ES2545223T3 - Composiciones y procedimientos para modular el corte y empalme de SMN2 - Google Patents

Composiciones y procedimientos para modular el corte y empalme de SMN2 Download PDF

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ES2545223T3 ES12188625.3T ES12188625T ES2545223T3 ES 2545223 T3 ES2545223 T3 ES 2545223T3 ES 12188625 T ES12188625 T ES 12188625T ES 2545223 T3 ES2545223 T3 ES 2545223T3
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Brenda F. Baker
Adrian R. Krainer
Yimin Hua
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Cold Spring Harbor Laboratory
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Abstract

Un oligonucleótido antisentido dirigido al intrón 7 de una molécula de ácido nucleico que codifica SMN2, en el que dicho oligonucleótido tiene una longitud de hasta 20 nucleótidos y comprende una modificación 2'-O-metoxietilazúcar en cada posición, en el que la secuencia de nucleótidos de dicho oligonucleótido comprende la SEC ID Nº: 83, SEC ID Nº: 85, SEC ID Nº: 87 o SEC ID Nº: 89.

Description

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imagen11
E12188625
12-08-2015
nucleótidos y están compuestos por 2’-O-metoxietilnucleótidos, también conocidos como nucleótidos 2’-MOE. Los enlaces internucleosídicos (esqueleto) son fosfodiéster a lo largo del oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. El sitio diana indica el primer número de nucleótido (más en 5’) de la secuencia diana (SEC ID Nº 1) a la que se une el oligonucleótido.
Tabla 1
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Compuestos 2’-MOE dirigidos a SMN2
Nº ISIS
Sitio diana Región diana Longitud Secuencia (5’ a 3’) SEC ID Nº
390645
1 Intrón 6 15 TAGATAGCTATATAT 2
393593
2 Intrón 6 15 ATAGATAGCTATATA 3
393592
3 Intrón 6 15 TATAGATAGCTATAT 4
393591
4 Intrón 6 15 ATATAGATAGCTATA 5
393590
5 Intrón 6 15 GATATAGATAGCTAT 6
393602
5 Intrón 6 12 ATAGATAGCTAT 7
390644
6 Intrón 6 15 AGATATAGATAGCTA 8
393601
6 Intrón 6 12 TATAGATAGCTA 9
393589
7 Intrón 6 15 TAGATATAGATAGCT 10
393600
7 Intrón 6 12 ATATAGATAGCT 11
393588
8 Intrón 6 15 ATAGATATAGATAGC 12
393599
8 Intrón 6 12 GATATAGATAGC 13
393587
9 Intrón 6 15 TATAGATATAGATAG 14
393598
9 Intrón 6 12 AGATATAGATAG 15
393586
10 Intrón 6 15 ATATAGATATAGATA 16
393597
10 Intrón 6 12 TAGATATAGATA 17
390643
11 Intrón 6 15 TATATAGATATAGAT 18
393596
11 Intrón 6 12 ATAGATATAGAT 19
393595
12 Intrón 6 12 TATAGATATAGA 20
393594
13 Intrón 6 12 ATATAGATATAG 21
390642
16 Intrón 6 15 ATAGCTATATAGATA 22
390641
21 Intrón 6 15 AAAAAATAGCTATAT 23
390640
26 Intrón 6 15 GTTAAAAAAAATAGC 24
390639
31 Intrón 6 15 AGGAAGTTAAAAAAA 25
390638
36 Intrón 6 15 AATAAAGGAAGTTAA 26
390637
41 Intrón 6 15 AGGAAAATAAAGGAA 27
390636
46 Intrón 6 15 CTGTAAGGAAAATAA 28
372641
61 Exón 7 15 ATTTTGTCTAAAACC 29
385909
62 Exón 7 15 GATTTTGTCTAAAAC 30
383497
63 Exón 7 12 TTTTGTCTAAAA 31
385908
63 Exón 7 15 TGATTTTGTCTAAAA 32
383496
64 Exón 7 12 ATTTTGTCTAAA 33
385907
64 Exón 7 15 TTGATTTTGTCTAAA 34
383495
65 Exón 7 12 GATTTTGTCTAA 35
385906
65 Exón 7 15 TTTGATTTTGTCTAA 36
385910
65 Exón 7 16 TTTTGATTTTGTCTAA 37
372642
66 Exón 7 15 TTTTGATTTTGTCTA 38
383494
