en plantas. Por ejemplo, las bacterias de Bacillus thuringiensis (B.t.) se han comercializado y usado como insecticidas seguros para el medio ambiente y aceptables durante más de treinta años. La disminución en la aplicación de agentes pesticidas ha dado como resultado que los suelos y las aguas que efluyen de estos suelos a las corrientes, ríos, pozos y lagos estén más limpios. Además de estos beneficios 35 ambientales, ha habido un aumento perceptible en el número de insectos beneficiosos en los campos de cultivo en los que crecen cultivos transgénicos resistentes a insectos debido a la disminución en el uso de agentes insecticidas químicos.
La interferencia de ARN (ARNi) proporciona una herramienta potencialmente potente para controlar la expresión 40 génica debido a su especificidad de selección de la diana y a una eficacia notablemente alta en la supresión del ARNm diana. ARNi se refiere al proceso de silenciamiento génico post-transcripcional específico de secuencia mediado por ARN pequeños interferentes (ARNpi) (Zamore, P. et al., Cell 101:25-33 (2000); Fire, A. et al., Nature 391:806 (1998); Hamilton et al., Science 286, 950-951 (1999); Lin et al., Nature 402:128-129 (1999)). Aunque los mecanismos subyacentes a la ARNi no están completamente caracterizados, se cree que la presencia de ARNbc en 45 una célula activa la ARNi activando la enzima Dicer ribonucleasa III (Zamore, P. et al., (2000); Hammond et al., Nature 404, 293 (2000)). Dicer procesa el ARNbc en pequeños trozos llamados ARN pequeños interferentes (ARNpi), que son de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud y comprenden aproximadamente 19 dúplex de pares de bases (Zamore et al., (2000); Elbashir et al., Genes Dev., 15, 188 (2001)). Después de la administración a células, las moléculas de ARNpi se asocian con un complejo de endonucleasa, 50 citado comúnmente como un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que junta la hebra antisentido del ARNpi y la diana génica de ARNm celular. RISC escinde al ARNm, que después se libera y degrada. De manera importante, RISC es después capaz de degradar copias adicionales del ARNm diana.
Por consiguiente, la presente divulgación proporciona métodos y composiciones para controlar la infestación por 55 plagas reprimiendo, retrasando o de otro modo reduciendo la expresión génica en una plaga particular.
Sumario de la invención
La invención proporciona una célula de planta transformada con y que comprende un polinucleótido que codifica un 60 ARN bicatenario, comprendiendo dicho ARN bicatenario hebras complementarias hibridadas, en la que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleótido seleccionado entre el grupo que consiste en:
(i) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 65 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420 y 2466,
(ii) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana que codifica la secuencia de aminoácidos representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 4, 796, 891, 1074, 1685 y 2367, y
(iii) polirribonucleótidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleótidos de (i) o (ii).
5
La invención también proporciona una planta transformada con y que comprende un polinucleótido que codifica un ARN bicatenario, comprendiendo dicho ARN bicatenario hebras complementarias hibridadas, en la que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleótido seleccionado entre el grupo que consiste en:
(i) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana representado por 10 cualquiera de las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420 y 2466,
(ii) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana que codifica la secuencia de aminoácidos representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 4, 796, 891, 1074, 1685 y 2367, y
(iii) polirribonucleótidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleótidos de (i) 15 o (ii).
La invención proporciona además una planta que comprende un ARN bicatenario, comprendiendo dicho ARN bicatenario hebras complementarias hibridadas, en la que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleótido seleccionado entre el grupo que consiste en: 20
(i) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420 y 2466,
(ii) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana que codifica la 25 secuencia de aminoácidos representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 4, 796, 891, 1074, 1685 y 2367, y
(iii) polirribonucleótidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleótidos de (i) o (ii).
Además se proporciona una semilla de la planta de la invención, comprendiendo dicha semilla dicho ARN 30 bicatenario.
También se proporciona un producto de la planta de la invención, comprendiendo dicho producto dicho ARN bicatenario.
35
La invención proporciona además un pesticida que comprende la planta de la presente invención.
En una realización de la invención, se proporciona un método para controlar una infestación por una plaga de insectos, que comprende proporcionar a la plaga material de planta que comprende el ARN bicatenario, comprendiendo dicho ARN bicatenario hebras complementarias hibridadas, en la que al menos una de dichas 40 hebras comprende un polirribonucleótido seleccionado entre el grupo que consiste en:
(i) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420 y 2466, 45
(ii) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana que codifica la secuencia de aminoácidos representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 4, 796, 891, 1074, 1685 y 2367, y
(iii) polirribonucleótidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleótidos de (i) o (ii).
50
En otra realización, se proporciona un método para controlar una infestación por una plaga de insectos, que comprende proporcionar dicho ARN bicatenario en la dieta de dicha plaga o rociar la superficie de una planta con dicho ARN bicatenario.
También se proporciona un método para mejorar el rendimiento de una cosecha, que comprende: 55
a) introducir un polinucleótido que codifica un ARN bicatenario, comprendiendo dicho ARN bicatenario hebras complementarias hibridadas, en la que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleótido seleccionado entre el grupo que consiste en:
60
(i) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026; 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420 y 2466,
(ii) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana que codifica la secuencia de aminoácidos representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 4, 796, 891, 1074, 1685 y 2367, y 65
(iii) polirribonucleótidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleótidos de (i) o (ii); y
b) cultivar dicha planta para permitir la expresión de dicho ARN bicatenario, en el que dicha expresión inhibe la alimentación por una plaga de insectos y la pérdida de rendimiento debido a la infestación por la plaga. 5
Además, la invención proporciona el uso de una planta o una célula de planta de la invención o un producto producido por una planta de la invención para tratar las infestaciones por insectos de plantas.
Breve descripción de los dibujos 10
Figura 1-LD: Supervivencia de L. decemlineata con dieta artificial tratada con ARNbc. Se alimentó a los insectos en el segundo estado larvario con dieta tratada con 50 µl de solución aplicada tópicamente de ARNbc (dianas o control de gfp). La dieta se sustituyó por una dieta nueva que contenía ARNbc aplicado tópicamente después de 7 días. El número de insectos supervivientes se evaluó en los días 2, 5, 7, 8, 9 y 13. El porcentaje de larvas 15 supervivientes se calculó en relación al día 0 (comienzo del ensayo). LD006 diana: (SEC ID Nº: 178); LD007 diana (SEC ID Nº: 183); LD010 diana (SEC ID Nº: 188); LD011 diana (SEC ID Nº: 193); LD014 diana (SEC ID Nº: 198); ARNbc de gfp (SEC ID Nº: 235).
Figura 2-LD: Supervivencia de L. decemlineata con dieta artificial tratada con ARNbc. Se alimentó a los insectos en el segundo estado larvario con dieta tratada con 50 µl de solución aplicada tópicamente de ARNbc (dianas o 20 control de gfp). La dieta se sustituyó solo por una dieta nueva después de 7 días. El número de insectos supervivientes se evaluó en los días 2, 5, 6, 7, 8, 9, 12 y 14. El porcentaje de larvas supervivientes se calculó en relación al día 0 (comienzo del ensayo). LD001 diana (SEC ID Nº: 163); LD002 diana (SEC ID Nº: 168); LD003 diana (SEC ID Nº: 173); LD015 diana (SEC ID Nº: 215); LD016 diana (SEC ID Nº: 220); ARNbc de gfp (SEC ID Nº: 235). 25
Figura 3-LD: Peso medio de larvas de L. decemlineata en discos foliares de patata tratados con ARNbc. Se alimentó a los insectos en el segundo estado larvario con discos foliares tratados tópicamente con 20 µl de una solución aplicada tópicamente (10 ng/µl) de ARNbc (LD002 diana o gfp). Después de dos días se transfirió a los insectos cada día a hojas no tratadas.
Figura 4-LD: Supervivencia de L. decemlineata con dieta artificial tratada con versiones más cortas de ARNbc 30 de LD014 diana y ARNbc concatémero. Se alimentó a los insectos en el segundo estado larvario con dieta tratada con 50 µl de solución aplicada tópicamente de ARNbc (gfp o dianas). El número de insectos supervivientes se evaluó en los días 3, 4, 5, 6 y 7. El porcentaje de larvas supervivientes se calculó en relación al día 0 (comienzo del ensayo).
Figura 5-LD: Supervivencia de larvas de L. decemlineata con dieta artificial tratada con diferentes 35 concentraciones de ARNbc de LD002 diana (a), LD007 diana (b), LD010 diana (c), LD011 diana (d), LD014 diana (e), LD015 diana (f), LD016 (g) y LD027 diana (h). Se alimentó a los insectos en el segundo estado larvario con dieta tratada con 50 µl de solución aplicada tópicamente de ARNbc. La dieta se sustituyó por una dieta nueva que contenía ARNbc aplicado tópicamente después de 7 días. El número de insectos supervivientes se evaluó a intervalos regulares. El porcentaje de larvas supervivientes se calculó en relación al día 0 (comienzo del ensayo). 40
Figura 6-LD: Efectos de cepas de E. coli que expresan ARNbc de LD010 diana en la supervivencia de larvas del escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata, a lo largo del tiempo. Las dos cepas bacterianas se ensayaron en bioensayos separados basados en dieta artificial: (a) AB301-105(DE3); los puntos de datos para pGBNJ003 y pGN29 representan los valores de mortalidad general de 5 clones bacterianos diferentes, (b) BL21(DE3); los puntos de datos para pGBNJ003 y pGN29 representan los valores de mortalidad 45 general de 5 clones bacterianos diferentes y uno individual, respectivamente. Las barras de error representan desviaciones estándar.
Figura 7-LD: Efectos diferentes clones de cepas de E. coli (a) AB301-105 (DE3) y (b) BL21 (DE3) que expresan ARNbc de LD010 diana en la supervivencia de larvas del escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata, 12 días después de la infestación. Los puntos de datos son valores de mortalidad media para cada 50 clon para pGN29 y pGBNJ003. El clon 1 de AB301-105 (DE3) que porta el plásmido pGBNJ003 mostró una mortalidad del 100 % para el EPC en ese punto temporal. Las barras de error representan desviaciones estándar.
Figura 8-LD: Efectos diferentes clones de cepas de E. coli (a) AB301-105 (DE3) y (b) BL21 (DE3) que expresan ARNbc de LD010 diana en el crecimiento y desarrollo de los supervivientes larvarios del escarabajo de la patata 55 de Colorado, Leptinotarsa decemlineata, 7 días después de la infestación. Los puntos de datos son valores de % de peso larvario medio para cada clon (un clon para pGN29 y cinco clones para pGBNJ003) basándose en los datos de la Tabla 10. El tratamiento solo con dieta representa un peso larvario 100 % normal.
Figura 9-LD: Supervivencia de larvas del escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata, en plantas de patata rociadas con bacterias productoras de ARN bicatenario 7 días después de la infestación. Se 60 contó el número de supervivientes larvarios y se expresó en términos de % de mortalidad. La cepa bacteriana hospedadora usada fue la cepa deficiente en RNasaIII AB301-105 (DE3). La diana génica de insecto fue LD010.
Figura 10-LD: Retraso de crecimiento/desarrollo de supervivientes larvarios del escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata, alimentados con plantas de patata rociados con bacterias productoras de ARNbc 11 días después de la infestación. La cepa bacteriana hospedadora usada fue la cepa deficiente en 65 RNasaIII AB301-105 (DE3). Las cifras de los datos se representan como porcentaje del peso larvario normal; 100
% del peso larvario normal dado para tratamiento solo con dieta. La diana génica de insecto fue LD010. Las barras de error representan desviaciones estándar.
Figura 11-LD: Resistencia de la patata al daño causado por larvas del escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata, por bacterias productoras de ARN bicatenario 7 días después de la infestación. A la izquierda, planta rociada con 7 unidades de bacteria AB301-105 (DE3) que contiene al plásmido pGN29; a la 5 derecha, planta rociada con 7 unidades de bacteria AB301-105 (DE3) que contiene al plásmido pGBNJ003. Una unidad se define como el equivalente a 1 ml de una suspensión bacteriana a un valor de DO de 1 a 600 nm. La diana génica de insecto fue LD010.
Figura 12-LD: Supervivencia de adultos de L. decemlineata en discos foliares de patata tratados con ARNbc. Se alimentó a insectos adultos jóvenes con discos foliares tratados con ARN bicatenario durante los dos primeros 10 días y después en follaje de patata no tratado. El número de insectos supervivientes se evaluó de manera regular; se registró a los insectos que se movían como insectos que estaban vivos y parecían moverse normalmente; los insectos moribundos como insectos que estaban vivos pero que parecía que estaban enfermos y que se movían lentamente, estos insectos no eran capaces de volver a colocarse tras ponerlos hacia arriba. LD002 diana (SEC ID Nº: 168); LD010 diana (SEC ID Nº: 188); LD014 diana (SEC ID Nº: 198); LD016 diana 15 (SEC ID Nº: 220); ARNbc de gfp (SEC ID Nº: 235).
Figura 13-LD: Efectos de ARN bicatenario diana producido por bacterias contra larvas de L. decemlineata. Se aplicaron cincuenta µl de una suspensión de DO 1 de bacterias tratadas con calor que expresaban ARNbc (SEC ID Nº: 188) tópicamente sobre la dieta artificial en cada pocillo de una placa de 48 pocillos. Se pusieron larvas de EPC en estado L2 en cada pocillo. En el día 7, se tomó una foto de las larvas de EPC en una placa que contenía 20 (a) dieta con bacterias que expresan ARN bicatenario 10 diana, (b) dieta con bacterias que portan el vector vacío pGN29 y, (c) solo dieta.
Figura 14-LD Efectos en la supervivencia larvaria de EPC y el crecimiento de diferentes cantidades de E. coli de la cepa AB301-105(DE3) inactivadas que portan el plásmido pGBNJ003 aplicadas tópicamente al follaje de la patata antes de la infestación por insectos. Se alimentó a diez larvas de L1 con patata tratada durante 7 días. 25 Cantidad de suspensión bacteriana rociada sobre las plantas: 0,25 U, 0,08 U, 0,025 U, 0,008 U de diana 10 y 0,25 U de pGN29 (control negativo; también incluye agua Milli-Q). Una unidad (U) se define como la cantidad bacteriana equivalente presente en 1 ml de cultivo con un valor de densidad óptica de 1 a 600nm. Se roció un volumen total de 1,6 ml sobre cada planta. La diana génica de insecto fue LD010.
Figura 15-LD Resistencia de la patata al daño causado por larvas de EPC por E. coli de cepa AB301-105(DE3) 30 inactivadas que portan el plásmido pGBNJ003 siete días después de la infestación. (a) agua, (b) 0,25 U de E. coli AB301-105(DE3) que portan pGN29, (c) 0,025 U de E. coli AB301-105(DE3) que portan pGBNJ003, (d) 0,008 U de E. coli AB301-105(DE3) que portan pGBNJ003. Una unidad (U) se define como la cantidad bacteriana equivalente presente en 1 ml de cultivo con un valor de densidad óptica de 1 a 600nm. Se roció un volumen total de 1,6 ml sobre cada planta. La diana génica de insecto fue LD010. 35
Figura 1-PC: Efectos de los ARNbc diana ingeridos en la supervivencia y crecimiento de larvas de P. cochleariae. Se alimentó a las larvas neonatas con discos foliares de colza tratados con 25 µl de solución de ARNbc a 0,1 µg/µl aplicada tópicamente (dianas o control de gfp). Después de 2 días, los insectos se transfirieron a nuevos discos foliares tratados con ARNbc. En el día 4, las larvas de un replicado por cada tratamiento se recogieron y se pusieron en una placa de Petri que contenían nuevo follaje de colza no tratado. 40 Los insectos se evaluaron en los días 2, 4, 7, 9 y 11. (a) Supervivencia de larvas de P. cochleariae en discos foliares de colza tratados con ARNbc. El porcentaje de larvas supervivientes se calculó en relación al día 0 (comienzo del ensayo). (b) Pesos medios de larvas de P. cochleariae en discos foliares de colza tratados con ARNbc. Se pesó juntos a los insectos de cada replicado y se determinó el peso medio por larva. Las barras de error representan desviaciones estándar. Diana 1: SEC ID Nº: 473; diana 3: SEC ID Nº: 478; diana 5: SEC ID Nº: 45 483; diana 10: SEC ID Nº: 488; diana 14: SEC ID Nº: 493; diana 16: SEC ID Nº: 498; diana 27: SEC ID Nº: 503; ARNbc de gfp: SEC ID Nº: 235.
Figura 2-PC: Supervivencia de P. cochleariae en discos foliares de colza tratados con diferentes concentraciones de ARNbc de (a) PC010 diana y (b) PC027 diana. Se colocaron larvas neonatas en discos foliares tratados con 25 µl de solución de ARNbc aplicada tópicamente. Los insectos se transfirieron a nuevos 50 discos foliares tratados en el día 2. En el día 4 para PC010 diana y en el día 5 para PC027 diana, se transfirió a los insectos a hojas no tratadas. El número de insectos supervivientes se evaluó en los días 2, 4, 7, 8, 9 y 11 para PC010 y 2, 5, 8, 9 y 12 para PC027. El porcentaje de larvas supervivientes se calculó en relación al día 0 (comienzo del ensayo).
Figura 3-PC: Efectos de E.coli de la cepa AB301-105(DE3) que expresan PC010 diana de ARNbc en la 55 supervivencia del escarabajo de la hoja de la mostaza, P. cochleariae, a lo largo del tiempo. Los puntos de datos para cada tratamiento representan los valores de mortalidad media de 3 replicados diferentes. Las barras de error representan desviaciones estándar. Diana 10: SEC ID Nº: 488
Figura 1-EV: Supervivencia de larvas de E. varivestis en discos foliares de alubia tratados con ARNbc. Se alimentó a las larvas neonatas con discos foliares de alubia tratados con 25 µl de solución de ARNbc a 1 µg/µl 60 aplicada tópicamente (dianas o control de gfp). Después de 2 días, los insectos se transfirieron a nuevos discos foliares tratados con ARNbc. En el día 4, las larvas de un tratamiento se recogieron y se pusieron en una caja de plástico que contenían nuevo follaje de alubia no tratado. Se evaluó la mortalidad de los insectos en los días 2, 4, 6, 8 y 10. El porcentaje de larvas supervivientes se calculó en relación al día 0 (comienzo del ensayo). Diana 5: SEC ID Nº: 576; diana 10: SEC ID Nº: 586; diana 15: SEC ID Nº: 591; diana 16: SEC ID Nº: 596; ARNbc de gfp: 65 SEC ID Nº: 235.
Figura 2-EV: Efectos de ARNbc diana ingerido en la supervivencia de adultos de E. varivestis y resistencia al daño foliar por insectos de judía verde. (a) Supervivencia de adultos de E. varivestis en hojas de alubia tratadas con ARNbc. Se alimentó a los adultos con discos foliares de alubia tratados con 75 µl de solución de ARNbc a 0,1 µg/µl aplicada tópicamente (dianas o control de gfp). Después de 24 horas, los insectos se transfirieron a nuevos discos foliares tratados con ARNbc. Después de 24 horas adicionales, los adultos de un tratamiento se 5 recogieron y se pusieron en una caja de plástico que contenía nuevas plantas de alubia enteras en maceta no tratadas. Se evaluó la mortalidad de los insectos en los días 4, 5, 6, 7, 8 y 11. El porcentaje de adultos supervivientes se calculó en relación al día 0 (comienzo del ensayo). Diana 10: SEC ID Nº: 586; diana 15: SEC ID Nº: 591; diana 16: SEC ID Nº: 596; ARNbc de gfp: SEC ID Nº: 235. (b) Resistencia al daño foliar de la alubia causado por adultos de E. varivestis por ARNbc. Las plantas enteras que contenían insectos de un tratamiento 10 (véase (a)) se comprobaron visualmente en busca de daño foliar en el día 9. (i) diana 10; (ii) diana 15; (iii) diana 16; (iv) ARNbc de gfp: (v) no tratados.
Figura 1-TC: Supervivencia de larvas de T. castaneum con dieta artificial tratadas con ARNbc de diana 14. Se alimentó a las larvas neonatas con dieta basada en una mezcla de harina/leche con 1 mg ARNbc de diana 14. El control fue agua (sin ARNbc) en la dieta. Se efectuaron cuatro replicados de 10 larvas en primer estadio por 15 replicado para cada tratamiento. Se evaluó la supervivencia de los insectos como media del porcentaje en los días 6, 17, 31, 45 y 60. El porcentaje de larvas supervivientes se calculó en relación al día 0 (comienzo del ensayo). Las barras de error representan desviaciones estándar. TC014 diana: SEC ID Nº: 878.
Figura 1-MP: Efecto de ARNbc de diana 27 en la supervivencia de ninfas de Myzus persicae. Aquellas en el primer estadio se pusieron en cámaras de alimentación que contenían 50 µl de dieta líquida con 2 µg/µl de 20 ARNbc (diana 27 o control de ARNbc de gfp). Por tratamiento, se pusieron 5 cámaras de alimentación con 10 estadios en cada cámara de alimentación. El número de supervivientes se evaluó a los 8 días después de comenzar el bioensayo. Las barras de error representan desviaciones estándar. MP027 diana: SEC ID Nº: 1061; ARNbc de gfp: SEC ID Nº: 235.
Figura 1-NL: Supervivencia de Nilaparvata lugens en dieta artificial líquida tratada con ARNbc. Se alimentó a 25 ninfas del primer o segundo estadio larvario con dieta suplementada con solución de 2 mg/ml de dianas de ARNbc en bioensayos separados: (a) NL002, NL003, NL005, NL010; b) NL009, NL016; c) NL014, NL018; (d) NL013, NL015, NL021. La supervivencia de insectos sobre dianas se comparó con la de solo dieta y dieta con control de ARNbc de gfp a la misma concentración. La dieta se reemplazó por una dieta nueva que contenía ARNbc cada dos días. El número de insectos supervivientes se evaluó cada día. 30
Figura 2-NL: Supervivencia de Nilaparvata lugens en dieta artificial líquida tratada con diferentes concentraciones de ARNbc de NL002 diana. Se alimentó a ninfas del primer o segundo estadio larvario con dieta suplementada con 1, 0,2, 0,08 y 0,04 mg/ml (concentración final) de NL002. La dieta se reemplazó por una dieta nueva que contenía ARNbc cada dos días. El número de insectos supervivientes se evaluó cada día.
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Descripción detallada de la invención
La presente divulgación proporciona un medio para controlar las infestaciones por plagas administrando a una plaga una secuencia codificante diana que suprime o inhibe de manera post-transcripcional una función biológica requerida en la plaga. En un aspecto, la divulgación contempla alimentar a una plaga con una molécula o más de 40 ácido ribonucleico (ARN) bicatenario o interferente pequeño transcrito a partir de la totalidad o una porción de una secuencia codificante diana que es esencial para el mantenimiento y supervivencia de la plaga. Por tanto, la presente divulgación se refiere a la inhibición específica de secuencia de secuencias codificantes usando ARN bicatenario (ARNbc), incluyendo ARN pequeño interferente (ARNpi), como medio para el control de plagas.
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Hasta ahora, no ha sido práctico proporcionar moléculas de ARNbc en la dieta de la mayoría de las especies de plagas debido a que las moléculas de ARN se degradan fácilmente por las nucleasas en el ambiente y se creyó que eran inestables en ambientes levemente alcalinos o ácidos, tales como aquellos encontrados en los tractos digestivos de la mayor parte de plagas de invertebrados. Por tanto, ha existido la necesidad de métodos mejorados para modular la expresión génica suprimiendo, retrasando o de otro modo reduciendo la expresión génica en una 50 plaga particular con el fin de controlar una infestación por una plaga o para introducir nuevos rasgos fenotípicos.
Los inventores en el presente documento han identificado medios para controlar la infestación por una plaga proporcionando moléculas de ARNbc en la dieta de dicha plaga. La secuencia del ARNbc corresponde a una parte o la totalidad de un gen esencial de la plaga y produce la regulación negativa de la plaga mediante interferencia de 55 ARN (ARNi). Como resultado de la regulación negativa del ARNm, el ARNbc previene la expresión de la proteína diana de la plaga y da como resultado uno o más de (pero sin limitación) los siguientes atributos: reducción en la alimentación por la plaga, reducción en la viabilidad de la plaga, muerte de la plaga, inhibición o diferenciación y desarrollo de la plaga, ausencia o capacidad reducida de la reproducción sexual por la plaga, formación de músculos, formación de hormona juvenil, regulación de hormona juvenil, regulación y transporte de iones, 60 mantenimiento del potencial de la membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación del esperma, síntesis de feromonas, percepción de feromonas, formación de antenas, formación de alas, formación de patas, desarrollo y diferenciación, formación de huevos, maduración larvaria, formación de enzimas digestivas, síntesis de hemolinfa, mantenimiento de la hemolinfa, neurotransmisión, división celular, metabolismo energético, respiración, apoptosis y cualquier componente de la estructura citoesquelética de una célula eucariota, 65 tales como, por ejemplo, actinas y tubulinas. Uno cualquiera o cualquier combinación de estos atributos puede dar
como resultado una inhibición eficaz de la infestación por la plaga y en el caso de una plaga de plantas, la inhibición de la infestación de la planta.
Todos los términos técnicos empleados en esta memoria descriptiva se usan de manera común en bioquímica, biología molecular y agricultura; de este modo, se entienden por los expertos en el campo al que pertenece esta 5 divulgación. Estos términos técnicos pueden encontrarse, por ejemplo, en: MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3ª ed., Vol. 1 (-3), ed. Sambrook y Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Ausubel et al., Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience, Nueva York, 1988 (con actualizaciones periódicas); SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN 10 MOLECULAR BIOLOGY, 5ª ed., Vol. 1 (-2), ed. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc., 2002; GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL, Vol. 1-2, ed. Green et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997.
La metodología implicada en las técnicas de biología vegetal se describen en el presente documento y también se 15 describen en detalle en tratados tales como METHODS IN PLANT MOLECULAS BIOLOGY: A LABORATORY COURSE MANUAL, ed. Maliga et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1995. Se describen varias técnicas usando PCR, por ejemplo, en Innis et al., PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, San Diego, 1990 y en Dieffenbach y Dveksler, PCR PRIMER: A LABORATORY MANUAL, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2003. Los pares 20 de cebadores de PCR pueden derivarse de secuencias conocidas mediante técnicas conocidas, tales como el uso de programas informáticos previstos para ese fin, por ejemplo, Primer, versión 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA. Los métodos para la síntesis química de ácidos nucleicos se discuten, por ejemplo, en Beaucage y Caruthers, Tetra. Letts. 22: 1859-62 (1981) y Matteucci y Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981). 25
Las digestiones con enzimas de restricción, fosforilaciones, ligamientos y transformaciones se efectuaron tal como se describe en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Todos los reactivos y materiales usados para el crecimiento y mantenimiento de células bacterianas se obtuvieron a través de Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wis.), DIFCO Laboratories (Detroit, Mich.), 30 Invitrogen (Gaithersburg, Md.), o Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.) a menos que se especifique lo contrario.
Transformación de Agrobacterium o bacteriana: como se conoce bien en la técnica, las Agrobacteria que se usan para transformar células vegetales son derivados desarmados y virulentos de, generalmente, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes, que contienen un vector. El vector contiene típicamente un polinucleótido 35 deseado que se localiza entre los límites de un ADN-T. Sin embargo, puede usarse cualquier bacteria capaz de transformar una célula vegetal, tales como, Rhizobium trifolii, Rhizobium leguminosarum, Phyllobacterium myrsinacearum, SinoRhizobium meliloti y MesoRhizobium loti.
Angiosperma: plantas vasculares que tienen semillas encerradas en un ovario. Las angiospermas son plantas de 40 semilla que producen flores que portan frutos. Las angiospermas se dividen en plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas.
La actividad biológica se refiere al comportamiento biológico y los efectos de una proteína o péptido y sus manifestaciones en una plaga. Por ejemplo, un ARNi puede evitar la traducción de un ARNm particular, inhibiendo 45 de este modo la actividad biológica de la proteína codificada por el ARNm u otra actividad biológica de la plaga.
En la presente descripción, una molécula de ARNi puede inhibir una actividad biológica en una plaga, dando como resultado uno o más de (pero sin limitación) los siguientes atributos: reducción en la alimentación por la plaga, reducción en la viabilidad de la plaga, muerte de la plaga, inhibición o diferenciación y desarrollo de la plaga, 50 ausencia o capacidad reducida de la reproducción sexual por la plaga, formación de músculos, formación de hormona juvenil, regulación de hormona juvenil, regulación y transporte de iones, mantenimiento del potencial de la membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación del esperma, síntesis de feromonas, percepción de feromonas, formación de antenas, formación de alas, formación de patas, desarrollo y diferenciación, formación de huevos, maduración larvaria, formación de enzimas digestivas, síntesis de hemolinfa, 55 mantenimiento de la hemolinfa, neurotransmisión, división celular, metabolismo energético, respiración, apoptosis y cualquier componente de la estructura citoesquelética de una célula eucariota, tales como, por ejemplo, actinas y tubulinas.
Un producto básico abarca cualquier producto producido o de otro modo derivado a partir de una planta, 60 incluyendo, pero sin limitación, comida, alimento, fibra, papel, comida, proteína, almidón, harina, ensilaje, café, té y aceite.
ADN complementario (ADNc) se refiere a un ADN monocatenario sintetizado a partir de un molde de ARNm maduro. Aunque hay varios métodos, el ADNc se sintetiza más frecuentemente a partir de ARNm maduro 65 (completamente cortado y empalmado) usando la enzima transcriptasa inversa. Esta enzima actúa sobre una sola
hebra de ARNm, generando su ADN complementario basándose en el emparejamiento de pares de bases de ARN (A, U, G, C) a sus complementos de ADN (T, A, C, G). Dos hebras de ácido nucleico son sustancialmente complementarias cuando se emparejan al menos un 85 % de sus bases.
Polinucleótido deseado: un polinucleótido deseado es un elemento genético, tal como un promotor, potenciador, o 5 terminador, o un gen o un polinucleótido que se va a transcribir y/o traducir en una célula transformada que comprende el polinucleótido deseado en su genoma. Si el polinucleótido deseado comprende una secuencia que codifica un producto proteico, la región codificante puede unirse operativamente a elementos reguladores, tales como a un promotor y a un terminador, que producen la expresión de un transcrito de ARN mensajero asociado y/o un producto proteico codificado por el polinucleótido deseado. Por lo tanto, un "polinucleótido deseado" puede 10 comprender un gen que está unido operativamente en la orientación 5' a 3' a un promotor, un gen que codifica una proteína y un terminador. Como alternativa, el polinucleótido deseado puede comprender un gen o un fragmento del mismo, en una orientación "sentido" y/o "antisentido", cuya transcripción produce ácidos nucleicos que pueden afectar a la expresión de un gen endógeno en la célula vegetal. Un polinucleótido deseado también puede producir tras la transcripción un producto de ARN bicatenario tras lo que se inicia la interferencia de ARN de un gen al que se 15 asocia el polinucleótido deseado. Un polinucleótido deseado puede posicionarse en un vector, de tal forma que las secuencias del límite izquierdo y derecho flanquean o se encuentran a cada lado del polinucleótido deseado. La presente divulgación prevé la integración estable de uno o más polinucleótidos deseados en el genoma de al menos una célula hospedadora. Un polinucleótido deseado puede estar mutado o ser una variante de su secuencia de tipo silvestre. Se entiende que la totalidad o parte del polinucleótido deseado puede integrarse en el genoma de un 20 hospedador. También se entiende que la expresión "polinucleótido deseado" abarca uno o más de dichos polinucleótidos. Por lo tanto, un vector puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más polinucleótidos deseados.
Una planta dicotiledónea (dicot) es una planta de flor cuyos embriones tienen dos mitades de semilla o 25 cotiledones, venas foliares ramificadas y partes de flor en múltiplos de cuatro o cinco. Los ejemplos de dicotiledóneas incluyen, pero sin limitación, Eucalyptus, Populus, Liquidamber, Acacia, teka, caoba, algodón, tabaco, Arabidopsis, tomate, patata, remolacha azucarera, brécol, mandioca, batata, pimiento, poinsetia, judía, alfalfa, soja, zanahoria, fresa, lechuga, roble, arce, nogal, rosa, menta, calabaza, margarita, geranio, aguacate y cactus.
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Exógeno, en referencia a un ácido nucleico, significa que ese ácido nucleico se deriva de organismos no hospedadores. El ADN o ARN exógeno representa ácidos nucleicos que son de origen natural en la composición genética de hongos, bacterias, virus, mamíferos, peces o aves, pero que no son de origen natural en el hospedador que se va a transformar. Por lo tanto, un ácido nucleico exógeno es uno que codifica, por ejemplo, un polipéptido que no se produce de manera natural por el hospedador transformado. Un ácido nucleico exógeno no tiene por qué 35 codificar un producto proteico.
Un hongo o células fúngicas, tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier célula presente en o derivada de un organismo que pertenece al reino Fungi. Los métodos son aplicables a todos los hongos y células fúngicas que son susceptibles de silenciamiento génico mediante interferencia de ARN y que son capaces de 40 internalizar ARN bicatenario a partir de su ambiente inmediato.
En una realización, el hongo puede ser un moho, o más particularmente un hongo filamentoso. En otras realizaciones, el hongo puede ser una levadura.
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En una realización, el hongo puede ser un hongo ascomiceto, es decir, un hongo que pertenece al Phylum Ascomycota.
En realizaciones y métodos preferidos pero no limitantes la célula fúngica se selecciona del grupo que consiste en:
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una célula fúngica de, o una célula derivada de un hongo patógeno para plantas, tales como, pero sin limitación, Acremoniella spp., Allomyces spp., Alternaria spp. (por ejemplo Alternaria brassicola o Alternaria solani), Amorphothec spp., Ascochyta spp. (por ejemplo, Ascochyta pisi), Aspergillius spp., Aureobasidium spp., Blastocladiella spp., Botrytis spp. (por ejemplo, Botrytis cinerea o Botryotinia fuckeliana), Candida spp., Cladosporium spp., Cercospora spp. (por ejemplo Cercospora kikuchii o Cercospora zaea-maydis), Chaetomium 55 spp., Cladosporium spp. (por ejemplo Cladosporium fulvum), Colletotrichum spp. (por ejemplo Colletotrichum lindemuthianum), Coccidioides spp., Conidiobolus spp., Coprinopsis spp., Corynascus spp., Cryphonectria spp., Cryptococcus spp., Cunninghamella spp., Curvularia spp., Debarymyces spp., Diplodia spp. (por ejemplo Diplodia maydis), Emericella ssp., Encephalitozoon spp., Eremothecium spp., Erysiphe spp. (por ejemplo Erysiphe graminis f. sp. graminis, Erysiphe graminis f.sp. hordei o Erysiphe pisi), Erwinia armylovora, Fusarium spp. (por ejemplo 60 Fusarium nivale, Fusarium sporotrichioides, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Fusarium germinearum, Fusarium culmorum, Fusarium solani, Fusarium moniliforme o Fusarium roseum), Gaeumanomyces spp. (por ejemplo Gaeumanomyces graminis f.sp. tritici), Geomyces spp., Gibberella spp. (por ejemplo Gibberella zeae), Gloeophyllum spp., Glomus spp., Helminthosporium spp. (por ejemplo Helminthosporium turcicum, Helminthosporium carbonum, Helminthosporiurn mavdis o Helminthosporium sigmoideum), Hypocrea spp., 65 Kluyveromyces spp., Lentinula spp., Leptosphaeria salvinii, Leucosporidium spp., Macrophomina spp. (por ejemplo
Macrophomina phaseolina), Magnaportha spp. (por ejemplo Magnaporthe oryzae), Metharhizium spp., Mucor spp., Mycosphaerella spp., Neurospora spp., Nectria spp. (por ejemplo Nectria heamatococca), Ophiostoma spp., Paracocidioides spp, Peronospora spp. (por ejemplo Peronospora manshurica o Peronospora tabacina), Phoma spp. (por ejemplo Phoma betae), Phaeopsheria spp., Phanerochaete spp., Phakopsora spp. (por ejemplo Phakopsora pachyrhizi), Phymatotrichum spp. (por ejemplo Phymatotrichum omnivorum), Phytophthora spp. (por ejemplo 5 Phytophthora cinnamomi, Phytophthora cactorum, Phytophthora phaseoli, Phytophthora parasitica, Phytophthora citrophthora, Phytophthora megasperma f.sp. soiae o Phytophthora infestans), Plasmopara spp. (por ejemplo Plasmopara viticola), Pneumocystis spp., Podosphaera spp. (por ejemplo Podosphaera leucotricha), Puccinia spp. (por ejemplo Puccinia sorghi, Puccinia striiformis, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia asparagi, Puccinia recondita o Puccinia arachidis), Pythium spp. (por ejemplo Pythium aphanidermatum), Pyronema spp., Pyrenophora spp. (por 10 ejemplo Pyrenophora tritici-repentens o Pyrenophora teres), Pyricularia spp. (por ejemplo Pyricularia oryzae), Pythium spp. (por ejemplo Pythium ultimum), Rhincosporium secalis, Rhizoctonia spp. (por ejemplo Rhizoctonia solani, Rhizoctonia oryzae o Rhizoctonia cerealis), Rhizopus spp. (por ejemplo Rhizopus chinensid), Saccharomyces spp., Scerotium spp. (por ejemplo Scerotium rolfsii), Sclerotinia spp. (por ejemplo Sclerotinia sclerotiorum), Septoria spp. (por ejemplo Septoria lycopersici, Septoria glycines, Septoria nodorum o Septoria tritici), Spizellomyces spp., 15 Thermomyces spp., Thielaviopsis spp. (por ejemplo Thielaviopsis basicola), Tilletia spp., Trametes spp., Trichoderma spp. (por ejemplo Trichoderma virde), Trichophyton spp., Uncinula spp. (por ejemplo Uncinula necator), Ustilago maydis (por ejemplo tizón del maíz), Venturia spp. (por ejemplo Venturia inaequalis o Venturia pirina) Yarrwia spp. o Verticillium spp. (por ejemplo Verticillium dahliae o Verticilliuna albo-atrum).
20
Gen se refiere a una secuencia polinucleotídica que comprende secuencias de control y codificantes necesarias para la producción de un polipéptido o precursor. El polipéptido puede estar codificado por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificante. Un gen puede constituir una secuencia codificante no interrumpida o puede incluir uno o más intrones, unidos por las uniones de corte y empalme adecuadas. Además, un gen puede contener una o más modificaciones bien en las regiones codificantes o no 25 traducidas que podrían afectar a la actividad biológica o a la estructura química del producto de expresión, a la velocidad de expresión o al modo de control de la expresión. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, mutaciones, inserciones, eliminaciones y sustituciones de uno o más nucleótidos. En este sentido, dichos genes modificados pueden citarse como "variantes" del gen "nativo".
30
Un elemento genético es cualquier secuencia nucleotídica discreta, tal como, pero sin limitación, un promotor, gen, terminador, intrón, potenciador, espaciador, región 5' no traducida, región 3' no traducida, o sitio de reconocimiento de recombinasa.
Una modificación genética se refiere a la introducción estable de ADN en el genoma de determinados organismos 35 aplicando métodos de biología molecular y celular.
La "supresión génica" o "regulación negativa de la expresión génica" o "inhibición de la expresión génica" se usan de manera intercambiable y se refieren a una reducción medible u observable en la expresión génica o una supresión completa detectable de la expresión génica, al nivel de producto proteico y/o producto de ARNm del gen 40 diana. La regulación negativa o inhibición de la expresión génica es "específica" cuando la regulación negativa o la inhibición del gen diana sucede sin efectos evidentes en otros genes de la plaga.
Dependiendo de la naturaleza del gen diana, la regulación negativa o la inhibición de la expresión génica en las células de una plaga puede confirmarse mediante análisis fenotípico de la célula o de la plaga completa o midiendo 45 el ARNm o la expresión proteica usando técnicas moleculares, tales como hibridación de solución de ARN, protección de nucleasas, hibridación de Northern, retrotranscripción, control de la expresión génica con una micromatriz, unión de anticuerpos, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), transferencia Western, radioinmunoensayo (RIA), otros inmunoensayos o análisis de células activadas por fluorescencia (FACS).
50
Gimnosperma, tal como se usan en el presente documento, se refiere a una planta de semilla que porta semillas sin ovarios. Los ejemplos de gimnospermas incluyen coníferas, cícadas, ginkgos y efedras.
Homología, tal como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias. Es posible que las secuencias de proteínas o nucleótidos sean homólogas si muestran un nivel "significativo" de similitud de secuencia o más 55 preferentemente de identidad de secuencia. Las secuencias realmente homólogas están relacionadas por la divergencia a partir de un gen antecesor común. Los homólogos de secuencia pueden ser de dos tipos: (i) en los casos donde existen homólogos en diferentes especies se conocen como ortólogos. Por ejemplo, los genes de α-globina en ser humano y ratón son ortólogos; (ii) los parálogos son genes homólogos en una sola especie. Por ejemplo, los genes de α- y β-globina en ratón son parálogos. 60
Una célula hospedadora se refiere a un microorganismo, a una célula procariota, a una célula eucariota, o a una línea celular cultivada como una entidad unicelular que puede usarse, o se ha usado como receptor para un vector recombinante u otra transferencia de polinucleótidos, e incluye la descendencia de la célula original que se ha transfectado. La descendencia de una célula individual puede no ser necesariamente completamente idéntica en su 65 morfología en su genómica o en el complemento de ADN total que el progenitor original debido a mutaciones
naturales, accidentales o deliberadas.
Insecto tal como se usa en el presente documento puede ser cualquier insecto, lo que significa cualquier organismo que pertenece al reino de los Animales, más específicamente al phylum Arthropoda y a la clase Insecta o a la clase arachnida. Los métodos son aplicables a todos los insectos que son susceptibles de silenciamiento génico mediante 5 interferencia de ARN y que son capaces de internalizar ARN bicatenario a partir de su ambiente inmediato.
En una realización, el insecto puede pertenecer a los siguientes órdenes: Acari, Araneae, Anoplura, Coleoptera, Collembola, Dermaptera, Dictyoptera, Diplura, Diptera, Embioptera, Ephemeroptera, Grylloblatodea, Hemiptera, Homoptera, Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Mecoptera, Neuroptera, Odonata, Orthoptera, 10 Phasmida, Plecoptera, Protura, Psocoptera, Siphonaptera, Siphunculata, Thysanura, Strepsiptera, Thysanoptera, Trichoptera y Zoraptera.
En realizaciones y métodos preferidos pero no limitantes, el insecto se selecciona entre el grupo que consiste en:
15
un insecto que es una plaga para plantas, tal como, pero sin limitación Nilaparvata spp. (por ejemplo, N. lugens (saltamontes marrón)); Laodelphax spp. (por ejemplo, L. striatellus (saltamontes marrón pequeño)); Nephotettix spp. (por ejemplo, N. virescens o N. cincticeps (saltahojas verde), o N.nigropictus (saltahojas del arroz)); Sogatella spp. (por ejemplo, S. furcifera (saltamontes de dorso blanco)); Blissus spp. (por ejemplo, B. leucopterus leucopterus (chinche)); Scotinophora spp. (por ejemplo, S. vermidulate (insecto negro del arroz)); Acrosternum spp. (por ejemplo, 20 A. hilare (chinche verde)); Parnara spp. (por ejemplo, P. guttata (saltador del arroz)); Chilo spp. (por ejemplo, C. suppressalis (barrenador rayado del tallo del arroz), C. auricilius (barrenador del tallo de flecos dorados), o C. polychrysus (barrenador del tallo de cabeza negra)); Chilotraea spp. (por ejemplo, C. polychrysa (barrenador del tallo del arroz)); Sesamia spp. (por ejemplo, S. inferens (barrenador rosa del arroz)); Tryporyza spp. (por ejemplo, T. innotata (barrenador blanco del arroz), o T. incertulas (barrenador amarillo del arroz)); Cnaphalocrocis spp. (por 25 ejemplo, C. medinalis (enrollador de la hoja del arroz)); Agromyza spp. (por ejemplo, A. osyzae (mosca minadora), o A. parvicornis (mosca minadora de la hoja del maíz)); Diatraea spp. (por ejemplo, D. saccharalis (barrenador de la caña del azúcar), o D. grandiosella (barrenador del maíz del suroeste)); Narnaga spp. (por ejemplo, N. aenescens (oruga verde del arroz)); Xanthodes spp. (por ejemplo, X. transversa (oruga verde)); Spodoptera spp. (por ejemplo, S. frugiperda (gusano cogollero), S. exigua (oruga de la remolacha), S. littoralis (oruga podadora) o S. praefica 30 (oruga podadora de rayas amarillas occidental)); Mythimna spp. (por ejemplo, Mythmna (Pseudaletia) seperata (oruga negra)); Helicoverpa spp. (por ejemplo, H. zea (gusano del maíz)); Colaspis spp. (por ejemplo, C. brunnea (colaspis de la uva)); Lissorhoptrus spp. (por ejemplo, L. oryzophilus (picudo acuático del arroz)); Echinocnemus spp. (por ejemplo, E. squamos (picudo de la planta del arroz)); Diclodispa spp. (por ejemplo, D. armigera (hispa del arroz)); Oulema spp. (por ejemplo, O. oryzae (escarabajo de la hoja); Sitophilus spp. (por ejemplo, S. oryzae (picudo 35 del arroz)); Pachydiplosis spp. (por ejemplo, P. oryzae (mosquito enano del arroz)); Hydrellia spp. (por ejemplo, H. griseola (minador pequeño del arroz), o H. sasakii (gusano del tallo del arroz)); Chlorops spp. (por ejemplo, C. oryzae (gusano del arroz)); Ostrinia spp. (por ejemplo, O. nubilalis (barrenador europeo del maíz)); Agrotis spp. (por ejemplo, A.ipsilon (gusano cortador negro)); Elasmopalpus spp. (por ejemplo, E. lignosellus (barrenador menor del tallo del maiz)); Melanotus spp. (gusano alambre); Cyclocephala spp. (por ejemplo, C. borealis (escarabajo rubio del 40 norte), o C. immaculata (escarabajo rubio del sur)); Popillia spp. (por ejemplo, P. japonica (escarabajo japonés)); Chaetocnema spp. (por ejemplo, C. pulicaria (escarabajo pulga del maíz)); Sphenophorus spp. (por ejemplo, S. maidis (picudo del maíz)); Rhopalosiphum spp. (por ejemplo, R. maidis (pulgón de la hoja del maíz)); Anuraphis spp. (por ejemplo, A. maidiradicis (pulgón de la raíz del maíz)); Melanoplus spp. (por ejemplo, M. femurrubrum (saltamontes de patas rojas) M. differentialis (saltamontes diferencial) o M. sanguinipes (saltamontes migratorio)); 45 Hylemya spp. (por ejemplo, H. platura (mosca de la semilla del maíz)); Anaphothrips spp. (por ejemplo, A. obscrurus (trips de la hierba)); Solenopsis spp. (por ejemplo, S. milesta (hormiga ladrona)); o spp. (por ejemplo, T. urticae (araña de dos manchas), T. cinnabarinus (ácaro carmín); Helicoverpa spp. (por ejemplo, H. zea (gusano del algodón), o H. armigera (gusano de américa)); Pectinophora spp. (por ejemplo, P. gossypiella (gusano rosa)); Earias spp. (por ejemplo, E. vittella (gusano manchado)); Heliothis spp. (por ejemplo, H. virescens (gusano cogollero del 50 tabaco)); Anthonomus spp. (por ejemplo, A. grandis (grillo de la cápsula del algodonero)); Pseudatomoscelis spp. (por ejemplo, P. seriatus (pulga saltona del algodón)); Trialeurodes spp. (por ejemplo, T. abutiloneus (mosca blanca de alas bandeadas) T. vaporariorum (mosca blanca de invernadero)); Bemisia spp. (por ejemplo, B. argentifolii (mosca blanca de la hoja del tabaco)); Aphis spp. (por ejemplo, A. gossypii (pulgón del algodón), A. mellifera); Lygus spp. (por ejemplo, L. lineolaris (chinche manchadora) o L. hesperus (chinche manchadora occidental)); Euschistus 55 spp. (por ejemplo, E. conspersus (chinche conspersa)); Chlorochroa spp. (por ejemplo, C. sayi (chinche de Say)); Nezara spp. (por ejemplo, N. viridula (chinche verde del sur)); Thrips spp. (por ejemplo, T. tabaci (trips de la cebolla)); Frankliniella spp. (por ejemplo, F. fusca (trips del tabaco), o F. occidentalis (trips occidental de la flor)); Leptinotarsa spp. (por ejemplo, L. decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado), L. juncta (falso escarabajo de la patata), o L. texana (falso escarabajo de la patata de Texas)); Lema spp. (por ejemplo, L. trilineata (escarabajo de 60 la patata de tres líneas)); Epitrix spp. (por ejemplo, E. cucumeris (escarabajo pulga de la patata), E. hirtipennis (escarabajo pulga), o E. tuberis (escarabajo pulga de tubérculos)); Epicauta spp. (por ejemplo, E. vittata (escarabajo ampolla de rayas)); Empoasca spp. (por ejemplo, E. fabae (saltahojas de la patata)); Myzus spp. (por ejemplo, M. persicae (pulgón verde del melocotón)); Paratrioza spp. (por ejemplo, P. cockerelli (psílido)); Conoderus spp. (por ejemplo, C. falli (gusano de alambre de la patata del sur), o C. vespertinus (gusano de alambre del tabaco)); 65 Phthorimaea spp. (por ejemplo, P. operculella (polilla de la patata)); Macrosiphum spp. (por ejemplo, M. euphorbiae
(pulgón de la patata)); Thyanta spp. (por ejemplo, T. pallidovirens (chinche de hombros rojos)); Phthorimaea spp. (por ejemplo, P. operculella (polilla de la patata)); Helicoverpa spp. (por ejemplo, H. zea (gusano del fruto del tomate); Keiferia spp. (por ejemplo, K. lycopersicella (gusano alfiler del tomate)); Limonius spp. (gusanos de alambre); Manduca spp. (por ejemplo, M. sexta (gusano del tabaco), o M. quinquemaculata (gusano del tomate)); Liriomyza spp. (por ejemplo, L. sativae, L. trifolli o L. huidobrensis (minador de hojas)); Drosophilla spp. (por ejemplo, 5 D. melanogaster, D. yakuba, D. pseudoobscura o D. simulans); Carabus spp. (por ejemplo, C. granulatus); Chironomus spp. (por ejemplo, C. tentanus); Ctenocephalides spp. (por ejemplo, C.felis (pulga del gato)); Diaprepes spp. (por ejemplo, D. abbreviatus (picudo de la raíz)); Ips spp. (por ejemplo, I. pini (horadador del pino)); Tribolium spp. (por ejemplo, T. castaneum (escarabajo de suelo rojo)); Glossing spp. (por ejemplo G. morsitans (mosca tse-tsé)); Anopheles spp. (por ejemplo, A. gambiae (mosquito de la malaria)); Helicoverpa spp. (por ejemplo, H. armigera 10 (gusano africano)); Acyrthosiphon spp. (por ejemplo, A. pisum (pulgón del guisante)); Apis spp. (por ejemplo, A. melifera (abeja melífera)); Homalodisca spp. (por ejemplo, H. coagulate (chicharrita de alas cristalinas)); Aedes spp. (por ejemplo, Ae. aegypti (mosquito de la fiebre amarilla)); Bombyx spp. (por ejemplo, B. mori (gusano de la seda), B. mandarina); Locusta spp. (por ejemplo, L. migratoria (langosta migratoria)); Boophilus spp. (por ejemplo, B. microplus (pulga del ganado)); Acanthoscurria spp. (por ejemplo, A. gomesiana (tarántula chocolate de pelo rojo)); 15 Diploptera spp. (por ejemplo, D. punctata (cucaracha escarabajo del pacífico)); Heliconius spp. (por ejemplo, H. erato (mariposa roja de la flor de la pasión) o H. melpomene (mariposa de postman)); Curculio spp. (por ejemplo, C. glandium (picudo de la bellota)); Plutella spp. (por ejemplo, P. xylostella (polilla de la col)); Amblyomma spp. (por ejemplo, A. variegatum (pulga del ganado)); Anteraea spp. (por ejemplo, A. yamamai (polilla de la seda)); Belgica spp. (por ejemplo, B. antartic), Bemisa spp. (por ejemplo, B. tabaci), Bicyclus spp., Biphillus spp., Callosobruchus 20 spp., Choristoneura spp., Cicindela spp., Culex spp., Culicoides spp., Diaphorina spp., Diaprepes spp., Euclidia spp., Glossina spp., Gryllus spp., Hydropsyche spp., Julodis spp., Lonomia spp., Lutzomyia spp., Lysiphebus spp, Meladema spp, Mycetophagus spp., Nasonia spp., Oncometopia spp., Papilio spp., Pediculus spp., Plodia spp., Rhynchosciara spp., Sphaerius spp., Toxoptera spp., Trichoplusa spp. y Armigeres spp. (por ejemplo, A. subalbatus). 25
Un "agente para el control de plagas" o un "agente de supresión génica" se refiere a una molécula particular de ARN que comprende un primer segmento de ARN y un segundo segmento de ARN, en el que la complementariedad entre el primer y el segundo segmento de ARN da como resultado la capacidad de los dos segmentos para que hibriden in vivo e in vitro para formar una molécula bicatenaria. Generalmente, puede ser preferible incluir un tercer 30 segmento de ARN que enlace y estabilice a la primera y segunda secuencia de tal forma que puede formarse un tallo unido junto a un extremo de cada uno del primer y el segundo segmento por el tercer segmento para formar un bucle, de tal forma que la estructura completa forma una estructura de tallo y bucle, o las estructuras que hibridan de una manera más estrechas pueden formar una estructura de tallo-bucle anudada. Como alternativa, podría formarse una horquilla simétrica sin un tercer segmento en el que no se ha diseñado un bucle, pero que por razones estéricas 35 una horquilla podría formar su propio bucle cuando el tallo es lo suficientemente largo como para estabilizarse por sí mismo. El primer y el segundo segmento de ARN se encontrará generalmente entre la longitud de la molécula de ARN y será una repetición sustancialmente invertida del otro y se unen juntos mediante el tercer segmento de ARN. El primer y el segundo segmento corresponde invariablemente y no respectivamente a una secuencia sentido y una antisentido respecto del ARN transcrito a partir del gen diana en la plaga de insecto diana que se suprime por la 40 ingestión de la molécula de ARNbc.
El agente de control de plagas puede ser una molécula de ácido nucleico sustancialmente purificada (o aislada) y más específicamente moléculas de ácido nucleico o fragmentos de moléculas de ácido nucleico de las mismas de un ADN genómico (ADNg) o una biblioteca de ADNc. Como alternativa, los fragmentos pueden comprender 45 oligonucleótidos más pequeños que tengan de aproximadamente 15 a aproximadamente 250 restos de nucleótidos y más preferentemente, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 restos de nucleótidos.
Introducción, tal como se usan en el presente documento, se refiere a la inserción de una secuencia de ácido nucleico en una célula, mediante métodos que incluyen infección, transfección, transformación o transducción. 50
Una planta monocotiledónea (monocot) es una planta de flor que tiene embriones con un cotiledón u hoja de semilla, venas foliares paralelas y partes de flor en múltiplos de tres. Los ejemplos de monocotiledóneas incluyen, pero sin limitación, césped, maíz, arroz, avena, trigo, cebada, sorgo, orquídea, iris, lirio, cebolla y palmera.
55
Los nematodos, o lombrices, son uno de los phylums de animales más comunes, con más de 20.000 especies diferentes descritas (más de 15.000 son parasíticas. Son ubicuos en ambientes de agua dulce, marinos y terrestres, donde generalmente superan en número a otros animales en cuando al recuento de individuos y de especies y se encuentran en localizaciones tan diversas como la Antártida y fosas oceánicas. Además, hay muchas formas parasíticas, incluyendo patógenos en la mayoría de plantas y animales. 60
Los métodos son aplicables a todos los nematodos que son susceptibles de silenciamiento génico mediante interferencia de ARN y que son capaces de internalizar ARN bicatenario a partir de su ambiente inmediato.
En una realización, el nematodo puede pertenecer a la familia de los Heteroderidae, que abarca los géneros 65 Heterodera y Globodera.
En realizaciones y métodos preferidos pero no limitantes el nematodo se selecciona del grupo que comprende, pero sin limitación: Meloidogyne spp. (por ejemplo, M. incognita, M. javanica, M. graminicola, M. arenaria, M. chitwoodi, M. hapla o M. paranaensis); Heterodera spp. (por ejemplo, H. oryzae, H. glycines, H. zeae o H. schachtii); Globodera spp. (por ejemplo, G. pallida o G. rostochiensis); Rotylenchulus spp. (por ejemplo, R. reniformis); Pratylenchus spp. (por ejemplo, P. coffeae, P. Zeae o P. goodeyi); Radopholus spp. (por ejemplo, R. similis); Hirschmaniella spp. (por 5 ejemplo, H. oryzae); Ancylostoma spp. (por ejemplo, A. caninum, A. ceylanicum, A. duodenale o A. tubaeforme); Anisakid; Aphelenchoides spp. (por ejemplo, A. Besseyi); Ascarids; Ascaris spp., (por ejemplo, A. suum o A. lumbridoides); Belonolaimus spp.; Brugia spp. (por ejemplo, B. malayi o B. pahangi); Bursaphelenchus spp.; Caenorhabditis spp. (por ejemplo, C. elegans, C. briggsae o C. remanei); Clostridium spp. (por ejemplo, C. acetobutylicum); Cooperia spp. (por ejemplo, C. oncophora); Criconemoides spp.; Cyathostomum spp. (por ejemplo, 10 C. catinatum, C. coronatum o C. pateratum); Cylicocyclus spp. (por ejemplo, C. insigne, C. nassatus o C. radiatus); Cylicostephanus spp. (por ejemplo, C. goldi o C. longibursatus); Diphyllobothrium; Dirofilaria spp. (por ejemplo, D. immitis); Ditylenchus spp. (por ejemplo, D. dipsaci, D. destructor o D. Angustus); Enterobius spp. (por ejemplo, E. vermicularis); Haemonchus spp. (por ejemplo, H. contortus); Helicotylenchus spp.; Hoplolaimus spp.; Litomosoides spp. (por ejemplo, L. sigmodontis); Longidorus spp. (por ejemplo, L. macrosoma); Necator spp. (por ejemplo, N. 15 americanus); Nippostsongylus spp. (por ejemplo, N. brasiliensis) ; Onchocerca spp. (por ejemplo, O. volvulus); Ostertagia spp. (por ejemplo, O. ostertagi); Parastrongyloides spp. (por ejemplo, P. trichosuri); Paratrichodorus spp. (por ejemplo, P. minor o P. teres); Parelaphostrongylus spp. (por ejemplo, P. tenuis); Radophulus spp.; Scutellonerna. spp.; Strongyloides spp. (por ejemplo, S. Ratti o S. stercoralis); Teladorsagia spp. (por ejemplo, T. circurncincta); Toxascaris spp. (por ejemplo, T. leonina); Toxocara spp. (por ejemplo, T. canis o T. cati); Trichinella 20 spp. (por ejemplo, T. britovi, T. spiralis o T. spirae); Trichodorus spp. (por ejemplo, T. similis); richuris spp. (por ejemplo, T. muris, T. vulpis o T. trichiura); Tylenchulus spp.; Tylenchorhynchus spp.; Uncinaria spp. (por ejemplo, U. stenocephala); Wuchereria spp. (por ejemplo, W. bancrofti); Xiphinema spp. (por ejemplo, X. Index o X. americanum).
25
Los nematodos parasíticos de plantas causan grandes pérdidas de cosechas. Los géneros más comunes son: Aphelenchoides (nematodos foliares), Meloidogyne (nematodos del tallo radicular), Heterodera, Globodera (nematodos císticos) tales como el nematodo de la raíz de la patata, Nacobbus, Pratylenchus (nematodos lesionadores), Ditylenchus, Xiphinema, Longidorus, Trichodorus. Otros nematodos atacan a la corteza y a los árboles de bosques. El representante más importante de este grupo es Bursaphelenchus xylophilus, el nematodo de 30 la madera del pino, presente en Asia y América y recientemente descubierto en Europa.
Una célula normal se refiere a una célula de un fenotipo no transformado o que muestra una morfología de una célula no transformada del tipo de tejido que se está examinando.
35
Unido operativamente significa combinar dos o más moléculas de tal modo que en combinación funcionan adecuadamente en una célula de planta. Por ejemplo, un promotor se une operativamente a un gen estructural cuando el promotor controla la transcripción del gen estructural.
Los ortólogos son genes que están relacionados por descendencia vertical de un ancestro común y codifican 40 proteínas con la misma función en especies diferentes. Debido a su separación después de un suceso de especiación, los ortólogos pueden divergir, pero normalmente tienen similitudes a niveles de secuencia y de estructura. Dos genes que se derivan de un ancestro común y codifican proteínas con función similar se citan como ortólogos. La identificación de ortólogos es crítica para hacer predicciones fiables de la función génica en genomas recién secuenciados. 45
Plaga o plaga diana incluye, pero sin limitación, insectos, arácnidos, crustáceos, hongos, bacterias, virus, nematodos, platelmintos, lombrices, oxiuros, anquilosomas, tenias, tripanosomas, esquistosomas, moscardones, pulgas, garrapatas, ácaros y piojos que son parasíticos en el ambiente humano y perjudican a las plantas. Una plaga puede ingerir o entrar en contacto con una o más células, tejidos, o productos producidos por una planta 50 transformada con un agente de supresión génica bicatenario.
Un pesticida se refiere a cualquier sustancia o mezcla de sustancias pensadas para prevenir, destruir, repeler o mitigar cualquier plaga. Un pesticida puede ser una sustancia química o un agente biológico, tal como una planta transgénica, usada contra plagas incluyendo insectos, patógenos de plantas, malas hierbas, nematodos y microbios 55 que compiten con los humanos por la comida, destruyen la propiedad, esparcen enfermedades o son una molestia.
El fenotipo es un rasgo o característica distintiva de una planta, que puede alterarse integrando uno o más "polinucleótidos deseados" y/o marcadores de selección/exploración en el genoma de al menos una célula de planta de una planta transformada. Los "polinucleótidos deseados" y/o marcadores pueden conferir un cambio en el 60 fenotipo de una planta transformada, modificando una cualquiera de una serie de características o propiedades genéticas, moleculares, bioquímicas, fisiológicas, morfológicas o agronómicas de la célula vegetal o planta transformada en su conjunto. Por lo tanto, la expresión de uno o más polinucleótidos deseados integrados de manera estable en el genoma de una planta puede producir un fenotipo seleccionado del grupo que consiste en, pero sin limitación, tolerancia aumentada a enfermedades, tolerancia aumentada a insectos, tolerancia aumentada a 65 la sequía, tolerancia mejorada al frío y a las heladas, vigor mejorado, color mejorado, salud y características
nutricionales mejoradas, almacenamiento mejorado, rendimiento mejorado, tolerancia aumentada a la sal, tolerancia aumentada a metales pesados, tolerancia aumentada al estrés por agua, dulzor aumentado, vigor mejorado, sabor mejorado, textura mejorada, contenido en fosfato disminuido, germinación mejorada, captación mejorada de micronutrientes, composición de almidón mejorada y mayor longevidad de las flores.
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Tejido vegetal: una "planta" es cualquiera de los diversos organismos fotosintéticos, eucariotas y multicelulares del reino Plantae que de manera característica producen embriones, contienen cloroplastos y tienen paredes celulares de celulosa. Una parte de una planta, es decir, un "tejido de planta" puede tratarse de acuerdo con los métodos de la presente divulgación para producir una planta transgénica. Pueden transformarse muchos tejidos de plantas e incluyen, pero sin limitación, embriones somáticos, polen, hojas, tallos, callos, estolones, microtubérculos y brotes. 10 Por lo tanto, la presente divulgación prevé la transformación de plantas angiospermas y gimnospermas tales como acacia, alfalfa, manzana, albaricoque, alcachofa, fresno, espárrago, aguacate, banana, cebada, judía, remolacha, abedul, haya, mora, arándano, brécol, coles de Bruselas, repollo, colza, cantalupo, zanahoria, mandioca, coliflor, cedro, un cereal, apio, castaña, cereza, col china, cítricos, clementinas, trébol, café, maíz, algodón, caupí, pepino, ciprés, berenjena, olmo, endivia, eucalipto, hinojo, higos, abeto, geranio, uva, pomelo, cacahuete, cereza de suelo, 15 cicuta, nogal americano, con rizada, kiwi, colinabo, alerce, lechuga, puerro, limón, lima, algarroba, pino, culantrillo, maíz, mango, arce, melón, mijo, champiñón, mostaza, nuez, roble, avena, okra, cebolla naranja, una planta, flor o árbol ornamental, papaya, palma, perejil, chirivía, guisante, melocotón, cacahuete, pera, turba, pimiento, caqui, guandul, pino, piña, plátano, ciruela, granada, patata, calabaza, achicoria, rábano, colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, sauce, soja, espinaca, pícea, calabaza, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, batata, maíz 20 dulce, mandarina, té, tabaco, tomate, árboles, tritical, céspedes, nabo, una vid, nogal, berro, sandía, trigo, batata, tejo y calabacín.
De acuerdo con la presente divulgación, un "tejido de planta" también abarca células vegetales. Las células vegetales incluyen cultivos en suspensión, callos, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, 25 brotes, gametofitos, esporofitos, polen, semillas y microesporas. Los tejidos de plantas pueden estar en varios estados de madurez y pueden crecerse en cultivo líquido o sólido, o en suelo o medio adecuado en macetas, invernaderos o campos. Un tejido de planta también se refiere a cualquier clon de dicha planta, semilla, descendencia, propágulo ya se genere sexual o asexualmente y los descendientes de cualquiera de estos, tales como esquejes o semillas. 30
Transformación de plantas y cultivo celular: se refiere generalmente al proceso mediante el cual las células vegetales se modifican genéticamente y se transfieren a un medio de cultivo de plantas adecuado para su mantenimiento, crecimiento posterior y/o desarrollo posterior. Dichos métodos se conocen bien por los expertos en la materia. 35
Progenie: una "progenie", tal como la progenie de una planta transgénica, es una que nace de, se engendra por, o se deriva de una planta o de la planta transgénica. Por lo tanto, una planta de "progenie", es decir, una planta de generación "F1" es la descendencia o un descendiente de la planta transgénica producida mediante los métodos de la invención. Una progenie de una planta transgénica puede contener en al menos uno, algunos, o todos sus 40 genomas celulares el polinucleótido deseado que se integró en una célula de la planta transgénica parental mediante los métodos descritos en el presente documento. Por lo tanto, el polinucleótido deseado se "transmite" o "hereda" por la planta de progenie. El polinucleótido deseado que se hereda de este modo en la planta de progenie puede residir en una construcción de ADN-T, que también se hereda por la planta de progenie a partir de su progenitor. El término "progenie", tal como se usa en el presente documento, puede considerarse también como los 45 vástagos o descendientes de un grupo de plantas.
Promotor: promotor pretende significar un ácido nucleico, preferentemente ADN que se une a ARN polimerasa y/o a otros elementos reguladores de la transcripción. Como con cualquier promotor, los promotores facilitarán o controlarán la transcripción del ADN o ARN para generar una molécula de ARNm a partir de una molécula de ácido 50 nucleico que está unida operativamente al promotor. Tal como se ha afirmado anteriormente, el ARN generado puede codificar una proteína o polipéptido o puede codificar un ARN de interferencia, o una molécula antisentido.
un promotor de planta es un promotor capaz de iniciar la transcripción en células vegetales independientemente de si su origen es una célula vegetal o no. Los promotores de plantas ejemplares incluyen, pero sin limitación, aquellos 55 que se obtienen de plantas, virus de plantas y bacterias, tales como Agrobacterium o Rhizobium que comprenden genes expresados en células vegetales. Los ejemplos de promotores bajo el control de desarrollo incluyen promotores que inician la transcripción preferencialmente en determinados tejidos, tales como e xilema, hojas, raíces, o semillas. Dichos promotores se citan como promotores preferidos de tejido. Los promotores que inician la transcripción solo en determinados tejidos se citan como promotores específicos de tejido. Un promotor 60 específico de tipo celular dirige principalmente la expresión en determinados tipos celulares en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares en las raíces u hojas, por ejemplo, un promotor específico de raíz. Un promotor inducible o represible es un promotor que está bajo control ambiental. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar a la transcripción mediante promotores inducibles incluyen condiciones anaerobias o la presencia de luz. Los promotores específicos de tejido, preferidos de tejido, específicos de tipo celular e 65 inducibles forman parte de los promotores no constitutivos. Un promotor constitutivo es un promotor que está
activo en la mayoría de condiciones ambientales y en la mayoría de las partes de plantas.
Un polinucleótido es una secuencia nucleotídica que comprende una secuencia génica codificante o un fragmento de la misma, un promotor, un intrón, una región potenciadora, un sitio de poliadenilación, un sitio de inicio de la traducción, regiones 5' o 3' no traducidas, un gen indicador, un marcador de selección o similares. El polinucleótido 5 puede comprender ADN o ARN monocatenario o bicatenario. El polinucleótido puede comprender bases modificadas o una estructura modificada. El polinucleótido puede ser genómico, un transcrito de ARN (tal como ARNm) o una secuencia nucleotídica procesada (tal como un ADNc). El polinucleótido puede comprender una secuencia en orientación sentido o antisentido.
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Un polinucleótido aislado es una secuencia polinucleotídica que no está en su estado nativo, por ejemplo, el polinucleótido está compuesto de una secuencia nucleotídica no encontrada en la naturaleza o el polinucleótido está separado de secuencias nucleotídicas con las que está típicamente en proximidad o está próximo a secuencias nucleotídicas con las que típicamente no está en proximidad.
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Una secuencia nucleotídica recombinante se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene una modificación diseñada por ingeniería genética mediante manipulación por mutagénesis, enzimas de restricción y similares.
Interferencia de ARN (ARNi) se refiere a la supresión específica de secuencia o específica de gen de la expresión 20 génica (síntesis de proteínas) que está mediada por ARN pequeño interferente (ARNpi).
Semilla: una "semilla" puede considerarse un óvulo de planta maduro que contiene un embrión y una parte propagadora de una planta, tal como un tubérculo o espora. Una semilla puede incubarse antes de la transformación mediada por microorganismos, en la oscuridad, por ejemplo, para facilitar la germinación. La semilla también puede 25 esterilizarse antes de la incubación, tal como mediante un breve tratamiento con lejía. La plántula resultante puede exponerse posteriormente a una bacteria deseada para su transformación.
Marcador de selección/exploración: un gen que, en caso de expresarse en plantas o tejidos de plantas, hace posible distinguirlos de otras plantas o tejidos de plantas que no expresan ese gen. Los procedimientos de 30 exploración pueden requerir ensayos para la expresión de proteínas codificadas por el gen marcador de exploración. Los ejemplos de marcadores de selección incluyen el gen de neomicina fosfotransferasa (NPTII) que codifica la resistencia a kanamicina y geneticina, el gen higromicina fosfotransferasa (HPT o APHIV) que codifica la resistencia a higromicina, u otros genes similares conocidos en la técnica.
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Identidad de secuencia: tal como se usa en el presente documento, la "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico incluye referencia a los restos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para máxima correspondencia a lo largo de una región específica. En los casos donde las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren en dichas 40 sustituciones conservativas tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para hacer este ajuste se conocen bien por los expertos en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, el porcentaje de identidad de secuencia significa el valor determinado al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de una ventana de comparación, en el que la 45 porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico idéntica en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de 50 comparación y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia.
La "identidad de secuencia" tiene un significado reconocido en la técnica y puede calcularse usando técnicas publicadas. Véase COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, ed. (Oxford University Press, 1988), BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, ed. (Academic Press, 1993), COMPUTER 55 ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PARTE I, Griffin y Griffin, eds., (Humana Press, 1994), SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, Von Heinje ed., Academic Press (1987), SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov y Devereux, eds. (Macmillan Stockton Press, 1991) y Carillo y Lipton, SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (1988). Los métodos empleados comúnmente para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, aquellos divulgados en GUIDE To HUGE COMPUTERS, Bishop, ed., (Academic Press, 1994) y Carillo y 60 Lipton, anteriormente citado. Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas informáticos. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, al paquete informático GCG (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTN, FASTA (Atschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)) y FASTDB (Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6: 237 (1990)). 65
Los ARN de horquilla corta (ARNhc) son ARN monocatenarios que tienen un alto grado de estructura secundaria, de tal forma que una porción de la hebra de ARN forma un bucle de horquilla.
ARN pequeño interferente (ARNpi) se refiere a moléculas de ARN bicatenario de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud que se nombran por su capacidad para interferir de manera específica 5 con la expresión génica de proteínas.
Una secuencia diana se refiere a una secuencia nucleotídica en una plaga que se selecciona para su supresión o inhibición mediante tecnología de ARN bicatenario. Una secuencia diana codifica una característica o actividad biológica esencial en una plaga. 10
Terminadores transcripcionales: Las construcciones de expresión de ADN tienen típicamente una región de terminación transcripcional en el extremo opuesto de la región reguladora del inicio de la transcripción. La región de terminación puede seleccionarse para estabilidad del ARNm para potenciar la expresión y/o para la adición de colas de poliadenilación añadidas al producto de transcripción génica. La traducción de un nuevo polipéptido sufre 15 terminación cuando cualquiera de los tres codones de terminación de cadena entran en el sitio A en el ribosoma. Los codones de terminación de la traducción son UAA, UAG y UGA.
ADN transferente (ADN-T): un ADN-T bacteriano es un elemento genético que se conoce como un elemento capaz de integrar una secuencia nucleotídica contenida en sus límites en otro genoma. A este respecto, un ADN-T está 20 flanqueado, típicamente, por dos secuencias "límite". Un polinucleótido deseado de la presente invención y un marcador de selección pueden posicionarse entre la secuencia similar al límite izquierdo y la secuencia similar al límite derecho de un ADN-T. El polinucleótido deseado y el marcador de selección contenido en el ADN-T pueden estar unidos operativamente a una diversidad de ácidos nucleicos diferentes, específicos de plantas (es decir, nativos), o exógenos, como elementos reguladores de promotor y terminador que facilitan su expresión, es decir, la 25 transcripción y/o traducción de la secuencia de ADN codificada por el polinucleótido o marcador de selección deseado.
Transformación de células vegetales: Un proceso mediante el cual se inserta de manera estable un ácido nucleico en el genoma de una célula vegetal. La transformación puede suceder en condiciones naturales o 30 artificiales usando diversos métodos bien conocidos en la técnica. La transformación puede basarse en cualquier método conocido para la inserción de secuencias de ácido nucleico en una célula hospedadora procariota o eucariota, incluyendo protocolos de transformación mediados por Agrobacterium, tales como la "transformación refinada" o la "cultivo preciso", infección viral, bigotes, electroporación, microinyección, tratamiento con polietilenglicol, choque térmico, lipofección y bombardeo con micropartículas. 35
Planta transgénica: una planta transgénica es una que comprende al menos un genoma celular en el que se ha integrado de manera estable un ácido nucleico exógeno. Una planta transgénica es una planta que solo comprende una célula modificada genéticamente y genoma celular, o es una planta que contiene algunas células modificadas genéticamente, o es una planta en la que todas las células están modificadas genéticamente. Una planta 40 transgénica puede ser una que comprende la expresión del polinucleótido deseado, es decir, el ácido nucleico exógeno, en solo determinadas partes de la planta. Por lo tanto, una planta transgénica puede solo contener células modificadas genéticamente en determinadas partes de su estructura.
Variante: una "variante", tal como se usa en el presente documento, pretende indicar una secuencia nucleotídica 45 que se desvía de la secuencia nucleotídica estándar o dada de un gen particular. Los términos "isoforma", "isotipo" y "análogo" también se refieren a formas "variantes" de una secuencia nucleotídica. Una secuencia nucleotídica que se altera mediante la adición, eliminación o sustitución de uno o más nucleótidos puede considerarse una secuencia "variante". Una "variante" también puede referirse a un "gen reordenado", tal como aquellos descritos en las patentes asignadas a Maxygen. 50
Se entiende que la presente divulgación no está limitada a la metodología particular, protocolos, vectores y reactivos, etc., descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento solo se usa con el fin de describir realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente divulgación. Cabe destacar que tal como se usa en el presente documento 55 y en las reivindicaciones adjuntas, las formas del singular "un", "una" y "el" o "la" incluyen referencia en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a "un gen" es una referencia a uno o más genes e incluye equivalentes de los mismos conocidos para los expertos en la materia.
I. Plagas diana 60
La presente divulgación proporciona metodologías y construcciones para controlar las infestaciones por plagas de insectos administrando a una plaga una secuencia codificante diana que suprime o inhibe de manera post-transcripcional una función biológica requerida en la plaga. Tal como se usa en el presente documento, el término "plaga" se refiere a insectos, arácnidos, crustáceos, hongos, bacterias, virus, nematodos, platelmintos, lombrices, 65 oxiuros, anquilosomas, tenias, tripanosomas, esquistosomas, moscardones, pulgas, garrapatas, ácaros y piojos y
similares que son parasíticos en seres humanos, animales y plantas. Una plaga puede ingerir o entrar en contacto con una o más células, tejidos, o productos producidos por una planta transformada con un agente de supresión génica bicatenario.
Un rasgo de "resistencia a plagas" es una característica de una planta transgénica hospedadora que hace que la 5 planta sea resistente al ataque de una plaga que típicamente es capaz de infligir daño o pérdida a la planta. Dicha resistencia a plagas puede surgir de una mutación natural o más típicamente de la incorporación de ADN recombinante que confiere resistencia a plagas. Para conferir resistencia a insectos a una planta transgénica, un ADN recombinante puede, por ejemplo, transcribirse en una molécula de ARN que forma una molécula de ARNbc en los tejidos o fluidos de la planta recombinante. La molécula de ARNbc está compuesta en parte de un segmento de 10 ARN que es idéntico a un segmento correspondiente de ARN codificado a partir de una secuencia de ADN en un insecto de la plaga que prefiere alimentarse de la planta recombinante. La expresión del gen en el insecto de plaga diana se suprime por el ARNbc y la supresión de la expresión del gen en el insecto de plaga diana da como resultado que la planta sea resistente al insecto.
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Las plagas adecuadas incluyen cualquier herbívoro que cause daño a una planta o a una porción de la misma. La divulgación contempla plagas de insectos, nematodos y hongos en particular.
Las plagas de insectos son de particular interés e incluyen, pero sin limitación:
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del orden Lepidoptera, por ejemplo, Acleris spp., Adoxophyes spp., Aegeria spp., Agrotis spp., Alabama argillaceae, Amylois spp., Anticarsia gemmatalis, Archips spp, Argyrotaenia spp., Autographa spp., Busseola fusca, Cadra cautella, Carposina nipponensis, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocrocis spp., Cnephasia spp., Cochylis spp., Coleophora spp., Crocidolomia binotalis, Cryptophlebia leucotreta, Cydia spp., Diatraea spp., Diparopsis castanea, Earias spp., Ephestia spp., Eucosma spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., 25 Grapholita spp., Hedya nubiferana, Heliothis spp., Hellula undalis, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Leucoptera scitella, Lithocollethis spp., Lobesia botrana, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosoma spp., Mamestra brassicae, Manduca sexta, Operophtera spp., Ostrinia Nubilalis, Pammene spp., Pandemics spp., Panolis flammea, Pectinophora gossypiella, Phthorimaea operculella, Pieris rapae, Pieris spp., Plutella xylostella, Prays spp., Scirpophaga spp., Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp., Synanthedon spp., Thaumetopoea spp., 30 Tortrix spp., Trichoplusia ni y Yponomeuta spp.; del orden Coleoptera, por ejemplo, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. y Trogoderma spp.; del orden Orthoptera, por ejemplo, Blatta spp., Blattella spp., 35 Gryllotalpa spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Periplaneta ssp. y Schistocerca spp.; del orden Isoptera, por ejemplo, Reticulitemes ssp; del orden Psocoptera, por ejemplo, Liposcelis spp.; del orden Anoplura, por ejemplo, Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Pemphigus spp. y Phylloxera spp.; del orden Mallophaga, por ejemplo, Damalinea spp. y Trichodectes spp.; del orden Thysanoptera, por ejemplo, Franklinella spp., Hercinothrips spp., Taeniothrips spp., Thrips palmi, Thrips tabaci y Scirtothrips aurantii; del orden Heteroptera, por ejemplo, Cimex 40 spp., Distantiella theobroma, Dysdercus spp., Euchistus spp., Eurygaster spp., Leptocorisa spp., Nezara spp., Piesma spp., Rhodnius spp., Sahlbergella singularis, Scotinophara spp., Triatoma spp., familia Miridae spp. tales como Lygus hesperus y Lygus lineoloris, familia Lygaeidae spp. tales como Blissus leucopterus y familia Pentatomidae spp.; del orden Homoptera, por ejemplo, Aleurothrixus floccosus, Aleyrodes brassicae, Aonidiella spp., Aphididae, Aphis spp., Aspidiotus spp., Bemisia tabaci, Ceroplaster spp., Chrysomphalus aonidium, Chrysomphalus 45 dictyospermi, Coccus hesperidum, Empoasca spp., Eriosoma larigerum, Erythroneura spp., Gascardia spp., Laodelphax spp., Lacanium corni, Lepidosaphes spp., Macrosiphus spp., Myzus spp., Nehotettix spp., Nilaparvata spp., Paratoria spp., Pemphigus spp., Planococcus spp., Pseudaulacaspis spp., Pseudococcus spp., Psylla ssp., Pulvinaria aethiopica, Quadraspidiotus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp.., Scaphoideus spp., Schizaphis spp., Sitobion spp., Trialeurodes vaporariorum, Trioza erytreae y Unaspis citri; del orden Hymenoptera, por ejemplo, 50 Acromyrmex, Atta spp., Cephus spp., Diprion spp., Diprionidae, Gilpinia polytoma, Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Neodiprion spp, Solenopsis spp. y Vespa ssp.; del orden Diptera, por ejemplo, Aedes spp., Antherigona soccata, Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Ceratitis spp., Chrysomyia spp., Culex spp., Cuterebra spp., Dacus spp., Drosophila melanogaster, Fannia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Hypoderma spp., Hyppobosca spp., Liriomysa spp., Lucilia spp., Melanagromyza spp., Musca ssp., Oestrus spp., Orseolia spp., 55 Oscinella frit, Pegomyia hyoscyami, Phorbia spp., Rhagoletis pomonella, Sciara spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp. y Tipula spp., del orden Siphonaptera, por ejemplo, Ceratophyllus spp. y Xenopsylla cheopis y del orden Thysanura, por ejemplo, Lepisma saccharina.
Las plagas de nematodos de interés particular incluyen, por ejemplo, A. caninum, A. ceylanciurn, H. contortus, O. 60 ostertagi, C. elegans, C. briggsae, P. pacificus, S. stercoralis, S. ratti, P. trichosuri, M. arenaria, M. chitwoodi, M. hapla, M. incognita, M. javanica, M. paraensis, G. rostochiensis, G. pallida, H. glycines, H. schattii, P. penetrans, P. vulnus, R. similis, Z. punctata, A. suum, T. canis, B. malayi, D. immitis, O. volvulus, T. vulpis, T. spiralis, X. index. A. duodenale, A. lumbricoides, así como especies de los siguientes géneros: Aphelenchoides, Nacobbus, Ditylenchus, Longidorus, Trichodorus y Bursaphelenchus. 65
Las plagas fúngicas de interés particular incluyen, pero sin limitación Acremoniella spp., Alternaria spp. (por ejemplo Alternaria brassicola o Alternaria solani), Ascochyta spp. (por ejemplo, Ascochyta pisi), Botrytis spp. (por ejemplo, Botrytis cinerea o Botryotinia fuckeliana), Cladosporium spp., Cercospora spp. (por ejemplo, Cercospora kikuchii o Cercospora zaea-maydis), Cladosporium spp. (por ejemplo Cladosporium fulvum), Colletotrichum spp. (por ejemplo Colletotrichum lindemuthianum), Curvularia spp., Diplodia spp. (por ejemplo, Diplodia maydis), Erysiphe spp. (por 5 ejemplo Erysiphe graminis f. sp. graminis, Erysiphe graminis f.sp. hordei o Erysiphe pisi), Erwinia armylovora, Fusarium spp. (por ejemplo Fusarium nivale, Fusarium sporotrichioides, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Fusarium germinearum, Fusarium culmorum, Fusarium solani, Fusarium moniliforme o Fusarium roseum), Gaeumanomyces spp. (por ejemplo Gaeumanomyces graminis f.sp. tritici), Gibberella spp. (por ejemplo Gibberella zeae), Helminthosporium spp. (por ejemplo Helminthosporium turcicum, Helminthosporium carbonum, 10 Helminthosporiurn mavdis o Helminthosporium sigmoideum), Leptosphaeria salvinii, Macrophomina spp. (por ejemplo Macrophomina phaseolina), Magnaportha spp. (por ejemplo Magnaporthe oryzae), Mycosphaerella spp., Nectria spp. (por ejemplo, Nectria heamatococca), Peronospora spp. (por ejemplo Peronospora manshurica o Peronospora tabacina), Phoma spp. (por ejemplo Phoma betae), Phakopsora spp. (por ejemplo Phakopsora pachyrhizi), Phymatotrichum spp. (por ejemplo Phymatotrichum omnivorum), Phytophthora spp. (por ejemplo 15 Phytophthora cinnamomi, Phytophthora cactorum, Phytophthora phaseoli, Phytophthora parasitica, Phytophthora citrophthora, Phytophthora megasperma f.sp. soiae o Phytophthora infestans), Plasmopara spp. (por ejemplo Plasmopara viticola), Podosphaera spp. (por ejemplo Podosphaera leucotricha), Puccinia spp. (por ejemplo Puccinia sorghi, Puccinia striiformis, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia asparagi, Puccinia recondita o Puccinia arachidis), Pythium spp. (por ejemplo Pythium aphanidermatum), Pyrenophora spp. (por ejemplo Pyrenophora tritici-repentens o 20 Pyrenophora teres), Pyricularia spp. (por ejemplo Pyricularia oryzae), Pythium spp. (por ejemplo Pythium ultimum), Rhincosporium secalis, Rhizoctonia spp. (por ejemplo Rhizoctonia solani, Rhizoctonia oryzae o Rhizoctonia cerealis), Rhizopus spp. (por ejemplo Rhizopus chinensid), Scerotium spp. (por ejemplo Scerotium rolfsii), Sclerotinia spp. (por ejemplo Sclerotinia sclerotiorum), Septoria spp. (por ejemplo Septoria lycopersici, Septoria glycines, Septoria nodorum o Septoria tritici), Thielaviopsis spp. (por ejemplo Thielaviopsis basicola), Tilletia spp., Trichoderma spp. 25 (por ejemplo Trichoderma virde), Uncinula spp. (por ejemplo Uncinula necator), Ustilago maydis (por ejemplo tizón del maíz), Venturia spp. (por ejemplo, Venturia inaequalis o Venturia pirina) o Verticillium spp. (por ejemplo, Verticillium dahliae o Verticillium albo-atrum);
II. Identificación de secuencias diana 30
La presente divulgación proporciona un método para identificar y obtener un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica para producir un ARNbc o un ARNpi. Por ejemplo, dicho método comprende: (a) sondar un ADNc o una biblioteca de ADN genómico con una sonda de hibridación que comprende la totalidad o una porción de una secuencia nucleotídica o un homólogo de la misma a partir de un insecto usado como diana; (b) identificar un 35 clon de ADN que hibrida con la sonda de hibridación; (c) aislar el clon de ADN identificado en la etapa (b); y (d) secuenciar el ADNc o el fragmento de ADN genómico que comprende el clon aislado en la etapa (c) en el que la molécula de ácido nucleico secuenciada transcribe la totalidad o una porción sustancial de la secuencia del nucleótido de ARN o un homólogo del mismo.
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Adicionalmente, la presente divulgación contempla un método para obtener un fragmento de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica para producir una porción sustancial de un ARNbc o un ARNpi que comprende: (a) sintetizar el primer y el segundo cebador oligonucleotídico correspondiente a una porción de una de las secuencias nucleotídicas de una plaga usada como diana; y (b) amplificar un molde de ADNc o de ADN genómico en un vector de clonación usando el primer y el segundo cebador oligonucleotídico de la etapa (a) en el 45 que la molécula de ácido nucleico amplificada transcribe una porción sustancial de un ARNbc o ARNpi.
En la puesta en práctica de la presente divulgación, un gen diana puede derivarse de cualquier plaga que cause daño a plantas de cultivo y las consiguientes pérdidas de rendimiento. Pueden emplearse varios criterios para la selección de los genes diana preferidos. El gen es uno cuyo producto proteico tiene una rápida velocidad de 50 renovación, de tal forma que la inhibición del ARNbc dará como resultado una rápida disminución de los niveles de proteína. En determinadas realizaciones, es ventajoso seleccionar un gen para el que una pequeña pérdida en el nivel de expresión da como resultado efectos perjudiciales para la plaga receptora. Si se desea usar como diana una amplia variedad de especies de insectos, por ejemplo, se selecciona un gen que esté elevadamente conservado entre estas especies. Por el contrario, con el fin de conferir especificidad, en determinadas realizaciones, se 55 selecciona un gen que contiene regiones que están poco conservadas entre especies individuales de insectos, o entre insectos y otros organismos. En determinadas realizaciones, puede ser deseable seleccionar un gen que no tiene homólogos conocidos en otros organismos.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "derivado de" se refiere a una secuencia nucleotídica 60 específica que puede obtenerse a partir de una fuente o especie particular específica, aunque no necesariamente directamente de esa fuente o especie específica.
En una realización, se selecciona un gen que se expresa en el intestino del insecto. Los genes diana expresados en el intestino evitan la necesidad de que el ARNbc se extienda por el insecto. Los genes diana pueden incluir, por 65 ejemplo, aquellos que comparten homologías sustanciales con las secuencias nucleotídicas de genes conocidos que
se expresan en el intestino que codifican componentes proteicos de la V-ATPasa de protones de membrana plasmática (Dow et al., 1997, Dow, 1999), por ejemplo, la subunidad B o E de V-ATPasa. Este complejo de proteínas es la única fuente de energía del transporte de iones epitelial y es responsable de la alcalinización del lumen del intestino medio. La V-ATPasa también se expresa en el túbulo de Malpighi, un sobrecrecimiento de intestino posterior del insecto que funciona en equilibrio fluido y en la detoxificación de compuestos exógenos de un modo 5 análogo a un órgano de riñón de un mamífero.
En otra realización, se selecciona un gen que está esencialmente implicado en el crecimiento, desarrollo y reproducción de un insecto. Los genes ejemplares incluyen, pero sin limitación, las subunidades estructurales de proteínas ribosomales y un gen de coatómero beta, el gen CHD3. Las proteínas ribosomales, tales como S4 (RpS4) 10 y S9 (RpS9) son constituyentes estructurales del ribosoma implicados en la biosíntesis de proteínas y que son componentes de la subunidad pequeña ribosómica citosólica, las proteínas ribosómicas, tales como L9 y L19 son constituyentes estructurales del ribosoma implicados en la biosíntesis de proteínas que se localiza en el ribosoma. El gen de coatómero beta en C. elegans codifica una proteína que es una subunidad de un complejo multimérico que forma un revestimiento de vesícula de membrana. Se han descubierto secuencias similares en diversos organismos, 15 tales como Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster y Saccharomyces cerevisiae. Se encuentran secuencias relacionadas en diversos organismos, tales como Leptinotarsa decemlineata, Phaedon cochleariae, Epilachna varivetis, Anthonomus grandis, Tribolium castaneum, Myzus persicae, Nilaparvata lugens, Chilo suppressalis, Plutella xylostella y Acheta domesticus. Otras dianas génicas pueden incluir, por ejemplo, aquellas que juegan papeles importantes en la viabilidad, crecimiento, desarrollo, reproducción e infectividad. Estos genes diana 20 incluyen, por ejemplo, genes constitutivos, factores de transcripción y genes específicos de insecto o mutaciones knockout letales en Caenorhabditis o Drosophila. Los genes diana también pueden ser aquellos que son de otros organismos, por ejemplo, de un nematodo (por ejemplo, Meloidogyne spp. o Heterodera spp.), otros insectos o arácnidos (por ejemplo, Leptinotarsa spp., Phaedon spp., Epilachna spp., Anthonomus spp., Tribolium spp., Myzus spp., Nilaparvata spp., Chilo spp., Plutella spp., o Acheta spp. Además, la secuencia nucleotídica para su uso como 25 secuencia diana también puede derivarse de genes virales, bacterianos, fúngicos, o de insecto cuyas funciones se han establecido a través de la bibliografía y cuyas secuencias de nucleótidos comparten una similitud sustancial con los genes diana en el genoma de un insecto.