66 Exón 7 12 TGATTTTGTCTA 39
383493
67 Exón 7 12 TTGATTTTGTCT 40
385905
67 Exón 7 15 TTTTTGATTTTGTCT 41
383492
68 Exón 7 12 TTTGATTTTGTC 42
385904
68 Exón 7 15 CTTTTTGATTTTGTC 43
383491
69 Exón 7 12 TTTTGATTTTGT 44
383490
70 Exón 7 12 TTTTTGATTTTG 45
372643
71 Exón 7 15 CTTCTTTTTGATTTT 46
383489
71 Exón 7 12 CTTTTTGATTTT 47
383488
72 Exón 7 12 TCTTTTTGATTT 48
372644
76 Exón 7 15 CCTTCCTTCTTTTTG 49
372645
81 Exón 7 15 GAGCACCTTCCTTCT 50
372646
86 Exón 7 15 AATGTGAGCACCTTC 51
372647
91 Exón 7 15 TAAGGAATGTGAGCA 52
383470
92 Exón 7 18 AATTTAAGGAATGTGAGC 53
13 E12188625
12-08-2015
(continuación)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Compuestos 2’-MOE dirigidos a SMN2
Nº ISIS
Sitio diana Región diana Longitud Secuencia (5’ a 3’) SEC ID Nº
383477
92 Exón 7 15 TTAAGGAATGTGAGC 54
383469
93 Exón 7 18 TAATTTAAGGAATGTGAG 55
383476
93 Exón 7 15 TTTAAGGAATGTGAG 56
383487
93 Exón 7 12 AAGGAATGTGAG 57
383468
94 Exón 7 18 TTAATTTAAGGAATGTGA 58
383475
94 Exón 7 15 ATTTAAGGAATGTGA 59
383486
94 Exón 7 12 TAAGGAATGTGA 60
383467
95 Exón 7 18 CTTAATTTAAGGAATGTG 61
383474
95 Exón 7 15 AATTTAAGGAATGTG 62
383485
95 Exón 7 12 TTAAGGAATGTG 63
372648
96 Exón 7 15 TAATTTAAGGAATGT 64
383466
96 Exón 7 18 CCTTAATTTAAGGAATGT 65
383484
96 Exón 7 12 TTTAAGGAATGT 66
383473
97 Exón 7 15 TTAATTTAAGGAATG 67
383483
97 Exón 7 12 ATTTAAGGAATG 68
383472
98 Exón 7 15 CTTAATTTAAGGAAT 69
383482
98 Exón 7 12 AATTTAAGGAAT 70
383471
99 Exón 7 15 CCTTAATTTAAGGAA 71
383481
99 Exón 7 12 TAATTRAAGGAA 72
372649
100 Exón 7 15 TCCTTAATTTAAGGA 73
383480
100 Exón 7 12 TTAATTTAAGGA 74
383479
101 Exón 7 12 CTTAATTTAAGG 75
383478
102 Exón 7 12 CCTTAATTTAAG 76
390646
115 Intrón 7 15 TGCTGGCAGACTTAC 77
390647
120 Intrón 7 15 CATAATGCTGGCAGA 78
393610
121 Intrón 7 15 TCATAATGCTGGCAG 79
393609
122 Intrón 7 15 TTCATAATGCTGGCA 80
393608
123 Intrón 7 15 TTTCATAATGCTGGC 81
387949
124 Intrón 7 20 ATTCACTTTCATAATGCTGG 82
393607
124 Intrón 7 15 CTTTCATAATGCTGG 83
393619
124 Intrón 7 12 TCATAATGCTGG 84
390648
125 Intrón 7 15 ACTTTCATAATGCTG 85
393618
125 Intrón 7 12 TTCATAATGCTG 86
393606
126 Intrón 7 15 CACTTTCATAATGCT 87
393617
126 Intrón 7 12 TTTCATAATGCT 88
393605
127 Intrón 7 15 TCACTTTCATAATGC 89
393616
127 Intrón 7 12 CTTTCATAATGC 90
393604
128 Intrón 7 15 TTCACTTTCATAATG 91
393615
128 Intrón 7 12 ACTTTCATAATG 92
393603
129 Intrón 7 15 ATTCACTTTCATAAT 93
393614
129 Intrón 7 12 CACTTTCATAAT 94
390649
130 Intrón 7 15 GATTCACTTTCATAA 95
393613
130 Intrón 7 12 TCACTTTCATAA 96
393612
131 Intrón 7 12 TTCACTTTCATA 97
393611
132 Intrón 7 12 ATTCACTTTCAT 98
390650
135 Intrón 7 15 AGTAAGATTCACTTT 99
390651
140 Intrón 7 15 ACAAAAGTAAGATTC 100
390652
145 Intrón 7 15 GTTTTACAAAAGTAA 101
390653
150 Intrón 7 15 ATAAAGTTTTACAAA 102
390654
155 Intrón 7 15 AAACCATAAAGTTTT 103
390655
160 Intrón 7 15 TCCACAAACCATAAA 104
60 Otras secuencias de ácido nucleico para los genes de SMN están disponibles públicamente y son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los números de acceso en Genbank: NM_000344, NM_022874, NM_022875, U43883, AC140134, AC139778, AC010237, AC022119 y AC004999 proporcionan secuencias de nucleótidos de SMN1 o SMN2.