Para muchos de los insectos que son dianas potenciales para su control, puede haber información limitada referente 30 a las secuencias de la mayoría de genes o del fenotipo resultante de la mutación de genes particulares. Por tanto, pueden seleccionarse genes basándose en la información disponible referente a genes correspondientes en un organismo modelo, tal como Caenorhabditis o Drosophila, o en otras especies de insectos. También pueden seleccionarse genes basándose en la información de secuencias disponible para otras especies, tales como especies de nematodos o fúngicas, en las que se han caracterizado los genes. En algunos casos será posible 35 obtener la secuencia de un gen correspondiente a partir de un insecto diana efectuando búsquedas en bases de datos, tales como GenBank, usando bien el nombre del gen o la secuencia del gen. Una vez que se ha obtenido la secuencia, puede usarse la PCR para amplificar un segmento seleccionado de manera adecuada del gen en el insecto.
40
Para obtener un segmento de ADN a partir del gen correspondiente en una especie de insecto, por ejemplo, pueden diseñarse cebadores de PCR basándose en la secuencia tal como se encuentra en C. elegans o Drosophila, o un insecto a partir del cual ya se ha clonado el gen. Los cebadores se diseñan para amplificar un segmento de ADN de longitud suficiente. Las condiciones de amplificación se seleccionan de tal forma que sucederá la amplificación incluso si los cebadores no coinciden exactamente con la secuencia diana. Como alternativa, el gen, o una porción 45 del mismo, puede clonarse a partir de una biblioteca de ADN genómico o de ADNc preparada a partir de la especie de plaga de insecto, usando un gen de insecto conocido como sonda. Se conocen técnicas para llevar a cabo la PCR y la clonación a partir de bibliotecas. En los ejemplos se proporcionan detalles adicionales del proceso mediante el cual los segmentos de ADN procedentes de especies de plagas de insecto diana pueden aislarse basándose en la secuencia de genes clonados anteriormente a partir de una especie de insecto. Un experto en la 50 materia será consciente de que puede usarse una diversidad de técnicas para aislar segmentos génicos de especies de plagas de insectos que correspondan a genes previamente aislados de otras especies.
III. Métodos para inhibir o suprimir un gen diana
55
La presente divulgación proporciona métodos para inhibir la expresión génica de uno o múltiples genes diana en una plaga diana usando métodos de ARNbc. La divulgación es particularmente útil para la modulación de la expresión génica de eucariotas, en particular, la modulación de la expresión de genes presentes en plagas que muestran un nivel de pH del sistema digestivo que es de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 9,5, más preferentemente de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0 y aún más preferentemente de aproximadamente 6,5 a 60 aproximadamente 7,5. Para plagas de plantas con un sistema digestivo que muestra niveles de pH fuera de estos intervalos, pueden desearse el uso de métodos de administración que no requieran la ingestión de moléculas de ARNbc.
Los métodos abarcan proporcionar simultánea o secuencialmente dos o más construcciones de ARN bicatenario o 65 de ARN al mismo insecto, para lograr la regulación negativa o la inhibición de múltiples genes diana o para lograr
una inhibición más potente de un solo gen diana.
Como alternativa, se usan múltiples dianas proporcionando un ARN bicatenario que se dirige a múltiples secuencias diana y una sola diana se inhibe de manera más eficaz por la presencia de más de una copia del fragmento de ARN bicatenario correspondiente al gen diana. Por lo tanto, en una realización, la construcción de ARN bicatenario 5 comprende múltiples regiones de ARNbc, comprendiendo al menos una hebra de cada región de ARNbc una secuencia nucleotídica que es complementaria a al menos parte de una secuencia nucleotídica diana de un gen diana de insecto. Las regiones de ARNbc en la construcción de ARN pueden ser complementarias al mismo o a diferentes genes diana y/o las regiones de ARNbc pueden ser complementarias a dianas de la misma o diferentes especies de insectos. El uso de dichas construcciones de ARNbc en una célula vegetal hospedadora, por lo tanto, 10 confiere una resistencia más potente a una sola o a múltiples especies de insectos en la planta. En una realización, la región de ARN bicatenario comprende múltiples copias de la secuencia nucleotídica que es complementaria al gen diana. Como alternativa, el ARNbc se dirige a más de una secuencia diana del mismo gen diana. La divulgación por lo tanto abarca construcciones de ARN bicatenario aislado que comprenden al menos dos copias de dicha secuencia de nucleótidos complementarias a al menos parte de una secuencia nucleotídica de una diana de insecto. 15 Puede desarrollarse ARNbc que se dirige a más de una de las dianas anteriormente mencionadas, o una combinación de diferentes ARNbc contra dianas diferentes anteriormente mencionadas. Los nucleótidos de ARNbc y construcciones de ARNbc adecuadas se describen en el documento WO2006/046148.
Los términos "dirigir", "se dirige" y "dirección" son expresiones alternativas para indicar que al menos una de las 20 hebras del ARNbc es complementaria a y como tal puede unirse a, el gen o secuencia nucleotídica diana.
El efecto modulador del ARNbc es aplicable a una diversidad de genes expresados en las plagas, incluyendo, por ejemplo, genes endógenos responsables del metabolismo celular o de la transformación celular, incluyendo genes constitutivos, factores de transcripción y otros genes que codifican polipéptidos implicados en el metabolismo celular. 25
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "inhibición de la expresión génica" o "inhibir la expresión de una diana génica en la célula de una plaga" se refiere a la ausencia (o disminución observable) en el nivel de producto de proteína y/o ARNm del gen diana. La especificidad se refiere a la capacidad para inhibir el gen diana sin efectos manifiestos sobre otros genes de la célula y sin efectos sobre cualquier gen en la célula que esté 30 produciendo la molécula de ARNbc. La inhibición de la expresión génica del gen diana en la plaga de insecto puede dar como resultado nuevos rasgos fenotípicos en la plaga de insecto.
"Supresión génica" se refiere a cualquiera de los métodos bien conocidos para reducir los niveles de transcripción génica a ARNm y/o la posterior traducción del ARNm. La supresión génica también pretende indicar la reducción de 35 la expresión de proteínas a partir de un gen o una secuencia codificante, incluyendo la supresión génica postranscripcional y la supresión transcripcional. La supresión génica postranscripcional está mediada por la homología entre la totalidad o una parte de un ARNm transcrito a partir de un gen o secuencia génica usada como diana para su supresión y el ARN bicatenario correspondiente usado para la supresión y se refiere a la reducción sustancial y medible de la cantidad de ARNm disponible en la célula para unirse a los ribosomas. El ARN transcrito 40 puede estar en orientación con sentido para efectuar lo que se denomina co-supresión, en la orientación antisentido para efectuar lo que se denomina supresión antisentido, o en ambas orientaciones, produciendo un ARNbc lo que se denomina interferencia de ARN (ARNi).
La supresión transcripcional está mediada por la presencia en la célula de un agente de supresión génica de ARNbc 45 que muestra una identidad de secuencia sustancial con una secuencia de ADN promotora o con el complemento de la misma para efectuar lo que se denomina una trans supresión de promotor. La supresión génica puede ser eficaz contra un gen de planta nativo asociado a un rasgo, por ejemplo, para proporcionar plantas con niveles reducidos de una proteína codificada por el gen nativo o con niveles potenciados o reducidos de un metabolito afectado. La supresión génica también puede ser eficaz contra genes diana en plagas de plantas que pueden ingerir o estar en 50 contacto con material vegetal que contiene agentes de supresión génica, específicamente diseñados para inhibir o suprimir la expresión de una o más secuencias homólogas o complementarias en la célula de la plaga. La supresión génica postraduccional mediante ARN orientado en la dirección antisentido o con sentido para regular la expresión génica en células vegetales se divulga en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.107.065, 5.759.829, 5.283.184 y 5.231.020. El uso de ARNbc para suprimir genes en plantas se divulga en los documentos WO 99/53050, WO 55 99/49029, en las publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos Nº 2003/0175965 y 2003/0061626, en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2004/0029283 y en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.506.559 y 6.326.193.
Un método beneficioso para la supresión génica postranscripcional en plantas emplea ARN transcrito tanto en 60 orientación con sentido como con orientación antisentido que está estabilizado, por ejemplo, como una estructura en horquilla y de tallo y bucle. Una construcción de ADN preferida para efectuar la supresión génica postranscripcional es una en la que un primer segmento codifica un ARN que muestra una orientación antisentido que muestra una identidad sustancial con un segmento de un gen usado como diana para supresión, que está unido a un segundo segmento en orientación con sentido que codifica un ARN que muestra una complementariedad sustancial con el 65 primer segmento. Dicha construcción forma una estructura de tallo y bucle mediante la hibridación del primer
segmento con el segundo segmento y se forma una estructura de tallo y bucle a partir de las secuencias nucleotídicas que unen a los dos segmentos (véanse los documentos WO94/01550, WO98/05770, US 2002/0048814 y US 2003/0018993).
De acuerdo con una realización de la presente divulgación, se proporciona una secuencia nucleotídica para la que la 5 expresión in vitro da como resultado la transcripción de una secuencia de ARNbc que es sustancialmente homóloga a una molécula de ARN de un gen diana en una plaga que comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia nucleotídica del genoma de la plaga. Por lo tanto, después de que la plaga ingiera, o de otro modo capte la secuencia de ARNbc incorporada en una dieta o rociada sobre una superficie vegetal, se efectúa una regulación negativa de la secuencia nucleotídica diana correspondiente al gen diana en las células de una plaga diana. 10
La inhibición de un gen diana usando la tecnología de ARNbc es específica de secuencia en tanto que las secuencias nucleotídicas correspondientes a la región dúplex del ARN son dianas para inhibición genética. Se prefiere ARN que contiene secuencias nucleotídicas idénticas a una porción del gen diana. Se ha descubierto que las secuencias de ARN con inserciones, eliminaciones y mutaciones puntuales en relación a la secuencia diana 15 también son efectivas para la inhibición. Se prefiere que el ARNbc inhibidor y la porción del gen diana compartan al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia, o aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia, o aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia, o aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia, o incluso aproximadamente un 100 % de identidad de secuencia. Como alternativa, la región dúplex del ARN puede definirse funcionalmente como una secuencia nucleotídica que es capaz de hibridar con una porción del 20 transcrito del gen diana. Una secuencia menor de la de longitud completa que muestra una homología mayor compensa a una secuencia menos homóloga más larga. La longitud de las secuencias nucleotídicas idénticas puede ser de al menos aproximadamente 25 50, 100, 200, 300, 400, 500 o al menos aproximadamente 1000 bases. Normalmente, debe usarse una secuencia de más de 20-100 nucleótidos, aunque se preferiría una secuencia de más de aproximadamente 200-300 nucleótidos y se preferiría especialmente una secuencia de más de 25 aproximadamente 500-1000 nucleótidos dependiendo del tamaño del gen diana. Esto tiene la ventaja de ser capaz de tolerar variaciones de secuencia que podrían esperarse debido a mutación genética, polimorfismo de cepa o divergencia evolutiva. La molécula de ácido nucleico introducida puede no necesitar ser absolutamente homóloga, puede no necesitar ser de longitud completa en relación bien al producto primario de transcripción o al ARNm totalmente procesado del gen diana. Por tanto, los expertos en la materia tienen que darse cuenta de que, tal como 30 se divulgan en el presente documento, no es necesaria una identidad de secuencia del 100 % entre el ARN y el gen diana para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento.
IV. Métodos para preparar ARNbc
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Las moléculas de ARNbc pueden sintetizarse in vivo o in vitro. El ARNbc puede formarse mediante una sola hebra de ARN autocomplementaria o a partir de dos hebras de ARN complementarias. La ARN polimerasa endógena de la célula puede mediar la transcripción in vivo, o puede usarse ARN polimerasa clonada para la transcripción in vivo o in vitro. La inhibición puede estar dirigida mediante transcripción específica en un órgano, tejido, o tipo celular; la estimulación de una condición ambiental (por ejemplo, infección, estrés, temperatura, inductores químicos); y/o 40 diseñar la transcripción a un estadio del desarrollo o edad. Las hebras de ARN pueden estar o no poliadeniladas; las hebras de ARN pueden ser o no capaces de traducirse en un polipéptidos por el aparato transcripcional de una célula.
Un ARN, ARNbc, ARNpi, o ARNmi puede producirse química o enzimáticamente por un experto en la materia 45 mediante reacciones manuales o automatizadas o in vivo en otro organismo. El ARN también puede producirse mediante síntesis orgánica parcial o total; puede introducirse cualquier ribonucleótido modificado mediante síntesis enzimática u orgánica in vitro. El ARN puede sintetizarse por una ARN polimerasa celular o por una ARN polimerasa de bacteriófago (por ejemplo, T3, T7, SP6). El uso y la producción de una construcción de expresión se conocen en la materia (véase, por ejemplo, el documento WO 97/32016; Las Patentes de Estados Unidos Nº 5.593.874, 50 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214 y 5.804.693). Si se sintetiza químicamente o mediante síntesis enzimática in vitro, el ARN puede purificarse antes de la introducción en la célula. Por ejemplo, el ARN puede purificarse a partir de una mezcla mediante extracción con un disolvente o una resina, precipitación, electroforesis, cromatografía, o una de sus combinaciones. Como alternativa, el ARN puede usarse sin o con una purificación mínima para evitar pérdidas debido al procesamiento de la muestra. EL ARN puede secarse para su almacenamiento o disolverse en una 55 solución acuosa. La solución puede contener tampones o sales para promover la hibridación y/o estabilización de las hebras dúplex.
V. Secuencias polinucleotídicas
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De acuerdo con la divulgación se proporcionan secuencias nucleotídicas, cuya expresión da como resultado una secuencia de ARN que es sustancialmente homóloga a una molécula de ARN de un gen diana en una plaga que comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia nucleotídica en el genoma de la plaga. Por lo tanto, tras la ingestión de la secuencia de ARNbc puede obtenerse la regulación negativa de la secuencia nucleotídica del gen diana en las células de la plaga dando como resultado un efecto perjudicial sobre el mantenimiento, viabilidad, 65 proliferación, reproducción e infestación de la plaga.
Cada "secuencia nucleotídica" expuesta en el presente documento se presenta como una secuencia de desoxirribonucleótidos (abreviados como A, G, C y T). Sin embargo, se entiende por "secuencia nucleotídica" de una molécula de ácido nucleico o polinucleótido, para una molécula o polinucleótido de ADN, una secuencia de desoxirribonucleótidos y para una molécula o polinucleótido de ARN, la secuencia correspondiente de ribonucleótidos (A, G, C y U) donde cada desoxinucleótido de timina (T) en la secuencia de desoxinucleótido 5 especificada se reemplaza por el ribonucleótido uracilo (U).
Tal como se usa en el presente documento, un "ácido nucleico" se refiere a un polímero de bases de desoxirribonucleótido o ribonucleótido monocatenario o bicatenario leído del extremo 5' al extremo 3'. Un ácido nucleico puede contener opcionalmente bases nucleotídicas de origen no natural o alteradas que permiten la lectura 10 correcta por una polimerasa y que no reducen la expresión de un polipéptido codificado por ese ácido nucleico. Una "secuencia nucleotídica" o "secuencia de ácidos nucleicos" se refiere a las hebras tanto con sentido como antisentido de un ácido nucleico bien como hebras individuales o en el dúplex.
El término "ácido ribonucleico" (ARN) es inclusivo de ARNi (ARN inhibidor), ARNbc (ARN bicatenario), ARNpi (ARN 15 pequeño interferente), ARNm (ARN mensajero), ARNmi (micro ARN), ARNt (ARN transferente, ya esté cargado o descargado con un aminoácido acilado correspondiente) y ARNc (ARN complementario) y el término "ácido desoxirribonucleico" (ADN) es inclusivo de ADNc y ADN genómico y de híbridos de ADN-ARN.
Las expresiones "segmento de ácido nucleico", "segmento de secuencia de nucleótidos", o más generalmente 20 "segmento" se entenderá por los expertos en la materia como una expresión funcional que incluye tanto secuencias genómicas, secuencias de ARN ribosómico, secuencias de ARN transferente, secuencias de ARN mensajero, secuencias de operón y secuencias nucleotídicas diseñadas más pequeñas que expresan o pueden adaptarse para expresar proteínas, polipéptidos o péptidos.
25
Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en cualquiera de las secuencias polinucleotídicas de las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466. La divulgación también proporciona fragmentos de las secuencias polinucleotídicas de las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 30 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466. La divulgación proporciona además ácidos nucleicos complementarios, o fragmentos de los mismos, para cualquiera de las secuencias polinucleotídicas de las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466, así como un ácido nucleico que comprende al menos 15 bases contiguas que hibrida con cualquiera de las secuencias polinucleotídicas de las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 35 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466.
La presente divulgación también proporciona secuencias ortólogas y complementos y fragmentos de las mismas, de las secuencias polinucleotídicas de las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466. Por consiguiente, la divulgación abarca secuencias 40 diana que son ortólogos de insecto de un gen que comprende una secuencia nucleotídica tal como se representa en cualquiera de las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466. A modo de ejemplo, los ortólogos de insecto pueden comprender una secuencia nucleotídica tal como se representa en cualquiera de las SEC ID Nº: 56, 829-832, 958-963, 1771-1774 y 2418-2420, o un fragmento de las mismas de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 o 27 45 nucleótidos. En la Tabla 4 se proporciona una lista no limitante de genes ortólogos de insectos o arácnidos o secuencias que comprenden al menos un fragmento de 15, preferentemente de al menos 17 pb de una de las secuencias de la divulgación.
la divulgación también abarca secuencias diana que son ortólogos de nematodo de un gen que comprende una 50 secuencia nucleotídica tal como se representa en cualquiera de las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466. De acuerdo con otro aspecto, la divulgación abarca por lo tanto cualquiera de los métodos descritos en el presente documento para controlar el crecimiento de nematodos en un organismo, o para prevenir la infestación por nematodos de un organismo susceptible a la infección por nematodos, que comprende poner en contacto células de nematodo con un 55 ARN bicatenario, en el que dicho ARN bicatenario comprende hebras complementarias hibridadas, una de las cuales tiene una secuencia nucleotídica que es complementaria a al menos parte de la secuencia nucleotídica de un gen diana que comprende un fragmento de al menos 21 nucleótidos de cualquiera de las secuencias tal como se representan en las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466, en el que el ARN bicatenario se capta por el nematodo y por lo tanto 60 controla el crecimiento o evita la infestación. La divulgación también se refiere a plantas transgénicas resistentes a nematodos que comprenden un fragmento de al menos 21 nucleótidos de cualquiera de las secuencias tal como se representan en las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466. En la Tabla 5 se proporciona una lista no limitante de genes ortólogos de nematodos o secuencias que comprenden al menos un fragmento de 15, preferentemente de al menos 17 pb de una 65 de las secuencias de la divulgación.
De acuerdo con otra realización, la divulgación abarca secuencias diana que son ortólogos fúngicos de un gen que comprende una secuencia nucleotídica tal como se representa en cualquiera de las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466. A modo de ejemplo, los ortólogos fúngicos pueden comprender una secuencia nucleotídica tal como se representa en la SEC ID Nº: 1026, o un fragmento de al menos 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 o 27 nucleótidos de la misma. De 5 acuerdo con otro aspecto, la divulgación abarca por lo tanto cualquiera de los métodos descritos en el presente documento para controlar el crecimiento fúngico en una célula o en un organismo, o para prevenir la infestación fúngica de una célula o un organismo susceptible a la infección fúngica, que comprende poner en contacto células fúngicas con una ARN bicatenario, en el que dicho ARN bicatenario comprende hebras complementarias hibridadas, una de las cuales tiene una secuencia nucleotídica que es complementaria a al menos parte de la secuencia 10 nucleotídica de un gen diana que comprende un fragmento de al menos 21 nucleótidos de cualquiera de las secuencias tal como se representan en las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466, en el que el ARN bicatenario se capta por el hongo y por lo tanto controla el crecimiento o evita la infestación. La invención también se refiere a plantas transgénicas resistentes a hongos que comprenden un fragmento de al menos 21 de cualquiera de las secuencias representadas 15 en las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466. En la Tabla 6 se proporciona una lista no limitante de genes ortólogos fúngicos o secuencias que comprenden al menos un fragmento de 15, preferentemente de al menos 17 pb de una de las secuencias de la divulgación.
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En una realización adicional, una molécula de ARNbc de la divulgación comprende cualquiera de las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466, aunque las secuencias expuestas en las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466 no son limitantes. Una molécula de ARNbc puede comprender cualquier gen diana contiguo procedente de una especie de plaga (por ejemplo, de 25 aproximadamente 25 o más, o de aproximadamente 21, 22, 23, 24, o 25 o más nucleótidos contiguos).
Por molécula(s) de ácido nucleico "aislada(s)" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha extraído de su ambiente natural. Por ejemplo, las moléculas de ADN recombinante contenidas en una construcción de ADN se consideran aisladas para los fines de la presente divulgación. Los ejemplos adicionales de moléculas de 30 ADN aisladas incluyen moléculas de ADN recombinante mantenidas en células hospedadoras heterólogas o moléculas de ADN purificadas (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vitro de las moléculas de ADN de la presente divulgación. Las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente.
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Las moléculas de ácido nucleico pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, o en forma de ADN, incluyendo, por ejemplo, ADNc y ADN genómico obtenido mediante clonación o producido sintéticamente. EL ADN o ARN puede ser bicatenario o monocatenario. El ADN monocatenario puede ser la hebra codificante, también conocido como la hebra con sentido, o puede ser la hebra no codificante, también citado como la hebra antisentido.
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VI. Análisis de secuencias
A menos que se indique lo contrario, todas las secuencias nucleotídicas determinadas secuenciando una molécula de ADN se determinaron usando un secuenciador de ADN automatizado (tal como el Modelo 373 de Applied Biosystems, Inc.). Por tanto, tal como se conoce en la materia para cualquier secuencia de ADN determinada 45 mediante esta estrategia automatizada, cualquier secuencia nucleotídica determinada en el presente documento puede contener algunos errores. Las secuencias nucleotídicas determinadas mediante automatización son típicamente al menos aproximadamente un 95 % idénticas, más típicamente al menos aproximadamente un 96 % hasta al menos aproximadamente un 99,9 % idénticas a la secuencia nucleotídica real de la molécula de ADN secuenciada. La secuencia real puede determinarse de manera más precisa mediante otras estrategias, incluyendo 50 métodos de secuenciación manual de ADN bien conocidos en la técnica. Como también se sabe en la técnica, una sola inserción o deleción en una secuencia de nucleótidos determinada, comparada con la secuencia real, provocará un desplazamiento del marco en la traducción de la secuencia nucleotídica, de tal forma que la secuencia de aminoácidos predicha codificada por una secuencia nucleotídica determinada puede ser completamente diferente de la secuencia de aminoácidos realmente codificada por la molécula de ADN secuenciada, comenzando en el punto 55 de dicha inserción o deleción.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas de hibridación con una porción del polinucleótido en una molécula de ácido nucleico descrita anteriormente. Por un polinucleótido que hibrida con una "porción" de un polinucleótido se entiende 60 un polinucleótido (bien de ADN o de ARN) que hibrida con al menos aproximadamente 15 nucleótidos y más preferentemente con al menos aproximadamente 20 nucleótidos y aún más preferentemente con al menos aproximadamente 30 nucleótidos, e incluso más preferentemente con más de 30 nucleótidos del polinucléotido de referencia. Estos fragmentos que hibridan con los fragmentos de referencia son útiles como sondas y cebadores diagnósticos. Dos secuencias hibridan cuando forman un complejo bicatenario en una solución de hibridación de 65 SSC 6X, SDS al 0,5 %, solución de Denhardt 5X y 100 µg de ADN portador no específico. Véase Ausubel et al.,
sección 2.9, suplemento 27 (1994). Las secuencias pueden hibridar a "rigurosidad moderada", que se define como una temperatura de 60 °C en una solución de hibridación de SSC 6X, SDS al 0,5 %, solución de Denhardt 5X y 100 µg de ADN portador no específico. Para la hibridación de "alta rigurosidad", la temperatura se aumenta a 68 °C. Después de la reacción de hibridación a rigurosidad moderada, se lavan los nucleótidos en una solución de SSC 2X más SDS al 0,05 % cinco veces a temperatura ambiente, con lavados posteriores con SSC 0,1X más SDS al 0,1 % 5 a 60 °C durante 1 h. Para alta rigurosidad, la temperatura de lavado se aumenta a 68 °C. Los nucleótidos hibridados son aquellos que se detectan usando 1 ng de una sonda radiomarcada que tiene una radiactividad específica de 10.000 cpm/ng, donde los nucleótidos hibridados son claramente visibles después de exposición a película de rayos X a -70 °C durante no más de 72 horas.
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La presente solicitud se dirige a dichas moléculas de ácido nucleico que son al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a una secuencia de ácido nucleico descrita en cualquiera de las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466. Sin embargo, se prefieren moléculas de ácido nucleico que son al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la secuencia de ácido nucleico expuesta en cualquiera de las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 15 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466. Las diferencias entre dos secuencias de ácido nucleico pueden suceder en las posiciones 5' o 3' terminales de la secuencia nucleotídica de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas bien individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. 20
Como aspecto particular, si cualquier molécula de ácido nucleico particular es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia nucleotídica de referencia se refiere a una comparación efectuada entre dos moléculas usando algoritmos bien conocidos en la técnica y puede determinarse convencionalmente usando programas informáticos disponibles públicamente, tales como el algoritmo BLASTN. Véase Altschul et al., Nucleic 25 Acids Res. 25:3389-3402 (1997).
En una realización, un ácido nucleico comprende una hebra antisentido que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), en el que la hebra antisentido es complementaria a una secuencia de ARN o una porción de la misma 30 que codifica una proteína que controla el ciclo celular o la recombinación de homólogos y en el que dicho ANpi comprende además una hebra sentido que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30) y en el que dicha hebra con sentido y dicha hebra antisentido son secuencias nucleotídicas distintas donde al menos aproximadamente 15 nucleótidos en cada hebra son complementarios con la otra hebra. 35
En una realización, la presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico bicatenarias que median dicho silenciamiento génico de interferencia de ARN. En otra realización, las moléculas de ANpi consisten en moléculas de ácido nucleico dúplex que contienen de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 pares de bases entre oligonucleótidos que comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos (por ejemplo, 40 aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30). En otra realización más, las moléculas de ANpi comprenden moléculas de ácido nucleico dúplex con extremos salientes de aproximadamente 1 a aproximadamente 32 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, o 3), por ejemplo, dúplex de aproximadamente 21 nucleótidos con aproximadamente 19 pares de bases y salientes 3'-terminales de mononucleótido, dinucleótido o trinucleótido. En otra realización más, las moléculas de ANpi comprenden moléculas 45 de ácido nucleico dúplex con extremos romos, donde ambos extremos son romos, o como alternativa, donde uno de los extremos es romo.
Una molécula de ANpi puede comprender nucleótidos modificados a la vez que se mantiene la capacidad para mediar la ARNi. Los nucleótidos modificados pueden usarse para mejorar características in vitro o in vivo tales como 50 la estabilidad, actividad, y/o biodisponibilidad. Por ejemplo, una molécula de ANpi puede comprender nucleótidos modificados como un porcentaje del número total de nucleótidos presentes en la molécula de ANpi. Como tal, una molécula de ANpi puede comprender generalmente de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 100 % de nucleótidos modificados (por ejemplo, aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de nucleótidos modificados). El porcentaje 55 real de nucleótidos modificados presentes en una molécula de ANpi dada dependerá del número total de nucleótidos presentes en el ANpi. Si la molécula de ANpi es monocatenaria, el porcentaje de modificación puede basarse en el número total de nucleótidos presentes en las moléculas de ANpi monocatenarias. Del mismo modo, si la molécula de ANpi es bicatenaria, el porcentaje de modificación puede basarse en el número total de nucleótidos presentes en la hebra con sentido, en la hebra antisentido, o en las hebras tanto con sentido como antisentido. 60
VII. Construcciones de ácido nucleico
Un vector de ácido nucleico recombinante puede, por ejemplo, ser un plásmido lineal o circular cerrado. El sistema de vector puede ser un solo vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ácido 65 nucleico total que se va a introducir en el genoma del hospedador bacteriano. Además, un vector bacteriano puede
ser un vector de expresión. Las moléculas de ácido nucleico tal como se exponen en las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466, o fragmentos de las mismas pueden, por ejemplo, insertarse sustancialmente en un vector bajo el control de un promotor adecuado que funciona en uno o más hospedadores microbianos para dirigir la expresión de una secuencia codificante enlazada u otra secuencia de ADN. Hay muchos vectores disponibles para este fin y la 5 selección del vector adecuado dependerá principalmente del tamaño del ácido nucleico que se va a insertar en el vector y de la célula hospedadora particular que se va a transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes dependiendo de su función (amplificación de ADN o expresión de ADN) y de la célula hospedadora particular con la que sea compatible. Los componentes de vector para transformación bacteriana incluyen generalmente, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, 10 uno o más genes de marcador de selección y un promotor inducible que permite la expresión de ADN exógeno.
Promotores
"Unido operativamente", tal como se usa en referencia a una secuencia reguladora y a una secuencia nucleotídica 15 estructural, significa que la secuencia reguladora provoca la expresión regulada de la secuencia nucleotídica estructural enlazada. Las "secuencias reguladoras" o los "elementos de control" se refieren a secuencias nucleotídicas situadas cadena arriba (secuencias no codificantes 5'), en, o cadena abajo (secuencias 3' no traducidas) de una secuencia nucleotídica estructural y que influencia la sincronía y el nivel o cantidad de transcripción, procesamiento de ARN o estabilidad, o la traducción de la secuencia nucleotídica estructural asociada. 20 Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líder de traducción, intrones, potenciadores, estructuras de tallo-bucle, secuencias de unión represoras y secuencias de reconocimiento de poliadenilación y similares.
Un vector de expresión para producir un ARNm también puede contener un promotor inducible que se reconoce por 25 el organismo bacteriano hospedador y está unido operativamente al ácido nucleico que codifica, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico que codifica el ARNm de D. v. virgifera o un fragmento de interés del mismo. Los promotores inducibles adecuados para su uso con hospedadores bacterianos incluyen el promotor de β-lactamasa, promotores PL y PR de fago λ de E. coli y promotor de galactosa de E. coli, promotor de arabinosa, promotor de fosfatasa alcalina, promotor de triptófano (trp) y el promotor del operón de lactosa y variaciones de los mismos y 30 promotores híbridos, tales como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos inducibles conocidos.
La divulgación contempla promotores que funcionan en diferentes especies de plantas. Los promotores útiles para la expresión de polipéptidos en plantas incluyen aquellos que son inducibles, virales, sintéticos, o constitutivos, tal 35 como se describe en Odell et al., (1985), y/o promotores que se regulan temporalmente, que se regulan espacialmente y que se regulan de manera espacio-temporal. Los promotores preferidos incluyen los promotores potenciados de CaMV35S y el promotor de FMV35S. Para un control óptimo de las especies que se alimentan de raíces, puede ser preferible lograra los niveles más altos de expresión de estos genes en las raíces de las plantas. Se han identificado y se conocen en la técnica una serie de promotores potenciados en raíz (Lu et al., 2000; 40 Patentes de Estados Unidos Nº 5.837.848 y 6.489.542).
En una realización, el vector de transformación en plantas comprende una molécula de ADN purificada y aislada que comprende un promotor unido operativamente a una o más secuencias nucleotídicas. La secuencia nucleotídica se selecciona entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº: 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 45 1046, 1073, 1577, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420, 2466. La secuencia nucleotídica incluye un segmento que codifica la totalidad o una parte de un ARN presente en un transcrito de ARN de una plaga diana y puede comprender repeticiones invertidas de la totalidad o parte de un ARN diana de la plaga. La molécula de ADN que comprende el vector de expresión también puede contener una secuencia de intrón funcional posicionada bien cadena arriba de la secuencia codificante o incluso dentro de la secuencia codificante y también puede contener una 50 secuencia líder cinco prima (5') no traducida (es decir, una UTR o 5'-UTR) posicionada entre el promotor y el punto de inicio de la traducción.
Genes de marcador de selección
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Un vector o construcción de ADN recombinante comprenderá típicamente un marcador de selección que confiera un fenotipo de selección en células vegetales. Los marcadores de selección también pueden usarse para seleccionar plantas o células vegetales que contienen los ácidos nucleicos exógenos que codifican polipéptidos o proteínas. El marcador puede codificar resistencia a un biocida, resistencia a antibióticos (por ejemplo, kanamicina, bleomicina G418, higromicina, etc.), o resistencia a herbicidas (por ejemplo, glifosato, etc.). Los ejemplos de marcadores de 60 selección incluyen, pero sin limitación, un gen neo que codifica resistencia a kanamicina y puede seleccionarse para usar kanamicina, G418, etc., un gen bar que codifica resistencia a bialafós; un gen de EPSP sintasa mutante que codifica resistencia a glifosato; un gen de nitrilasa que confiere resistencia a bromoxinilo; un gen de acetolactato sintasa (ALS) mutante que confiere resistencia a imidazolinona o a sulfonilurea; y un gen DHFR de resistencia a metotrexato. Los ejemplos de dichos marcadores de selección se ilustran en las Patentes de Estados Unidos 65 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 y 6.118.047.
Un vector o construcción recombinante puede incluir también un marcador de exploración. Los marcadores de exploración pueden usarse para controlar la expresión. Los ejemplos de marcadores de exploración incluyen un gen de β-glucuronidasa o de uidA (GUS) que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos (Jefferson, 1987; Jefferson et al., 1987); un gen de locus R, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos vegetales (Dellaporta et al., 1988); un gen de β-5 lactamasa (Sutcliffe et al., 1978), un gen que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen de luciferasa (Ow et al., 1986) un gen de xylE (Zukowsky et al., 1983) que codifica una catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogénicos; un gen de α-amilasa (Ikatu et al., 1990); un gen de tirosinasa (Katz et al., 1983) que codifica una enzima capaz de oxidar tirosina a DOPA y dopaquinona que a su vez se condensa en melanina; una α-galactosidasa, que cataliza a 10 un sustrato cromogénico de α-galactosa.
Los vectores para transformación en plantas preferidos incluyen aquellos derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937, 5.501.967 y el documento EP 0 122 791). También son útiles y se conocen plásmidos de Agrobacterium rhizogenes 15 (o "Ri"). Otros vectores para transformación en plantas preferidos incluyen aquellos divulgados, por ejemplo, por Herrera-Estrella (1983); Bevan (1983), Klee (1985) y en el documento EP 0 120 516.
En general, se prefiere introducir un ADN recombinante funcional en una localización no específica en el genoma de una planta. En casos especiales, puede ser útil insertar una construcción de ADN recombinante mediante 20 integración de sitio específico. Existen varios sistemas de recombinación de sitio específico que se sabe que funcionan en plantas, incluyendo cre-lox tal como se divulga en la Patente de Estados Unidos Nº 4.959.317 y FLP-FRT tal como se divulga en la Patente de Estados Unidos Nº 5.527.695.
Puede prepararse un vector de transformación usando métodos disponibles en la técnica. El vector de 25 transformación comprende una o más secuencias de nucleótidos que es/son capaces de transcribirse a una molécula de ARN y que es/son sustancialmente homólogos y/o complementarios a una o más secuencias de nucleótidos codificadas por el genoma del insecto, de tal forma que tras la captación del ARN existe regulación negativa de la expresión de al menos una de las secuencias de nucleótidos respectivas del genoma del insecto.
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Un vector de transformación en plantas puede contener secuencias de más de un gen, permitiendo de este modo la producción de más de un ARNbc para inhibir la expresión de dos o más genes en células de una plaga diana. Un experto en la materia apreciará fácilmente que pueden combinarse segmentos de ADN cuya secuencia corresponda a aquella presente en diferentes genes en un solo segmento de ADN compuesto para la expresión en una planta transgénica. Como alternativa, puede modificarse un plásmido que ya contiene al menos un segmento de ADN 35 mediante la inserción secuencial de segmentos de ADN adicionales entre las secuencias del potenciador, del promotor y del terminador. En el agente de control de insectos diseñado para la inhibición de múltiples genes, los genes que se van a inhibir pueden obtenerse de la misma especie de insecto para potenciar la eficacia del agente de control de insectos. En determinadas realizaciones, los genes pueden derivarse de diferentes insectos para ampliar el rango de insectos contra los que el agente es eficaz. Cuando se usan como diana múltiples genes para la 40 supresión o una combinación de expresión y supresión, puede fabricarse un elemento de ADN policistrónico tal como se ilustra y divulga en Fillatti, Publicación de la Solicitud Nº US 2004-0029283.
El vector de transformación puede citarse como una construcción de ADNbc y también puede definirse como una molécula recombinante, como un agente de control de insectos, como una molécula genética o como una 45 construcción genética quimérica. Una construcción genética quimérica puede comprender, por ejemplo, secuencias nucleotídicas que codifican uno o más transcritos antisentido, uno o más transcritos con sentido, uno o más de cada uno de los anteriormente mencionados, en el que la totalidad o parte de un transcrito de estos es homólogo con la totalidad o parte de una molécula de ARN que comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia nucleotídica en el genoma de un insecto. 50
VIII. Plantas para ingeniería genética
Una "planta" es cualquiera de los diversos organismos fotosintéticos, eucariotas y multicelulares del reino Plantae que de manera característica producen embriones, contienen cloroplastos y tienen paredes celulares de celulosa. 55 Una parte de una planta, es decir, un "tejido de planta" puede tratarse de acuerdo con los métodos de la presente invención para producir una planta transgénica. Pueden transformarse muchos tejidos de plantas de acuerdo con la invención e incluyen, pero sin limitación, embriones somáticos, polen, hojas, tallos, callos, estolones, microtubérculos y brotes.
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Por lo tanto, la presente divulgación prevé la transformación de plantas angiospermas y gimnospermas tales como acacia, alfalfa, manzana, albaricoque, alcachofa, fresno, espárrago, aguacate, banana, cebada, judía, remolacha, abedul, haya, mora, arándano, brécol, coles de Bruselas, repollo, colza, cantalupo, zanahoria, mandioca, coliflor, cedro, un cereal, apio, castaña, cereza, col china, cítricos, clementinas, trébol, café, maíz, algodón, caupí, pepino, ciprés, berenjena, olmo, endivia, eucalipto, hinojo, higos, abeto, geranio, uva, pomelo, cacahuete, cereza de suelo, 65 cicuta, nogal americano, con rizada, kiwi, colinabo, alerce, lechuga, puerro, limón, lima, algarroba, pino, culantrillo,
maíz, mango, arce, melón, mijo, champiñón, mostaza, nuez, roble, avena, okra, cebolla naranja, una planta, flor o árbol ornamental, papaya, palma, perejil, chirivía, guisante, melocotón, cacahuete, pera, turba, pimiento, caqui, guandul, pino, piña, plátano, ciruela, granada, patata, calabaza, achicoria, rábano, colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, sauce, soja, espinaca, pícea, calabaza, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, batata, maíz dulce, mandarina, té, tabaco, tomate, árboles, tritical, céspedes, nabo, una vid, nogal, berro, sandía, trigo, batata, 5 tejo y calabacín.
Un "tejido de planta" también abarca células vegetales. Las células vegetales incluyen cultivos en suspensión, callos, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen, semillas y microesporas. Los tejidos de plantas pueden estar en varios estados de madurez y pueden crecerse en cultivo 10 líquido o sólido, o en suelo o medio adecuado en macetas, invernaderos o campos. Un tejido de planta también se refiere a cualquier clon de dicha planta, semilla, descendencia, propágulo ya se genere sexual o asexualmente y los descendientes de cualquiera de estos, tales como esquejes o semillas.
La "progenie", tal como la progenie de una planta transgénica, es una que nace de, se engendra por, o se deriva de 15 una planta o de la planta transgénica. Por lo tanto, una planta de "progenie", es decir, una planta de generación "F1" es la descendencia o un descendiente de la planta transgénica producida. Una progenie de una planta transgénica puede contener en al menos uno, algunos, o todos sus genomas celulares el polinucleótido deseado que se integró en una célula de la planta transgénica parental mediante los métodos descritos en el presente documento. Por lo tanto, el polinucleótido deseado se "transmite" o "hereda" por la planta de progenie. El polinucleótido deseado que 20 se hereda de este modo en la planta de progenie puede residir en una construcción de ADN-T, que también se hereda por la planta de progenie a partir de su progenitor. El término "progenie", tal como se usa en el presente documento, puede considerarse también como los vástagos o descendientes de un grupo de plantas.
Una "semilla" puede considerarse un óvulo de planta maduro que contiene un embrión y una parte propagadora de 25 una planta, tal como un tubérculo o espora. Una semilla puede incubarse antes de la transformación mediada por Agrobacterium, en la oscuridad, por ejemplo, para facilitar la germinación. La semilla también puede esterilizarse antes de la incubación, tal como mediante un breve tratamiento con lejía. La plántula resultante puede exponerse entonces a una cepa deseada de Agrobacterium u otra bacteria adecuada para la transformación.
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La presente divulgación se extiende a métodos tal como se describen en el presente documento, en los que el insecto es Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado) y la planta es patata, berenjena, tomate, pimiento, tabaco, cereza de suelo o arroz, maíz o algodón.
La presente divulgación se extiende a métodos tal como se describen en el presente documento, en los que el 35 insecto es Phaedon chochleariae (escarabajo de hoja de la mostaza) y la planta es mostaza, repollo chino, hojas de nabo, col rizada o col china.
La presente divulgación se extiende a métodos tal como se describen en el presente documento, en los que el insecto es Epilachna varivetis (escarabajo del frijol mexicano) y la planta es frijol, habas, alubias, judías verdes, 40 habas de Lima, frijol mungo, ejotes, frijoles de ojo negro, frijol de terciopelo, soja, caupí, guandul, trébol o alfalfa.
La presente divulgación se extiende a métodos tal como se describen en el presente documento, en los que el insecto es Anthonornus grandis (grillo de la cápsula del algodonero) y la planta es algodón.
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La presente divulgación se extiende a métodos tal como se describen en el presente documento, en los que el insecto es Tribolium castaneum (escarabajo rojo de la harina) y la planta está en forma de productos de grano almacenados, tales como harina, cereales, comida, galletas saladas, judía, especias, pastas, mezcla para pasteles, pienso seco para animales, flores secas, chocolate, nuez, semillas, e incluso en especímenes de museo disecados.
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La presente divulgación se extiende a métodos tal como se describen en el presente documento, en los que el insecto es Myzus persicae (pulgón verde del melocotón) y la planta es un árbol, tal como Prunus, particularmente melocotonero, albaricoque o ciruela; un cultivo de vegetales de las familias Solanaceae, Chenopodiaceae, Conipositae, Cruciferae y Cucurbitaceae, incluyendo, pero sin limitación, alcachofa, espárrago, judía, remolacha, brécol, coles de Bruselas, repollo, zanahoria, coliflor, cantalupo, apio, maíz, pepino, hinojo, con rizada, colinabo, 55 nabo, berenjena, lechuga, mostaza, okra, perejil, chirivía, guisante, pimiento, patata, rábano, espinaca, calabaza, tomate, nabo, berro y sandía; y cultivos de campo, tales como, pero sin limitación, tabaco, remolacha azucarera y girasol; un cultivo de flor o de otra planta ornamental.
La presente divulgación se extiende a métodos tal como se describen en el presente documento, en los que el 60 insecto es Nilaparvata lugens y la planta es una especie de arroz.
La presente divulgación se extiende a métodos tal como se describen en el presente documento, en los que el insecto es Chilo suppressalis (barrenador rayado del tallo del arroz) y la planta es una planta de arroz, cebada, sorgo, maíz, trigo o césped. 65
La presente divulgación se extiende a métodos tal como se describen en el presente documento, en los que el insecto es Plutella xylostella (palomilla de dorso diamante) y la planta es una especie de Brassica tal como, pero sin limitación, repollo, col china, coles de Bruselas, con rizada, colza, brécol, coliflor, nabo, mostaza o rábano.
La presente divulgación se extiende a métodos tal como se describen en el presente documento, en los que el 5 insecto es Acheta domesticus (grillo doméstico) y la planta es cualquier planta tal como se describe en el presente documento o cualquier materia orgánica.
IX. Métodos para ingeniería genética
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La presente divulgación contempla la introducción de una secuencia nucleotídica en una planta para lograr niveles de expresión inhibidores de una plaga de una o más moléculas de ARNbc. Los polinucleótidos y polipéptidos pueden introducirse en una célula vegetal hospedadora mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica para introducir secuencias recombinantes en una célula hospedadora diana. Dichos procedimientos incluyen, pero sin limitación, protocolos de transfección, infección, transformación captación natural, fosfato de calcio, 15 electroporación, microinyección, biolística y transformación mediada por microorganismos. Véase, por ejemplo, Miki et al., 1993, "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants", En: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick y Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, páginas 67-88. Los métodos seleccionados varían en función de la planta hospedadora.
20
La transferencia génica mediada por microorganismos se refiere al uso de un microorganismo para introducir un gen exógeno en una planta hospedadora. Aunque se ha usado ampliamente Agrobacterium (Horsch et al., Science 227:1229-31, 1985) para transferir genes a una planta, no es la única bacteria capaz de transformar plantas. Por ejemplo, se ha demostrado que varias especies de bacterias fuera del género Agrobacterium pueden modificarse para mediar la transferencia génica a diversas plantas. Se hicieron competentes bacterias de dos familias y tres 25 géneros, Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizobium meliloti y Mesorhizobium loti, para transferencia génica mediante adquisición tanto del plásmido Ti desarmado como de un vector binario. Broothaerts, W. et al. Nature Feb 10, 433 (7026):629-633 (2005). La transformación estable de tres especies de plantas, tabaco, arroz y Arabidopsis, se logró con estas especies no de Agrobacterium usando discos foliares, callo derivado de escutelo o inmersión floral. Id. Por lo tanto, diversas bacterias asociadas a plantas, cuando portan un plásmido Ti desarmado y un vector binario (o 30 presumiblemente un plásmido co-integrado o Ti completo), son fácilmente capaces de transferir ADN-T a plantas.