65 Ejemplo 2
14
imagen12
imagen13
imagen14
E12188625
12-08-2015
ARN y se realizó la RT-PCR como se ha descrito con anterioridad para analizar los cambios de corte y empalme del pre-ARNm de SMN2. Los productos de la PCR se digirieron con DdeI para distinguir entre SMN1 y SMN2, se separaron mediante electroforesis en geles de poliacrilaminda desnaturalizante al 6% y se analizaron mediante autorradiografía. El porcentaje de tránscritos de SMN2 sometidos a corte y empalme que contienen el exón 7 (% de inclusión) se muestra en la Tabla 5. También se indican la longitud y el sitio diana de cada oligonucleótido relativos a la SEC ID Nº 1.
Tabla 5
10
15
20
25
30
Efecto de los oligonucleótidos antisentido de SMN2 sobre el corte y empalme de los pre-ARNm de SMN2
Nº ISIS
Sitio diana Longitud % de inclusión
383470
92 18 4,9
383477
92 15 5,3
383469
93 18 18,9
383476
93 15 32,8
383468
94 18 18,7
383475
94 15 84,8
383467
95 18 8,1
383474
95 15 77,0
372648
96 15 59,6
383466
96 18 37,5
383473
97 15 42,2
383472
98 15 45,0
383471
99 15 37,1
Control
N/A N/A 41,3
Vehículo
N/A N/A 41,4
Los resultados demuestran que una serie de oligonucleótidos antisentido de SMN2 pueden alterar el corte y
35 empalme de los pre-ARNM de SMN2. ISIS 383467, ISIS 383468, ISIS 383469, ISIS 383470, ISIS 383476 e ISIS 383477 inhibieron la inclusión del exón 7; ISIS 383474, ISIS 383475 e ISIS 372648 aumentaron significativamente la inclusión del exón 7; e ISIS 383466, ISIS 383471, ISIS 383472 e ISIS 383473 parecía que tenían muy poco efecto sobre el corte y empalme de SMND respecto al oligonucleótido y a los vehículos control Estos resultados sugieren que los oligonucleótidos de SMN2 con un sitio diana entre los nucleótidos 94 . 96 son particularmente eficaces en la
40 consecución de la inclusión del exón 7 durante el corte y empalme del pre-ARNm de SMN2 y también sugiere que los oligonucleótidos de 15 nucleótidos de longitud son más eficaces que los de 18 nucleótidos de longitud.
Ejemplo 6
45 Efecto de los compuestos antisentido sobre el corte y empalme de SMN2 en células fibroblastos de SMA
De acuerdo con la presente divulgación, los oligonucleótidos antisentido de SMN2 se analizaron en células
fibroblastos procedentes de un paciente con SMA de tipo I (línea celular 3813; Coovert y col., Human Mol. Genet.,
1997, 6, 1205-1214). Los fibroblastos de SMA contienen SMN2, pero no expresan SMN1. Los fibroblastos de SMA
50 se sometieron a lipofección con 200 nM de los oligonucleótidos antisentido de SMN2 ISIS 372641, ISIS 372642, ISIS 372643, ISIS 372644, ISIS 372645, ISIS 372646, ISIS 372647, ISIS 372648 o ISIS 372649, o el oligonucleótido control ISIS 72693. Setenta horas tras la transfección se aisló el ARN y se realizó RT-PCR como se ha descrito anteriormente para examinar los cambios en el corte y empalme de los pre-ARNm de SMN2 endógena. Los productos de la PCR se separaron mediante electroforesis y se analizaron mediante autorradiografía. El porcentaje
55 de tránscritos de SMN2 sometidos a corte y empalme que contienen el exón 7 (% de inclusión) se muestra en la Tabla 6. El sitio diana de cada oligonucleótido relativo a la SEC ID Nº 1 también está indicado.