Una planta transgénica es una que comprende al menos un genoma celular en el que se ha integrado de manera estable un ácido nucleico exógeno. Una planta transgénica es una planta que solo comprende una célula modificada genéticamente y genoma celular, o es una planta que contiene algunas células modificadas genéticamente, o es una 35 planta en la que todas las células están modificadas genéticamente. Una planta transgénica puede ser una que comprende la expresión del polinucleótido deseado, es decir, el ácido nucleico exógeno, en solo determinadas partes de la planta. Por lo tanto, una planta transgénica puede solo contener células modificadas genéticamente en determinadas partes de su estructura.
40
Los métodos para la creación de plantas transgénicas y la expresión de ácidos nucleicos heterólogos en plantas en particular se conocen y pueden usarse con los ácidos nucleicos proporcionados en el presente documento para preparar plantas transgénicas que muestran susceptibilidad reducida a ser alimento de un organismo de plaga diana. Pueden prepararse vectores de transformación en plantas, por ejemplo, insertando el ARNbc que produce ácidos nucleicos divulgados en el presente documento en vectores de transformación en plantas e introduciendo 45 estos en plantas. Un sistema de vector conocido se ha derivado modificando el sistema de transferencia génica natural de Agrobacterium tumefaciens. El sistema natural comprende plásmidos Ti (inductores de tumor) grandes que contienen un segmento grande, conocido como ADN-T, que se transfiere a las plantas transformadas. Otro segmento del plásmido Ti, la región vir, es responsable de la transferencia de ADN-T. La región de ADN-T está limitada por repeticiones terminales. En los vectores binarios modificados, se han eliminado los genes inductores de 50 tumores y las funciones de la región vir se usan para transferir ADN exógeno limitado por las secuencias que bordean al ADN-T. La región T también puede contener un marcador de selección para la recuperación eficaz de plantas y células transgénicas y un sitio de clonación múltiple para insertar secuencias para la transferencia, tal como un ácido nucleico que codifica ARNbc.
55
Una planta transgénica formada usando métodos de transformación mediados por Agrobacterium u otro microorganismo contiene típicamente una secuencia nucleotídica recombinante insertada en un cromosoma y se cita como un suceso transgénico. Dichas plantas transgénicas pueden citarse como heterocigóticas para la secuencia exógena insertada. Una planta transgénica homocigótica con respecto a un transgén puede obtenerse mediante autofecundación de una planta transgénica segregante para producir una semilla de F1. Un cuarto de la simiente de 60 F1 producida será homocigótica respecto al transgén. La germinación de semillas de F1 da como resultado plantas que pueden ensayarse para heterocigocidad u homocigocidad, Usando típicamente un ensayo SNP o un ensayo de amplificación térmica que permita la distinción entre heterocigotos y homocigotos (es decir, un ensayo de cigocidad).
Por consiguiente, la presente divulgación también proporciona plantas o células vegetales, que comprenden los 65 polinucleótidos o polipéptidos de la presente divulgación. En una realización, las plantas son angiospermas o
gimnospermas. Más allá del significado ordinario de planta, el término "plantas" también pretende significar la fruta, semillas, flor, estróbilo etc. de la planta. La planta puede ser un transfectante directo, lo que significa que el vector se introdujo directamente en la planta, tal como mediante Agrobacterium, o la planta puede ser la progenie de una planta transfectada. La progenie también puede obtenerse mediante reproducción asexual de una planta transfectada. La planta de segunda generación o una posterior puede o no producirse mediante reproducción 5 sexual, es decir, fertilización. Además, la planta puede ser un gametofito (fase haploide) o un esporofito (fase diploide).
X. Cría/cruzamientos convencionales
10
Además de la transformación directa de una planta con una construcción de ácido nucleico recombinante, las plantas transgénicas pueden prepararse cruzando una primera planta que tiene una construcción de ácido nucleico recombinante con una segunda planta que carece de la construcción. Por ejemplo, el ácido nucleico recombinante para la supresión génica puede introducirse en una primera línea de plantas que es susceptible a transformación para producir una planta transgénica que puede cruzarse con una segunda línea de planta para la introgresión del 15 ácido nucleico recombinante para la supresión génica en la segunda línea de plantas.
Puede ser ventajoso expresar una construcción de ácido nucleico en una planta macho estéril, por ejemplo, como medio para reducir la preocupación acerca del flujo transgénico a plantas vecinas.
20
La presente divulgación puede, en la práctica, combinarse con otros rasgos de control de insectos en una planta para lograr rasgos deseados para el control mejorado de la infestación por insectos. La combinación de rasgos de control de insectos que emplean modos de acción distintos puede proporcionar plantas transgénicas protegidas contra insectos con mayor durabilidad frente a plantas que portan un solo rasgo de control de insectos debido a la probabilidad reducida de que se desarrolle resistencia en el campo. 25
La combinación de determinadas construcciones de ARNbc con uno o más genes de proteínas de control de plagas puede dar como resultado sinergias que potencien el fenotipo de control de plagas de una planta transgénica. Los bioensayos de plagas que emplean dieta artificial o tejido de planta completo pueden usarse para definir respuestas a dosis para mortalidad larvaria, por ejemplo, o inhibición del crecimiento usando tanto ARNbc como proteínas de 30 control de plagas. Un experto en la materia puede ensayar mezclas de moléculas de ARNbc y proteínas de control de plagas en un bioensayo para identificar combinaciones de agentes activos que son sinérgicos y deseables para su desarrollo en plantas protegidas contra plagas (Tabashnik, 1992). Se ha comunicado sinergia para eliminar plagas entre diferentes proteínas de control de insectos (para una revisión, véase Schnepf et al., 1998). Se anticipa que las sinergias existirán entre determinados ARNbc y entre determinados ARNbc y determinadas proteínas de 35 control de insectos.
XI. Cuantificación de la inhibición de expresión de gen diana
La inhibición de la expresión de un gen diana puede cuantificarse midiendo bien el ARN diana endógeno o la 40 proteína producida mediante la traducción del ARN diana y las consecuencias de la inhibición pueden confirmarse mediante el examen de las propiedades evidentes de la célula u organismo. Las técnicas para cuantificar ARN y proteínas son conocidas para un experto habitual en la materia. Existen múltiples marcadores de selección que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectionicina, rifampicina y tetraciclina y similares. 45
En determinadas realizaciones, la expresión génica se inhibe en al menos un 10 %, preferentemente en al menos un 33 %, más preferentemente en al menos un 50 % y aún más preferentemente en al menos un 80 %. La expresión génica puede inhibirse en al menos un 80 %, más preferentemente en al menos un 90 %, más preferentemente en al menos un 95 %, o en al menos un 99 % en las células de la plaga de tal forma que tiene lugar una inhibición 50 significativa. Una inhibición significativa pretende hacer referencia a una inhibición suficiente que da como resultado un fenotipo detectable (por ejemplo, cese del crecimiento larvario, parálisis o mortalidad, etc.) o una disminución detectable en el ARN y/o proteína correspondiente al gen diana que se está inhibiendo. Aunque en determinadas realizaciones la inhibición sucede en sustancialmente todas las células del insecto, en otras realizaciones preferidas la inhibición ocurre solo en un subconjunto de células que expresan el gen. Por ejemplo, si el gen que se va a inhibir 55 juega un papel esencial en las células del tracto alimentario del insecto, la inhibición del gen en estas células es suficiente para ejercer un efecto perjudicial en el insecto.
XII. Productos
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Se proporcionan productos básicos que contienen una o más de las secuencias de la presente divulgación y se producen a partir de una planta recombinante o semilla que contiene una o más de las secuencias nucleotídicas divulgadas. Un producto básico que contiene una o más de las secuencias pretende incluir, pero sin limitación, comidas, aceites, granos triturados o enteros o semillas de una planta, cualquier producto alimentario comprendido en una comida, aceite, o grano triturado o entero de una planta o semilla recombinante, o cualquier ensilaje, fibra, 65 papel, u otro producto derivado de una planta que contiene una o más de las secuencias de la presente divulgación.
La detección de una secuencia en un producto básico proporciona, de hecho, pruebas de que el producto comprende una planta transgénica, o a una porción de la misma, que expresa una secuencia divulgada para controlar la infestación por plagas usando métodos de supresión génica mediados por ARNbc.
A continuación se proporcionan ejemplos específicos para identificar secuencias diana que comprenden al menos 5 una o más moléculas de ARN bicatenario ilustradas en el presente documento pensadas para suprimir una característica o función esencial en la plaga, así como para introducir las secuencias dianas en plangas. Estos pretenden ser ilustrativos y no limitaciones de la presente invención.
Ejemplo 1: Genes diana silenciadores de C. elegans en C. elegans en exploración de alto rendimiento 10
La genoteca completa de C. elegans se preparó en el vector pGN9A (WO 01/22121) entre dos promotores y terminadores de T7 idénticos, conduciendo su expresión en la dirección sentido y antisentido después de la expresión de la T7 polimerasa, que se indujo mediante IPTG.
15
Esta biblioteca se transformó en la cepa bacteriana AB301-105 (DE3) en formato de placas de 96 pocillos. Para la exploración del genoma completo, estas células bacterianas se alimentaron con la cepa nuc-1 (e1392) de C. elegans deficiente en nucleasa.
El suministro de ARNbc producido en la cepa bacteriana AB301-105 (DE3), en gusanos nuc-1 (e1392) de C. 20 elegans, se realizó en un formato de placa de 96 pocillos de la siguiente manera: se transfirieron huevos de nuc-1 a una placa distinta y se dejaron incubar simultáneamente a 20 °C durante una sincronización de la generación L1. Las placas de 96 pocillos se llenaron con 100 µL de medio de crecimiento líquido que comprendía IPTG y con 10 µL de cultivo celular bacteriano de DO600 1 AB301-105 (DE3) de la biblioteca de ARNbc de C. elegans portadora cada una de un vector con un fragmento genómico de C. elegans para la expresión del ARNbc. A cada pocillo, se 25 añadieron 4 de los gusanos sincronizados de L1 y se incubaron a 25 °C durante al menos 4 a 5 días. Estos experimentos se realizaron por cuadruplicado. En la exploración se usaron 6 controles:
- pGN29 = control negativo, tipo silvestre
- pGZ1 = unc-22 = fenotipo con contracciones nerviosas 30
- pGZ18 = quitina sintasa = letal embrionario
- pGZ25 = pos-1 = letal embrionario
- pGZ59 = bli-4D = letal agudo
- ACC = acetil co-enzima A carboxilasa = letal agudo
35
Después de 5 días, el fenotipo de los gusanos nuc-1 (e1392) de C. elegans alimentados con las bacterias productoras del ARNbc se compararon con el fenotipo de gusanos alimentados con el vector vacío (pGN29) y los otros controles. Los gusanos que se habían alimentado con ARNbc se exploraron con respecto a la letalidad (aguda o larvaria) para la generación parental (Po), letalidad (embrionaria) para primera generación filial (F1), o para el retraso de crecimiento de Po de la siguiente manera: (i) Letalidad aguda de Po: Las L1 no se han desarrollado y se 40 han muerto, este fenotipo nunca da progenie y los pocillos parecen vacíos; (ii) Letalidad (larvaria) de Po: Po murieron en un estadio posterior a L1, este fenotipo tampoco da progenie. Se encuentran larvas muertas o gusanos adultos muertos en los pocillos; (iii) Letalidad para F1: Las L1 se han desarrollado hasta el estadio adulto y están aún vivas. Este fenotipo no tiene progenie. Esto puede deberse a esterilidad, letalidad embrionaria (huevos muertos en la parte inferior del pocillo), detención embrionaria o detención larvaria (eventualmente termina siendo letal); (iv) 45 Crecimiento detenido y retraso/retardo del crecimiento: Comparación con un pocillo con desarrollo normal y Nº normal de progenie.
Para las secuencias diana que se presentan en la Tabla 1A, se llegó a la conclusión de que el silenciamiento del gen diana de C. elegans mediado por el ARNbc en nematodos, tales como C. elegans, tenía un efecto fatal sobre el 50 crecimiento y la viabilidad de los gusanos.
Después del experimento anterior de silenciamiento con ARNbc, se llevó a cabo un experimento de fenotipado más detallado en C. elegans en un formato de alto rendimiento en placas de 24 pocillos. La biblioteca de ARNbc producida en la cepa bacteriana AB301-105 (DE3), tal como se describe anteriormente, se suministró a gusanos C. 55 elegans nuc-1 (e1392) en placas de 24 pocillos de la siguiente manera: se transfirieron huevos de nuc-1 a una placa distinta y se dejaron incubar simultáneamente a 20 °C durante una sincronización de la generación L1. Posteriormente 100 de los gusanos L1 sincronizados se sumergieron en 500 µL de una mezcla de medio de alimentación completo S, que comprendía colesterol 5 µg/ml, PEG 4 µL/ml e IPTG 1 mM y 500 µL de cultivo celular bacteriano de DO600 1 AB301-105 (DE3) de la biblioteca de ARNbc de C. elegans portadora cada una de un vector 60 con un fragmento genómico de C. elegans para la expresión del ARNbc. Se rotó a los gusanos de L1 sumergidos durante 2 horas a 25 ºC.
Después de la centrifugación y retirada de 950 µL del sobrenadante, 5 µL del sedimento restante y resuspendido (que comprendía aproximadamente de 10 a 15 gusanos) se transfirieron a la mitad de cada pocillo de una placa de 65 24 pocillos, cargada con una capa de caldo LB agar. La placa inoculada se incubó a 25 °C durante 2 días. En la fase
adulta, se individualizó 1 gusano adulto y se incubó a 25 °C durante 2 días para inspeccionar su progenie. Los gusanos adultos se inspeccionaron in situ en la placa de 24 pocillos original. Estos experimentos se realizaron por cuadruplicado.
Esta exploración fenotípica detallada se repitió con un segundo lote de gusanos, siendo la única diferencia que los 5 gusanos del segundo lote se incubaron a 20 ºC durante 3 días.
El fenotipo de los gusanos alimentados con ARNbc de C. elegans se comparó con el fenotipo de gusanos C. elegans nuc-1 (e1392) alimentados con el vector vacío.
10
Basándose en este experimento, se llegó a la conclusión de que el silenciamiento de los genes diana de C. elegans como se representa en la Tabla 1A tenía un efecto fatal sobre el crecimiento y viabilidad de los gusanos y que este gen diana es esencial para la viabilidad de los nematodos. Por lo tanto, estos genes son buenos genes diana para controlar (eliminar o evitar el crecimiento) a los nematodos mediante el silenciamiento génico mediado por ARNbc. Por consiguiente, la presente divulgación abarca el uso de ortólogos en nematodos del gen diana anterior de C. 15 elegans, para controlar la infestación por nematodos, tales como infestaciones por nematodos en plantas.
Ejemplo 2: Identificación de ortólogos de D. melanogaster
Tal como se describe en el Ejemplo 1 anterior, se identificaron numerosas secuencias letales de C. elegans y 20 pueden usarse para identificar ortólogos en otras especies y géneros. Por ejemplo, las secuencias letales de C. elegans pueden usarse para identificar secuencias ortólogas de D. melanogaster. Es decir, puede hacerse una búsqueda con cada secuencia de C. elegans contra una base de datos pública, tal como GenBank, para secuencias ortólogas en D. melanogaster. Se seleccionaron los ortólogos potenciales de D. melanogaster que compartían un alto grado de homología de secuencia (valor E preferentemente menor que o igual a 1E-30) y las secuencias son los 25 mejores aciertos recíprocos de blast, esto último significa que las secuencias de organismos diferentes (por ejemplo, C. elegans y D. melanogaster) son los mejores aciertos blast entre sí. Por ejemplo, la secuencia C de C. elegans se comparó frente a secuencias en D. melanogaster usando BLAST. Si la secuencia C tiene la secuencia D de D. melanogaster como la mejor coincidencia y cuando D se compara con todas las secuencias de C. elegans, a su vez también con la secuencia C, entonces D y C son mejores coincidencias recíprocas. Este criterio se usa a menudo 30 para definir la ortología, que significa secuencias similares de especies diferentes, que tienen función similar. Los identificadores de secuencia de D. melanogaster se representan en la Tabla 1A.
Ejemplo 3: Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado)
35
A. Clonación de secuencias génicas parciales de Leptinotarsa decemlineata
Se aisló ARN intacto de alta calidad de 4 fases larvarias diferentes de Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado; Fuente: Jeroen van Schaik, Entocare CV Biologische Gewasbescherming, Postbus 162, 6700 AD Wageningen, Países Bajos) usando reactivo TRIzol® (Nº de Cat 15596-026/15596-018, Invitrogen™, Rockville, 40 Maryland, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico presente en la preparación de ARN se retiró mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante (Nº de Cat. 1700, Promega®). El ADNc se generó usando un kit comercialmente disponible (Transcriptasa inversa SuperScript® III, Nº de Cat. 18080044, Invitrogen™, Rockville, Maryland, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.
45
Para aislar secuencias de ADNc que comprendían una porción de los genes LD001, LD002, LD003, LD006, LD007, LD010, LD011, LD014, LD015, LD016 y LD018, se realizó una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® (Nº de Cat. N8080240, Applied Biosystems®) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificación de cada uno de los genes se 50 proporcionan en la Tabla 2-LD, que muestra genes diana de Leptinotarsa decemlineata que incluyen las secuencias cebadoras y las secuencias de ADNc obtenidas. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, purificado (Kit de extracción de gel QIAquick®, Nº de Cat. 28706, Qiagen®), se clonaron en el vector 55 pCR8/GW/TOPO® (Nº de Cat. K2500 20, Invitrogen™) y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-LD y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoácidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-LD, en la que el inicio de la fase de lectura se indica entre paréntesis. 60
B. Producción de ARNbc de los genes de Leptinotarsa decemlineata
Se sintetizó ARNbc en cantidades de miligramo usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express (Nº de Cat. P1700, Promega®). En primer lugar se generaron por separado dos moldes 65 promotores de ARN polimerasa T7 en dirección 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo
cada una la secuencia diana en una orientación diferente con respecto al promotor de T7.
Para cada uno de los genes diana, se generó el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso específicos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-LD. Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: 4 5 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se generó usando cebadores directos e inversos de T7 específicos en una reacción PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-LD. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de 10 purificación PCR (kit de purificación PCR Qiaquick®, Nº de Cat. 28106, Qiagen®) y precipitación con NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-LD. La Tabla 8-LD presenta secuencias para la preparación de fragmentos de ARN de secuencias diana de 15 Leptinotarsa decemlineata y secuencias de concatémero, incluyendo secuencias cebadoras.
C. Clonación de genes de Leptinotarsa decemlineata en el vector vegetal pK7GWIWG2D(II)
Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actúa a través de fragmentos de ARNbc, las secuencias 20 nucleotídicas diana de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientación antisentido y sentido, separados por el intrón - CmR - intrón, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construcción de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reacción de recombinación LR entre un clon de entrada que contenía attL (véase el Ejemplo 1) y un vector de destino que contenía attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a través de 25 VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reacción de recombinación de LR se llevó a cabo usando la mezcla enzimática LR Clonase™ II (Nº de Cat. 11791-020, Invitrogen™) siguiendo las instrucciones del fabricante.. Estos experimentos de clonación produjeron una construcción en horquilla de cada uno de los genes LD002, LD006, LD007, LD010, LD011, LD014 y LD016, que tenían bien la orientación promotor - sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido, o la orientación promotor- antisentido - intrón - CmR - intrón - sentido y 30 en el que el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para la transformación en A. tumefaciens.
Para LD002, se realizó una doble digestión con enzimas de restricción BsoBI y PvuI en LD002 clonado en pCR8/GW/TOPO® (véase el Ejemplo 3A). Para LD006, se realizó una digestión con la enzima de restricción BsoBI 35 en LD006 clonado en pCR8/GW/TOPO® (véase el Ejemplo 3A). Para LD007, se realizó una digestión con la enzima de restricción BsoBI en LD007 clonado en pCR8/GW/TOPO® (véase el Ejemplo 3A). Para LD007, se realizó una digestión con la enzima de restricción BsoBI en LD007 clonado en pCR8/GW/TOPO® (véase el Ejemplo 3A). Para LD010, se realizó una doble digestión con enzimas de restricción PvuI y PvuII en LD010 clonado en pCR8/GW/TOPO® (véase el Ejemplo 3A). Para LD014, se realizó una digestión con la enzima de restricción BsoBI 40 en LD014 clonado en pCR8/GW/TOPO® (véase el Ejemplo 1). Para LD016, se realizó una digestión con la enzima de restricción BsoBI en LD016 clonado en pCR8/GW/TOPO® (véase el Ejemplo 3A). La banda que contenía el gen de interés flanqueado por los sitios de attL se purificó usando el kit de extracción en gel Qiaquick®. Se añadió una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 150 ng de pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubó durante al menos 1h a 25 °C. Después del tratamiento con la solución de proteinasa K (10 min a 37°C), la 45 mezcla de recombinación completa se transformó en las células químicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante análisis por digestión de restricción. La secuencia completa de la construcción en horquilla para:
- LD002 (antisentido - intrón - CmR - intrón - sentido) se expone en la SEC ID Nº:: 240; 50
- LD006 (sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido) se expone en la SEC ID Nº:: 241;
- LD007 (sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido) se expone en la SEC ID Nº:: 242;
- LD010 (sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido) se expone en la SEC ID Nº:: 243;
- LD011 (antisentido - intrón - CmR - intrón - sentido) se expone en la SEC ID Nº:: 244;
- LD014 (sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido) se expone en la SEC ID Nº:: 245; 55
- LD016 (antisentido - intrón - CmR - intrón - sentido) se expone en la SEC ID Nº:: 246;
La Tabla 9-LD proporciona secuencias completas para cada construcción en horquilla.
D. Exploración de dianas de ARNbc usando dieta artificial para la actividad contra Leptinotarsa decemlineata 60
Se preparó dieta artificial para el escarabajo de la patata de Colorado de la siguiente manera (adaptada de Gelman et al., 2001, J. Ins. Sc., vol. 1, Nº 7, 1-10): se esterilizaron en autoclave el agua y el agar, y los demás ingredientes (mostrados en la Tabla 2 más adelante) se añadieron cuando la temperatura descendió a 55 °C. A esta temperatura, los ingredientes se mezclaron bien antes de dividir la dieta en alícuotas en placas de 24 pocillos (Nunc™) con una 65 cantidad de 1 ml de diete por pocillo. Se dejó solidificar la dieta artificial por enfriamiento a temperatura ambiente. La
dieta se almacenó a 4 °C durante hasta tres semanas.
Tabla 2: Ingredientes para la dieta artificial
Ingredientes
Volumen para 1 l
agua
768 ml
agar
14 g
copos de avena laminados
40 g
levadura de Tórula
60 g
hidrolizado de lactalbúmina
30 g
caseína
10 g
fructosa
20 g
mezcla salina de Wesson
4 g
polvo de fruto de tomate
12,5 g
hoja de patata en polvo
25 g
b-sitosterol
1 g
ácido sórbico
0,8 g
Metil parabeno
0,8 g
mezcla de vitaminas de Vanderzant
12 g
sulfato de neomicina
0,2 g
aureomicina
0,130 g
rifampicina
0,130 g
cloranfenicol
0,130 g
nistatina
0,050 g
aceite de soja
2 ml
aceite de germen de trigo
2 ml
Se aplicaron cincuenta µl de una solución de ARNbc a una concentración de 1 mg/ml por vía tópica sobre la dieta 5 artificial sólida en los pocillos de la placa multipocillo. La dieta se secó en una cabina de flujo laminar. Por tratamiento, se ensayaron veinticuatro larvas de escarabajo de la patata de Colorado (2º estadio), con dos insectos por pocillo. Las placas se conservaron en la cámara de cría de insectos a una temperatura de 25 ± 2 °C, humedad relativa del 60 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Se evaluó a los escarabajos como vivos o muertos cada 1, 2 o 3 días. Después de siete días, para las dianas LD006, LD007, LD010, LD011 y LD014, la dieta 10 se reemplazó por dieta nueva con ARNbc aplicado por vía tópica a la misma concentración (1 mg/ml); para las dianas LD001, LD002, LD003, LD015 y LD016, la dieta se reemplazó solo por dieta reciente. Los ARNbc diana se compararon con solo con dieta o dieta con ARNbc aplicado por vía tópica correspondiente a un fragmento de la secuencia codificante de la GFP (proteína fluorescente verde) (SEC ID Nº: 235).
15
La alimentación con dieta artificial que contenía los ARNbc desnudos a larvas de L. decemlineata dio como resultado aumentos significativos en la mortalidad de las larvas como se indica en dos bioensayos separados (Figuras 1LD-2LD).
Todos los ARNbc ensayados dieron como resultado finalmente una mortalidad del 100 % después de 7 a 14 días. La 20 dieta con o sin ARNbc de GFP mantuvo a los insectos a lo largo del bioensayo con poca o sin mortalidad.
Típicamente, en todos los ensayos observados, las larvas de EPC de segundo estadio se alimentaron normalmente con dieta con o sin ARNbc durante 2 días y cambiaron al tercer estadio larvario. En este nuevo estadio larvario, se observó que los EPC reducían significativamente o del todo su alimentación, con un aumento en la mortalidad como 25 resultado.
E. Bioensayo de dianas de ARNbc usando discos foliares de patata para actividad contra Leptinotarsa decemlineata
30
Se empleó un método de bioensayo alternativo usando material foliar de patata en lugar de dieta artificial como fuente de alimentación para los EPC. Se cortaron discos de aproximadamente 1,1 cm de diámetro (o 0,95 cm2) de hojas de plantas de patata de 2 a 3 de vida usando un horadador de corteza de tamaño adecuado. Los discos foliares tratados se prepararon aplicando 20 µl de una solución de 10 ng/µl de ARNbc de LD002 diana o ARNbc de gfp de control en la superficie foliar adaxial. Se dejó que los discos foliares se secasen y se colocaron 35 individualmente en 24 pocillos de una multiplaca de 24 pocillos (Nunc™). Se colocó en cada pocillo un solo EPC de
segundo estadio larvario, que después se cubrió con papel de tejido y una tapa de plástico multipocillo. La placa que contenía los insectos y los discos foliares se mantuvo en una cámara de insectos a 28 °C con un fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad. Se dejó que los insectos se alimentasen de los discos foliares durante 2 días, tras los cuales se transfirieron los insectos a una nueva placa que contenía discos foliares tratados recientes. A continuación, los insectos se transfirieron a una placa que contenía discos foliares no tratados cada día hasta el día 7. Se registraron 5 las puntuaciones de mortalidad y peso de los insectos.
La alimentación con discos foliares de patata con ARNbc desnudo intacto aplicado sobre la superficie de LD002 diana a larvas de L. decemlineata dio como resultado un aumento significativo en la mortalidad larvaria (es decir, en el día 7 todos los insectos estaban muertos; mortalidad del 100 %) mientras que el ARNbc de gfp de control no tuvo 10 ningún efecto sobre la supervivencia del EPC. El ARNbc de LD002 diana afectó gravemente al crecimiento de las larvas después de 2 a 3 días mientras que las larvas alimentadas con ARNbc de gfp a la misma concentración se desarrollaron como normales (Figura 3-LD).
F. Exploración de versiones más cortas de los ARNbc usando dieta artificial con respecto a la actividad 15 contra Leptinotarsa decemlineata
Este ejemplo ilustra el descubrimiento de que fragmentos de ARNbc más cortos (60 o 100 pb) por sí mismos o como construcciones de concatémero son suficientes para causar toxicidad para el escarabajo de la patata de Colorado.
20
Para este ejemplo se seleccionó LD014, una diana que se sabe que induce letalidad en el escarabajo de la patata de Colorado. Este gen codifica una subunidad E de V-ATPasa (SEC ID Nº:: 15).
Un fragmento de 100 pares de bases, LD014_F1, en la posición 195-294 en la SEC ID N:: 15 (SEC ID Nº: 159) y un fragmento de 60 pares de bases, LD014_F2, en la posición 235-294 en la SEC ID N:: 15 (SEC ID Nº: 160) se 25 seleccionaron adicionalmente. Véase también la Tabla 7-LD.
Se diseñaron dos concatémeros de 300 pares de bases, LD014_C1 y LD014_C2, (SEC ID Nº:: 161 y SEC ID Nº:: 162). LD014_C1 contenía 3 repeticiones del fragmento de 100 pares de bases descrito anteriormente (SEC ID Nº:: 159) y LD014_C2 contenía 5 repeticiones del fragmento de 60 pares de bases descrito anteriormente (SEC ID Nº:: 30 160). Véase también la Tabla 7-LD.
Los fragmentos LD014_F1 y LD014_F2 se sintetizaron como cebadores en sentido y antisentido. Estos cebadores se hibridaron para crear las moléculas de ADN bicatenario antes de la clonación. Se incluyeron los sitios de restricción XbaI y XmaI en los extremos 5' y 3' de los cebadores, respectivamente, para facilitar la clonación. 35
Los concatémeros se produjeron como genes sintéticos de 300 pares de bases. Se incluyeron los sitios de restricción XbaI y XmaI en los extremos 5' y 3' de los fragmentos de ADN sintéticos, respectivamente, para facilitar la clonación.
40
Las 4 moléculas de ADN, es decir, las 2 unidades sencillas (LD014_F1 y LD014_F2) y los 2 concatémeros (LD014_C1 y LD014_C2), se sometieron a digestión con XbaI y XmaI y se subclonaron en pBluescriptII SK+ linealizado con digestiones de XbaI y XmaI, dando como resultado plásmidos recombinantes p1, p2, p3 y p4, respectivamente.
45
Producción de ARN bicatenario: se sintetizó ARNbc usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express. En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en dirección 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una orientación diferente con respecto al promotor de T7. Para LD014_F1, se generó el molde de T7 en sentido usando el cebador directo específico de T7 oGBM159 y el cebador inverso específico oGBM164 (representados en el 50 presente documento como SEC ID Nº:: 204 y SEC ID Nº: 205, respectivamente) en una reacción PCR con las siguientes condiciones: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72°C. El molde de T7 antisentido se generó usando el cebador directo específico oGBM163 y el cebador inverso específico de T7 oGBM160 (representado en el presente documento como SEC ID Nº: 206 y SEC ID Nº:: 207, respectivamente) en una reacción PCR con las mismas condiciones 55 descritas anteriormente. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificación PCR (kit de purificación PCR Qiaquick®) y precipitación de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante se representa en el presente documento por SEC ID Nº: 203. 60
Para LD014_F2, se generó el molde de T7 en sentido usando el cebador directo específico de T7 oGBM161 y el cebador inverso específico oGBM166 (representados en el presente documento como las SEC ID Nº:: 209 y SEC ID Nº:: 210, respectivamente) en una reacción PCR con las siguientes condiciones: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72°C. El molde de 65 T7 antisentido se generó usando el cebador directo específico oGBM165 y el cebador inverso específico de T7
oGBM162 (representado en el presente documento como SEC ID Nº: 211 y SEC ID Nº:: 212, respectivamente) en una reacción PCR con las mismas condiciones descritas anteriormente. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificación PCR (kit de purificación PCR Qiaquick®) y precipitación de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, 5 siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante se representa en el presente documento por SEC ID Nº: 208.
También para los concatémeros, se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en dirección 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una 10 orientación diferente con respecto al promotor de T7. Los plásmidos recombinantes p3 y p4 que contenían LD014_C1 y LD014_C2 se linealizaron con XbaI o XmaI, los dos fragmentos lineales para cada construcción se purificaron y se usaron como molde para el ensayo de transcripción in vitro, usando los promotores de T7 que flanqueaban a los sitios de clonación. Se preparó ARN bicatenario mediante transcripción in vitro usando Sistema de ARNi T7 RiboMAX™ Express. Las hebras sentido de los ARNbc resultantes para LD014_C1 y LD014_C2 se 15 representan en el presente documento por SEQ ID NO:: 213 y SEC ID Nº:: 214, respectivamente.
Secuencias más cortas de LD014 diana y concatémeros fueron capaces de inducir letalidad en Leptinotarsa decemlineata, tal como se muestra en la Figura 4-LD.
20
G. Exploración de los ARNbc a diferentes concentraciones usando dieta artificial para actividad contra Leptinotarsa decemlineata
Cincuenta µl de una solución de ARNbc a concentraciones en serie de factor 10 de 1 µg/µl (para LD027 diana a partir de 0,1 µg/µl) hasta 0,01 ng/µl se aplicaron por vía tópica en la dieta artificial sólida en los pocillos de una placa 25 de 24 pocillos (Nunc™). La dieta se secó en una cabina de flujo laminar. Por tratamiento, se ensayaron veinticuatro larvas de escarabajo de la patata de Colorado (2º estadio), con dos insectos por pocillo. Las placas se conservaron en la cámara de cría de insectos a una temperatura de 25 ± 2 °C, humedad relativa del 60 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Se evaluó a los escarabajos como vivos o muertos a intervalos regulares hasta el día 14. Después de siete días, la dieta se reemplazó por dieta nueva con ARNbc aplicado por vía tópica a las mismas 30 concentraciones. Los ARNbc diana se compararon con dieta sola.
La alimentación con dieta artificial que contenía los ARNbc desnudos intactos de diferentes dianas a larvas de L. decemlineata dio como resultado mortalidades larvarias elevadas a concentraciones tan bajas como entre 0,1 y 10 ng de ARNbc/µl tal como se muestra en la Figura 5-LD. 35
H. Clonación de un fragmento génico de EPC en un vector adecuado para la producción bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos
Aunque puede usarse cualquier promotor bacteriano eficaz, se clonó un fragmento de ADN correspondiente a una 40 diana génica de EPC en un vector para la expresión de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano (véase el documento WO 00/01846).
Las secuencias de los cebadores específicos usados para la amplificación de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los 45 cebadores se usan en una reacción PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizó en gel de agarosa, se purificó (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonó en su extremo romo en vector pGNA49A linealizado con Srf I (referencia al documento WO00188121A1) y se secuenció. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la secuencia respectiva tal como se proporciona en la Tabla 50 8. El vector recombinante que porta esta secuencia se denomina pGBNJ003.
Las secuencias de los cebadores específicos usados para la amplificación del fragmento génico LD010 se proporcionan en la Tabla 8 (cebador directo SEC ID Nº:: 191 y cebador inverso SEC ID Nº:: 190). El molde usado era el vector pCRB/GW/TOPO® que contenía la secuencia LD010 (SEC ID Nº:: 11). Los cebadores se usaron en una 55 reacción PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizó en gel de agarosa, se purificó (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonó en su extremo romo en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuenció. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la SEC ID Nº:: 188 tal como se proporciona en la Tabla 8. El vector recombinante que porta esta secuencia se denominó pGBNJ003. 60
I. Expresión y producción de una diana de ARN bicatenario en dos cepas de Escherichia coli: (1) AB301-105(DE3), y, (2) BL21(DE3)
Se siguieron los procedimientos descritos a continuación para expresar niveles adecuados de ARN bicatenario 65 activo en insectos de LD010 diana en bacterias. Se usó una cepa deficiente en RNasaIII, AB301-105(DE3), en
comparación con bacterias que contenían RNasaIII de tipo silvestre, BL21(DE3).
Transformación de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)
Se añadieron trescientos ng del plásmido y se mezclaron suavemente en una alícuota de 50 µl de la cepa de E. coli 5 químicamente competente enfriada en hielo AB301-105(DE3) o BL21(DE3). Las células se incubaron sobre hielo durante 20 minutos antes de someterlas a un tratamiento de choque térmico de 37 °C durante 5 minutos, después de los cuales se pusieron de nuevo sobre hielo durante 5 minutos adicionales. Se añadieron cuatrocientos cincuenta µl de medio SOC a temperatura ambiente a las células y la suspensión se incubó en un agitador (250 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Se transfirieron cien µl de la suspensión de células bacterianas a un matraz cónico de 500 ml que 10 contenía 150 ml de caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) líquido suplementado con 100 µg/ml de antibiótico de carbenicilina. El cultivo se incubó en un agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37 °C durante toda la noche (16 a 18 horas).
Inducción química de la expresión de ARN bicatenario en AB301-105(DE3) y BL21(DE3) 15
La expresión de ARN bicatenario del vector recombinante pGBNJ003, en la cepa bacteriana AB301-105(DE3) o BL21(DE3) fue posible ya que estaban presentes todos los componentes genéticos para expresión controlada. En presencia del inductor químico isopropiltiogalactósido, o IPTG, la polimerasa T7 dirigirá la transcripción de la secuencia diana en direcciones tanto antisentido como sentido ya que estas están flanqueadas por promotores de 20 T7 orientados de manera opuesta.
La densidad óptica a 600 nm del cultivo bacteriano de una noche se midió usando un espectrofotómetro adecuado y se ajustó a un valor de 1 mediante la adición de caldo LB reciente. Se transfirieron cincuenta ml de este cultivo a un tubo Falcon™ de 50 ml y el cultivo se centrifugó después a 3000 g a 15 °C durante 10 minutos. Se retiró el 25 sobrenadante y el sedimento bacteriano se resuspendió en 50 ml de medio completo S reciente (medio SNC más 5 µg/ml de colesterol) suplementado con 100 µg/ml de carbenicilina e IPTG 1 mM. Las bacterias se indujeron durante 2 a 4 horas a temperatura ambiente.
Tratamiento con calor de bacterias 30
Las bacterias se destruyeron mediante tratamiento con calor para minimizar el riesgo de contaminación de la dieta artificial en las placas de ensayo. Sin embargo, el tratamiento con calor de las bacterias que expresaban ARN bicatenario no es un requisito previo para inducir la toxicidad hacia los insectos debido a la interferencia de ARN. El cultivo bacteriano inducido se centrifugó a 3000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos, se desechó el 35 sobrenadante y el sedimento se sometió a 80 °C durante 20 minutos en un baño con agua. Después del tratamiento con calor, el sedimento bacteriano se resuspendió en 1,5 ml de agua MilliQ y la suspensión se transfirió a un tubo de microcentrífuga. Se prepararon y usaron diversos tubos en los bioensayos para cada renovación. Los tubos se conservaron a -20 °C hasta su uso posterior.
40
J. Ensayos de laboratorio para probar Escherichia coli que expresan el ARNbc diana de LD010 contra Leptinotarsa decemlineata
Se emplearon dos métodos de bioensayo para ensayar el ARN bicatenario producido en Escherichia coli contra larvas del escarabajo de la patata de colorado: (1) bioensayo basado en dieta artificial, y, (2) bioensayo basado en 45 plantas.
Bioensayos basado en dieta artificial
Se preparó una dieta artificial para el escarabajo de la patata de Colorado como se ha descrito anteriormente en el 50 Ejemplo 4. Se dispensó medio mililitro de dieta en cada uno de los pocillos de una placa de ensayo multipocillo de 48 pocillos (Nunc™). Para cada tratamiento, se aplicaron cincuenta µl de una suspensión de bacterias tratadas con calor de DO 1 (que es equivalente a 5 x 107 células bacterianas) que expresaban ARNbc por vía tópica en la dieta sólida en los pocillos y se dejaron secar las placas en una cabina de flujo laminar. Por tratamiento, se ensayaron cuarenta y ocho larvas de escarabajo de la patata del colorado de 2º estadio, una por cada pocillo que contenía dieta 55 y bacterias. Cada fila de una placa (es decir, 8 pocillos) se consideró como un replicado. Las placas se mantuvieron en la cámara de cría de insectos a una temperatura de 25 ± 2 °C, humedad relativa del 60 ± 5 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Después de cada 4 días, se transfirieron los escarabajos a dieta reciente que contenía bacterias aplicadas por vía tópica. Los escarabajos se evaluaron como vivos o muertos cada día o tres días después de la infestación. Para los supervivientes, se registró el crecimiento y desarrollo en términos de peso 60 larvario en el día 7 después de la infestación.
Para la cepa de E. coli AB301-105(DE3) deficiente en RNasaIII, se ensayaron las bacterias que contenían el plásmido pGBNJ003 y aquellas que contenían el vector vacío pGN29 (referencia al documento WO 00/188121A1) en bioensayos para toxicidad en EPC. Las bacterias que portaban el plásmido pGBNJ003 mostraron un claro 65 aumento en la mortalidad de insectos a lo largo del tiempo, mientras que se observó muy poca o ninguna mortalidad
para pGN29 y control de solo dieta (Figuras 6a-LD y 7a-LD). El crecimiento y desarrollo de supervivientes larvarios del escarabajo de la patata de Colorado, 7 días después de la alimentación con una dieta artificial que contenía bacterias que expresaban ARNbc de LD010 diana, estaba gravemente impedido (Tabla 10-LD, Figura 8a-LD).
Para la cepa de E. coli BL21(DE3), se ensayaron bacterias que contenían plásmido pGBNJ003 y aquellas que 5 contenían el vector vacío pGN29 contra las larvas del escarabajo de la patata de Colorado. Se observaron efectos perjudiciales similares en las larvas alimentadas con dieta suplementada con bacterias BL21(DE3) al igual que para la cepa deficiente en RNasaIII, AB301-105(DE3) (Figuras 6b-LD y 7b-LD). Sin embargo, el número de supervivientes para los cinco clones fue mayor para BL21(DE3) que para AB301-105(DE3); en el día 12, los valores promedio de mortalidad fueron aproximadamente un 25 % menores para esta cepa en comparación con la cepa 10 deficiente en RNasaIII. Asimismo, los pesos promedio de los supervivientes alimentados con dieta que contenía BL21(DE3) que expresaba ARNbc correspondiente a LD010 diana se vieron gravemente reducidos (Tabla 10-LD, Figura 8b-LD).
El retraso en el crecimiento y desarrollo de las larvas de EPC alimentadas con una dieta que contenía cualquiera de 15 las dos cepas bacterianas que alojaban el plásmido pGBNJ003 estaba directamente correlacionado con la inhibición de la alimentación dado que no se observaban excrementos en los pocillos de placas recientes del día 4 en adelante cuando se compararon con bacterias que portaban el vector vacío pGN29 o las de la placa de solo dieta. Esta observación fue similar a aquella en la que se alimentó a los EPC con ARN bicatenario transcrito in vitro aplicado por vía tópica a la dieta artificial (véase el Ejemplo 3D); en este caso, el cese de la alimentación se produjo desde el día 20 2 en adelante en los tratados con dieta.
Bioensayos basados en plantas
Se roció a plantas de patata enteras con suspensiones de bacterias químicamente inducidas que expresaban 25 ARNbc antes alimentar a larvas de EPC con las plantas. Las plantas de patata de la variedad "línea 5" se desarrollaron a partir de tubérculos hasta el estadio de 8-12 hojas desplegadas en una cámara de cultivo de plantas con las siguientes condiciones: 25 ± 2 °C, humedad relativa del 60 %, fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plástico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recortó la base y se cubrió con una fina malla de nailon 30 para permitir el aireamiento, reducir la condensación en su interior e impedir que se escapen las larvas. Se colocaron quince larvas de escarabajo de la patata de Colorado en el estadio larvario L1 en cada planta tratada en la jaula. Las plantas se trataron con una suspensión de E. coli AB301-105(DE3) que portaban los plásmidos pGBNJ003 (clon 1; Figura 7a-LD) o el plásmido pGN29 (clon 1; véase la Figura 7a-LD). Se aplicaron diferentes cantidades de bacterias a las plantas: 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 células bacterianas 35 en 1 ml de una suspensión bacteriana a un valor de densidad óptica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se roció un volumen total de 1,6 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usó una planta por tratamiento en ese ensayo. Se contó el número de supervivientes y se registró el peso de cada superviviente.
El rociado de las plantas con una suspensión de la cepa bacteriana de E. coli AB301-105(DE3) que expresaba 40 ARNbc diana de pGBNJ003 dio lugar a un drástico aumento en la mortalidad de los insectos en comparación con el control de pGN29. El recuento de mortalidad se mantuvo cuando la cantidad de suspensión celular bacteriana se diluyó 9 veces (Figura 9-LD). Los pesos promedio de los supervivientes larvarios en el día 11 en las plantas rociadas con bacterias que portaban el vector pGBNJ003 eran aproximadamente 10 veces menores que los de aquellos de pGN29 (Figura 10-LD). El daño por la alimentación de las larvas de EPC en la planta de la patata 45 rociada con bacterias que contenían el plásmido pGBNJ003 estaba muy reducido en comparación con el daño ocasionado a una planta de patata pulverizada con bacterias que contenían el vector vacío pGN29 (Figura 11-LD).
Estos experimentos demostraron que el ARN bicatenario correspondiente a una secuencia diana de gen de insecto producida en sistemas de expresión de tipo silvestre o deficientes en RNasaIII es tóxico para el insecto en cuanto a 50 aumentos sustanciales en la mortalidad de los insectos y en el retraso en el crecimiento/desarrollo para los supervivientes larvarios. También está claro a partir de estos experimentos que se proporciona un ejemplo para proteger eficazmente a plantas/cultivos del daño por insectos mediante el uso de una pulverización de una formulación que consiste en bacterias que expresan ARN bicatenario correspondiente a un gen diana de insecto.
55
K. Ensayo de diversas densidades de cultivo en suspensión de Escherichia coli que expresan ARNbc de diana de LD010 contra Leptinotarsa decemlineata
La preparación y tratamiento de cultivos bacterianos se describen en el Ejemplo 3J. Se aplicaron diluciones en serie de factor tres de cultivos (comenzando a partir de 0,25 unidades equivalentes) de la cepa de Escherichia coli 60 deficiente en RNasaIII AB301-105(DE3) que expresaba ARN bicatenario de LD010 diana al follaje de la planta de la patata de la variedad "Bintje" en el estadio de 8-12 hojas desplegadas. Se colocaron diez larvas de L1 de L. decemlineata sobre las plantas tratadas con una planta por tratamiento. La puntuación de la mortalidad de insectos y el impedimento del crecimiento se realizó en el día 7 (es decir, 7 días después de la infestación).
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Tal como se muestra en la Figura 14-LD, se registró una alta mortalidad larvaria de EPC (del 90 al 100 %) después de 1 semana cuando se alimentó a los insectos con plantas de patata tratadas con una aplicación tópica mediante una fina pulverización de cultivos inactivados por calor de E. coli que portaban plásmido pGBNJ003 (para la expresión de ARNbc de diana 10) a densidades de 0,25, 0,08 y 0,025 unidades bacterianas. A 0,008 unidades, aproximadamente un tercio de los insectos estaban muertos, sin embargo, los insectos supervivientes eran 5 significativamente más pequeños que aquellos en los grupos de control (E. coli que portaba el vector vacío pGN29 y solo agua). El daño por la alimentación de las larvas de EPC en la planta de la patata rociada con bacterias que contenían el plásmido pGBNJ003 a concentraciones de 0,025 o 0,008 unidades estaba muy reducido en comparación con el daño ocasionado a una planta de patata pulverizada con bacterias que contenían el vector vacío pGN29 (Figura 15-LD). 10
L. Los adultos son extremadamente susceptibles al ARNbc ingerido por vía oral correspondiente a genes diana.
El ejemplo proporcionado a continuación destaca el descubrimiento de que los insectos adultos (y no solo insectos 15 en el estadio larvario) son extremadamente susceptibles al ARNbc ingerido por vía oral correspondiente a genes diana.
Se seleccionaron cuatro genes para este experimento: dianas 2, 10, 14 y 16 (SEC ID Nº: 168, 188, 198 y 220, respectivamente). Se usó como control ARNbc de un fragmento de GFP (SEC ID Nº: 235). Se cogieron al azar 20 adultos jóvenes (de 2 a 3 días de vida) del cultivo de cría en laboratorio sin sesgo hacia el género del insecto. Se seleccionaron diez adultos por tratamiento. Los adultos se mantuvieron previamente en ayuno durante al menos 6 horas antes del comienzo del tratamiento. En el primer día del tratamiento, se dio de comer a cada adulto cuatro discos foliares de patata (1,5 cm2 de diámetro) que se habían tratado previamente con una aplicación tópica de 25 µl de ARNbc diana a 0,1 µg/µl (sintetizado tal como se describe en el Ejemplo 3A; aplicación tópica tal como se 25 describe en el Ejemplo 3E) por disco. Se confinó a cada adulto en una placa de Petri pequeña (3 cm de diámetro) para asegurarse de que todos los insectos habían ingerido cantidades iguales de alimento y por lo tanto recibían las mismas dosis de ARNbc. Al día siguiente se alimentó de nuevo a cada adulto con cuatro discos foliares tratados tal como se ha descrito anteriormente. En el tercer día, se recogieron los diez adultos por tratamiento y se colocaron juntos en una jaula que consistía en una caja de plástico (dimensiones 30 cm x 20 cm x 15 cm) con una fina malla 30 de nailon incorporada en la tapa para proporcionar buena ventilación. Dentro de la caja, se colocó en la base cierta cantidad de papel de filtro humedecido. Se colocó cierta cantidad de follaje de patata (no tratado) sobre el papel para mantener a los adultos durante el experimento. A partir del día 5, se llevaron a cabo evaluaciones regulares para contar el número de insectos muertos, vivos (que se movían) y moribundos. Para evaluar si los insectos estaban moribundos, se colocó a los adultos sobre sus dorsos para comprobar si eran capaces de volver a colocarse en 35 varios minutos; se consideró que un insecto estaba moribundo solo si no era capaz darse la vuelta.
En este experimento se demostraron efectos tóxicos específicos evidentes del ARN bicatenario correspondiente a diferentes dianas en adultos del escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata, (Figure 12-LD). El ARN bicatenario correspondiente a un fragmento de gfp no mostró toxicidad hacia adultos de EPC en el día de la 40 valoración final (día 19). Este experimento demostró claramente que la supervivencia de adultos de EPC se redujo gravemente solo tras unos días de exposición a ARNbc cuando se administró por vía oral. Por ejemplo, para la diana 10, en el día 5, 5 de 10 adultos estaban moribundos (enfermos y se movían lentamente); en el día 6, 4 de cada 10 adultos estaban muertos con tres de los supervivientes moribundos; en el día 9, todos los adultos observados estaban muertos. 45
Como consecuencia de este experimento, la aplicación de los ARN bicatenarios diana contra plagas de insectos pueden ampliarse para incluir las dos fases vitales de una plaga de insecto (es decir, larvas y adultos) que pueden ocasionar un amplio daño a los cultivos, como es el caso del escarabajo de la patata de Colorado.
50
Ejemplo 4: Phaedon cochleariae (escarabajo de la hoja de mostaza)
A. Clonación de una secuencia parcial de los genes de Phaedon cochleariae (escarabajo de la hoja de mostaza) PC001, PC003, PC005, PC010, PC014, PC016 y PC027 mediante PCR de familia
55
Se aisló ARN intacto de alta calidad a partir del estadio larvario de Phaedon cochleariae (escarabajo de la hoja de mostaza; Fuente: Dr. Caroline Muller, Julius-von-Sachs-Institute for Biosciences, Chemical Ecology Group, University of Wuerzburg, Julius-von-Sachs-Platz 3, D-97082 Wuerzburg, Alemania) usando reactivo TRIzoI® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico presente en la preparación de ARN se retiró mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante. Se generó ADNc usando un kit comercialmente disponible 60 (transcriptasa inversa SuperScript® III) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para aislar secuencias de ADNc que comprendían una porción de los genes PC001, PC003, PC005, PC010, PC014, PC016 y PC027, se realizó una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las instrucciones del fabricante. 65
Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificación de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-PC. La Tabla 2-PC muestra genes diana de Phaedon cochleariae que incluyen secuencias cebadoras y secuencias de ADNc obtenidas. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de 5 agarosa, se purificó (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR4/TOPO® (Nº de Cat. K4530-20, Invitrogen™) y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-PC y se citan como las secuencias parciales.
Las secuencias de aminoácidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID Nº respectivas tal como 10 se proporcionan en la Tabla 3-PC, La Tabla 3-PC proporciona secuencias de aminoácidos de clones de ADNc y el inicio de la fase de lectura se indica entre paréntesis.
B. Producción de ARNbc de los genes de Phaedon cochleariae
15
Se sintetizó ARNbc en cantidades de miligramo usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express. En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en dirección 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una orientación diferente con respecto al promotor de T7.
20
Para cada uno de los genes diana, se generó el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso específicos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-PC. La Tabla 8-PC proporciona detalles para preparar fragmentos de ARN de secuencias diana de Phaedon cochleariae, incluyendo secuencias cebadoras.
25
Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: 1 minuto a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 50 °C y 1 minuto a 72 °C seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se generó usando cebadores directos e inversos de T7 específicos en una reacción PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de 30 los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-PC. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificación PCR (kit de purificación PCR Qiaquick®) y precipitación de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-35 PC.
C. Recombinación de los genes de Phaedon cochleariae (escarabajo de la hoja de mostaza) en el vector vegetal pK7GWIWG2D(II)
40
Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actúa a través de fragmentos de ARNbc, las secuencias nucleotídicas diana de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientación antisentido y sentido, separados por el intrón - CmR - intrón, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construcción de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reacción de recombinación LR entre un clon de entrada que contenía attL (véase el Ejemplo 4A) y un 45 vector de destino que contenía attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a través de VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reacción de recombinación de LR se llevó a cabo usando la mezcla enzimática LR Clonase™ II siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos experimentos de clonación produjeron una construcción en horquilla de cada uno de los genes PC001, PC010, PC014, PC016 y PC027, que tenían la orientación promotor - sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido y en el que 50 el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para la transformación en A. tumefaciens.
Se realizaron digestiones con enzimas de restricción en los plásmidos de pCR8/GW/TOPO® que contenían las diferentes dianas (véase el Ejemplo 4B): para PC001, una doble digestión con BsoBI y PvuI; para PC010, una doble 55 digestión con PvuI y PvuII; para PC014, una triple digestión con II, PvuI y XhoI; para PC016, una sola digestión con ApaLI; para PC027, una doble digestión con AvaI y DrdI. La banda que contenía el gen de interés flanqueado por los sitios de attL se purificó usando el kit de extracción en gel Qiaquick®. Se añadió una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 150 ng de pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubó durante al menos 1h a 25 °C. Después del tratamiento con la solución de proteinasa K (10 min a 37°C), la mezcla de recombinación 60 completa se transformó en las células químicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante análisis por digestión de restricción. La secuencia completa de la construcción en horquilla para:
- PC001 (sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido) se representa en la SEC ID Nº: 508;
- PC010 (sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido) se representa en la SEC ID Nº: 509; 65
- PC014 (sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido) se representa en la SEC ID Nº: 510;
- PC016 (sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido) se representa en la SEC ID Nº: 511;
- PC027 (sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido) se representa en la SEC ID Nº: 512;
La Tabla 9-PC proporciona secuencias para cada construcción en horquilla.
5
D. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc, usando discos foliares de colza oleaginosa con respecto a actividad contra larvas de Phaedon cochleariae
El ejemplo proporcionado a continuación es una ejemplificación del hallazgo de que las larvas del escarabajo de la hoja de la mostaza (EHM) son susceptibles a ARNbc ingerido por vía oral correspondiente a los propios genes 10 diana.
Para ensayar las diferentes muestras de ARN bicatenario contra larvas de EHM, se empleó un ensayo disco foliar usando material foliar de colza oleaginosa (Brassica napus variedad SW Oban; Fuente: Nick Balaam, Sw Seed Ltd., 49 North Road, Abington, Cambridge, CB1 6AS, Reino Unido) como fuente de alimentación. Los cultivos de insecto 15 se mantuvieron en la misma variedad de colza oleaginosa en la cámara de insectos a 25 ± 2 °C y una humedad relativa del 60 ± 5 % con un fotoperiodo de 16h de luz/8h de oscuridad. Se cortaron discos de aproximadamente 1,1 cm de diámetro (o 0,95 cm2) de hojas de plantas de colza de 4 a 6 semanas de edad usando un taladro de corteza de tamaño adecuado. Se diluyeron muestras de ARN bicatenario a 0,1 µg/µl en agua Milli-Q que contenía Triton™ X-100 al 0,05 %. Se prepararon discos foliares tratados aplicando 25 µl de la solución diluida de ARNbc diana de 20 PC001, PC003, PC005, PC010, PC014, PC016, PC027 y ARNbc de gfp de control o Triton™ X-100 0,05 % sobre la superficie foliar adaxial. Se dejaron secar los discos foliares y se colocaron individualmente en cada uno de los 24 pocillos de una multiplaca de 24 pocillos que contenían 1 ml de agar al 2 % gelificado que ayuda a evitar que el disco foliar se seque. Se colocaron dos larvas de EHM neonatas en cada pocillo de la placa, que después se cubrió con una tapa de plástico multipocillo. La placa (un tratamiento que contenía 48 insectos) se dividió en 4 replicados 25 de 12 insectos por replicado (cada fila). La placa que contenía los insectos y los discos foliares se mantuvo en una cámara de insectos a 25 ± 2 °C y una humedad relativa del 60 ± 5 % con un fotoperiodo de 16h de luz/8h de oscuridad. Se alimentó a los insectos con discos foliares durante 2 días, tras los cuales se transfirieron a una nueva placa que contenía discos foliares recientemente tratados. A continuación, 4 días después del inicio del bioensayo, los insectos de cada replicado se recogieron y se transfirieron a una placa de Petri que contenía hojas de colza 30 oleaginosa nuevas no tratadas. Se registraron la mortalidad larvaria y el peso promedio en los días 2, 4, 7, 9 y 11.
Las larvas de P. cochleariae alimentadas con hojas de colza oleaginosa tratadas con ARNbc diana desnudo intacto dieron como resultado aumentos significativos en las mortalidades larvarias para todas las dianas ensayadas, tal como se indica en la Figura 1(a). El ARN bicatenario ensayado para PC010 diana ocasionó una mortalidad larvaria 35 del 100 % en el día 9 y para PC027 en el día 11. Para todas las otras dianas, se alcanzaron valores de mortalidad significativamente altos en el día 11 en comparación con el ARNbc de gfp de control, Triton™ X-100 al 0,05 % solamente hoja no tratada: (valor promedio en porcentaje ± intervalo de confianza con alfa 0,05) PC001 (94,4 ± 8,2); PC003 (86,1 ± 4,1); PC005 (83,3 ± 7,8); PC014 (63,9 ± 20,6); PC016 (75,0 ± 16,8); ARNbc de gfp (11,1 ± 8,2); Triton™ X-100 al 0,05 % (19,4 ± 10,5); hoja solamente (8,3 ± 10,5). 40
Los supervivientes larvarios se evaluaron basándose en su peso promedio. Para todas las dianas ensayadas, las larvas del escarabajo de la hoja de mostaza tuvieron pesos promedio significativamente reducidos después del día 4 del bioensayo; los insectos alimentados con ARNbc de gfp o Triton™ X-100 al 0,05 % solamente, se desarrollaron normalmente, al igual que para larvas solamente con hojas (Figura 1(b)-PC). 45
E. Ensayos de laboratorio para explorar ARNbc a diferentes concentraciones usando discos foliares de colza oleaginosa con respecto a la actividad contra larvas de Phaedon cochleariae
Se aplicaron veinticinco µl de una solución de ARNbc PC010 o PC027 diana a concentraciones diez veces en serie 50 desde 0,1 µg/µl hasta 0,1 ng/µl por vía tópica sobre el disco foliar de colza oleaginosa, tal como se ha descrito en el Ejemplo 4D anterior. Como control negativo, se administró solamente Triton™ X-100 al 0,05 % al disco foliar. Por tratamiento, se ensayaron veinticuatro larvas neonatas de escarabajo de la hoja de mostaza, con dos insectos por pocillo. Las placas se conservaron en la cámara de cría de insectos a una temperatura de 25 ± 2 °C, humedad relativa del 60 ± 5 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. En el día 2, las larvas se transfirieron a una 55 nueva placa que contenía discos foliares nuevos tratados con ARNbc. En el día 4 para PC010 diana y en el día 5 para PC027 diana, los insectos de cada replicado se transfirieron a una placa de Petri que contenía material foliar no tratado abundante. Los escarabajos se evaluaron como vivos o muertos en los días 2, 4, 7, 8, 9 y 11 para PC010 diana y 2, 5, 8, 9 y 12 para PC027 diana.
60
La alimentación con discos foliares de colza oleaginosa que contenían ARNbc desnudos intactos de las dos dianas diferentes, PC010 y PC027, a larvas de P. cochleariae dio como resultado altas mortalidades a concentraciones tan bajas como 1 ng de ARNbc/µl de solución, tal como se muestra en las Figuras 2 (a) y (b). Los valores de mortalidad promedio en porcentaje ± intervalo de confianza con alfa 0,05 para diferentes concentraciones de ARNbc para PC010 diana en el día 11, 0 µg/µl: 8,3 ± 9,4; 0,1 µg/µl: 100; 0,01 µg/µl: 79,2 ± 20,6; 0,001 µg/µl: 58,3 ± 9,4; 0,0001 65 µg/µl: 12,5 ± 15,6; y para PC027 diana en el día 12, 0 µg/µl: 8,3 ± 9,4; 0,1 µg/µl: 95,8 ± 8,2; 0,01 µg/µl: 95,8 ± 8,2;
0,001 µg/µl: 83,3 ± 13,3; 0,0001 µg/µl: 12,5 ± 8,2.
F. Clonación de un fragmento génico de EHM en un vector adecuado para la producción bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos
5
A continuación hay un ejemplo de clonación de un fragmento de ADN correspondiente a una diana génica de EHM en un vector para la expresión de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier vector que comprende un promotor de T7 o cualquier otro promotor para la transcripción eficaz en bacterias (referencia al documento WO0001846).
10
Las secuencias de los cebadores específicos usados para la amplificación del fragmento génico diana PC010 se proporcionan en la Tabla 8-PC. El molde usado era el vector pCR8/GW/TOPO® que contenía la secuencia de PC010 (SEC ID Nº: 253). Los cebadores se usaron en una reacción PCR touchdown con las siguientes condiciones: 1 minuto a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C con reducción de la temperatura de -0,5 °C por ciclo y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 50 15 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizó en gel de agarosa, se purificó (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonó con extremos romos en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuenció. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la SEC ID Nº: 488 tal como se proporciona en la Tabla 8-PC. El vector recombinante que porta esta secuencia se denominó pGCDJ001.
20
G. Expresión y producción de una diana de ARN bicatenario en dos cepas de Escherichia coli AB301-105(DE3)
Se siguieron los procedimientos descritos a continuación para expresar niveles adecuados de ARN bicatenario activo en insectos de diana de insectos en bacterias. En este experimento, se usa una cepa deficiente en RNasaIII, 25 AB301-105(DE3).
Transformación de AB301-105(DE3)
Se añadieron trescientos ng del plásmido y se mezclaron suavemente en una alícuota de 50 µl de la cepa de E. coli 30 químicamente competente enfriada en hielo AB301-105(DE3). Las células se incubaron sobre hielo durante 20 minutos antes de someterlas a un tratamiento de choque térmico de 37 °C durante 5 minutos, después de los cuales se pusieron de nuevo sobre hielo durante 5 minutos adicionales. Se añadieron cuatrocientos cincuenta µl de medio SOC a temperatura ambiente a las células y la suspensión se incubó en un agitador (250 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Se transfirieron cien µl de la suspensión de células bacterianas a un matraz cónico de 500 ml que contenía 150 35 ml de caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) líquido suplementado con 100 µg/ml de antibiótico de carbenicilina. El cultivo se incubó en un agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37 °C durante toda la noche (16 a 18 horas).
Inducción química de la expresión de ARN bicatenario en AB301-105(DE3)
40
La expresión de ARN bicatenario del vector recombinante pGCDJ001, en la cepa bacteriana AB301-105(DE3) fue posible ya que estaban presentes todos los componentes genéticos para expresión controlada. En presencia del inductor químico isopropiltiogalactósido, o IPTG, la polimerasa T7 dirigirá la transcripción de la secuencia diana en direcciones tanto antisentido como sentido ya que estas están flanqueadas por promotores de T7 orientados de manera opuesta. 45
La densidad óptica a 600 nm del cultivo bacteriano de una noche se midió usando un espectrofotómetro adecuado y se ajustó a un valor de 1 mediante la adición de caldo LB reciente. Se transfirieron cincuenta ml de este cultivo a un tubo Falcon™ de 50 ml y el cultivo se centrifugó después a 3000 g a 15 °C durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante y el sedimento bacteriano se resuspendió en 50 ml de medio completo S reciente (medio SNC más 5 50 µg/ml de colesterol) suplementado con 100 µg/ml de carbenicilina e IPTG 1 mM. Las bacterias se indujeron durante 2 a 4 horas a temperatura ambiente.
Tratamiento con calor de bacterias
55
Las bacterias se destruyeron mediante tratamiento con calor para minimizar el riesgo de contaminación de la dieta artificial en las placas de ensayo. Sin embargo, el tratamiento con calor de las bacterias que expresaban ARN bicatenario no es un requisito previo para inducir la toxicidad hacia los insectos debido a la interferencia de ARN. El cultivo bacteriano inducido se centrifugó a 3000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos, se desechó el sobrenadante y el sedimento se sometió a 80 °C durante 20 minutos en un baño con agua. Después del tratamiento 60 con calor, el sedimento bacteriano se resuspendió en un volumen total de 50 ml de solución de Triton™ X-100 al 0,05 %. El tubo se almacenó a 4 °C hasta su uso posterior.
H. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Phaedon cochleariae
Bioensayos de disco foliar
5
Se empleó el método de bioensayo de disco foliar para ensayar ARN bicatenario de PC010 diana producido en Escherichia coli (a partir de plásmido pGCDJ001) contra larvas del escarabajo de la hoja de mostaza. Se prepararon discos foliares a partir de follaje de colza oleaginosa, tal como se describe en el Ejemplo 4. En cada disco se pipetearon veinte µl de una suspensión bacteriana, con una medición de densidad óptica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. El disco foliar se colocó en un pocillo de una placa multipocillo de 24 pocillos que contenía 1 ml de 10 agar gelificado. En cada disco foliar se añadieron dos larvas neonatas. Para cada tratamiento, se prepararon 3 replicados de 16 larvas neonatas por cada replicado. Las placas se mantuvieron en la cámara de cría de insectos a una temperatura de 25 ± 2 °C y una humedad relativa del 60 ± 5 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. En el día 3 (es decir, 3 días después del comienzo del bioensayo), las larvas se transfirieron a una nueva placa que contenía discos foliares nuevos tratados (misma dosificación). El material foliar se renovó cada dos días a 15 partir del día 5 en adelante. El bioensayo se puntuó en mortalidad y peso promedio. Los controles negativos fueron discos foliares tratados con bacterias que portaban el plásmido pGN29 (vector vacío) y solamente hoja.
Se ha mostrado un claro aumento de la mortalidad de larvas de P. cochleariae con el tiempo después de alimentar a los insectos con hojas de colza oleaginosa tratadas con una suspensión de cepa de E. coli deficiente en RNasaIII 20 ABC301-105(DE3) que contienen el plásmido pGCDJ001, mientras que se observó muy poca o ninguna mortalidad de insectos en el caso de bacterias con el plásmido pGN29 o control solamente con hojas (Figura 3-PC).
Bioensayos basados en plantas
25
Se rocían plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas químicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los EHM con las plantas. Las plantas se cultivan en una cámara de crecimiento vegetal. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plástico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recortó la base y se cubrió con una fina malla de nailon para permitir el aireamiento, reducir la condensación en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan 30 EHM en cada planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspensión de E. coli AB301-105(DE3) que portan el plásmido pGCDJ001 o el plásmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 células bacterianas en 1 ml de una suspensión bacteriana a un valor de densidad óptica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se rocía un volumen total de entre 1 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este 35 ensayo. Se cuenta el número de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.
El rociado de las plantas con una suspensión de la cepa bacteriana de E. coli AB301-105(DE3) que expresa ARNbc diana de pGCDJ001 da lugar a un drástico aumento en la mortalidad de los insectos en comparación con el control de pGN29. Estos experimentos demuestran que el ARN bicatenario correspondiente a una secuencia diana de gen 40 de insecto producida en sistemas de expresión bacteriana de tipo silvestre o deficientes en RNasaIII es tóxico para el insecto en cuanto a aumentos sustanciales en la mortalidad de los insectos y en el retraso en el crecimiento/desarrollo para los supervivientes larvarios. También está claro a partir de estos experimentos que se proporciona un ejemplo para proteger eficazmente a plantas/cultivos del daño por insectos mediante el uso de una pulverización de una formulación que consiste en bacterias que expresan ARN bicatenario correspondiente a un gen 45 diana de insecto.
Ejemplo 5: Epilachna varivetis (Escarabajo del frijol mexicano)
A. Clonación de secuencias génicas parciales de Epilachna varivetis 50
Se aisló ARN intacto de alta calidad de 4 fases larvarias diferentes de Epilachna varivetis (escarabajo del frijol mexicano; Fuente: Thomas Dorsey, Supervising Entomologist, New Jersey Department of Agriculture, Division of Plant. Industry, Bureau of Biological Pest Control, Phillip Alampi Beneficial Insect Laboratory, PO Box 330, Trenton, Nueva Jersey 08625-0330, EE.UU.) usando reactivo TRIzoI® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN 55 genómico presente en la preparación de ARN se retiró mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante (Nº de Cat. 1700, Promega). El ADNc se generó usando un kit comercialmente disponible (Transcriptasa inversa SuperScript® III) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para aislar secuencias de ADNc que comprendían una porción de los genes EV005, EV009, EV010, EV015 y 60 EV016, se realizó una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las instrucciones del fabricante.
Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificación de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-EV, que muestra genes diana de Epilachna varivetis que incluyen las secuencias 65 cebadoras y las secuencias de ADNc obtenidas. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las
siguientes condiciones: para EV005 y EV009, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 50°C y 1 minuto 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C; para EV014, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 53 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 7 minutos a 72 °C; para EV010 y EV016, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 40 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de 5 agarosa, se purificaron (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR4/TOPO® y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-EV y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoácidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-EV, en la que el inicio de la fase de lectura se indica entre paréntesis. 10
B. Producción de ARNbc de los genes de Epilachna varivetis
Se sintetizó ARNbc en cantidades de miligramo usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express. En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en 15 dirección 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una orientación diferente con respecto al promotor de T7.
Para cada uno de los genes diana, se generó el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso específicos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de 20 los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-EV.
Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: 1 minuto a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 50 °C y 1 minuto a 72 °C seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se generó usando 25 cebadores directos e inversos de T7 específicos en una reacción PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-EV. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificación PCR (kit de purificación PCR Qiaquick®) y precipitación de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se 30 hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-EV.
C. Recombinación de los genes de Epilachna varivetis en el vector vegetal pK7GWIWG2D(II) 35
Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actúa a través de fragmentos de ARNbc, las secuencias nucleotídicas diana de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientación antisentido y sentido, separados por el intrón - CmR - intrón, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construcción de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron 40 usando la reacción de recombinación LR entre un clon de entrada que contenía attL (véase el Ejemplo 1) y un vector de destino que contenía attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a través de VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reacción de recombinación de LR se llevó a cabo usando la mezcla enzimática LR Clonase™ II siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos experimentos de clonación dieron como resultado una construcción en horquilla para cada uno de los genes diana, 45 que tenían la orientación promotor - sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido y en el que el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para la transformación en A. tumefaciens.
Se realizaron digestiones con enzimas de restricción en los plásmidos de pCR8/GW/TOPO® que contenían las 50 diferentes dianas (véase el Ejemplo B). La banda que contenía el gen de interés flanqueado por los sitios de attL se purificó usando el kit de extracción en gel Qiaquick®. Se añadió una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 150 ng de pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubó durante al menos 1h a 25 °C. Después del tratamiento con la solución de proteinasa K (10 min a 37°C), la mezcla de recombinación completa se transformó en las células químicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante análisis por 55 digestión de restricción.
D. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc usando discos foliares de judía con respecto a actividad contra larvas de Epilachna varivetis
60
El ejemplo proporcionado a continuación es una ejemplificación del hallazgo de que las larvas del escarabajo del frijol mexicano (EFM) son susceptibles a ARNbc ingerido por vía oral correspondiente a los propios genes diana.
Para ensayar las diferentes muestras de ARN bicatenario contra larvas de EFM, se empleó un ensayo de disco foliar usando material foliar de judía verde (Phaseolus vulgaris variedad Montano; Fuente: Aveve NV, Bélgica) como 65 fuente de alimentación. La misma variedad de judías se usó para mantener cultivos de insectos en la cámara de
insectos 25 ± 2 °C y una humedad relativa del 60 ± 5 % con un fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad. Se cortaron discos de aproximadamente 1,1 cm de diámetro (o 0,95 cm2) de hojas de plantas de judía de 1 a 2 semanas de edad usando un taladro de corteza de tamaño adecuado. Se diluyeron muestras de ARN bicatenario a 1 µg/µl en agua Milli-Q que contenía Triton™ X-100 al 0,05 %. Se prepararon discos foliares tratados aplicando 25 µl de la solución diluida de ARNbc diana de EV005, EV010, EV015, EV016 y ARNbc de gfp de control o Triton™ X-100 5 0,05 % sobre la superficie foliar adaxial. Se dejaron secar los discos foliares y se colocaron individualmente en cada uno de los 24 pocillos de una multiplaca de 24 pocillos que contenían 1 ml de agar al 2 % gelificado que ayuda a evitar que el disco foliar se seque. Se colocó una única larva de EFM neonata en cada pocillo de una placa, que después se cubrió con una tapa de plástico multipocillo. La placa se dividió en 3 replicados de 8 insectos por replicado (fila). La placa que contenía los insectos y los discos foliares se mantuvo en una cámara de insectos a 25 ± 10 2 °C y una humedad relativa del 60 ± 5 % con un fotoperiodo de 16h de luz/8h de oscuridad. Los insectos se alimentaron de los discos foliares durante 2 días, después de lo cual los insectos se transfirieron a una nueva placa que contenía discos foliares recién tratados. A continuación, 4 días después del inicio del bioensayo, los insectos se transfirieron a una placa de Petri que contenía hojas de judía frescas no tratadas cada día hasta el día 10. La mortalidad de los insectos se registró el día 2 y después cada dos días. 15
La alimentación con hojas de judía verde que contenían ARNbc diana desnudos intactos aplicados en superficie a larvas de E. varivestis dio como resultado aumentos significativos de las mortalidades larvarias, tal como se indica en la Figura 1. Los ARN bicatenarios ensayados de las dianas EV010, EV015 y EV016 condujeron a un 100 % de mortalidad después de 8 días, mientras que el ARNbc de EV005 diana tardó 10 días en matar a todas las larvas. La 20 mayoría de los insectos alimentados con discos foliares tratados que contenían ARNbc de gfp de control o solamente el tensioactivo Triton™ X-100 se mantuvieron durante todo el bioensayo (Figura 1-EV).
E. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc usando discos foliares de judía con respecto a actividad contra adultos de Epilachna varivestis 25
El ejemplo proporcionado a continuación es una ejemplificación del hallazgo de que los adultos del escarabajo del frijol mexicano son susceptibles a ARNbc ingerido por vía oral correspondiente a los propios genes diana.
En una preparación de bioensayo similar a la de las larvas del escarabajo del frijol mexicano, se ensayaron EFM 30 adultos frente a ARN bicatenario aplicado por vía tópica a discos foliares de judía. El ARNbc de ensayo de cada diana EV010, EV015 y EV016 se diluyó en Triton™ X-100 al 0,05 % hasta una concentración final de 0,1 µg/µl. Se trataron discos foliares de judía mediante aplicación tópica de 30 µl de la solución de ensayo a cada disco. Se dejó que los discos se secaran completamente antes de colocar cada uno en un corte de agar al 2 % gelificado en cada pocillo de una placa multipocillo de 24 pocillos. Se recogieron adultos de tres días de edad de las jaulas de cultivo y 35 no se les alimentó durante 7-8 horas antes de colocar un adulto en cada pocillo de la placa de bioensayo (por lo tanto, 24 adultos por tratamiento). Las placas se mantuvieron en la cámara de cría de insectos (en las mismas condiciones que para las larvas de EFM durante 24 horas) después de lo cual los adultos se transfirieron a una nueva placa que contenía discos foliares tratados con ARNbc nuevos. Después de 24 horas adicionales, los adultos de cada tratamiento se recogieron y se colocaron en una caja de plástico con dimensiones de 30 cm x 15 cm x 10 40 cm que contenían dos plantas de judía en macetas y no tratadas de 3 semanas de edad. Se evaluó la mortalidad de los insectos desde el día 4 hasta el día 11.
Los tres ARNbc diana (EV010, EV015 y EV016) ingeridos por adultos Epilachna varivestis dieron como resultado aumentos significativos de la mortalidad del día 4 (4 después del comienzo del bioensayo), como se muestra en la 45 Figura 2(a)-EV. A partir del día 5, se observaron cambios drásticos en los patrones de alimentación entre insectos a los que se alimentó inicialmente con discos foliares de judía tratados con ARNbc diana y los que se alimentaron con discos que contenían ARNbc de gfp de control o tensioactivo Triton™ X-100. Fueron claramente visibles reducciones en el daño foliar por adultos EFM en plantas de judía no tratadas para las tres dianas en comparación con controles de ARNbc de gfp y de solamente tensioactivo, aunque a distintos niveles; los insectos alimentados con diana 15 50 provocaron el menor daño al follaje de la judía (Figura 2(b)-EV).
F. Clonación de un fragmento génico de EFM en un vector adecuado para la producción bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos
55
A continuación hay un ejemplo de clonación de un fragmento de ADN correspondiente a una diana génica de EHM en un vector para la expresión de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier vector que comprende un promotor de T7 o cualquier otro promotor para la transcripción eficaz en bacterias (referencia al documento WO0001846).
60
Las secuencias de los cebadores específicos usados para la amplificación de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-EV. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los cebadores se usan en una reacción PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizó en gel de agarosa, se purificó (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonó con extremos 65 romos en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuenció. La secuencia del producto PCR resultante
corresponde a la secuencia respectiva tal como se proporciona en la Tabla 8-EV.
G. Expresión y producción de una diana de ARN bicatenario en dos cepas de Escherichia coli: (1) AB301-105(DE3), y, (2) BL21(DE3)
5
Se siguieron los procedimientos descritos a continuación para expresar niveles adecuados de ARN bicatenario activo en insectos de diana de insectos en bacterias. Se usó una cepa deficiente en RNasaIII, AB301-105(DE3), en comparación con bacterias que contenían RNasaIII de tipo silvestre, BL21(DE3).
Transformación de AB301-105(DE3) y BL21(DE3) 10
Se añadieron trescientos ng del plásmido y se mezclaron suavemente en una alícuota de 50 µl de la cepa de E. coli químicamente competente enfriada en hielo AB301-105(DE3) o BL21(DE3). Las células se incubaron sobre hielo durante 20 minutos antes de someterlas a un tratamiento de choque térmico de 37 °C durante 5 minutos, después de los cuales se pusieron de nuevo sobre hielo durante 5 minutos adicionales. Se añadieron cuatrocientos cincuenta 15 µl de medio SOC a temperatura ambiente a las células y la suspensión se incubó en un agitador (250 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Se transfirieron cien µl de la suspensión de células bacterianas a un matraz cónico de 500 ml que contenía 150 ml de caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) líquido suplementado con 100 µg/ml de antibiótico de carbenicilina. El cultivo se incubó en un agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37 °C durante toda la noche (16 a 18 horas). 20
Inducción química de la expresión de ARN bicatenario en AB301-105(DE3) y BL21(DE3)
La expresión de ARN bicatenario a partir del vector recombinante en la cepa bacteriana AB301-105(DE3) o BL21(DE3) fue posible ya que estaban presentes todos los componentes genéticos para expresión controlada. En 25 presencia del inductor químico isopropiltiogalactósido, o IPTG, la polimerasa T7 dirigirá la transcripción de la secuencia diana en direcciones tanto antisentido como sentido ya que estas están flanqueadas por promotores de T7 orientados de manera opuesta.
La densidad óptica a 600 nm del cultivo bacteriano de una noche se midió usando un espectrofotómetro adecuado y 30 se ajustó a un valor de 1 mediante la adición de caldo LB reciente. Se transfirieron cincuenta ml de este cultivo a un tubo Falcon™ de 50 ml y el cultivo se centrifugó después a 3000 g a 15 °C durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante y el sedimento bacteriano se resuspendió en 50 ml de medio completo S reciente (medio SNC más 5 µg/ml de colesterol) suplementado con 100 µg/ml de carbenicilina e IPTG 1 mM. Las bacterias se indujeron durante 2 a 4 horas a temperatura ambiente. 35
Tratamiento con calor de bacterias
Las bacterias se destruyeron mediante tratamiento con calor para minimizar el riesgo de contaminación de la dieta artificial en las placas de ensayo. Sin embargo, el tratamiento con calor de las bacterias que expresaban ARN 40 bicatenario no es un requisito previo para inducir la toxicidad hacia los insectos debido a la interferencia de ARN. El cultivo bacteriano inducido se centrifugó a 3000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos, se desechó el sobrenadante y el sedimento se sometió a 80 °C durante 20 minutos en un baño con agua. Después del tratamiento con calor, el sedimento bacteriano se resuspendió en 1,5 ml de agua MilliQ y la suspensión se transfirió a un tubo de microcentrífuga. Se prepararon y usaron diversos tubos en los bioensayos para cada renovación. Los tubos se 45 conservaron a -20 °C hasta su uso posterior.
H. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Epilachna varivetis
50
Bioensayos basados en plantas
Se rocían plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas químicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los EFM con las plantas. Se cultivan en una cámara de cultivo de plantas. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plástico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente 55 colocado en el suelo en una maceta y se recortó la base y se cubrió con una fina malla de nailon para permitir el aireamiento, reducir la condensación en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan EFM en cada planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspensión de E. coli AB301-105(DE3) que portan el vector recombinante o el plásmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 células bacterianas en 1 ml de una suspensión bacteriana a un 60 valor de densidad óptica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se rocía un volumen total de entre 1 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este ensayo. Se cuenta el número de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.
El rociado de las plantas con una suspensión de la cepa bacteriana de E. coli AB301-105(DE3) que expresa ARNbc 65 diana de vector recombinante da lugar a un drástico aumento en la mortalidad de los insectos en comparación con el
control de pGN29. Estos experimentos demuestran que el ARN bicatenario correspondiente a una secuencia diana de gen de insecto producida en sistemas de expresión bacteriana de tipo silvestre o deficientes en RNasaIII es tóxico para el insecto en cuanto a aumentos sustanciales en la mortalidad de los insectos y en el retraso en el crecimiento/desarrollo para los supervivientes larvarios. También está claro a partir de estos experimentos que se proporciona un ejemplo para proteger eficazmente a plantas/cultivos del daño por insectos mediante el uso de una 5 pulverización de una formulación que consiste en bacterias que expresan ARN bicatenario correspondiente a un gen diana de insecto.
Ejemplo 6: Anthonomus grandis (grillo de la cápsula del algodonero)
10
A. Clonación de secuencias parciales de Anthonomus grandis
Se aisló ARN intacto, de alta calidad de las 3 fases de Anthonomus grandis (grillo de la cápsula del algodonero; Fuente: Dr. Gary Benzon, Benzon Research Inc., 7 Kuhn Drive, Carlisle, Pennsylvania 17013, EE.UU.) usando reactivo TRIzoI® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico presente en la preparación de ARN se 15 retiró mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante. Se generó ADNc usando un kit comercialmente disponible (transcriptasa inversa SuperScript® III) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para aislar secuencias de ADNc que comprendían una porción de los genes AG001, AG005, AG010, AG014 y AG016, se realizó una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las 20 instrucciones del fabricante.
Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificación de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-AG. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: para AG001, AG005 y AG016, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 25 minuto a 50°C y 1 minuto y 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C; para AG010, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 2 minutos y 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C; para AG014, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 7 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR8/GW/TOPO® y se secuenciaron. 30 Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-AG y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoácidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-AG,
B. Producción de ARNbc de los genes de Anthonomus grandis (grillo de la cápsula del algodonero) 35
Se sintetizó ARNbc en cantidades de miligramo usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express. En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en dirección 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una orientación diferente con respecto al promotor de T7. 40
Para cada uno de los genes diana, se generó el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso específicos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-AG. Se realizó una PCR touchdown de la siguiente manera: 1 minuto a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C con reducción de la temperatura de 0,5 45 °C por ciclo y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 50 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se generó usando cebadores directos e inversos de T7 específicos en una reacción PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-AG. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron 50 mediante el kit de purificación PCR (kit de purificación PCR Qiaquick®) y precipitación de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-AG.
55
C. Recombinación de los genes de Anthonomus grandis en el vector vegetal pK7GWIWG2D(II)
Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actúa a través de fragmentos de ARNbc, las secuencias nucleotídicas diana de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientación antisentido y sentido, separados por el intrón - CmR - intrón, en el que CmR es el marcador de resistencia a 60 cloranfenicol, para formar una construcción de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reacción de recombinación LR entre un clon de entrada que contenía attL (véase el Ejemplo 1) y un vector de destino que contenía attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a través de VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reacción de recombinación de LR se llevó a cabo usando la mezcla enzimática LR Clonase™ II siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos 65 experimentos de clonación dieron como resultado una construcción en horquilla para cada uno de los genes diana,
que tenían la orientación promotor - sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido y en la que el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para la transformación en A. tumefaciens.
Se realizaron digestiones con enzimas de restricción en los plásmidos de pCR8/GW/TOPO® que contenían las 5 diferentes dianas (véase el Ejemplo 2). La banda que contenía el gen de interés flanqueado por los sitios de attL se purificó usando el kit de extracción en gel Qiaquick®. Se añadió una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 150 ng de pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubó durante al menos 1h a 25 °C. Después del tratamiento con la solución de proteinasa K (10 min a 37°C), la mezcla de recombinación completa se transformó en las células químicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante análisis por 10 digestión de restricción.
D. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc, usando dieta artificial con respecto a actividad contra las larvas del grillo de la cápsula del algodonero, Anthonomus grandis. Se mantiene un cultivo de grillos de la cápsula del algodonero, Anthonomus grandis, con dieta artificial. Para los bioensayos, se recogen huevos de 15 grillo de la cápsula del algodonero y se preparan tal como se ha descrito anteriormente y se colocan en una placa de Petri sobre papel de filtro húmedo. Los huevos se incuban en oscuridad a 25 ± 2 °C y una humedad relativa del 65 ± 5 % durante tres días para obtener larvas de primera fase. Estas larvas se usan en superposición de superficie de la dieta y bioensayos de incorporación para ensayar ARNbc correspondiente a genes diana de GCA AG001, AG005, AG010, AG014 y AG016. 20
Para el bioensayo de superposición de superficie de la dieta, se aplican por vía tópica 25 µl muestras de ARN bicatenario a una concentración de 1 µg/µl a 500 µl dieta establecida en cada pocillo. Para el bioensayo de incorporación en la dieta, se mezclan 50 µl de ARNbc (1 µg/µl) con 500 µl dieta establecida (a una temperatura aproximada de 45 °C). En ambos bioensayos, las placas se dejan secar en una cabina de flujo laminar horizontal. Se 25 transfieren larvas de grillos de la cápsula del algodonero L1 a la dieta con un insecto por pocillo. Se ensayan cuarenta y ocho insectos en total para cada uno de los tratamientos.
Se realizan evaluaciones a intervalos diarios hasta el día 7 (7 días después del inicio del bioensayo). En cada evaluación los insectos se evalúan como vivos o muertos y se examinan en busca de anomalías. Durante la prueba 30 las condiciones de ensayo son 25 ± 2 °C y una humedad relativa del 65 ± 5 %, con un fotoperiodo de 14:10 horas de luz:oscuridad.
E. Clonación de un fragmento génico de GCA en un vector adecuado para la producción bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos 35
A continuación hay un ejemplo de clonación de un fragmento de ADN correspondiente a una diana génica de GCA en un vector para la expresión de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier vector que comprende un promotor de T7 o cualquier otro promotor para la transcripción eficaz en bacterias (referencia al documento WO0001846). 40
Las secuencias de los cebadores específicos usados para la amplificación de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-AG. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los cebadores se usan en una reacción PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR 45 resultante se analizó en gel de agarosa, se purificó (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonó con extremos romos en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuenció. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la secuencia respectiva tal como se proporciona en la Tabla 8.
F. Expresión y producción de una diana de ARN bicatenario en dos cepas de Escherichia coli: (1) AB301-50 105(DE3), y, (2) BL21(DE3)
Se siguieron los procedimientos descritos a continuación para expresar niveles adecuados de ARN bicatenario activo en insectos de diana de insectos en bacterias. Se usó una cepa deficiente en RNasaIII, AB301-105(DE3), en comparación con bacterias que contenían RNasaIII de tipo silvestre, BL21(DE3). 55
Transformación de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)
Se añadieron trescientos ng del plásmido y se mezclaron suavemente en una alícuota de 50 µl de la cepa de E. coli químicamente competente enfriada en hielo AB301-105(DE3) o BL21(DE3). Las células se incubaron sobre hielo 60 durante 20 minutos antes de someterlas a un tratamiento de choque térmico de 37 °C durante 5 minutos, después de los cuales se pusieron de nuevo sobre hielo durante 5 minutos adicionales. Se añadieron cuatrocientos cincuenta µl de medio SOC a temperatura ambiente a las células y la suspensión se incubó en un agitador (250 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Se transfirieron cien µl de la suspensión de células bacterianas a un matraz cónico de 500 ml que contenía 150 ml de caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) líquido suplementado con 100 µg/ml de antibiótico de 65 carbenicilina. El cultivo se incubó en un agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37 °C durante toda la noche (16 a 18
horas).
Inducción química de la expresión de ARN bicatenario en AB301-105(DE3) y BL21(DE3)
La expresión de ARN bicatenario a partir del vector recombinante en la cepa bacteriana AB301-105(DE3) o 5 BL21(DE3) fue posible ya que estaban presentes todos los componentes genéticos para expresión controlada. En presencia del inductor químico isopropiltiogalactósido, o IPTG, la polimerasa T7 dirigirá la transcripción de la secuencia diana en direcciones tanto antisentido como sentido ya que estas están flanqueadas por promotores de T7 orientados de manera opuesta.
10
La densidad óptica a 600 nm del cultivo bacteriano de una noche se midió usando un espectrofotómetro adecuado y se ajustó a un valor de 1 mediante la adición de caldo LB reciente. Se transfirieron cincuenta ml de este cultivo a un tubo Falcon™ de 50 ml y el cultivo se centrifugó después a 3000 g a 15 °C durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante y el sedimento bacteriano se resuspendió en 50 ml de medio completo S reciente (medio SNC más 5 µg/ml de colesterol) suplementado con 100 µg/ml de carbenicilina e IPTG 1 mM. Las bacterias se indujeron durante 15 2 a 4 horas a temperatura ambiente.
Tratamiento con calor de bacterias
Las bacterias se destruyeron mediante tratamiento con calor para minimizar el riesgo de contaminación de la dieta 20 artificial en las placas de ensayo. Sin embargo, el tratamiento con calor de las bacterias que expresaban ARN bicatenario no es un requisito previo para inducir la toxicidad hacia los insectos debido a la interferencia de ARN. El cultivo bacteriano inducido se centrifugó a 3000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos, se desechó el sobrenadante y el sedimento se sometió a 80 °C durante 20 minutos en un baño con agua. Después del tratamiento con calor, el sedimento bacteriano se resuspendió en 1,5 ml de agua MilliQ y la suspensión se transfirió a un tubo de 25 microcentrífuga. Se prepararon y usaron diversos tubos en los bioensayos para cada renovación. Los tubos se conservaron a -20 °C hasta su uso posterior.
G. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Anthonomus grandis 30
Bioensayos basados en plantas
Se rocían plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas químicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los GCA con las plantas. Se cultivan en una cámara de cultivo de plantas. Las plantas se cubrieron 35 colocando una botella de plástico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recortó la base y se cubrió con una fina malla de nailon para permitir el aireamiento, reducir la condensación en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan GCA en cada planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspensión de E. coli AB301-105(DE3) que portan el vector recombinante o el plásmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y 40 7 unidades, donde una unidad se define como 109 células bacterianas en 1 ml de una suspensión bacteriana a un valor de densidad óptica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se rocía un volumen total de entre 1 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este ensayo. Se cuenta el número de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.
45
El rociado de las plantas con una suspensión de la cepa bacteriana de E. coli AB301-105(DE3) que expresa ARNbc diana de vector recombinante da lugar a un drástico aumento en la mortalidad de los insectos en comparación con el control de pGN29. Estos experimentos demuestran que el ARN bicatenario correspondiente a una secuencia diana de gen de insecto producida en sistemas de expresión bacteriana de tipo silvestre o deficientes en RNasaIII es tóxico para el insecto en cuanto a aumentos sustanciales en la mortalidad de los insectos y en el retraso en el 50 crecimiento/desarrollo para los supervivientes larvarios. También está claro a partir de estos experimentos que se proporciona un ejemplo para proteger eficazmente a plantas/cultivos del daño por insectos mediante el uso de una pulverización de una formulación que consiste en bacterias que expresan ARN bicatenario correspondiente a un gen diana de insecto.