60
65
18
imagen15
E12188625
12-08-2015
Tabla 8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Compuestos del microcamino de ISIS 372642: Efecto sobre la inclusión del exón 7
Nº ISIS
Sitio diana Longitud % de inclusión en minigen de SMN2 % de inclusión de SMN2 endógena % de inclusión de SMN1 endógena
385909
62 15 44 43 81
383497
63 12 55 51 86
385908
63 15 49 53 85
383496
64 12 32 36 81
385907
64 15 56 54 86
383495
65 12 54 49 85
385906
65 15 56 57 87
385910
65 16 60 66 89
372642
66 15 66 74 89
383494
66 12 57 51 86
383493
67 12 57 52 85
385905
67 15 74 85 89
383492
68 12 60 56 85
385904
68 15 9 6 19
383491
69 12 38 41 81
383490
70 12 51 49 84
383489
71 12 13 27 76
383488
72 12 24 38 82
Control
N/A N/A 52 51 86
Control
N/A N/A 53 50 86
Tabla 9
Compuestos del microcamino de ISIS 372648: Efecto sobre la inclusión del exón 7
Nº ISIS
Sitio diana Longitud % de inclusión en minigen de SMN2 Minigene % de inclusión de SMN2 endógena % de inclusión de SMN1 endógena
383470
92 18 8 12 63
383477
92 15 6 7 38
383469
93 18 29 26 89
383476
93 15 36 31 87
383487
93 12 11 16 79
383468
94 18 31 26 88
383475
94 15 85 88 96
383486
94 12 44 41 91
383467
95 18 14 13 82
383474
95 15 79 71 94
383485
95 12 63 60 93
372648
96 15 70 57 93
383466
96 18 38 43 92
383484
96 12 65 56 92
383473
97 15 62 53 94
383483
97 12 63 56 94
20
imagen16
E12188625
12-08-2015
372642, ISIS 385905 e ISIS 383475, cada uno de los cuales dirigidos al exón 7, aumentaban significativamente la inclusión del exón 7 de SMN2. Estos compuestos dirigidos al exón 7 y un compuesto dirigido al intrón 7 de SMN2 (ISIS 387949) se compararon en lo que respecta a su capacidad para estimular la inclusión del exón 7. Como se ha descrito en ejemplos anteriores del presente documento, las células HEK293 se sometieron a electroporación con 10 5 µM de oligonucleótido y se realizó RT-PCR tras dos días para analizar los cambios del corte y empalme de SMN1 y SMN2 endógenas. En comparación con el oligonucleótido control, los compuestos dirigidos al exón 7 exhibían un incremento significativo de la inclusión del exón 7, como era de esperar. Además, el compuesto dirigidos al intrón 7 condujo a la incorporación del exón 7 en casi todos los ARNm de SMN1 y SMN2. Estos Resultados sugieren que los compuestos antisentido dirigidos a las secuencias intrónicas también contribuyen a la incorporación del exón 7 de
10 SMN2. Se sabe que las secuencias intrónicas contienen elementos reguladores del corte y empalme (es decir, potenciadores del corte y empalme intrónico y silenciadores del corte y empalme intrónico), lo que proporciona un posible mecanismo de acción para ISIS 387949.
Ejemplo 9
15
Mapeo sistemático de los silenciadores del corte y empalme intrónico (ISS)
Para investigar adicionalmente si los compuestos antisentido dirigidos a los intrones que flanquean al exón 7 de SMN2 podían alterar la inclusión del exón 7, por ejemplo interfiriendo con los silenciadores de corte y empalme 20 intrónico, se diseñaron compuestos dirigidos a 60 nucleótidos del intrón 6 (nucleótidos 1-60 de SEC ID Nº 1) o a los 60 nucleótidos del intrón 7 (nucleótidos 115-174 de SEC ID Nº 1) inmediatamente adyacentes al exón 7. Los compuestos antisentido dirigidos al intrón 6 (ISIS 390636, ISIS 390637, ISIS 390638, ISIS 390639, ISIS 390640, ISIS 390641, ISIS 390642, ISIS 390643, ISIS 390644 e ISIS 390645) o al intrón 7 (ISIS 390646, ISIS 390647, ISIS 390648, ISIS 390649, ISIS 390650, ISIS 390651, ISIS 390652, ISIS 390653, ISIS 390654 e ISIS 390655) se 25 muestran anteriormente en la Tabla 1. Cada compuesto se analizó en tres ensayos diferentes para evaluar su efecto sobre la inclusión del exón 7: Corte y empalme del minigen de SMN2 en extractos acelulares, corte y empalme del minigen de SMN2 en células HEK293 transfectadas y corte y empalme de SMN2 endógena en células HEK293. Los resultados obtenidos de los tres ensayos demostraron que varios compuestos antisentido podían aumentar la inclusión del exón 7, en concreto ISIS 390644 and ISIS 390648 fueron los más efectivos como compuestos dirigidos
30 al intrón 6 y al intrón 7, respectivamente.