55
Ejemplo 7: Tribolium castaneum (escarabajo rojo de la harina)
A. Clonación de secuencias parciales de Tribolium castaneum
Se aisló ARN intacto de alta calidad de todos los estadios diferentes de Tribolium castaneum (escarabajo rojo de la 60 harina; Fuente: Dr. Lara Senior, Insect Investigations Ltd., Capital Business Park, Wentloog, Cardiff, CF3 2PX, Gales, Reino Unido) usando reactivo TRIzoI® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico presente en la preparación de ARN se retiró mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante. Se generó ADNc usando un kit comercialmente disponible (transcriptasa inversa SuperScript® III) siguiendo las instrucciones del fabricante. 65
Para aislar secuencias de ADNc que comprendían una porción de los genes TC001, TC002, TC010, TC014 y TC015, se realizó una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las instrucciones del fabricante.
Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificación de cada uno de los genes se 5 proporcionan en la Tabla 2-TC. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 50°C y 1 minuto y 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C (TC001, TC014, TC015); 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 2 minutos y 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C (TC010); 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 53 °C y 1 minuto a 72 °C, 10 seguido de 7 minutos a 72 °C (TC002). Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR8/GW/TOPO® y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-TC y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoácidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-TC. 15
B. Producción de ARNbc de los genes de Tribolium castaneum
Se sintetizó ARNbc en cantidades de miligramo usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express. En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en 20 dirección 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una orientación diferente con respecto al promotor de T7.
Para cada uno de los genes diana, se generó el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso específicos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de 25 los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-TC. Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: 1 minuto a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C (-0,5 °C/ciclo) y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 50 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se generó usando cebadores directos e inversos de T7 específicos en una reacción PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos 30 cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-TC. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificación PCR (kit de purificación PCR Qiaquick®) y precipitación de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante 35 para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-TC.
C. Recombinación de los genes de Tribolium castaneum en el vector vegetal pK7GWIWG2D(II)
Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actúa a través de fragmentos de ARNbc, las secuencias 40 nucleotídicas diana de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientación antisentido y sentido, separados por el intrón - CmR - intrón, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construcción de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reacción de recombinación LR entre un clon de entrada que contenía attL (véase el Ejemplo 1) y un vector de destino que contenía attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a través de 45 VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reacción de recombinación de LR se llevó a cabo usando la mezcla enzimática LR Clonase™ II siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos experimentos de clonación dieron como resultado una construcción en horquilla para cada uno de los genes diana, que tenían la orientación promotor - sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido y en el que el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para 50 la transformación en A. tumefaciens.
Se realizaron digestiones con enzimas de restricción en los plásmidos de pCR8/GW/TOPO® que contenían las diferentes dianas (véase el Ejemplo 2). La banda que contenía el gen de interés flanqueado por los sitios de attL se purificó usando el kit de extracción en gel Qiaquick®. Se añadió una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 55 150 ng de pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubó durante al menos 1h a 25 °C. Después del tratamiento con la solución de proteinasa K (10 min a 37°C), la mezcla de recombinación completa se transformó en las células químicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante análisis por digestión de restricción.
60
D. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc, usando dieta artificial para actividad contra larvas de Tribolium castaneum
El ejemplo proporcionado a continuación es una ejemplificación del hallazgo de que las larvas del escarabajo rojo de la harina (ERH) son susceptibles a ARNbc ingerido por vía oral correspondiente a los propios genes diana. 65
Se mantuvieron escarabajos rojos de la harina, Tribolium castaneum, en Insect Investigations Ltd. (origen: Imperial College of Science, Technology and Medicine, Silwood Park, Berkshire, Reino Unido). Los insectos se cultivaron de acuerdo con SOP/251/01 de la compañía. En resumen, los escarabajos se alojaron en jarras o tanques de plástico. Estos tienen una parte superior abierta para permitir la ventilación. Se ajustó una pieza de malla sobre la parte superior y se fija con una banda elástica para evitar la fuga. Se colocó medio de cría de larvas (harina) en el 5 recipiente en el que pueden criarse los escarabajos. Las colonias de escarabajos producidas almacenadas se mantuvieron en una habitación a temperatura controlada a 25 ± 3 °C con un ciclo de luz:oscuridad de 16:8 horas.
Se incorporó ARN bicatenario de TC014 diana (con la secuencia correspondiente a SEC ID Nº: 799) a una mezcla de harina y leche en polvo (harina integral: leche en polvo a una relación de 4:1) y se dejó secar durante toda la 10 noche. Cada replicado se preparó por separado: Se añadieron 100 µl de una solución de ARNbc 10 µg/µl (1 mg de ARNbc) a una mezcla de 0,1 g harina/leche. Se molió la mezcla seca en un polvo fino. Los insectos se mantuvieron dentro de placas de Petri (diámetro de 55 mm), revestido con una doble capa de papel de filtro. La dieta tratada se colocó entre las dos capas de papel de filtro. Se colocaron diez larvas de primera fase de ambos sexos en cada placa (replicado). Se realizaron cuatro replicados para cada tratamiento. El control fue agua Milli-Q. Se realizaron 15 evaluaciones (número de supervivientes) de manera regular. Durante la prueba, las condiciones de ensayo fueron de 25 - 33 °C y una humedad relativa del 20 - 25 %, con un fotoperiodo de 12:12 horas de luz:oscuridad.
La supervivencia de larvas de T. castaneum a lo largo del tiempo con dieta artificial tratada con ARNbc TC014 diana se redujo significativamente en comparación con el control solamente con dieta, tal como se muestra en la Figura 1. 20
E. Clonación de un fragmento génico de ERH en un vector adecuado para la producción bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos
A continuación hay un ejemplo de clonación de un fragmento de ADN correspondiente a una diana génica de ERH 25 en un vector para la expresión de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier vector que comprende un promotor de T7 o cualquier otro promotor para la transcripción eficaz en bacterias (referencia al documento WO0001846).
Las secuencias de los cebadores específicos usados para la amplificación de los genes diana se proporcionan en la 30 Tabla 8-TC. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los cebadores se usan en una reacción PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizó en gel de agarosa, se purificó (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonó con extremos romos en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuenció. La secuencia del producto PCR resultante 35 corresponde a la secuencia respectiva tal como se proporciona en la Tabla 8-TC.
F. Expresión y producción de una diana de ARN bicatenario en dos cepas de Escherichia coli: (1) AB301-105(DE3), y, (2) BL21(DE3)
40
Se siguieron los procedimientos descritos a continuación para expresar niveles adecuados de ARN bicatenario activo en insectos de diana de insectos en bacterias. Se usó una cepa deficiente en RNasaIII, AB301-105(DE3), en comparación con bacterias que contenían RNasaIII de tipo silvestre, BL21(DE3).
Transformación de AB301-105(DE3) y BL21(DE3) 45
Se añadieron trescientos ng del plásmido y se mezclaron suavemente en una alícuota de 50 µl de la cepa de E. coli químicamente competente enfriada en hielo AB301-105(DE3) o BL21(DE3). Las células se incubaron sobre hielo durante 20 minutos antes de someterlas a un tratamiento de choque térmico de 37 °C durante 5 minutos, después de los cuales se pusieron de nuevo sobre hielo durante 5 minutos adicionales. Se añadieron cuatrocientos cincuenta 50 µl de medio SOC a temperatura ambiente a las células y la suspensión se incubó en un agitador (250 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Se transfirieron cien µl de la suspensión de células bacterianas a un matraz cónico de 500 ml que contenía 150 ml de caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) líquido suplementado con 100 µg/ml de antibiótico de carbenicilina. El cultivo se incubó en un agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37 °C durante toda la noche (16 a 18 horas). 55
Inducción química de la expresión de ARN bicatenario en AB301-105(DE3) y BL21(DE3)
La expresión de ARN bicatenario a partir del vector recombinante en la cepa bacteriana AB301-105(DE3) o BL21(DE3) fue posible ya que estaban presentes todos los componentes genéticos para expresión controlada. En 60 presencia del inductor químico isopropiltiogalactósido, o IPTG, la polimerasa T7 dirigirá la transcripción de la secuencia diana en direcciones tanto antisentido como sentido ya que estas están flanqueadas por promotores de T7 orientados de manera opuesta.
La densidad óptica a 600 nm del cultivo bacteriano de una noche se midió usando un espectrofotómetro adecuado y 65 se ajustó a un valor de 1 mediante la adición de caldo LB reciente. Se transfirieron cincuenta ml de este cultivo a un
tubo Falcon™ de 50 ml y el cultivo se centrifugó después a 3000 g a 15 °C durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante y el sedimento bacteriano se resuspendió en 50 ml de medio completo S reciente (medio SNC más 5 µg/ml de colesterol) suplementado con 100 µg/ml de carbenicilina e IPTG 1 mM. Las bacterias se indujeron durante 2 a 4 horas a temperatura ambiente.
5
Tratamiento con calor de bacterias
Las bacterias se destruyeron mediante tratamiento con calor para minimizar el riesgo de contaminación de la dieta artificial en las placas de ensayo. Sin embargo, el tratamiento con calor de las bacterias que expresaban ARN bicatenario no es un requisito previo para inducir la toxicidad hacia los insectos debido a la interferencia de ARN. El 10 cultivo bacteriano inducido se centrifugó a 3000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos, se desechó el sobrenadante y el sedimento se sometió a 80 °C durante 20 minutos en un baño con agua. Después del tratamiento con calor, el sedimento bacteriano se resuspendió en 1,5 ml de agua MilliQ y la suspensión se transfirió a un tubo de microcentrífuga. Se prepararon y usaron diversos tubos en los bioensayos para cada renovación. Los tubos se conservaron a -20 °C hasta su uso posterior. 15
G. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Tribolium castaneum
Bioensayos basados en plantas 20
Se rocían plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas químicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los ERH con las plantas. Se cultivan en una cámara de cultivo de plantas. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plástico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recortó la base y se cubrió con una fina malla de nailon para permitir el 25 aireamiento, reducir la condensación en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan ERH en cada planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspensión de E. coli AB301-105(DE3) que portan el vector recombinante o el plásmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 células bacterianas en 1 ml de una suspensión bacteriana a un valor de densidad óptica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se rocía un volumen total de entre 1 30 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este ensayo. Se cuenta el número de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.
El rociado de las plantas con una suspensión de la cepa bacteriana de E. coli AB301-105(DE3) que expresa ARNbc diana de vector recombinante da lugar a un drástico aumento en la mortalidad de los insectos en comparación con el 35 control de pGN29. Estos experimentos demuestran que el ARN bicatenario correspondiente a una secuencia diana de gen de insecto producida en sistemas de expresión bacteriana de tipo silvestre o deficientes en RNasaIII es tóxico para el insecto en cuanto a aumentos sustanciales en la mortalidad de los insectos y en el retraso en el crecimiento/desarrollo para los supervivientes larvarios. También está claro a partir de estos experimentos que se proporciona un ejemplo para proteger eficazmente a plantas/cultivos del daño por insectos mediante el uso de una 40 pulverización de una formulación que consiste en bacterias que expresan ARN bicatenario correspondiente a un gen diana de insecto.
Ejemplo 8: Myzus persicae (pulgón verde del melocotón)
45
A. Clonación de secuencias parciales de Myzus persicae
Se aisló ARN intacto, de alta calidad de ninfas de Myzus persicae (pulgón verde del melocotón; Fuente: Dr. Rachel Down, Insect & Pathogen Interactions, Central Science Laboratory, Sand Hutton, York, YO41 1LZ, Reino Unido) usando reactivo TRIzoI® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico presente en la preparación de 50 ARN se retiró mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante. Se generó ADNc usando un kit comercialmente disponible (transcriptasa inversa SuperScript® III) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para aislar secuencias de ADNc que comprendían una porción de los genes MP001, MP002, MP010, MP016 y MP027, se realizó una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las 55 instrucciones del fabricante.
Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificación de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-MP. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: para MP001, MP002 y MP016, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 60 minuto a 50°C y 1 minuto 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C; para MP027, se usó un programa de touchdown: 10 minutos a 95 °C, seguido de 10 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 40 segundos a 60 °C con reducción de la temperatura de 1 °C por ciclo y 1 minuto 10 segundos a 72 °C, seguido de 30 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 40 segundos a 50 °C y 1 minuto 10 segundos a 72 °C, seguido de 7 minutos a 72 °C; para MP010, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 3 minutos a 72 °C, seguido de 7 minutos a 65 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extracción de gel
QIAquick®), se clonaron en el vector pCR8/GW/TOPO® y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-MP y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoácidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-MP,
5
B. Producción de ARNbc de genes de Myzus persicae
Se sintetizó ARNbc en cantidades de miligramo usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express. En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en dirección 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una 10 orientación diferente con respecto al promotor de T7.
Para cada uno de los genes diana, se generó el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso específicos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-MP. Se realizó una PCR touchdown de la siguiente manera: 1 minuto 15 a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C (para MP001, MP002, MP016, MP027 y gfp) o 30 segundos a 50 °C (para MP010) con una reducción de la temperatura de 0,5 °C por ciclo y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 45 °C y 1 minuto a 72 °C seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se generó usando cebadores directos e inversos de T7 específicos en una reacción PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos 20 cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-MP. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificación PCR (kit de purificación PCR Qiaquick®) y precipitación de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante 25 para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-MP.
C. Recombinación de los genes de Myzus persicae en el vector vegetal pK7GWIWG2D(II)
Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actúa a través de fragmentos de ARNbc, las secuencias 30 nucleotídicas diana de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientación antisentido y sentido, separados por el intrón - CmR - intrón, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construcción de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reacción de recombinación LR entre un clon de entrada que contenía attL (véase el Ejemplo A) y un vector de destino que contenía attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a través de 35 VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reacción de recombinación de LR se llevó a cabo usando la mezcla enzimática LR Clonase™ II siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos experimentos de clonación produjeron una construcción en horquilla de cada uno de los genes MP001, MP002, MP010, MP016 y MP026, que tenía la orientación promotor - sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido y en el que el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S 40 es adecuado para la transformación en A. tumefaciens.
Se realizó una digestión con la enzima de restricción Alw44I para todas las dianas clonadas en pCR8/GW/TOPO® (véase el Ejemplo B). La banda que contenía el gen de interés flanqueado por los sitios de attL se purificó usando el kit de extracción en gel Qiaquick®. Se añadió una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 150 ng de 45 pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubó durante al menos 1h a 25 °C. Después del tratamiento con la solución de proteinasa K (10 min a 37°C), la mezcla de recombinación completa se transformó en las células químicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante análisis por digestión de restricción. La secuencia completa de la construcción en horquilla para:
50
- MP001 (sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido) se representa en la SEC ID Nº: 1066;
- MP002 (sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido) se representa en la SEC ID Nº: 1067;
- MP010 (sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido) se representa en la SEC ID Nº: 1068;
- MP016 (sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido) se representa en la SEC ID Nº: 1069;
- MP027 (sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido) se representa en la SEC ID Nº: 1070. 55
La Tabla 9-MP proporciona secuencias completas para cada construcción en horquilla.
D. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc usando dieta artificial líquida con respecto a actividad contra Myzus persicae 60
Se preparó dieta artificial líquida para el pulgón verde del melocotón, Myzus persicae, basándose en la dieta adecuada para pulgones del guisante (Acyrthosiphon pisum), tal como se describe por Febvay et al. (1988) [Influence of the amino acid balance on the improvement of an artificial diet for a biotype of Acyrthosiphonpisum (Homoptera: Aphididae). Can. J. Zool. 66: 2449-2453], pero con algunas modificaciones. El componente de 65 aminoácidos de la dieta se preparó de la siguiente manera: en mg/100 ml, alanina 178,71, beta-alanina 6,22,
arginina 244,9, asparagina 298,55, ácido aspártico 88,25, cisteína 29,59, ácido glutámico 149,36, glutamina 445,61, glicina 166,56, histidina 136,02, isoleucina 164,75, leucina 231,56, clorhidrato de lisina 351,09, metionina 72,35, ornitina (HCl) 9,41, fenilalanina 293, prolina 129,33, serina 124,28, treonina 127,16, triptófano 42,75, tirosina 38,63, L-valina 190,85. Los aminoácidos se disolvieron en 30 ml de H2O Milli-Q excepto para tirosina que se disolvió primero en unas pocas gotas de HCl 1 M antes de añadirla a la mezcla de aminoácidos. El componente de mezcla 5 de vitaminas de la dieta se preparó como una reserva concentrada 5x de la siguiente manera: en mg/l, ácido aminobenzoico 100, ácido ascórbico 1000, biotina 1, pantotenato de calcio 50, cloruro de colina 500, ácido fólico 10, mioinositol 420, ácido nicotínico 100, clorhidrato de piridoxina 25, riboflavina 5, clorhidrato de tiamina 25. La riboflavina se disolvió en 1 ml de H2O a 50 °C y después se añadió a la reserva de mezcla de vitaminas. La mezcla de vitaminas se separó en alícuotas en 20 ml por alícuota y se almacenó a -20 °C. Se añadió una alícuota de mezcla 10 de vitaminas a la solución de aminoácidos. Se añadió sacarosa y MgSO4.7H2O con las siguientes cantidades a la mezcla: 20 g y 242 mg, respectivamente. Se preparó una solución de reserva de metales traza de la siguiente manera: en mg/100 ml, CuSO4.5H2O 4,7, FeCl3.6H2O 44,5, MnCl2.4H2O 6,5, NaCl 25,4, ZnCl2 8,3. Se añadieron diez ml de la solución de metales traza y 250 mg de KH2PO4 a la dieta y se añadió agua Milli-Q a un volumen final de dieta líquida de 100 ml. El pH de la dieta se ajustó a 7 con una solución de KOH 1 M. La dieta se esterilizó por 15 filtración a través de un disco de filtro de 0,22 µm (Millipore).
Se criaron pulgones verdes del melocotón (Myzus persicae; Fuente: Dr. Rachel Down, Insect & Pathogen Interactions, Central Science Laboratory, Sand Hutton, York, YO41 1LZ, Reino Unido) sobre colza oleaginosa de 4 a 6 semanas de edad (Brassica napus variedad SW Oban; Fuente: Nick Balaam, Sw Seed Ltd., 49 North Road, 20 Abington, Cambridge, CB1 6AS, Reino Unido) en jaulas con marco de aluminio que contenían una malla de 70 µm en una cámara de ambiente controlado con las siguientes condiciones: 23 ±2 °C y humedad relativa del 60 ± 5 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas.
Un día antes del inicio del bioensayo, se recogieron adultos de las jaulas de cría y se colocaron en hojas de colza 25 nuevas separadas en una placa de Petri y se dejaron durante toda la noche en la cámara de insectos. Al día siguiente se seleccionaron ninfas de primera fase y se transfirieron a cámaras de alimentación. Una cámara de alimentación comprendía 10 ninfas de primera fase colocadas en una paca de Petri pequeña (con un diámetro de 3 cm) cubierta con una única capa de parafilm M muy estirado sobre el que se añadieron 50 µl de la dieta. La cámara se selló con una segunda capa de parafilm y se incubó en las mismas condiciones que los cultivos de adultos. La 30 dieta con ARNbc se renovó cada dos días y se evaluó la supervivencia de los insectos en el día 8, es decir, al 8º día después del comienzo del bioensayo. Por tratamiento, se prepararon simultáneamente 5 cámaras de alimentación de bioensayos (replicados). Se incorporaron soluciones de ARNbc de ensayo y de control (gfp) en la dieta hasta una concentración final de 2 µg/µl. Las cámaras de alimentación se mantuvieron a 23 ± 2 °C y una humedad relativa del 60 ± 5 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Se determinó un ensayo de Mann-Whitney mediante 35 GraphPad Prism versión 4 para establecer si las medianas diferían significativamente entre la diana 27 (MP027) y ARNbc de gfp.
En el bioensayo, la alimentación con dieta artificial líquida suplementada con ARNbc desnudo intacto de la diana 27 (SEC ID Nº: 1061) a ninfas de Myzus persicae usando una cámara de alimentación, dio como resultado un aumento 40 significativo de la mortalidad, tal como se muestra en la Figura 1. El porcentaje medio de supervivientes para la diana 27, ARNbc de gfp y tratamiento solamente con dieta fue de 2, 34 y 82, respectivamente. La comparación de la diana 027 con grupos de ARNbc usando el ensayo de Mann-Whitney dio como resultado un valor de P de una cola de 0,004 que indica que la mediana de la diana 027 es significativamente diferente (P < 0,05) de la mediana mayor esperada de ARNbc de gfp. Los pulgones verdes del melocotón con la dieta líquida con ARNbc de diana 27 45 incorporado fueron notablemente más pequeños que aquellos que se alimentaron con dieta solamente o con ARNbc de gfp de control (datos no presentados).
E. Clonación de un fragmento génico de PVM en un vector adecuado para la producción bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos 50
A continuación hay un ejemplo de clonación de un fragmento de ADN correspondiente a una diana génica de PVM en un vector para la expresión de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier vector que comprende un promotor de T7 o cualquier otro promotor para la transcripción eficaz en bacterias (referencia al documento WO0001846). 55
Las secuencias de los cebadores específicos usados para la amplificación de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-MP. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los cebadores se usan en una reacción PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR 60 resultante se analizó en gel de agarosa, se purificó (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonó en su extremo romo en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuenció. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la secuencia respectiva tal como se proporciona en la Tabla 8-MP.
65
F. Expresión y producción de una diana de ARN bicatenario en dos cepas de Escherichia coli: (1) AB301-105(DE3), y, (2) BL21(DE3)
Se siguieron los procedimientos descritos a continuación para expresar niveles adecuados de ARN bicatenario activo en insectos de diana de insectos en bacterias. Se usó una cepa deficiente en RNasaIII, AB301-105(DE3), en 5 comparación con bacterias que contenían RNasaIII de tipo silvestre, BL21(DE3).
Transformación de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)
Se añadieron trescientos ng del plásmido y se mezclaron suavemente en una alícuota de 50 µl de la cepa de E. coli 10 químicamente competente enfriada en hielo AB301-105(DE3) o BL21(DE3). Las células se incubaron sobre hielo durante 20 minutos antes de someterlas a un tratamiento de choque térmico de 37 °C durante 5 minutos, después de los cuales se pusieron de nuevo sobre hielo durante 5 minutos adicionales. Se añadieron cuatrocientos cincuenta µl de medio SOC a temperatura ambiente a las células y la suspensión se incubó en un agitador (250 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Se transfirieron cien µl de la suspensión de células bacterianas a un matraz cónico de 500 ml que 15 contenía 150 ml de caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) líquido suplementado con 100 µg/ml de antibiótico de carbenicilina. El cultivo se incubó en un agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37 °C durante toda la noche (16 a 18 horas).
Inducción química de la expresión de ARN bicatenario en AB301-105(DE3) y BL21(DE3) 20
La expresión de ARN bicatenario a partir del vector recombinante en la cepa bacteriana AB301-105(DE3) o BL21(DE3) fue posible ya que estaban presentes todos los componentes genéticos para expresión controlada. En presencia del inductor químico isopropiltiogalactósido, o IPTG, la polimerasa T7 dirigirá la transcripción de la secuencia diana en direcciones tanto antisentido como sentido ya que estas están flanqueadas por promotores de 25 T7 orientados de manera opuesta.
La densidad óptica a 600 nm del cultivo bacteriano de una noche se midió usando un espectrofotómetro adecuado y se ajustó a un valor de 1 mediante la adición de caldo LB reciente. Se transfirieron cincuenta ml de este cultivo a un tubo Falcon™ de 50 ml y el cultivo se centrifugó después a 3000 g a 15 °C durante 10 minutos. Se retiró el 30 sobrenadante y el sedimento bacteriano se resuspendió en 50 ml de medio completo S reciente (medio SNC más 5 µg/ml de colesterol) suplementado con 100 µg/ml de carbenicilina e IPTG 1 mM. Las bacterias se indujeron durante 2 a 4 horas a temperatura ambiente.
Tratamiento con calor de bacterias 35
Las bacterias se destruyeron mediante tratamiento con calor para minimizar el riesgo de contaminación de la dieta artificial en las placas de ensayo. Sin embargo, el tratamiento con calor de las bacterias que expresaban ARN bicatenario no es un requisito previo para inducir la toxicidad hacia los insectos debido a la interferencia de ARN. El cultivo bacteriano inducido se centrifugó a 3000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos, se desechó el 40 sobrenadante y el sedimento se sometió a 80 °C durante 20 minutos en un baño con agua. Después del tratamiento con calor, el sedimento bacteriano se resuspendió en 1,5 ml de agua MilliQ y la suspensión se transfirió a un tubo de microcentrífuga. Se prepararon y usaron diversos tubos en los bioensayos para cada renovación. Los tubos se conservaron a -20 °C hasta su uso posterior.
45
G. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Myzus persicae
Bioensayos basados en plantas
50
Se rocían plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas químicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los PVM con las plantas. Se cultivan en una cámara de cultivo de plantas. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plástico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recortó la base y se cubrió con una fina malla de nailon para permitir el aireamiento, reducir la condensación en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan PVM en cada 55 planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspensión de E. coli AB301-105(DE3) que portan el vector recombinante o el plásmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 células bacterianas en 1 ml de una suspensión bacteriana a un valor de densidad óptica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se rocía un volumen total de entre 1 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este ensayo. Se 60 cuenta el número de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.
El rociado de las plantas con una suspensión de la cepa bacteriana de E. coli AB301-105(DE3) que expresa ARNbc diana de vector recombinante da lugar a un drástico aumento en la mortalidad de los insectos en comparación con el control de pGN29. Estos experimentos demuestran que el ARN bicatenario correspondiente a una secuencia diana 65 de gen de insecto producida en sistemas de expresión bacteriana de tipo silvestre o deficientes en RNasaIII es
tóxico para el insecto en cuanto a aumentos sustanciales en la mortalidad de los insectos y en el retraso en el crecimiento/desarrollo para los supervivientes larvarios. También está claro a partir de estos experimentos que se proporciona un ejemplo para proteger eficazmente a plantas/cultivos del daño por insectos mediante el uso de una pulverización de una formulación que consiste en bacterias que expresan ARN bicatenario correspondiente a un gen diana de insecto. 5
Ejemplo 9: Nilaparvata lugens (saltamontes marrón)
A. Clonación de secuencias parciales de Nilaparvata lugens
10
A partir de ARN total de alta calidad de Nilaparvata lugens (fuente: Dr. J. A. Gatehouse, Dept. Biological Sciences, Durham University, Reino Unido) se generó ADNc usando un kit comercialmente disponible (Transcriptasa inversa SuperScript® III) siguiendo el protocolo del fabricante.
Para aislar secuencias de ADNc que comprendían una porción de los genes de Nilaparvata lugens NL001, NL002, 15 NL003, NL004, NL005, NL006, NL007, NL008, NL009, NL010, NL011, NL012, NL013, NL014, NL015, NL016, NL018, NL019, NL021, NL022 y NL027, se realizó una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo el protocolo del fabricante.
Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificación de cada uno de los genes se 20 proporcionan en la Tabla 2-NL. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: para NL001, 5 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL002: 3 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL003: 3 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 61 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 25 °C; para NL004: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 51 °C y 1 minuto a 72 °C; para NL005: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL006: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 3 minuto 30 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL007: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 15 segundos a 72 °C, seguido de 10 30 minutos a 72 °C; para NL008: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 53 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL009: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL010: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 2 minuto 30 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL011: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 35 °C y 1 minuto a 72 °C; para NL012: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C; para NL013: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 10 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL014: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 53 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL015: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 40 segundos a 72 °C, 40 seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL016: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 40 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL018: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 35 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL019: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL021: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 45 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 45 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL022: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 45 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; y para NL027: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 45 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonaron en el vector 50 pCR8/GW/TOPO® y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-NL y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoácidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-NL,
55
B. Clonación de una secuencia parcial del gen NL023 de Nilaparvata lugens mediante secuencia de EST
A partir de ARN total de alta calidad de Nilaparvata lugens (fuente: Dr. J. A. Gatehouse, Dept. Biological Sciences, Durham University, Reino Unido) se generó ADNc usando un kit comercialmente disponible (Transcriptasa inversa SuperScript® III) siguiendo el protocolo del fabricante. 60
Se amplificó una secuencia parcial de ADNc, NL023, a partir de ADNc de Nilaparvata lugens que correspondía a una secuencia de EST de Nilaparvata lugens en la base de datos pública Genbank con el número de referencia CAH65679.2. Para aislar secuencias de ADNc que comprendían una porción del gen NL023, se realizó una serie de reacciones PCR con cebadores específicos basados en EST usando PerfectShot™ ExTaq (Nº de Cat. RR005A, 65 Takara Bio Inc.) siguiendo el protocolo del fabricante.
Para NL023, se usaron los cebadores específicos oGBKW002 y oGBKW003 (representados en el presente documento como SEC ID Nº: 1157 y SEC ID Nº: 1158, respectivamente) en dos reacciones PCR independientes con las siguientes condiciones: 3 minutos a 95 °C, seguido de 30 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 56 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR4-TOPO® y se secuenciaron. La 5 secuencia consenso resultante de la secuencia de ambos productos de PCR se representa en el presente documento por SEC ID Nº: 1111 y se cita como secuencia parcial del gen NL023. La secuencia parcial de aminoácidos correspondiente se representa en el presente documento como SEC ID Nº: 1112.
C. Producción de ARNbc de genes de Nilaparvata lugens 10
Se sintetizó ARNbc en cantidades de miligramo usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express. En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en dirección 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una orientación diferente con respecto al promotor de T7. 15
Para cada uno de los genes diana, se generó el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso específicos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 4. Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: para NL001: 4 minutos a 94 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 60 °C y 1 minuto a 72 °C, 20 seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL002: 4 minutos a 94 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 60 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL003: 4 minutos a 94 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 66 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL004: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 54 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL005: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 25 segundos a 57 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL006: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 54 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL007: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 51 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL008: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 54 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL009: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 30 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 54 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL010: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 54 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL011: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 53 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL012: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 53 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para 35 NL013: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL014: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 51 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL015: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL016: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 57 °C y 1 minuto a 72 °C, 40 seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL018: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL019: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 54 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL021: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL022: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 45 segundos a 53 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL023: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 52 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; y para NL027: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 52 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se generó usando cebadores directos e inversos de T7 específicos en una reacción PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de 50 los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 4-NL. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificación PCR (kit de purificación PCR Qiaquick®). Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante, pero con la siguiente modificación: El sedimento de 55 ARN se lava dos veces en etanol al 70 %. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-NL.
El ADN molde usado para las reacciones PCR con cebadores de T7 en el control de proteína verde fluorescente (gfp) fue el plásmido pPD96.12 (the Fire Lab, http://genome-www.stanford.edu/group/fire/), que contiene la 60 secuencia codificante de gfp de tipo silvestre intercalada por 3 intrones sintéticos. Se sintetizó ARN bicatenario usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express. En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en dirección 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una orientación diferente con respecto al promotor de T7. Para gfp, se generó el molde de T7 sentido usando el cebador directo específico de T7 oGAU183 y el cebador 65 inverso específico oGAU182 (representados en el presente documento como SEC ID Nº: 236 y SEC ID Nº: 237,
respectivamente) en una reacción PCR con las siguientes condiciones: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se generó usando el cebador directo específico oGAU181 y el cebador inverso específico de T7 oGAU184 (representados en el presente documento como SEC ID Nº: 238 y SEC ID Nº: 239, respectivamente) en una reacción PCR con las mismas condiciones descritas anteriormente. Los productos PCR resultantes se 5 analizaron en gel de agarosa y se purificaron (kit de purificación PCR QIAquick®). Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron mediante precipitación con acetato de sodio e isopropanol, siguiendo el protocolo del fabricante, pero con la siguiente modificación: El sedimento de ARN se lava dos veces en etanol al 70 %. Las hebras sentido del ARNbc resultantes se representa en el presente documento por SEC ID Nº: 235. 10
D. Pruebas de laboratorio para explorar dianas de ARNbc usando dieta artificial líquida con respecto a actividad contra Nilaparvata lugens
Se preparó dieta artificial líquida (MMD-1) para el saltamontes marrón del arroz, Nilaparvata lugens, tal como se 15 describe por Koyama (1988) [Artificial rearing and nutritional physiology of the planthoppers and leafhoppers (Homoptera: Delphacidae and Deltocephalidae) on a holidic diet. JARQ 22: 20-27], pero con una modificación en la concentración final del componente de la dieta, sacarosa: se usó un 14,4 % (peso frente a volumen). Se prepararon componentes de la dieta como concentrados separados: reserva mineral 10x (almacenada a 4 °C), reserva de aminoácidos 2x (almacenada a -20 °C) y reserva de vitaminas x 10 (almacenada a -20 °C). Los componentes de 20 reserva se mezclaron inmediatamente antes del inicio de un bioensayo a concentración de 4/3x para permitir la dilución con la solución de ARNbc de ensayo (concentración 4x), el pH se ajustó a 6,5 y se esterilizó por filtración en alícuotas de aproximadamente 500 µl.
Se criaron saltamontes marrones del arroz (Nilaparvata lugens) en plantas de arroz de dos a tres meses de edad 25 (Oryza sativa cv Taichung Native 1) en una cámara de ambiente controlado: 27 ± 2 °C, humedad relativa del 80 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Una cámara de alimentación comprendía 10 ninfas de primera o segunda fase colocadas en una placa de Petri pequeña (con un diámetro de 3 cm) cubierta con una única capa de parafilm M muy estirado a la que se añadieron 50 µl de la dieta. La cámara se selló con una segunda capa de parafilm y se incubó en las mismas condiciones que los cultivos de adultos pero sin exposición directa a la luz. La 30 dieta con ARNbc se renovó cada dos días y se evaluó la supervivencia de los insectos diariamente. Por tratamiento, se prepararon simultáneamente 5 cámaras de alimentación de bioensayos (replicados). Se incorporaron soluciones de ARNbc de ensayo y de control (gfp) en la dieta hasta una concentración final de 2 mg/ml. Las cámaras de alimentación se mantuvieron a 27 ± 2 °C, humedad relativa del 80 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Se analizaron los datos de supervivencia de insectos usando el modelo de curva de supervivencia de Kaplan-35 Meier y se compararon las supervivencias entre grupos usando el ensayo de rangos logarítmicos (Prism versión 4.0).
La alimentación con dieta artificial líquida suplementada con ARNbc desnudos intactos a Nilaparvata lugens in vitro usando una cámara de alimentación dio como resultado aumentos significativos de las mortalidades de las ninfas tal 40 como se muestra en cuatro bioensayos separados (Figuras 1(a)-(d)-NL; Tablas 1a-d-NL). Estos resultados demuestran que los ARNbc correspondientes a diferentes genes esenciales de SM mostraron toxicidad significativa hacia el saltamontes marrón del arroz.
El efecto del ARNbc de gfp en la supervivencia de SM en estos bioensayos no es significativamente diferente a la 45 supervivencia solamente con dieta.
Las Tablas 10a-d-NL muestran un resumen de la supervivencia de Nilaparvata lugens con dieta artificial suplementada con 2 mg/ml (concentración final) de las siguientes dianas: en la Tabla 10(a)-NL: NL002, NL003, NL005, NL010; en la Tabla 10(b)-NL NL009, NL016; en la Tabla 10(c)-NL NL014, NL018; y en la Tabla 10(d)-NL 50 NL013, NL015, NL021. En la columna de análisis de supervivencia, el efecto del ARNi se indica de la siguiente manera: + = supervivencia significativamente reducida en comparación con el control de ARNbc de gfp (alfa < 0,05); - = sin diferencias significativas en la supervivencia en comparación con el control de ARNbc de gfp. Se compararon las curvas de supervivencia (entre dieta solamente y la dieta complementada con ARNbc de ensayo, ARNbc de gfp y ARNbc de ensayo y dieta solamente y ARNbc de gfp) usando el ensayo de rangos logarítmicos. 55
E. Pruebas de laboratorio para explorar ARNbc a diferentes concentraciones usando dieta artificial con respecto a actividad contra Nilaparvata lugens
Se aplicaron cincuenta µl de dieta artificial líquida suplementada con diferentes concentraciones de ARNbc de 60 NL002 diana, concretamente 1, 0,2, 0,08 y 0,04 mg/ml (concentración final), a las cámaras de alimentación de saltamontes marrón. La dieta con ARNbc se renovó cada dos días y se evaluó la supervivencia de los insectos diariamente. Por tratamiento, se prepararon simultáneamente 5 cámaras de alimentación de bioensayos (replicados). Las cámaras de alimentación se mantuvieron a 27 ± 2 °C, humedad relativa del 80 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Se analizaron los datos de supervivencia de insectos usando el modelo 65 de curva de supervivencia de Kaplan-Meier y se compararon las supervivencias entre grupos usando el ensayo de
rangos logarítmicos (Prism versión 4.0).
La alimentación con dieta artificial líquida suplementada con ARNbc desnudos intactos NL002 diana a diferentes concentraciones dio como resultado mortalidades de SM significativamente mayores a concentraciones finales tan bajas como 0,04 mg de ARNbc por ml de dieta en comparación con la supervivencia solamente con dieta, tal como 5 se muestra en la Figura 2-NL y en la Tabla 9-NL. La Tabla 9-NL resume la supervivencia de Nilaparvata lugens en un ensayo de alimentación con dieta artificial suplementado con 1, 0,2, 0,08 y 0,04 mg/ml (concentración final) de NL002 diana. En la columna de análisis de supervivencia se indica el efecto del ARNi de la siguiente manera: + = reduce significativamente la supervivencia en comparación con control solamente con dieta (alfa < 0,05); - = sin diferencias significativas en la supervivencia en comparación con el control solamente con dieta. Las curvas de 10 supervivencia se compararon usando el ensayo de rangos logarítmicos.
F. Clonación de un fragmento génico de SM en un vector adecuado para la producción bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos
15
A continuación hay un ejemplo de clonación de un fragmento de ADN correspondiente a una diana génica de SM en un vector para la expresión de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier vector que comprende un promotor de T7 o cualquier otro promotor para la transcripción eficaz en bacterias (referencia al documento WO0001846).
20
Las secuencias de los cebadores específicos usados para la amplificación de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los cebadores se usan en una reacción PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizó en gel de agarosa, se purificó (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonó con extremos 25 romos en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuenció. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la secuencia respectiva tal como se proporciona en la Tabla 8-NL.
G. Expresión y producción de una diana de ARN bicatenario en dos cepas de Escherichia coli: (1) AB301-105(DE3), y, (2) BL21(DE3) 30
Se siguieron los procedimientos descritos a continuación para expresar niveles adecuados de ARN bicatenario activo en insectos de diana de insectos en bacterias. Se usó una cepa deficiente en RNasaIII, AB301-105(DE3), en comparación con bacterias que contenían RNasaIII de tipo silvestre, BL21(DE3).
35
Transformación de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)
Se añadieron trescientos ng del plásmido y se mezclaron suavemente en una alícuota de 50 µl de la cepa de E. coli químicamente competente enfriada en hielo AB301-105(DE3) o BL21(DE3). Las células se incubaron sobre hielo durante 20 minutos antes de someterlas a un tratamiento de choque térmico de 37 °C durante 5 minutos, después 40 de los cuales se pusieron de nuevo sobre hielo durante 5 minutos adicionales. Se añadieron cuatrocientos cincuenta µl de medio SOC a temperatura ambiente a las células y la suspensión se incubó en un agitador (250 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Se transfirieron cien µl de la suspensión de células bacterianas a un matraz cónico de 500 ml que contenía 150 ml de caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) líquido suplementado con 100 µg/ml de antibiótico de carbenicilina. El cultivo se incubó en un agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37 °C durante toda la noche (16 a 18 45 horas).
Inducción química de la expresión de ARN bicatenario en AB301-105(DE3) y BL21(DE3)
La expresión de ARN bicatenario a partir del vector recombinante en la cepa bacteriana AB301-105(DE3) o 50 BL21(DE3) fue posible ya que estaban presentes todos los componentes genéticos para expresión controlada. En presencia del inductor químico isopropiltiogalactósido, o IPTG, la polimerasa T7 dirigirá la transcripción de la secuencia diana en direcciones tanto antisentido como sentido ya que estas están flanqueadas por promotores de T7 orientados de manera opuesta.
55
La densidad óptica a 600 nm del cultivo bacteriano de una noche se midió usando un espectrofotómetro adecuado y se ajustó a un valor de 1 mediante la adición de caldo LB reciente. Se transfirieron cincuenta ml de este cultivo a un tubo Falcon™ de 50 ml y el cultivo se centrifugó después a 3000 g a 15 °C durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante y el sedimento bacteriano se resuspendió en 50 ml de medio completo S reciente (medio SNC más 5 µg/ml de colesterol) suplementado con 100 µg/ml de carbenicilina e IPTG 1 mM. Las bacterias se indujeron durante 60 2 a 4 horas a temperatura ambiente.
Tratamiento con calor de bacterias
Las bacterias se destruyeron mediante tratamiento con calor para minimizar el riesgo de contaminación de la dieta 65 artificial en las placas de ensayo. Sin embargo, el tratamiento con calor de las bacterias que expresaban ARN
bicatenario no es un requisito previo para inducir la toxicidad hacia los insectos debido a la interferencia de ARN. El cultivo bacteriano inducido se centrifugó a 3000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos, se desechó el sobrenadante y el sedimento se sometió a 80 °C durante 20 minutos en un baño con agua. Después del tratamiento con calor, el sedimento bacteriano se resuspendió en 1,5 ml de agua MilliQ y la suspensión se transfirió a un tubo de microcentrífuga. Se prepararon y usaron diversos tubos en los bioensayos para cada renovación. Los tubos se 5 conservaron a -20 °C hasta su uso posterior.
H. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Nilaparvata lugens
10
Bioensayos basados en plantas
Se rocían plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas químicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los SM con las plantas. Se cultivan en una cámara de cultivo de plantas. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plástico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente 15 colocado en el suelo en una maceta y se recortó la base y se cubrió con una fina malla de nailon para permitir el aireamiento, reducir la condensación en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan SM en cada planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspensión de E. coli AB301-105(DE3) que portan el vector recombinante o el plásmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 células bacterianas en 1 ml de una suspensión bacteriana a un 20 valor de densidad óptica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se rocía un volumen total de entre 1 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este ensayo. Se cuenta el número de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.
El rociado de las plantas con una suspensión de la cepa bacteriana de E. coli AB301-105(DE3) que expresa ARNbc 25 diana de vector recombinante da lugar a un drástico aumento en la mortalidad de los insectos en comparación con el control de pGN29. Estos experimentos demuestran que el ARN bicatenario correspondiente a una secuencia diana de gen de insecto producida en sistemas de expresión bacteriana de tipo silvestre o deficientes en RNasaIII es tóxico para el insecto en cuanto a aumentos sustanciales en la mortalidad de los insectos y en el retraso en el crecimiento/desarrollo para los supervivientes larvarios. También está claro a partir de estos experimentos que se 30 proporciona un ejemplo para proteger eficazmente a plantas/cultivos del daño por insectos mediante el uso de una pulverización de una formulación que consiste en bacterias que expresan ARN bicatenario correspondiente a un gen diana de insecto.
Ejemplo 10: Chilos suppressalis (barrenador rayado del tallo del arroz), 35
A. Clonación de la secuencia parcial de los genes de Chilo suppressalis mediante PCR familiar
Se aisló ARN intacto, de alta calidad de los 4 estadios larvarios diferentes de Chilo suppressalis (barrenador rayado del tallo del arroz) usando reactivo TRIzol® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico presente en 40 la preparación de ARN se retiró mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante. Se generó ADNc usando un kit comercialmente disponible (transcriptasa inversa SuperScript® III) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para aislar secuencias de ADNc que comprendían una porción de los genes CS001, CS002, CS003, CS006, CS007, 45 CS009, CS011, CS013, CS014, CS015, CS016 y CS018, se realizó una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las instrucciones del fabricante.
Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificación de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-CS. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes 50 condiciones: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR4/TOPO® y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-CS y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoácidos parciales correspondientes se 55 representan por las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-CS.
B. Producción de ARNbc de los genes de Chilo suppressalis
Se sintetizó ARNbc en cantidades de miligramo usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 60 Ribomax™ Express. En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en dirección 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una orientación diferente con respecto al promotor de T7.
Para cada uno de los genes diana, se generó el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso 65 específicos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de
los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-CS. Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se generó usando cebadores directos e inversos de T7 específicos en una reacción PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la 5 Tabla 8-CS. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificación PCR (kit de purificación PCR Qiaquick®) y precipitación de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-CS. 10
C. Recombinación de los genes de Chilo suppressalis en el vector vegetal pK7GWIWG2D(II)
Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actúa a través de fragmentos de ARNbc, las secuencias nucleotídicas diana de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientación 15 antisentido y sentido, separados por el intrón - CmR - intrón, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construcción de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reacción de recombinación LR entre un clon de entrada que contenía attL (véase el Ejemplo 1) y un vector de destino que contenía attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a través de VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reacción de recombinación de LR se 20 llevó a cabo usando la mezcla enzimática LR Clonase™ II siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos experimentos de clonación dieron como resultado una construcción en horquilla para cada uno de los genes diana, que tenían la orientación promotor - sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido y en el que el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para la transformación en A. tumefaciens. 25
Se realizaron digestiones con enzimas de restricción en los plásmidos de pCR8/GW/TOPO® que contenían las diferentes dianas (véase el Ejemplo B). La banda que contenía el gen de interés flanqueado por los sitios de attL se purificó usando el kit de extracción en gel Qiaquick®. Se añadió una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 150 ng de pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubó durante al menos 1h a 25 °C. Después 30 del tratamiento con la solución de proteinasa K (10 min a 37°C), la mezcla de recombinación completa se transformó en las células químicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante análisis por digestión de restricción.
D. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc, usando dieta artificial para actividad contra larvas 35 de Chilo suppressalis
Se mantuvieron barrenadores rayados del tallo del arroz, Chilo suppressalis, (origen: Syngenta, Stein, Suiza) con una dieta artificial modificada basada en la descrita por Kamano y Sato, 1985 (en: Handbook of Insect Rearing. volúmenes I y II. P Singh y RF Moore, eds., Elsevier Science Publishers, Ámsterdam y Nueva York, 1985, págs. 40 448). En resumen, se preparó un litro de dieta de la siguiente manera: se añadieron 20 g de agar a 980 ml de agua Milli-Q y se esterilizó por autoclave; la solución de agar se enfrió a aproximadamente 55 °C y los demás ingredientes se añadieron y se mezclaron exhaustivamente: 40 g de harina de maíz (Polenta), 20 g de celulosa, 30 g de sacarosa, 30 g de caseína, 20 g de germen de trigo (tostado), 8 g mezcla de sales de Wesson, 12 g de mezcla de vitaminas de Vanderzant, 1,8 g de ácido sórbico, 1,6 g de nipagina (metilparabeno), 0,3 g de aureomicina, 0,4 g de 45 colesterol y 0,6 g de L-cisteína. La dieta se enfrió a aproximadamente 45 °C y se vertió en bandejas o vasos de alimentación. La dieta se dejó reposar en una cabina de flujo laminar horizontal. Se retiraron secciones de hojas de arroz con huevos ovipositados de una jaula que alojaba polillas adultas y se clavaron en la dieta sólida en el vaso o bandeja de cría. Se dejó que los huevos eclosionaran y las larvas disponibles estaban disponibles para bioensayos y el mantenimiento de los cultivos de insectos. Durante las pruebas y la cría, las condiciones fueron de 28 ± 2 °C y una 50 humedad relativa del 80 ± 5 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas.
Se usó la misma dieta artificial para los bioensayos pero en este caso la dieta se vertió a partes iguales en 24 placas multipocillo, conteniendo cada pocillo 1 ml de dieta. Una vez que se establece la dieta, las formulaciones de ensayo se aplican a la superficie de la dieta (2 cm2), a la tasa de 50 µl de ARNbc de diana a 1 µg/µl. Las soluciones de 55 ARNbc se dejan secar y se colocan dos larvas de polillas de primera fase en cada pocillo. Después de 7 días, las larvas se transfieren a dieta tratada reciente en placas multipocillo. En el día 14 (es decir, 14 días después del inicio del bioensayo) se registra el número de insectos vivos y muertos y se examinan en busca de anomalías. Se ensayan veinticuatro larvas en total por tratamiento.
60
Se realiza un bioensayo alternativo en el que se alimentan larvas neonatas del barrenador rayado del tallo del arroz con hojas de arroz tratadas. Se sumergen secciones pequeñas de hojas de arroz Indica de la variedad Taichung native 1 en solución de Triton™ X-100 al 0,05 % que contiene 1 µg/µl de ARNbc diana, se deja secar y cada sección se coloca en un pocillo de una de 24 multipocillos que contienen agar gelificado al 2 %. Se transfieren dos neonatos de la bandeja de cría a cada sección de hoja tratada con ARNbc (24 larvas por tratamiento). Después de 4 y 8 días, 65 las larvas se transfieren a secciones de hojas de arroz tratadas recientes. El número de larvas vivas y muertas se
evalúa los días 4, 8 y 12; también se registra cualquier anomalía.
E. Clonación de un fragmento génico de BRA en un vector adecuado para la producción bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos
5
A continuación hay un ejemplo de clonación de un fragmento de ADN correspondiente a una diana génica de BRA en un vector para la expresión de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier vector que comprende un promotor de T7 o cualquier otro promotor para la transcripción eficaz en bacterias (referencia al documento WO0001846).
10
Las secuencias de los cebadores específicos usados para la amplificación de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los cebadores se usan en una reacción PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizó en gel de agarosa, se purificó (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonó con extremos 15 romos en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuenció. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la secuencia respectiva tal como se proporciona en la Tabla 8-CS.
F. Expresión y producción de una diana de ARN bicatenario en dos cepas de Escherichia coli: (1) AB301-105(DE3), y, (2) BL21(DE3) 20
Se siguieron los procedimientos descritos a continuación para expresar niveles adecuados de ARN bicatenario activo en insectos de diana de insectos en bacterias. Se usó una cepa deficiente en RNasaIII, AB301-105(DE3), en comparación con bacterias que contenían RNasaIII de tipo silvestre, BL21(DE3).
25
Transformación de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)
Se añadieron trescientos ng del plásmido y se mezclaron suavemente en una alícuota de 50 µl de la cepa de E. coli químicamente competente enfriada en hielo AB301-105(DE3) o BL21(DE3). Las células se incubaron sobre hielo durante 20 minutos antes de someterlas a un tratamiento de choque térmico de 37 °C durante 5 minutos, después 30 de los cuales se pusieron de nuevo sobre hielo durante 5 minutos adicionales. Se añadieron cuatrocientos cincuenta µl de medio SOC a temperatura ambiente a las células y la suspensión se incubó en un agitador (250 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Se transfirieron cien µl de la suspensión de células bacterianas a un matraz cónico de 500 ml que contenía 150 ml de caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) líquido suplementado con 100 µg/ml de antibiótico de carbenicilina. El cultivo se incubó en un agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37 °C durante toda la noche (16 a 18 35 horas).
Inducción química de la expresión de ARN bicatenario en AB301-105(DE3) y BL21(DE3)
La expresión de ARN bicatenario a partir del vector recombinante en la cepa bacteriana AB301-105(DE3) o 40 BL21(DE3) fue posible ya que estaban presentes todos los componentes genéticos para expresión controlada. En presencia del inductor químico isopropiltiogalactósido, o IPTG, la polimerasa T7 dirigirá la transcripción de la secuencia diana en direcciones tanto antisentido como sentido ya que estas están flanqueadas por promotores de T7 orientados de manera opuesta.
45
La densidad óptica a 600 nm del cultivo bacteriano de una noche se midió usando un espectrofotómetro adecuado y se ajustó a un valor de 1 mediante la adición de caldo LB reciente. Se transfirieron cincuenta ml de este cultivo a un tubo Falcon™ de 50 ml y el cultivo se centrifugó después a 3000 g a 15 °C durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante y el sedimento bacteriano se resuspendió en 50 ml de medio completo S reciente (medio SNC más 5 µg/ml de colesterol) suplementado con 100 µg/ml de carbenicilina e IPTG 1 mM. Las bacterias se indujeron durante 50 2 a 4 horas a temperatura ambiente.
Tratamiento con calor de bacterias
Las bacterias se destruyeron mediante tratamiento con calor para minimizar el riesgo de contaminación de la dieta 55 artificial en las placas de ensayo. Sin embargo, el tratamiento con calor de las bacterias que expresaban ARN bicatenario no es un requisito previo para inducir la toxicidad hacia los insectos debido a la interferencia de ARN. El cultivo bacteriano inducido se centrifugó a 3000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos, se desechó el sobrenadante y el sedimento se sometió a 80 °C durante 20 minutos en un baño con agua. Después del tratamiento con calor, el sedimento bacteriano se resuspendió en 1,5 ml de agua MilliQ y la suspensión se transfirió a un tubo de 60 microcentrífuga. Se prepararon y usaron diversos tubos en los bioensayos para cada renovación. Los tubos se conservaron a -20 °C hasta su uso posterior.
G. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Chilo suppressalis
Bioensayos basados en plantas
5
Se rocían plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas químicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los BRA con las plantas. Se cultivan en una cámara de cultivo de plantas. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plástico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recortó la base y se cubrió con una fina malla de nailon para permitir el aireamiento, reducir la condensación en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan BRA en cada 10 planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspensión de E. coli AB301-105(DE3) que portan el vector recombinante o el plásmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 células bacterianas en 1 ml de una suspensión bacteriana a un valor de densidad óptica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se rocía un volumen total de entre 1 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este ensayo. Se 15 cuenta el número de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.
El rociado de las plantas con una suspensión de la cepa bacteriana de E. coli AB301-105(DE3) que expresa ARNbc diana de vector recombinante da lugar a un drástico aumento en la mortalidad de los insectos en comparación con el control de pGN29. Estos experimentos demuestran que el ARN bicatenario correspondiente a una secuencia diana 20 de gen de insecto producida en sistemas de expresión bacteriana de tipo silvestre o deficientes en RNasaIII es tóxico para el insecto en cuanto a aumentos sustanciales en la mortalidad de los insectos y en el retraso en el crecimiento/desarrollo para los supervivientes larvarios. También está claro a partir de estos experimentos que se proporciona un ejemplo para proteger eficazmente a plantas/cultivos del daño por insectos mediante el uso de una pulverización de una formulación que consiste en bacterias que expresan ARN bicatenario correspondiente a un gen 25 diana de insecto.
Ejemplo 11: Plutella xylostella (palomilla de dorso diamante)
A. Clonación de una secuencia parcial de la Plutella xylostella 30
Se aisló ARN intacto, de alta calidad de todos los estadios larvarios diferentes de Plutella xylostella (palomilla de dorso diamante; Fuente: Dr. Lara Senior, Insect Investigations Ltd., Capital Business Park, Wentloog, Cardiff, CF3 2PX, Gales, Reino Unido) usando reactivo TRIzoI® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico presente en la preparación de ARN se retiró mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del 35 fabricante. Se generó ADNc usando un kit comercialmente disponible (transcriptasa inversa SuperScript® III) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para aislar secuencias de ADNc que comprendían una porción de los genes PX001, PX009, PX010, PX015, PX016, se realizó una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las 40 instrucciones del fabricante.
Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificación de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-PX. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 50°C y 1 minuto y 30 45 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C (para PX001, PX009, PX015, PX016); 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 2 minuto y 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C (para PX010). Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR8/GW/TOPO® y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-PX y se 50 citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoácidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-PX.
B. Producción de ARNbc de los genes de Plutella xylostella
55
Se sintetizó ARNbc en cantidades de miligramo usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express. En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en dirección 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una orientación diferente con respecto al promotor de T7.
60
Para cada uno de los genes diana, se generó el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso específicos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-PX. Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: 1 minuto a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C (-0,5 °C/ciclo) y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 50 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 65 72 °C. El molde de T7 antisentido se generó usando cebadores directos e inversos de T7 específicos en una
reacción PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-PX. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificación PCR (kit de purificación PCR Qiaquick®) y precipitación de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se 5 purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-PX.
C. Recombinación de los genes de Plutella xylostella en el vector vegetal pK7GWIWG2D(II)
10
Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actúa a través de fragmentos de ARNbc, las secuencias nucleotídicas diana de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientación antisentido y sentido, separados por el intrón - CmR - intrón, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construcción de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reacción de recombinación LR entre un clon de entrada que contenía attL (véase el Ejemplo 1) y un vector 15 de destino que contenía attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a través de VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reacción de recombinación de LR se llevó a cabo usando la mezcla enzimática LR Clonase™ II siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos experimentos de clonación dieron como resultado una construcción en horquilla para cada uno de los genes diana, que tenían la orientación promotor - sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido y en el que el promotor es el 20 promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para la transformación en A. tumefaciens.
Se realizaron digestiones con enzimas de restricción en los plásmidos de pCR8/GW/TOPO® que contenían las diferentes dianas (véase el Ejemplo 2). La banda que contenía el gen de interés flanqueado por los sitios de attL se 25 purificó usando el kit de extracción en gel Qiaquick®. Se añadió una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 150 ng de pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubó durante al menos 1h a 25 °C. Después del tratamiento con la solución de proteinasa K (10 min a 37°C), la mezcla de recombinación completa se transformó en las células químicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante análisis por digestión de restricción. 30
D. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc, usando dieta artificial para actividad contra larvas de Plutella xylostella
Se mantuvieron palomillas de dorso diamante , Plutella xylostella, en Insect Investigations Ltd. (origen: Newcastle 35 University, Newcastle-upon-Tyne, Reino Unido). Los insectos se criaron en hojas de repollo. Se seleccionaron larvas de ambos sexos, de primera fase (de aproximadamente 1 día de edad) para su uso en el ensayo. Los insectos se mantuvieron en tubos Eppendorf (1,5 ml de capacidad). Se colocó dieta de palomilla de dorso diamante comercialmente disponible (Bio-Serv, NJ, EE.UU), preparada siguiendo las instrucciones del fabricante sobre la tapa de cada tubo (capacidad de 0,25 ml, diámetro de 8 mm). Mientras aún era líquida, la dieta se niveló para retirar el 40 exceso y producir una superficie homogénea.
Una vez que la dieta se ha establecido, se aplican las formulaciones de ensayo a la superficie de la dieta, a una tasa de 25 µl de formulación no diluida (1 µg/µl de ARNbc de dianas) por replicado. Se deja que las formulaciones de ensayo se sequen y se coloca una larva de polilla de primera fase en cada tubo. La larva se coloca sobre la 45 superficie de la dieta en la tapa y se cierra cuidadosamente el tubo. Los tubos se almacenan boca abajo, sobre las tapas, de tal forma que la larva permanece sobre la superficie de la dieta. Dos veces por semana las larvas se transfieren a nuevos tubos Eppendorf con dieta reciente. Se proporciona a los insectos dieta tratada durante las primeras dos semanas del ensayo y a continuación dieta no tratada.
50
Se realizan evaluaciones dos veces por semanas durante un total de 38 días momento en el cual todas las larvas están muertas. En cada evaluación los insectos se evalúan como vivos o muertos y se evalúan en busca de anomalías. Se realizan cuarenta replicados de larvas individuales para cada uno de los tratamientos. Durante la prueba las condiciones de ensayo son 23 a 26 °C y una humedad relativa del 50 al 65 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. 55
E. Clonación de un fragmento génico de PDD en un vector adecuado para la producción bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos
A continuación hay un ejemplo de clonación de un fragmento de ADN correspondiente a una diana génica de PDD 60 en un vector para la expresión de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier vector que comprende un promotor de T7 o cualquier otro promotor para la transcripción eficaz en bacterias (referencia al documento WO0001846).
Las secuencias de los cebadores específicos usados para la amplificación de los genes diana se proporcionan en la 65 Tabla 8-PX. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los
cebadores se usan en una reacción PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizó en gel de agarosa, se purificó (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonó con extremos romos en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuenció. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la secuencia respectiva tal como se proporciona en la Tabla 8-PX. 5
F. Expresión y producción de una diana de ARN bicatenario en dos cepas de Escherichia coli: (1) AB301-105(DE3), y, (2) BL21(DE3)
Se siguieron los procedimientos descritos a continuación para expresar niveles adecuados de ARN bicatenario 10 activo en insectos de diana de insectos en bacterias. Se usó una cepa deficiente en RNasaIII, AB301-105(DE3), en comparación con bacterias que contenían RNasaIII de tipo silvestre, BL21(DE3).
Transformación de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)
15
Se añadieron trescientos ng del plásmido y se mezclaron suavemente en una alícuota de 50 µl de la cepa de E. coli químicamente competente enfriada en hielo AB301-105(DE3) o BL21(DE3). Las células se incubaron sobre hielo durante 20 minutos antes de someterlas a un tratamiento de choque térmico de 37 °C durante 5 minutos, después de los cuales se pusieron de nuevo sobre hielo durante 5 minutos adicionales. Se añadieron cuatrocientos cincuenta µl de medio SOC a temperatura ambiente a las células y la suspensión se incubó en un agitador (250 rpm) a 37 °C 20 durante 1 hora. Se transfirieron cien µl de la suspensión de células bacterianas a un matraz cónico de 500 ml que contenía 150 ml de caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) líquido suplementado con 100 µg/ml de antibiótico de carbenicilina. El cultivo se incubó en un agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37 °C durante toda la noche (16 a 18 horas).
25
Inducción química de la expresión de ARN bicatenario en AB301-105(DE3) y BL21(DE3)
La expresión de ARN bicatenario a partir del vector recombinante en la cepa bacteriana AB301-105(DE3) o BL21(DE3) fue posible ya que estaban presentes todos los componentes genéticos para expresión controlada. En presencia del inductor químico isopropiltiogalactósido, o IPTG, la polimerasa T7 dirigirá la transcripción de la 30 secuencia diana en direcciones tanto antisentido como sentido ya que estas están flanqueadas por promotores de T7 orientados de manera opuesta.
La densidad óptica a 600 nm del cultivo bacteriano de una noche se midió usando un espectrofotómetro adecuado y se ajustó a un valor de 1 mediante la adición de caldo LB reciente. Se transfirieron cincuenta ml de este cultivo a un 35 tubo Falcon™ de 50 ml y el cultivo se centrifugó después a 3000 g a 15 °C durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante y el sedimento bacteriano se resuspendió en 50 ml de medio completo S reciente (medio SNC más 5 µg/ml de colesterol) suplementado con 100 µg/ml de carbenicilina e IPTG 1 mM. Las bacterias se indujeron durante 2 a 4 horas a temperatura ambiente.
40
Tratamiento con calor de bacterias
Las bacterias se destruyeron mediante tratamiento con calor para minimizar el riesgo de contaminación de la dieta artificial en las placas de ensayo. Sin embargo, el tratamiento con calor de las bacterias que expresaban ARN bicatenario no es un requisito previo para inducir la toxicidad hacia los insectos debido a la interferencia de ARN. El 45 cultivo bacteriano inducido se centrifugó a 3000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos, se desechó el sobrenadante y el sedimento se sometió a 80 °C durante 20 minutos en un baño con agua. Después del tratamiento con calor, el sedimento bacteriano se resuspendió en 1,5 ml de agua MilliQ y la suspensión se transfirió a un tubo de microcentrífuga. Se prepararon y usaron diversos tubos en los bioensayos para cada renovación. Los tubos se conservaron a -20 °C hasta su uso posterior. 50
G. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Plutella xylostella
Bioensayos basados en plantas 55
Se rocían plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas químicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los PDD con las plantas. Se cultivan en una cámara de cultivo de plantas. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plástico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recortó la base y se cubrió con una fina malla de nailon para permitir el 60 aireamiento, reducir la condensación en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan PDD en cada planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspensión de E. coli AB301-105(DE3) que portan el vector recombinante o el plásmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 células bacterianas en 1 ml de una suspensión bacteriana a un valor de densidad óptica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se rocía un volumen total de entre 1 65 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este ensayo. Se
cuenta el número de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.
El rociado de las plantas con una suspensión de la cepa bacteriana de E. coli AB301-105(DE3) que expresa ARNbc diana de vector recombinante da lugar a un drástico aumento en la mortalidad de los insectos en comparación con el control de pGN29. Estos experimentos demuestran que el ARN bicatenario correspondiente a una secuencia diana 5 de gen de insecto producida en sistemas de expresión bacteriana de tipo silvestre o deficientes en RNasaIII es tóxico para el insecto en cuanto a aumentos sustanciales en la mortalidad de los insectos y en el retraso en el crecimiento/desarrollo para los supervivientes larvarios. También está claro a partir de estos experimentos que se proporciona un ejemplo para proteger eficazmente a plantas/cultivos del daño por insectos mediante el uso de una pulverización de una formulación que consiste en bacterias que expresan ARN bicatenario correspondiente a un gen 10 diana de insecto.
Ejemplo 12: Acheta domesticus (grillo doméstico)
A. Clonación de secuencias parciales de Acheta domesticus 15
Se aisló ARN intacto de alta calidad de todos los estadios diferentes de Acheta domesticus (grillo doméstico; Fuente: Dr. Lara Senior, Insect Investigations Ltd., Capital Business Park, Wentloog, Cardiff, CF3 2PX, Gales, Reino Unido) usando reactivo TRIzoI® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico presente en la preparación de ARN se retiró mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante. Se generó ADNc usando 20 un kit comercialmente disponible (transcriptasa inversa SuperScript® III) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para aislar secuencias de ADNc que comprendían una porción de los genes AD001, AD002, AD009, AD015 y AD016, se realizó una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las instrucciones del fabricante. 25
Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificación de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-AD. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 50°C y 1 minuto y 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, 30 se purificaron (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR8/GW/TOPO® y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-AD y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoácidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID Nº respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-AD,
35
B. Producción de ARNbc de los genes de Acheta domesticus
Se sintetizó ARNbc en cantidades de miligramo usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express. En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en dirección 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una 40 orientación diferente con respecto al promotor de T7.
Para cada uno de los genes diana, se generó el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso específicos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-AD. Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: 1 45 minuto a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C (-0,5 °C/ciclo) y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 50 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se generó usando cebadores directos e inversos de T7 específicos en una reacción PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-50 AD. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificación PCR (kit de purificación PCR Qiaquick®) y precipitación de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-AD. 55
C. Recombinación de los genes de Acheta domesticus en el vector vegetal pK7GWIWG2D(II)
Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actúa a través de fragmentos de ARNbc, las secuencias nucleotídicas diana de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientación 60 antisentido y sentido, separados por el intrón - CmR - intrón, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construcción de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reacción de recombinación LR entre un clon de entrada que contenía attL (véase el Ejemplo 1) y un vector de destino que contenía attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a través de VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reacción de recombinación de LR se 65 llevó a cabo usando la mezcla enzimática LR Clonase™ II siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos
experimentos de clonación dieron como resultado una construcción en horquilla para cada uno de los genes diana, que tenían la orientación promotor - sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido y en el que el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para la transformación en A. tumefaciens.
5
Se realizaron digestiones con enzimas de restricción en los plásmidos de pCR8/GW/TOPO® que contenían las diferentes dianas (véase el Ejemplo 2). La banda que contenía el gen de interés flanqueado por los sitios de attL se purificó usando el kit de extracción en gel Qiaquick®. Se añadió una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 150 ng de pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubó durante al menos 1h a 25 °C. Después del tratamiento con la solución de proteinasa K (10 min a 37°C), la mezcla de recombinación completa se transformó 10 en las células químicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante análisis por digestión de restricción.
D. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc, usando dieta artificial para actividad contra larvas de Acheta domesticus 15
Se mantuvieron grillos domésticos, Acheta domesticus, en Insect Investigations Ltd. (origen: Blades Biological Ltd., Kent, Reino Unido). Los insectos se criaron con microgránulos de salvado y hojas de repollo. Se seleccionaron ninfas de ambos sexos del mismo tamaño y no más de 5 días de edad para su uso en la prueba. Se mezcló ARN bicatenario con una dieta de roedor en gránulos basada en trigo (dieta convencional de rata y ratón, B & K Universal 20 Ltd., Grimston, Aldbrough, Hull, Reino Unido). La dieta, BK001P, contiene los siguientes ingredientes en orden descendente en peso: trigo, soja, harina forrajera de trigo, cebada, aglutinante de gránulos, vitamina 5 de roedor, mezcla de grasas, fosfato dicálcico, carbamatos fungicidas. La dieta granulada para roedores se tritura finamente y se trata con calor en un horno de microondas antes de mezclar, para inactivar cualquier componente enzimático. Toda la dieta de roedor se toma del mismo lote para asegurar la uniformidad. La dieta triturada y el ARNbc se 25 mezclan exhaustivamente y se moldean en gránulos pequeños del mismo peso, que se dejan secar durante toda la noche a temperatura ambiente.
Se aplicaron muestras de ARN bicatenario de dianas y control de gfp a concentraciones de 10 µg/µl a una relación de 1 g de dieta molida más 1 ml de solución de ARNbc, dando como resultado de este modo una tasa de aplicación 30 de 10 mg de ARNbc por gramo de gránulos. Los gránulos se reemplazan cada semana. Se proporciona a los insectos gránulos tratados durante las primeras tres semanas de la prueba. A continuación se proporcionan gránulos no tratados. Los insectos se mantienen dentro de recipientes de plástico con tapa (9 cm de diámetro, 4,5 cm de profundidad), diez por recipiente. Cada arena contiene un gránulo cebo tratado y una fuente de agua (bola de algodón húmeda), cada uno colocado en un bote de bajo peso separado. El agua se repone a voluntad durante todo 35 el experimento.
Se realizan evaluaciones a intervalos de dos veces por semana, sin haber más de cuatro días entre las evaluaciones, hasta que todos los insectos habían muerto o mudado al estadio adulto (84 días). En cada evaluación los insectos se evalúan como vivos o muertos y se examinan en busca de anomalías. Desde el día 46 en adelante, 40 una vez que ha comenzado la muda a adulto, todos los insectos (vivos y muertos) se evalúan como ninfa o adulto. Los insectos supervivientes se pesan en el día 55 de la prueba. Se realizan cuatro replicados para cada uno de los tratamientos. Durante la prueba las condiciones de ensayo son 25 a 33 °C y una humedad relativa del 20 al 25 %, con un fotoperiodo de 12:12 horas de luz:oscuridad.
45
E. Clonación de un fragmento génico de GD en un vector adecuado para la producción bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos
A continuación hay un ejemplo de clonación de un fragmento de ADN correspondiente a una diana génica de GD en un vector para la expresión de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier vector 50 que comprende un promotor de T7 o cualquier otro promotor para la transcripción eficaz en bacterias (referencia al documento WO0001846).
Las secuencias de los cebadores específicos usados para la amplificación de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los 55 cebadores se usan en una reacción PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizó en gel de agarosa, se purificó (Kit de extracción de gel QIAquick®), se clonó con extremos romos en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuenció. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la secuencia respectiva tal como se proporciona en la Tabla 8-AD. 60
F. Expresión y producción de una diana de ARN bicatenario en dos cepas de Escherichia coli: (1) AB301-105(DE3), y, (2) BL21(DE3)
Se siguieron los procedimientos descritos a continuación para expresar niveles adecuados de ARN bicatenario 65 activo en insectos de diana de insectos en bacterias. Se usó una cepa deficiente en RNasaIII, AB301-105(DE3), en
comparación con bacterias que contenían RNasaIII de tipo silvestre, BL21(DE3).
Transformación de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)
Se añadieron trescientos ng del plásmido y se mezclaron suavemente en una alícuota de 50 µl de la cepa de E. coli 5 químicamente competente enfriada en hielo AB301-105(DE3) o BL21(DE3). Las células se incubaron sobre hielo durante 20 minutos antes de someterlas a un tratamiento de choque térmico de 37 °C durante 5 minutos, después de los cuales se pusieron de nuevo sobre hielo durante 5 minutos adicionales. Se añadieron cuatrocientos cincuenta µl de medio SOC a temperatura ambiente a las células y la suspensión se incubó en un agitador (250 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Se transfirieron cien µl de la suspensión de células bacterianas a un matraz cónico de 500 ml que 10 contenía 150 ml de caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) líquido suplementado con 100 µg/ml de antibiótico de carbenicilina. El cultivo se incubó en un agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37 °C durante toda la noche (16 a 18 horas).
Inducción química de la expresión de ARN bicatenario en AB301-105(DE3) y BL21(DE3) 15
La expresión de ARN bicatenario a partir del vector recombinante en la cepa bacteriana AB301-105(DE3) o BL21(DE3) fue posible ya que estaban presentes todos los componentes genéticos para expresión controlada. En presencia del inductor químico isopropiltiogalactósido, o IPTG, la polimerasa T7 dirigirá la transcripción de la secuencia diana en direcciones tanto antisentido como sentido ya que estas están flanqueadas por promotores de 20 T7 orientados de manera opuesta.
La densidad óptica a 600 nm del cultivo bacteriano de una noche se midió usando un espectrofotómetro adecuado y se ajustó a un valor de 1 mediante la adición de caldo LB reciente. Se transfirieron cincuenta ml de este cultivo a un tubo Falcon™ de 50 ml y el cultivo se centrifugó después a 3000 g a 15 °C durante 10 minutos. Se retiró el 25 sobrenadante y el sedimento bacteriano se resuspendió en 50 ml de medio completo S reciente (medio SNC más 5 µg/ml de colesterol) suplementado con 100 µg/ml de carbenicilina e IPTG 1 mM. Las bacterias se indujeron durante 2 a 4 horas a temperatura ambiente.
Tratamiento con calor de bacterias 30
Las bacterias se destruyeron mediante tratamiento con calor para minimizar el riesgo de contaminación de la dieta artificial en las placas de ensayo. Sin embargo, el tratamiento con calor de las bacterias que expresaban ARN bicatenario no es un requisito previo para inducir la toxicidad hacia los insectos debido a la interferencia de ARN. El cultivo bacteriano inducido se centrifugó a 3000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos, se desechó el 35 sobrenadante y el sedimento se sometió a 80 °C durante 20 minutos en un baño con agua. Después del tratamiento con calor, el sedimento bacteriano se resuspendió en 1,5 ml de agua MilliQ y la suspensión se transfirió a un tubo de microcentrífuga. Se prepararon y usaron diversos tubos en los bioensayos para cada renovación. Los tubos se conservaron a -20 °C hasta su uso posterior.
40
G. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Acheta domesticus
Bioensayos basados en plantas
45
Se rocían plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas químicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los GD con las plantas. Se cultivan en una cámara de cultivo de plantas. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plástico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recortó la base y se cubrió con una fina malla de nailon para permitir el aireamiento, reducir la condensación en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan GD en cada 50 planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspensión de E. coli AB301-105(DE3) que portan el vector recombinante o el plásmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 células bacterianas en 1 ml de una suspensión bacteriana a un valor de densidad óptica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se rocía un volumen total de entre 1 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este ensayo. Se 55 cuenta el número de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.
El rociado de las plantas con una suspensión de la cepa bacteriana de E. coli AB301-105(DE3) que expresa ARNbc diana de vector recombinante da lugar a un drástico aumento en la mortalidad de los insectos en comparación con el control de pGN29. Estos experimentos demuestran que el ARN bicatenario correspondiente a una secuencia diana 60 de gen de insecto producida en sistemas de expresión bacteriana de tipo silvestre o deficientes en RNasaIII es tóxico para el insecto en cuanto a aumentos sustanciales en la mortalidad de los insectos y en el retraso en el crecimiento/desarrollo para los supervivientes larvarios. También está claro a partir de estos experimentos que se proporciona un ejemplo para proteger eficazmente a plantas/cultivos del daño por insectos mediante el uso de una pulverización de una formulación que consiste en bacterias que expresan ARN bicatenario correspondiente a un gen 65 diana de insecto.
Ejemplo 13: Pyricularia grisea (tizón del arroz)
A. Clonación de secuencias parciales de P. grisea
Se aísla ARN intacto, de alta calidad de diferentes estadios de crecimiento de P. grisea usando reactivo TRIzol® 5 siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico presente en la preparación de ARN se retira mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante. Se genera ADNc usando un kit comercialmente disponible (transcriptasa inversa SuperScript® III) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para aislar secuencias de ADNc que comprenden una porción del gen diana, se realiza PCR con cebadores 10 degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las instrucciones del fabricante. Los productos de PCR resultantes se fraccionan y secuencian.
B. Producción de ARNbc de genes de P. grisea
15
Se sintetiza ARNbc en cantidades de miligramo usando un kit comercialmente disponible, tal como sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los productos PCR resultantes se analizan en gel de agarosa y se purifican mediante el kit de purificación PCR (por ejemplo, kit de purificación PCR Qiaquick®) y precipitación de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclan y las hebras de ARN resultantes se hibridan, después se tratan con DNasa y RNasa y se purifican con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones 20 del fabricante.
C. Recombinación de diana de P. grisea en el vector vegetal pK7GWIWG2D(II)
Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actúa a través de fragmentos de ARNbc, las secuencias 25 nucleotídicas de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientación antisentido y sentido, separados por el intrón - CmR - intrón, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construcción de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reacción de recombinación LR entre un clon de entrada que contenía attL (véase el Ejemplo A) y un vector de destino que contenía attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a través de VIB/Plant Systems 30 Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reacción de recombinación de LR se llevó a cabo usando la mezcla enzimática LR Clonase™ II siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos experimentos de clonación dieron como resultado una construcción en horquilla para el gen diana, que tenían la orientación promotor - sentido - intrón - CmR - intrón - antisentido y en el que el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para la transformación en A. tumefaciens. 35
Se realizaron digestiones con enzimas de restricción en los plásmidos de pCR8/GW/TOPO® que contenían la diana (véase el Ejemplo B). La banda que contenía el gen de interés flanqueado por los sitios de attL se purificó usando el kit de extracción en gel Qiaquick®. Se añadió una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 150 ng de pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubó durante al menos 1h a 25 °C. Después del 40 tratamiento con la solución de proteinasa K (10 min a 37°C), la mezcla de recombinación completa se transformó en las células químicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante análisis por digestión de restricción.
D. Expresión y producción de una diana de ARN bicatenario en dos cepas de Escherichia coli: (1) AB301-45 105(DE3), y, (2) BL21(DE3)
Se siguieron los procedimientos descritos a continuación para expresar niveles adecuados de ARN bicatenario de diana fúngica en bacterias. Se usó una cepa deficiente en RNasaIII, AB301-105(DE3), en comparación con bacterias que contenían RNasaIII de tipo silvestre, BL21(DE3). 50
Transformación de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)
Se añadieron trescientos ng del plásmido y se mezclaron suavemente en una alícuota de 50 µl de la cepa de E. coli químicamente competente enfriada en hielo AB301-105(DE3) o BL21(DE3). Las células se incubaron sobre hielo 55 durante 20 minutos antes de someterlas a un tratamiento de choque térmico de 37 °C durante 5 minutos, después de los cuales se pusieron de nuevo sobre hielo durante 5 minutos adicionales. Se añadieron cuatrocientos cincuenta µl de medio SOC a temperatura ambiente a las células y la suspensión se incubó en un agitador (250 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Se transfirieron cien µl de la suspensión de células bacterianas a un matraz cónico de 500 ml que contenía 150 ml de caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) líquido suplementado con 100 µg/ml de antibiótico de 60 carbenicilina. El cultivo se incubó en un agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37 °C durante toda la noche (16 a 18 horas).
Inducción química de la expresión de ARN bicatenario en AB301-105(DE3) y BL21(DE3)
La expresión de ARN bicatenario a partir del vector recombinante en la cepa bacteriana AB301-105(DE3) o BL21(DE3) fue posible ya que estaban presentes todos los componentes genéticos para expresión controlada. En presencia del inductor químico isopropiltiogalactósido, o IPTG, la polimerasa T7 dirigirá la transcripción de la 5 secuencia diana en direcciones tanto antisentido como sentido ya que estas están flanqueadas por promotores de T7 orientados de manera opuesta.
La densidad óptica a 600 nm del cultivo bacteriano de una noche se midió usando un espectrofotómetro adecuado y se ajustó a un valor de 1 mediante la adición de caldo LB reciente. Se transfirieron cincuenta ml de este cultivo a un 10 tubo Falcon™ de 50 ml y el cultivo se centrifugó después a 3000 g a 15 °C durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante y el sedimento bacteriano se resuspendió en 50 ml de medio completo S reciente (medio SNC más 5 µg/ml de colesterol) suplementado con 100 µg/ml de carbenicilina e IPTG 1 mM. Las bacterias se indujeron durante 2 a 4 horas a temperatura ambiente.
15
Tratamiento con calor de bacterias
Las bacterias se destruyeron mediante tratamiento con calor para minimizar el riesgo de contaminación de la dieta artificial en las placas de ensayo. Sin embargo, el tratamiento con calor de las bacterias que expresaban ARN bicatenario no es un requisito previo para inducir la toxicidad hacia los insectos debido a la interferencia de ARN. El 20 cultivo bacteriano inducido se centrifugó a 3000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos, se desechó el sobrenadante y el sedimento se sometió a 80 °C durante 20 minutos en un baño con agua. Después del tratamiento con calor, el sedimento bacteriano se resuspendió en 1,5 ml de agua MilliQ y la suspensión se transfirió a un tubo de microcentrífuga. Se prepararon y usaron diversos tubos en los bioensayos para cada renovación. Los tubos se conservaron a -20 °C hasta su uso posterior. 25
Tabla 1 A
DI de C.elegans
ID de D. melanogaster Descripción Exploración de ARNi Devgen
B0250.1
CG1263 Proteína de subunidad ribosómica grande L8. Aguda letal o letal
B0336.10
CG3661 Proteína de subunidad ribosómica grande L23. Aguda letal o letal
B0336.2
CG8385 Factor de ribosilación de ADP. Aguda letal o letal
B0464.1
CG3821 Aspartil(D) ARNt sintetasa putativa. Aguda letal o letal
C01G8.5
CG10701 Ortólogo de la familia ERM de enlazantes citoesqueléticos. Aguda letal o letal
C01H6.5
CG33183 Receptor de hormonas nucleares que se requiere en todas las mudas larvarias Aguda letal o letal
C02C6.1
CG18102 Miembro de la clase génica relacionada con DYNamina Aguda letal o letal
C03D6.8
CG6764 Proteína de subunidad ribosómica grande L24 (R1p24p). Aguda letal o letal
C04F12.4
CG6253 rpl-14 codifica una proteína de subunidad ribosómica grande de L14. Aguda letal o letal
C04H5.6
CG10689 Producto con actividad ARN helicasa (EC:2.7.7.) implicado en el corte y empalme de ARNm nuclear, mediante espliceosoma que es un componente del complejo de espliceosoma. Embrionaria letal o estéril
C13B9.3
CG14813 Subunidad delta del complejo de coatómero (COPI). Aguda letal o letal
C17H12.14
CG1088 Miembro de la clase génica de ATPasa vacuolar H. Aguda letal o letal
C26E6.4
CG3180 ARN polimerasa II dirigida por ADN. Aguda letal o letal
F23F12.6
CG16916 Subunidad de ATPasa triple A del subcomplejo de base de partícula reguladora 19S del proteasoma 26S (RP) Aguda letal o letal
F57B9.10
CG10149 Miembro de la clase génica de tipo no ATPasa, partícula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal
K11D9.2
CG3725 Homólogo de Ca[2+] ATPasa del retículo sarcoendoplásmico. Embrionaria letal o estéril
T20G5.1
CG9012 Cadena pesada de clatrina Aguda letal o letal
T20H4.3
CG5394 Prolil-ARNt sintetasa (ProRS) citoplásmica predicha. Aguda letal o letal
T21E12.4
CG7507 Homólogo de cadena pesada de dineína citoplasmática. Aguda letal o letal
C05C10.3
CG1140 ortólogo del gen humano 3-OXOÁCIDO COA TRANSFERASA Aguda letal o letal
DI de C.elegans
ID de D. melanogaster Descripción Exploración de ARNi Devgen
C09D4.5
CG2746 Proteína ribosómica L19, constituyente estructural de ribosoma implicado en la biosíntesis de proteínas que se localiza en el ribosoma. Aguda letal o letal
C09E10.2
CG31140 Ortólogo de diacilglicerol cinasa implicado en el movimiento, oviposición y transmisión sináptica y se expresa en neuronas. Aguda letal o letal
C13B9.3
CG14813 Subunidad delta del coatómero (COPI). Aguda letal o letal
C14B9.7
CG12775 Proteína de subunidad ribosómica grande L21 (RPL-21) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal
C15H11.7
CG30382 Subunidad tipo 6 alfa de la partícula del núcleo de proteasa 20S del proteasoma 26S (CP). Aguda letal o letal
C17E4.9
CG9261 Proteína implicada en el complejo de ATPasa que intercambia Na+/K+. Embrionaria letal o estéril
C17H12.14
CG1088 Subunidad E de V-ATPasa. Aguda letal o letal
C23G10.4
CG11888 Subunidad no ATPasa del subcomplejo de base de partícula reguladora 19S del proteasoma 26S (RPN-2). Aguda letal o letal
C26D10.2
CG7269 Producto con actividad helicasa implicado en el corte y empalme de ARNm nuclear, mediante espliceasoma que se localiza en el núcleo. Aguda letal o letal
C26E6.4
CG3180 Subunidad de 140 kD de ARN polimerasa II (RpII 140), actividad de ARN polimerasa dirigida por ADN (EC:2.7.7.6) implicada en la transcripción del promotor Pol II que es un componente del complejo de núcleo de ARN polimerasa II dirigida por ADN. Aguda letal o letal
C26F1.4
CG15697 Producto con función en la biosíntesis de proteínas y ubiquitina en la degradación de proteínas. Aguda letal o letal
C30C11.1
CG12220 Función desconocida. Aguda letal o letal
C30C11.2
CG10484 Miembro de la clase génica de tipo no ATPasa, partícula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal
C36A4.2
CG13977 Citocromo P450. Aguda letal o letal
C37C3.6
CG33103 Ortólogo de trombospondina, papilina y lacunina. Aguda letal o letal
C37H5.8
CG8542 Miembro de la clase génica de proteína de choque térmico. Aguda letal o letal
C39F7.4
CG3320 Proteína Rab-1 implicada en la adhesión celular. Aguda letal o letal
C41C4.8
CG2331 ATPasa del retículo endoplasmático transicional TER94, organización y biogénesis del Golgi. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento
C42D8.5
CG8827 Proteína similar a ACE. Aguda letal o letal
C47E12.5
CG1782 Enzima activadora de ubiquitina, función en una reacción dependiente de ATP que activa ubiquitina antes de su conjugación a proteínas que se degradarán posteriormente por el proteasoma 26S. Aguda letal o letal
C47E8.5
CG1242 Miembro de la clase génica de formación de DAuer anómala. Aguda letal o letal
C49H3.11
CG5920 Proteína de subunidad ribosómica pequeña S2. Aguda letal o letal
C52E4.4
CG1341 Miembro de la clase génica de tipo ATPasa, partícula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal
C56C10.3
CG8055 Proteína vehículo potencialmente implicada en el transporte intracelular de proteínas. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento
CD4.6
CG4904 Subunidad tipo 1 alfa de la partícula del núcleo de proteasa 20S del proteasoma 26S (CP). Aguda letal o letal
D1007.12
CG9282 Proteína de subunidad ribosómica grande L24. Aguda letal o letal
DI de C.elegans
ID de D. melanogaster Descripción Exploración de ARNi Devgen
D1054.2
CG5266 Miembro de la clase génica de subunidad alfa de proteasoma. Aguda letal o letal
D1081.8
CG6905 Proteína transformante de MYB. Aguda letal o letal
F07D10.1
CG7726 Proteína de subunidad ribosómica grande L11 (RPL-11.2) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal
F11C3.3
CG17927 Cadena pesada de miosina muscular (MHC B). Aguda letal o letal
F13B10.2
CG4863 Proteína L3 de subunidad ribosómica grande (rp1-3). Aguda letal o letal
F16A11.2
CG9987 Tipo de proteína hipotética de Methanococcus 0682. Aguda letal o letal
F20B6.2
CG17369 Subunidad B de V-ATPasa. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento
F23F12.6
CG16916 Subunidad de ATPasa triple A del subcomplejo de base de partícula reguladora 19S del proteasoma 26S (RP) (RPT-3). Aguda letal o letal
F25H5.4
CG2238 Factor de elongación de la traducción 2 (EF-2), una proteína de unión a GTP implicada en la síntesis de proteínas. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento
F26D10.3
CG4264 Miembro de la clase génica de proteína de choque térmico. Aguda letal o letal
F28C6.7
CG6846 Proteína de subunidad ribosómica grande L26 (RPL-26) implicada en la biosíntesis de proteínas. Embrionaria letal o estéril
F28D1.7
CG8415 Proteína de subunidad ribosómica pequeña (S23) (RPS-23) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal
F29G9.5
CG5289 Miembro de la clase génica de tipo ATPasa, partícula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal
F32H2.5
CG3523 Proteína mitocondrial. Aguda letal o letal
F37C12.11
CG2986 Proteína de subunidad ribosómica pequeña (S21) (RPS-21) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal
F37C12.4
CG7622 Proteína de subunidad ribosómica grande L36 (RPL-36) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal
F37C12.9
CG1527 Proteína de subunidad ribosómica pequeña (S14) (RPS-14) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal
F38E11.5
CG6699 Subunidad beta' (beta-prima) del complejo de coatómero (COPI). Aguda letal o letal
F39B2.6
CG10305 Proteína de subunidad ribosómica pequeña (S26) (RPS-26) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal
F39H11.5
CG12000 Miembro de la clase génica de subunidad beta de proteasoma. Aguda letal o letal
F40F8.10
CG3395 Proteína ribosómica S9 (RpS9), constituyente estructural de ribosoma implicado en la biosíntesis de proteínas que es un componente de la subunidad ribosómica pequeña citosólica. Aguda letal o letal
F42C5.8
CG7808 Proteína de subunidad ribosómica pequeña (S8) (RPS-8) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal
F49C12.8.
CG5378 Miembro de la clase génica de tipo no ATPasa, partícula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal
F53A3.3
CG2033 Proteína de subunidad ribosómica pequeña S15a. Aguda letal o letal
F53G12.10
CG4897 Proteína L7 de subunidad ribosómica grande (rp1-7). Aguda letal o letal
F54A3.3
CG8977 Función desconocida. Aguda letal o letal
DI de C.elegans
ID de D. melanogaster Descripción Exploración de ARNi Devgen
F54E2.3
CG1915 Producto con actividad cinasa de cadena ligera de miosina sallimus (sls) (EC:2.7.1.117) implicado en la condensación de cromosoma mitótico que se localiza en el núcleo.
F54E7.2
CG11271 Proteína de subunidad ribosómica pequeña (S12) (RPS-12) implicada en la biosíntesis de proteínas. Aguda letal o letal
F55A11.2
CG4214 Miembro de la clase génica de SYNtaxina. Aguda letal o letal
F55A3.3
CG1828 Factor de transcripción. Aguda letal o letal
F55C10.1
CG11217 Ortólogo de calcineurina B, la subunidad reguladora de la proteína fosfatasa 2B. Aguda letal o letal
F56F3.5
CG2168 rps-1 codifica una proteína de subunidad ribosómica pequeña S3A. Aguda letal o letal
F57B9.10
CG10149 Miembro de la clase génica de tipo no ATPasa, partícula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal
F58F12.1
CG2968 ATP sintasa. Aguda letal o letal
F59E10.3
CG3948 Subunidad zeta del complejo de coatómero (COPI). Aguda letal o letal
JC8.3
CG3195 Proteína L12 de subunidad ribosómica grande (rpl-12). Aguda letal o letal
K01G5.4
CG1404 GTPasa monomérica pequeña RAN potencial (adhesión celular). Aguda letal o letal
K04F10.4
CG 18734 Subtilasa. Aguda letal o letal
K05C4.1
CG12323 Miembro de la clase génica de subunidad beta de proteasoma. Aguda letal o letal
K07D4.3
CG18174 Partícula reguladora del proteasoma potencial, subcomplejo de tapa, rpn11 Aguda letal o letal
K11D9.2
CG3725 Ca[2+] ATPasa del retículo sarcoendoplásmico. Embrionaria letal o estéril; Aguda letal o letal
M03F4.2
CG4027 Una actina que se expresa en la pared corporal y músculos vulvares y la espermateca. Aguda letal o letal
R06A4.9
CG1109 Seis repeticiones de WD40. Aguda letal o letal
R10E11.1
CG15319 Cofactor transcripcional potencial. Aguda letal o letal
R12E2.3
CG3416 Proteína con actividad endopeptidasa implicada en la proteolisis y peptidolisis. Aguda letal o letal
F10C1.2
CG10119 Miembro de la clase génica B de filamento intermedio. Embrionaria letal o estéril
F35G12.8
CG11397 Homólogo de la subunidad SMC4 de condensina mitótica. Embrionaria letal o estéril
F53G12.1
CG5771 Homólogo de GTPasa. Embrionaria letal o estéril
F54E7.3
CG5055 Proteína que contiene dominio PDZ. Embrionaria letal o estéril
H28O16.1
CG3612 ATP sintasa. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento
K12C11.2
CG4494 Miembro de la clase génica homóloga de SUMO (relacionada con ubiquitina). Embrionaria letal o estéril
R12E2.3
CG3416 Miembro de la clase génica de tipo no ATPasa, partícula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal
R13A5.8
CG6141 Proteína ribosómica L9, constituyente estructural de ribosoma implicado en la biosíntesis de proteínas que se localiza en el ribosoma. Aguda letal o letal
T01C3.6
CG4046 rps-16 codifica una proteína de subunidad ribosómica pequeña S16. Aguda letal o letal
DI de C.elegans
ID de D. melanogaster Descripción Exploración de ARNi Devgen
T01H3.1
CG7007 Proteína de tipo proteína proteolipídica PPA1. Aguda letal o letal
T05C12.7
CG5374 Chaperonina citosólica. Aguda letal o letal
T05H4.6
CG5605 Subunidad 1 del factor de liberación de cadena peptídica eucariota. Aguda letal o letal
T10H9.4
CG17248 N-sinaptobrevina; v-SNARE, transporte mediado por vesículas, vesícula sináptica.
T14F9.1
CG7332 Subunidad de ATPasa. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento
T20G5.1
CG9012 Cadena pesada de clatrina Aguda letal o letal
T21B10.7
CG7033 Proteína 1 de complejo t. Embrionaria letal o estéril
W09B12.1
CG17907 Acetilcolinesterasa.
T27F2.1
CG8264 Miembro de la clase génica homóloga SKIP (proteína que interactúa con Ski) de mamífero. Aguda letal o letal
ZC434.5
CG5394 Glutamil-ARNt sintetasa mitocondrial predicha (GluRS). Aguda letal o letal
B0511.6
CG6375 Helicasa. Embrionaria letal o estéril
DY3.2
CG10119 Lamina nuclear; proteína LMN-1. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento
R13G10.1
CG11397 Homólogo de la subunidad SMC4 de condensina mitótica. Tipo silvestre
T26E3.7
CG3612 Proteína mitocondrial predicha. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento
Y113G7A.3
CG1250 Activador de GTPasa, transporte de proteínas de ER al Golgi, componente del la pila del Golgi. Aguda letal o letal
Y43B11AR.4
CG11276 Proteína ribosómica S4 (RpS4), constituyente estructural de ribosoma implicado en la biosíntesis de proteínas que es un componente de la subunidad ribosómica pequeña citosólica. Aguda letal o letal
Y46G5A.4
CG5931 Gen Y46G5A.4. Aguda letal o letal
Y71F9AL.17
CG7961 Subunidad alfa del complejo de coatómero (COPI). Aguda letal o letal
Y76B12C.7
CG10110 Factor de escisión génica y especificidad de poliadenilación. Embrionaria letal o estéril
Y37D8A.10
CG1751 Función desconocida. Embrionaria letal o estéril
CG7765
C06G3.2 Miembro de la clase génica de proteína de tipo kinesina.
CG10922
C44E4.4 Proteína de unión a ARN. Embrionaria letal o estéril
CG4145
F01G12.5 Colágeno de tipo IV alfa-2. Embrionaria letal o estéril
CG13391
F28H1.3 Alanil-ARNt sintetasa (AlaRS) citoplasmática no predicha. Retardo del crecimiento o detención del crecimiento
CG7765
R05D3.7 Miembro de la clase génica descoordinada. Embrionaria letal o estéril
CG7398
R06A4.4 Miembro de la clase génica de la familia de importina beta. Embrionaria letal o estéril
DI de C.elegans
ID de D. melanogaster Descripción Exploración de ARNi Devgen
CG7436
T17E9.2 Función desconocida. Embrionaria letal o estéril
CG2666
T25G3.2 Quitina sintasa potencial. Embrionaria letal o estéril
CG17603
W04A8.7 Factor asociado a proteína de unión a TATA, TAFIL (TAFII250). Embrionaria letal o estéril
Tablas 1-LD/TC/MP/NL/CS/AD
ID de diana
Identificador Dm SEC ID Nº NA SEC ID Nº AA Función (basada en Flybase)
LD002
CG8055 3 4 Proteína vehículo que está implicada potencialmente en el transporte de células intracelulares
TC002
CG8055 795 796
MP002
CG8055 890 891
NL002
CG8055 1073 1074
CS002
CG8055 1684 1685
AD002
CG8055 2366 2367
Tabla 2-LD Tabla 3-LD
ID de diana
Cebador directo 5' → 3' Cebador inverso 5' → 3' Secuencia de ADNc (hebra con sentido) 5' → 3' Secuencia de aminoácidos correspondiente de clon de ADNc
LD001
SEC ID Nº: 25 SEC ID Nº: 26 SEC ID Nº: 1 SEC ID Nº: 2 (fase +1)
LD002
SEC ID Nº: 27 SEC ID Nº: 28 SEC ID Nº: 3 SEC ID Nº: 4 (fase -3)
LD003
SEC ID Nº: 29 SEC ID Nº: 30 SEC ID Nº: 5 SEC ID Nº: 6 (fase -2)
LD006
SEC ID Nº: 31 SEC ID Nº: 32 SEC ID Nº: 7 SEC ID Nº: 8 (fase +1)
LD007
SEC ID Nº: 33 SEC ID Nº: 34 SEC ID Nº: 9 SEC ID Nº: 10 (fase +1)
LD010
SEC ID Nº: 35 SEC ID Nº: 36 SEC ID Nº: 11 SEC ID Nº: 12 (fase +1)
LD011
SEC ID Nº: 37 SEC ID Nº: 38 SEC ID Nº: 13 SEC ID Nº: 14 (fase -1)
LD014
SEC ID Nº: 39 SEC ID Nº: 40 SEC ID Nº: 15 SEC ID Nº: 16 (fase +3)
LD014_F1
SEC ID Nº: 159
LD014_F2
SEC ID Nº: 160
LD014_C1
SEC ID Nº: 161
LD014_C2
SEC ID Nº: 162
LD015
SEC ID Nº: 41 SEC ID Nº: 42 SEC ID Nº: 17 SEC ID Nº: 18 (fase -1)
LD016
SEC ID Nº: 43 SEC ID Nº: 44 SEC ID Nº: 19 SEC ID Nº: 20 (fase -2)
LD018
SEC ID Nº: 45 SEC ID Nº: 46 SEC ID Nº: 21 SEC ID Nº: 22 (fase +2)
LD027
SEC ID Nº: 47 SEC ID Nº: 48 SEC ID Nº: 23 SEC ID Nº: 24 (fase +1)
5
Tabla 2-PC Tabla 3-PC
ID de diana
Cebador directo 5' → 3' Cebador inverso 5' → 3' Secuencia de ADNc (hebra con sentido) 5' → 3' Secuencia de aminoácidos correspondiente de clon de ADNc
PC001
SEC ID Nº: 261 SEC ID Nº: 262 SEC ID Nº: 247 SEC ID Nº: 248 (fase +1)
PC003
SEC ID Nº: 263 SEC ID Nº: 264 SEC ID Nº: 249 SEC ID Nº: 250 (fase +2)
PC005
SEC ID Nº: 265 SEC ID Nº: 266 SEC ID Nº: 251 SEC ID Nº: 252 (fase +3)
PC010
SEC ID Nº: 267 SEC ID Nº: 268 SEC ID Nº: 253 SEC ID Nº: 254 (fase +3)
PC014
SEC ID Nº: 269 SEC ID Nº: 270 SEC ID Nº: 255 SEC ID Nº: 256 (fase +3)
PC016
SEC ID Nº: 271 SEC ID Nº: 272 SEC ID Nº: 257 SEC ID Nº: 258 (fase +2)
PC027
SEC ID Nº: 273 SEC ID Nº: 274 SEC ID Nº: 259 SEC ID Nº: 260 (fase +1)
Tabla 2-EV Tabla 3-EV
ID de diana
Cebador directo 5' → 3' Cebador inverso 5' → 3' Secuencia de ADNc (hebra con sentido) 5' → 3' Secuencia de aminoácidos correspondiente de clon de ADNc
EV005
SEC ID Nº: 523 SEC ID Nº: 524 SEC ID Nº: 513 SEC ID Nº: 514 (fase +3)
EV009
SEC ID Nº: 525 SEC ID Nº: 526 SEC ID Nº: 515 SEC ID Nº: 516 (fase +1)
EV010
SEC ID Nº: 527 SEC ID Nº: 528 SEC ID Nº: 517 SEC ID Nº: 518 (fase +3)
EV015
SEC ID Nº: 529 SEC ID Nº: 530 SEC ID Nº: 519 SEC ID Nº: 520 (fase +1)
ID de diana
Cebador directo 5' → 3' Cebador inverso 5' → 3' Secuencia de ADNc (hebra con sentido) 5' → 3' Secuencia de aminoácidos correspondiente de clon de ADNc
EV016
SEC ID Nº: 531 SEC ID Nº: 532 SEC ID Nº: 521 SEC ID Nº: 522 (fase +2)
Tabla 2-AG Tabla 3-AG
ID de diana
Cebador directo 5' → 3' Cebador inverso 5' → 3' Secuencia de ADNc (hebra con sentido) 5' → 3' Secuencia de aminoácidos correspondiente de clon de ADNc
AG001
SEC ID Nº: 611 SEC ID Nº: 612 SEC ID Nº: 601 SEC ID Nº: 602 (fase +1)
AG005
SEC ID Nº: 613 SEC ID Nº: 614 SEC ID Nº: 603 SEC ID Nº: 604 (fase +2)
AG010
SEC ID Nº: 615 SEC ID Nº: 616 SEC ID Nº: 605 SEC ID Nº: 606 (fase +3)
AG014
SEC ID Nº: 617 SEC ID Nº: 618 SEC ID Nº: 607 SEC ID Nº: 608 (fase +3)
AG016
SEC ID Nº: 619 SEC ID Nº: 620 SEC ID Nº: 609 SEC ID Nº: 610 (fase +1)
Tabla 2-TC Tabla 3-TC 5
ID de diana
Cebador directo 5' → 3' Cebador inverso 5' → 3' Secuencia de ADNc (hebra con sentido) 5' → 3' Secuencia de aminoácidos correspondiente de clon de ADNc
TC001
SEC ID Nº: 803 SEC ID Nº: 804 SEC ID Nº: 793 SEC ID Nº: 794 (fase +1)
TC002
SEC ID Nº: 805 SEC ID Nº: 806 SEC ID Nº: 795 SEC ID Nº: 796 (fase +1)
TC010
SEC ID Nº: 807 SEC ID Nº: 808 SEC ID Nº: 797 SEC ID Nº: 798 (fase +3)
TC014
SEC ID Nº: 809 SEC ID Nº: 810 SEC ID Nº: 799 SEC ID Nº: 800 (fase +1)
TC015
SEC ID Nº: 811 SEC ID Nº: 812 SEC ID Nº: 801 SEC ID Nº: 802 (fase +2)
Tabla 2-MP Tabla 3-MP
ID de diana
Cebador directo 5' → 3' Cebador inverso 5' → 3' Secuencia de ADNc (hebra con sentido) 5' → 3' Secuencia de aminoácidos correspondiente de clon de ADNc
MP001
SEC ID Nº: 898 SEC ID Nº: 899 SEC ID Nº: 888 SEC ID Nº: 889 (fase +1)
MP002
SEC ID Nº: 900 SEC ID Nº: 901 SEC ID Nº: 890 SEC ID Nº: 891 (fase +2)
MP010
SEC ID Nº: 902 SEC ID Nº: 903 SEC ID Nº: 892 SEC ID Nº: 893 (fase +3)
MP016
SEC ID Nº: 904 SEC ID Nº: 905 SEC ID Nº: 894 SEC ID Nº: 895 (fase +1)
MP027
SEC ID Nº: 906 SEC ID Nº: 907 SEC ID Nº: 896 SEC ID Nº: 897 (fase +3)
Tabla 2-NL Tabla 3-NL
ID de diana
Cebador directo 5' → 3' Cebador inverso 5' → 3' Secuencia de ADNc (hebra con sentido) 5' → 3' Secuencia de aminoácidos correspondiente de clon de ADNc
NL001
SEC ID Nº: 1117 SEC ID Nº: 1118 SEC ID Nº: 1071 SEC ID Nº: 1072 (fase +2)
NL002
SEC ID Nº: 1119 SEC ID Nº: 1120 SEC ID Nº: 1073 SEC ID Nº: 1074 (fase +1)
NL003
SEC ID Nº: 1121 SEC ID Nº: 1122 SEC ID Nº: 1075 SEC ID Nº: 1076 (fase +2)
NL004
SEC ID Nº: 1123 SEC ID Nº: 1124 SEC ID Nº: 1077 SEC ID Nº: 1078 (fase +1)
NL005
SEC ID Nº: 1125 SEC ID Nº: 1126 SEC ID Nº: 1079 SEC ID Nº: 1080 (fase +1)
NL006
SEC ID Nº: 1127 SEC ID Nº: 1128 SEC ID Nº: 1081 SEC ID Nº: 1082 (fase +3)
NL007
SEC ID Nº: 1129 SEC ID Nº: 1130 SEC ID Nº: 1083 SEC ID Nº: 1084 (fase +2)
NL008
SEC ID Nº: 1131 SEC ID Nº: 1132 SEC ID Nº: 1085 SEC ID Nº: 1086 (fase +1)
NL009
SEC ID Nº: 1133 SEC ID Nº: 1134 SEC ID Nº: 1087 SEC ID Nº: 1088 (fase +1)
NL010
SEC ID Nº: 1135 SEC ID Nº: 1136 SEC ID Nº: 1089 (extremo amino terminal) SEC ID Nº: 1115 (extremo C terminal) SEC ID Nº: 1090 (extremo amino terminal) (fase +2) SEC ID Nº: 1116 (extremo carboxilo terminal) (fase +3)
NL011
SEC ID Nº: 1137 SEC ID Nº: 1138 SEC ID Nº: 1091 SEC ID Nº: 1092 (fase +2)
NL012
SEC ID Nº: 1139 SEC ID Nº: 1140 SEC ID Nº: 1093 SEC ID Nº: 1094 (fase +2)
NL013
SEC ID Nº: 1141 SEC ID Nº: 1142 SEC ID Nº: 1095 SEC ID Nº: 1096 (fase +2)
NL014
SEC ID Nº: 1143 SEC ID Nº: 1144 SEC ID Nº: 1097 SEC ID Nº: 1098 (fase +2)
NL015
SEC ID Nº: 1145 SEC ID Nº: 1146 SEC ID Nº: 1099 SEC ID Nº: 1100 (fase +1)
NL016
SEC ID Nº: 1147 SEC ID Nº: 1148 SEC ID Nº: 1101 SEC ID Nº: 1102 (fase +2)
ID de diana
Cebador directo 5' → 3' Cebador inverso 5' → 3' Secuencia de ADNc (hebra con sentido) 5' → 3' Secuencia de aminoácidos correspondiente de clon de ADNc
NL018
SEC ID Nº: 1149 SEC ID Nº: 1150 SEC ID Nº: 1103 SEC ID Nº: 1104 (fase +2)
NL019
SEC ID Nº: 1151 SEC ID Nº: 1152 SEC ID Nº: 1105 SEC ID Nº: 11,06 (fase +2)
NL021
SEC ID Nº: 1153 SEC ID Nº: 1154 SEC ID Nº: 1107 SEC ID Nº: 1108 (fase +2)
NL022
SEC ID Nº: 1155 SEC ID Nº: 1156 SEC ID Nº: 1109 SEC ID Nº: 1110 (fase +2)
NL023
SEC ID Nº: 1157 SEC ID Nº: 1158 SEC ID Nº: 1111 SEC ID Nº: 1112 (fase +2)
NL027
SEC ID Nº: 1159 SEC ID Nº: 1160 SEC ID Nº: 1113 SEC ID Nº: 1114 (fase +2)
Tabla 2-CS Tabla 3-CS
ID de diana
Cebador directo 5' → 3' Cebador inverso 5' → 3' Secuencia de ADNc (hebra con sentido) 5' → 3' Secuencia de aminoácidos correspondiente de clon de ADNc
CS001
SEC ID Nº: 1706 SEC ID Nº: 1707 SEC ID Nº: 1682 SEC ID Nº: 1683 (fase +1)
CS002
SEC ID Nº: 1708 SEC ID Nº: 1709 SEC ID Nº: 1684 SEC ID Nº: 1685 (fase +1)
CS003
SEC ID Nº: 1710 SEC ID Nº: 1711 SEC ID Nº: 1686 SEC ID Nº: 1687 (fase +1)
CS006
SEC ID Nº: 1712 SEC ID Nº: 1713 SEC ID Nº: 1688 SEC ID Nº: 1689 (fase +1)
CS007
SEC ID Nº: 1714 SEC ID Nº: 1715 SEC ID Nº: 1690 SEC ID Nº: 1691 (fase +3)
CS009
SEC ID Nº: 1716 SEC ID Nº: 1717 SEC ID Nº: 1692 SEC ID Nº: 1693 (fase +1)
CS011
SEC ID Nº: 1718 SEC ID Nº: 1719 SEC ID Nº: 1694 SEC ID Nº: 1695 (fase +1)
CS013
SEC ID Nº: 1720 SEC ID Nº: 1721 SEC ID Nº: 1696 SEC ID Nº: 1697 (fase +2)
CS014
SEC ID Nº: 1722 SEC ID Nº: 1723 SEC ID Nº: 1698 SEC ID Nº: 1699 (fase +2)
CS015
SEC ID Nº: 1724 SEC ID Nº: 1725 SEC ID Nº: 1700 SEC ID Nº: 1701 (fase +1)
CS016
SEC ID Nº: 1726 SEC ID Nº: 1727 SEC ID Nº: 1702 SEC ID Nº: 1703 (fase -3)
CS018
SEC ID Nº: 1728 SEC ID Nº: 1729 SEC ID Nº: 1704 SEC ID Nº: 1705 (fase +2)
Tabla 2-PX Tabla 3-PX
ID de diana
Cebador directo 5' → 3' Cebador inverso 5' → 3' Secuencia de ADNc (hebra con sentido) 5' → 3' Secuencia de aminoácidos correspondiente de clon de ADNc
PX001
SEC ID Nº: 2110 SEC ID Nº: 2111 SEC ID Nº: 2100 SEC ID Nº: 2101 (fase +1)
PX009
SEC ID Nº: 2112 SEC ID Nº: 2113 SEC ID Nº: 2102 SEC ID Nº: 2103 (fase +3)
PX010
SEC ID Nº: 2114 SEC ID Nº: 2115 SEC ID Nº: 2104 SEC ID Nº: 2105 (fase +3)
PX015
SEC ID Nº: 2116 SEC ID Nº: 2117 SEC ID Nº: 2106 SEC ID Nº: 2107 (fase +3)
PX016
SEC ID Nº: 2118 SEC ID Nº: 2119 SEC ID Nº: 2108 SEC ID Nº: 2109 (fase +2)
5
Tabla 2-AD Tabla 3-AD
ID de diana
Cebador directo 5' → 3' Cebador inverso 5' → 3' Secuencia de ADNc (hebra con sentido) 5' → 3' Secuencia de aminoácidos correspondiente de clon de ADNc
AD001
SEC ID Nº: 2374 SEC ID Nº: 2375 SEC ID Nº: 2364 SEC ID Nº: 2365 (fase +1)
AD002
SEC ID Nº: 2376 SEC ID Nº: 2377 SEC ID Nº: 2366 SEC ID Nº: 2367 (fase +2)
AD009
SEC ID Nº: 2378 SEC ID Nº: 2379 SEC ID Nº: 2368 SEC ID Nº: 2369 (fase +3)
AD015
SEC ID Nº: 2380 SEC ID Nº: 2381 SEC ID Nº: 2370 SEC ID Nº: 2371 (fase +2)
AD016
SEC ID Nº: 2382 SEC ID Nº: 2383 SEC ID Nº: 2372 SEC ID Nº: 2373 (fase +2)
Tabla 4- LD/TC/MP/CS/AD
ID de diana
SEC ID Nº Nº de Ejemplo Gi y especie
LD002
56 17861597 (Drosophila melanogaster), 92223378 (Drosophila willistoni), 92471309 (Drosophila erecta)
TC002
829 18920284 (Anopheles gambiae)
TC002
830 75717966 (Tribolium castaneum)
TC002
831 92475657 (Drosophila erecta) 13763220 (Drosophila melanogaster)
TC002
832 75717966 (Tribolium castaneum)
MP002
958 47537017 (Acyrthosiphon pisum)
MP002
959 15363283 (Apis mellifera)
MP002
960 47537017 (Acyrthosiphon pisum)
ID de diana
SEC ID Nº Nº de Ejemplo Gi y especie
MP002
961 47537017 (Acyrthosiphon pisum)
MP002
962 47537017 (Acyrthosiphon pisum)
MP002
963 110762684 (Apis mellifera)
CS002
1771 91849872 (Bombyx mori)
CS002
1772 33498783 (Anopheles gambia)
CS002
1773 110762684 (Apis mellifera)
CS002
1774 49552807 (Rhipicephalus appendiculatus)
AD002
2418 55902553 (Locusta migratoria)
AD002
2419 67899569 (Drosophila pseudoobscura)
AD002
2420 110762684 (Apis mellifera)
Tabla 6-MP
ID de diana
SEC ID Nº Nº de Ejemplo Gi y especie
MP002
1026 68026454 (Schizosaccharomyces pombe 972h-)
Tabla 8-LD
ID de diana
Cebadores directos 5' → 3' Cebadores inversos 5' → 3' Secuencia de ADN de ARNbc (hebra con sentido) 5' → 3'
LD001
SEC ID Nº: 164 SEC ID Nº: 165 SEC ID Nº: 163
SEC ID Nº: 166 SEC ID Nº: 167
LD002
SEC ID Nº: 169 SEC ID Nº: 170 SEC ID Nº: 168
SEC ID Nº: 171 SEC ID Nº: 172
LD003
SEC ID Nº: 174 SEC ID Nº: 175 SEC ID Nº: 173
SEC ID Nº: 176 SEC ID Nº: 177
LD006
SEC ID Nº: 179 SEC ID Nº: 180 SEC ID Nº: 178
SEC ID Nº: 181 SEC ID Nº: 182
LD007
SEC ID Nº: 184 SEC ID Nº: 185 SEC ID Nº: 183
SEC ID Nº: 186 SEC ID Nº: 187
LD010
SEC ID Nº: 189 SEC ID Nº: 190 SEC ID Nº: 188
SEC ID Nº: 191 SEC ID Nº: 192
LD011
SEC ID Nº: 194 SEC ID Nº: 195 SEC ID Nº: 193
SEC ID Nº: 196 SEC ID Nº: 197
LD014
SEC ID Nº: 199 SEC ID Nº: 200 SEC ID Nº: 198
SEC ID Nº: 201 SEC ID Nº: 202
LD014_F1
SEC ID Nº: 204 SEC ID Nº: 205 SEC ID Nº: 203
SEC ID Nº: 206 SEC ID Nº: 207
LD014_F2
SEC ID Nº: 209 SEC ID Nº: 210 SEC ID Nº: 208
SEC ID Nº: 211 SEC ID Nº: 212
LD014_C1
SEC ID Nº: 213
LD014_C2
SEC ID Nº: 214
LD015
SEC ID Nº: 216 SEC ID Nº: 217 SEC ID Nº: 215
SEC ID Nº: 218 SEC ID Nº: 219
LD016
SEC ID Nº: 221 SEC ID Nº: 222 SEC ID Nº: 220
SEC ID Nº: 223 SEC ID Nº: 224
LD018
SEC ID Nº: 226 SEC ID Nº: 227 SEC ID Nº: 225
SEC ID Nº: 228 SEC ID Nº: 229
LD027
SEC ID Nº: 231 SEC ID Nº: 232 SEC ID Nº: 230
SEC ID Nº: 233 SEC ID Nº: 234
gfp
SEC ID Nº: 236 SEC ID Nº: 237 SEC ID Nº: 235
SEC ID Nº: 238 SEC ID Nº: 239
5
Tabla 8-PC
ID de diana
Cebadores directos 5' → 3' Cebadores inversos 5' → 3' Secuencia de ADN de ARNbc (hebra con sentido) 5' → 3'
PC001
SEC ID Nº: 474 SEC ID Nº: 475 SEC ID Nº: 473
SEC ID Nº: 476 SEC ID Nº: 477
PC003
SEC ID Nº: 479 SEC ID Nº: 480 SEC ID Nº: 478
SEC ID Nº: 481 SEC ID Nº: 482
ID de diana
Cebadores directos 5' → 3' Cebadores inversos 5' → 3' Secuencia de ADN de ARNbc (hebra con sentido) 5' → 3'
PC005
SEC ID Nº: 484 SEC ID Nº: 485 SEC ID Nº: 483
SEC ID Nº: 486 SEC ID Nº: 487
PC010
SEC ID Nº: 489 SEC ID Nº: 490 SEC ID Nº: 488
SEC ID Nº: 491 SEC ID Nº: 492
PC014
SEC ID Nº: 494 SEC ID Nº: 495 SEC ID Nº: 493
SEC ID Nº: 496 SEC ID Nº: 497
PC016
SEC ID Nº: 499 SEC ID Nº: 500 SEC ID Nº: 498
SEC ID Nº: 501 SEC ID Nº: 502
PC027
SEC ID Nº: 504 SEC ID Nº: 505 SEC ID Nº: 503
SEC ID Nº: 506 SEC ID Nº: 507
Tabla 8-EV
ID de diana
Cebadores directos 5' → 3' Cebadores inversos 5' → 3' Secuencia de ADN de ARNbc (hebra con sentido) 5' → 3'
E005
SEC ID Nº: 577 SEC ID Nº: 578 SEC ID Nº: 576
SEC ID Nº: 579 SEC ID Nº: 580
EV009
SEC ID Nº: 582 SEC ID Nº: 583 SEC ID Nº: 581
SEC ID Nº: 584 SEC ID Nº: 585
EV010
SEC ID Nº: 587 SEC ID Nº: 588 SEC ID Nº: 586
SEC ID Nº: 589 SEC ID Nº: 590
EV015
SEC ID Nº: 592 SEC ID Nº: 593 SEC ID Nº: 591
SEC ID Nº: 594 SEC ID Nº: 595
EV016
SEC ID Nº: 597 SEC ID Nº: 598 SEC ID Nº: 596
SEC ID Nº: 599 SEC ID Nº: 600
Tabla 8-AG 5
ID de diana
Cebadores directos 5' → 3' Cebadores inversos 5' → 3' Secuencia de ADN de ARNbc (hebra con sentido) 5' → 3'
AG001
SEC ID Nº: 769 SEC ID Nº: 770 SEC ID Nº: 768
SEC ID Nº: 771 SEC ID Nº: 772
AG005
SEC ID Nº: 774 SEC ID Nº: 775 SEC ID Nº: 773
SEC ID Nº: 776 SEC ID Nº: 777
AG010
SEC ID Nº: 779 SEC ID Nº: 780 SEC ID Nº: 778
SEC ID Nº: 781 SEC ID Nº: 782
AG014
SEC ID Nº: 784 SEC ID Nº: 785 SEC ID Nº: 783
SEC ID Nº: 786 SEC ID Nº: 787
AG016
SEC ID Nº: 789 SEC ID Nº: 790 SEC ID Nº: 788
SEC ID Nº: 791 SEC ID Nº: 792
Tabla 8-TC
ID de diana
Cebadores directos 5' → 3' Cebadores inversos 5' → 3' Secuencia de ADN de ARNbc (hebra con sentido) 5' → 3'
TC001
SEC ID Nº: 864 SEC ID Nº: 865 SEC ID Nº: 863
SEC ID Nº: 866 SEC ID Nº: 867
TC002
SEC ID Nº: 869 SEC ID Nº: 870 SEC ID Nº: 868
SEC ID Nº: 871 SEC ID Nº: 872
TC010
SEC ID Nº: 874 SEC ID Nº: 875 SEC ID Nº: 873
SEC ID Nº: 876 SEC ID Nº: 877
TC014
SEC ID Nº: 879 SEC ID Nº: 880 SEC ID Nº: 878
SEC ID Nº: 881 SEC ID Nº: 882
TC015
SEC ID Nº: 884 SEC ID Nº: 885 SEC ID Nº: 883
SEC ID Nº: 886 SEC ID Nº: 887
Tabla 8-MP
ID de diana
Cebadores directos 5' → 3' Cebadores inversos 5' → 3' Secuencia de ADN de ARNbc (hebra con sentido) 5' → 3'
MP001
SEC ID Nº: 1042 SEC ID Nº: 1043 SEC ID Nº: 1041
SEC ID Nº: 1044 SEC ID Nº: 1045
MP002
SEC ID Nº: 1047 SEC ID Nº: 1048 SEC ID Nº: 1046
SEC ID Nº: 1049 SEC ID Nº: 1050
MP010
SEC ID Nº: 1052 SEC ID Nº: 1053 SEC ID Nº: 1051
SEC ID Nº: 1054 SEC ID Nº: 1055
MP016
SEC ID Nº: 1057 SEC ID Nº: 1058 SEC ID Nº: 1056
SEC ID Nº: 1059 SEC ID Nº: 1060
MP027
SEC ID Nº: 1062 SEC ID Nº: 1063 SEC ID Nº: 1061
SEC ID Nº: 1064 SEC ID Nº: 1065
Tabla 8-NL
ID de diana
Cebadores directos 5' → 3' Cebadores inversos 5' → 3' Secuencia de ADN de ARNbc 5' → 3'
NL001
SEC ID Nº: 1573 SEC ID Nº: 1574 SEC ID Nº: 1572
SEC ID Nº: 1575 SEC ID Nº: 1576
NL002
SEC ID Nº: 1578 SEC ID Nº: 1579 SEC ID Nº: 1577
SEC ID Nº: 1580 SEC ID Nº: 1581
NL003
SEC ID Nº: 1583 SEC ID Nº: 1584 SEC ID Nº: 1582
SEC ID Nº: 1585 SEC ID Nº: 1586
NL004
SEC ID Nº: 1588 SEC ID Nº: 1589 SEC ID Nº: 1587
SEC ID Nº: 1590 SEC ID Nº: 1591
NL005
SEC ID Nº: 1593 SEC ID Nº: 1594 SEC ID Nº: 1592
SEC ID Nº: 1595 SEC ID Nº: 1596
NL006
SEC ID Nº: 1598 SEC ID Nº: 1599 SEC ID Nº: 1597
SEC ID Nº: 1600 SEC ID Nº: 1601
NL007
SEC ID Nº: 1603 SEC ID Nº: 1604 SEC ID Nº: 1602
SEC ID Nº: 1605 SEC ID Nº: 1606
NL008
SEC ID Nº: 1608 SEC ID Nº: 1609 SEC ID Nº: 1607
SEC ID Nº: 1610 SEC ID Nº: 1611
NL009
SEC ID Nº: 1613 SEC ID Nº: 1614 SEC ID Nº: 1612
SEC ID Nº: 1615 SEC ID Nº: 1616
NL010
SEC ID Nº: 1618 SEC ID Nº: 1619 SEC ID Nº: 1617
SEC ID Nº: 1620 SEC ID Nº: 1621
NL011
SEC ID Nº: 1623 SEC ID Nº: 1624 SEC ID Nº: 1622
SEC ID Nº: 1625 SEC ID Nº: 1626
NL012
SEC ID Nº: 1628 SEC ID Nº: 1629 SEC ID Nº: 1627
SEC ID Nº: 1630 SEC ID Nº: 1631
NL013
SEC ID Nº: 1633 SEC ID Nº: 1634 SEC ID Nº: 1632
SEC ID Nº: 1635 SEC ID Nº: 1636
NL014
SEC ID Nº: 1638 SEC ID Nº: 1639 SEC ID Nº: 1637
SEC ID Nº: 1640 SEC ID Nº: 1641
NL015
SEC ID Nº: 1643 SEC ID Nº: 1645 SEC ID Nº: 1644 SEC ID Nº: 1646 SEC ID Nº: 1642
NL016
SEC ID Nº: 1648 SEC ID Nº: 1649 SEC ID Nº: 1647
SEC ID Nº: 1650 SEC ID Nº: 1651
NL018
SEC ID Nº: 1653 SEC ID Nº: 1654 SEC ID Nº: 1652
SEC ID Nº: 1655 SEC ID Nº: 1656
NL019
SEC ID Nº: 1658 SEC ID Nº: 1659 SEC ID Nº: 1657
SEC ID Nº: 1660 SEC ID Nº: 1661
NL021
SEC ID Nº: 1663 SEC ID Nº: 1664 SEC ID Nº: 1662
SEC ID Nº: 1665 SEC ID Nº: 1666
NL022
SEC ID Nº: 1668 SEC ID Nº: 1669 SEC ID Nº: 1667
SEC ID Nº: 1670 SEC ID Nº: 1671
NL023
SEC ID Nº: 1673 SEC ID Nº: 1674 SEC ID Nº: 1672
SEC ID Nº: 1675 SEC ID Nº: 1676
NL027
SEC ID Nº: 1678 SEC ID Nº: 1679 SEC ID Nº: 1677
SEC ID Nº: 1680 SEC ID Nº: 1681
5
Tabla 8-CS
ID de diana
Cebadores directos 5' → 3' Cebadores inversos 5' → 3' Secuencia de ADN de ARNbc (hebra con sentido) 5' → 3'
CS001
SEC ID Nº: 2041 SEC ID Nº: 2042 SEC ID Nº: 2040
SEC ID Nº: 2043 SEC ID Nº: 2044
CS002
SEC ID Nº: 2046 SEC ID Nº: 2047 SEC ID Nº: 2045
SEC ID Nº: 2048 SEC ID Nº: 2049
CS003
SEC ID Nº: 2051 SEC ID Nº: 2052 SEC ID Nº: 2050
SEC ID Nº: 2053 SEC ID Nº: 2054
CS006
SEC ID Nº: 2056 SEC ID Nº: 2057 SEC ID Nº: 2055
SEC ID Nº: 2058 SEC ID Nº: 2059
CS007
SEC ID Nº: 2061 SEC ID Nº: 2062 SEC ID Nº: 2060
SEC ID Nº: 2063 SEC ID Nº: 2064
CS009
SEC ID Nº: 2066 SEC ID Nº: 2067 SEC ID Nº: 2065
SEC ID Nº: 2068 SEC ID Nº: 2069
CS011
SEC ID Nº: 2071 SEC ID Nº: 2072 SEC ID Nº: 2070
SEC ID Nº: 2073 SEC ID Nº: 2074
CS013
SEC ID Nº: 2076 SEC ID Nº: 2077 SEC ID Nº: 2075
SEC ID Nº: 2078 SEC ID Nº: 2079
CS014
SEC ID Nº: 2081 SEC ID Nº: 2082 SEC ID Nº: 2080
SEC ID Nº: 2083 SEC ID Nº: 2084
CS015
SEC ID Nº: 2086 SEC ID Nº: 2087 SEC ID Nº: 2085
SEC ID Nº: 2088 SEC ID Nº: 2089
CS016
SEC ID Nº: 2091 SEC ID Nº: 2092 SEC ID Nº: 2090
SEC ID Nº: 2093 SEC ID Nº: 2094
CS018
SEC ID Nº: 2096 SEC ID Nº: 2097 SEC ID Nº: 2095
SEC ID Nº: 2098 SEC ID Nº: 2099
Tabla 8-PX
ID de diana
Cebadores directos 5' → 3' Cebadores inversos 5' → 3' Secuencia de ADN de ARNbc (hebra con sentido) 5' → 3'
PX001
SEC ID Nº: 2340 SEC ID Nº: 2341 SEC ID Nº: 2339
SEC ID Nº: 2342 SEC ID Nº: 2343
PX009
SEC ID Nº: 2345 SEC ID Nº: 2346 SEC ID Nº: 2344
SEC ID Nº: 2347 SEC ID Nº: 2348
PX010
SEC ID Nº: 2350 SEC ID Nº: 2351 SEC ID Nº: 2349
SEC ID Nº: 2352 SEC ID Nº: 2353
PX015
SEC ID Nº: 2355 SEC ID Nº: 2356 SEC ID Nº: 2354
SEC ID Nº: 2357 SEC ID Nº: 2358
PX016
SEC ID Nº: 2360 SEC ID Nº: 2361 SEC ID Nº: 2359
SEC ID Nº: 2362 SEC ID Nº: 2363
Tabla 8-AD 5
ID de diana
Cebadores directos 5' → 3' Cebadores inversos 5' → 3' Secuencia de ADN de ARNbc (hebra con sentido) 5' → 3'
AD001
SEC ID Nº: 2462 SEC ID Nº: 2463 SEC ID Nº: 2461
SEC ID Nº: 2464 SEC ID Nº: 2465
AD002
SEC ID Nº: 2467 SEC ID Nº: 2468 SEC ID Nº: 2466
SEC ID Nº: 2469 SEC ID Nº: 2470
AD009
SEC ID Nº: 2472 SEC ID Nº: 2473 SEC ID Nº: 2471
SEC ID Nº: 2474 SEC ID Nº: 2475
AD015
SEC ID Nº: 2477 SEC ID Nº: 2478 SEC ID Nº: 2476
SEC ID Nº: 2479 SEC ID Nº: 2480
AD016
SEC ID Nº: 2482 SEC ID Nº: 2483 SEC ID Nº: 2481
SEC ID Nº: 2484 SEC ID Nº: 2485
Tabla 10-LD
Bioensayo
Cepa hospedadora bacteriana Tratamiento Nº de supervivientes Peso total Peso promedio/larva
I
solamente dieta 8* 1,0245 0,1281
AB309-105
pGN29 8* 1,0124 0,1266
pGBNJ003 clon 1
4 0,0273 0,0068
pGBNJ003 clon 2
1 0,0091 0,0091
pGBNJ003 clon 3
25 0,7113 0,0285
pGBNJ003 clon 4
12 0,1379 0,0115
pGBNJ003 clon 5
12 0,1808 0,0151
II
solamente dieta 8* 1,0435 0,1304
BL21 (DE3)
pGN29 8* 1,1258 0,1407
pGBNJ003 clon 1
33 0,5879 0,0178
pGBNJ003 clon 2
42 0,8034 0,0191
pGBNJ003 clon 3
33 0,3441 0,0104
pGBNJ003 clon 4
21 0,1738 0,0083
pGBNJ003 clon 5
33 0,3628 0,0120
Tablas 10(a)-NL
ARNi
Media de % de supervivencia (días después del inicio) Análisis de supervivencia1
0
1 2 3 4 5 6 7 8
gfp
100 98 90 82 68 60 44 32 20 -
solamente dieta
100 98 96 86 74 68 58 54 38 -
NL002
100 98 90 76 68 34 6 0 0 +
NL003
100 98 74 48 36 22 12 2 0 +
NL005
100 100 74 56 40 20 16 6 4 +
NL010
100 96 74 56 48 30 18 12 8 +
1 = Los datos se analizaron usando el análisis de curva de supervivencia de Kaplan-Meier
5
Tablas 10(a)-NL (continuación)
Chi cuadrado valor de P Dif. Sig.2
dieta frente a:
NL002
29,06 < 0,0001 Sí
NL003
39,59 < 0,0001 Sí
NL005
29,55 < 0,0001 Sí
NL010
21,04 < 0,0001 Sí
ARNbc de gfp frente a:
NL002
15,09 0,0001 Sí
NL003
22,87 < 0,0001 Sí
NL005
15,12 < 0,0001 Sí
NL010
8,838 0,0029 Sí
dieta frente a ARNbc de gfp
4,030 0,0447 (~0,05) No
2 alfa < 0,05
Tablas 10(b)-NL
ARNi
Media de % de supervivencia (días después del inicio) Análisis de supervivencia1
0
1 2 3 4 5 6 7 8
gfp
100 96 84 82 76 70 54 50 44 -
solamente dieta
100 96 88 82 76 70 54 50 44 -
NL009
100 94 75 63 42 30 24 22 14 +
NL016
100 94 84 78 54 44 36 18 14 +
1 = Los datos se analizaron usando el análisis de curva de supervivencia de Kaplan-Meier 10
Chi cuadrado valor de P Dif. Sig.2
dieta frente a:
NL009
11,98 0,0005 Sí
NL016
8,98 0,0027 Sí
ARNbc de gfp frente a:
NL009
13,69 0,0002 Sí
NL016
11,37 0,0007 Sí
dieta frente a ARNbc de gfp:
0,03317 0,8555 No
2 alfa < 0,05
Tablas 10(c)-NL
ARNi
Media de % de supervivencia (días después del inicio) Análisis de supervivencia1
0
1 2 3 4 5 6 7 8
gfp
100 92 84 78 72 62 58 56 48 -
solamente dieta
100 84 72 68 64 58 52 42 42 -
NL014
100 86 68 60 46 32 24 18 14 +
NL018
100 82 70 54 40 30 18 14 12 +
1 = Los datos se analizaron usando el análisis de curva de supervivencia de Kaplan-Meier 5
Chi cuadrado valor de P Dif. Sig.2
dieta frente a:
NL014
8,088 0,0045 Sí
NL018
10,47 0,0012 Sí
ARNbc de gfp frente a:
NL014
14,55 0,0001 Sí
NL018
17,64 < 0,0001 Sí
dieta frente a ARNbc de gfp:
0,6548 0,4184 No
2 alfa < 0,05
Tablas 10(d)-NL
ARNi
Media de % de supervivencia (días después del inicio) Análisis de supervivencia1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
gfp
100 96 84 84 72 68 68 66 66 62 -
solamente dieta
100 96 86 82 74 72 70 70 66 58 -
NL013
100 94 82 68 50 40 30 28 20 20 +
NL015
100 100 72 30 18 12 8 6 6 6 +
NL021
100 100 84 58 50 44 40 34 34 22 +
1 = Los datos se analizaron usando el análisis de curva de supervivencia de Kaplan-Meier 10
Tablas 10(d)-NL (continuación)
Chi cuadrado valor de P Dif. Sig.2
dieta frente a:
NL013
15,73 < 0,0001 Sí
NL015
39,44 < 0,0001 Sí
NL021
12,75 0,0004 Sí
ARNbc de gfp frente a:
NL013
16,42 < 0,0001 Sí
NL015
39,15 < 0,0001 Sí
NL021
14,1 0,0002 Sí
Chi cuadrado valor de P Dif. Sig.2
dieta frente a ARNbc de gfp:
0,1031 0,7481 No
2 alfa < 0,05
Tabla 11-NL
ARNi NL002
Media de % de supervivencia (días después del inicio) Análisis de supervivencia1
0
1 2 3 4 5 6 7
solamente dieta
100 100 96 90 86 78 78 78 -
1 μg/μl
100 84 80 44 26 8 6 6 +
0,2 μg/μl
100 84 60 12 8 4 2 2 +
0,08 μg/μl
100 84 62 18 14 6 6 6 +
0,04 μg/μl
100 84 48 24 22 22 22 22 +
1 = Los datos se analizaron usando el análisis de curva de supervivencia de Kaplan-Meier
5
Chi cuadrado valor de P Dif. Sig.2
dieta frente a:
NL002 1 μg/μl
57,53 < 0,0001 Sí
NL002 0,2 μg/μl
74,54 < 0,0001 Sí
NL002 0,08 μg/μl
64 < 0,0001 Sí
NL002 0,04 μg/μl
39,49 < 0,0001 Sí
2 alfa < 0,05

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un ARN bicatenario aislado que comprende hebras complementarias hibridadas, en el que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleótido seleccionado entre el grupo que consiste en:
    5
    (i) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 1073, 1577, 3, 56, 168, 795, 829 a 832, 868, 890, 958 a 963, 1026, 1046, 1684, 1771 a 1774, 2045, 2366, 2418 a 2420 y 2466,
    (ii) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana que codifica la secuencia de aminoácidos representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 1074, 4, 796, 891, 1685 y 2367, y 10
    (iii) polirribonucleótidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleótidos de (i) o (ii).
  2. 2. Un polinucleótido aislado que codifica el ARN bicatenario de la reivindicación 1.
    15
  3. 3. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 2.
  4. 4. Una célula transformada con y que comprende el polinucleótido de la reivindicación 2.
  5. 5. La célula de la reivindicación 4, en la que dicha célula es una célula vegetal. 20
  6. 6. Una planta transformada con y que comprende el polinucleótido de la reivindicación 2.
  7. 7. Una planta que comprende un ARN bicatenario de la reivindicación 1.
    25
  8. 8. Una semilla de la planta de las reivindicaciones 6 o 7, en la que dicha semilla comprende dicho ARN bicatenario.
  9. 9. Un producto producido a partir de la planta de la reivindicación 6 o 7, en el que dicho producto comprende dicho ARN bicatenario.
    30
  10. 10. Un pesticida que comprende la planta de la reivindicación 7.
  11. 11. Un método para controlar la infestación por plaga de insectos, que comprende proporcionar a una plaga material vegetal que comprende el ARN bicatenario de la reivindicación 1.
    35
  12. 12. Un método para controlar la infestación por plaga de insectos, que comprende proporcionar el ARN bicatenario de la reivindicación 1 en la dieta de dicha plaga de insecto o rociar una superficie vegetal con el ARN bicatenario de la reivindicación 1.
  13. 13. Un método para mejorar el rendimiento de cultivo, que comprende: 40
    a) introducir un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, en la planta; y
    b) cultivar dicha planta para permitir la expresión de dicho ARN bicatenario, en el que dicha expresión inhibe la alimentación por una plaga de insectos y la pérdida de rendimiento debido a la infestación por la plaga.
    45
  14. 14. Uso de un ARN bicatenario de acuerdo con la reivindicación 1, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, un vector de acuerdo con la reivindicación 3, una célula de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, una planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, o un producto de acuerdo con la reivindicación 9, para tratar las infestaciones por insectos de plantas.
    50
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