Para investigar adicionalmente las regiones dirigidas por ISIS 390644 e ISIS 390648, se diseñaron compuestos adicionales como microcaminos alrededor de estas secuencias diana (véase en la Tabla 1 las secuencias. Para estos experimentos, los compuestos de 12 y 15 nucleótidos de longitud se diseñaron y analizaron
35 de acuerdo con los procedimientos detallados en los ejemplos anteriores del presente documento. Se analizaron los compuestos dirigidos a la región de ISIS 390644 (intrón 6) en el ensayo del minigen de SMN2 y el ensayo de SMN1/SMN2 endógenas en células HEK293. Los resultados se muestran en la tabla 12.
Tabla 12
40
45
50
55
60
65
Resultados del microcamino del compuesto ISIS 390644 del intrón 6
Nº ISIS
Sitio diana Longitud % de inclusión en minigen de SMN2 % de inclusión en SMN2 endógena
393586
10 15 10 32
393587
9 15 18 44
393588
8 15 32 60
393589
7 15 59 79
390644
6 15 65 75
393590
5 15 49 67
393591
4 15 20 46
393592
3 15 22 44
393593
2 15 29 50
393594
13 12 20 44
393595
12 12 13 39
393596
11 12 15 44
393597
10 12 13 39
393598
9 12 17 48
393599
8 12 30 64
393600
7 12 28 62
22 E12188625
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(continuación)
5
10
Resultados del microcamino del compuesto ISIS 390644 del intrón 6
Nº ISIS
Sitio diana Longitud % de inclusión en minigen de SMN2 % de inclusión en SMN2 endógena
393601
6 12 44 63
393602
5 12 29 46
Control
N/A N/A 22 43
Como se muestra en la Tabla 12, los compuestos antisentido que tienen un sitio diana de los nucleótidos 58 (SEC ID Nº 2) tienen como resultado un mayor porcentaje de tránscritos que contienen el exón 7. Estos hallazgos sugieren que esta región del intrón 6 contiene un silenciador de corte y empalme intrónico que normalmente 15 funciona inhibiendo la inclusión del exón 7. Tras el bloqueo de este elemento regulador, la selección del sitio de corte y empalme se altera para estimular la inclusión del exón 7.
Se analizaron los compuestos dirigidos a la región 390648 (intrón 7) usando el ensayo del minigen de SMN2 in vitro y en células HEK293 transfectadas y se analizaron en el ensayo de corte y empalme de SMN2 20 endógena en células HEK293, Los resultados se muestran en la tabla 13.
Tabla 13
25
30
35
40
45
Resultados del microcamino del compuesto ISIS 390648 del intrón 7
Nº ISIS
Sitio diana Longitud % de inclusión en minigen de SMN2 in vitro % de inclusión en minigen de SMN2 % de inclusión de SMN2 endógena
393603
129 15 43 51 76
393604
128 15 46 75 97
393605
127 15 57 97 100
393606
126 15 56 97 100
390648
125 15 53 98 100
393607
124 15 67 100 100
393608
123 15 75 100 100
393609
122 15 60 97 100
393610
121 15 54 58 78
393611
132 12 41 17 40
393612
131 12 39 30 58
393613
130 12 42 43 64
393614
129 12 48 43 64
393615
128 12 38 36 44
393616
127 12 38 30 90
393617
126 12 36 30 92
393618
125 12 44 71 97
393619
124 12 69 92 97
Control
N/A N/A 28 23 44
50 Aunque todos los compuestos condujeron a un incremento de la inclusión del exón 7, los compuestos con sitios diana entre los nucleótidos 121 y 129 (SEC ID Nº 1) fueron más eficaces.
Se evaluaron adicionalmente determinados compuestos dirigidos al intrón 7 sobre la inclusión del exón 7 de SMN2 tras la transfección a una dosis baja de oligonucleótido de 0,1 µM. Como se ha descrito anteriormente, las 55 células HEK293 se sometieron a electroporación con ISIS 393605, ISIS 393606, ISIS 390648, ISIS 393607, ISIS 393608, ISIS 393609, ISIS 393617, ISIS 393618 o ISIS 393619 y se determinaron los niveles de los productos de corte y empalme de SMN2 endógena. Los resultados se muestran en la tabla 14.
60
65
23

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  1. imagen1
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